АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, ОПОСРЕДОВАННАЯ ЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ И КОМПОНЕНТАМИ КЛЕТОЧНОЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENS
advertisement
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, ОПОСРЕДОВАННАЯ ЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ И КОМПОНЕНТАМИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ PSEUDOMONAS ALCALIGENS Cидорова Наталья Анатольевна канд. биол. наук, доцент Петрозаводского государственного университета, РФ, г. Петрозаводск E-mail: fagafon@yandex.ru Комкова Ольга Петровна старший преподаватель Петрозаводского государственного университета, РФ, г. Петрозаводск E-mail: vanlis@petrsu.ru ANTAGONISTIC ACTIVITY MEDIATED WITH LYTIC ENZYMES AND COMPONENTS OF THE CELL WALL OF PSEUDOMONAS ALCALIGENS Sidorova Natalya сandidate of Biological Sciences, Associate Professor, Petrozavodsk State University, Russia, Petrozavodsk Komkova Olga Senior Lecturer, Petrozavodsk State University, Russia, Petrozavodsk АННОТАЦИЯ Исследовано ингибирующее действие Pseudomonas alcaligenes в отношении патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus и Aeromonas sp. По результатам эксперимента установлено закономерное изменение роста индикаторных штаммов в присутствии метаболитов и компонентов клеточной стенки Pseudomonas alcaligenes. Регуляцию антагонизма наблюдали по четырем ______________________________ Сидорова Н.А., Комкова О.П. Антагонистическая активность, опосредованная литическими ферментами и компонентами клеточной стенки Pseudomonas alcaligens // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2015. № 3-4 (12) . URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/2044 направлениям: индифферентное, стимулирующее, ингибирующее и инвертирующее с полным ингибированием признака и переключением на стимуляцию роста тест-культуры. ABSTRACT Inhibitory effect of Pseudomonas alcaligenes in relation to pathogenic microorganisms Staphylococcus aureus and Aeromonas sp. was investigated. According to the results of the experiment, a natural change in the growth of indicator strains in the presence of the Pseudomonas alcaligenes metabolites and components of the cell wall was revealed. Regulation of antagonism was observed in four directions: indifferent, stimulatory, inhibitory and inverting with complete inhibition characteristic and switching to the stimulation of growth of the test cultures. Ключевые слова: антагонизм, антимикробные вещества, колонизационная резистентность, индифференция, стимуляция, ингибирование. Keywords: antagonism, antimicrobial substances, colonization resistance, indifference, stimulation, inhibition. Антагонистическая активность контролирует выживание большинства микроорганизмов в природных ассоциациях — многокомпонентных системах, состоящих из доминантных и ассоциативных организмов, выполняющих функцию формирования и обеспечения стабильности и продуктивности симбиоза [1, с. 63]. При этом антагонистическая активность доминантной микрофлоры находится под влиянием регуляторных штаммов и опосредуется синтезом антибиотиков, бактериоцинов ферментов [2, с. 561; 3, с. 503]. Несмотря по микробному свойства антагонизму, на и литических накопленный псевдомонад при материал конкуренции с патогенными видами не достаточно охарактеризованы; остаётся неясной роль клеточных стенок на межвидовом этого уровне. вида К бактерий малоизученным при реализации явлениям отношений можно отнести и биотическую регуляцию антагонизма бактерий, обусловленную ферментами — липазами, протеазами и амилазами. Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали модифицированные методы учета прямого антагонизма по Murray и Frederiq. Антагонистическую активность микробной культуры оценивали по проценту угнетения и степень прироста тест-культуры при совместной инкубации с культуральной жидкостью антагониста. Для количественной интерпретации данных использовали метод Бухарина с соавторами (патент РФ № 2175673). Конкурентные отношения изучали с помощью трех вариантов микроорганизмов: 1) антагонисты — Pseudomonas alcaligenes; 2) индикаторные культуры — клинические и лабораторные штаммы Staphylococcus aureus и Aeromonas sp.; 3) регуляторы — клинические и лабораторные штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli. В зависимости от степени действия антагониста на культуру эффект оценивался как ингибирующий, индифферентный или стимулирующий. Выявление механизмов конкуренции между псевдомонадами и патогенными микроорганизмами проводили с помощью влияния метаболической активности и компонентов клеточной стенки Pseudomonas alcaligenes на рост индикаторных культур. Метаболизм оценивался по активности ряда литических ферментов: липазы, α-амилазы и протеазы. Активность липазы определяли спектрофотометрическим методом по реакции с паранитрофенилпальметатом (пНФП). За единицу активности принимали количество фермента в 1 мл, которое катализирует освобождение 1 нмоля п-нитрофенола (пНФ) из эмульгированного субстрата (пНФП) за 1 мин при температуре 370 С, т. е. 1 ед. липолитической активности (ЛА) = 1 нмоль × мин-1 × мл-1. Для количественной оценки α-амилазы Ps. alcaligens выращивали на качалке при 30° С в течение 2 суток. Активность ферментов измеряли по методу Шомогьи. Для определения активности протеаз к смеси ферментного порошка с водой прибавляли фосфатный буфер с pH-6,3 и нагревали до 37° С. Отбирали нулевую пробу, к смеси добавляли антисептик. Пробы брали через 2, 4, 8, 24 часа. В нулевой пробе титрованием определяли количество образовавшихся карбоксильных групп. Вычитая из количества щелочи, пошедшей на титрование опытной пробы, количество щелочи, пошедшей на титрование нулевой пробы, получали количество щелочи, израсходованное на титрование карбоксильных групп, образовавшихся при распаде белка под действием фермента за определенный отрезок времени, что характеризовало активность фермента. Концентрирование и очистку компонентов клеточной стенки Pseudomonas alcaligenes проводили с помощью двухразового дифференциального ультрацентрифугирования на центрифуге «MicroCen» со скоростью 14.800 об/мин без охлаждения в течение 20 мин. Частицы сохраняли в буфере ST (10мМ NaCl, 50mM трис-HCl, pH 7,5). Все эксперименты проводили в двух повторностях при трехкратном воспроизведении. Метаболической активностью в отношении липаз обладали все исследованные культуры Pseudomonas alcaligenes. Удельная липолитическая активность у разных штаммов Pseudomonas alcaligenes менялась в пределах от 18,90 до 34,56 ед/мг белка при титре бактерий от 103 до 109 клеток/мл. При изучении амилазной активности установлено, что из исследуемых 20 штаммов Pseudomonas alcaligenes ферментативную активность проявили только 6 культур, что составило 30 % от общего количество исследуемых вариантов. Амилазная активность у изученных штаммов Pseudomonas alcaligenes менялась в пределах от 0,324 ± 0,012 до 0,425 ± 0,014 ед. (мкмоль/мл. мин) при титре бактерий 106 и 105 клеток/мл соответственно. При действии метаболитов Pseudomonas что во всех случаях на alcaligenes антагонистическая клетки S. aureus активность обнаружено, была выше, чем при действии нативного штамма, от 2,5 раз для штамма S. aureus.3 до 6 для S. aureus.7. В отличие от метаболитов, компоненты клеточной стенки псевдомонад оказались антагонистической обнаружен для менее активности штаммов эффективными микроорганизмов, S. aureus.1 и для стимуляции максимальный S. aureus.4 и эффект составлял 2,2, а минимальный 1,15 обнаружен у S. aureus.3. Также при действии метаболитов Pseudomonas alcaligenes на клетки Bacillus subtilis обнаружено, что во всех случаях антагонистическая активность была выше, чем при действии нативного штамма в 0,6; 0,4; 0,5 раз для B. subtilis.1, B. subtilis.2 и пробиотического штамма B. subtilis № 534 соответственно. В результате исследования установлено, что компоненты клеточной стенки Pseudomonas alcaligenes более эффективно стимулируют антагонистическую активность, чем их метаболиты, — от 1,9 раз для B.subtilis.1 до 2,9 раз для B. subtilis № 534. Эффективность действия метаболитов антагониста на Escherichia coli M-17 превышала контрольные значения в 1,2 раза, а компонентов клеточной стенки — в 2,4 раза. Самая высокая антагонистическая активность установлена между Pseudomonas alcaligenes и Aeromonas sp. Продукты метаболизма оказались эффективнее, чем нативный штамм в 5,5 раз, а компоненты клеточной стенки превышали контрольные величины в 4,3 раза (табл. 1). Таблица 1. Антагонистическая активность Pseudomonas alcaligenes Индикаторные культуры микроорганизмов Staphylococcus aureus(n=10) Bacillus subtilis.1 Bacillus subtilis.2 Bacillus subtilis №534 Escherichia coli M-17 Aeromonas sp. При Антагонистическая активность Pseudomonas alcaligenes, % Штамм Метаболиты Компоненты клеточной Pseudomonas Pseudomonas стенки alcaligenes alcaligenes Pseudomonas alcaligenes 13,0 34,5 23,8 21,9 9,4 11,6 исследовании 42,7 36,9 25,9 27,8 11,7 64,2 отношений между 21,9 47,8 39,1 25,1 23,1 49,8 штаммом-антагонистом и чувствительной культурой обнаружена зависимость проявления антагонизма от вида чувствительных культур. Установлено ингибирующее действие Pseudomonas alcaligenes в отношении патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus и Aeromonas sp. Продукция антимикробных веществ активными культурами Pseudomonas alcaligenes происходила только при их культивировании с чувствительным штаммом. Для сильных антагонистов, таких как бациллы, характерно конститутивное проявление признака, слабо зависимое от действия псевдомонад, и такие отношения можно констатировать как индифферентные. Полученные результаты по зависимости проявления антагонистической активности бактерий от чувствительной культуры позволяют заключить, что антагонизм — результат межмикробных отношений между активной и чувствительной культурами. При межвидовых отношениях между псевдомонадами, стафилококком, бациллами, энтеробактериями и аэромонадами наблюдается регуляция процесса как со стороны штаммаантагониста, так и со стороны индикаторной культуры. Регуляцию антагонизма наблюдали по направлениям: индифферентное, стимулирующее, ингибирующее и инвертирующее, т. е. полное ингибирование признака с переключением на стимуляцию роста. Изученные бактерии обладали в основном способностью ингибировать и инвертировать проявление антагонизма. Наиболее выраженно эти свойства проявлялись у аэромонад. Установлено, что антагонистическая активность псевдомонад находится в зависимости от температурного режима (табл. 2). Оказалось, что конкуренция Р. alcaligenes по-разному протекает при температурах 5° С и 21° С. При взаимодействии Р. alcaligenes со стафилококком рост антагониста ускорялся при повышении температуры, и параллельно усиливалась его антагонистическая активность. При изучении влияния температуры культивирования на межвидовые отношения между псевдомонадами и аэромонадами установлено, что низкие температуры вызывают стимуляцию изученных процессов для Р. alcaligenes. Таблица 2. Влияние температуры на антагонистическую активность Стимуляция активности в отношении S. aureus Антагонист 5°С 21°С Р. alcaligenes 2-3 4-7 2 3-4 Р. cichoril 2 3 1 3 Стимуляция активности в отношении Aeromonas sp. Антагонист 5°С 21°С P. alcaligenes 9 7 6 1 P. cichoril 3 3-4 1 1 *числитель — d зоны бактерицидности (см) Знаменатель — d колонии По результатам оценки закономерных различий роста псевдомонад в присутствии стафилококка и аэромонад при разных температурах можно предположить, что одинаковые температурные оптимумы роста микробной культуры (в нашем случае для псевдомонад и аэромонад) вызывают стимуляцию у штамма-антагониста роста и антагонистической активности. Если температурные оптимумы роста культуры имеют разные кардинальные точки (в нашем случае для псевдомонад и стафилококка), то происходит незначительная стимуляция роста и антагонистической активности вида. Результаты исследований по стимуляции конкурентных отношений псевдомонад входят в разработку технологии по созданию новых лечебнопрофилактических биопрепаратов и поддержаны Программой стратегического развития Петрозаводского государственного университета на 2012—2016 гг. Список литературы: 1. Бухарин О.В. Инфекция — модельная система ассоциативного симбиоза // Микробиология. — 2009. — Т. 83. — Вып. 1. — № 6. — С. 47—63. 2. Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовых уровнях: дисс... д-ра биол. наук. — СПб., 2007. — 561 c. 3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках / Учебник. 6-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ: Наука, 2004. — 503 с.
