Диссертация Жабина

1
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«Белгородский государственный аграрный университет имени В.Я. Горина»
На правах рукописи
Жабина Виктория Юрьевна
Экспериментальная и производственная оценка элективных
питательных сред и дезинфектантов при туберкулезе крупного
рогатого скота
06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Научный руководитель:
доктор ветеринарных наук
Коваленко Анатолий Михайлович
Белгород – 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Общая характеристика работы..............................................................................4
1.0. Обзор литературы........................................................................................9
1.1.
Возбудители туберкулеза и его формы изменчивости............................9
1.2.
Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота................14
1.2.1. Аллергический метод диагностики……….............................................15
1.3.
Лабораторные методы диагностики туберкулеза животных................21
1.3.1. Бактериоскопический метод исследования............................................21
1.3.2. Культуральный метод исследования.......................................................22
1.3.3. Патологоанатомический метод исследования........................................23
1.4.
Характеристика эпизоотического процесса при туберкулезе крупного
рогатого скота............................................................................................24
1.5.
Дезинфицирующие
средства
применяемые
для
уничтожения
микобактерий.............................................................................................27
2.0. Собственные исследования......................................................................40
2.1.
Материал и методы исследования...........................................................40
3.0. Результаты исследований.........................................................................47
3.1.
Характеристика эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в Российской Федерации................................................47
3.2. Эпизоотический статус ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с.Васильевка
Ракитянского района, Белгородской области.........................................51
3.3. Динамика выявления животных реагирующих на ППД–туберкулин для
млекопитающих.........................................................................................54
3.4. Эффективность применения молекулярно–генетического теста при
исследовании биоматериала на туберкулез............................................60
3.5.
Результаты
поисковых
синтетической
исследований
элективной
питательной
по разработке
плотной
среды для первичного
выделения микобактерий.........................................................................63
3.6.
Изучение влияния методов предпосевной обработки биоматериала на
3
рост микобактерий, в том числе L–форм при посевах на питательные
среды...........................................................................................................67
3.7.
Изучение
сравнительной
эффективности
дезинфицирующих
средств........................................................................................................71
3.7.1. Изучение выделяемости культур микобактерий из объектов внешней
среды...........................................................................................................71
3.7.2. Изучение
бактерицидных
свойств
анолитов
приготовленных
по технологии «АКВА–ЭХА» в камеральных условиях.......................74
3.7.3. Сравнительное
полученных
изучение
по
дезинфицирующих свойств
технологии
«АКВА–ЭХА»
в
растворов,
условиях
неблагополучного по туберкулезу хозяйства.........................................78
4.0. Обсуждение результатов исследований.................................................82
5.0.Выводы..........................................................................................................93
Практические предложения..................................................................................94
Список сокращений и условных обозначений..................................................95
Список используемой литературы......................................................................96
Список иллюстрированного материла.............................................................121
Приложения
4
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Среди инфекционных болезней человека и
животных особое место занимает туберкулез. С тех пор, когда Р. Кохом был
открыт
возбудитель
туберкулеза,
претерпели
значительные
изменения
положения о развитии и проявлении инфекционного и эпизоотического
процессов (Гулюкин М.И. с соавт. 2011, 2012; Данко Ю.Ю., 1998,1999;
Донченко А.С. с соавт., 1995,1997; Найманов А.Х. с соавт., 2013,2014;
Овдиенко Н.П. с соавт., 1999,2009; Ткаченко А.А., 2000; Шаров А.Н., 1982 и
др.). В 20 веке возросла роль, так называемых атипичных микобактерий и их
роль в патологии животных и людей (Ильинская З.Д., 1973; Каграманов А.И.,
1963; Мартма О.В., 1991; Урбан В.П. с соавт., 1974,1982,1995 и др.). Открытие
L–форм у возбудителя туберкулеза заставило изменить и по новому решать
вопросы диагностики и профилактики, эпизоотологии и эпидемиологии
болезни (Васильев В.Н., 1971; Гертман М.И., 1988; Дорожкова И.Р. 1995; Кузин
А.И., 1978 и др.). Инфицирование организма не всегда приводит к заболеванию.
По данным медицинских исследователей к 20 летнему возрасту практически
все люди инфицированы возбудителем туберкулеза. В тоже время количество
больных на 100 тысяч жителей колеблется от 17 до 50 случаев. Этот сложный
вопрос еще далеко не познан наукой. Нельзя до конца считать решенным
вопрос
о
взаимосвязи
различных
видов
микобактерий:
патогенных,
потенциально патогенных, атипичных и сапрофитов (Агапова М.Ф. с соавт.,
2011; Бойко А.А. с соавт., 1991; Кассич Ю.Я., 1990; Кузин А.И., 1978; Кузьмин
В.А. с соавт., 2012; Урбан В.П. с соавт., 1983; Шаров А.Н., 1982; Щуревский
В.Е. с соавт., 1984 и др.).
Изменения, происходящие во взглядах на развитие инфекционного,
эпидемического
и
эпизоотического
процессов
выделяют
туберкулез
в
отдельную группу болезней, при которой объекты внешней среды имеют
существенно важное значение в возникновении и распространении данной
инфекции. Принимая во внимание, что развитие инфекционного и характер
5
эпизоотического процесса определяют целый комплекс факторов, среди
которых основная роль отводится возбудителю болезни, вопросы диагностики
туберкулеза,
в
диагностики,
части
имеют
аллергического
существенно
и
бактериологического
важное
значение
в
методов
определении
эпизоотического статуса животноводческих хозяйств (Боганец Н.С., 2005;
Донченко А.С. с соавт., 1995;1997; Донченко Н.А., 2004; Ерошенко Л.А. с
соавт., 2001; Ткаченко А.А., 2000; Урбан В.П., 1966;1974;1996 и др.).
Туберкулез относится к заболеваниям, при которых аллергия участвует
как обязательный компонент основного патологического процесса (Авербах
М.М. с соавт., 1976; Найманов А.Х., 1981, с соавт. 2014; Овдиенко Н.П. с
соавт., 1996; Урбан В.П., Данко Ю.Ю., 1983; Урбан В.П., 1966,1982,1983;
Шаров А.Н., 1970 и др.). По своей природе туберкулиновая проба это высоко
специфическая реакция иммунокомпетентных клеток с аллергеном (Авербах
М.М. с соавт., 1976). Неуклонно изменяющиеся условия экологического
баланса, во многом неконтролируемое и бессистемное применение большого
количества
химиотерапевтических препаратов оказывают
влияние на
иммунобиологическую реактивность организма животных. В конечном итоге
наблюдаются сбои в работе иммунной системы. Это проявляется неадекватной
реакцией организма на те или иные средства специфической профилактики и
диагностике. Применительно к аллергической диагностики туберкулеза, по–
прежнему проблемной задачей является своевременное выявление животных с
латентной формой или в начале развития инфекционного процесса (Найманов
А.Х., 2014;).
Еще одной проблемой является низкие ростовые свойства микобактерий
при их культивировании на питательных средах. В рутинной лабораторной
практике
это
существенно
затрудняет
своевременное
выделение
и
последующую видовую идентификацию микобактерий (Аликаева А.П., 1979;
Букова Н.К. с соавт., 2004; Донченко А.С. с соавт., 2000,2006; Евглевский А.А.
2004; Корнева И.Н. с соавт., 2002; Тарасова Е.В. с соавт., 2012 и др.).
Особую значимость в системе мер борьбы с туберкулезом придается
6
дезинфекции помещений и скотных дворов. В настоящее время для
дезинфекции животноводческих помещений, наряду с известными средствами,
предлагается целый ряд новых, качественно улучшенных дезинфектантов
(Аржаков В.Н., 2002,
с соавт., 2004; Березнев А.П. с соавт., 1990, 1994;
Борознов С.Л. с соавт., 2006; Бутко М.П. с соавт., 2003; Высоцкий А.Э. с соавт.,
2006 и др.). Выбор того или иного дезинфектанта определяется не только
рекомендациями
производителей.
Большое
значение
имеют
результаты
независимых экспертиз, в том числе научно–производственных испытаний.
Все вышеизложенные проблемные вопросы приняты нами во внимание и
определили цель и задачи диссертационного исследования.
Цель
и
задачи
исследования.
Целью
исследований
является
экспериментальная и производственная оценка элективных питательных сред
для выращивания микобактерий и новых дезинфектантов для обеззараживания
животноводческих объектов при туберкулезе крупного рогатого скота
В соответствии с целью были обозначены следующие задачи:
1.Изучить эпизоотическую ситуацию и диагностическую эффективность
аллергической диагностической пробы при туберкулезе крупного рогатого
скота.
2.Разработать новую, более эффективную плотную питательную среду
для первичного выделения микобактерий из биоматериала, полученного от
животных убитых с диагностической целью.
3.Провести
сравнительное
изучение
ростовых
свойств
усовершенствованной полужидкой питательной среды Белгородской ГСХА и
среды Дорожковой И.Р. для выделения L–форм микобактерий.
4.В экспериментальных и полевых опытах изучить возможность
применения
экологически
безопасных,
анолитных
дезинфицирующих
растворов, полученных по технологии «АКВА–ЭХА», для обеззараживания
микобактерий туберкулеза.
Основные положения, выносимые на защиту:
7
1. Результаты изучения эффективности аллергической диагностической
пробы при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в условиях ООО
"Семхоз Ракитянский" ММК с. Васильевка, Ракитянского района, Белгородской
области.
2. Плотная синтетическая элективная питательная среда для первичного
выделения микобактерий туберкулеза из биоматериала.
3. Результаты исследований по выделяемости микобактерий из объектов
внешней среды в неблагополучном по туберкулезу крупного рогатого скота
хозяйстве.
эффективности
4.Оценка
применения
новых
анолитных
дезинфицирующих растворов, полученных по технологии «АКВА–ЭХА» в
условиях эксперимента и неблагополучного по туберкулезу крупного рогатого
скота хозяйства.
Научная
новизна.
Разработана
плотная
питательная
среда
для
первичного выделения микобактерий туберкулеза.
Экспериментально и в полевых условиях изучены обеззараживающие
свойства новых экологически безопасных анолитных дезинфицирующих
средств,
приготовленных
по
технологии
Показана
«АКВА–ЭХА».
целесообразность применения в системе противотуберкулезных мероприятий
экологически безопасных анолитов с содержанием активного хлора 250–400
мг/л и рH 5–7.
Практическая
значимость
работы.
На
основании
проведенных
исследований определена эффективность и представлены предложения по
использованию
нового
состава
элективной
питательной
среды
для
выращивания микобактерий туберкулеза; применения новых, экологически
безопасных анолитных дезинфицирующих средств, полученных по технологии
«АКВА–ЭХА» с содержанием активного хлора 250–400 мг/л и рH 5–7.
Апробация работы. Основные положения доложены и обсуждены на:
–
заседании
кафедры
инфекционной
и
инвазионной
патологии
Белгородского государственного аграрного университета (2014–2015);
8
–
конкурсном отборе по программе "Участник Молодежного Научно
Инновационного Конкурса 2011" (УМНИК–2011);
– Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов,
аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений МСХ РФ в ЦФО в
номинации "Ветеринарные науки" (Диплом за победу во II этапе, 2012г.);
–
Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов,
аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений МСХ РФ в
номинации "Ветеринарные науки" (Грамота за III этап, 2012г.);
–
Международной
XXVII
научно–практической
конференции
«Естественные и математические науки в современном мире» НП «СибАК» (г.
Новосибирск, 2015 г.);
–
XI
Международной
научно–практической
конференции
«Стратегические вопросы мировой науки 2015» (Польша, 2015г.).
Публикации
результатов
исследований
По
теме
диссертации
опубликовано 6 научные работы, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных
ВАК РФ.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на
122 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы,
материалы и методы исследований, результаты собственных исследований,
обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения,
список сокращений и условных обозначений, список используемой литературы,
список иллюстрированного материала (всего 228 источников, из которых 44
иностранных). Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 8 рисунками.
9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Возбудители туберкулеза и его формы изменчивости
В настоящее время из окружающей среды, биоматериала от животных и
людей выделено и описано более 300 видов микобактерий. По современной
классификации
микроорганизмов,
микобактерии
относятся
к
роду
Mycobacterium, семейству Mycobacteriaceae, ряда Actinomycetes (Берджи Д.,
1997). Все они кислото – и спиртоустойчивые, хорошо окрашиваются по Циль–
Нильсену, но у некоторых видов микобактерий на определенных стадиях роста
в части клеток это свойство не наблюдают (Авербах М.М., 1976; Аликаева
А.П., 1963; Борисов С.Е., 2001; Борисов Л.Б.. 2005; Вишневский Б.И. с соавт.,
2002; Воробьев А.А., 2001; Донченко А.С. с соавт., 2002,2006; Драбкина О.Р.,
1963; Иртуганова О.А., 2001; Кисиленко В.Н. с соавт. 2007; Козлов В.Е, 2004;
Лазовская А.Л., 1976; Мартма О.В. с соавт. 1991; Модель Л.М., 1958; Олескин
А.В. с соавт., 2000; Azuma I., Kolbel H. K., 1978). Патогенными для животных и
человека
являются
Mycobacterium
tuberculosis,
Mycobacterium
bovis,
Mycobacterium avium.
Mycobacterium tuberculosis – это прямые или чуть изогнутые, тонкие,
длинные палочки (0,3–0,6 мкм на 1–6 мкм) но иногда встречаются очень
короткие или длинные формы. Клетки микобактерий содержат гранулы,
которые расположены на полюсах, а их количество зависит от многих
факторов. Деструктивные по клеточной стенке L–формы МБТ выделяют в
основном из патологоанатомического материала от больных туберкулезом
людей, которых лечили туберкулостатическими препаратами. На плотных
питательных средах рост колоний (субкультур) M.tuberculosis наблюдают на
20–60 сутки, а добавление к среде 5–6% глицерина ускоряет и улучшает их
рост. Микобактерии туберкулеза человеческого вида на плотных яичных средах
вырастают в виде сухих рыхлых, матовых колоний неправильной формы (R–
форма), гладких колоний, сливающихся между собой. На средах с добавлением
бычьей сыворотки и
картофельной среды с добавлением глицерина растут
10
медленно, толстыми складчатыми слоями. Колонии МБТ имеют цвет слоновой
кости, а при старении (60–90 суток) приобретают кремовый цвет. На жидкой
или полужидкой среде рост колоний МБТ появляется на поверхности на 7–14
сутки. Наиболее благоприятная температура роста для этого вида микобактерий
является 37°С, однако они могут вырастать и при 30–34°С (при рН 6,4–7), но
значительно медленнее. При комнатной температуре и при 45°С культура
M.tuberculosis роста не дает. Каталазная активность отсутствует. Реакция с
теллуритом калия отрицательная, а с твин–80 дает иногда положительную
реакцию. Культура обладает выраженной амидазной активностью и является
возбудителем туберкулеза у людей. У зараженных (1 мг/см³) морских свинок
через 30–60 суток вызывает генерализованную форму туберкулеза, а у
кроликов единичные туберкулезные поражения внутренних органов, что и
является основным признаком дифференциации M.tuberculosis от M.bovis
(Донченко А.С. с соавт., 1997; Тупота Н.Л., 2010; Урбан В.П., 1996; Черноусова
Л.Н., 2002; Чичибанин Е.С., 1987,1990; Шаров А.Н., 1982; Beerwerth W., 1976;
Butler, Rey W., 1987; Corner L., 1988; Kopner E., 1933; Tsukamura M.A., 1980;
Valero–Guillen P.L., 1987).
Mycobacterium bovis – это прямые или чуть изогнутые, короткие, тонкие
палочки (0,3–4,6 мкм на 1,5–2 мкм). При микроскопическом исследовании в
середине клеток находят зерна (зерна Муха), которые расположены на краях
микобактерий. Как размер микобактерий, так и количество в них зерен зависит
от возраста культуры и условий их культивирования. Однако, полиморфизм у
микобактерий отмечают не только при выращивании на питательной среде, но
и
при
выделении
их
из
патологического
материала,
где
наряду с
палочковидными формами могут присутствовать и кокковидные, удлиненные
формы. Наиболее благоприятная температура роста для M.bovis 37–38°С. При
посеве с патологического материала на питательную среду Левенштейна–
Йенсена первичный рост колоний этих микобактерий обнаруживают через 1–2
месяца, а иногда и позже. Добавление к яичным средам 8% и более глицерина
подавляет рост микобактерий M.bovis. На плотных питательных средах M.bovis
11
вырастают в виде сухих и бородавчатых колоний (R–форма), а при посеве из
патологического материала на среду Левенштейна–Йенсена как правило
вырастают мелкие круглые, влажные, почти прозрачные колонии цвета
слоновой кости – сплошной рост (S–форма). Культура микобактерий бычьего
вида микроаэрофильная, поэтому в жидкой и полужидкой питательной среде
растет на поверхности среды. При пересевах культура быстро адаптируется в
аэробной среде. При культивировании (t = 25°С и 45°C), на среде с
добавлением 5% хлористого натрия культура МБТ роста не дают, каталазная,
амидазная (с никотинамидом и пиразинамидом) активность и реакция с
теллуритом калия и твин–80 негативные. M.bovis патогенен для крупного
рогатого скота, других домашних и диких жвачных, приматов, хищников и
людей. При внутримышечном заражении морских свинок и внутривенном
кроликов на 30–90 сутки вызывает генерализованную форму туберкулеза
(Ашимова К.К., 1991; Бойко А.А., 1991; Белоусов В.И., 2004; Воробьев А.А.,
2001; Головьев Е.Л., 2001; Донченко с соавт., 2006; Дорожкова И.Р., 1982;
Евглевский Ал.А., 1997; Колычев Н.М., 1987; Кузин А.И., 1992; Лазовская А.Л.,
1976; Найманов А.Х., 2014; Писарев А.И., 2000; Тупота Н.Л. с соавт, 2010;
Kubica G.P., 1981; Lugosi L., 1959; Tragati F., 1977).
Mycobacterium avium – это тонкие, прямые или изогнутые, превышающие
по длине микобактерии бычьего и человеческого видов палочки. В мазках из
одной культуры могут встречаться как незернистые, так и с выраженной
зернистостью микобактерии. Форма и размер микобактерий птичьего вида
зависит от химического состава питательной среды, на котором их
культивировали, продолжительности сроков выращивания культуры и других
причин. В M.avium сильно развит полиморфизм, вследствие чего в препаратах,
окрашенных по методу Циль–Нильсена, оказываются как в виде кокковидных
форм, так и длинных палочек. Рост культуры микобактерий туберкулеза
птичьего вида на плотных яичных средах появляется раньше, чем у культур
микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого видов – на 15–30 сутки.
Колонии, как правило, влажные, мелкие, гладкие, блестящие, маслянистые,
12
имеют вид закругленных бляшек цвета слоновой кости. На плотных
питательных средах иногда образуются кольцевые колонии с валикообразными
краями. При старении культура иногда имеет желтоватый цвет. Оптимальная
температура роста M.avium 40°С, но могут расти, как при комнатной
температуре, так и при 45°С. Микобактерии туберкулеза птичьего вида не
растут на питательной среде с 5% – хлористого натрия, имеют отрицательную
каталазную активность, не гидролизуют твин–80 и имеют положительную
реакцию с теллурит калия и обладают выраженной никотинамидазной и
пиразинамидазной активностью. M.avium патогенен для домашних, диких,
синантропных и зоопарковых птиц и свиней. У зараженных внутривенно
кроликов через 30–60 суток вызывает септическая форму, а у цыплят –
генерализованную форму туберкулеза (Драбкина О.Р., 1963; Иртуганова О.А.,
2001; Кисиленко В.Н. с соавт.2007; Шаров А.Н., 1982; Beerwerth W., 1976;
Kolbel H.K., 1978).
Атипичные микобактерии.
Первую попытку классифицировать эту большую и гетерогенную группу
сделал Е. Раньон в 1959 году. Исходя из пигментообразования и скорости
роста, он разделил микобактерии на четыре группы:
1) фотохромогенные;
2) скотохромогенные;
3) нефотохромогенные;
4) быстрорастущие.
Атипичные микобактерии имеют форму прямых или слегка изогнутых
палочек с закругленными краями, которые окрашиваются по методу Циль–
Нильсена в красный цвет. На синтетических питательных средах они
вырастают быстрее, чем истинные возбудители туберкулеза. Атипичные
микобактерии не прихотливы к элективным питательным средам. Рост колоний
на питательных средах наблюдается на 7–30 сутки и зависит от вида
микобактерий. Оптимальная температура роста – 37°С, но они хорошо растут
как при комнатной температуре, так и t = 45 и 52°С.
13
К первой группе фотохромогенных микобактерий относят культуры,
которые произрастают на питательных средах в течение 20–30 суток при
температуре 37°С. Они не создают пигмент в темноте, но при культивировании
их на свете, или после искусственного освещения создают пигмент желтого или
оранжевого цвета. К этой группе относятся M.kansasii и M.marinum (Оттен
Т.Ф., Васильев А.В., 2005).
Вторая группа – скотохромогенные микобактерии. К ним относятся
микобактерии, рост которых проявляется через 10–20 суток при температуре
37°С в виде гладких, блестящих, маслянистой консистенции колоний.
Особенностью этой группы микобактерий является образование желтого,
оранжевого или терракотового пигмента как на свету так и в темноте. К этой
группе относятся M.scrofulaceum и M.gordonae (Быкова С.Ю., 1994; Ильинская
З.Д., 1973; Каграманов А.И., 1963).
Третья группа – нефотохромогенные микобактерии. Представители этой
группы очень гетерогенные и морфологически полиморфные. Рост культур на
питательных средах при 37°С наблюдается через 10–30 суток после их посева в
виде гладких, блестящих колоний (S–форма), а иногда и шероховатых колоний
(R–форма). Они могут расти и при комнатной температуре, но значительно
медленнее. Микобактерии видов M.avium и M.intracellulare могут расти при 40–
45°С, а M.xenopi при 52°С. Представители этой группы не образуют пигмента,
кроме M.xenopi, которые в процессе роста имеют светло–желтый цвет. Что
касается вида M.intracellulare, то при старении (40–60 день) они могут
приобретать кремовый цвет. К этой группе относятся виды: M.avium,
M.intracellulare, M.terrae, M.gastri, M.triviale, M.nonchromogenicum и M.xenopi
(Литвинов В.И. с соавт., 2008; Осипова Е.П., 2004; Урбан В.П. с соавт.,
1966,1974; Щуревский В.Е., 1984; Lefford M.J., 1975,1984).
Четвертая группа – быстрорастущие микобактерии. При температуре
37°С микобактерии этой группы вырастают через 3–5 суток после посева.
Некоторые виды из них могут расти при t 45°С и 52°С . На питательных средах
вырастают в виде как S–форм, так и R–форм. Среди них есть как
14
пигментированные, так и не образующие пигмента виды. К этой группе
относятся виды: M.fortuitum, M.smegmatis, M.phlei, M.vaccae, M.dienhoferi,
M.flavescens, M.ulcerans, M.peregrinum и M.chelonei (Александров А.А., 2003;
Альшенский М.В., 2004; Vialler I.G., 1973,1976; Zorawski C., 1974,1983,1987).
Все они имеют способность сенсибилизировать организм животных и
птиц к туберкулину, что объясняется их антигенным родством с истинными
возбудителями туберкулеза (Авербах М.М., 1976; Джупина С.И., 1991;
Гулюкин М.И., 2012; Найманов А.Х. с соавт., 2014; Овдиенко Н.П., 1999;
Ackermann L.J., 1974; Contrina N., Vera, 1986).
1.2.Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
Согласно «Наставлением по диагностике туберкулеза животных»,
утверждённого Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации от 18
ноября
диагноз
2002г.,
устанавливается
на
основании
результатов
патологоанатомического, бактериологического, включая биологическую пробу,
аллергического методов с учетом эпизоотологических.
Инфекционный процесс при туберкулезе у животных развивается очень
медленно, первые иммунологические сдвиги могут проявляться не раньше чем
через
год
после
заражения.
Сегодня
клинически
больные
животные
встречаются очень редко. Появление первых клинических признаков зависит от
условий
содержания,
эксплуатации
животных,
степени
вирулентности
возбудителя и места его локализации. Нельзя забывать о влияние различных
стресс–факторов: неполноценное кормление, низкая температура внутри
животноводческих помещений в зимнее время, сквозняки, высокая влажность
(Кузин А.И., 1978,1992; Kaufmann S., 1981; Khansari D.N., 1990.). На характер
развития
болезни
(беременность,
влияет
роды,
и
физиологическое
интенсивная лактация).
состояние
Чаще
животного
всего заболевание
протекает преимущественно хронически (Вишневский Б.И. с соавт, 2002;
Кассич В.Ю., 2004; Урбан В.П., 1982,1996). Острое течение характеризуется
быстрой потерей упитанности, нарушением функции дыхания, поражением
15
наружных лимфатических узлов, желудочно–кишечного тракта, вымени и
других систем и органов.
Такие патогенетические особенности должны быть приняты за основу
при диагностике данной инфекции. Диагностику туберкулеза делят на
прижизненную
и
посмертную.
Среди
предложенных
прижизненных
специфических методов диагностики, заслуживает внимание аллергический
метод диагностики.
1.2.1.Аллергический метод диагностики
В 1890 году Р. Кохом был получен туберкулин и внедрен в медицинскую
практику вначале для терапии туберкулеза у человека, а затем для диагностики
туберкулеза крупного рогатого скота. Клеменс Фон Пирке в 1906 году ввел
понятие "аллергия". Аллергия, сверхчувствительность иммунной системы
организма на повторное введение аллергена. Инфекционная аллергия связана с
участием: бактерий, риккетсий, вирусов грибов, простейших, глистов и
продуктов их жизнедеятельности. Как известно, реакция замедленного типа
свойственна инфекционной аллергии (Авербах М. М., 1976; Chavez P. R., 1984;
Enarson D.A., 2000).
Суть диагностики туберкулеза основана на явлении повышенной
чувствительности
замедленного
типа
организма,
инфицированного
микобактериями, на повторное введение аллергена. У крупного рогатого скота
аллергия наступает через 72 часа в виде повышения местной температуры,
болезненности и разлитой отечности (Урбан В.П. с соавт., 1982,1983; Шаров
А.Н., 1980).
После
признания
аллергической
специфического диагностического
теста,
реакции
не
на
туберкулин
утихают дискуссии
как
среди
исследователей и практиков о степени достоверности метода и методики его
проведения (Кассич В.Ю., 2004). На сегодняшний день в диагностике
туберкулеза
применяют
внутрикожную,
глазную
и
внутривенную
аллергическую реакцию. О благополучии стада судят по показаниям
аллергической диагностической пробы в отношении туберкулеза и степени
16
распространения
туберкулеза
в
неблагополучном
стаде.
Официально
признанным прижизненным методом диагностики, считается внутрикожная
туберкулиновая проба. По мнению большинства авторов, внутрикожная
аллергическая диагностика с использованием специфического аллергена, дает
весьма хорошие результаты при выявлении скрытых форм инфекционного
процесса,
в
достоверно
неблагополучных
по
заболеванию
хозяйствах
(Альшецкий М.В., 2004; Бойко А.А., 1991; Евглевский Ал.А., 1997; Кузин А.И.,
1978,1992). Но за последние десятилетия, данная проба постепенно утрачивала
свою специфичность в связи с возросшим количеством неспецифических
реакций (Евглевский А.А., 2004; Евглевский Ал.А., Дубинин А.Н., 1997;
Trenner
P.,
Из–за
1986).
развития
крупных животноводческих
ферм,
возрастания племенного поголовья, увеличения концентрации животных в
помещениях, увеличения продуктивности, остается нерешенным вопрос о
сбалансировании полноценного кормления животных и создания нормальных
условий микроклимата. Все это, приводят к дисбалансу организма животного с
внешней
средой,
к
снижению
общей
резистентности
поголовья.
К
вышеизложенным неблагоприятным факторам, влияющих на иммунный, в т.ч.
на
аллергический
статус
организма,
прибавились
результаты
научно–
технической революции: постоянный рост количества токсических веществ во
внешней среде, употребление в сельском хозяйстве громадного количества
гербицидов, инсектицидов, минеральных удобрений, широкое применение в
животноводстве антибиотиков, резкое увеличение количества применяемых
вакцин (Урбан В.П. с соавт., 1974, 1982, 1983, 1995).
Урбан В.П. (1995) и Данко Ю.Ю. (1999) отмечают, что даже с активным
туберкулезным процессом выявить всех животных аллергической пробой не
удается, т.е. часть таких животных не реагируют на введенный туберкулин.
Отсюда следует, что отсутствие туберкулиновых реакций у животных не
является гарантией, что данное животное не болеет, а тем более не заражено
возбудителем туберкулеза. По мнению Джупина С.И. (1991), Донченко А.С.
(1995), Кузина А.И. (1978), Найманова А.Х. (2014) исчезновение реакций на
17
туберкулин в оздоравливаемом стаде, где был туберкулез, не дает оснований
для объявления стада благополучным.
Долгие годы в нашей стране применяли одновременно внутрикожную и
глазную туберкулинизацию. Глазная проба имеет ряд преимуществ она более
чувствительна, специфична, не вызывает десенсибилизации, так же выявляет
животных с генерализованной формой туберкулеза, при плохой упитанности, в
период стельности (Тупота Н.Л., 2010). Однако, не смотря на все преимущества
при массовой диагностике, выявляется ряд недостатков: невозможность
применения у животных с воспаленной оболочкой глаза, субъективности
оценки реакции, возможности механического удаления секрета, поэтому
учеными была предпринята попытка ее усовершенствования (Найманов А.Х.,
1990). После многочисленных исследований Найманов А.Х. (1990), доказал,
что
глазная
туберкулиновая
проба
не
может
использоваться,
как
самостоятельная диагностическая проба из–за недовыявления большого
количества больных туберкулезом животных, трудоемкости и длительности ее
выполнения. В связи с этим глазная проба использовалась как дополнительный
и вспомогательный метод при дифференциации неспецифических реакций у
животных реагирующих на ППД – туберкулин для млекопитающих. На
сегодняшний день глазная проба не применяется ни в одной стране мира, в том
числе и нашей, но ее иногда используют в благополучных хозяйствах в целях
отбора животных для диагностического убоя.
Внутривенная туберкулиновая проба, впервые предложена Кальметт (A.
L. Ch. Calmette), Негрэ (Negre) и Боке (Boquet) в 1909г. После этого
эффективность данной пробы изучали многие ученые (Бойко А.А., 1991;
Донченко А.С., 1997; Кузин А.И., 1978). Ими было установлено, что
внутривенная проба является специфичной, но уступает по чувствительности
внутрикожной и глазной пробе, не вызывает сенсибилизации на повторное
введение.
На основании этого рекомендуют применять
туберкулиновую
пробу
как
дополнительный
метод
при
внутривенную
оздоровлении
неблагополучных по туберкулезу стад и предлагают ее для дифференциации
18
неспецифических внутрикожных реакций, обусловленных сенсибилизацией
животных атипичными микобактериями.
Для дифференциации специфических и параспецифических реакций у
крупного рогатого скота в хозяйствах, благополучных по туберкулезу,
применяют симультанную пробу с ППД – туберкулином для млекопитающих и
сухим очищенным комплексным антигеном из атипичных микобактерий
(КАМ).
Использование
симультанной
пробы
основано
на
видовой
специфичности аллергии проявляющейся более выраженными реакциями на
аллерген, родственным по антигенному составу микобактериям, вызвавшим
состояние сенсибилизации (Шаров А.Н., 1982).
Обобщая данные литературы следует отметить, что до настоящего
времени нет однозначной оценки этого диагностического теста, как по оценке
его специфичности, так и по оценке результатов исследований.
Неспецифическая реакция при диагностике туберкулеза животных,
проявляется повсеместно и превращается в актуальную проблему при
диагностике туберкулеза. Существует ряд данных о причинах возникновения
данной
неспецифической
реакции.
Модель
Л.М.
(1958)
говорит,
о
псевдоаллергической реакции на туберкулин для млекопитающих и птиц в
связи не только с инфицированием организма атипичными микобактериями, но
и с нарушением обмена веществ (белковый перекорм концентрированными
кормами). Ряд ученных (Ашимова К.К., 1991; Донченко А.С. с соавт., 1997;
Евглевский
А.А.,
2004;
Лазовская
А.Л.,
1976)
допускали
версию
о
сенсибилизации организма крупного рогатого скота белками и балластными
веществами, входящими в состав мясо–пептонного бульона, на котором
готовился альттуберкулин.
Такие реакции могут возникать вследствие сенсибилизации организма
животных кислотоустойчивыми сапрофитами, наличия глистных инвазий и др.
По наблюдениям некоторых авторов (Мартма О.В., 1978,1991; Найманов
А.Х., 2014) при воздействии на организм стрессовых факторов – резкой смены
условий
содержания,
длительной
транспортировки,
перемены
климата,
19
)
t
стельности и охоты, несоблюдения техники введения препарата, повреждения
кожи, возникают неспецифические реакции на туберкулин. В последние
месяцы стельности и в ранний послеродовой период больные туберкулезом
коровы утрачивают способность к ответным аллергическим реакциям. Как
отмечает ряд авторов (Овдиенко Н.Н., Донченко А.С., 1999), возникновению
аллергических реакций на туберкулин способствуют и такие неспецифические
факторы, как сильное травмирование кожи толстой иглой, попадание
туберкулина прямо в кровеносный сосуд, гнойные или гнойно–некротические
процессы, лепрозная и актиномикозная инфекция и др. (Овдиенко Н.П.,
Найманов А.Х., Нуратипов Р.А., 1995).
О зависимости уровня чувствительности организма к туберкулину и
активности
туберкулезного
процесса
у
крупного
рогатого
скота
нет
единодушного мнения. Ряд исследователей (Ткаченко А.А., 2000; Тупота С.Г.,
2010) отмечают прямую зависимость между интенсивностью внутрикожных
туберкулиновых проб и тяжестью туберкулезного процесса, другие (Урбан
В.П., Данко Ю.Ю., 1983) считают, что по интенсивности внутрикожных
туберкулиновых проб нельзя судить об активности туберкулезного процесса.
Ряд ученных (Вишневский Б.И., Нарвская О.В., Васильева С.Н.,2002)
показали,
что
интенсивность
туберкулиновых
реакций
усиливается
с
нарастанием туберкулезного процесса, а затем резко снижается, хотя
туберкулез продолжает прогрессировать. Большое число исследователей
(Авербах М.М., 1976; Шаров А.Н., 1970,1980,1982; Щуревский В.Е., Овдиенко
А.М., Кадочкин А.А., Кудяков В.Н, 1984) утверждают, что у крупного рогатого
скота реактивность к туберкулину угасает с возрастом, что, вероятней всего,
обусловлено возрастанием функциональной активности Т–супрессоров.
По мере изучения разных методов аллергической диагностики и влияния
на ее специфичность биотических и абиотических факторов изменились
подходы к ее оценке и технологии проведения. В 1925 году была предложена
Британской комиссией двойная внутрикожная туберкулиновая проба. Позже
(1947), эта же комиссия. доказала что, однократное введение туберкулина,
20
обладает такой же ценностью, что и двукратное. Постепенно данный метод
применили в Америки, Африки и Западной Европе. На сегодняшний день
двукратная внутрикожная проба не применяется не в одной стране мира. В
СССР после доклада Вишневского П.П. в 1926 году предложена двойная
внутрикожная проба. Считалось, что данный метод повышает выявляемость
больных туберкулезом животных, что дало право авторам рекомендовать
повторное введение туберкулина в одном цикле исследований. На сегодняшний
день споры о кратности внутрикожного введения идут только в России. Урбан
В.П., с соавт.(1974) утверждают что при многократном введении ППД –
туберкулина с интервалом 45 дней сокращается число животных, реагирующих
на первичное введение туберкулина и увеличивается реагирующих на
повторное. При повторном введении туберкулина авторы дополнительно
выявили 29–60% больных туберкулезом животных. Однако Найманов А.Х.,
1981; Шаров А.Н., 1982, рекомендуют применять однократное введение ППД –
туберкулина так как повторное введение является неспецифичным.
Со
времени
приготовления
первого
препарата
для
диагностики
туберкулеза предложено было целый ряд туберкулинов. Основные из них –
альттуберкулин и очищенный ППД – туберкулин для млекопитающих. Проводя
сравнительное изучение ППД и альттуберкулинов для млекопитающих на
крупном
рогатом скоте
большинство исследователей
(Овдиенко
Н.П.,
Найманов А.Х., 1996; Овдиенко Н.П., Донченко А.С., 1999) нашли, что ППД –
туберкулин более специфичен.
В последние годы исследователями (Евглевский А.А., 2005) был
предложен качественно новый туберкулин для диагностики туберкулеза –
безальбумозный, активность которого, по мнению автора на 20% превосходит
таковую у ППД – туберкулина в пересчете на содержание аллергеноактивных
веществ.
Такое обилие противоречивых взглядов на механизм неспецифических
реакций и на степень специфичности разных туберкулинов требует проведения
дальнейших исследований.
21
1.3.Лабораторные
методы
диагностики
туберкулеза
животных
Бактериологические исследования на туберкулез проводятся, только в том
случае
если
туберкулезные
у
реагирующих
изменения
в
на
туберкулин
животных
отсутствуют
органах.
Используют
паренхиматозных
бактериологический метод для выделения культур микобактерий, определений
их видовой принадлежности. Они включают в себя бактериоскопию мазков
отпечатков, культуральный и биологические методы (Найманов А.Х., 1989).
Существенным
недостатком
бактериологического
метода
является
длительность исследований, медленный рост микобактерий (не менее 3
месяцев), большая продолжительность постановки биопробы и низкая
эффективность культурального исследования.
1.3.1.Бактериоскопические метод исследования
Бактериоскопию проводят в основном из биоматериала, где присутствуют
кислотоустойчивые микобактерии. Данный метод иногда используют для
прижизненной диагностики туберкулеза (микроскопии молока, бронхиальной и
носовой слизи), но в основном он применяется при проведении послеубойных
исследований
патологоанатомического
патологоанатомических
изменений.
материала
Простота
при
исследований
отсутствии
мазков–
отпечатков, полученных из лимфатических узлов и паренхиматозных органов
одно из главных преимуществ данного метода. Поскольку бактериоскопия дает
положительные результаты при содержание в 1 мл биоматериала не менее 100
тыс. микобактерий, то
большинство авторов данные ограничения метода
считают значительными (Донченко Н.А. с соавт., 2004; Иртуганов О.А., 2006;
Скородумов Д.И., 2005).
Данный метод не дает возможности дифференцировать различные виды
микобактерий, указывая лишь на их наличие в данном биоматериале.
Существенным
недостатком
дополнительно
является
то,
что
кислотоустойчивостью обладают микроорганизмы рода: Rhodococcus, Nocardia,
Legionella (Tsukamura, M., 1978).
22
Василев В.Н. (1971) указывая на то, что микобактерии окрашиваясь в
красный цвет по методике Циль–Нильсена не всегда имеют однородную
окраску, так как разные виды микобактерий в своей клеточной оболочке
содержат разные количества липидов и миколовых кислот. Колычевым Н.М.
(1985)
была
предложена
методика
концентрирования
микобактерий
в
исследуемом материале методом флотации. Более чувствительным считается
люминесцентный метод микроскопии, основанный на способности адгезии
липидов с флуорохромами при облучении ультрафиолетом. Донченко Н.А.,
(2004) и Иртугановым О.А., (2006) было отмечено, что микобактерии
туберкулеза дают своеобразное свечение и хорошо видны в темном поле.
Следовательно, полученные положительные результаты люминесцентной
микроскопии не могут быть основанием для остановки окончательного
диагноза на туберкулез и должны быть подтверждены культуральными,
биологическими или молекулярно–генетическим методам.
1.3.2.Культуральный метод исследования
Данный метод исследования базируется на способности микобактерий
рекультивироваться на различных питательных средах. Метод позволяет
получить изоляты микобактерий для дальнейшей их идентификации, изучения
фенотипических,
молекулярно–генетических
особенностей.
Патогенные
микобактерии в большинстве своем содержат малое количество ферментов и
веществ стимулирующих их рост и требуют обогащения питательных сред
(Донченко А.С. с соавт., 2000; Ерошенко Л.А. с соавт., 2001; Тупота Н.Л.,
2010). Репродукция популяций микобактерий происходит в течение 18–24
часов (Ощепков В.Г., Таллер Л.А., 2010). Преимущество культурального
метода заключается в том, что он в состоянии на специальных питательных
средах выделить микобактерии, как с различным уровнем патогенности, так и
совершенно безобидных сапрофитов, данный метод позволяет накопив
культуральную
массу
биохимические
свойства
определить
микобактерий,
вирулентность,
наличие
биологические,
миколовых кислот
генетических маркеров (Колычев Н.М., Ощепков В.Г., 2001).
и
23
Поскольку в микобактериях происходят очень медленно обменные
процессы,
что
питательных
сопровождается
средах,
то
естественным
существуют
медленным
определенные
ростом
сложности
на
при
использование культурального метода. По данным Драбкиной Р.О. (1963),
критерий чувствительности данного метода является нахождение в 1 мл от 20
до 100 микобактерий. Ранее Аликаевой А.П. (1963) и Кузиным А.И. (1978)
было предложено для обработки биоматериала перед его посевом использовать
2–4% или 8–10% растворы серной кислоты. Но позднее (Кадочкиным А.М.,
1984, Тажгалиевым Н.М., 1987) предположили, что эффективнее использовать
серную, соляную и щавелевую кислоты.
Для повышения элективных свойств питательных сред были предложены
биологически–активные
добавки,
по
мнению
авторов
оказывающее
достоверное стимулирующие воздействие на рост микобактерий. В мировой
практике используется радиометрическая система BAKTEC, для быстрого
обнаружения МБ в жидкой питательной среде (Оттен, Т.Ф., Васильева А.В.,
2005).
Подытожив выше изложенные данные необходимо отметить, что в
ветеринарной
фтизиатрии
постоянно
ведутся
исследования,
как
по
совершенствованию методов предпосевной обработки так и созданию
высокоэлективных питательных сред для выращивания микобактерий.
1.3.3.Патологоанатомический метод исследования
Для патологоанатомической диагностики туберкулеза крупного рогатого
скота
чаще
всего
используют
лимфатические
узлы,
где
содержаться
творожистые некротические желтоватого цвета с содержанием извести
уплотненные очажки. Данный метод исследования является основным в
большинстве государств мира для первичной диагностики туберкулеза.
Недостатком данного метода является то, что в некоторых случаях
патологоанатомические изменения у убитых животных не проявляются
вышеперечисленными
изменениями,
что
обусловлено
волнообразным
течением, как инфекционного, так и патологического процесса. Многие
24
исследователи считают, кровоизлияние в лимфатических узлах началом
инфекционного процесса, хотя это довольно полемические
утверждения
(Ильинская З.Д., 1973; Найманов А.Х., Гулюкин М.И., 2014). Туберкулы
имеющие в основном округлую форму светло серо–желтого оттенка плотные
на ощупь, с творожистой массой в центре, обизвестленые в большинстве
случаев окружены плотной соединительной тканью (Якушева О.В., Суворов
B.C., Колоскова Э.Л., 2004). Согласно инструкции по диагностике туберкулеза
осмотру подвергают заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные
предлопаточные брыжеечные, надвыменные, портальные лимфатические узлы
и паренхиматозные органы: легкие, селезенка, печень, плевра, брюшина,
кишечник и молочная железа. Туберкулез поражает любые органные и
тканевые
структуры.
При
генерализованной
форме
туберкулеза
патологоанатомические изменения наблюдаются в матке, яичниках, кишечнике,
костной ткани, коже и подкожной клетчатке.
1.4.Характеристика
эпизоотического
процесса
при
туберкулезе
крупного рогатого скота
Хотя о туберкулезе известно с давних времен и с момента открытия
Робертом Кохом (1882) прошло много времени – туберкулез остается особо
опасным и широко распространенным заболеванием. К данному заболеванию
восприимчив человек, домашние и дикие животные в т. ч. и птицы.
Борьба с туберкулезом, как и с любой инфекцией должна вестись с
помощью выявления источника возбудителя инфекции (Global tuberculosis
control, 2008).
Источник возбудителя инфекции – это первичное звено эпизоотической
цепи. Зараженный организм в котором происходит размножение, сохранение и
накапливание возбудителя,
т.е. больное животное – является источником
возбудителя инфекции при туберкулезе. Необходимо учитывать, что не только
животные могут переносчиками туберкулеза, но и человек. Так в Московском
зоопарке, очень остро стояла проблема заражения приматов, где источником
инфекции служил обслуживающий персонал и посетители (Альшинецкий М.В.,
25
2004). Очень часто регистрируют заболевание у диких животных: барсуков,
лисиц, львов, гепардов, оленей, бурых медведей. Поэтому в 1996 году
международное эпизоотическое бюро, потребовало наблюдать за дикими
животными и убивать их при обнаружение заражения в целях сохранения всего
вида.
Важную роль помимо источника возбудителя инфекции играет, передача
инфекции от больного животного к здоровому, т.е. механизм передачи
возбудителя (Яременко Н.А., 2002). Основной путь заражения туберкулезом
является аэрогенный и алиментарный. Есть данные, что инфицирование может
происходить внутриутробно, через кожу, соски вымени (Кузин А.И., 1978). При
заражение у крупного рогатого скота поражаются лимфатические узлы,
кишечник. Инкубационный период длится от нескольких месяцев до года, это в
первую очередь зависит от физиологического состояния организма, его
содержания и кормления. Так как при туберкулезе локализация М.bovis
происходит во всем организме, то и выделение возбудителя происходит
множественно (с мокротой при кашле, фекалии, молоко). Объекты внешней
среды служат лишь факторами передачи инфекции, так как не могут быть
средой обитаний микобактерий. Хотя в тоже время при выделение их из
организма
больного
животного
сохраняется
их
вирулентность
и
жизнеспособность: в навозе – до 7 месяцев; в трупах – до года; в почве – более
двух лет; в мясе – до года (Кузин А.И., 1992). Их устойчивость к воздействию
различных физических и химических факторов, объясняется
строением
клеточной стенки и высокого содержания в ней липидов и восков. Поэтому
контаминированные объекты внешней среды–воздух, почва, вода, корма и
продукты животноводства играют важную роль в возникновении новых очагов
туберкулеза.
Особое
значение
в
распространении
туберкулеза
имеет
месторасположение больных животных. Некоторыми учеными (Деканосидзе
Т.В., 1989; Дудницкий И.А. с соавт., 1989) удалось выделить из старых
кормушек микобактерии с утраченной вирулентностью, но при наличии
26
восприимчивых животных и определенных условиях эта инфекция могла
проявиться снова. Таким образом, повторное возникновение эпизоотического
процесса
может
быть
обусловлено
как
присутствием
латентных
микобактерионосителей, так и объектов внешней среды, контаминированных
МБТ (Смолянинов Ю.И., 1994; Солодова И.В., 2011). Говоря об атипичных
микобактериях, то они свободно размножаются в окружающей среде (почве,
воде). Атипичные микобактерии выделяют из почвы лугов, пастбищ,
скотоводческих угодий, проб соломы, силоса, сена и сенажа, комбикорма, с
овощей из проб торфа, деревьев, а также водоемов, колодцев и водопроводной
воды.
При определенных условиях атипичные микобактерии, попадая в
организм животных могут приживаться в нем, вызывая сенсибилизацию к
туберкулину. Это объясняется антигенным родством их с возбудителем
туберкулеза, тем самым давая перекрестную реакцию с туберкулином. Что
подтверждается
выделением
их
из
патматериала
убитых
животных,
реагирующих на туберкулин (Тупота С.Г., 2010; Шаров А.Н., 2002). Таким
образом, в естественных условиях – очень распространенным явлением бывает
сенсибилизация
крупного
рогатого
скота
атипичными
микобактериями
(Щуревский В.Е. с соавт., 1984). В некоторых случаях некоторые виды
атипичных
микобактерий
могут
вызвать
классические
туберкулезные
поражения (MAIS).
Учитывая
большую
устойчивость
микобактерий
туберкулеза
к
воздействию различных физических, химических факторов и длительную
жизнеспособность в различных объектах окружающей среды, то факторы
передачи представляющие угрозу возникновения новых случаев вспышек
требуют особого внимания при разрыве эпизоотической цепи.
В
борьбе
с
туберкулезом
благодаря
оздоровительным
противотуберкулезным мероприятиям достигнуты большие успехи. Широкое
распространение туберкулезной инфекции среди крупного рогатого скота
наблюдалось в первые десятилетия ХХ века, когда в большинстве стран
27
Западной Европы было обнаружено до 90% неблагополучных хозяйств, а
пораженность животных в них достигала более 70% (Legosi L., 1959).
Так
в
годы
50–60
благодаря
проведению
масштабных
противотуберкулезных мероприятий количество неблагополучных пунктов
снизилось до 50%. К 1984 году количество стран, свободных от туберкулеза
увеличилось до 25%. В 1985 году не регистрировали случаев заболевания
животных туберкулезом в 35 странах, а в 1987 году в 55 странах. В некоторых
случаях оздоровление неблагополучных по заболеванию туберкулезом хозяйств
происходило от 40 до 80 лет(Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Солодова И.В.,
2004). Но после оздоровления поголовья крупного рогатого скота в некоторых
странах заболевания животных туберкулезом возникало повторно (Овдиенко
Н.П., Ведерников В.А., Найманов А.Х., Пыталев П.Н., 1990). Причиной этому
были присутствие в стадах 1–3% больных животных, которые оставались в
состоянии анергии, а также инфицированные дикие животные.
Анализ литературных данных показал, что вопрос устойчивости
возбудителей туберкулеза в объектах внешней среды еще остается открытым,
так как данные по этой теме носят очень разносторонний характер, в связи с
чем
невозможно
жизнеспособности
сделать
и
окончательный
патогенности
окружающей среде. Изучение этого
вывод
различных
о
видов
сроках
хранения
микобактерий
в
вопроса даст более объективное
представление о возбудителях туберкулеза и позволит разработать систему
противотуберкулезных и ветеринарно–санитарных мероприятий, настроенных
на уничтожение патогенных микобактерий в объектах внешней среды.
1.5.Дезинфицирующие средства, применяемые для уничтожения
микобактерий
Химические методы дезинфекции наиболее доступные и широко
применяются в практической ветеринарной медицине с использованием
различных химических соединений чаще всего в виде водных растворов, и реже
– в виде твердых или сыпучих веществ, аэрозоля, газа (Поляков А.А., 1975;
Schlisser, T., 1979).
28
Водные растворы дезинфектантов чаще применяют путем орошения
поверхностей, подлежащих обработке (мокрый способ), или замачивания
инвентаря в емкостях. При этом для полной обработки поверхностей тратят от
1 до 2 л/м² дезинфицирующего раствора при экспозиции не менее 3 часов
(Вранчан З.Э.,1957; Гежес И.Б. и соавт., 1988; Леви М.И., и соавт., 1988; Collins
F.M., 1986; Shopiro D., 1984)
В промышленном животноводстве и птицеводстве широкого применения
приобрел метод дезинфекции путем мелко–капельного распыления. Этот метод
позволяет снизить затраты дезинфицирующих препаратов до 0,2–0,5 л/м² в
результате
равномерного
нанесения
раствора.
Одним
из
путей
совершенствования химического метода дезинфекции является применение
аэрозолей. При их использовании достигается одновременное обеззараживание
поверхностей и воздуха помещений, при этом расходы дезинфицирующего
средств уменьшаются в 3–5 раз (Борознов С.Л., 2006; Боченин Ю.И., 1986;
Дудницкий И.А. с соавт., 1988,1989; Закомырдин А.А. и соавт., 1990; Bonini, V.
Loosan, 1985).
Применяемые дезинфицирующие средства в дезинфиктологии должны
отвечать следующим требованиям: иметь широкий спектр антимикробного
действия (включая штаммы особо устойчивых микроорганизмов), быстро
инактивировать патогенные микроорганизмы, сохранять стабильность при
хранении и транспортировке, хорошо растворяться в воде, быть нетоксичными,
не владеть коррозионными свойствами, быть экономичными, экологически
чистыми,
безопасными
для
обслуживающего
персонала
и
животных,
устойчивыми к органическим нагрузкам, простыми в приготовлении и
применении (Поляков А.А., 1975,1983; Siebert, J., 2001; Steiger, A.. 1978).
Характеристики,
на
основании
которых
выбирают
эффективные
дезинфицирующие средства, включающие в себя, прежде всего, спектр
антимикробной активности с учетом действия не только на возбудителей
кишечных и кокковых инфекций, а также бактерицидный эффект в отношении
микобактерий туберкулеза (Закомырдин А.А., 1990; Поляков А.А., 1986).
29
Требования, предъявляемые к дезинфицирующих препаратам, резко
ограничивают круг применения химических соединений, которые могут быть
использованы
для
проведения
противотуберкулезных
мероприятий
туберкулезной инфекции (Костина Г.И., 1981).
Вместе с этим, для проведения профилактической и вынужденной
дезинфекции в животноводческих помещениях применяют следующие группы
препаратов:
1. Фенольные соединения – обладающие высокой активностью в
отношении вегетативных форм бактерий, грибов, микобактерий и оболочечных
вирусов. Особенностью фенольных препаратов является их способность
образовывать пленку на продезинфицированных поверхностях и длительное
время действовать на патогенные и условно патогенные микроорганизмы
(Поляков
А.А.,
комплексные
1975).
Фенольные
соединения
с
препараты
способны
полисахаридами
образовывать
клеточной
стенки
микроорганизмов и нарушать при этом ее свойства (Вашков В.И., 1977; Кравец
А.Т. и соавт., 1986).
Для уничтожения микобактерий в окружающей среде применяют
карболовую кислоту в концентрации от 2 до 5% при экспозиции 15–30 минут.
Эффективные бактерицидные свойства в отношении возбудителей туберкулеза
имеет феносмолин – препарат получаемый из фенольной смолы, является
промежуточным продуктом фенол–ацетонового производства, содержащий
смесь различных фенолов, ароматических углеводов, высокомолекулярных
соединений. Колычевым Н.М. (1984, 1985, 1987) и Кузиным А.И. (1978, 1992) в
эксперименте доказано, что при однократном применении 8% эмульсии
феносмолину и расходе 1 л/м², или 0,5–1 л/м² двукратно при экспозиции 1 час, а
во время обеззараживания почвы из расчета 10 л на 1 м² по 24–48 часов
происходит полная девитализация возбудителей туберкулеза M.bovis и
M.avium.
Крезоловые и мыльно–карболовые смеси
также используют для
дезинфекции при температуре рабочего раствора 50°С–80°С в концентрации 1–
30
2% и экспозиции 6 часов. Раствор серно–крезоловой смеси в 10% концентрации
при
температуре
обеззараживает
40°С
объекты,
контаминированные
микобактериями туберкулеза при суточной экспозиции (Аржаков В.Н., 2002;
Аржаков В.Н., и соавт. 2002).
Однако группа этих препаратов, обладают неприятным едким запахом,
токсичностью,
раздражающим
и
сенсибилизирующим
действием,
канцерогенностью.
2.
Кислородные
соединения
широко
применяются
в
мировой
ветеринарной практике. Они проявляют широкий спектр бактерицидной
активности, способные растворять кровь и многие другие биологические
субстраты, хорошо коагулируют белок, не имеют запаха, быстро распадаются в
окружающей среде на нетоксичные продукты. Препараты этой группы
являются сильными окислителями, основным действием которых является
образование свободных радикалов, нарушающих липидный обмен в мембране
клеток, ДНК и другие важные компоненты микробной клетки. Несмотря на
репродукцию многими микроорганизмами каталазы, которая защищает клетку
от воздействия перекисных соединений путем разложения их на воду и
кислород, концентрации, используемые при дезинфекции, позволяют, в
большинстве случаев преодолеть этот механизм резистентности.
Наиболее известный препарат этой группы – перекись водорода. Его
применяют в 3–10% концентрации для аэрозольной дезинфекции, а 6%
концентрация активна для споровых форм микроорганизмов.
Основными отрицательными свойствами применения препаратов данной
группы
является
резорбтивным
тканевая
действиями,
токсичность
вызывая
при
с
местно–раздражающим
этом
коррозию
металлов
и
и
обесцвечивание тканей.
3.
Хлорные
соединения
являются
традиционными
средствами
дезинфекции при туберкулезе (Дудницкий И.А., 1989; Кассич Ю.Я. и соавт,
1990). Они обладают высокой антимикробной активностью за счет воздействия
на
процессы
окисления,
вызывая
угнетение
некоторых
важных
31
ферментативных реакций
в микробной клетке,
денатурацию
белка
и
нуклеиновых кислот (Беляев И.Я., 1989; Меньш А.Ф., 1984,1994;).
В соответствии с историческими этапами разработки, изучения и
особенностями химического строения среди этих соединений выделяют три
поколения дезинфицирующих средств на основе хлора, которые существенно
отличаются друг от друга (Колычев Н.М., 1984,1985,1987;)
К первому поколению относится хлорная известь, промышленностью
выпускается в двух марках: А и Б. По количеству активного хлора каждая
форма подразделяется на три сорта. В хлорной извести марки А первого,
второго и третьего сортов содержится хлора соответственно 28, 25 и 20%, а в
препарате марки Б – 35, 32 и 27%. Обеззараживающим действием в отношении
микобактерий туберкулеза имеет осветленный раствор хлорной извести,
содержащий 5% активного хлора при 3–6 часовой экспозиции, 20% взвесь
свежегашеной извести при трехкратном нанесении с часовым интервалом и
экспозицией 6 суток (Меньш А.Ф., 1984,1994; Поляков А.А., 1986; Туренгбаев
К.А., 1989; Шеина И.В., 1982; Hahesy T., 1992).
Второе поколение представлено хлорамином Б. Большинство препаратов
в которых действующим началом являются хлорамин Б, не обладают
туберкулоцидными
свойствами.
Достаточную
активность
в
отношении
микобактерий приобретают активированные аммиаком, сернокислым или
хлористым аммонием растворы хлорамина Б, препараты «Клорина» и
«трихлороль» при 6–часовой экспозиции (Арзуманян С.П., 1993; Барабанов
И.И., 1987; Дудницкий И.А., 1989; Кассич Ю.Я., 1990; Поляков А.А., 1975;
Садыкова В.И., 1983).
Несмотря на большое количество разработанных хлорсодержащих
препаратов, надо заметить, что они имеют: резкий запах, раздражают слизистые
оболочки глаз и верхних дыхательных путей, вызывают коррозию металлов,
обесцвечивают окрашенные изделия, имеют низкую стабильность при
хранении.
32
К третьему поколению относятся средства дезинфекции, которые в
качестве действующего вещества содержат хлороз циануровую кислоту или
хлорпроизводные
гидантоина
1974,1983,1987)
Они
(Архипов
или
их
О.П.,
1949,1948;
композиционный
Zorawski
состав,
C.,
имеют
модернизированную форму выпуска, что позволяет значительно снизить их
отрицательные качества. Препараты этой группы имеют широкий спектр
противомикробной активности, включая микобактерии туберкулеза.
4. Группа спиртов. Насчитывается около 14 видов спиртов, входящих в
состав
дезинфицирующих
применение
получили
препаратов,
этиловый
и
но
наибольшее
изопропиловый.
практическое
Механизм
их
антимикробного действия сводится к денатурации структурных и ферментных
белков микробной клетки. В концентрации 60 – 90% они активны в отношении
вегетативных форм бактерий, микобактерий, грибов и оболочечных вирусов.
Отрицательным действием их является то, что спирты не имеют моющих
свойств, фиксируют органические загрязнения и могут портить изделия из
пластмасс и резины. В таких препаратов быстро снижается концентрация
действующего вещества в результате быстрого испарения (Аржаков П.В.,
2002,2004; Березнев А.П., 1990; 1994; Бурганов З.Б., 1995; Волков Ю.П., 1992;
Высоцкий А.Э., 2002; Высоцкий А.Э., и соавтр.,2006; Тихонов П.М., 1979).
Применение спиртов в чистом виде для дезинфекции экономически
невыгодно, поэтому их вводят в рецептуры современных комбинированных
средств: «Декосепт», «Деконекс», «Соларсепт», «АХД 2000», «Хоспидермин».
Для дезинфекции животноводческих и птицеводческих помещений
применяют однохлористый йод, 5% спиртовой раствор йода, йодоформ и
йодинол используют для очистки и дезинфекции кожи. Аэрозоль йодистого
алюминия применяют методом возгонки, что позволяет снизить бактериальную
загрязненность воздуха в 3–10 раз.
Негативом применения препаратов этой группы относятся появление
йодостойких штаммов бактерий, снижение антимикробной активности при
наличии белкового субстрата, токсичность, сенсибилизирующие свойства,
33
дубящие
и
прижигающие
действия
на
ткани
организма,
развитие
гиперчувствительности (Кузин А.И., 1992).
Альдегиды – высокоактивные соединения с высокими антимикробными
свойствами ко всем видам микроорганизмов, механизм действия которых
направлен на алкилирование амино – и сульфгидрильных групп протеинов и
подавления их синтеза. Альдегиды достаточно широко используются для
дезинфекции. Среди них наибольшее распространение получили формальдегид,
глутаровый и ортофталевый альдегиды (Ощепков В.Г., 2002; Stonchill, A.A.,
Krop S., Borick P.M., 1963; Strauch, D. J., 1987)
Формальдегид (альдегид муравьиной кислоты) характеризуется высокой
антимикробной активностью. Этот препарат инактивирует микроорганизмы
благодаря высокой реакционной способности.
Высокие
бактерицидные
свойства
в
отношении
микобактерий
туберкулеза имеет щелочной раствор формальдегида, содержащий 3%
формальдегида и 3% едкого натра. Эта композиция активна при норме расхода
0,5 л/м², а при обработке объектов с органическим загрязнением – 0,75 л/м² .
Щелочной формальдегид уничтожает возбудителя туберкулеза M.bovis за
60 минут, тогда как большинство атипичных микобактерий устойчивы даже до
5% концентрации щелочного формальдегида и по более длительной экспозиции
(несколько часов). Данная композиция препарата при минусовой температуре
не уничтожает микобактерии туберкулеза в течение 30 часов. Обеззараживания
навоза овец от неспорообразующих патогенной микрофлоры достигается при
расходе 3 кг формальдегида на 1 м³ навоза при экспозиции в течение 72 часов.
Дезинфекцию спецодежды при туберкулезе проводят путем его погружения в
4% раствор формальдегида не менее 4 часов (Березнев А.П., и соавт.,
1990,1994).
Униполярная электрохимическая активация жидких сред. На сегодняшний день
исследователи особое
внимание
уделяют новому научно–техническому
направлению униполярной электрохимической активации воды.
34
Основу
электрохимической
электролиза,
однако
электрообработки
техника
активации
и
жидкостей
в
сред
технология
значительной
составляют
проведения
степени
процессы
униполярной
отличаются
от
традиционных техники и технологии, используемых в электрохимических
(электролизных) производствах (Бахир В.М., Задорожний Ю.Г., Леонов Б.И.,
Паничева С.А., 1999). Электрохимическая активация основана на ранее
неизвестном свойстве растворов, подвергнутых анодному или катодному
воздействию на инертном электроде, переходить в длительно существующее
неравновесное состояние и проявлять в этом состоянии каталитическую
активность и повышенную реакционную способность в окислительно–
восстановительных и кислотно–основных реакциях (Бахир В.М., 1990).
Электрохимическая активация (ЭХА) жидкости осуществляется в
диафрагменных электроактиваторах (электролизерах).
Сущность способа получения жидкости с электроактивными свойствами
заключается в том, что при обработке жидкости, в частности, обычной
водопроводной
водой,
в
зоне
основного
электрода
диафрагменного
электролизера в режиме максимального перенапряжения электрода происходит
изменение ее свойств, резко отличающихся от изменений, происходящих при
обычном электролизе. Жидкость после униполярного электрохимического
воздействия определенное время находится в метастабильном состоянии,
характеризуемом аномальными значениями активности–повышенным уровнем
внутренней
потенциальной
энергии;
если
активированная
жидкость
используется в каких–либо химических реакциях до завершения релаксации, то
наличие избытка внутренней потенциальной энергии может существенно
повлиять
на
скорость
и
другие
параметры
таких
реакций.
Электроактивированные жидкие среды в последние годы нашли широкое
применение в различных отраслях народного хозяйства, в том числе: в
нефтяной и газовой промышленности, строительной технике, сельском
хозяйстве, в медицине (Бахир В.М., 1999).
35
Мы знаем, что технологические растворы используются в качестве
реагента или среды для протекания физико–химических реакций. Их
реакционная способность определяется кислотно–основными и окислительно–
восстановительными свойствами. Обычно, эти свойства растворам придают
добавки
химических
веществ.
В
отличие
от
вышеупомянутого,
электрохимическая активация позволяет без использования химических
реагентов
регулировать
кислотно–основные
и
окислительно–
восстановительные свойства растворов, что дает возможность его широкого
применения.
Оценка бактерицидной активности дезинфектантов.
Для определения бактерицидных свойств дезинфектантов предложены
следующие методы: чашечный, диффузный, суспензионный и метод носителей.
Чашечный метод первичной оценки бактерицидов основан на известном
методе
определения
антибиотикочувствительности
микроорганизмов
с
некоторой его модификацией.
Суть метода вертикальной диффузии заключается в способности
дезинфектантов вызвать задержку или остановку роста суточной культуры
микобактерий, которые растут в пробирке на плотной питательной среде при
воздействии на нее препарата в заданной концентрации (Аленькин Б.Ф., 1977).
Базовым методом определения бактерицидной активности химических
дезинфектантов в отношении микобактерий является суспензионный метод в
различных вариантах и модификациях. Его суть заключается в том, что в
разные разведения дезинфицирующего препарата непосредственно вносят
взвесь микобактерий. После выдерживания заданной экспозиции и с
последующей нейтрализацией продукта осадок высевают на питательную среду
и инкубируют (Bergan T., Lystad A., 1971; Parkinson E., 1981).
Наиболее распространенным является метод носителей. Он основан на
контаминации
нанесением
бактериальной
бактериальной
взвесью
дезинфицирующего
взвеси
используют
тест–объектов
препарата.
бязевые,
В
с
последующим
качестве
батистовые
носителей
тест–объекты,
36
предметные стекла, оргстекло, металлические цилиндры, стеклянные трубки,
деревянные бруски и цементную плитку (Дудницкий И.А., 1977; Колычев Н.М.,
1987; Модель Л.М., 1958; Платонов Г.И., 1975; Reybrouck G., 1982).
С
целью
определения
чувствительности
микроорганизмов
к
дезинфицирующим препаратам предложена методика диффузии в агаре с
применением лунок (вырезанных в толще агара) и цилиндриков, наложенных
на поверхность среды, содержащей различные концентрации препарата, а
также
метод
диффузии
с
дисками
на
агаре.
При
определении
антибактериальной активности дезинфицирующих средств и возможной
резистентности бактериальных культур также применяется методика с
использованием цветных питательных сред (Дудницкий И.А., Шуваева О.Н.,
1977; Bergan T., Lystad A., 1971; Konig, K., 1974).
В
случае
получения
положительных
результатов
бактерицидного
действия исследуемого дезинфектанта культуральным методом проводят его
биологическое
исследование
Актуальным является вопрос
бактерицидных
свойств
(биопробу)
выбора
на
лабораторных
животных.
тест–культуры при определении
дезинфицирующих
препаратов.
Бактерицидные
свойства потенциального дезинфектанта для применения при туберкулезе
нужно изучать не только по непатогенным лабораторным тест–культурам, но и
обязательно по M.bovis и M.avium (Murohachi T., Kondo E., 1969; Stronchill
A.A., 1963).
В лабораторных опытах установлено, что быстрорастущие культуры
атипичных микобактерий M.phlei более устойчивы чем M.bovis, что позволяет
ее использовать в качестве тест–культуру в процессе разработки режимов
дезинфекции (Платонов Г.И. и соавт., 1975,1982).
Для первичной оценки эффективности дезинфицирующих препаратов на
их пригодность для обеззараживания объектов при туберкулезе крупного
рогатого скота рекомендуется использовать сапрофитные микобактерии,
атипичные микобактерии вида M.fortuitum.
37
По данным Schlisser T. (1974), при определении бактерицидных свойств в
новых дезинфектантов в США используют микобактерии комплекса M.avium–
intracellulare и M.tuberculosis, в европейских странах – M.avium, M.fortuitum,
M.phlei (Bass G.K., 1968; Waterworth P.W., 1984).
При определении бактерицидных свойств новых дезинфектантов в
отношении микобактерий большое значение имеет правильный выбор
питательной среды. Для этого предложено 20 плотных, 15 редких, 10
специальных сред для культивирования микобактерий (Васильев В.Н., 1971)
Наиболее
практичными
являются
среды
Гельберга,
Петраньяни,
Левенштейна–Йенсена, Финн–2, Сотона, Модель, «Новой» (Мордовского),
полусинтетическая среда Школьниковой (Варенко В.Н.,1980; Кассич Ю.Я.,
1990).
Что касается жидких синтетических сред, то они имеют меньше
диагностическое значение, поскольку рост колоний происходит на дне
пробирок, что затрудняет оценку учета роста культур.
Контроль качества дезинфекции объектов ветеринарного надзора
При определении эффективности проведения профилактических и
оздоровительных мероприятий большое значение имеет контроль качества
дезинфекции, который проводят в три этапа: визуальный, технологический и
бактериологический (Аржаков В.Н и соавт., 2004; Смолянинов Ю.И., 2004;
Шаров А.Н., 2005).
В
ветеринарной
практике
контроль
качества
дезинфекции
животноводческих помещений проводят путем отбора проб смывом с помощью
ватных или марлевых тампонов. Отобранный таким образом материал пробы
дважды
отмывают
центрифугированием
в
течение
20–30
минут
в
нейтрализующих жидкостях и воде. Полученный при этом осадок высевают на
плотную питательную среду Левенштейна–Йенсена и культивируют в
термостате при 37°С. При наличии роста культуры на поверхности питательной
среды проводят микроскопию мазков (Вареца Л.А., 1983; Васильев Н.С., 2005;
Вицинец Т.В., 2002; Вицинец Т.В. и соавт., 2004).
38
Качество проведенной дезинфекции можно установить при применении
метода культивирования микобактерий на стеклах в редких питательных
средах.
С целью экономии труда и времени для оценки качества дезинфекции
объектов ветеринарного надзора предложен метод отпечатков с поверхности
объектов с тонким слоем элективного геля с последующим инкубированием
проб–отпечатков (Высоцкий А.Э., 2002).
Для оценки эффективности дезинфекции едким натрием рекомендуют
использовать модифицированный экспресс–тест с лактозой и бромтимоловым
синим, цитохимический метод (Данко Ю.Ю., 1998,1999).
При бактериологическом контроле качества дезинфекции определяют
наличие в исследуемом материале жизнеспособные клетки санитарно–
показательных
микроорганизмов
стафилококков
(aureus,
(Escherichia,
epidermidis,
Citrobacter,
saprophyticus),
Enterobacter),
микобактерий
или
спорообразующих аэробных рода Bacillus (Донченко А.С., 1995,1997).
Стафилококк
как
наиболее
устойчивый
из
вегетативных
форм
микроорганизмов может быть показателем оценки качества дезинфекции при
туберкулезе птицы и крупного рогатого скота. В качестве тест–микробов с
целью контроля эффективности дезинфекции при туберкулезе предложены
атипичные
микобактерии,
как
отвечающие
основным
требованиям,
предъявляемым к санитарно–представительным микроорганизмам (Елистратов
И.С., 1987; Кучеренко И.Н., 1994,1995).
Для
определения
качества
проведенной
дезинфекции
вагонов
предложенный метод с тест–микробом St.аureus (штамм 209–Р), основанный на
обнаружении жизнеспособных клеток в микрокультуре на дрожжевой среде,
позволяет оценивать эффективность дезинфекции через 7–8 часов после ее
проведения.
При контроле дезинфекции транспортных средств и животноводческих
помещений предусмотрено размещение в них деревянных тест–объектов,
контаминированных суточной агаровой культуры золотистого стафилококка со
39
стерильным навозом. Дезинфекцию признают удовлетворительной, если нет
роста тест–микробов во всех исследованных пробах (Лысенко А.П., 2002;
Смолянинов Ю.И., 1994).
Анализируя данные литературы необходимо отметить, что остается
малоизученным вопросы эффективности, диагностической чувствительности
аллергической диагностической пробы с использованием ППД – туберкулина
для млекопитающих. Ведутся обширные исследования по совершенствованию
ростовых свойств элективных питательных сред, как для первичного выделения
бактериальных форм микобактерий, так и деструктивных по клеточной стенки
L–форм микобактерий. (Белоусов В.И., 2004; Головченко М.В., 2002; Донченко
А.С. и соавт., 2000;2006). Не менее интенсивно проводятся изыскательские
исследования по совершенствованию подходов к разработке экологически–
безопасных
дезинфицирующих
средств,
используемых
как
для
профилактической, так и для вынужденной дезинфекции объектов внешней
среды
при
проведении
противотуберкулезных
оздоровительно–
профилактических мероприятий. (Меньш А.В.. 1994; Обухов И.Л., 1996;
Поляков А.А., 1975, 1983,1986; Шеина И.В., 1982). Это явилось основанием для
проведения исследований по разработке и оценки элективных питательных
сред для первичного выделения микобактерий и L–форм, а так же проведения
экспериментальных и производственных опытов по изучению антисептических
свойств дезинфектантов при туберкулезе крупного рогатого скота.
40
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.Материал и методы исследований
Диссертационные исследования проводились на кафедре инфекционной и
инвазионной
патологии
Белгородского
государственного
аграрного
университета имени В.Я. Горина, в ОГБУ «Ракитянская ветеринарная станция
по борьбе с болезнями животных», «Ракитянской межрайонной ветеринарной
лаборатории», ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с. Васильевка Ракитянского
района, Белгородской области в период с 2010 по 2014 гг.
В
работе
иммунологический,
использовали
эпизоотологический,
микробиологический,
клинический,
патологоанатомический
методы
исследований.
Использовали
ретроспективные
пространственно–временной
данные
динамике
ФГБУ
«ВНИИЗЖ»,
интенсивности
о
проявления
эпизоотического процесса при туберкулезе крупного рогатого скота.
Для сравнительной оценки интенсивности эпизоотического процесса
(уровня заболеваемости), мы определяли индекс заболеваемости (ИЗ) –
отношение числа заболевших животных к общему числу восприимчивых
животных (в %)–по формуле:
ИЗ =
З ´ 100
(%)
СП
, (1)
где: З–количество заболевших животных за год,
СП–среднегодовое поголовье животных.
Оценку эффективности аллергической диагностической пробы (АДП)
проводили в неблагополучном по туберкулезу крупного рогатого скота
хозяйстве ООО «Семхоз Ракитянский» ММК с. Васильевка, Ракитянского
района, Белгородской области. Общее поголовье крупного рогатого скота
составляло 3500 голов.
41
Объектом для проведения аллергических исследований являлись телята,
начиная с 2–х месячного возраста, молодняк и взрослый крупный рогатый скот.
Для исследований использовали ППД–туберкулин для млекопитающих ФГУП
Курской биофабрики серия 4, номер ПВР1–3,0/00424; серия 9, номер ПВР1–
3,0/00424; серия 24, номер ПВР1–3,0/00424. Животные с положительными
реакциями
на
ППД
туберкулин
подлежали
диагностическому
убою.
Отобранный от убитых животных биоматериал (лимфатические узлы)
использовали для бактериологического исследования. Посевы проводили на
плотных (Левенштейна–Йенсена) и жидких питательных средах. Микроскопию
мазков–отпечатков проводили из лимфатических узлов от реагирующих
животных. Окрашивание мазков по методике Циль–Нильсена.
Для полимеразной цепной реакции использовали 29 проб биоматериала и
«Тест–систему для выявления и дифференциации возбудителей туберкулеза
M.bovis и M.tuberculosis» производства НПО НАРВАК. Визуализацию
полученных
результатов
амплификации
(ампликонов)
осуществляли
с
использованием набора для электрофоретического анализа. При постановке
ПЦР использовали следующий режим амплификации: 95°С–5 мин, 95°С–0,5
мин, 65°С–0,5 мин. } – 45 циклов, 72°С–0,5 мин, 10°С–24 часа.
Детектировали фрагменты геномов возбудителей М.bovis в 580 парах
нуклеотидов. Положительные образцы содержали специфическую светящуюся
полосу строго на том же уровне, что и полоса в положительном контроле.
Схема опыта по изучению ростовых свойств питательных сред при
исследование патологоанатомического материала
Для экспериментальных опытов использовали 30 дневную культуру
M.bovis,
выращенную
на
среде
Павловского
(картофельная
среда).
Бактериологической петлей отбирали колонии микобактерий, помещали их во
флаконы со стеклянными бусами. После добавления физиологического
раствора подвергали шуттелированию в течение 30 минут. Полученную взвесь
микобактерий
высевали
на
поверхность
усовершенствованной
плотной
питательной среды и среды Левенштейна–Йенсена (по 10 пробирок на каждую
42
пробу). Учет результатов роста проводили через каждые сутки. При
обнаружении первых, едва заметных точечных образований, фиксировали
время их появления. С полученных колоний брали пробы для проведения
микроскопии. Окраску мазков проводили по методу Циль–Нильсена.
В опытах использовали 75 проб биоматериала от убитых животных.
Предпосевная обработка проводилась по методикам Аликаевой А.П. (1940) и с
использованием 3% раствора серной кислоты (Тарасова Е.В., 2012).
Предпосевная обработка заключалась в измельчении в фарфоровой
ступке лимфатических узлов, добавления–3% раствора серной кислоты
(экспозиция
5
минут)
с
последующим
двукратным
отмыванием
в
физиологическом растворе. Обработку биоматериала проводили следующим
образом. Лимфатические узлы измельчали ножницами на кусочки размером
0,5×0,5 см³. Измельченный биоматериал помещали в стерильные ступки,
заливали 3% раствором серной кислоты, выдерживали 15 минут. Затем кислоту
сливали. Биоматериал
трижды отмывали стерильным физиологическим
раствором. Отмытый биоматериал тщательно растирали стерильным песком до
однородной массы, добавляя 15,0 см³ стерильного физиологического раствора.
Полученную взвесь фильтровали через стерильные мембранные фильтры
диаметром 0,45 мкм. Посев взвеси (для исследования на наличие L–форм)
после предпосевной обработки проводили по 0,3±0,05 см³ в 10 пробирок на
полужидкие среды Дорожковой И.Р. и испытуемые варианты плотной
питательные среды для первичного выделения микобактерий и питательную
среду для выделения L–форм Белгородской ГСХА. Посевы культивировали в
термостате при температуре 37,0±0,5°С в вертикальном положении.
Для получения R, S–бактериальных форм микобактерий подготовленный
биоматериал высевали в 10 пробирках на среду Левенштейна–Йенсена. Посевы
выдерживали в термостате при температуре 37,0±0,5°С в горизонтальном
положении 2 суток.
43
Микроскопию L–форм микобактерий проводили с использованием
фазово–контрастной микроскопии в темном поле. Бактериальные формы
микроскопировали в световом микроскопе.
Для
определения
использовали
биохимических
биохимические
тесты:
свойств
культур
каталазную,
микобактерий
никотинамидазную,
пиразинамидазную активность, 5% хлористым натрием и салицилатом натрия,
теллуритом
калия,
мочевиной
и
твин–80,
согласно
Методическим
рекомендациям по уточнению диагноза на туберкулез у крупного рогатого
скота и определению видовой принадлежности культур микобактерий, Харьков
(1987).
Для постановки биопробы использовали здоровых морских свинок не
реагирующих на ППД–туберкулин для млекопитающих, весом 300–350г.
Морских свинок заражали гомогенатом из патологоанатомического материала
и взвесью культур микобактерий в дозе 0,00001 мг/см³.
Схема опыта по изучению выделяемости культур микобактерий из
объектов внешней среды
Проводили смывы и соскобы из объектов внешней среды на площади
10×10 см. Было отобрано 180 проб из кормушек, стен, поилок, и прилегающей к
ним территории (поверхность почвы и навоза). Соскобы и смывы после
обработки по Аликаевой А.П. (1940) высевали на питательную среду
Левенштейна–Йенсена (одна проба на 20 пробирок). Наблюдение за ростом
культур осуществляли каждые сутки. При появлении первичных, заметных
колоний, проводили микроскопию.
Схема опыта по изучению бактерицидных свойств анолитов
приготовленных по технологии «АКВА–ЭХА» в камеральных условиях
Для получения дезинфицирующих растворов использовали установку
«АКВА–ЭХА» научно–производственного предприятия «Изумруд» РАСХН г.
Санкт–Петербург.
Антимикробные растворы получали по технологии электрохимической
активации (ЭХА), основанной на униполярном воздействии постоянного
44
электрического поля высокой напряженности на слабоминерализованные (1–5
г/л) растворы. В процессе получения анолита химическая реакция протекала
следующим образом: 2Н2O + 2Na+ 2NaOH + H®+ 2е 2; 2НO + 2е ® Н2 + 2OН–.
Готовили образцы испытуемых растворов : №1 с pH 6–7 и содержанием
активного хлора 250 мг/л., при использовании силы тока 10А; №2 с pH 6,0±0,5
и содержание активного хлора 400 мг/л., при использовании силы тока 12А; №3
pH 5 и содержание активного хлора 300 мг/л. Раствор получали при
использовании силы тока 9А; №4 pH 9 и содержание активного хлора 300 мг/л.,
при использовании силы тока 9А; №5 pH 4 и содержание активного хлора 300
мг/л., при использовании силы тока 11А; №6 pH 10 и содержание активного
хлора 300 мг/л., при использовании силы тока 11А. Оценку испытуемых
образцов растворов провели в сравнении с дезинфицирующими веществами
(Кристалл–1000) и (Хлорантоин).
«Кристалл–1000» – дезинфицирующее средство производства ООО
«Интер–Синтез». Основу данного препарата составляют перекись водорода
(38–40%); катамин алкилдиметилбензиламмоний хлорид (1–1,5%) и бензоат
натрия (0,8%).
«Хлорантоин» – включает в своем составе: дихлорантин – 21–23%; 5,5–
диметилгидантоин – 12–16%; триполифосфат натрия – 5–5,5%; анионные
поверхностно–активные вещества – 3–5%; ингибитор коррозии до 10%;
щелочные моющие средства до 10%; натрий хлористый до 100%. Содержание
активного хлора в препарате–не менее 13,5%.
В качестве сравнительного дезинфицирующего средства использовался
традиционно применяемый для дезинфекции 3%–ный раствор NaOH (едкий
натр).
Тест–объектами для контаминации микобактерий служили деревянные,
стеклянные, керамические плитки размером 10×10 см. На испытание каждого
дезинфицирующего вещества использовали по три стерильных. На плитки
наносили по 1,0 мг/мл взвеси M.bovis. После контаминации тест–объектов
взвесью микобактерий их орошали дезинфицирующими средствами. Спустя 30
45
мин, 1–6 часов проводили смывы и посевы на питательные среды
Левенштейна–Йенсена (10 пробирок на каждую пробу).
Схема опыта сравнительного изучения дезинфицирующих свойств
растворов,
полученных
по
технологии
«АКВА–ЭХА»
в
условиях
неблагополучного по туберкулезу хозяйстве
Оценку дезинфицирующих свойств испытуемых растворов проводили в
условиях неблагополучного по туберкулезу хозяйства. В качестве исследуемых
объектов использовали кормушки, стены, поилки, поверхностные слои почвы
(территория
фермы).
Обрабатывали
испытуемыми
дезинфицирующими
растворами с использованием установки Karcher из расчета 1000 см³/м² при
обработке животноводческих помещений, прилегающей территории 3000
см³/м². В первом коровнике обработку проводили нативным раствором с
концентрацией активного хлора 250 мг/л, (рН 6–7). Во втором коровнике
использовали раствор А с концентрацией активного хлора 400 мг/л, (рН 6±0,5).
В третьем коровнике применяли раствор с концентрацией активного хлора 300
мг/л с (рН 5). В четвертом коровнике использовали 3% р–р NaOH.
Противомикробная активность испытуемых антисептиков проводилась через 30
минут, 1, 3, 5 и 12 часов, путем посевов на питательную среду Левенштейна–
Йенсена (одна проба на 10 пробирок).
В соответствующих разделах диссертационной работы мы более
подробно детализируем методические подходы проведения экспериментальных
и
производственных
опытов.
Статистическую
обработку
полученных
результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета
программ Microsoft Excel for Windows 7.
46
СХЕМА ОПЫТОВ
Неблагополучное хозяйство по туберкулезу крупного рогатого скота
всего в хозяйстве (n=3500) голов
Аллергическая диагностическая проба
подвергалось исследованию (n=21329)
Реагирующие на
ППД–туберкулин
для млекопитающих
(n=775)
Не реагирующие на
ППД–туберкулин
для млекопитающих
(n=20554)
Диагностический убой и проведение
патологоанатомического исследования
(n=1500)
Животные с
патологоанатомическим
и изменениями
(n=309)
Животные без
патологоанатомических
изменений
(n=1191)
Лабораторные исследования
Бактериологические исследования
ПЦР (n–29)
Биопроба (n–20)
плотная питательная
среда
среда
Белгородской ГСХА
среда
Левенштейна–Йенсена
среда Дорожковой И.Р.
Микроскопия
Посев на плотные и жидкие
питательные среды (n=3000)
Исследования по
выделению
микобактерий из
объектов внешней
среды: стен,
кормушек, поилок,
прилегающих
территорий,
поверхностных
слоев и т.д.
(n=180)
Применение
дезинфицирующих
веществ
– 3%р–р NaOH,
– анолитных
растворов
приготовленных
по технологи
«АКВА–ЭХА»;
–Кристалл–1000;
–Хлорантоин.
47
3.0 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1.Характеристика
эпизоотической
ситуации
по
туберкулезу
крупного рогатого скота в Российской Федерации
Интенсивность проявления эпизоотического процесса при туберкулезе
крупного
рогатого
скота
изучали
используя
ретроспективные
данные
ветеринарной статистики за период с 2008 по 2013 гг.. Для этого использовали
показатели частоты выявления реагирующих на туберкулин животных в
хозяйствах РФ, уровень заболеваемости туберкулезом, динамику выявления и
оздоровления неблагополучных пунктов, материалы выявления туберкулезных
поражений при убое (данные ФГБУ «ВНИИЗЖ» о пространственно–временной
динамике
интенсивности
проявления
эпизоотического
процесса
при
туберкулезе крупного рогатого скота).
Эпизоотическая ситуация в РФ, базируясь на данных таблицы 1 носила
перемежающий характер. В начале имела место тенденция снижения (до 2011
года), а затем повышения (до 2013 года) выявляемости новых неблагополучных
пунктов. В 2008 году в Российской Федерации было выявлено 26 новых
неблагополучных пунктов, в том числе: в Белгородской (1), Курской (2),
Липецкой (2), Тульской (1), Омской (1), Новосибирской (1), Челябинской (1),
Амурской (2) и Рязанской (3) областях, Ставропольском (4) и Краснодарском
крае (1), Республиках Ингушетия (2), Дагестан (2), Татарстан (1), а в 2009 году
было выявлено всего 10 новых неблагополучных пунктов, в том числе:
Белгородской (1), Московской (1), Тульской (3), Челябинской (1) и Ростовской
(1) областях, Республики Ингушетия (1) и Ставропольском крае (2).
В 2010 году количество новых неблагополучных пунктов в РФ составило
20. По регионам: в Волгоградской–1 (8 больных туберкулезом), Иркутской–
1(50), Курской–1(18), Новосибирской–2 (102), Орловской–2 (426), Пермской–2
(322), Рязанской–1 (5), Саратовской–2 (151), Тамбовской–1 (1), Тюменской–
48
1(2) и Ульяновской–1 (345) областях, Республиках Калмыкия–1 (14),
Мордовия–1 (18), Северная Осетия–1 (58) и Чечня (1), Красноярском крае–1(4).
Самый низкий показатель выявляемости новых неблагополучных пунктов
был в 2011 году (7). В их числе в Новосибирской области–2, Тульской–1,
Оренбургской–1, Нижегородской–1, Республиках Татарстан–1 и Ингушетия–1,
общее количество больных туберкулезом животных составило 495 голов.
В 2012 году было выявлено 17 новых неблагополучных пунктов (в 2,5
раза больше по сравнению с предыдущем годом). В их числе: Алтайский–1 и
Краснодарский
край–1,
Амурская–1,
Белгородская–3,
Курская–1,
Новосибирская–1, Саратовская–2 и Тульская–3 области, в Республиках
Кабардино–Балкария–1, Мордовия–1, Татарстан–1, Чечня–1. Общее количество
больных животных составило 906 голов.
В
2013
году
наблюдалось
повышение
выявляемости
новых
неблагополучных пунктов (20). По регионам: в Алтайском–1 (3 больных
туберкулезом) и Красноярском крае–1 (144), Республиках Мордовия–1 (144) и
Татарстан–8 (692), по областям в Белгородской–1 (218), Самарской–1 (16),
Тульской–1 (121), Тюменской–2 (49), Ульяновской–1 (114), Курской–1 (67),
Омской–2 (114).
Количество
выявленных
туш
с
характерными
для
туберкулеза
патологоанатомическими поражениями, по отношению к числу реагирующих
на туберкулин, имело тенденцию к росту (с 16,4% в 2008 году, до 26,9% в
2009). Затем этот показатель стабилизировался на уровне (20,3% в 2010 году,
21,8% 2011 году). Тенденция к снижению обозначилась к 2012 году (15,4%), в
2013 (16,7%).
В целом с 2008 по 2013 годы количество неблагополучных пунктов
уменьшилось от 82 до 33. Количество оздоровляемых пунктов снизилось с 33
до 6.
Количество больных животных в 2008 г. cоставило – 5014, а в 2013 году –
2370, что сопоставимо с уменьшением поголовья КРС в целом по стране.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
49
Таблица 1. Динамика эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в Российской Федерации с 2008 по 2013гг
Показатели
Наличие
неблагополучных
пунктов на 1.01 в т.ч.
Выявлено новых
неблагополучных
пунктов
Очаговая инцидентность
2008
2009
2010
2011
2012
2013
82
49
41
33
34
45
26
10
20
7
17
20
118
161
154,7
157,1
161
155
562
378
356
401
398
2085
1860
1631
2594
2370
18
28
6
6
7
26,9
20,3
21,8
15,4
16,7
Выявлено животных с
патологоанатомическими 826
изменениями тыс. гол.
Выявлено положительно
реагирующих на ППД–
5014
туберкулин тыс. гол.
Оздоровлено
33
неблагополучных
пунктов
Процентное отношение
числа животных с
патологоанатомическими
16,4
изменениями к числу
убитых (реагирующих на
туберкулин), %.
Визуализация
полученных
результатов
изучения
заболеваемости,
сравнительной оценки интенсивности эпизоотического процесса представлена
на рисунке 1.
Наивысший уровень заболеваемости туберкулезом был отмечен в 2008
году (0,053%). С 2009 по 2011 этот индекс снизился в 2,5 раза (0,017% к 2011
году). В последующие 2012, 2013 гг. уровень индекса заболеваемости вырос до
0,028% и 0,026 % , соответственно. В целом по России индекс заболеваемость с
2008 по 2013 составил 0,027%.
50
Рисунок 1. Заболеваемость туберкулезом крупного рогатого скота в
Российской Федерации с 2008 по 2013 гг
Наиболее
напряженная
эпизоотическая
ситуация
по
туберкулезу
крупного рогатого скота наблюдалась в животноводческих хозяйствах
Белгородской области. Так только за 2009 год в одном из в неблагополучных
хозяйств было убито с диагностической целью реагирующего на ППД –
туберкулин скота 349 голов, что составило 24% от общего числа убитых и было
обнаружено
13%
туш
с
характерными
для
туберкулеза
патологоанатомическими изменениями.
Принимая
во
внимание
вышеизложенные
ретроспективные
и
проспективные эпизоотологические данные можно сделать заключение, о том
что эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в
животноводческих хозяйствах РФ имеет характер постоянного устойчивого
неблагополучия в ряде регионов.
Приведенные выше данные по изучению эпизоотической ситуации в
Российской Федерации по туберкулезу крупного рогатого скота и постоянное
неблагополучие животноводческих хозяйств Белгородской области по данной
инфекции, подтолкнули нас на изучение эпизоотического статуса одного из
стационарно неблагополучных хозяйств – ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с.
Васильевка.
51
3.2.Эпизоотический статус ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с.
Васильевка, Ракитянского района, Белгородской области
ООО
Ракитянском
"Семхоз
Ракитянский" ММК
районе,
Белгородской
с.
Васильевка
области.
В
находиться
в
эксплуатацию
животноводческий комплекс ввели в 2010 году. Животноводческие помещения
с беспривязным содержанием крупного рогатого скота, состоят из 5 корпусов
изготовленных из мягких металлических конструкций, расположенных на
расстоянии 5 километров от ближайших административных зданий. Стадо
укомплектовано крупным рогатым скотом
голштино–фризской и черно–
пестрой породы. Удои на одну фуражную корову составляют 3,2 и 3,8 литра.
Имеются два выгульных двора. Около 60% животных постоянно реагируют в
РИД на антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, т.е. данное хозяйство
является неблагополучным по данной инфекции. Наблюдается ранний переход
выпойки телят от цельного молока на искусственный заменитель цельного
молока.
В
среднем
25–30%
поголовья
растелившихся
коров
имеют
послеродовые эндометриты, обнаруживаются последствия инфекционного
ринотрахеита с пустулезным вульвовагинитом, проявляющийся обильной
сыпью в нижней части влагалища и истечением из носовых отверстий, что
подтверждается результатами серологических тестов. Молодняк (35%) до
месячного возраста имеет поражения верхних дыхательных путей, желудочно–
кишечного тракта, что проявляется длительными кашлевыми реакциями и
диарейными явлениями. Около 30% поголовья фуражного стада имеют
поражение дистального отдела конечностей, сопровождающиеся хромотой и
нарушением двигательной активности.
"Семхоз Ракитянский" является неблагополучным по туберкулезу с
ноября
2012 года. В период с 2012 по 2013 гг., в этом хозяйстве было
подвергнуто ежемесячным аллергическим исследованиям 21329 голов крупного
рогатого скота. Было выявлено 775 голов реагирующих на ППД – туберкулин
для млекопитающих. Результаты исследований представлены в таблице 2. Все
52
реагирующие животные подверглись диагностическому убою с проведением
патологоанатомических и бактериологических исследований.
Таблица 2. Динамика эпизоотологической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в ООО "Семхоз Ракитянский" в период 2012 по 2013гг
Показатели
2013
2012
Период проведения
исследований
Подвергнуто
Реагировали на
исследованиям в АДП
туберкулин, гол.
животных, гол.
Туберкулезные изменения
в лимфатических узлах у
реагирующих на
туберкулин, %
Ноябрь
2741
194
7,08
Декабрь
1818
99
5,45
Январь
1409
94
6,67
Февраль
3481
166
4,77
Март
2536
117
4,61
Апрель
2580
58
2,24
Май
2612
43
1,65
Июнь
2107
7
0,33
Июль
2045
55
2,69
21329
775
–
Всего
Анализируя данные таблицы 2 и рисунка 2 необходимо отметить, что с
ноября (2012) по январь (2013) наблюдалась тенденция постепенного
уменьшения в 2 раза количества реагирующих животных. В феврале (2013)
количества реагирующих животных увеличилось в 1,8 раза. В дальнейшем
продолжилась тенденция уменьшения выявляемости количества реагирующих
животных. Что касается присутствия у этих особей патологоанатомических
изменений, свойственных туберкулезной инфекции, то в этот период
исследований данный показатель тоже имел тенденцию к постепенному
уменьшению и в июне (2013) понизился в 21 раз против ноября (2012).
53
Рисунок 2. Соотношения выявляемости реагирующих на ППД–
туберкулин животных к количеству обнаруженных туберкулезных
поражений
Данная корреляционная зависимость прерывалась в июле (2013) и
характеризовалась увеличением числа реагирующих на ППД – туберкулин
животных
в
7,8
раза
и
выявляемостью
особей
с
туберкулезными
патологоанатомическими изменениями в 8,2 раза. Если в начале проведения
противотуберкулезных мероприятий среди 194 голов реагирующего скота,
АДП позволяла выявить 133 особи с туберкулезными патологоанатомическими
изменениями т.е. 68,5%, то уже через 3 месяца данный показатель снизился до
34%, а еще через 5 месяцев уменьшился до 10,0%, к концу исследований (июнь
2013г.) данный показатель составил 4,0%. Это свидетельствует о понижении
чувствительности и специфичности АДП в стационарно–неблагополучном
хозяйстве, что связано по всей видимости с увеличением количества
анергичных животных. Наглядность полученных результатов представлена в
рисунке 2.
54
выявления
3.3.Динамика
животных
реагирующих
на
ППД–
туберкулин для млекопитающих
Исследования проводили в 9 сериях опытов с ноября 2012 года по июль
2013 года. Общее количество подвергнутых исследованию животных составило
3500 голов. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3. Динамика выявления животных реагирующих на туберкулин по
возрастным группам, голов
Период проведения исследований
Январь
Февраль
Март
Апрель
Май
Июнь
Июль
2013
Декабрь
2012
Ноябрь
Половозрастные
группы
Реагирующие
животные
194
99
94
166
177
58
43
7
55
Коровы
179
38
94
35
111
35
43
7
55
Телки
(от 6 до 12 мес.)
3
34
–
62
–
11
–
–
–
Телки
(от12 до 18мес.)
12
–
–
11
6
5
–
–
–
Бычки
–
27
–
58
–
17
–
–
–
Из данных приведенных в таблице 3 видно, что в ноябре 2012 года было
выявлено реагирующих на ППД – туберкулин животных 194 гол., в т.ч. 179
коров, 3 телки (6–12 мес. возраста) и 12 телок (12–18 мес. возраста). Из них с
утолщением кожной складки от 3 до 5 мм – 67; от 5 до 10 мм – 58; более 10 мм
–69 голов, что составило 35,0%, 29,0%, 36,0%, соответственно. Интенсивность
кожных реакций у телок была следующей: из числа реагирующих у двух
особей (6–12 мес. возраста) составила 3–5 мм, у одной – более 5; у 7 (12–18 мес.
возраста) – 3–5 мм, у 5 от 5 до 10 мм.
55
В декабре положительно реагировало 99 гол., в т.ч. 38 коров, 34 телки (6–
12 мес. возраста) и 27 бычков (2–6 мес. возраста). Из них с утолщением кожной
складки от 3 до 5 мм – 32; от 5 до 10 мм – 26; более 10 мм –23 головы, что
составило 32,0%, 26,0%, 43,0%, соответственно. Интенсивность кожной
реакции у молодняка была следующей: у шести телок (6–12 мес. возраста) от 3
до 5 мм, у 11 от 5 до 10 мм, 17 – более 10 мм; у 5 бычков (2–6 мес. возраста) 3
до 5 мм, 7 голов с утолщением от 5–10 мм, у 15 голов более 10 мм.
В январе было выявлено 94 коровы реагирующих на туберкулин.
Интенсивность кожной реакции была следующей: у 64 – от 3 до 5 мм; у 20 от 5
до 10 мм; у 10 более 10мм, что составило 68,0%, 21,0%, 11,0%, соответственно.
В феврале выявлено реагирующих 166 голов, в т.ч. 35 коров, 62 телки (2–
6 мес. возраста), 11 телок (12–18 мес. возраста), бычков (2–6 мес. возраста) – 58
голов. Из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм – 47; от 5 до 10 мм –
38; более 10 мм – 25 голов, что составило 47,0%, 38,0%, 15,0%, соответственно.
Интенсивность кожной реакции у молодняка была следующей: у 28 телок (2–6
мес. возраста) с утолщением кожной складки на 3 до 5 мм; у 24 голов от 5 мм
до 10 мм; у 10 голов более 10 мм. У 11 телок (2–18 мес. возраста) от 3 до 5 мм;
у 23 бычков (2–6 мес. возраста) от 3 до 5 мм; у 29 голов от 6 до 10 мм; у 6 более
10 мм.
В марте прореагировало 117 голов, в т.ч. 111 коров и 6 телок (12–18 мес.
возраста), из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм – 55; от 5 до 10
мм – 45; более 10 мм – 17 голов, что составило 47,0%,
соответственно.
Интенсивность кожных реакций
38,0%, 15,0%,
у коров
проявлялось
следующим образом: 7 голов – от 3 до 5 мм; у 15 от 6 до 10 мм; у 19 более 10
мм. У 6 телок (12–18 мес. возраста) – от 3 до 5 мм.
Показатели
проявления
представлены в таблице 4.
кожной
реакции
(в
%)
на
туберкулин
56
Февраль
Март
Апрель
Май
Июнь
Июль
2013
Январь
2012
Декабрь
От 3 до
5 мм
От 5 до
10 мм
Более
10 мм
Период проведения исследований
Ноябрь
Утолщение
кожной складки
Таблица 4. Показатели интенсивности проявления кожных реакций на
туберкулин, %
35,0
32,0
68,0
47,0
47,0
74,0
84,0
29,0
51,0
29,0
26,0
21,0
38,0
38,0
22,0
9,0
42,0
31,0
36,0
43,0
11,0
15,0
15,0
4,0
7,0
29,0
18,0
В апреле положительную реакцию дали 58 голов, в т.ч. 35 коров, 11 телок
(2–6 мес. возраста), 5 телок (12–18 мес. возраста), бычки (2–6 мес. возраста) –
17 голов. Из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм – 43; от 5 до 10 мм
– 13; более 10 мм – 2 головы, что составило 74,0%, 22,0%, 4,0%,
соответственно. Интенсивность кожной реакции у молодняка была следующей:
9 телок (2–6 мес. возраста) – от 3 до 5 мм., по одной голове – более 5 мм и 10
мм. У 4 телок (2–18 мес. возраста) от 3 до 5 мм, у одной головы более 5 мм. У
14 бычков (2–6 мес. возраста) от 3 до 5 мм, у 2 голов от 5 до 10 мм, у одной
особи более 10 мм.
В мае положительную реакцию дали 43 головы крупного рогатого скота.
Интенсивность кожной реакции была следующей: у 36 коров утолщение
кожной складки от 3 до 5 мм, у 4 от 5до 10 мм, у 3 голов более 10 мм, что
составило 84,0%, 9,0%, 7,0%, соответственно.
В июне положительную реакцию дали 7 голов. Интенсивность кожной
реакции была следующей: у 2 коров от 3 до 5 мм, у 3 от 5 до 10 мм, у 2 голов
более 10 мм, что составило 29,0%, 42,0%, 29,0%, соответственно.
В июле положительную реакцию дали 55 голов крупного рогатого скота.
Интенсивность кожной реакции была следующей: у 28 коров утолщение
57
кожной складки от 3 до 5 мм, у 17 от 5 до 10 мм, у 10 голов более 10 мм, что
составило 51,0%, 31,0%, 18,0%, соответственно.
При проведении убоя реагирующих на туберкулин животных обнаружили
туберкулезные изменения в ноябре 2012 у 133 (68,55%); в декабре – 32 голов
(32,32%). В январе 2013 году – 32 (34,04%); в феврале – 63 (37,95%); в марте –
16 (13,68%); в апреле – 6 (10,34%); в мае – 15 голов (34,88%) от общего числа
реагирующих животных. В июле 2013 – 2 головы со слабыми туберкулезными
изменениями в бронхиальных и средостенных лимфатических узлах (табл.5).
Таблица 5. Количество животных с туберкулезными изменениями в
лимфатических узлах
Период проведения исследований
2012
При
туберкулин
Декабрь
Январь
Февраль
Март
Апрель
Май
Июнь
Июль
Реагирующих
животных, голов
С туберкулезными
поражениями
в т.ч.: голов / %
2013
Ноябрь
Показатели
194
99
94
166
117
58
43
7
55
133
32
32
63
16
6
15
–
2
68,5
32,3
0,3
34,9
–
3,6
проведении
молодняка
34,0 37,9 13,7
послеубойной
крупного
экспертизы
рогатого скота
у
реагирующего
на
протяжение
на
всех
исследований, характерных туберкулезных изменений не обнаружено. Тем не
менее,
у
некоторых
особей
наблюдали
незначительное
увеличение
лимфатических узлов (бронхиальных, средостенных) с кровоизлияниями. При
проведении
микроскопических
исследований
мазков–отпечатков
лимфатических узлов обнаруживали микобактерии, окрашенные по Цилю–
Нильсену в красный цвет.
Наиболее выраженные патологоанатомические изменения, характерные
для туберкулеза (поражения средостенных, бронхиальных и заглоточных
лимфатических узлов) выявлены в ноябре 2012 года (рис. 3).
58
Рисунок 3. Характерные послеубойные патологические изменения при
туберкулезе (лимфатический узел)
А менее выраженные в марте – апреле месяце 2013 года на рисунке 4.
Рисунок 4. Туберкулезные поражения в лимфатических узлах у животных
В июне 2013 года было выявлено 7 реагирующих на туберкулин коров.
При убое этих животных туберкулезных патологоанатомических поражений
выявлено не было. Спустя месяц было выявлено 55 реагирующих коров. При
убое у двух из них были обнаружены характерные для туберкулеза поражения
59
лимфатических узлов. Столь выраженный вираж в количестве реагирующих
животных вполне мог быть обусловлен активацией латентного туберкулеза на
фоне изменения климатических условий в летний период времени. В этот
период года в наибольшей степени снижается резистентность организма, что
приводит к активации туберкулезного процесса.
В
целом,
применение
аллергического
метода
диагностики
с
использованием ППД – туберкулина для млекопитающих в условиях
неблагополучного по туберкулезу хозяйства позволило выявлять от 3,6% до
68% особей с активным развитием туберкулезного процесса. Следует отметить,
что у большинства животных с высокой интенсивностью кожной реакции на
туберкулин, обнаруживали или туберкулезные поражения или, незначительные
увеличения средостенных и бронхиальных лимфатических узлов (рис. 5), на
разрезе, которых имело место наличие точечных кровоизлияний.
Рисунок 5. Точечные кровоизлияния в лимфатических узлах при
туберкулезе крупного рогатого скота
Для объективной оценки чувствительности и специфичности АДП
необходимо было применить современные молекулярно–генетические тесты,
способные проводить прямую детекцию ДНК M.bovis.
60
3.4.Эффективность применения молекулярно–генетического теста
при исследовании биоматериала на туберкулез
В качестве дополнительного теста при диагностики туберкулеза нами
апробирована полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методом ПЦР было
исследовано
29
проб
биоматериала
средостенные
(бронхиальные,
и
заглоточные лимфатические узлы). Среди них исследовали биоматериал от не
реагирующих на туберкулин 20 и 9 голов реагирующих в АДП с утолщением
кожной складки от 3 до 7 мм. Наличие в ампликонах ДНК M.bovis установлено
у 27 проб (93%) (табл. 6).
Таблица 6. Оценка чувствительности и специфичности молекулярно –
генетического теста (ПЦР)
Инв.
номер
4275
5914
3649
5629
4093
3885
4245
6033
5547
3900
Патологоанатомический материал с
туберкулезными изменениями
Кровоизлияния в средостенных, заглоточных
л/у.
Кровоизлияния в средостенных,
бронхиальных л/у.
Кровоизлияния в средостенных,
бронхиальных л/у.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Кровоизлияния в средостенных, заглоточных
л/у.
Кровоизлияния в средостенных заглоточных
л/у.
Кровоизлияния в средостенных,
бронхиальных л/у.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Результаты
исследований
Утолщение
кожной складки ПЦР
на ППД –
туберкулин, мм
–
+
–
+
3
+
3
+
3
+
–
+
–
+
4
+
7
+
3
+
61
Продолжение таблицы 6. Оценка чувствительности
молекулярно – генетического теста (ПЦР)
Инв.
Патологоанатомический материал с
туберкулезными изменениями
и специфичности
Результаты
исследований
Утолщение
кожной складки
на ППД–
туберкулин, мм
ПЦР
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
4
+
3
+
7
+
30785
4068
30768
3072
30741
5008
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Кровоизлияния в средостенных, заглоточных
л/у.
Кровоизлияния в средостенных,
бронхиальных л/у.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Кровоизлияния в средостенных, заглоточных
л/у.
Кровоизлияния в средостенных, заглоточных
л/у.
Кровоизлияния в средостенных,
бронхиальных л/у.
Кровоизлияния в средостенных, заглоточных
л/у.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Бронхиальные и средостенные л/у. с туб.
поражениями.
Кровоизлияния в средостенных,
бронхиальных л/у.
Л/у. без видимых поражений
Л/у. без видимых поражений
Л/у. без видимых поражений
Л/у. без видимых поражений
Л/у. без видимых поражений
Л/у. без видимых поражений
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
–
4573
Л/у. без видимых поражений
–
–
номер
31196
5840
043
3929
5617
4032
7199
5227
5894
5905
5861
5217
62
Несмотря на отсутствие, как аллергических реакций, так и туберкулезных
изменений у животных (n=7) в 5 пробах биологического материала было
детектировано наличие последовательностей ДНК M.bovis в 71% случаев, что
свидетельствует о высокой чувствительности данного теста.
Применение
биоматериале,
ПЦР
для
свидетельствуют
выявления
о
более
возбудителя
высокой
туберкулеза
в
чувствительности
и
специфичности молекулярно–генетического теста по сравнению с рутинной
бактериологической диагностикой. Полученные нами результаты согласуются с
результатами исследований Борисова Т.А. и соавт., 2004; Донченко А.С. и
соавт., 2004; Калмыкова М.С. и соавт., 2006,2007,2008; Корнева И.Н., 2004;
Найманов А.Х. и соавт., 2009; Обухов И.Л. и соавт., 1996; Осипова Е.П., 2004;
Таллер Л.А. соавт., 2011; Шаров А.Н. 2000,2003.
Таким образом, прямой метод детекции ДНК возбудителя туберкулеза
(ПЦР) позволяет в 90% и более выявлять ничтожно малые количества ДНК
M.bovis в инфицированном микобактериями биоматериале еще до проведения
бактериологических исследований, что по времени опережает точность
постановки первичного диагноза на туберкулез.
63
3.5.Результаты поисковых исследований по разработке плотной
синтетической элективной питательной среды для первичного выделения
микобактерий
При проведении бактериологических исследований весьма проблемной
задачей является выделяемость микобактерий на питательных средах. В
последние годы это наблюдают и в производстве микобактериальных
антигенов. В рутинной лабораторной практике это существенно затрудняет
своевременное
выделение
и
последующую
видовую
идентификацию
микобактерий. В лабораторной практике и предприятиях биологической
промышленности применяют различные питательные среды.
Недостатком питательной среды Левенштейна–Йенсена, является ее не
высокая чувствительность к незначительным количествам микобактерий в
посевном материале. К примеру для роста на среде Левенштейна–Йенсена
необходимо присутствие в посевном материале в взвеси микобактерий (1,0 см³)
не менее 100–200 живых микробных клеток.
Подбор питательной плотной среды для выделения микобактерий мы
проводили основываясь на данных по химическому составу микобактерий.
При разработке плотной питательной среды для первичного выделения
микобактерий брали: аммоний лимоннокислый как источник азота и
органической кислоты, способный изменять pH среды в щелочную сторону;
калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый семиводный,
железо
сернокислое,
сернокислый
цинк,
натрий
фосфорнокислый
двузамещенный – как важные источники микроэлементов, неорганические
кофакторы для многих ферментативных реакций, участвующих в связывании
ферментов и субстратов, улучающие рост микобактерий; фумаровая кислота в
качестве стереоспецифического фермента, участвующего в катализе и
гидратации в фумарате; глицерин в качестве консерванта; агар–агар в качестве
полноценного продукта не ингибирующего рост микроорганизмов и не
изменяющего питательную ценность сред. Она отличается от аналогов тем, что
64
аспарагин заменен на гликокол и дополнительно в состав введена фумаровая
кислота. Это обусловлено тем, что гликокол обладает теми же свойства, что и
аспарагин,
но
на
порядок
дешевле
и
выпускается
отечественными
производителями. Данную среду можно стерилизовать при 100°С и выше.
Разработанная
питательная
среда
предназначена
для
ускорения
выявления микобактерий. В её состав включены компоненты необходимые для
роста микобактерий.
В ходе поисковых опытов нами было сконструировано три варианта
среды. Считаем уместным привести их составы в мас /%:
Среда №1.
двузамещенный–2,0;
Аммоний лимоннокислый–1,5; калий фосфорнокислый
магний
сернокислый
семиводный–0,2;
железо
сернокислое–0,1; сернокислый цинк–0,1; гликокол–2,0; фумаровая кислота–2,0;
натрий
фосфорнокислый
двузамещенный–0,5;
хлористый
натрий–0,3;
глицерин–20,0; агар–агар–23,0; глицин–1,5; остальное вода.
Среда №2.
двузамещенный–2,4;
Аммоний лимоннокислый–1,7; калий фосфорнокислый
магний
сернокислый
семиводный–0,3;
железо
сернокислое–0,15; сернокислый цинк–0,15; гликокол–2,5; фумаровая кислота–
2,5; натрий фосфорнокислый двузамещенный–1; хлористый натрий–0,4;
глицерин–22,0; агар–агар–25,0; глицин–1,8; остальное вода.
Среда №3.
двузамещенный–1,8;
Аммоний лимоннокислый–1,3; калий фосфорнокислый
магний
сернокислый
семиводный–0,1;
железо
сернокислое–0,05; сернокислый цинк–0,05; гликокол–1; фумаровая кислота–
1,5; натрий фосфорнокислый двузамещенный–0,3; хлористый натрий–0,15;
глицерин–18,0; агар–агар–21,0; глицин–1,0; остальное вода. Во всех трех
вариантах рH был 7,2±0,2.
Все три варианта испытуемых плотных питательных сред для первичного
выделения микобактерий готовили следующим образом. Навески аммония
лимоннокислого растворяли в горячей дистиллированной воде. Другие соли и
глицерин в указанной выше последовательности добавляли в теплую
дистиллированную воду. После полного растворения добавляли 23,0±2,0 гр.
65
агар–агара. рH среды доводили до нужных параметров дробным добавлением
гидроксида натрия. Стерилизацию проводили автоклавированием в режиме
120°С в течение 30 минут.
Для изучения ростовых свойств микобактерий нами использовались
референтная культура
M.bovis (в концентрации
до 0,00001 мг/мл) и
гомогенаты биоматериала (лимфатические узлы). Посевы проводили на все три
образца испытуемой плотной питательной среды. В качестве аналога для
сравнения использовали среду Левенштейна–Йенсена. Полученные взвеси
высевали по 0,25 см³ на 1 пробирку. Пробирки помещались в термостат при
37°С. Учет ростовых свойств микобактерий на испытуемых опытных образцах
питательных сред и контрольной среды (Левенштейна–Йенсена) проверяли
каждые сутки. Полученные данные представлены в таблице 7.
20/–
(n) культур
(n) проб без
пат.
изменениями
Выделено
в сутки
3.
(n) культур
9/–
Выделено
в сутки
(n) проб с
пат.
изменениями
Среда №3
(n) культур
2.
Среда №2
Выделено
в сутки
Штамм
M.bovis
Среда №1
Рост на среде
Левенштейна
– Йенсена
(контроль)
(n) культур
1.
Рост на испытуемых плотных питательных
средах
–
17±0,3
–
19±0,3
–
18±0,2
–
17±0,2
9
21±0,4
9
28±0,1
9
30±0,3
9
17±0,2
18
24±0,2
15
30±0,1
12
34±0,3
12
Выделено
в сутки
Пат.
материал
(n) проб. биоматериала
МБТ / взвесь
№ п/п.
Таблица 7. Результаты сравнительного изучения ростовых свойств испытуемой
плотной питательной среды
–/0,00001
15±0,1
мг/мл
Первичный рост микобактерий туберкулеза
M.bovis в образце №1
(опытная среда) отмечен на 15–16 сутки. Обнаруживала колонии в виде мелких
с
маковое зерно,
бугорчатых
белого
цвета
(1–2)
образований.
Рост
микобактерий на опытной среде (образец №2) отмечен на 17–18 сутки. В
66
образце №3 рост появился на 19–20 сутки в виде слабозаметных 1–2 колоний
образований величиной меньше макового зерна.
При посеве надосадочной жидкости из биоматериала
на испытуемую
плотную питательную среду (образец №1) первичный рост колоний наблюдали
на 17–18 сутки. Было выделено 27 культур M.bovis.
На испытуемых средах (образцы №2 и №3), рост микобактерий отмечали
на 21–22 и 30–31 сутки. При микроскопии мазков окрашенных по Цилю–
Нильсену обнаруживали полиморфные палочки красного цвета с округлыми
краями (характерно для M.bovis). Колонии были представлены в виде цвета
слоновой кости в R–форме (с бугристыми и неровными краями).
На среде Левенштейна–Йенсена (контроль) рост микобактерий отмечали
в виде единичных бугорчатых образований с просяное зерно, на 18–19 сутки.
Было выделено 21 культура, что на 6 меньше в сравнении с образцом №1.
Исходя из результатов проведенных экспериментальных опытов, можно
сделать заключение о том, что разработанный состав питательной среды имеет
определенное
преимущество
Левенштейна–Йенсена.
перед
стандартной
Использование
этого
питательной
варианта
среды
средой
позволяет
ускорить процесс получения первичных культур микобактерий в среднем от 3
до
5
суток.
Полученные
результаты
использованы
в
Методических
рекомендациях по применению питательных сред для выделения M.bovis и L–
форм,
утверждены
методической
комиссией
факультета
медицины БелГСХА им. В.Я. Горина протокол №4 от 17.12.2014г.
ветеринарной
67
3.6.Изучение
влияния
методов
предпосевной
обработки
биоматериала на рост микобактерий, в том числе L–форм при посевах на
питательные среды
Исследования по изучению ростовых свойств питательных сред провели с
использованием двух видов предпосевной обработки: по методу Аликаевой
А.П. и более щадящего режима с использованием раствора 3% серной кислоты.
В качестве объекта исследований использовали 75 проб биоматериала,
полученного от больных животных: из них 53 без характерных для туберкулеза
изменений: 13 с незначительными увеличениями лимфатических узлов и
кровоизлияниями; 9 с характерными для туберкулеза патологоанатомическими
изменениями в лимфатических узлах.
Посевы проводили на испытуемую плотную питательную среду для
первичного выделения микобактерий и среду Левенштейна–Йенсена.
Результаты исследований по оценке влияния методов предпосевной
обработки на рост микобактерий на плотных питательных средах представлены
в таблице 8.
(n) выделенных
культур(%)
Загрязненность
посевов
Первичный
рост
(сутки)
(n) выделенных
культур(%)
Загрязненность
посевов
Плотная питательная среда
Первичный
рост (сутки)
Питательная среда
Левенштейна–Йенсена
Предпосевная
обработка
75
(n) проб
Таблица 8. Результаты влияния методов предпосевной обработки на рост
микобактерий на плотных питательных средах
А.П. Аликаевой
21±0,3
18 (24,0)
0,6±0,009%
14±0,2
21 (28,0)
0,5±0,009%
3% растворов
серной кислоты
18±0,3
21 (28,0)
1,2±0,009%
16±0,1
22 (29,3)
0,95±0,009
%
–
39
–
–
42
–
Итого
При применении предпосевной обработки биоматериала по Аликаевой
68
А.П. (1940), было выделено: на среде Левенштейна–Йенсена–18 (24,0%)
культур микобактерий, а на испытуемой среде–21 (28,0%). Рост микобактерий
на среде Левенштейна–Йенсена проявился на 20–21 сутки, а на испытуемой на
14–15 сутки. На среде Левенштейна–Йенсена было выявлено 7 культур в R–
форме,
S–форме–11,
а
на
испытуемой
в
R–форме–16,
S–форме–5.
Загрязненность посевов при использовании предпосевной обработки по
Аликаевой А.П. составила 0,6±0,009% на среде Левенштейна–Йенсена и
плотной питательной среде 0,5±0,009%.
При применении 3% раствора серной кислоты было выделено: на среде
Левенштейна–Йенсена 21 (28,0%) культура микобактерий, а на испытуемой
среде–22 (29,3%). Первичный рост наблюдался на 18–19 сутки и 16–17 сутки, ,
соответственно. При этом на среде Левенштейна–Йенсена в R–форме–8, S–
форме–12, а на плотной питательной среде в R–форме–16, S–форме–6.
Загрязненность посевов с использованием предпосевной обработки 3–%
раствором
серной
кислоты
составила
на
среде
Левенштейна–Йенсена
1,2±0,009% и на плотной питательной для первичного выделения микобактерий
0,95±0,009%.
Визуальные данные свидетельствуют о том, что на испытуемой
питательной среде наблюдался более интенсивный рост колоний M.bovis.
От 9 проб (лимфатические узлы с патологоанатомическими изменениями)
во всех случаях наблюдали первичный рост микобактерий на 12–19 сутки.
При посеве 53 проб (лимфатические узлы без патологоанатомических
изменений) во всех случаях результаты были отрицательными.
При посеве 13 проб (лимфатические узлы с незначительным увеличением
и кровоизлияниями) на среде Левенштейна–Йенсена было выделено–28
культур M.bovis. Из них при обработке по методу Аликаевой А.П.: 5 на среде
Левенштейна–Йенсена, и 9 на плотной питательной среде для первичного
выделения микобактерий. При обработке 3% раствором: 6 и 8 культур ,
соответственно.
69
Что касается L–форм микобактерий, то они получены только после
обработки 3% раствором серной кислоты. При этом на среде Дорожковой И.Р.
–13, а на испытуемой питательной среде Белгородской ГСХА–18 культур L–
форм. Применение предпосевной обработки с использованием 3% раствора
серной кислоты позволило выделить на среде Дорожковой И.Р.–54 (72,0%)
культуры L–форм микобактерий; на испытуемой питательной среде–57
(76,0%). Первичный рост культур L–форм наблюдали на 15–16 сутки и 14–15
сутки,
соответственно.
Загрязненность
посевов
при
использовании
предпосевной обработки с использованием 3–% раствора серной кислоты
составила 1,3±0,01% на среде Дорожковой И.Р. и 1,1±0,02% на испытуемой.
Результаты исследований представлены в таблице 9.
(n) выделенных
культур (%)
Загрязненность
посевов
Первичный рост
(сутки)
(n) выделенных
культур(%)
Загрязненность
посевов
Предпосевная обработка
3% растворов
серной кислоты
Среда Дорожковой И.Р.
Питательная среда для
выделения L– форм
микобактерий (БелГСХА)
Первичный рост
(сутки)
(n) проб
75
Таблица 9. Результаты сравнительного изучения ростовых свойств питательных
сред для выделения L–форм микобактерий
18±0,2
54(72,0)
1,3±0,01%
14±0,1
57(76,0)
1,1±0,02%
При оценке ростовой активности L–форм микобактерий на сравниваемых
питательных средах получены следующие результаты. У 9 исследованных проб
(с характерными туберкулезными изменениями в лимфатических узлах), нами
не выделено деструктивных по клеточной стенке L–форм микобактерий, что
касается 13 проб (лимфатические узлы с кровоизлияниями), то в 11 случаях
на обеих средах (84,6%) были выделены L–формы микобактерий. Рост на среде
Дорожковой И.Р. наблюдали на 17 сутки и 15 сутки на испытуемой
питательной среде. Среди 53 проб (лимфатические узлы без патологических
70
изменений) в 49 (65,3%) были выделены L–формы микобактерий. Рост культур
обнаруживали на 12 и 13 сутки.
Рост L–форм микобактерий на питательных средах Дорожковой И.Р. и
питательной среде Белгородской ГСХА, проявился в форме облаковидных
колоний. В поле зрения наблюдали микроструктурные элементы разной
оптической плотности в виде сферобластических аморфных масс.
В целом, разработанный нами вариант солевой плотной питательной
среды для первичного выделения микобактерий позволил выявить на 5 (23,8%)
суток раньше первичный рост микобактерий. При этом выделяемость
используемой культуры M.bovis была на 3 (14,2%) больше. А при
использование предпосевной обработке с применением 3% раствора серной
кислоты рост начался на 2 суток раньше и удалось выделить на одну культуру
больше.
По своим ростовым свойствам питательная среда для выделения L–форм
микобактерий позволила выявить на 4 (22,2%) суток раньше L–формы в
сравнении со средой Дорожковой И.Р..
71
3.7.Изучение
сравнительной
эффективности
дезинфицирующих
средств
3.7.1.Изучение выделяемости культур микобактерий из объектов
внешней среды
Для установления дезинфицирующих свойств, изучаемых препаратов
нами был поставлен эксперимент в условиях неблагополучного по туберкулезу
хозяйства. Для проведения бактериологических исследований отбирали 180
проб из объектов внешней среды (кормушек, стен, поилок, и прилегающий к
ним территории, поверхностные слои почвы, навоза). Результаты исследований
представлены в таблице 10.
Таблица 10. Динамика выделения культур микобактерий из объектов внешней
среды
№
п/п
Исследуемые пробы
(n) проб
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Стены
Пол
Окна
Кормушки
Поилки
Грунт
Навоз
Силос
Сено
Всего
20
20
20
20
20
20
20
20
20
180
Идентифицировано
(n) выделенных выделенные культуры
культур
M.bovis Атипичные
5
2
3
4
2
2
3
–
3
4
2
2
5
1
4
3
1
2
3
1
2
2
–
2
1
–
1
30
9
21
Были выделены микобактерии, относящийся к различным группам по
классификации Раньона: со стен–5, пола–4, окон–3, кормушек–4, поилок–5,
образцов поверхностного грунта–3, навоза–3, силоса–2 и сена–1 культуры, что
показано на рисунке 6.
72
Рисунок 6. Количество выделенных культур микобактерий из различных
объектов внешней среды
По результатам исследований было выявлено 30 культур микобактерий.
Исходя из видовой принадлежности 21 из них отнесены к атипичным
микобактериям и 9 к M.bovis ( рис. 7). Из 9 культур M.bovis выделены: 2–со
стен, 2–пола, 2–кормушек, 1–поилок, 1–грунта, навоза–одна. 21 культура
атипичных микобактерий была выделена со стен–3, пола–2, окон–3, кормушек–
2, поилок–4, проб грунта–2, проб навоза–2, проб силоса–2, проб сена–1.
Рисунок 7. Соотношение выделенных культур микобактерий из объектов
внешней среды (%)
При проведении культуральных исследований от 10 проб из каждого
объекта внешней среды первичный рост на среде Левенштейна–Йенсена
отмечали рост на 26–27 сутки (M.bovis) и 9–10 сутки (атипичные
73
микобактерии), в R–форме при культивировании в термостате с температурой
37,0°С±0,5°С.
Изучаемые типичные культуры M.bovis не росли при 25°С и 45°С и не
подвергались
гидролизу
твин–80,
имели
отрицательную
каталазную,
никотинамидазную, пиразинамидазную активность, не образовывали пигмента,
не давали роста на среде с 5% хлористым натрием и салицилатом натрия, имели
отрицательную
реакцию
с
теллуритом
калия
и
мочевиной,
плохо
суспендировались в физиологическом растворе. Подкожное введение взвеси
изучаемых культур в дозе 1,0 мг/см3 морским свинкам обусловливало
сенсибилизацию организма морских свинок к ППД – туберкулину для
млекопитающих. Эта реакция выявлялась на 21 сутки. Состояние ПЧЗТ
сохранялось на протяжении 3–х месяцев. У убитых лабораторных животных
были выявлены туберкулезные изменения в паренхиматозных органах.
Из полученных 21 культуры микобактерий: 8 были типированы по
результатам биохимическим тестов, как быстрорастущие M.fortuitum по
классификации Раньона, проявляющие сплошной рост на 5–6 сутки при
выдерживание в температурном режиме при 25°С и 37°С.
Рисунок 8. Соотношение
микобактерий
выделяемости различных видов атипичных
74
При 45°С рост колоний нами не наблюдался. Все выделенные культуры
микобактерий росли в виде бугристых, складчатых, влажных колоний белого
цвета в R–форме. По результатам биохимических исследований 13 культур
были отнесены к виду M.scrofulaceum–4 группы по Раньону, а 7 культур к виду
M.murinum, 2 к группе–скотохромогеных (рис. 8).
Таким образом, при изучении выделяемости культур микобактерий из
объектов
внешней
классифицированы
среды
как
было
M.bovis,
установлено,
что
8–M.fortuitum,
из
культур,
30
4–M.scrofulaceum;
9
7–
M.murinum, 2–скотохромогеных. Это свидетельствует о развитии в данном
неблагополучном пункте, среди поголовья, как микобактериозов, так и
истинного туберкулеза. В связи с этим была поставлена задача о возможности
воздействия на второе звено эпизоотической цепи (механизмы и факторы
передачи)
экологически
безопасных
дезинфицирующих
веществ,
инактивирующих, как возбудителя M.bovis, так и атипичных микобактерий без
нанесения ущерба животноводческим помещениям и окружающей среде.
3.7.2.Изучение бактерицидных свойств анолитов приготовленных по
технологии «АКВА–ЭХА» в камеральных условиях
Наработку электрохимических растворов проводили
на установке
«АКВА–ЭХА» при использовании параметров силы тока от 9 до 12А. Образцы
электрохимических растворов в дальнейшем подвергали бактерицидному
тестированию в отношении M.bovis с использованием стандартных тест–
объектов (деревянная, стеклянная, кафельная плитка). Полученные растворы
представляли собой бесцветную прозрачную жидкость, обладающую слабым
запахом хлорированной воды. В данных растворах в период релаксации,
концентрация кислородных соединений в анолите сохранялась на уровне
близком к начальному, а биоцидная активность была стабильной в течение 6
месяцев.
Используя
технологию
электрохимической
активации
(ЭХА)
основанную на униполярном воздействии постоянного электрического поля
75
высокой напряженности на слабоминерализованные (1–5 г/л) растворы в
специальных установках–электролизерах, были получены дезинфицирующие
растворы (анолиты), обладающие бактерицидными свойствами.
Поскольку
задачей
наших
исследований
было
изучение
антимикобактериальной активности антисептических растворов, полученных
по технологии «АКВА–ЭХА» и имеющих в своем составе соединения
пергидроля и хлорноватистые соединения с рH от 4 до 10 растворов, то их
сравнивали
с
другими
известными
пергидроль–,
хлор–содержащим
дезинфицирующими препаратами "Кристалл 1000" и "Хлорантоин".
По
результатам
бактериологических
исследований
(табл.
11)
в
контрольном тесте, где не применяли дезинфицирующие вещества (чистый
контроль), а обрабатывали тест–объекты только стерильной дистиллированной
водой) рост культур микобактерий на среде Левенштейна–Йенсена проявлялся
на 9–10 сутки.
В начале, они были в виде единичных колоний величиной с просяное
зерно, а в дальнейшем на 20–21 сутки, проявлялись сплошным ростом
микобактерий бело–кремового цвета. В тесте, где применяли 3% раствор
NaOH, в течение 3–х месяцев роста микобактерий не наблюдали. В изучаемых
пробах (№4–6) наблюдали первичный рост микобактерий на 29–30 сутки
(проба №6) в виде первоначально единичных колоний бело–кремового цвета. В
пробе № 5 первичный рост наблюдали на 48–49 сутки в виде колоний бело–
кремового цвета. В образце № 4 рост микобактерий туберкулеза в виде
единичных колоний наблюдали на 39–40 сутки.
На питательных средах
Левенштейна–Йенсена, (посев из образцов, обработанных растворами №1, №2
и №3), роста микобактерий не отмечено. При испытании аналога "Кристалл–
1000" первичный рост уже наблюдали на 29–30 сутки, который проявлялся
единичными
колониями
с
просяное
зерно
бело–кремового
цвета
с
последующим множественным разрастанием всех колоний. При использование
"Хлорантоина"
рост
микобактерий
был
отмечен
на
28–29
сутки,
76
проявляющейся наличием единичных колоний кремового цвета, которые в
дальнейшем сливались между собой в сплошные конгломераты.
Таблица 11. Изучение бактерицидных свойств электрохимических растворов на
культуре M.bovis.
№
п/п
1.
2.
3.
Испытуемые
вещества
Рост колоний
МБТ на ___ сутки
Электрохимические растворы по
технологии «АКВА–ЭХА»
№1
–
№2
–
№3
–
4.
№4
39±0,4
5.
№5
48±0,3
6.
№6
29±0,2
7.
Кристалл
1000
29±0,3
8.
Хлорантоин
28±0,6
Характеристика роста колоний МБ на
питательной среде Левенштейна–Йенсена
из проб, полученных на деревянных тест–
объектах
Рост отсутствует
Рост отсутствует
Рост отсутствует
Единичные колонии с просяное зерно бело–
кремового цвета
Единичные колонии с просяное зерно бело–
кремового цвета
Колонии с просяное зерно бело–кремового
цвета
Аналоги
Множественные
сливающиеся
колонии
белого цвета
Множественные колонии
переходящие в
сплошной налёт кремового цвета
Контроль
9.
Контроль
10.
Контроль
едкий натрий
9±0,3
Сплошной рост
кремового цвета
Рост отсутствует
в
виде
налёта
бело–
Полученные результаты исследований позволяют сделать следующее
заключение.
Электрохимические
растворы,
полученные
по
технологии
«АКВА–ЭХА», в отношении микобактерий туберкулеза обладают достаточно
выраженными бактерицидными свойствами. Наиболее устойчивые показатели
бактерицидности наблюдались у растворов полученных при силе тока – 10А с
содержанием активного хлора 250 мг/л и рН 6–7, – 12А с содержанием
активного хлора 400 мг/л и рН 6±0,5 и 9А с содержанием активного хлора 300
мг/л и рН 5. При использовании этих растворов при посевах смывов на среду
Левенштейна–Йенсена (роста не наблюдалось в течение 3–х месяцев после
посева). Дезинфицирующие препараты (аналоги), имеющие в своем составе
77
соединения пергидроля и хлорсодержащие компоненты "Хлорантоин" и
"Кристалл–1000",
уступали
по своему бактерицидному действию,
что
проявлялось ростом на 28±0,6 и 29±0,2 сутки в виде единичных, (с просяное
зерно бело–кремового цвета колоний). Данное бактерицидное действие
электрохимических растворов обусловлено низкой минерализацией анолита
АНК, его повышенной гидратационной способностью, что способствует
увеличению проницаемости клеточных стенок и мембран, создаёт условия для
интенсивного осмотического и электроосмотического переноса оксидантов во
внутриклеточную среду. В качестве теоретического пояснения, можно
говорить, что осмотический перенос оксидантов через оболочки и мембраны
микробных клеток проявляется интенсивнее, ввиду существенного различия
осмотического градиента этих клеток. Ускоренному электроосмотическому
переносу
оксидантов
внутрь
бактериальных
клеток
способствуют
многочисленные электрически заряженные микропузырьки электролизных
газов, создающие в зонах контакта с биополимерами мощные локальные
электрические поля с высокой степенью неоднородности. По всей видимости,
полученные электрохимические растворы, №1–(рН 6–7) с концентрацией
активного хлора 250 мг/л, полученным при силе тока 10А; №2–(рН 6±0,5) с
концентрацией активного хлора 400 мг/л, получали при силе тока 12А; №3–(рН
5) с концентрацией активного хлора 300 мг/л, полученным при силе тока 9А
обладают наиболее стойкими бактерицидными свойствами с постоянным рН
(от 5 до 7). Понижения или увеличения рН не меняет степень проникновения,
как пергидрольных, так и хлорноватистых соединений. Другие же сильно
кислые или щелочные растворы при нанесение на тест–объекты в значительной
степени меняют свой рН в зависимости от обрабатываемой поверхности.
В контроле, применение едкого натра обеспечило полное уничтожение
микобактерий. В контроле (где использовали дистиллированную воду) были
выявлены ожидаемые результаты т.е. на питательных средах наблюдали
сплошной рост микобактерий на 9–10 сутки.
78
3.7.3. Сравнительное изучение дезинфицирующих свойств растворов,
полученных по технологии «АКВА–ЭХА» в условиях неблагополучного
по туберкулезу хозяйства
Поскольку
в
камеральных
опытах
наилучшими
бактерицидными
свойствами в отношение M.bovis обладали антисептические растворы, с рН 6–7
и концентрацией активного хлора 250,0 мг/л (раствор №1), с рН 6±0,5 и
концентрацией активного хлора 400,0 мг/л (раствор №2), с рН 5 и
концентрацией активного хлора 300,0 мг/л (раствор №3), то их научно–
производственные испытания проводили в нативном виде в условиях
неблагополучного по туберкулезу хозяйства в сравнении с 3% раствором
NaOH. В первом животноводческом помещение (коровнике) обработку
проводили нативным раствором №1 «АКВА–ЭХА» с концентрацией активного
хлора 250,0 мг/л, рН 6–7. Во втором помещении использовали раствор №2 с
концентрацией активного хлора 400,0 мг/л, рН 6±0,5. В третьем помещении
применяли раствор №3 с концентрацией активного хлора 300,0 мг/л рН 5.
Распыление дезинфицирующих веществ проводили с помощью установки
Karcher из расчета 1000,0 см³/м² в помещении и 3000,0 см³/м² при обработке
прилегающей территории и почвы. Смывы и соскобы с кормушек, стен, поилок
проводили через 30 минут, 1 час, 3, часа, 5 часов, 12 часов с последующим
посевом на питательные среды Левенштейна–Йенсена. Для контроля брали
стандартный 3% раствор NaOH, используемый в большинстве хозяйств, как для
вынужденной,
так
и
профилактической
дезинфекции.
В
результате
проведенных исследований установлено, что после применения стандартного
3% раствора NaOH и исследования смывов и соскобов произведенных через 30
минут рост культур микобактерий обнаруживали в пробах, со стен–1, пола–2,
кормушек–1. Из них выделено 4 культуры M.bovis и 1 культура атипичных
микобактерий M.scrofulaceum (табл. 12).
79
Таблица 12. Результаты бактериологических исследований после применения
3% раствора NaOH, через 30 минут после обработки
№
п/п
Исследуемые
поверхности
(n) проб
(n) выделенных
культур
1
2
3
4
стены
полы
окна
кормушки
Всего
20
20
20
20
80
1
2
–
2
5
Идентифицировано
выделенные культуры
M.bovis M.scrofulaceum
1
–
2
–
–
–
1
1
4
1
Через час после обработки с полученных смывов и соскобов выделено
две культуры микобактерий, из которых одна отнесена была к M.bovis, а одна к
M.fortuitum (табл. 13). Из смывов проведенных через 3, 5 и 12 часов роста
микобактерий на питательных средах не обнаружено.
№ п/п
Таблица 13. Результаты бактериологических исследований после применения
3% раствора NaOH, через 1 час после обработки
Исследуемые
поверхности
1
2
3
4
стены
пол
окна
кормушки
Всего
(n) выделенных
(n) проб
культур
20
20
20
20
80
–
1
–
1
2
Идентифицировано
выделенные культуры
M.bovis
M.fortuitum
–
–
–
1
–
–
1
–
1
1
После обработки раствором №3 и при проведении культуральных
исследований со смывами и соскобами, полученными через 30 минут после
обработки, выделено 4 культуры микобактерий из них 1 была отнесена к
M.bovis, а остальные 3 к M.scrofulaceum (табл. 14).
80
№ п/п
Таблица 14. Результаты бактериологических исследований после применения
раствора №3, через 30 минут после обработки
Исследуемые
поверхности
1
2
3
4
стены
пол
окна
кормушки
Всего
(n) выделенных
(n) проб
культур
20
20
20
20
80
1
1
–
2
4
Идентифицировано
выделенные культуры
M.bovis
Атипичные
1
–
–
1
–
–
–
2
1
3
В последующем при бактериологическом контроле через 1, 3, 5 и 12
часов микобактерии на питательных средах не вырастали. После применения
растворов №1 и №2 в период через 30 минут, 1, 3, 5 и 12 часов при
использовании культуральных исследований в пробах сделанных в этот период
со смывов и соскобов, роста микобактерий не выявляли.
Рост культур микобактерий обнаруженный через 30 минут после
применения образца №3, (в условиях эпизоотологического эксперимента) и его
отсутствие при дальнейшем исследовании через 1, 3, 5 и 12 часов, по нашему
мнению связано с тем, что после механической очистки в полах, на стенах, в
кормушках остается большое количество органических соединений, которые
забирают на себя часть активного вещества раствора. В дальнейшем, при более
длительном воздействии как хлорноватистых, так пергидрольных соединений
происходит
полное
обезвреживание
микобактерий,
что
подтверждено
отсутствием высеиваемости их через 1, 3, 5 и 12 часов.
При
проведении
сравнительных
исследований
дезинфицирующих
свойств растворов №1, №2, №3, как в камеральных так и в эпизоотологическом
опыте установлено, что они обладают высокими бактерицидными свойствами,
обеспечивающими инактивацию, как возбудителей туберкулеза M.bovis так и
атипичных микобактерий. Рост культур микобактерий, со стен 1–M.bovis, пола
2–M.bovis, кормушек: 1–M.bovis, 1–M.scrofulaceum в опытной группе, где
применяли 3% NаOH (через 30 минут) по всей видимости связан не только с
81
высокой гигроскопичностью растворов NаOH, но и со слабой проникающей
способностью в глубокие слои деревянных поверхностей помещений. Это
подтверждается данными, полученными через 1, 3, 5 и 12 часов, когда через 1
час количество выделенных культур уже уменьшилось в 2,5 раза. Полное
отсутствие выделяемости микобактерий из исследуемых смывов через 3, 5 и 12
часов связано с полным и глубоким проникновением дезинфицирующего
раствора и инактивацией микобактерий 3% NaOH, как в деревянных
покрытиях, так и в оштукатуренных стенах, где они могли находиться.
Проведенные исследования позволяют сделать заключение о том, что
экологически безопасные анолитные бактерицидные растворы, с рН 5–7 и
концентрацией
активного
хлора
250–400 мг/л
превосходят
по своим
дезинфицирующим свойствам обычно применяемый 3% NaOH и могут
успешно применяться для профилактической, так и вынужденной дезинфекции
в хозяйствах неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота. По
результатам исследований разработаны методические рекомендации по
применению
питательных
сред
для
выделения
M.bovis
и
L–форм,
утвержденных методической комиссией факультета ветеринарной медицины
БелГСХА им. В.Я. Горина протокол №4 от 17.12.2014г.
82
4.0. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исходным началом диссертационного исследования являлся анализ
эпизоотической ситуации туберкулезу крупного рогатого скота на территории
Российской Федерации, в Белгородской области на примере конкретного
хозяйства. Этот анализ свидетельствует о стационарном неблагополучии ряда
регионов и областей РФ по этой инфекции.
При использовании показателей частоты выявления реагирующих на
туберкулин животных,
уровня заболеваемости туберкулезом, динамики
выявления и оздоровления неблагополучных пунктов, данных статистики
послеубойных
диагностических
пространственно–временной
исследований,
динамике
а
так
же
интенсивности
данных
о
проявления
эпизоотического процесса при туберкулезе крупного рогатого скота, выявлена
тенденция
носящая
перемежающий
характер
усугубление
развития
эпизоотического процесса в ряде регионов и хозяйств. Если в начале 2011 года
наблюдали снижение, то уже к 2013 году повышение выявляемости новых
неблагополучных пунктов. В целом за период с
2008 по 2012 гг
эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в регионах
Российской Федерации изменялась следующим образом. В 2008 г туберкулез
регистрировался в 26 неблагополучных пунктах, в том числе: в Белгородской
(1), в Курской (2), в Липецкой (2), в Тульской (1), в Омской (1), в
Новосибирской (1), в Челябинской (1), в Амурской (2) и Рязанской (3) областях;
в Ставропольском (4) и Краснодарском крае (1); в Республиках Ингушетия (2),
Дагестан (2), Татарстан (1). В 2009 году было выявлено всего 10 новых
неблагополучных пунктов, в том числе: в Белгородской (1), в Московской (1), в
Тульской (3), в Челябинской (1) и Ростовской (1) областях, Республике
Ингушетия (1) и Ставропольском крае (2). В 2010 году количество новых
неблагополучных пунктов в РФ составило 20 по регионам: в Волгоградской–1
(8 больных туберкулезом), в Иркутской–1 (50), в Курской–1 (18), в
Новосибирской–2 (102), в Орловской–2 (426), в Пермской–2 (322), в Рязанской–
83
1 (5), в Саратовской–2 (151), в Тамбовской–1 (1), в Тюменской–1 (2) и
Ульяновской–1 (345) областях, Республиках Калмыкия–1 (14), Мордовия–1
(18), Северная Осетия–1 (58) и Чечня (1), в Красноярском крае–1 (4). Самый
низкий показатель выявляемости новых неблагополучных пунктов был в 2011
году (7). В их числе Новосибирская–2, Тульская–1, Оренбургская–1,
Нижегородская–1 области, Республики Татарстан–1, Ингушетия–1, общее
количество больных туберкулезом животных 495. В 2012 году было выявлено
17 новых неблагополучных пунктов (2,5 раза больше по сравнению с
предыдущем годом), В их числе: Алтайский–1 и Краснодарский край–1,
Амурская–1, Белгородская–3, Курская–1, Новосибирская–1, Саратовская–2,
Тульская–3 области, в Республиках Кабардино–Балкария–1, Мордовия–1,
Татарстан–1 и Чечня–1. В 2013 году наблюдалось повышение выявляемости
новых неблагополучных пунктов. По регионам: в Алтайском–1 (3больных
туберкулезом) и Красноярском крае–1 (144), Республиках Мордовия–1 (144) и
Татарстан–8 (692); по областям в Белгородской–1 (218), Самарской–1 (16),
Тульской–1 (121), Тюменской–2 (49), Ульяновской–1 (114), Курской–1 (67),
Омской–2 (114).
Первостепенное значение в распространении возбудителя туберкулеза
крупного рогатого скота, имеют животные с активным туберкулезным
процессом (источник возбудителя инфекции), которые непрерывно выделяют
во внешнюю среду миллиарды микробных клеток. Таких животных среди
реагирующих на туберкулин, в последние пять лет, выявлялось от 16,47% до
26,96%. Эти данные свидетельствуют о сложной эпизоотической ситуации по
туберкулезу. В период с 2008 по 2013гг ежегодно, по состоянию на 01.01,
регистрировалось
от
33
до
82
неблагополучных
пунктов.
Реально
оздоравливалось от 6 до 33. Наблюдалась тенденция понижения (в 2 раза)
выявляемости
реагирующих
на
туберкулин
больных
животных
в
неблагополучных пунктах РФ, что позволяет прогнозировать постоянное
наличие скрытой туберкулезной инфекции во всех ранее зарегистрированных
стационарно–неблагополучных пунктах.
84
Интенсивность
проявления
эпизоотического
процесса
(уровень
заболеваемости) при туберкулезе в 2008 году была на уровне 0,017%. В
дальнейшем, к 2012–2013 годам показатель уровня заболеваемости вырос до
0,028%. В целом по России заболеваемость за период с 2008 по 2013 гг
составила 0,027%. Полученные показатели заболеваний коррелируют с
данными Бойко А. А. (1991), Гулюкин, М.И. (2012), Данко Ю.Ю. (1998,1999),
Донченко А.С. (1997), Евглевский А.А. (1994), Найманов А.Х.
(2013),
Овдиенко Н.П. (2009), Солодова И.В. (2011), Тупота С.Г. (2010), Яременко Н.А.
(2002).
Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в ряде
регионов
РФ
Применительно
эпизоотическая
характеризовалась
к
Белгородской
обстановка
по
устойчивым
области
туберкулезу
неблагополучием.
достаточно
крупного
напряженная
рогатого
скота
наблюдалась в ООО «Семхозе Ракитянский». Наглядным подтверждением
этому является то, что при диагностическом убое 349 голов было выявлено
37%
туш
с
характерными
для
туберкулеза
патологоанатомическими
изменениями (24% от общего числа убитых).
С 2012 по 2013 годы, в ООО "Семхоз Ракитянский" ежемесячно
подвергалось туберкулинизации: 2741, 1818, 1409, 3481, 2536, 2580, 2612, 2107,
2045 голов. Количество реагирующих на туберкулин животных, соответственно
составило:194, 99, 94, 166, 117, 58, 43, 7, 55 голов. О широком распространении
и сложности эпизоотической ситуации по туберкулезу свидетельствовали
результаты реагирования на туберкулин 117 телок (2–18 мес. возраста). Доля
животных реагирующих на туберкулин, по отношению к числу убитых с
туберкулезными изменениями, колебалась в пределах от 7,08% до 0,33%.
Снижение показателя выявляемости реагирующих на туберкулин животных в
летний период вполне
возможно было связано с воздействием высокой
атмосферной температуры.
Жаркая погода является неблагоприятным
фактором, в результате чего снижается иммунобиологическая реактивность
организма животных.
85
В ноябре 2012 года было выявлено реагирующих на туберкулин 194
голов, в т.ч. 179 коров, 3 телки (6–12 мес. возраста) и 12 телок (12–18 мес.
возраста). Интенсивность кожной реакции была следующей: у двух телок (6–12
мес. возраста), утолщение кожной складки составило 3–5 мм, у одной головы
более 5; у 7 телок (12–18 мес. возраста) 3–5 мм, у 5 от 5 до 10 мм. Что
составило 34,5%, 29,5%, 36%, соответственно. В декабре положительно
реагировало 99 гол., в т.ч. 38 коров, 34 телки (6–12 мес. возраста) и 27 бычков
(2–6 мес. возраста). Интенсивность кожной реакции была следующей: у 6 телок
(6–12 мес. возраста) утолщение кожной складки от 3 до 5 мм, у 11 от 5 до 10
мм, 17 голов более 10 мм; у 5 бычков (2–6 мес. возраста) 3 до 5 мм; 7 голов с
утолщением от 5–10 мм; у 15 голов более 10 мм. Что составило 30,6%, 26,5%,
42,9%, соответственно. В январе положительную реакцию дали 94 гол.
Интенсивность кожной реакции была следующей: у 64 коров утолщение
кожной складки от 3 до 5 мм; у 20 от 5 до 10 мм; у 10 голов более 10мм. Что
составило 60,08%, 21,28%, 10,64%, соответственно. В феврале выявлено
реагирующих 166 гол., в т.ч. 35 коров, 62 телки (2–6 мес. возраста), 11 телок
(12–18 мес. возраста), бычки (2–6 мес. возраста)–58 голов. Интенсивность
кожной реакции была следующей: у 28 голов с утолщением кожной складки
телок (2–6 мес. возраста) на 3 до 5 мм; у 24 голов от 5 мм до 10 мм; у 10 голов
более 10 мм; у 11 телок (2–18 мес. возраста) от 3 до 5 мм; у 23 бычков (2–6 мес.
возраста) от 3 до 5 мм; у 29 голов от 6 до 10 мм; у 6 более 10 мм. Что составило
46,4%, 38,6%, 15%, соответственно. В марте было выявлено 117 реагирующих
на туберкулин животных, в том числе 111 коров и 6 телок (2–18 мес. возраста).
Интенсивность кожной реакции была следующей: у 6 телок (6–12 мес.
возраста) с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм. Что составило 71%,
16,2%, 12,8%, соответственно. В апреле положительную реакцию дали 58
голов, в т.ч. 35 коров, 11 телок (2–6 мес. возраста), 5 телок (12–18 мес.
возраста), бычки (2–6 мес. возраста) – 17 голов. Интенсивность кожной реакции
была следующей: 9 телок (2–6 мес. возраста) утолщение кожной складки от 3
до 5 мм; у одной головы более 5 мм; и у одной головы более 10 мм; у 4 телок
86
(2–18 мес. возраста) от 3 до 5 мм; у одной головы более 5 мм; у 14 бычков (2–6
мес. возраста) от 3 до 5 мм; у 2 голов от 5 до 10 мм; у одной головы более 10мм.
Что составило 74.1%, 22,4%, 3,5%, соответственно. В мае положительную
реакцию дали 43 головы крупного рогатого скота. Интенсивность кожной
реакции была следующей: у 36 коров утолщение кожной складки от 3 до 5 мм;
у 4 от 5 до 10 мм; у 3 голов более 10 мм. Что составило 83,7%, 9,3%, 7%,
соответственно. В июне положительно реагировали на туберкулин 7 голов.
Интенсивность кожной реакции была следующей: у 2 коров утолщение кожной
складки от 3 до 5 мм; у 3 от 5 до 10 мм; у 2 голов более 10 мм. Что составило
28,5%, 43%, 28,5%, соответственно. В июле положительная реакция на
туберкулин была выявлена у 55 животных. Интенсивность кожной реакции
была следующей: у 28 коров утолщение кожной складки от 3 до 5 мм; у 17 от 5
до 10 мм; у 10 голов более 10мм. Что составило 50,91%, 30,91%, 18,18%,
соответственно.
О достаточно высоком уровне чувствительности больных к туберкулину
свидетельствовали
результаты
убоя
животных.
Патологоанатомические
изменения, характерные для туберкулеза, были обнаружены: в ноябре (2012) у
133 голов, что составляло 68,55%; в декабре 32 голов (32,32%); в январе
2013года 32 головы (34,04%); в феврале 63 голов (37,95%); в марте 16 голов
(13,68%); в апреле 6 голов (10,34%); в мае 15 голов (34,88%); в июле 2 головы
(3,63%). У молодняка крупного рогатого скота до 1,5 годовалого возраста
туберкулезные
поражения
отсутствовали.
реагирования на туберкулин, убоя
В
дальнейшем,
после
пика
больных, показатели обнаружения
туберкулезных поражений снизились в 10 раз (до 3,63%).
При сопоставлении показателей интенсивности аллергических реакций на
туберкулин и наличием туберкулезных изменений у убитых животных мы не
выявили четкой корреляционной связи, что согласуется с данными Евглевского
Ал.А. (1997), Кассич В.Ю. (2004), Козлова В.Е. (2004), Мартма О.В. (1978),
Найманова А.Х. и соавт. (2014), Овдиенко Н.П. и соавт. (1995), Урбан В.П. и
соавт. (1966,1983). Наглядным подтверждением этому являлись случаи, когда у
87
животных с высокой интенсивностью кожной реакции на туберкулин при убое
отсутствовали туберкулезные изменения в лимфатических узлах. И наоборот, у
коров с минимальной реакцией на туберкулин (утолщение кожной складки 3
мм) наблюдали характерные туберкулезные изменения.
При оценке чувствительности метода ПЦР было установлено, что из 29
исследованных проб патологоанатомического материала в 27 случаев были
выявлены ДНК M.bovis. Таким образом, результаты применения ПЦР для
выявления возбудителя туберкулеза в биоматериале, свидетельствуют о более
высокой чувствительности и специфичности молекулярно–генетического теста
по сравнению с рутинной бактериологической диагностикой. Полученные нами
результаты согласуются с результатами исследований Борисова Т.А. и соавт.,
2004; Гребенникова Т.В., 2004; Донченко А.С. и соавт., 2004; Калмыкова М.С. и
соавт., 2007, 2008; Корнева И.Н., 2004; Найманов А.Х. и соавт., 2009,2014;
Обухов И.Л. и соавт., 1996,1997; Осипова Е.П., 2004; Таллер Л.А. соавт., 2011;
Шаров А.Н. 2000,2003.
Еще одной проблемной задачей, которой мы коснулись в своем
диссертационном
исследовании,
являлось
повышение
эффективности
первичного выращивания микобактерий на питательных средах. В последние
годы наблюдается тенденция к снижению ростовой активности микобактерий
на известных питательных средах. Это наблюдают и в производстве
микобактериальных антигенов и в рутинной лабораторной практике. Это
существенно затрудняет своевременное выделение и последующую видовую
идентификацию микобактерий (Аликаева А.П., 1979; Банникова В.Н. с соавт.,
1979; Боганец Н.С., 2006; Головченко М.В. с соавт., 2002; Донченко А.С. с
соавт., 2000,2006; Дорожкова И.Р., 1992; Тупота Н.Л. с соавт., 2010 и др.). Для
выделения микобактерий мы использовали испытуемый состав солевой
(минеральный) питательной среды и среду Левенштейна–Йенсена. В качестве
биоматериала использовали 75 проб от больных туберкулезом животных
(имевших характерные туберкулезные изменения в лимфатических узлах);
незначительные
увеличения
лимфатических
узлов
и
без
88
патологоанатомических изменений. Предпосевную обработку проводили
по
методу Аликаевой А.П.(1940) и с использованием раствора 3% серной кислоты
(Тарасова Е.В., 2012). Посевы проводили на элективные питательные среды: –
Левенштейна–Йенсена, испытуемый вариант плотной питательной среды
Дорожковой И.Р. и питательную среду для выращивания L–форм микобактерий
Белгородской ГСХА.
В камеральном опыте первичный рост M.bovis на испытуемом варианте
усовершенствованной плотной питательной среде появлялся на 15–16 сутки в
виде мелких с маковое зерно, бугорчатых белого цвета (1–2) колоний. На среде
Левенштейна–Йенсена рост микобактерий в виде единичных с просяное зерно
бугорчатых образований, обнаруживался на 18–19 сутки.
В ходе лабораторного тестирования было установлено, что минеральная
плотная питательная среда содержащая: аммоний лимоннокислый–1,5; калий
фосфорнокислый двузамещенный–2,0; магний сернокислый семиводный–0,2;
железо сернокислое–0,1; сернокислый цинк–0,1; гликокол–2,0; фумаровая
кислота–2,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный–0,5; хлористый натрий–
0,3; глицерин–20,0; агар–агар–23,0; глицин–1,5; остальное вода, позволяет
значительно, в среднем на 3–4 дня, ускорить время получения первичных
культур микобактерий.
Еще один аспект, отраженный нами в диссертационном исследовании,
касался предпосевной обработки. В наших исследованиях предпосевная
обработка с использованием 3% раствора серной кислоты, позволила
качественно улучшить биоматериал для последующего посева на питательные
среды. Загрязненность питательных сред с использованием данной методики
увеличилась в 2 раза с 0,5±0,009% и 1,2±0,009%.
Еще один важный аспект – специфичность. Эти исследования мы провели
с
использованием
53
проб
биоматериала
(лимфатические
узлы
без
туберкулезных поражений). Рост микобактерий на испытуемой питательной
среде и на стандартной среде Левенштейна–Йенсена отсутствовал. Напротив,
от 9 проб (лимфатические узлы с характерными для туберкулеза изменениями)
89
во всех случаях на обеих средах проявлялся рост микобактерий. На среде
Левенштейна–Йенсена на 18–19 сутки, а на испытуемой на 12–15 сутки. При
использовании 13 проб биоматериала (кровоизлияния в лимфатических узлах
или их незначительное увеличение) во всех случаях наблюдали рост колоний
микобактерий. На среде Левенштейна–Йенсена на 19–24 сутки, а на
испытуемой на 16–19 сутки.
При сравнительном изучении ростовых свойств питательных сред для
выделения L–форм микобактерий (тестирование на 9 пробах с характерными
туберкулезными изменениями), на обеих питательных средах, нами не
выделено деструктивных по клеточной стенке L–форм микобактерий. Что
касается 13 проб (с незначительным увеличением лимфатических узлов или
кровоизлияниями в них) в 11 случаях (84,6%) на 17 сутки на среде Дорожковой
И.Р. были выделены L–форм и микобактерий. Рост L–форм микобактерий на
испытуемой питательной среде наблюдали на 14–15 сутки. Выделено 57 L–
форм микобактерий.
Применение предпосевной обработке лимфатических узлов по методике
Аликаевой А.П.(1940) было не информативным. Рост L–форм микобактерий
как на питательной среде Дорожковой И.Р., так и на питательной среде для
выделения L–форм отсутствовал. Это связано с тем, что высокая концентрация
серной кислоты, используемая данной методике, обезвреживает деструктивные
по клеточной стенке L–формы микобактерий. Напротив, применение 3%
раствора серной кислоты, с использованием того же биоматериала, позволило
выделить на среде Дорожковой И.Р.–54 (72%) культуры микобактерий, а на
питательной среде Белгородской ГСХА–57 (76%) L–форм микобактерий.
Первичный рост наблюдался на 15–16 сутки и 14–15 сутки, соответственно.
Загрязненность посевов при использовании предпосевной обработки 3–%
раствором серной кислоты составила на среде Дорожковой И.Р. 1,3±0,01% и
1,1±0,02% на питательной среде для выделения L–форм микобактерий.
L–форм микобактерий на питательных средах Дорожковой И.Р. и
питательной среде Белгородской ГСХА росли в форме облаковидных колоний.
90
При проведении фазово–контрастной микроскопии, в поле зрения наблюдали
микроструктурные
элементы
разной
оптической
плотности
в
виде
сферобластических аморфных масс.
Эти сведения о выделяемости L–форм микобактерий совпадают по своей
значимости с данными Быкова С.Ю., 1994; Гертман М.И., 1988; Дорожковой
И.Р., 1982; Коваленко А.М. и соавт., 2012; Кузьмина В.А. и соавт., 2012;
Тарасовой Е.В. и соавт., 2012.
Особую значимость в системе мер борьбы с туберкулезом придается
дезинфекции помещений и скотных дворов. В настоящее время для
дезинфекции животноводческих помещений, наряду с известными средствами,
предлагается целый ряд новых, качественно улучшенных дезинфектантов
(Аржаков В.Н., 2002, с соавт., 2004; Березнев А.П. с соавт., 1990,1994; Борознов
С.Л. с соавт., 2006; Бутко М.П. с соавт., 2003; Высоцкий А.Э. с соавт., 2006 и
др.).
Выбор
того
рекомендациями
или
иного дезинфектанта
производителей.
Большое
определяется
значение
имеют
не
только
результаты
независимых экспертиз, в том числе научно–производственных испытаний.
Именно
этот
аспект
был
запланирован
в
нашем
диссертационном
исследовании. В своих исследованиях мы использовали растворы анолитов, с
различным рH и содержанием хлорноватистых соединений. Растворы готовили
с использованием прибора «АКВА–ЭХА» "Изумруд" г. Санкт–Петербург.
Наиболее устойчивые показатели бактерицидности, наблюдались у
растворов полученных при силе тока 10А с содержанием активного хлора 250
мг/л и рН 6–7, 12А с содержанием активного хлора 400 мг/л и рН 6±0,5 и 9А
имеющим в своем составе содержание активного хлора 300 мг/л и рН 5,
обеспечивающих отсутствие роста микобактерий туберкулеза на среде
Левенштейна–Йенсена в течение 3–х месяцев после посева. Дезинфицирующие
средства,
на
основе
пергидроля
и
хлорсодержащих
компонентов
"Хлорантоин" и "Кристалл–1000", уступали по своему бактерицидному
действию. Об этом свидетельствовал рост культур M.bovis. Бактерицидное
действие электрохимических растворов обусловлено низкой минерализацией
91
анолита
АНК,
его
повышенной
гидратационной
способностью,
что
способствует увеличению проницаемости клеточных стенок и мембран, создаёт
условия для интенсивного осмотического и электроосмотического переноса
оксидантов во внутриклеточную среду. Осмотический перенос оксидантов
через оболочки и мембраны микробных клеток намного интенсивнее
проявляется, чем через мембраны соматических клеток, ввиду существенного
различия
осмотического
градиента
этих
клеток.
Ускоренному
электроосмотическому переносу оксидантов внутрь бактериальных клеток
способствуют многочисленные электрически заряженные микропузырьки
электролизных газов, создающие в зонах контакта с биополимерами мощные
локальные электрические поля с высокой степенью неоднородности. По всей
видимости электрохимические растворы №1, №2, №3, обладают наиболее
приемлемыми бактерицидными свойствами. По всей видимости, это связано с
постоянным рН, в пределах от 5 до 7. Для проведения исследований по
изучению дезинфицирующих средств, препаратов анолитного ряда необходимо
было изучить микобактериальную обсемененность животноводческих ферм и
прилегающей территории
В неблагополучном по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйстве из
объектов внешней среды (кормушки, стены, из поилок, и прилегающий к ним
территории, поверхностные слои почвы, навоза) из 180 проб было выделено: 30
культур
микобактерий,
21
проба
отобрана
внутри
животноводческих
помещений и 9 культур из прилегающих к животноводческим помещениям
территорий. Из них 9 классифицированы как M.bovis, 8–M.fortuitum, 4–
M.scrofulaceum; 7–M.marinum, 2–скотохромогенные.
Данные
о
неблагополучных
сенсибилизации
хозяйствах
в
различных
т.ч.
и
видов
атипичных
микобактерий
в
подтверждаются
исследованиями Кассич Ю.Я. и соавт., (1998), Овдиенко Н.П. и соавт., (1999),
Найманова
А.Х.
и
соавт.,
(2014).
Экспериментально
и
в
условиях
неблагополучного по туберкулезу хозяйства нами были протестированы
бактерицидные свойства анолитных растворов. Анолитные растворы получены
92
при силе тока от 9 до 12А с нейтральным рН 5–7 и содержанием активного
хлора 250–400 мг/л. В ходе исследований было установлено, что они обладают
высокими
бактерицидными свойствами, обеспечивающими инактивацию
патогенных
и
непатогенных
форм
микобактерий,
как
возбудителей
туберкулеза. Рост культур микобактерий, где применяли 3% NаOH и проводили
бактериологический контроль дезинфекции смывов через 30 минут, по всей
видимости, связан не только с высокой гигроскопичностью горячих растворов
NаOH, но и со слабой проникающей способностью в глубокие слои деревянных
поверхностей
помещений.
Это
подтверждалось
результатами
бактериологических исследований смывов через 1, 3, 5 и 12 часов. Отсутствие
роста микобактерий из исследуемых смывов через 3, 5 и 12 часов связано с
полным
и
глубоким
проникновением
инактивацией микобактерий.
дезинфицирующего
В целом, по результатам при
раствора
и
изучении
эффективности новых антисептических средств в условиях неблагополучного
по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства, было установлено, что
наиболее приемлемыми и экологически безопасными являются пергидроль–
хлорноватистые соединения, которые обладают высокими бактерицидными
свойствами в отношении микобактерий туберкулеза.
По результатам исследований нами сделаны следующие выводы и
практические предложения
93
5. ВЫВОДЫ
1. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в РФ
характеризуется
(2008–2013гг.)
устойчивым
неблагополучием,
что
подтверждается 0,027% уровнем заболеваемости.
2. Применение аллергического метода диагностики с использованием
ППД – туберкулина для млекопитающих в условиях неблагополучного по
туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства позволяет выявлять от 3,6% до
68% особей с активным развитием туберкулезного процесса.
3. Разработана плотная питательная среда для ускоренного выделения
микобактерий, включающая в своем составе: аммоний лимоннокислый; калий
фосфорнокислый двузамещенный; магний сернокислый семиводный; железо
сернокислое; сернокислый цинк; гликокол; фумаровая кислота; натрий
фосфорнокислый двузамещенный; хлористый натрий; глицерин; агар–агар;
глицин, позволяющая увеличить на 14,2% выделяемость M.bovis в сравнении со
средой
Левенштейна–Йенсена.
Период
выявления
первичных
культур
сокращается в среднем на 5 суток.
4. При лабораторном тестировании полужидкой питательной среды
Белгородской ГСХА со средой Дорожковой И.Р. выделяемость культур
микобактерий
в
L–форме
составила
57
(76,0%)
против
54
(72,0%),
соответственно.
5. Анолитные экологически безопасные растворы, получаемые по
технологии «АКВА–ЭХА» с рН 5–7 и содержанием активного хлора в пределах
250–400
мг/л,
обладают
высокими
бактерицидными
свойствами,
что
обеспечивает полную инактивацию M.bovis, и делает возможным их
применение в качестве альтернативы экологически вредному гидроксиду
натрия
при
проведении
дезинфекции
неблагополучных по туберкулезу хозяйств.
животноводческих
объектов
94
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для первичного выделения культур микобактерий рекомендуется
использовать плотную минеральную питательную среду, включающую в своем
составе мас/% : аммоний лимоннокислый–1,5; калий фосфорнокислый
двузамещенный–2,0;
магний
сернокислый
семиводный–0,2;
железо
сернокислое–0,1; сернокислый цинк–0,1; гликокол–2,0; фумаровая кислота–2,0;
натрий
фосфорнокислый
двузамещенный–0,5;
хлористый
натрий–0,3;
глицерин–20,0; агар–агар–23,0; глицин–1,5; остальное вода. Методические
рекомендации по применению питательных сред для выделения M.bovis и L–
форм,
утверждены
методической
комиссией
факультета
ветеринарной
медицины БелГСХА им. В.Я. Горина протокол №4 от 17 декабря 2014г.
2. В системе оздоровительных мероприятий при туберкулезе, применять
экологически–безопасные анолитные растворы с содержанием активного хлора
250–400 мг/л и показателями рH от 5 до 7. Методические рекомендации по
применению
экологически
безопасных
дезинфицирующих
растворов,
приготовленных по технологии «АКВА–ЭХА» при туберкулезе крупного
рогатого скота, утверждены методической комиссией ФВМ БелГСХА им.
В.Я.Горина протокол №4 от 17 декабря 2014г.
95
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АДП – аллергическая диагностическая проба
АПК – агропромышленный комплекс
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
КАМ – комплексный аллерген из атипичных микобактерий.
КРС – крупный рогатый скот
л/у. – лимфатический узел
МБ – микобактерии
МБТ – микобактерии туберкулеза
ММК – мясомолочный комплекс
ППД – сухой очищенный белок
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЧЗТ – повышенная чувствительность замедленного типа
РИД – реакция иммунной диффузии
с туб. – с туберкулезными изминениями
ЭХА – Электрохимическая активация
рH – условный символ кислотности
n – количество
MAIS –Mycobacterium avium, intracellulare, scrofulaceum
96
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Авербах, М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М.
Авербах. – М.: Медицина, 1976. –312 с.
2.
Агапова, М.Ф. Диагностика, профилактика и меры борьбы при
туберкулезе сельскохозяйственных животных: метод. пособие / М.Ф.
Агапова, Н.А. Донченко, В.Т. Вольф. // Новосиб. гос. аграр. ун–т; ГНУ
ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии.– Новосибирск. 2011. – 83 с.
3.
Александров,
A.
A.
Применение
ПЦР–анализа
для
видовой
идентификации микобактерий / А.А. Александров, О.А. Иртуганова, Н.С.
Смирнова // В кн.: Туберкулез сегодня: Материалы VII российского
съезда фтизиатров. М.: Издательство БИНОМ. – 2003. – С. 105.
4.
Аликаева, А.П. Методика исследования кормов, фекалий, почвы и других
материалов из внешней среды для выявления микобактерий / А.П.
Аликаева // Бюллетень ВИЭВ, – 1979. – Вып. 34. – С. 29–30.
5.
Аликаева, А.П. Упрощенный метод выделения и выращивания чистых
культур туберкулезных бацилл из патологического материала / А.П.
Аликаева // Сов. Ветеринария, – 1940. – № 11–12. – С. 47–50.
6.
Аликаева, А.П. Туберкулез. Ветеринарная лабораторная практика / А.П.
Аликаева // М.: «Сельхозиздат», 1963. – Т. 1. – С.279–290.
7.
Альшинецкий, М.В. Диагностика туберкулеза зоопарковых животных /
М.В. Альшинецкий // Вет. патология. М., 2004. – № 12 (9). – С. 147– 148.
8.
Арзуманян, С.П. Туберкулоцидные свойства кальция гипохлорита
технического и грилена / С.П.
Арзуманян // Проблемы ветеринарной
санитарии и экологии: Сб. науч. тр. / ВНИИВСГиЭ М., 1993. – Ч. 2. – С.
50–54.
9.
Аржаков, В.Н. Определение чувствительности микроорганизмов к
антисептическим и дезинфицирующим препаратам / В.Н. Аржаков, М.М.
Ермакович, П.В. Аржаков // Материалы Междунар. науч. конф.,
Краснообск, 2004 г. / РАСХН. Сибирское отделение. – Новосибирск,
2004. – С. 24–28.
97
10.
Аржаков, В.Н. Эпизоотологические и методологические подходы к
оценке и направленному поиску новых средств дезинфекции и их
композиций: автореф. дис. … д–ра вет. наук: 16.00.03 / Аржаков Виктор
Николаевич. // ВНИИБТЖ. – Новосибирск, 2002. – 35 с.
11.
Аржаков, П.В. Оценка и контроль дезинфекции / П.В. Аржаков, М.М.
Ермакович, В.Н. Аржаков // Ж. Достижения науки и техники АПК, –
2004, – №4, – С. 38–40.
12.
Аржаков, П.В. Антимикробная активность моющих и дезинфицирующих
средств на предприятиях по переработке мяса / П.В. Аржаков, М.М.
Ермакович,
В.Н.
Аржаков
//
Материалы
научно–практической
конференции, посвященной 100–летию профессора Н.Г. Кондюрина
Омск: ИВМ ОмГАУ, 2004. – С. 221–227.
13.
Архипова, О.П. Дезинфекция активированными растворами хлорамина
некоторых объектов, заражённых спорами бациллы сибирской язвы и
туберкулезной палочкой / О.П. Архипова, В.М.
Ковалёв // Тр.
ЦНИИДиС. 1949. – Вып. 5. – С. 15–17.
14.
Архипова,
О.П.
Дезинфекция
туберкулезной
мокроты
сухими
препаратами хлора / О.П. Архипова // Тр. ЦНИИДиС. – 1948. – Вып. 4. –
С. 19–21.
15.
Ашимова,
К.К.
Совершенствование
биологической
пробы
при
диагностике туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд.
вет. наук: 16.00.02 / Ашимова Карлыгаш Калабаевна. ВНИИ эксперим.
ветеринарии им. Я.Р. Коваленко ВАСХНИЛ. – М., 1991. – 27 с.
16.
Банникова, В.Н.
Сравнительное
исследование
методов
обработки
патологического материала на туберкулез / В.Н. Банникова, B.И. Панкова
// Тр.КазНИВИ. Алма–Ата, – 1979. – С.16–19.
17.
Барабанов, И.И. Применение кальция гипохлорита нейтрального марки Б
в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах / И.И. Барабанов, Т.Г.
Путина
//
Проблемы
ветеринарной
животноводства. – М., 1987. – С. 73–76.
дезинфекции
объектов
98
18.
Бахир, В.М. Об электрохимической активации и воде "живой" и
"мертвой": Серия. Электрохимактивация / В.М. Бахир // Новая техника.
Новая технология. Вып.1, – М., – 1990. – 11 с.
19.
Бахир, В. М. Теоретические аспекты электрохимической активации / В.
М. Бахир // Второй международный симпозиум «Электрохимическая
активация»: тез. докладов и краткие сообщения. – М., 1999. – Ч. 1. – С.
39–49.
20.
Бахир,
В.М.
Электрохимическая
активация:
история,
состояние,
перспективы / В.М. Бахир, Ю.Г. Задорожний, Б. И. Леонов, С. А.
Паничева, В. И. Прилуцкий, О. И. Сухова // ВНИИИМТ: – М., 1999. – С.
199.
21.
Белоусов, В.И. Лабораторная диагностика туберкулеза животных в
Российской Федерации / В.И. Белоусов, М.В. Калмыков, Л.А. Таранова //
Ветеринарная патология. – 2004. – № 12. – С. 23–24.
22.
Беляев, И.Я. Дезинфекция свежегашеной известью при бруцеллёзе и
туберкулезе / И.Я. Беляев, И.И. Барабанов, В.Ф. Бричко // Ветеринария. –
1989. – № 3. – С. 28–29.
23.
Березнев,
А.П.
Дезинфекция
животноводческих
помещений
при
туберкулезе / А.П. Березнев, В.Ф. Бричко // Ветеринария. – 1990. – № 6. –
С. 20–22.
24.
Березнев, А.П. Композиции для аэрозольной дезинфекции помещений
при туберкулезе животных / А.П. Березнёв, В.Ф. Бричко // ВНИИВСГиЭ.
– 1994. – Т. 95, – Ч. 2. – С. 3–12.
25.
Боганец, Н.С. Бактериологическая диагностика туберкулеза животных и
ее усовершенствование: автореф. дис. …д–ра вет. наук: 16.00.03 / Боганец
Нина Сергеевна. – Омск, 2006. – 38 с.
26.
Бойко, А. А. Туберкулез крупного рогатого скота / А. А. Бойко, Е. П.
Сапегина
//
–
М.:
Всесоюзный
научно–исследовательский
и
технологический институт биологической промышленности, – 1991. – С.
92.
99
27.
Борисов, С.Е. Диагностика туберкулеза: возможности и пределы / С.Е.
Борисов // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2001. – № 3. – С.
5–10.
28.
Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /
Л.Б. Борисов. – М.: «Медицинское информационное агентство», 2005. –
736 с.
29.
Борисова,
Т.А.
микобактерий
Полимеразная
с
цепная
использованием
реакция
различных
для
индикации
тест–систем
в
животноводческих хозяйствах Республики Татарстан : Материалы
Всероссийской научно–практической конференции «Генодиагностика
инфекционных заболеваний» / Т.А. Борисова, Н.З. Хазипов, А.В. Иванов,
Р.А. Хамзин, Л.В. Королева // – М.: Всерос. гос. центр качества и
стандартизации лек. средств для животных и кормов, – 2004. – С. 205–
208.
30.
Борознов, С.Л. Повышение эффективности дезинфекционных и лечебных
препаратов, применяемых в форме аэрозолей / С.Л. Борознов, В.И Сапего
// Агропанорама. – 2006. – № 1. – С. 31–32.
31.
Боченин, Ю.И. О роли дисперсности аэрозоля в эффективности
дезинфекции поверхностей помещений / Ю.И. Боченин // Влажная и
аэрозольная дезинфекция в ветеринарии: Тр. ВНИИВСГЭ. – М., – 1988. –
С. 10–16.
32.
Букова, Н.К. Питательная среда ВКГ для ускоренного выращивания
микобактерий / Н.К. Букова, К.В. Шумилов, Н.П. Овдиенко, А.Х.
Найманов, Л.А. Таранова, О.В. Клименкова // Ветеринарная патология. –
2004. – № 12 (9). – С. 107–110.
33.
Бурганов, З.Б. Опыт ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота /
З.Б. Бурганов // Ветеринария. – 1995. – № 11. – С. 10–12.
34.
Бутко, М.П. Комплексная система оздоровления молочно–товарной
фермы от туберкулеза / М.П. Бутко, Ю.И. Боченин, В.Ф. Бричко, Д. В.
Грузнов и др. // Ветеринария. – 2003. – № 12. – С. 8–10.
100
35.
Быкова, С.Ю. Течение туберкулеза у морских свинок на фоне
инфицирования атипичными микобактериями: автореф. дис. ...канд. вет.
наук : 16.00.03 / Быкова Светлана Юрьевна. – М., 1994. – 23 с.
36.
Варенко, Ю.С. Способ ускоренного выращивания микобактерий / Ю.С.
Варенко, О.А. Ластков, П.С. Бескровный // Лабораторное дело. – 1980. –
№ 1. – С. 73–76.
37.
Вареца, Л.А. К вопросу о контроле качества дезинфекции при
туберкулезе / Л.А. Вареца // Инфекционные и паразитарные болезни
сельскохозяйственных животных : Под ред. В.И. Берковича. – Омск: Изд–
во Омского СХИ, 1983. – С. 83–86.
38.
Васильев, В.Н. Микобактериозы и микозы легких / В.Н. Васильев //
Медицина и физкультура. София, 1971. – 283 с.
39.
Васильев, Н.С. Современные средства производственного контроля
качества дезинфекционных и стерилизационных мероприятий / Н.С.
Васильев, Н.А. Фомин // Молочная промышленность. – 2005. – № 2. – С.
64–65.
40.
Вашков, В.И. Антимикробные средства и методы дезинфекции при
инфекционных заболеваниях / В.И. Вашков // М.: Медицина, 1977. – 295
с.
41.
Вицинец, Т.В. Сравнительная оценка методов бактериологического
контроля качества дезинфекции при туберкулезе животных: автореф. дис.
…канд. вет. наук: 16.00.03 / Вицинец Татьяна Васильевна. Ин–т
ветеринар. медицины Алт. гос. аграр. ун–та. – Барнаул: 2002. – 15 с.
42.
Вицинец, Т.В. Коррозионное действие феносмолина при влажной
дезинфекции в животноводческих и звероводческих хозяйствах / Т.В.
Вицинец // Алтайский вет. ин–т, – Барнаул, – 2002, – С 14.
43.
Вицинец, Т.В. Роль сопутствующей микрофлоры на выделение тест–
микробов в косвенном методе контроля качества дезинфекции при
туберкулезе / Т.В. Вицинец, Т.А. Беспалова, Н.М. Колычёв // Актуальные
101
вопросы микробиологии и инфекционной патологии животных. – Омск,
2004. – С. 28–30.
44.
Вишневский, Б.И. Вирулентность микобактерий туберкулеза / Б.И.
Вишневский, О.В. Нарвская, С.Н. Васильева // Проблемы туберкулеза. –
2002. – № 10. – С. 33–36.
45.
Волков, Ю.П. Перспективы развития исследований в области разработки
дезинфицирующих средств / Ю.П. Волков // Актуальные проблемы
дезинфекции, стерилизации, дезинсекции и дератизации: Материалы
науч. конф. – М., 1992. – С. 4–13.
46.
Воробьев, A.A. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии /
A.A. Воробьев, Ю.С. Кривошеий // М., «Мастерство», 2001. – 224 с.
47.
Вранчан, З.Э. Дезинфекция помещений при туберкулезе / З.Э. Вранчан //
Тр. ВНИИВСЭ. – М., 1957. – Т. 12. – С. 166–177.
48.
Высоцкий, А.Э. Контаминация молочно–товарных ферм микобактериями
и средства её снижения : автореф. дис. …канд. вет. наук : 16.00.03 /
Высоцкий Андрей Эдуардович. РУП БНИИЭВ. – Минск, 2002. – 20 с.
49.
Высоцкий, А.Э. Эффективность некоторых средств для дезинфекции при
туберкулезе / А.Э. Высоцкий, Ю.Г. Лях // Тезисы докладов научной
конференции. Киев НАУ – К., 2006. – С. 20–21.
50.
Гертман, М.И. Биологические свойства L–форм Mycobacterium bovis :
автореф. дис. …канд. вет. наук : 16.00.03 / Гертман Мария Ивановна. –
[ВНИИЭВ им. Я. Р. Коваленко]. – М., 1988. – 20 с.
51.
Гежес,
Л.В.
Ультраструктура
микобактерий
туберкулеза
после
воздействия композиции глутарового альдегида и ПАВ / Л.В. Гежес, И.Б.
Павлова,
Б.И. Коган,
В.И.
Околелов
//
Методы
диагностики
и
профилактики бруцеллёза и туберкулеза животных: Сб. науч. тр. – Омск,
1988. – С. 104–113.
52.
Головченко, М.В. Результаты сравнительного испытания питательных
сред
с
добавлением
различных
стимуляторов
при
выращивании
102
микобактерий / М.В. Головченко, Г.И. Устинова, В.И. Косенко //
Ветеринарная патология. – 2002. – № 12. – С. 113–115.
53.
Головлев, Е.Л. Экологическая стратегия бактерий: специфика проблемы /
Е.Л. Головлев // Микробиология. – 2001. – Т. 70 (4). – С. 437–443.
54.
Гребенникова, Т.В. Молекулярные методы исследования в диагностике
туберкулеза / Т.В. Гребенникова, С.Л. Кальнов, А.Д. Забережный, Т.И.
Алипер // Ветеринарная патология. – 2004. – № 12. – С.92–93.
55.
Гулюкин, М.И. Обзор эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в РФ и совершенствование мер борьбы с этой инфекцией /
М.И. Гулюкин, А.Х. Найманов // Тезисы докл. междунар. научно–практ.
конф., посв. 45летию Прикаспийской НИВИ. – Махачкала, 2012, – С. 38.
56.
Гулюкин, М.И. Оздоровительные мероприятия при туберкулезе крупного
рогатого скота / М.И. Гулюкин, А.Х. Найманов, В.А. Ведерников и соавт.
// Ветеринария. – № 1. – 2011. – С. 38.
57.
Данко, Ю.Ю. Новые направления в системе противоэпизоотических
мероприятий / Ю.Ю. Данко // Нижний Новгород. 1999. – С. 40–42.
58.
Данко, Ю.Ю. Эпизоотологический надзор в системе оздоровления при
туберкулезе крупного рогатого скота / Ю.Ю. Данко // СПб. 1998. – С. 38–
39.
59.
Деканосидзе, Т.В. Устойчивость микобактерий туберкулеза крупного
рогатого скота к аэрозолям дезинфицирующих средств и режимы их
применения : автореф. дис. ...канд. вет. наук : 16.00.03 / Деканосидзе
Тамара Владимировна. – М., 1989. – 24 с.
60.
Джупина,
С.И.
Методы
эпизоотологического
исследования
и
теория эпизоотического процесса / С.И. Джупина // Монография :
Новосибирск, 1991. – 138 с.
61.
Джупина, С.И. Обеспечить оздоровление крупного рогатого скота от
туберкулеза / С.И. Джупина // Ветеринария, – 1998, – № 9, – С. 8–10.
62.
Донченко, А.С. Основные научные положения организации мероприятий
по профилактике и борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота в
103
регионах Сибири и их практическое значение / А.С. Донченко // Тез.
докл. НПК.Новосибирск. 1995. – С. 67.
63.
Донченко А.С., Донченко В.Н., Бушмелева П.В., Донченко Н.А. Способ
постановки
биологической
пробы
для
определения
видовой
принадлежности микобактерий. : Патент на изобретение – RUS 2311872.
– 26.02.2006.
64.
Донченко А.С., Донченко В.Н., Донченко Н.А., Ионина С.В. Среда для
культивирования микобактерий туберкулеза : Патент на изобретение –
RUS 2192472. – 20.10.2000.
65.
Донченко,
особенности
А.С.
Взаимосвязь
туберкулеза
противотуберкулезных
человека
мероприятий,
и
животных,
проводимых
ветеринарной и медицинской службами / А.С. Донченко, В.Г. Мерман //
Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы. – Гродно. –
1997. – С. 71–73.
66.
Донченко, А.С. Сравнительная экономическая оценка оздоровительных
мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота / А.С. Донченко,
Ю.И.
Смолянинов
Ю.И.
//
Зооантропонозные
болезни,
меры
профилактики и борьбы. – Гродно. – 1997. – С. 78–80.
67.
Донченко, А.С. Совершенствование методики оценки эпизоотической
ситуации туберкулеза крупного рогатого скота / А.С. Донченко, Н.А.
Шкиль // Тез. докл. науч. практ. конф. – Новосибирск. – 1995. – С.15–16.
68.
Донченко, A.C. Обусловленность возникновения и напряженности зон
приуроченности туберкулеза крупного рогатого скота в западной Сибири
/ А.С. Донченко, Е.А. Удальцов // Вестн. РАСХН, – 2002, – № 4, – С. 75–
77.
69.
Донченко, В.Н. Диагностическая эффективность плотных питательных
коммерческих сред и опытной среды ИЭВСиДВ / В.Н. Донченко, C.В.
Ионина, Н.А. Донченко // Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии,
Казахстана, Беларуси и Башкортостана: Материалы 5 Международной
науч. практ. конф. – Новосибирск, – 2002. – С. 101–105.
104
70.
Донченко, H.A. Генетическое типирование микобактерий туберкулезного
комплекса с помощью анализа ПДФР ампликонов / Н.А. Донченко, А.С.
Донченко, В.И. Семенихин // Ветеринарная патология. – 2004. – № 12, –
С. 71.
71.
Дорожкова, И.Р.
Микробиологическая
диагностика
туберкулеза
и
микобактериозов / И.Р. Дорожкова // Туберкулез (ред. А.Г. Хоменко). –
М. : «Медицина», 1982. – С. 102–128.
72.
Дорожкова И.Р., Керимжанова Б.Ф. Питательная среда для получения
сферопластов микобактерий туберкулеза. : Патент СССР – № 4645683/13
– 15.01.1991.
73.
Дорожкова, И.Р. L–трансформация микобактерий в свете современной
эпидемиологической ситуации по туберкулезу в мире / И.Р. Дорожкова,
З.С. Земскова, В.Н. Круду // Вест. РАМН. – 1995. – № 7. – С. 30–33.
74.
Драбкина, P.O. Микробиология Туберкулеза / Р.О. Драбкина // – М.:
«Медгиз», 1963. – С. 254.
75.
Дудницкий,
И.А.
Дезинфекция
на
фермах,
неблагополучных
по
бруцеллёзу и туберкулезу / И.А. Дудницкий, В.Ф. Бричко, И.Д. Беляев и
др. // Ветеринария. – 1989. – № 6. – С. 7–11.
76.
Дудницкий, И.А. Дезинфицирующие средства / И.А. Дудницкий, П.П.
Деркачёв, В.В. Гришин // Ветеринария. – 1989. – № 2. – С. 5.
77.
Дудницкий, И.А. Кальция гипохлорит нейтральный для дезинфекции /
И.А. Дудницкий // Химизация сельского хозяйства. – 1988. – № 4. – С. 70.
78.
Евглевский, А.А. Диагностика и профилактика антропозоонозного
туберкулеза Евглевский А.А. // Курская гос. с.х. акад. им. И.И. Иванова. –
Курск. – 2004.
79.
Евглевский,
Ал.А.
Практические аспекты первичной диагностики
туберкулеза и дифференциации неспецифических реакций у крупного
рогатого скота / Ал.А.
Евглевский, А.Н. Дубинин // Методические
рекомендации. – Курск. – 1997.
105
80.
Елистратов, И.С. О состоянии и мерах по усилению борьбы с
бруцеллёзом
и
туберкулезом
животных
/
И.С.
Елистратов
//
Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллёзом и
туберкулезом животных. – Новосибирск, 1987. – С. 3–7.
81.
Ерошенко, Л.А. Использование стандартных сред для выращивания
микобактерий /Л.А. Ерошенко, А.Н. Шаров, Н.К. Букова // Матер. всерос.
науч. конф. по проблемам хронических инфекций. – Омск, – 2001. – С.
161–163.
82.
Закомырдин, А.А. Аэрозольная дезинфекция помещений при туберкулезе
крупного рогатого скота / А.А. Закомырдин, Т.В. Деканосидзе //
Ветеринария. – 1990. – № 10. – С. 20–22.
83.
Ильинская,
З.Д.
Морфологические
и
гистохимические
изменения
лимфатических узлов у крупного рогатого скота при заражении
типичными и атипичными микобактериями / З.Д. Ильинская // Труды 5–
ой научно–метод. конф., – М., 1973. – С. 104–105.
84.
Иртуганова,
О.А.
Автоматизированные
методы
культурального
определения М.Tuberculosis на жидких средах / О.А. Иртуганова, Н.С.
Смирнова, Л.В. Слогоцкая // Проблемы туберкулеза. – 2001. – № 3. – С.
53–55.
85.
Иртуганова, О. А. Современные возможности микобактериологической
диагностики туберкулеза / О. А. Иртуганова // Клин. лаб. диагностика. –
2006. – № 1. – С. 21–35.
86.
Каграманов, А.И. Об атипичных кислотоустойчивых микобактериях /
А.И. Каграманов // Проблемы туберкулеза. – 1963. – № 7, – С. 69–74.
87.
Кадочкин, A.M. Дифференциация и идентификация микобактерий /А.М.
Кадочкин // Ветеринария. – 1984. – № 9. – С. 62–63.
88.
Калмыкова, М.С. Диагностическая ценность ПЦР–тест–систем при
туберкулезе животных : автореф. дис. …канд. вет. наук : 16.00.03 /
Калмыкова Марина Станиславовна. ВИЭВ. – М., 2007, – 27 с.
106
89.
Калмыкова, М.С. Диагностическая ценность ПЦР–тест–систем при
туберкулезе животных / М.С. Калмыкова, А.Х. Найманов // Материалы
междунар. научно–практ. конф. «Современное состояние и перспективы
исследований по инфекционной патологии животных, рыб и пчел». – М.,
– 2008. – С. 142–153.
90.
Калмыкова, М.С. Сравнительное испытание тест–систем для ПЦР
диагностики туберкулеза животных / М.С. Калмыкова // Ветеринарная
патология. – 2006. – № 3.
91.
Кассич, В.Ю. Микобактериозы как паразитозы и сапронозы / В.Ю.
Кассич // Ветеринарная патология . – 2004. – № 12. – С. 127–129.
92.
Кассич, Ю.Я. Достижения науки и практики в изучении туберкулеза
животных / Ю.Я. Кассич // Ветеринария, – 1998, – № 12, – С. 9–11.
93.
Кассич, Ю.Я. Туберкулез и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич, А.Ф.
Борзяк, А.Ф. Кочмарский, О.В. Мартма, И.Т. Нечваль, Н.П. Овдиенко, М.
Павлас, А.Н. Шаров, В.Е. Щуревский // – Киев. – Урожай. 1990. – 304 с.
94.
Кисиленко, В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология. Часть 3.
Частная микробиология / В.Н. Кисиленко, Н.М. Колычев, О.С. Суворина
под. ред. Е. В. Ярных // – М.: – Колос С. 2007. – 215 с.
95.
Коваленко, A.M. Выделение измененных форм
микобактерий / A.M.
Коваленко, Е.В. Тарасова // Вестник КГСХА – Курск. – 2012. – № 1. – С.
113–115.
96.
Козлов, В.Е. Оценка эффективности и специфичности коммерческих
серий туберкулина (ППД) для млекопитающих отечественного и
зарубежного производства / В.Е. Козлов, Н.К. Букова, А.Х. Найманов //
Ветеринарная патология. – 2004. – № 12. – С. 82–85.
97.
Колычев, Н.М. О нормах расхода дезинфектантов при туберкулезе / Н.М.
Колычев // Ветеринария. – 1985. – № 9. – С. 23–25.
98.
Колычев, Н.М. О сохранении вирулентности микобактерий во внешней
среде / Н.М. Колычев // Ветеринария. – 1987. – № 5. – С. 29–32.
107
99.
Колычев, Н.М. Методы индикации и обеззараживания микобактерий
туберкулеза на объектах внешней среды : автореф. дис. …д–ра вет. наук :
16.00.03 / Колычев Николай Матвеевич – Казань. 1984.– 37с.
100. Колычев, Н.М. Зоопатогенные бактерии и меры борьбы с ними / Н.М.
Колычев, В.Г. Ощепков // – Омск : Изд–во ОмГАУ, 2001, – 632с.
101. Корнева, И.Н. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с
применением полимеразной цепной реакции / И.Н. Корнева, Е.П.
Осипова, А.Х. Найманов // Генодиагностика инфекционных заболеваний :
Сб. тезисов. 4–ая Всерос. научно–практ. конф. – М., – 2002. – С. 343–344.
102. Корнева, И.Н. Конструирование ПЦР–тест–систем для обнаружения и
идентификации микобактерий туберкулеза у животных / И.Н. Корнева,
В.В. Демкин // Ветеринарная патология. – 2004. – № 12. – С. 95–96.
103. Костина, Г.И. К вопросу о механизмах химической инактивации
микроорганизмов / ЖМЭИ. – 1981. – № 8. – С. 25–34.
104. Кравец, А.Т. Воздействие фенолята натрия на микобактерии туберкулеза /
А.Т. Кравец, В.П. Щинников, Н.С Григоревская // Иммунология,
диагностика и лечение инфекционных болезней сельскохозяйственных
животных. – Новосибирск, – 1986. – С. 47–48.
105. Кузин, А.И. Латентная туберкулезная инфекция и ее значение в
эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота : дис. …д–ра вет.
наук : 16.00.03 / Кузин Алексей Иванович. – М. 1978. – 271 с.
106. Кузин,
А.И.
Туберкулез
сельскохозяйственных
животных
и
его
профилактика. – М.: Росагропромиздат, 1992. – 189 с.
107. Кузьмин,
В.А.
Биологические
свойства
L–форм
микобактерий,
выделенных из объектов внешней среды / В.А. Кузьмин, Е.В. Тарасова,
A.M. Коваленко // Ветеринарная практика – СПб. – 2012. – № 1 (56). – С.
13–16.
108. Кучеренко,
И.Н.
Токсикологическая
оценка
композиционной
дезинфицирующей смеси / И.Н. Кучеренко // Туберкулез и бруцеллёз
108
сельскохозяйственных животных: методы и средства диагностики и
профилактики. – Новосибирск, – 1994 (1995). – С. 119–125.
109. Лазовская, А.Л. Патогенные и условно патогенные микобактерии / А.Л.
Лазовская, И.Н. Блохина // – Горький: ВолгоВятское изд–во. – 1976. – 114
с.
110. Леви, М.И Значение степени полимеризации глутарового альдегида для
приготовления иммуноферментного коньюгата и для целей дезинфекции
и стерилизации / М.И. Леви, Т.А. Шилко, С.А. Альтштейн // ЖМЭИ. –
1988. – № 5. – С. 118–119.
111. Литвинов, В.И. НеТуберкулезные микобактерии / В.И. Литвинов, М.В.
Макарова, М.А. Краснова // – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с.
112. Лысенко, А.П. Действие комбинированного дезинфектанта поверхностей
(КДП) на возбудителей инфекций и особенности его применения для
ветеринарной дезинфекции / А.П. Лысенко, А.А. Холод, С.А. Шуринова,
А.Э. Высоцкий // Ветеринарная медицина Беларуси. – 2002. – № 1. – С.
15–16.
113. Мартма
О.В.
Парааллергические
реакции
на
туберкулин
и
их
дифференциация / О.В. Мартма, К.К. Тяхнас // Ветеринария. – 1978. – №
4. – С. 35–38.
114. Мартма,
O.B.
Патогенность
и
вирулентность
различных
видов
микобактерий / О.В. Мартма, Н.П. Овдиенко, A.B. Ткачёв–Кузмин //
Туберкулез сельскохозяйственных животных. – М; Агропромиздат, –
1991. –С. 28–32.
115. Меньш, А.Ф. Дезинфекция при туберкулезе животных / А.Ф. Меньш //
Всерос. НИИ вет. санитарии, гигиены и экологии: Сб. науч. тр. – М.,
1994. – Т. 95, – Ч. 1.– С.26–32.
116. Меньш, А.Ф. Чувствительность микобактерий туберкулеза животных к
хлорсодержащим препаратам / А.Ф. Меньш // Вопросы ветеринарной
дезинфекции на современном этапе: Сб. науч. тр. ВНИИВС. – М.,
1984. – С. 3–6.
109
117. Методические рекомендации по дезинфекции при туберкулезе животных
/ УНИИЭВ. – Х., 1987. – 12 с.
118. Методические рекомендации по уточнению диагноза на туберкулез у
крупного рогатого скота благополучных хозяйств и определению видовой
принадлежности культур микобактерий/ УНИИЭВ. – Х., 1987. – 20 с.
119. Модель, Л.М. Биология туберкулезных микобактерий и иммунобиология
туберкулеза / Л.М. Модель // – М.: Медгиз, 1958. – 316 с.
120. Найманов, А.Х. Диагностическое значение ПЦР на современном этапе
борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, М.С.
Калмыкова, Е.П. Осипова // Ветеринарная патология. – 2009. – № 3(30). –
С. 33–39.
121. Найманов, А.Х. Совершенствование аллергической диагностики у
крупного рогатого скота: автореф. дис. …канд. вет. наук : 16.00.03 /
Найманов Али Хусинович. – М. 1981. – 17 с.
122. Найманов, А. X. Совершенствование глазной пробы при диагностике
туберкулеза у крупного рогатого скота / А. X. Найманов // Ветеринария. –
1990. – №2, С. 30–32.
123. Найманов,
А.Х.
Анализ
изменений
эпизоотической
ситуации
и
государственных оздоровительных мероприятий при туберкулезе КРС в
РФ / А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Е.П. Вангели, С.А. Коломыцев,
Н.М. Ткач // Ветеринария и кормление. – 2013. – № 4. – С. 51–54.
124. Найманов, А.Х. Основные проблемы и пути совершенствования
диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, Н.Г.
Толстенко, Е.П. Вангели и соавт. // Ветеринария и кормление. – 2014. – №
2. – С. 69.
125. Найманов, А. Х. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота
(туберкулез, паратуберкулез) / А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин // –
М.:ЗооВетКнина, 2014. – 238с.
110
126. Обухов,
И.Л.
Использование
полимеразной
цепной
реакции
в
практических ветеринарных лабораториях / И.Л. Обухов, К.Н. Груздев,
А.Н. Панин // Ветеринария. – 1997. – № 2. – С. 24–27.
127. Обухов,
И.Л.
Лабораторная
диагностика инфекционных болезней
методом ДНК амплификации при помощи полимеразной цепной реакции
(ПЦР) / И.Л. Обухов, К.Н. Груздев // Сборник науч. трудов ВГНКИ. – М.,
1995 (1996). – Т. 57. – С. 36–45.
128. Обухов, И.Л. Усовершенствование коммерческих ПЦР–тест–систем для
диагностики туберкулеза животных / И.Л. Обухов, Н.К. Букова, О.В.
Клименкова // Ветеринарная патология. –2004. –№ 12, – С. 94.
129. Овдиенко, Н.П. Мировое распространение туберкулеза крупного рогатого
скота и основные принципы профилактических и противоэпизоотических
мероприятий / Н.П. Овдиенко, В.А. Ведерников, А.Х. Найманов, П.Н.
Пыталев // Бюлл. ВИЭВ. – Вып. 7371.– 1990. С 3–23.
130. Овдиенко, Н.П. Основные направления и достижения в изучении
туберкулеза животных / Н.П. Овдиенко, А.С.
Донченко и соавт. //
Сборник материалов научной сессии РАСХН (к 100–летию ВИЭВ). –
1999. – Т. 1. – С. 111–114.
131. Овдиенко, Н.П. Оптимальная диагностическая доза ППД туберкулина для
млекопитающих / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Д.М. Мирзоев // Тез.
докл. науч. практ. конф. 100–летию Курской б/ф. – 1996. – С. 229–230.
132. Овдиенко,
Н.П.
Дифференциация
параалергических
реакций
на
туберкулин внутрикожной и пальпебральной пробой / Н.П. Овдиенко,
А.Х. Найманов, Р.А. Нуратипов // Тез. докл. науч. конф. – Новосибирск. –
1995. – С.40–41.
133. Овдиенко, Н.П. Эпизодическая обстановка по туберкулезу крупно
рогатого скота в зарубежных странах в начале XXI века / Н.П. Овдиенко,
А.Х. Найманов, И.В. Солодова // Ветеринарная патология. – 2004. –№ 1–
2. С. 51–54.
111
134. Овдиенко,
Н.П.
Туберкулез
как
международная
и
национальная
медиковетеринарная проблема в современных условиях / Н.П. Овдиенко,
А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко // Ветеринарный врач. – 2009. – № 2. – С.
14–17.
135. Овдиенко, Н.П. Совершенствование системы противотуберкулезных
мероприятий в сельских очагах туберкулеза / Н.П. Овдиенко, А.Х.
Найманов, Н.Г. Толстенко и др. // Ветеринарный врач. – 2009. – № 4. – С.
37–39.
136. Овдиенко,
Н.П.
К
вопросу
взаимовлияния
эпидемического
и
эпизоотического процессов туберкулеза и микобактериозов в Московской
области / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко // Ветеринарный
врач. – 2009. – № 6. – С. 17–20.
137. Олескин, A.B. Колониальная организация и межклеточная коммуникация
у микроорганизмов / A.B. Олескин, И.В. Ботвинко, Е.А. Цавкелова //
Микробиология. – 2000. – Т. 69 (3). – С. 309–327.
138. Осипова, Е. П. Применение полимеразной цепной реакции для
идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при
туберкулезе крупного рогатого скота: автореф. дис. ...канд. биол. наук :
16.00.03. / Осипова Елена Петровна. – ВИЭВ. – М. 2004. – 21 с.
139. Оттен, Т.Ф., Васильев A.B. Микобактериоз / – С–Пб.: Мед. пресса. 2005.
218 с.
140. Ощепков,
В.Г.
Устойчивость
микобактерий
к
дезинфицирующим
средствам / В.Г. Ощепков, В.Н. Аржаков // Ветеринария. – 2002. – № 3. –
С. 49–52.
141. Ощепков, В. Г.
Культурально–генетический метод диагностики
туберкулеза крупного рогатого скота / В. Г. Ощепков, Л. А. Таллер и др. //
Достижения науки и техники АПК : Теор. и науч.-практич. журнал. –
2010. – N 5. – С. 64–65.
112
142. Писарев, А.И. Сравнительная оценка разных методов и средств
диагностики туберкулеза крупного рогатого скота: дис. …канд. вет. наук :
16.00.03 / Писарев Анатолий Иванович. – Курск. 2000. – 132 с.
143. Платонов, Г.И. Дезинфицирующая эффективность новых хлорактивных
препаратов / Г.И. Платонов // ВНИИ дезинфекции и стерилизации: сб.
науч. тр. – М., – 1982. – № 31.– С.14–18.
144. Платонов, Г.И. Изучение действия новых дезинфицирующих средств на
микобактерии туберкулеза / Тр. ВНИИДиС. – 1975. – Вып. 24. – С. 18–20.
145. Поляков, А.А. Ветеринарно–санитарные мероприятия при туберкулезе /
А.А. Поляков, А.Ф. Меньш // Ветеринария. – 1983. – № 9. – С. 19–21.
146. Поляков, А.А. Ветеринарная дезинфекция / Под ред. А.А. Полякова Изд.
4–ое, перераб. и доп. – М.: Колос, 1975. – 560 с.
147. Полякова, А.А.
Руководство по ветеринарной санитарии / Под ред.
А.А. Полякова. – М.: Агропромиздат., 1986. – 320 с.
148. Садыкова,
В.И Применение фенолятов марки «Б» коксохимического
производства
для
ветеринарной
дезинфекции
/
Садыкова
В.И.,
Наурызбаев И.Б. // Тр. ВНИИВС. – М., – 1983. – С. 6–9.
149. Скородумов, Д.И. Микробиологическая диагностика бактериальных
болезней животных / Д.И. Скородумов // справочник. – М. – 2005. – С.
222–236, 273–293.
150. Смолянинов, Ю.И. Метод ускоренной постановки биологической пробы
на морских свинках в диагностике туберкулеза животных / Ю.И.
Смолянинов, Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова // Ветеринарная патология. –
2004. – № 12. – С. 115–118.
151. Смолянинов,
мероприятий
Ю.И.
при
Усовершенствование
туберкулезе
крупного
противоэпизоотических
рогатого
скота
и
их
экономическая эффективность: автореф. дис. ...д–ра вет. наук : 16.00.03 /
Смолянинов Юрий Иванович. – Новосибирск, 1994. – 36 с.
152. Солодова, И.В. Ретроспективный анализ изменений эпизоотической
ситуации туберкулеза крупного рогатого скота в РФ за 1951–2009 гг. :
113
автореф. дис. …канд. вет. наук: 06.02.02 / Солодова Ирина Владимировна.
– М., 2011. – 22 с.
153. Тажгалиев, Н.М. Сравнительная оценка способов обработки материалов
на высеваемость микобактерий : автореф. дис. ...канд. вет. наук : 06.00.03
/ Тажгалиев Нариман Магданович – М. – 1987. – 20с.
154. Таллер, JI.A. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза
крупного рогатого скота / Л.А. Таллер, В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секин и
соавт. // Достижения науки и техники АПК. – 2011. – № 9. – С. 67–69.
155. Тарасова, Е.В. Изучение сенсибилизирующих и патогенных свойств L–
форм микобактерий / Е.В. Тарасова, A.M. Коваленко // Бюллетень
научных работ Белгород, – 2012. – Вып. 29. – С. 76–80.
156. Тарасова,
Е.В.
Усовершенствование
метода
выделения
L–форм
микобактерий из патологоанатомического материала и объектов внешней
среды : автореферат дис. ...канд. вет. наук : 06.02.02 / Тарасова Елена
Владимировна. – Белгород. 2012. – 19 с.
157. Тарасова, Е.В., Коваленко А.М., Дорофеев А.Ф. «Питательная среда для
выделения L–форм микобактерий». Патент РФ – №2479630. – 20.04.2013.
158. Ткаченко, А.А. Эпизоотическое состояние по туберкулезу крупного
рогатого скота и совершенствование методов диагностики: автореф. дис.
…д–ра вет. наук : 16.00.06 / Ткаченко Алексей Андреевич. – Киев. 2000. –
43 с.
159. Тупота, Н.Л. Диагностическая значимость различных методов выявления
микобактерий / Н.Л. Тупота, С.В. Ионина, Н.А. Донченко и соавт. //
Ветеринария. – 2010. – № 3. – С. 56–58.
160. Тупота,
ситуации
С.Г.
Комплексная
туберкулеза
сравнительная
животных
и
оценка
методов
его
эпизоотической
диагностики
в
сельхозпредприятиях и личных подсобных хозяйствах : дис. ... канд. вет.
наук : 06.02.02 / Тупота Сергей Григорьевич. ИЭВСиДВ. – Новосибирск,
2010.– 149 с.
114
161. Тургенбаев, К.А. Обеззараживание навоза крупного рогатого скота при
туберкулезе / К.А. Тургенбаев // Ветеринария. – 1989. – № 10. – С.18–20.
162. Урбан, В.П. К диагностике туберкулеза / В.П.Урбан // Тез. докл. науч.
практ. конф. – Новосибирск. – 1995. – С. 810.
163. Урбан, В.П. О природе повторных вспышек туберкулез / В.П. Урбан //
Ветеринария. – 1982. – № 10. – С. 12–14.
164. Урбан, В.П. Современные проблемы борьбы с туберкулезом животных /
В.П. Урбан // Тез. докл. науч. практ. конф. 100–летию Курской б/ф. –
1996. – С. 326–328.
165. Урбан, В.П. Оценка туберкулиновой пробы при различных течениях
инфекционного и эпизоотического процессов при туберкулезе у крупного
рогатого скота / В.П.Урбан, Ю.Ю. Данко // Теоретические и практические вопросы ветеринарии, – Л., – 1983, – Т. 2, – 815 с.
166. Урбан, В.П. Аллергические реакции у телят, зараженных атипичными
микобактериями туберкулеза / В.П. Урбан, И.А.
Каркадиновская //
Материалы 15–ой научной конференции ЛВИ., – Л., – 1966, – С. 16–19.
167. Урбан, В.П. Диагностика туберкулеза с/х животных / В.П.Урбан, М.М.
Широбокова, Н.И.
Калишин // Учебное пособие для ветврачей. – Л.,
1974. – 34 с.
168. Хоулт, Дж. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н.
Крига, П. Снита и др. – М.: Мир, 1997. – Т. 2. – 800 с.
169. Черноусова,
Л.Н.
Современные
тенденции
и
возможности
микробиологической диагностики туберкулеза / Л.Н. Черноусова //
Российский медицинский журнал. – 2002. – № 10(16). – С. 697–698.
170. Чеснокова, П.В. Дезинфекция объектов животноводства при туберкулезе
препаратами йодёз и дезконтэн : дис. ...канд. вет. наук : 16.00.06 /
Чеснокова Полина Владимировна. Всерос. науч.–исслед. ин–т ВСГЭ
РАСХН. – М., 2009. – 168 с.
115
171. Чичибабин, Е.С. Питательные среды для выращивания микобактерий
туберкулеза / Е.С. Чичибабин // Проблемы туберкулеза. – 1987. – № 2. –
С. 56–58.
172. Чичибабин,
Е.С.
Совершенствование
питательной
среды
для
выращивания микобактерий туберкулеза / Е.С. Чичибабин // Проблемы
туберкулеза. – 1990. – С. 60–61.
173. Шаров, А.Н. К вопросу аллергической диагностики туберкулеза / Шаров
А.Н. // Состояние и перспективы научных исследований по диагностике,
профилактике туберкулеза и бруцеллёза и меры борьбы с этими
болезнями с.х. животных. – Омск, – 1980. – С. 17–18.
174. Шаров, А.Н. К вопросу диагностики туберкулеза / А.Н. Шаров //
Ветеринария. – 1982. – № 9. – С. 16–17.
175. Шаров,
А.Н.
К
вопросу
дифференциации
специфических
и
парааллергических реакций на туберкулин : автореф. дис. …канд. вет.
наук : 06.00.03 / Шаров Александр Николаевич. – М. – 1970. – 19 с.
176. Шаров, А.Н. О бактериологической диагностике туберкулеза / А.Н.
Шаров // Ветеринарная жизнь. – 2005. – № 6. – С. 7.
177. Шаров, А.Н. Проблемы ПЦР диагностики туберкулеза / А.Н. Шаров //
Ветеринарный консультант. – 2003. – № 21. – С. 14–15.
178. Шаров, А.Н. ПЦР при диагностике туберкулеза / А.Н. Шаров, Л.А.
Ерошенко, П.П. Суханов и соавт. // Ветеринария. – 2000. – № 10. – С.
1922.
179. Шаров,
А.Н.
Эффективность методов прижизненной
диагностики
туберкулеза / А.Н. Шаров, Л.А. Ерошенко, И.П. Суханов и соавт. //
Ветеринария. – 2002. – № 2. – С. 16–18.
180. Шеина, И.В. Дезинфицирующее средство водорастворимый гипохлорит
кальция/ И.В. Шеина, Л.А. Ярославская, А.Н. Иойриш и соавт. // Тр.
ВНИИВС. – М., – 1982. – С.14–18.
181. Щуревский, В.Е. Быстрорастущие атипичные микобактерии и их
значение в патологии крупного рогатого скота / В.Е. Щуревский, Н.П.
116
Овдиенко, А.М. Кадочкин, В.Н. Кудяков // Ветеринария. – 1984. – № 9. –
С. 29–30.
182. Якушева, О.В. К оценке патологоанатомических изменений в диагностике
туберкулеза
/ О.В.
Якушева,
B.C.
Суворов,
Э.Л.
Колоскова
//
Ветеринарная патология. – 2004. – № 12. – С. 79–80.
183. Яременко, Н.А. Эпизоотическая ситуация в мире и в России. / Н.А.
Яременко // Вет. газета. – 2002. – № 15. – С. 45.
184. Ackermann, L.J. Mycobacterium tuberculosis infection in a parrot / L.J.
Ackermann, S.C. Benbrook, B.C. Walton // Am. Rev. Resp. Dis., – 1974. – №
109, – P. 388–390.
185. Azuma, I. Chemical and immunological on Mycobacterial polysaccharides / I.
Azuma, H. Kimura, T. Ninaka // J. Bacteriol. – 1968. – Vol. 95, – № 2. – Р.
263–271.
186. Bass, G.K., Stuart L.S. Disinfection, sterilization and preservation.–
Philadelphia: Lawrence C.A. and Block S.S., – 1968. – 327 p.
187. Beerwerth, W. Mikobacterien in der Umwelt von Mensch und Tier /
Beerwerth, W., Kessel, U. // Zbl. Bacteriol. J, Reihe A. – 1976. – Vol. 235, –
1/3. – P. 177–183.
188. Bergan, T., Lystad A. Disinfectant Evaluation by a Capasity Use–Dilution Test
/ J. Appl. Bact. – 1971. – Vol. 34(4). – P. 741–750.
189. Bonini, V. Loosan: evercito demicroorganismi utili alliuomo / Roth E.
Desinfektion – uner laussliche Massnahme under heutigen // Fiethaltung.
Runderwelt. – 1985. – № 2. – Р. 60–61.
190. Butler, Rey W. Repid identification of mycobacterial mycolic acids by high
performance liquid chromatography / Butler, Rey W., Kilburn James O. //
Abstr. Annu. Meet. Amer. Sos. Microbiol., Atlanta, Ga, 16 March, 1987.
Washington, D.C. – 1987. – P. 135.
191. Cattabiani, F., Pelagatti L. Il cloro e i soul compositi nella disinfezione /
F.Cattabiani, L. Pelagatti // ODV obliettivi dos veter. – 1987. – № 8 (1). – Р.
17–22.
117
192. Chavez, P. R. Ectudio de las principales causas que originan los fenomenos de
alergia inespecifica en el gamado Borino en las condiciones de Cuba / Rev.
cub. Cienc. Veter. – 1984. – Vol. 15. – № 2. – P. 133–143.
193. Collins, F.M. Bactericidal activity of alkaline glutaraldehyde solution against a
number of atypical mycobacterial species / J. of Appl. Bacteriol. – 1986. –
Vol. 61, – № 3. – Р. 247–251.
194. Contrina, N., Vera A / Prevalencia de las micobacterias atipicas // Rev. cub.
Cienc. Veter. – 1986. – Vol. 17. – 3/4. – P. 163–168.
195. Corner, L. Comparison of media for the primay isolation of M bovis for
Veterinary and medical diagnostic laboratories / L. Corner, C. Nicolacopoulos
// Austr. Vet. J. – 1988. – Vol. 65. – №7 – P. 202–205.
196. Enarson D.A., Ait–Khaled N. Tuberculosis. // European Respiratory
Monograph. 2000. Р. 67–91.
197. Global tuberculosis control : surveillance, planning, financing : WHO report
2008. WHO/HTM/TB/2008.393 ISBN 978 92 4 156354 3.
198. Hahesy, T. Cattle manure and the spread of bovine tuberculosis / T. Hahesy,
M. Scanlon, O. Carton et al. // Irish veter. J. – 1992. – Vol.45, – № 4/6. – Р.
122–123.
199. Kaufmann, S.H.E. The role of cellmediated immunity in bacterial infections /
S.H.E. Kaufmann, H. Hahn // Rev.Infect.Dis. – 1981. – 3: – Р. 1221–1250.
200. Khansari, D.N. Effects of stress on the immune system / D.N. Khansari, A.J.
Murgo, R.E. Faith // Immunol. Today. – 1990. – 11: – Р. 170–175.
201. Kolbel, H.K. Anatomy of the mycobacterial cell / Ann. Microbiol. A. –– Р.
1978. – Vol. 129, – № l. – P. 29–37.
202. Konig, K. Versuch der Bewertung des diagnostischer Tierversuchs auf
Tuberculose bragger im Vergleich zu parallee gulegten Kultur / Erlangung der
Lahnmedizineschen Doktorwrirde Wurzburg. – 1974. – 47 p.
203. Kopner, E. Ulber die Bedeutung mit Mycobabacterium tuberculosis
zusammenlebenden ubiguitaren Bakterien // Lentralblatt fur Baleteriologie,
118
Parasitenkunde, Jnfektionaskrankheiten und Hygiene. – 1933, – H. 3/4 – S.
278–281.
204. Kubica, G.P. The genus Mycobacterium (except M.leprae) / G.P. Kubica, R.C.
Good // The Procaryotes. Berlin; Heidelberg: Springer, – 1981, – vol. 2, – P.
1962–1984.
205. Lefford, M.J. Transfer of adoptive immunity to tuberculosis in mice / Infect.
Immun. – 1975. – 11: – Р. 1174–1181.
206. Lefford, M.J. Diseases in mice and rats / The Mycobacteria: a Sourcebook.
Marcel Dekker, Inc., – New York. – 1984, – P. 947–977.
207. Lugosi, L. The method of culturing M. tuberculosis with use of freezedied
Loewenstern Jensen medium / Acta tuberc. scand. – 1959. – № 4. – P. 242–
248.
208. Murohachi, T., Kondo E., Yoshida K. The role of lipids in acid–fastness of
Mycobacteria / Amer. Rev. of Respir. Dis. – 1969. – Vol. 99, № 5. – P. 594–
598.
209. Parkinson, E. Testing of Disinfectants for veterinary Agricultural use. In.:
Disinfectants: Their use and Evaluation of Effectiveness / Society for Applied
// Bacteriology Technical Series. – 1981. – № 16. – Р. 33–36.
210. Reybrouck, G. The Evaluation of the Antimicrobial Activity of Disinfectants /
Princyples and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization / A.D.
Russell, W.B. Hugo, G.A. Ayliffe. – Oxford, – 1982. – P. 134–157.
211. Schlisser, T. Testing of Chemical Disinfectants for veterinary Medicine.
Selection and sensitivity of test Bacteria / Sonderelruck aus Hygiene und
Medlizin. – 1979. – № 4. – P. 51–56.
212. Shopiro, D. Disinfectants and their use / Poultry Internat. – 1984. – Vol. 234. –
P. 60–62.
213. Siebert, J. Kriterien der Luswahl von Reinigung / Desinfektionsmitteln fur
Boden und Personal / Siebert J.: org. Pharm. Ind. – 2001. – 63, – № 2, – 219–
223.
119
214. Steiger, A. Anwendung and wirkung von Wofasteril zur prophylükticken
Disinfection in belegten kälbustälen / A. Steiger // Tierzucht. – 1978. – № 32. –
Р. 10.
215. Stonchill, A.A., Krop S., Borick P.M. Buffered glutaraldehyde a new chemical
sterilizing solution / American. J. of Hospital Pharmacy. – 1963. – Vol. 20. – P.
458–465.
216. Strauch, D. J. Zur Stand der Stall – , Dung – und Gulledesinfektion / D.
Strauch, R. Böhm, W. Philipp, J. Wekevle. // T.I. – Tierarztl. – Umsch. – 1987.
– Bd. 42. – S. 325–330.
217. Tragati, F. An outbreak of tuberculosis in goats / F. Tragati, D. Bianca, M.
Finarri // Rivista di Zootechnica et Veterinaria. – 1977. – № 2. – P. 170–176.
218. Trenner, P. «Kombinal (R) VITASEPT» ein neies Flacherdesinfektionsmittel /
P. Trenner, K. Trutner, E. Ruffle // Tierzucht. 1986. 40,10: 438–439.
219. Tsukamura, M. Numerical classification of Rhodococcus (formerly Gordon)
organisms recently isolated from sputa of patients: description of Rhodococcus
Spuit Tsukamura Sp. Nov. / Tsukamura, M. // Int. Syst. Bacterid. – 1978. – 28.
– № 2. – P. 169–181.
220. Tsukamura, M. A. Reviem on the taxonomy of the genus Mycobacterium. I.
Definition of the denus Mycobacterium. / «Kekkaku». – 1980. – 55. – № 6. –
P. 289–295.
221. Tsukamura, M. A. Reviem on the taxonomy of the genus Mycobacterium. I.
Definition of the denus Mycobacterium. / «Kekkaku». – 1980. – 55. – № 7. –
P. 341–347.
222. ValeroGuillen, P.L. Cromatografía de capa final y cromatografía de gases en*
la identification de microbacterias de Ínteres clinico / ValeroGuillen, P.L.,
MartinLuengo, E. // Enferm, infec. y. Microbiol. clin. – 1987. – Vol. 5. – № 6.
– P. 361–366.
223. Vialler, I. G. Epidemiologie der infection mit atypischen Mycobacterien /
Vialler, I. G., Jonbert, U.E. // Praxis der Pneumologe – 1973. – P. 272.
120
224. Viáller, I. G. Isolement de mycobacteries atypiques partir de ganglions de
porcs et de bovines presumes sains (note complementaire) / Vialler, I. G. et. al.
// Bull. Soc. Sc. Veter. Med. Comp. – Lyon. – 1976. – Vol. 78. – № 5. – P.
273–276.
225. Waterworth, P.W. Laboratory Methods in Antimicrobial Chemotherapy // J.
Appl. Bact. – 1984. – Vol. 56. – P. 221–225.
226. Zorawski,
C.
Przeciwbakteryjne
drialanie
chloraminy
aktywowanej
amoniakiem / C. Zorawski, P. Skwarek, M. Lipiec, A. Cegelski A // Med.
weter. – 1987. – Т. 43. – № 5. – S. 273–277.
227. Zorawski, C. Badenia nad wystepowaniem pratkow ptasich I atypowych u swin
/ Zorawski, C., Karpinski T., Skwarek, P. // Med. wet. 1974. Vol. 30.n. 12. P.
711–714.
228. Zorawski, C. Mycobacterium intracellularae, serotype 8 (Davies), existing in
sawdust as a cause of mass infection of pigs / C. Zorawski, T. Karpinski //
Bull. Veter. Inst. In Pulawy. – 1983. – Vol. 26. – P. 14.
121
СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА
Формула 1. Индекс заболеваемости
Таблица 1. Динамика эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в Российской Федерации с 2008 по 2013гг.
Рисунок 1. Заболеваемость туберкулезом крупного рогатого скота в Российской
Федерации с 2008 по 2013 гг.
Таблица 2. Динамика эпизоотологической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в ООО "Семхоз Ракитянский" в период 2012 по 2013гг.
Рисунок 2. Соотношения выявляемости реагирующих на ППД–туберкулин
животных с количеством обнаруженных туберкулезных поражений
Таблица 3. Динамика выявления животных реагирующих на туберкулин по
возрастным группам, голов
Таблица 4. Показатели интенсивности проявления кожных реакций на
туберкулин, %
Таблица
5.
Количество
животных
с
туберкулезными
изменениями
в
лимфатических узлах
Рисунок 3. Характерные послеубойные патологические изменения при
туберкулезе (лимфатический узел)
Рисунок 4. Туберкулезные поражения в лимфатических узлах у животных
Рисунок 5. Точечные кровоизлияния в лимфатических узлах при туберкулезе
крупного рогатого скота
Таблица 6. Оценка чувствительности и специфичности молекулярно –
генетического теста (ПЦР)
Таблица 7. Результаты сравнительного изучения ростовых свойств испытуемой
плотной питательной среды
Таблица 8. Результаты влияния методов предпосевной обработки на рост
микобактерий на плотных питательных средах
Таблица 9. Результаты сравнительного изучения ростовых свойств питательных
сред для выделения L–форм микобактерий
122
Таблица 10. Динамика выделения культур микобактерий из объектов внешней
среды
Рисунок 6. Количество выделенных культур микобактерий из различных
объектов внешней среды
Рисунок 7. Соотношение выделенных культур микобактерий из объектов
внешней среды (%)
Рисунок
8.
Соотношение
выделяемости
различных
видов
атипичных
микобактерий
Таблица 11. Изучение бактерицидных свойств электрохимических растворов на
культуре M.bovis.
Таблица 12. Результаты бактериологических исследований после применения
3% раствора NaOH, через 30 минут после обработки
Таблица 13. Результаты бактериологических исследований после применения
3% раствора NaOH, через 1 час после обработки
Таблица 14. Результаты бактериологических исследований после применения
раствора №3, через 30 минут после обработки