Карбапенемазы грамотрицательных бактерий

Клинический обзор
перегородки / М. Н.Виноградова [и др.] // Актуальные вопросы
курортологии. Матер. научно!практич. конфер. Светлогорск, 18!19
сентября 2002. Калининград. 2002. С. 12!14.
4. Изюмская, А. О. Результаты физической реабилитации больных
кардиохирургического профиля в условиях санатория / А. О.Изюмская, В.
В.Сардыко // Тематич. сборник «Долечивание (реабилитация) больных
после операций на сердце и магистральных сосудах». М., 2007. Вып. 1. С.
85!88.
5. Кассирский, Г. И. Оценка типов реакции сердечно!сосудистой
системы при велоэргометрии у больных после хирургической коррекции
пороков сердца / Г. И. Кассирский [и др.] // Восстановит. медицина и
реабилитация. Тезисы Международн. Конгресса. М., 2005. С. 68.
6. Кассирский, Г. И. Медицинский аспект санаторного этапа
реабилитации больных после хирургической коррекции приобретенных
пороков сердца / Г. И. Кассирский, Д. П. Писанко // Тематич. сборник
«Долечивание (реабилитация) больных после операций на сердце и
магистральных сосудах». М., 2007. Вып. 1. С. 36 – 40.
7. Шостак, Н. А. Приобретённые пороки сердца / Н. А.Шостак [и др.] //
В кн.: Кардиология: Национальное руководство / под ред. Ю.Н.Беленкова,
Р.Г.Оганова. М.: ГЭОТАР!Медиа, 2007. С. 834 – 864.
8. Amato M. C. Treatment decision in asymptomatic aortic valve stenosis: role
of exercise testing / M. C.Amato [et al.] // Heart. 2001. Vol. 86. P. 381 – 386.
9. Bonow, R. O. 36th Betseda Conference: Recommendations for determin!
ing eligibility for competition in athletes with cardiovascular abnormalities. Task
Force 3: Valvular Heart Disease / R.O.Bonow [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol.
2005. Vol. 14. P. 1334!1340.
10. Bonow, R. O. Management of patients with valvular heart disease / R. O.
Bonow [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. 2006. Vol. 48, No 3. e1!e148.
11. Butchart, E. G. Recommendations for the management of patients after
heart valve surgery /
E. G. Butchart [et al.] // Eur. Heart J. Nov. 2005. Vol. 26 (22). P. 2463!2471.
12. Carli, F. Optimizing functional exercise capacity in the elderly surgical
population / F.Carli, G. Zavorsky // Current Opinion in Clinical Nutrition and
Metabolic Care. 2005. No 8. P. 23!32.
13. d’Arcy, J. L. Valvular heart disease: the next cardiac epidemic / J. L. d’Arcy
[et al.] //Heart. 2011 Jan. Vol. 97, No 2. P. 91!93.
14. Das, P. Exercise testing to stratify risk in aortic stenosis / P. Das [et al.] /
/ Eur. Heart J. 2005. Vol. 26. P. 1309!1313.
15. Flachskampf, F. A. Mitral regurgitation is incompletely characterized at
rest / F. A. Flachskampf // J. Am. Coll. Cardiol. 2010. Vol. 56. P. 310313.
16. Fredriksen, P. M. Effect of physical training in children and adolescent
with congenital heart disease / P. M. Fredriksen [et al.] // Cardiol. Young. 2000.
No 10. P. 107!114.
17. GohkleBarwolf, Ch. Exercise testing in valvular heart disease / Ch.Gohkle!
Barwolf // In: J.Perk et al. (eds). Cardiovascular prevention and rehabilitation.
Springer!Verlag London limited, 2007a. Ch. 16. P. 110!137.
18. GohkleBarwolf, Ch. Exercise training in valvular heart disease /
Ch.Gohkle!Barwolf // In: J.Perk et al. (eds). Cardiovascular prevention and
rehabilitation. Springer!Verlag London limited, 2007b. Ch. 20. P. 156!162.
19. Hadj, A. Pre!operative preparation for cardiac surgery utilizing of combina!
tion of metabolic, physical and mental therapy / A.Hadj [et al.] // Heart, Lung
and Circulation. 2006. Vol. 15. P. 172!181.
20. Hansen, L. Factors influencing survival and postoperative quality of life
after mitral valve reconstruction / L.Hansen [et al.] // Eur. J. Cardiovasc/ Sur!
gery. March 1, 2010. Vol. 37, No 3. P. 635!644.
21. Iung, B. Recommendations on the management of the asymptomatic
patient with valvular heart disease / B.Iung [et al.] // Eur. Heart J. 2002. Vol.
23. P. 1253!1266.
22. Jairath, N. The effect of moderate exercise training on oxygen uptake post!
aortic/mitral valve surgery / N.Jairath [et al.] // J. Cardiopulm. Rehab. 1995.
Vol. 15. P. 424!430.
23. Kim, H. J. Cardiopulmonary exercise testing before and one year after
mitral valve repair for severe mitral regurgitation / H. J. Kim [et al.] // Am. J.
Cardiol. 2004. Vol. 93. P. 1187!1189.
24. Koch, C.G. Impact of prosthesis!patient size on functional recovery after
aortic valve replacement / C.G.Koch [et al.] // Circulation. June 21, 2005. Vol.
111, No 24. P. 3221!3229.
25. Le Tourneau, T. Effects of mitral valve surgery on exercise capacity, ven!
tricular ejection fraction and neurohormonal activation in patients with severe
mitral regurgitation / T. Le Tourneau [et al.] // J. Amer. Coll. Cardiol. 2000. Vol.
36. P. 2263!2269.
26. Lunel, С. Return to work after cardiac valvular surgery. Retrospective study
of 105 patients / Lunel [et al.] // Arch. Mal. Coeur. Vaiss. 2003. Vol.P. 15 – 22.
27. Magne, J. Exercise!induceed changes in degenerative mitral regurgita!
tion / J. Magne [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. 2010. Vol. 56. P. 300!309.
28. Mathes, P. From exercise training to comprehensive cardiac rehabilita!
tion / P.Mathes // In: J.Perk et al. (eds). Cardiovascular prevention and reha!
bilitation. Springer!Verlag London limited, 2007. Ch. 1. P. 3!8.
29. Meurin, Ph. Early exercise training after mitral valve repair: a multicentric
Prospective French study / Ph.Meurin [et al.] // Chest. Sept. 1, 2005. Vol.
128, No 3. P. 1638!1644.
30. Minamisawa, S. Effect of aerobic training on exercise performing in pa!
tients after the Fontain operation / S.Minamisawa [et al.] // Am. J. Cardiol. 2001.
Vol. 88. P. 695!698.
31. Moss, R. Outcome of mitral valve repair or replacement: a comparison by
propensity score analysis / R.Moss [et al.] // Circulation. 2003. Vol. 108. (sup!
pl). P. 1190!1197.
32. Murphy, J. J. Get Fit for Your Op / J. J. Murphy, B. Conway // Europ. J.
Cardiovasc. Nurs. March 2007. Vol. 6, No 1. Suppl. S7!S8.
33. Perk, J. Cardiovascular prevention and rehabilitation / J. Perk [et al.] (eds).
Springer!Verlag London limited, 2007. 519 p.
34. Picano, F. The emerging role of exercise testing and stress echocardiog!
raphy in valvular heart disease / F.Picano [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. 2009.
Vol. 54. P. 2251!2260.
35. Rhodes, J. Impact of cardiac rehabilitation on the exercise function of
children with serious congenital heart disease / J.Rhodes [et al.] // Pediatrics.
Dec. 1, 2005. Vol. 116, No 6. P. 1339!1345.
36. Rosenfeldt, F. Physical conditioning and mental stress reduction – a
randomized trial in patients undergoing cardiac surgery / F.Rosenfeldt [et al.] /
/ BMC Complementary and Alternative Medicine. 2011. No 11.
37. Stew art, K. J. Cardiac rehabilitation following percutaneous revascular!
ization, heart transplant,
heart valve surgery, and for chronic heart failure / K.J.Stewart [et al.] // Chest.
June 2003. Vol. 123, No. 6. P. 2104!2111.
38. Takeda, S. Prediction of symptom!onset in aortic stenosis: a comparison
of pressure drop/flow slope and haemodinamic measures at rest / S.Takeda [et
al.] // Int. J. Cardiol. 2001. Vol. 81. P. 131!137.
39. Thourani, V. H. Outcomes and long!term survival for patients undergoing
mitral valve repair versus replacement effects of age and concomitant coronary
artery bypass grafting / V. H. Thourani [et al.] // Circulation. 2003. Vol. 108. P.
298!304.
Поступила 16.05.2012 г.
Д.В. Тапальский, В.А. Осипов, С.В. Жаворонок
КАРБАПЕНЕМАЗЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ:
РАСПРОСТРАНЕНИЕ И МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ
УО «Гомельский государственный медицинский университет»,
УО «Белорусский государственный медицинский университет»
Приобретенные карбапенемазы являются важными детерминантами антибиотикорезистентности многих грамотрицательных бактерий, включая энтеробактерии, Pseudomonas aeruginosa и другие грамотрицательные неферментирующие бактерии. Эти ферменты принадлежат к молекулярному классу B (металло-βлактамазы) или молекулярным классам A и D (сериновые карбапенемазы). Гены, кодирующие карбапенемазы,
входят в состав мобильных генетических элементов, что способствует их быстрому распространению в госпитальной среде. Обзор содержит данные о распространенности карбапенемаз различных типов и методах
их обнаружения.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, энтеробактерии, меропенем, имипенем,
карбапенемазы, металло-β-лактамазы
10
Клинический обзор
D.V. Tapalski, V.A. Osipov, S.V. Zhavoronok
СARBAPENEMASES OF GRAM-NEGATIVE PATHOGENS: SPREAD AND METHODS OF
DETECTION
Acquired carbapenemases are important resistance determinants in Gram-negative pathogens, including
Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa and other Gram-negative non-fermenters. These enzymes belonging
to either molecular class B (metallo-β-lactamases) or molecular classes A and D (serine carbapenemases).
Carbapenemases encoding genes are associated with mobile genetic elements that allow their rapid dissemination
in the clinical setting. The review contain data about prevalence carbapenemases of various types and methods of
their detection.
Key words: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, enterobacteria, meropenem, imipenem, carbapenemases,
metallo-β-lactamases
К
ный класс A), металло-β-лактамазы!МБЛ (молекулярный
класс В) и отдельные OXA!ферменты (молекулярный класс
D)!подгруппы OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58 (рисунок 1).
Распространение клинически значимых приобретенных
карбапенемаз среди отдельных видов грамотрицательных
неферментирующих бактерий и энтеробактерий представ!
лено в таблице.
Наиболее распространенным типом сериновых карба!
пенемаз молекулярного класса А являются КРС (Klebsiella
Pneumoniae Carbapenemase), активные в отношении пени!
циллинов, цефалоспоринов I!V поколений, карбапенемов,
азтреонама. KPC!1 впервые описана у K. pneumoniae (Се!
верная Каролина, США, 1996). Другие члены семейства КРС
(KPC!2 – KPC!10) отличаются от KPC!1 единичными амино!
кислотными заменами, которые незначительно изменяют
активность. Кроме K. pneumoniae ферменты этого типа были
обнаружены и у других энтеробактерий!K. oxytoca,
Enterobacter spp., Salmonella spp., Citrobacter freundii,
Escherichia coli, Serratia spp., а так же у Pseudomonas
aeruginosa. В большинстве случаев отмечено клональное
распространение KPC!продуцентов. Гены blaKPC часто вхо!
дят в состав мобильных элементов (транспозоны Tn4401!
типа), поэтому кроме клонального распространения возмо!
жен их горизонтальный перенос между штаммами [5, 6, 7].
Металло!β!лактамазы, относящиеся к молекулярному
классу В, являются металлосодержащими гидролазами, в
активном центре которых содержатся атомы цинка. Они
гидролизуют не только карбапенемы, но и большинство
других β!лактамных антибиотиков, включая пенициллины
и цефалоспорины, однако не активны в отношении моно!
бактамов (азтреонама). МБЛ не чувствительны к ингибито!
рам сериновых β!лактамаз (клавуланат, сульбактам, тазо!
бактам), их активность МБЛ подавляется ЭДТА и другими
арбапенемы являются наиболее эффективными пре!
паратами для лечения тяжелых нозокомиальных
инфекций и инфекций, вызванных полимикробной флорой.
Действие этой группы антибиотиков характеризуется ши!
роким спектром активности, низкой токсичностью, хороши!
ми фармакокинетическими параметрами. Как и все β!лак!
тамные антибиотики, карбапенемы являются ингибитора!
ми синтеза клеточной стенки, блокирующими транспепти!
дазную активность пенициллинсвязывающих белков. Они
обладают высокой стабильностью к расщеплению большин!
ством β!лактамаз, включая β!лактамазы расширенного
спектра и AmpC. Вместе с тем, приобретенная устойчивость
к антибиотикам данной группы становится в настоящее вре!
мя все более распространенной среди грамотрицательных
неферментирующих бактерий и энтеробактерий – возбу!
дителей нозокомиальных инфекций [1].
Формирование устойчивости к β-лактамам у грамотри!
цательных бактерий связано с различными механизмами,
включающими изменение проницаемости клеточной стен!
ки из!за возникновения дефектов пориновых каналов и
активацию систем эффлюкса [2]. Однако наибольшее кли!
ническое и эпидемиологическое значение имеет продукция
бактериальных ферментов, гидролизующих β-лактамное
кольцо антибиотиков – β-лактамаз.
Классификация и распространение карбапенемаз
Структурная классификация β!лактамаз учитывает пер!
вичную аминокислотную структуру ферментов и простран!
ственную структура активного центра. Функциональная
классификация основана на субстратной специфичности
ферментов (способности к преимущественному гидролизу
β!лактамов определенных групп – пенициллинов, цефалос!
поринов, монобактамов, карбапенемов). По структуре пер!
вичной аминокислотной последовательности β-лактамазы
разделяют на четыре молекулярных класса – А, B, C и D [3].
Ферменты классов А, C и D являются гидролазами серино!
вого типа, ферменты класса В являются металлосодержа!
щими гидролазами, в активном центре которых содержат!
ся один или два атома цинка. Способностью гидролизовать
карбапенемы обладают отдельные представители разных
молекулярных классов β-лактамаз [4], однако наиболее рас!
пространенными и клинически важными в настоящее вре!
мя являются сериновые карбапенемазы KPC (молекуляр!
Таблица. Распространение клинически значимых при!
обретенных карбапенемаз среди грамотрицательных
неферментирующих бактерий и энтеробактерий
Рисунок 1. Классификация карбапенемаз
11
Клинический обзор
нетической кассетой, расположенной на неконъюгативной
плазмиде размером 45 т.п.н. О выделении штаммов
P.aeruginosa, продуцирующих МБЛ VIM!2 в последующем
сообщалось во многих странах мира, что свидетельствует о
глобальном распространении этого фермента [12]. VIM!3
впервые был выделен у бактерий нескольких видов в Тай!
ване [13]. К настоящему времени описано 25 ферментов,
относящихся к группе VIM, большинство из них являются
эндемичными для определенных географических террито!
рий. Исключение составляют VIM!1 и VIM!2, которые в на!
стоящее время получили международное трансконтинен!
тальное распространение.
МБЛ типа NDM. Новый тип МБЛ получил обозначение
NDM!1 от «New Delhi Metallo!beta!lactamase!1», поскольку
первый штамм, продуцирующий этот фермент, был выделен
у гражданина Швеции индийского происхождения, посту!
пившего в больницу Нью!Дели в 2008 году с инфекцией
мочевого тракта [14]. Карбапенемаза NDM!1, кодируемая
плазмидным геном, подвержена активному горизонталь!
ному переносу и очень быстро распространяется между
разными видами грамотрицательных бактерий. Впервые
описанная у K. pneumoniae, позже она была обнаружена и
у других энтеробактерий!Escherichia coli, Morganella
morganii, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, а также
у неферментирующих бактерий!Acinetobacter baumanii и
P.aeruginosa. В настоящее время NDM!1 вышел за пределы
Индии, Пакистана, Великобритании и Северной Ирландии,
где первоначально был описан, и уже зарегистрирован в
США, Канаде, Австралии, Бельгии, Японии, Швеции, Вьет!
наме, Южной Корее, Тайване, Китае, Словении [15].
OXA!карбапенемазы являются β!лактамазы сериново!
го типа (класс D), наиболее важным свойством которых яв!
ляется активность в отношении карбапенемов. Историчес!
ки всем β!лактамазам класса D присваивается наимено!
вание ОХА, но не все они обладают карбапенемазной ак!
тивностью. К настоящему времени описано более 120 β!
лактамаз молекулярного класса D, порядка 50 из них гид!
ролизуют карбапенемы. Первая OXA!β!лактамаза с карба!
пенемазной активностью была впервые описана в 1993
году. Фермент был обнаружен у полиантибиотикорезистен!
тного A. baumannii, выделенного в 1985 году от пациента в
Шотландии. Этот фермент изначально получил обозначе!
ние ARI!1 (от «Acinetobacter, резистентный к имипенему»), а
позднее – OXA!23. В дальнейшем OXA!карбапенемазы раз!
личных типов обнаруживались среди штаммов
Acinetobacter baumannii во всем мире, а также у отдельных
представителей семейства Enterobacteriaceae. В настоящее
время описано девять кластеров OXA!β!лактамаз с карба!
пенемазной активностью: OXA!23, OXA!24, OXA!51, OXA!58,
металлохелаторами, однако использование этих соедине!
ний в качестве ингибиторов МБЛ невозможно в антибак!
териальной терапии вследствие их высокой токсичности
для макроорганизма [8].
Большинство генов, кодирующих продукцию приобре!
тенных МБЛ, входят в состав интегронов, которые облада!
ют высокой мобильностью и быстро распространяются меж!
ду микроорганизмами с помощью плазмид и транспозо!
нов. Кроме генов МБЛ, такие интегроны содержат в своем
составе дополнительные генные кассеты, несущие детер!
минанты устойчивости к антибактериальным препаратам
других классов (например, аминогликозидам и хлорамфе!
николу) и дезинфектантам. Также в составе интегронов
могут присутствовать гены других β!лактамаз, поэтому пе!
редача интегронов приводит к одномоментной передаче
сложного фенотипа множественной лекарственной устой!
чивости [9].
Наиболее часто приобретенные МБЛ выявляются у
P.aeruginosa, реже у других грамотрицательных нефермен!
тирующих бактерий, например, Acinetobacter spp. Отдель!
ные случаи продукции MBL у представителей семейства
Enterobacteriaceae. В настоящее время существует по мень!
шей мере девять различных типов приобретенных метало!
β!лактамаз: IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, KHM, NDM, TMB.
Важнейшими по распространенности и клинической зна!
чимости являются МБЛ типов IMP, VIM и NDM.
МБЛ VIM (Verona IMipenemase) впервые была иденти!
фицирована у штамма P.aeruginosa в Италии в генетичес!
кой кассете в интегроне 1!го класса. Эта MBL позже была
обнаружена у E. coli в Греции и K. pneumoniae во Франции
[10, 11]. МБЛ VIM!2 впервые была идентифицирована у
штамма P.aeruginosa из южной Франции в 1996 году. VIM!2
имеет высокую степень гомологии с VIM!1 и кодируется ге!
Рисунок 3. Выявление продукции МБЛ с помощью мето!
да «двойных дисков с ЭДТА». Положительные результаты
(МБЛ+): a – штамм P.aeruginosa №4922, г. Могилев; b –
штамм P.aeruginosa №6296, г. Гомель
Рисунок 2. Алгоритм выявления карбапенемазной ак!
тивности
12
Клинический обзор
концентрацией (МИК) для меропенема, имипенема или эр!
тапенема >2 мг/л, устойчивых по крайней мере к одному из
цефалоспоринов III поколения (цефотаксиму, цефтриаксону
или цефтазидиму). При использовании диско!диффузион!
ного метода подлежат дальнейшему скринингу на наличие
карбапенемаз изоляты с диаметрами зон подавления рос!
та для меропенема или эртапенема >21 мм [17].
Методы выявления МБЛ основаны на выявлении си!
нергизма между β!лактамами – цефтазидимом, имипене!
мом и меропенемом, которые являются субстратами для
МБЛ, и металлохелаторами – веществами, связывающими
ионы цинка из активного центра металло!β!лактамаз и
подавляющими их гидролитическую активность. Наиболее
широко в качестве хелатирующего агента для детекции МБЛ
используется этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Вместо
ЭДТА возможно использование дипиколиновой кислоты, 2!
меркаптопропионовой кислоты и других тиолов. Для выяв!
ления синергизма используется ряд фенотипических мето!
дов: метод двойных дисков, метод комбинированных дис!
ков, оценка снижения МИК карбапенемов в присутствии
ЭДТА с помощью Е!тестов или методом микроразведений в
бульоне [18].
Простым, эффективным и доступным методом выявле!
ния МБЛ, пригодным для использования в практических
микробиологических лабораториях, является метод двой!
ных дисков с ЭДТА [19]. Используют 0,5 М раствор ЭДТА, для
его получения 18,6 г трилона Б (Na2!ЭДТА*2H2O) растворя!
ют в дистиллированной воде, доведя объем до 100 мл. С
помощью NaOH доводят pH до 8,0, после чего полученный
раствор стерилизуют автоклавированием и хранят в холо!
дильнике.
Готовят инокулюм из чистой суточной культуры исследуе!
мого микроорганизма. Несколько колоний стерильным хлоп!
ковым тампоном вносят в пробирку с 3 мл стерильного фи!
зиологического раствора. Взвесь бактериальных клеток
доводят до мутности 0,5 по МакФарланду и наносят сте!
рильным тампоном на поверхность агара Мюллера!Хинто!
на. Через 5 – 10 мин после инокулирования на подсохшую
поверхность агара накладываются диски согласно следую!
щей схеме: в центр – пустой стерильный диск, на который
затем пипеткой наносится 10 мкл стерильного 0,5 М ра!
створа ЭДТА (рН 8,0), по бокам от него на расстоянии 15 мм
между центрами дисков – диски с цефтазидимом (30 мкг),
имипенемом (10 мкг) и меропенемом (10 мкг). Посевы инку!
бируют в термостате при 350С в течении 16!18 часов. С
целью контроля качества параллельно с анализом испыту!
емых культур проводят исследование контрольных штаммов!
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (отрицательный конт!
роль) и штаммы, продуцирующие МБЛ известных типов (по!
ложительные контроли).
Образование расширенной зоны подавления роста
между диском с ЭДТА и хотя бы одним из дисков, содержа!
щих β!лактамные антибиотики, расценивают как наличие
продукции МБЛ у тестируемого микроорганизма. Комби!
нацию из трех дисков (имипенем, меропенем, цефтазидим)
используют для повышения чувствительности метода, по!
скольку некоторые штаммы могут проявлять синергизм только
с каким!либо одним из антибиотиков.
С использованием метода двойных дисков с ЭДТА нами
было исследовано 107 полиантибиотикорезистентных кар!
бапенемрезистентных клинических изолятов P.aeruginosa,
выделенных из клинического материала госпитализирован!
ных больных в 16 стационарах четырех областных центров
Беларуси и г. Минска. продукция МБЛ выявлена у 19 из них
[20]. Положительные и отрицательные результаты метода
двойных дисков с ЭДТА представлены на рис. 3 и рис.4.
OXA!55, OXA!48, OXA!50, OXA!60, OXA!62, с идентичностью
аминокислотных последовательностей между представите!
лями различных кластеров от 40 до 70%, внутри кластера
идентичность последовательностей составляет 92,5% и бо!
лее [4, 16]. ОХА!карбапенемазы не ингибируются клавула!
новой кислотой, сульбактамом, тазобактамом, а также ус!
тойчивы к действию ЭДТА и других металлохелаторов.
Таким образом, из всего многообразия β!лактамаз кар!
бапенемазы представляют собой наибольшую угрозу, так
как обладают высокой каталитической активностью и ши!
роким спектром субстратной специфичности, включающем
практически все классы β!лактамных антибиотиков. Боль!
шинство из них не чувствительны к основным ингибиторам
β!лактамаз, используемым в современной медицине. Гены
карбапенемаз часто сцеплены с другими детерминантами
антибиотикорезистентности и включены в состав высоко
мобильных интегронов, способных быстро распространя!
ются между бактериями с помощью плазмид и транспозо!
нов. В результате приобретения генов карбапенемаз не!
редко формируются отдельные эпидемиологически значи!
мые клоны поли!и панрезистентных микроорганизмов, спо!
собны быстро распространяться на обширных географи!
ческих территориях и вызывать серьезные инфекции, труд!
но поддающиеся терапии. Детекция этого механизма рези!
стентности важна не только для назначения оптимальной
этиотропной терапии пациенту, но и для эпидемиологичес!
кого контроля распространения резистентных штаммов и
разработки мероприятий инфекционного контроля.
В связи с опасностью широкого распространения кар!
бапенемаз возникла необходимость внедрения в рутинную
практику лабораторий клинической микробиологии фено!
типических методов выявления карбапенемаз грамотри!
цательных бактерий. Фенотипические тесты могут дать важ!
ную информацию еще до проведения более дорогих молеку!
лярно!генетических методов, доступных для использования
как правило только в референсных лабораториях.
Методы детекции карбапенемаз
Поскольку наиболее значимым маркером продукции
карбапенемаз является устойчивость к карбапенемам, не!
обходимо проводить тестирование на наличие приобретен!
ных карбапенемаз у всех штаммов P. aeruginosa,
Acinetobacter spp. и энтеробактерий, проявляющих снижен!
ную чувствительность или устойчивость к карбапенемам
[16]. На рисунке 2 представлен алгоритм выявления кар!
бапенемазной активности у грамотрицательных бактерий.
Согласно рекомендациям Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) необходимо проведение дополнительных
скрининговых тестов на выявление карбапенемаз для всех
изолятов энтеробактерий с минимальной ингибирующей
Рисунок 4. Выявление продукции МБЛ с помощью мето!
да «двойных дисков с ЭДТА». Отрицательные результаты
(МБЛ!): a – штамм P.aeruginosa №1142, г. Витебск; b – штамм
P.aeruginosa №953, г. Гродно
13
Клинический обзор
Перспективным мето!
дом идентификации как с
точки зрения времени по!
лучения результата анали!
за, так и его информатив!
Рисунок 6. Выявление про! ности является метод гиб!
дукции МБЛ с помощью Etest® ридизационного анализа
MBL, положительный результат на ДНК-микрочипах. Дан!
ная технология имеет зна!
(МБЛ+)
чительные преимущества
перед традиционными методами, так как позволяет прово!
дить многопараметрический анализ, а также миниатюри!
зировать исследуемый образец, что значительно снижает
стоимость анализа и время его проведения [26].
В связи с появлением в отдельных лечебных учреждени!
ях республики МБЛ!продуцирующих изолятов и угрозой
быстрого клонального распространения продуцентов кар!
бапнемаз с множественной лекарственной устойчивостью,
в лабораториях клинической микробиологии назрела не!
обходимость внедрения систем микробиологического мо!
ниторинга, направленного на выявление резистентности
к карбапенемам среди клинических изолятов и расшиф!
ровку ее механизмов. Микробиологический мониторинг
должен включать фенотипическое выявление карбапене!
маз у штаммов, устойчивых к меропенему и имипенему, или
имеющих сниженную чувствительность к этим препаратам.
Фенотипические тесты могут использоваться в рутинной
практике локальных микробиологических лабораторий.
Штаммы с выявленной в фенотипическом тесте продукци!
ей карбапенемаз, а также штаммы с сомнительными ре!
зультатами фенотипического теста должны передаваться в
референсные лаборатории для выполнения молекулярно!
генетических исследований (выявление генов МБЛ и моле!
кулярно!генетическое типирование для оценки клональной
родственности).
В ходе дальнейшего ис!
следования для всех ото!
бранных при фенотипичес!
ком скрининге МБЛ!поло!
жительных штаммов в муль!
типлексной ПЦР было под!
тверждено наличие генов
Рисунок 5. Выявление про! МБЛ bla VIM [21]. Показана
дукции МБЛ с помощью мето! простота и доступность ме!
да комбинированных дисков тода для использования в
с ЭДТА, положительный ре! рутинной практике лабора!
зультат
(МБЛ+),
штамм торий клинической микро!
P.aeruginosa №52210, г. биологии.
При использовании ме!
Минск
тода комбинированных дисков раствор металлохелатора
наносится на диск с антибиотиком. После инокуляции Мюл!
лер!Хинтон агара суспензией исследуемого микроорганиз!
ма на поверхность питательной среды на расстоянии не
менее 30 мм между центрами накладывают по два диска с
имипенемом и меропенемом. На один из них пипеткой на!
носят 5 мкл стерильного 0,5 М раствора ЭДТА (рН 8,0). Ин!
кубацию проводят при 350С в течении 16!18 часов. Срав!
нивают диаметры зон подавления роста в парах имипенем
– имипенем/ЭДТА и меропенем – меропенем/ЭДТА. Увели!
чение зоны подавления роста на 7 мм и более при добавле!
нии ЭДТА расценивается как положительный результат (рис.
5).
Еще один вариант фенотипической детекции МБЛ осно!
ван на использовании E!тестов. Etest® MBL (bioMerieux,
Solna, Sweden) представляет собой двустороннюю полоску,
на одной стороне которой нанесен градиент меропенема в
диапазоне концентраций 0,125!8 мкг/мл, на другой – гра!
диент меропенема в диапазоне концентраций 0,032!2 мкг/
мл в сочетании с постоянной концентрацией ЭДТА [22]. Сни!
жение минимальной ингибирующей концентрации меро!
пенема в присутствии ЭДТА на 3 и более двукратных раз!
ведения (т.е. в 8 и более раз) свидетельствует о продукции
МБЛ (рис.6).
В качестве ингибитора сериновых карбапенемаз клас!
са А (KPC) используют аминофенилбороновую кислоту
(АФБК). Для выявления синергизма между карбапенемами
и АФБК используют методы двойных дисков и комбиниро!
ванных дисков [23, 24], техника постановки которых подоб!
ны аналогичным методам для выявления МБЛ. В методе
комбинированных дисков на один из дисков с карбапене!
мом наносится 10 мкл раствора АФБК с концентрацией 60
мг/мл (600 мкг на диск). Увеличение зоны подавления рос!
та на 4 мм и более при добавлении АФБК расценивается
как положительный результат. Еще одним рекомендован!
ным методом фенотипического скрининга KPC является
модифицированный Ходж!тест [16, 25].
Трактовка результатов фенотипических скрининговых
тестов для выявления карбапенемаз не всегда однознач!
на, особенно в случаях, когда наблюдается продукция не!
скольких типов β-лактамаз одновременно. Определение
ферментов ОХА-типа с помощью фенотипических тестов
практически невозможно [4].
Предложены амплификационные методы идентифика!
ции генов карбапенемаз, принадлежащих к наиболее рас!
пространенным группам. Разработаны методы мультиплек!
сной ПЦР в режиме реального времени с последующим
анализом кривых плавления полученных ампликонов для
идентификации генов МБЛ металло-β-лактамаз [19]. Одна!
ко мультиплексная способность метода ПЦР, как правило,
ограничена, что не позволяет одновременно детектировать
большое количество генов.
Литература
1. Галкин, Д. В. Карбапенемы через 20 лет после открытия: современные
микробиологические и клинические аспекты // Клиническая
микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2007.!Том 9.!№ 2. –
С. 133!152.
2. Strateva, T., Yordanov D. Pseudomonas aeruginosa – a phenomenon of
bacterial resistance // Journal of Medical Microbiology. – 2009. – Vol. 58. – P.
1133 – 1148.
3. Bush, K., Jacoby G.A., Medeiros A. A. A functional classification scheme
for beta!lactamases and its correlation with molecular structure // Antimicrobi!
al Agents and Chemotherapy. – 1995. – Vol. 39. – P. 1211 – 1233.
4. Queenan, A. M., Bush K. Carbapenemases: the versatile beta!lactamases
// Clinical Microbiology Reviews. – 2007. – Vol. 20. – P. 440 – 458.
5. Walsh, T. R. Clinically signi?cant carbapenemases: an update. Current
Opinion in Infectious Diseases. – 2008. – Vol. 21. – P. 367 – 371.
6. Pournaras, S., Protonotariou E., Voulgari E. et al. Clonal spread of KPC!2
carbapenemase!producing Klebsiella pneumoniae strains in Greece // Jour!
nal of Antimicrobial Chemotherapy.!2009. – Vol. 64. – P. 348 – 352.
7. Woodford, N., Zhang J., Warner M. et al. Arrival of Klebsiella pneumoniae
producing KPC carbapenemase in the United Kingdom // Journal of Antimicro!
bial Chemotherapy. – 2008. – Vol. 62. – P. 1261 – 1264.
8. Gupta, V. Metallo beta lactamases in Pseudomonas aeruginosa and Aci!
netobacter species // Expert Opinion on Investigational Drugs. – 2008. – Vol.
17. – P. 131 – 143.
9. Walsh, T. R., Toleman M. A., Poirel L., Nordmann P. Metallo!beta!lactama!
ses: the quiet before the storm? // Clinical Microbiology Reviews. – 2005. –
Vol. 18. – P. 306 – 325.
10. Giakkoupi, P., Xanthaki A., Kanelopoulou M., et al. VIM!1 metallo!β!lacta!
mase!producing Klebsiella pneumoniae strains in Greek hospitals // Journal of
Clinical Microbiology. – 2003. – Vol. 41. – P. 3893 – 3896.
11. Scoulica, E. V., Neonakis I. K., Gikas A. I., Tselentis Y. J. Spread of bla VIM!
1 – producing E. coli in a university hospital in Greece. Genetic analysis of the
integron carrying the bla VIM!1 metallo!β!lactamase gene // Diagnostic Micro!
biology and Infectious Disease. – 2004. – Vol. 48. – P. 167 – 172.
12. Woodford, N., Turton J. F., Livermore D. M. Multiresistant Gram!negative
bacteria: the role of high!risk clones in the dissemination of antibiotic resist!
14
Клинический обзор
ance// FEMS Microbiology Reviews. – 2011. – Vol. 35. – P. 736 – 755.
13. Yan, J. J., Hsueh P. R., Ko W. C., et al. Metallo!β!Lactamases in clinical
Pseudomonas isolates in Taiwan and identification of VIM!3, a novel variant of
the VIM!2 enzyme // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. – 2001. – Vol.
45. – P. 2224 – 2228.
14. Kumarasamy, K. K., Toleman M. A., Walsh T. R., et al. Emergence of a new
antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular,
biological, and epidemiological study // The Lancet Infectious Diseases. –
2010. – Vol. 10. – P. 597!602.
15. Antimicrobial, resistance: revisiting the «tragedy of the commons» //
Bulletin of the World Health Organization.!2010.!Vol. 88.!.P.805!806.
16. Miriagou, V., Cornaglia G., Edelstein M., et al. Acquired carbapenemases
in Gram!negative bacterial pathogens: detection and surveillance issues //
Clinical Microbiology and Infection.!2010. – Vol. 16.!P 112 – 122.
17. Clinical, and Laboratory Standards Institute. Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing; 19th informational supplement. CLSI doc!
ument M100!S19. Wayne, PA: CLSI, 2009.
18. Yong, D., Lee K., Yum J. H., et al. Imipenem!EDTA disk method for differ!
entiation of metallo!β!lactamase!producing clinical isolates of Pseudomonas
spp. and Acinetobacter spp. // Journal of Clinical Microbiology.!2002. – Vol.
40. – P. 3798 – 3801.
19. Шевченко, О. В., Эйдельштейн М. В., Степанова М. Н. Металло!β!
лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных
неферментирующих бактерий // Клиническая микробиология и
антимикробная химиотерапия. – 2007. – Т. 9. – №3. – С. 211 – 218.
20. Тапальский, Д. В., Осипов В. А., Левшина Н. Н. и др.
Карбапенемрезистентые штаммы синегнойной палочки – продуценты
метало!бета!лактамаз: распространение в различных регионах Беларуси
// Современные проблемы инфекционной патологии человека: сб. науч.
тр. – Минск: РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, 2010. – Вып.3. –
С.658!662.
21. Тапальский, Д. В., Осипов В. А., Склеенова Е. Ю. и др. Значение
металло!β!лактамаз в формировании и распространении устойчивости
Pseudomonas aeruginosa к карбапенемам // Достижения медицинской
науки Беларуси: реценз. науч.!практ. ежегодник. – Минск: ГУ РНМБ, 2010.
– Вып.XV. – С.146!147.
22. Walsh, T. R., Bolmstrom A., Qwarnstrom A., Gales A. Evaluation of a new
E!test for detecting metallo!β!lactamases in routine clinical testing // Journal of
Clinical Microbiology. – 2002. – Vol. 40. – P. 2755 – 2759.
23. Pasteran, F., Mendez T., Guerriero L., et al. Sensitive screening tests for
suspected class A carbapenemase production in species of Enterobacteriace!
ae // Journal of Clinical Microbiology. – 2009. – Vol. 47. – P.1631 – 1639.
24. Tsakris, A, Kristo I, Poulou A et al. Evaluation of boronic acid disk tests for
differentiating KPC!possessing Klebsiella pneumoniae isolates in the clinical
laboratory // Journal of Clinical Microbioly. – 2009. – Vol. 47. – P. 362 – 367.
25. Stuart, C. J., Leverstein!Van Hall M.A. Guideline for phenotypic screening
and confirmation of carbapenemases in Enterobacteriaceae // International
Journal of Antimicrobial Agents. – 2010. – Vol.36. – P. 205!210.
26. Уляшова, М. М., Халилова Ю. И., Рубцова М. Ю. и др.
Олигонуклеотидный микрочип для идентификации генов карбапенемаз
молекулярных классов A, B и D // Acta Naturae. – 2010.!№ 3. – C.116!125.
Поступила 19.03.2012 г.
Н. В. Хоменко
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И СРЕДОВЫЕ ФАКТОРЫ В РАЗВИТИИ ШИЗОФРЕНИИ
УО «Белорусский государственный медицинский университет»
Семейные и близнецовые исследования, а также исследования усыновленных детей позволили определить
генетический вклад в развитии шизофрении и других расстройств шизофренического спектра. Анализы близнецовых данных подтвердил генетическую предрасположенность и важность предшествующих стрессовых
событий, как основных детерминант шизофрении. Современный подход заключается в исследованиях гипотезы взаимодействия генов и окружающей средой (GxE). Генно-средовое взаимодействие происходит, когда сила
воздействия внешних средовых факторов на здоровье зависит от генотипа человека (или, наоборот, когда
средовые факторы сдерживают генетические эффекты). В этой статье описываются современные подходы к
изучению генетики шизофрении и оценки генно-средовых взаимодействий.
Ключевые слова: шизофрения, генетика, генно-средовые взаимодействия, эндофенотип.
N.V. Khamenka
GENETIC AND ENVIRONMENTAL FACTORS IN THE DEVELOPMENT OF
SCHIZOPHRENIA
Studies of families, twins and adopteens have helped to quantify the genetics contributions to schizophrenia and
other disorders of schizophrenia spectrum. Analyses of in twin data have confirmed genetic susceptibility and recent
life stresses as the major determinants of schizophrenia. Modern approach in research is testing of hypothesis of
measured gene-environment interaction (GxE). A GxE occurs when the effect of exposure to an environmental pathogen
on health is conditional on a person’s genotype (or conversely, when environmental experience moderates genes’
effects on health condition. This article describes the contemporary state of art in regard to genetics of schizophrenia
and hypotheses of measured gene-environment interaction.
Key words: schizophrenia, genetics, genetic-environmental interaction, endophenotype.
Н
происхождение расстройства [16].
Исторические аспекты развития понимания природы
психических расстройств.
Изучение механизмов передачи наследуемых призна!
ков начало стремительно развиваться в конце XIX века,
когда скрупулезный монах Грегор Мендель добросовестно
записывал свои наблюдения о наследуемости внешних
признаков гороха. В дальнейшем учение Менделя было
развито англичанином Бейтсоном (Bateson) и датчанином
де Ври (de Vries), которые определили, что передача на!
следственных свойств происходит посредством получения
от родителей дискретных «элементов наследования», об!
разующаяся при этом «мозайка» и определяет проявление
у конкретного представителя вида разнообразных свойств
(фенотипов). Таким образом, был сформулирован основ!
а протяжении последних лет шизофрения остается
самым неопределенным, и, вместе с тем наиболее
широко диагностируемым психическим заболеванием, не!
зависимо от популяции и применяемых диагностических
систем. Распространенность шизофрении в мире оцени!
вается в пределах 0,8!1%, а заболеваемость составляет 15
на 100 000 населения. По данным ВОЗ шизофрения входит
в десятку ведущих причин инвалидности, ее называют «наи!
худшим заболеванием, поражающим человека»[16]. Несмот!
ря на интенсивные исследования в течение последнего века,
этиология и патогенез остаются сравнительно неясными.
Но наше непонимание природы шизофрении не может быть
объяснено недостатком данных. В настоящее время имеют!
ся сотни тысяч публикаций, посвященных данному заболе!
ванию, которые представляют множество точек зрения на
15