Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМЕНИ М.П.ЧУМАКОВА» МАЛКИН ГЕННАДИЙ АНДРЕЕВИЧ Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток 03.02.02 - вирусология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.м.н. Т.К.Дзагурова МОСКВА - 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................................4 ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..........................................................................................11 ГЛАВА 1. Хантавирусы ..........................................................................................................12 1.1 Общие сведения .................................................................................................................12 1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов ...................................................13 1.3 Антигенные и генетические взаимоотношения..............................................................18 1.4 Специфическая лабораторная диагностика ....................................................................20 1.5 Применение клеточных культур в хантавирусологии .................................................24 ЧАСТЬ II СОБСТВЕННЫЕИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................29 Глава 2. Материалы и методы исследований ......................................................................29 2.1 Клеточные культуры .........................................................................................................29 2.2 Вирусы ................................................................................................................................30 2.3 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела ......................................................31 2.4 Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА) ..........................................................31 2.5 Методы иммуноферментного анализа (ИФА) ................................................................32 2.6 Метод индикации фокусобразующихединиц (МФОЕ) .................................................33 2.7 Реакция нейтрализации в культуре клеток (РН).............................................................34 2.8 Изоляция хантавирусных штаммов .................................................................................35 2.9 Индикация микоплазм в культуре клеток методом ПЦР ..............................................36 2.10 Санация клеточных культур ПТ-1 и 4647 от микоплазменной контаминации ....................36 2.11 ОТ-ПЦР.............................................................................................................................37 2.12 Методы электронной микроскопии ...............................................................................38 2.13 Статистические методы ..................................................................................................40 ГЛАВА 3. Репликация патогенных хантавирусов в клеточных линиях различного происхождения ...........................................................................................................................41 3.1 Сравнительная оценка эффективности методов индикации размножения .................41 3.2 Адаптация хантавирусов к размножению в клеточных культурах различного происхождения ........................................................................................................................44 3.3 Динамика размножения хантавирусов в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур ......................................................................................................................................53 3.3.1 Определение оптимальной множественности заражения ................................................. 54 3.3.2 Влияние различных условий на динамику накопления вируса Пуумала в КЖ ........... 58 3.3.3 Анализ динамики размножения вируса Пуумала в течение длительного периода времени в культуре клеток VERO ................................................................................................... 62 3.3.4 Характеристика ФОЕ патогенных хантавирусов в культурах VERO и Vero E6.......... 64 ГЛАВА 4. Изоляция и идентификация штаммов хантавирусов .....................................67 4.1 Изолирование хантавирусов в культуре клеток .............................................................67 4.2 Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, РН) .................70 ГЛАВА 5. Морфологическая характеристика хантавирусов ...........................................74 ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................................................ 80 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................................ 90 ВЫВОДЫ .................................................................................................................................................. 91 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 93 2 СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ АГ – антиген АТ – антитела БОЕ – бляшкообразующие единицы БСА – бычий сывороточный альбумин ГЛПС – геморрагическая лихорадка с почечным синдромом ГЛПС-ДОБ – ГЛПС, вызванная вирусом Добрава/Белград ГЛПС-ПУУ – ГЛПС, вызванная вирусом Пуумала ДОБ – вирус Добрава/Белград ДОБ/Куркино – генотип вируса ДОБ, хозяин – полевая мышь ДОБ/Сочи – генотип вируса ДОБ, хозяин – кавказская лесная мышь ИФА – иммуноферментный анализ КЖ – культуральная жидкость КЛ – клетки лизат клеток – клетки, разрушенные замораживанием/оттаиванием мАТ – моноклональные антитела МЗ – множественность заражения МФА – метод флюоресцирующих антител МФОЕ – метод индикации фокусобразующих единиц ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПУУ – вирус Пуумала РН – реакция нейтрализации СЕУ – вирус Сеул ТМБ – 3,3',5,5'-тетраметилбензидин ФИТЦ – флюоресцеин-5-изотиоцианат ФОЕ – фокусобразующие единицы ХПС – хантавирусный пульмональный синдром ХТН – вирус Хантаан ЭС – Энросепт DMP-30 – 2,4,6 - три диметиламинометил фенол PBS – фосфатный буферный раствор VERO – культура Vero; в отличие от Vero Е6 выделено прописными буквами для облегченного восприятия в тексте 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) занимает ведущее место среди природно-очаговых инфекций в России. Возбудители этой инфекции в составе рода Hantavirus входят в семейство Bunyaviridae.К настоящему времени доказана этиологическая роль четырех хантавирусов в структуре заболеваемости ГЛПС: в европейской части России и странах Европы – вирусы Пуумала (ПУУ) и 3 генотипа вируса Добрава/Белград (ДОБ); в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии – вирус Хантаан (ХТН) и его подтип Амур и вирус Сеул (СЕУ). Таким образом, под одним названием «ГЛПС» регистрируются, по крайней мере, четыре этиологически самостоятельных хантавирусных инфекций. Естественными хозяевами хантавирусов являются грызуны и насекомоядные, в организме которых вирус длительное время коэволюцинировал. Хантавирусы с трудом адаптируются к размножению в организме лабораторных животных, а также в клеточных культурах, что вероятно объясняет более чем тридцатилетний период безуспешных попыток изолировать возбудитель ГЛПС, вирусная природа которого уже была доказана [90]. Возможность использования клеточных культур для культивирования хантавирусов стала активно изучаться после успешной адаптации вируса Хантаан, изолированного на лабораторных мышах, к культуре клеток карциномы легких человека, А549 [31]. 4 Ввиду отсутствия размножению культуры лабораторных подавляющего приобретают культивирования животных, большинства особо важное хантавирусов, хантавирусов, значение изучения чувствительных их для к клеточные выделения патогенеза in и vitro, генетических, антигенных и других таксономических характеристик, а также для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. В то же время, хантавирусы, как и большинство представителей семейства Bunyaviridae, плохо адаптируются к размножению в клеточных культурах, характеризуются длительным циклом репликации, отсутствием цитопатического эффекта, имеют прочную внутриклеточную ассоциацию, низкий уровень накопления вируса в культуральной жидкости. Спектр изученных клеточных хантавирусов, весьма культур, используемых ограничен. Несмотря для на размножения многочисленные исследования, подбор клеточной культуры пригодной в качестве субстрата для производства вакцин против ГЛПС, остается одной из актуальных проблем. В особенности это касается вакцины на основе вируса Пуумала вследствие низкого уровня репродукции его в культуре клеток. Вместе с тем, получение высокоурожайного вирусного субстрата является принципиально важной основой для создания убитых цельновирионных вакцин против ГЛПС. К настоящему времени инактивированные хантавирусные вакцины производятся в Китае, КНДР и Южной Корее на основе вирусов Хантаан и Сеул, но они не обладают защитным действием 5 против вируса Пуумала – основного возбудителя ГЛПС у жителей европейской части России, на которую приходится более 98% всей заболеваемости, регистрируемой в России [104]. Степень разработанности темы исследования К началу нашей работы не проводились систематические исследования, касающиеся оптимизации условий получения вирусного субстрата для инактивированных вакцин против ГЛПС. Отсутствовала информация о сравнительной эффективности выявления инфекционной известных лабораторных активности хантавирусов методов в клеточных культурах, как основы для разработки методов контроля безопасности вакцины. Несмотря на то, что морфологические характеристики вируса Пуумала, очищенного из суспензии легких спонтанно инфицированных рыжих полевок, были характеризующих определены морфологию еще вируса в 1982 Пуумала г. [3], данных, адаптированного к размножению в клеточных культурах, в доступной литературе не имелось. По-прежнему ограниченным остается спектр клеточных культур, разрешающих эффективную репликацию патогенных хантавирусов. вышесказанное определяет актуальность и значимость Все настоящего исследования. Цель и задачи исследования Цель данной работы – уточнение спектра перевиваемых линий клеток, способных поддерживать размножение хантавирусов, вызывающих ГЛПС 6 (ПУУ, ХАН, СЕУ, ДОБ), выявление наиболее пермиссивной клеточной культуры и условий эффективной репликации в них хантавирусов, включая изоляцию штаммов от природных носителей. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительную оценку эффективности лабораторных методов для выявления инфекционной активности хантавирусов при культивировании в клеточных культурах (МФА, ИФА, МФОЕ, ОТ-ПЦР). 2. Провести адаптацию вирусов Пуумала и Добрава/Белград к размножению в клеточных культурах различного происхождения. 3. Определить динамику размножения и оптимальные сроки накопления вирусов ПУУ, ХТН, СЕУ, ДОБ в культуральной жидкости и в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур. 4. Оптимизировать условия получения вирусного субстрата (ПУУ, ХАН, СЕУ, ДОБ), пригодного для использования при изготовлении цельновирионной инактивированной вакцины против ГЛПС. 5. Изолировать хантавирусные штаммы в культуре клеток и провести их идентификацию. 6. Исследовать морфологические характеристики вируса Пуумала, а также культуры клеток при репликации в ней вируса, по результатам электронной микроскопии. 7 Научная новизна Получены приоритетные данные в изучении биологии возбудителей хантавирусных лихорадок у нас в стране и за рубежом. Впервые показана возможность адаптации Добрава/Белград системе - теленка, что патогенных хантавирусов Пуумала и к размножению в не свойственной им биологической перевиваемых клетках, полученных из почки овцы и почки открывает возможности дальнейшего изучения вопросов, связанных с преодолением видового барьера, вирусной трансмиссии и экологии хантавирусов. Впервые установлено, что вирионы вируса Пуумала по форме и размерам значительно отличаются от аналогичных характеристик других патогенных хантавирусов, но имеют сходство с морфологией близкородственного непатогенного вируса Тула. Установлено, что штаммы, представляющие вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, а также генотипы Добрава/Сочи и Добрава/Куркино отличаются по размеру и форме фокусов, образуемых в культурах Vero и Vero E6, что позволяет рассматривать эти различия как отличительный фенотипический признак. Теоретическая и практическая значимость работы Установлены закономерности размножения вирусов, возбудителей ГЛПС, в пермиссивных клеточных культурах, определены оптимальные условия сбора вирусного урожая. Штаммы вирусов-возбудителей ГЛПС адаптированы к размножению в клеточных культурах, разрешенных для производства вакцин вводимых людям. Предложены методы контроля остаточной инфекционной 8 активности инактивированной вакцины на основании сравнительной оценки эффективности методов индикации хантавирусов в культуре клеток. Уточнена морфология вирионов хантавируса Пуумала, адаптированного к размножению в клеточных культурах, что имеет практическую значимость для усовершенствования методов концентрирования и очистки вируссодержащих препаратов. Внедрение результатов исследования Результаты исследований использованы при создании лабораторных серий вакцины против ГЛПС, а также при составлении научно-технической документации на вакцину. В Государственной коллекции вирусов депонированы 2 штамма, представляющие генотипы Добрава/Сочи и Добрава/Куркино, выделенные в культуре Vero E6 от кавказской лесной мыши и от полевой мыши, соответственно. Личное участие автора в получении результатов Автором самостоятельно проведен обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме, обобщены результаты исследований и подготовлены материалы к публикациям. Самостоятельно выполнены все эксперименты по изучению хантавирусов в клеточных культурах, выделению и идентификации вирусных штаммов и их Совместно с сотрудниками лаборатории типированию. патоморфологии вирусных заболеваний выполнены электронно-микроскопические исследования. 9 Методология и методы исследования. Методологической основой исследования послужила совокупность вирусологических, серологических, молекулярно–биологических и электронно-микроскопических методов. Основные положения, выносимые на защиту 1. Определена эффективность различных методов индикации размножения патогенных хантавирусов в клеточных культурах (выявление вирусного антигена, инфекционного вируса и вирусной РНК). 2. Впервые показана возможность репликации вирусов Пуумала и Добрава/Белград в перевиваемых клетках почки овцы и почки теленка. 3. Установлено, что после 3-5 последовательных пассажей штаммов хантавирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул в культуре VERO уровень накопления этих вирусов в культуральной жидкости соответствуют таковому в культуре клеток Vero E6. 4. Определена динамика накопления вирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул в пермиссивных клеточных культурах в зависимости от множественности заражения (МЗ), времени контакта, присутствия белковых компонентов в среде поддержки. 5. В культуре Vero E6 изолированы штаммы 2-х генотипов вируса Добрава/Белград, проведено их иммунотипирование. 6. Выявлено, что ФОЕ, образуемые штаммами вирусов Пуумала, Хантаан и Сеул, а также штаммами генотипов Добрава/Сочи и Добрава/Куркино в культурах VERO или Vero E6 имеют различия по размеру и очертаниям, 10 что позволяет рассматривать их как отличительные фенотипические признаки. 7. Впервые показано, что вирионы вируса Пуумала морфологически отличаются от других патогенных вирусов при исследовании ультратонких срезов зараженной культуры Vero E6. Апробация и публикация материалов исследования Материалы исследования доложены и обсуждены на: конференциях молодых ученых ИПВЭ им. М.П. Чумакова 2011, 2012, 2013, 2014 гг; X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 12-13 апреля 2012 г; IX Международной конференции по проблемам ГЛПС, ХПС и хантавирусам. Пекин, Китай, 2013. По теме диссертации опубликованы 7 научных работ, из них 1 - в зарубежном журнале, индексируемом в международных библиографических базах, 5 публикаций в российских журналах, входящих в Перечень рецензируемых журналов, рекомендованных ВАК, а также 1 монография. 11 ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Хантавирусы 1.1 Общие сведения Хантавирусы в составе рода Hantavirus входят в семейство Bunyaviridae - одно из наиболее крупных семейств, включающих более 300 известных вирусов животных и растений, объединенных в 5 родов: Bunyavirus, Phlebovirus, Uukuvirus, Nairovirus и Hantavirus. Представители первых 4 родов являются типичными арбовирусами. Для хантавирусов какой-либо переносчик достоверно не установлен. К настоящему времени Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV-2012) зарегистрировано в составе рода Hantavirus 23 вируса, однако количество серологически и генетически различающихся друг от друга хантавирусов значительно превышает это число. К ним относятся не только патогенные для человека хантавирусы, но и вирусы с неустановленной к настоящему времени эпидемиологической значимостью. По распространению они подразделяются на вирусы Старого Света (Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава/Белград, Tула, Хабаровск, Топографов, Таиланд, Тоттапалиам) и Нового Света (Андес, Байо, Блэк Крик Кэнал, Кано Делгадито, Ель Моро Каньон, Исла Виста, Лагуна Негра, Мулешу, Нью Йорк, Проспект Хил, Рио Маморе, Рио Секундо, Син Нобре). Хантавирусные инфекции человека на евроазиатском континенте объединены под единым названием геморрагическая лихорадка с почечным 12 синдромом (ГЛПС). В структуре заболеваемости ГЛПС доказана этиологическая роль четырех хантавирусов: вирус Пуумала и три подтипа вируса Добрава/Белград в европейской части России и странах Европы; вирусы Хантаан и его подтип Амур и вирус Сеул – в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии. На американском континенте хантавирусные инфекции объединены под названием хантавирусный пульмональный синдром (ХПС) и вызываются, в основном, вирусами Син Номбре и Андес в Северной и Южной Америке соответственно [1]. 1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов Вирионы хантавирусов имеют округлую форму с размером в диаметре от 90 до 130 нм. Липидосодержащая сформированные вирионными оболочка гликопротеинами, имеет выступы, вирусные частицы морфологически однородны [2,3,4,5]. Плавучие плотности вирусных частиц в растворах сахарозы и хлорида цезия составляют 1,16-1,17 г/мл и 1,20-1,21 г/мл, соответственно. Хантавирусы стабильны лишь в нейтральной среде при значениях pH не ниже 5 и не выше 8, инактивируются растворителями липидов и термообработкой при температуре 50 0С [6]. Геном вирусов представляет собой сегментированную одноцепочечную негативную РНК. Три сегмента генома – большой (L), средний (M) и малый (S) – кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, поверхностные гликопротеины Gn и Gc и нуклеокапсидный белок N, 13 соответственно [7,8,9]. Каждый из геномных сегментов имеет единственную функционирующую открытую рамку считывания. Вирусные белки –RdRp, Gn, Gc и N – имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 KД соответственно. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на 3'-концах одну и ту же характерную короткую последовательность 3'AUCAUCAUCUG-…-5', отличающую их от других буньявирусов. Вирион проникает в клетку, прикрепляясь к ее поверхности участками одного или обоих наружных белков: Gn, Gc, с последующим эндоцитозом. Для проникновения в клетку патогенные и непатогенные хaнтавирусы используют различные рецепторы, b3 и b1 интегрины соответственно [10,11,12]. После интернализации вирусы оказываются в составе первичной эндосомы. Далее происходит ее слияние с первичной лизосомой с образованием вторичной эндосомы, что приводит к резкому закислению рН среды, окружающей вирусную частицу [13]. Предполагается, что для проникновения вируса в клетку необходимым условием является закисление эндосом, что приводит к изменению конформации Gn:Gc гетеродимеров и способствует слиянию клеточной и вирусной мембран [14]. Инициация транскрипции у хантавирусов, предположительно, происходит также, как у вируса гриппа [15], а именно: эндонуклеаза, входящая в состав полимеразного комплекса вириона, расщепляет мРНК зараженной клетки с образованием кэпированных фрагментов, действующих впоследствии в качестве праймеров – затравок. Полученные праймеры гетерогенны по 14 нуклеотидным последовательностям и имеют длину 10-18 нуклеотидов. Эти неспецифические последовательности были обнаружены на 5'-концах РНК разных буньявирусов, включая хантавирусы [16]. Геномные РНК-сегменты образуют комплексы с N-белком, формируя L-, M- и S-нуклеокапсиды. Предшественник поверхностных гликопротеинов, кодирующийся РНК М-сегмента, расщепляется в процессе синтеза белка (котрансляционно) на гликопротеины Gn и Gc, путем воздействия клеточной сигнальной пептидазы на консервативный аминокислотный мотив WAASA[17]. Было показано [18] и позже подтверждено [19], что ни Gn, ни Gc не могут покинуть эндоплазматический ретикулум при условии, что они транслированы независимо друг от друга. Есть и другие данные [20], свидетельствующие, что поверхностные гликопротеины, экспрессированные поодиночке, транспортируются в различные клеточные компартменты: GN - в комплекс Гольджи, а GC – в эндоплазматический ретикулум. Оба исследования, однако, сходятся в том, что формирование функционального гликопротеинового комплекса возможно только в комплексе Гольджи, куда GN и GC транспортируются только в случае их последовательной трансляции с одного мРНК предшественника. После гликозилирования вирусные частицы созревают – почкуясь через мембрану комплекса Гольджи и образуя везикулы, которые транспортируются к плазматической мембране с последующим выходом вирионов путем слияния клеточной и везикулярных мембран [21]. 15 Репликация хантавирусов, как и других РНК-содержащих вирусов, сопровождается высокой частотой мутаций, вызываемых ошибками копирования РНК. Характеристики этих ошибок – скорость и частота мутаций. Скорость мутаций (среднее число нуклеотидных замен на один цикл репликации) была определена для двух вирусов: ХТН и СЕУ - 1,7x10-4 и 3,3х10-4нт/сайт/год соответственно [22]. Что касается частоты мутаций (фракция РНК потомства, в которой наблюдается данная замена), то она была определена только для вируса Пуумала [23]. Явление генетической реассортации как in vitro, так и in vivo было описано для вирусов семейства Bunyaviridae уже давно. Начиная с 1995 года стали появляться публикации об обнаружении подобного явления и у хантавирусов, Добрава/Белград в том [25]. числе возбудителей Изучение ГЛПС: реассортантов Пуумала вируса [24], Хантаан: вирулентного для новорожденных мышей штамма, вызывающего фатальную инфекцию при подкожном заражении, и его аттенуированного варианта, не вызывающего смертность у мышей, показало, что генетические отличия между штаммами затрагивали М сегмент, а именно замену 515 аминокислоты в гликопротеине GN [26]. Возможность межвидовой геномной реассортации в эксперименте была показана при одновременном заражении клеток вирусом Пуумала и непатогенным представителем хантавирусов Нового света – вирусом Проспект Хилл. В результате был получен только один реассортантный клон с диплоидным М сегментом П. Хилл и S, L 16 сегментами Пуумала. При последующем клонировании были получены клоны вируса П. Хилл, исходный клон и клон, содержащий S, L сегменты Пуумала и М сегмент вируса П.Хилл. Последний обладал способностью вырабатывать у иммунизированных мышей нейтрализующие антитела к вирусу Пуумала [27]. Предполагается, что эволюция хантавирусов, подобно другим РНКсодержащим вирусам, происходит благодаря двум известным механизмам генетическому "дрейфу" (накоплению мутаций, а также делеций/вставок) и генетическому "шифту" (реассортации сегментов генома). Хантавирусы обнаруживаются у индивидуальных представителей природных носителей в виде относительно гомогенных (1% нуклеотидных различий) популяций ~ "квазивидов" [28]. Такой спектр близкородственных генотипов накапливается благодаря отсутствию механизмов генетической репарации. По-видимому, данный факт является основой эволюции хантавирусов как представителей РНК-содержащих вирусов. Частота их достаточно велика, судя по исследованиям, выполненным на примере вируса Пуумала. Так при анализе неполных сиквенсов S, М, L сегментов вирусной РНК от 360 полевок, которые были отловлены в течение 5 лет на одной территории, было показано, что абсолютное большинство нуклеотидных замен располагалось в нетранслируемой области или синонимические, таким образом, изменения на аминокислотном уровне консервативны. Реассортации сегментов РНК вируса Пуумала происходят регулярно и включают различные варианты ассоциаций 17 геномных сегментов: S-L/M (48,5%), M-L/S (47%), S-M/L (4,4%), однако, реассортанты не стабильны. Лишь незначительная часть реассортантных вариантов продолжает циркулировать наряду с родительскими штаммами. Таким образом, эволюционные процессы у хантавирусов имеют больше нейтральный характер [29, 30]. Фенотипические изменения хантавирусов могут происходить при смене хозяина. Например, вирус Пуумала, адаптированный к клеткам Vero Е6, становился менее патогенным для основного хозяина – рыжей полевки. При этом изменения на геномном уровне коснулись только некодирующих последовательностей S сегмента (замены в n 1577, 1580), не затронув аминокислотные последовательности вирусных белков [31]. 1.3 Антигенные и генетические взаимоотношения Антигенные свойства хантавирусов обусловлены наличием антигенов нуклеокапсидного белка и антигенов поверхностных гликопротеинов. При исследовании различных моноклональных антител к вирусу Пуумала было выявлено, что нуклеокапсидный белок вызывает образование антител, не способных нейтрализовать инфекционную активность, тогда как поверхностные гликопротеины стимулируют образование нейтрализующих антител [32,34]. Использование моноклональных антител в лабораторной диагностике сделало возможным детально определить антигенные различными хантавирусами [35,36,37,38]. Тем не 18 связи между менее, результаты иммунологического анализа различных хантавирусных штаммов с помощью данного метода могут быть весьма разноречивы и безусловное предпочтение при выяснении антигенных взаимоотношений остаётся за реакцией нейтрализации. В настоящее время для определения родственных взаимоотношений хантавирусов используется анализ генетического и эволюционного родства, проводимый с (филогенетический помощью анализ) математической нуклеотидных обработки или данных аминокислотных последовательностей вирусного генома. При сравнении полученных таким образом данных с данными иммунологических реакции (нейтрализация по редукции числа бляшек, МФА с использованием моноклональных антител) было показано, что они согласуются между собой. Критерии оценки молекулярно-генетических данных в отношении принадлежности хантавирусов к определенному виду до сих пор в окончательном виде не представлены. Международным комитетом по таксономии вирусов были предложены альтернативные критерии, такие как прямое доказательство ассоциации с определенным видом (или подвидом) грызуна-резервуара и носителя; значительная (не менее 7%) степень различий в аминокислотных последовательностях нуклеокапсидного белка; не менее 4-х кратной двухсторонней разницы в опытах перекрёстной нейтрализации вирусов; отсутствие естественной реассортации с другими видами, которые в комплексе определяют видовую дифференциацию хантавирусов [39]. 19 1.4 Специфическая лабораторная диагностика Лабораторная диагностика хантавирусной инфекции начала активно развиваться с 80-х годов прошлого столетия. Применительно к хантавирусам были разработаны иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследования, позволяющие в крови больных и органах грызунов выявить вирусоспецифические антитела, антиген и вирусную РНК. Впервые хантвирусный антиген был обнаружен непрямым методом флюоресцирующих антител при исследовании криостатных срезов органов полевых мышей [40]. После выделения в культуре клеток Vero E6 вируса Пуумала (штамм CG-1820) от рыжей полевки, отловленной в окрестности г.Уфы [41], а также вируса «Уссури» от восточно-азиатской мыши [42], отловленной в природном очаге ГЛПС в Приморском крае, была разработана технология изготовления культуральных антигенных препаратов. Внедрение МФА в широкую практику с начала 80-х годов позволило выявлять атипичные формы ГЛПС, а также подтверждать диагноз в сомнительных случаях. Выявляемые МФА антитела представляют собой суммарно иммуноглобулины классов IgМ и IgG. Для подтверждения серологического диагноза проводят исследование МФА парных сывороток крови для выявления 4-х кратного и более нарастания титра антител (суммарно IgМ и IgG), поскольку в эндемичных районах у 5-10 % здорового населения имеются специфические антитела класса IgG. Как метод индикации анти20 хантавирусных IgМ МФА не применяется, т.к. IgМ антитела плохо выявляются этим методом из-за конкурентного связывания антигенных детерминант антителами класса IgG [43], которые также могут определяться в крови с первых дней заболевания. Преимущество этого метода заключается в том, что в составе инфицированных клеток присутствуют все вирусные антигены в естественно конформационной рекомбинантных генетического форме, в отличие от антигенов. До внедрения методов молекулярноисследования, для серологической дифференциации хантавирусов активно применялся МФА с помощью моноклональных антител и реакция нейтрализации. Различные модификации иммуноферментных методов нашли применение для выявления специфических антител классов IgM, IgG, IgE [41,42,43,44,45]. Антитела к хантавирусам регистрируются с первых дней заболевания, однако в некоторых случаях появляются несколько позднее и для достоверности необходимо исследование второй сыворотки в период до 6 дня болезни [46]. Было показано, что вирусспецифические IgM антитела у некоторых больных длительно (более 1 года) могут выявляться в крови после заболевания, что предполагает необходимость определять нарастание титра IgM антител в парных сыворотках при диагностике ГЛПС [52]. Также было показано, что титры антител классов IgM и IgG не коррелируют с тяжестью заболевания [48,49,50,53]. 21 Иммуноферментные методы успешно применяются для выявления хантавирусных антигенов в суспензии органов мелких млекопитающих, а также органов больных, погибших от ГЛПС, в культуральной жидкости и лизате инфицированных хантавирусами клеток [54,55,56]. Различные модификации иммуноферментных применение для выявления специфических антител методов нашли классов IgM, IgG, IgE. На основе иммунохроматографии разработан экспресс метод определения IgM антител, диагностическая эффективность которого оценивается авторами 98-99% по отношению к иммуноферментной тест-системе IgM ELISA, выпускаемой фирмой Progen [57,58]. Метод выявления нейтрализующих антител основан на выявлении «выжившего» вируса после его контакта с антителами. Поскольку хантавирусы не вызывают видимых цитопатических изменений клеток, их индикацию в культуре клеток проводят различными методами: МФА, по образованию бляшек, по выявлению инфекционных фокусов. Как правило, применяется аранжировка опыта с использованием постоянной дозы вируса, которая нейтрализуется антителами в разведениях исследуемой сыворотки. Нейтрализующую активность сыворотки, ее титр, определяют как обратную величину конечного разведения сыворотки, подавляющей не менее 50-80 % опытной дозы вируса. A. Svedmiretal. в 1980 году предложили метод МФА для оценки титра хантавируса в реакции нейтрализации (РН) по конечному разведению дозы вируса, но в связи с малой чувствительностью, трудностью 22 учета результата этот метод не нашел дальнейшего применения. Также малоэффективным является метод нейтрализации с учетом редукции числа бляшкообразующих единиц (РН БОЕ), поскольку не все штаммы хантавирусов образуют в культуре четко различимые бляшки, но даже в тех случаях, когда они образуются, необходимо длительное время для их проявления – от 12 до 16 суток. Наиболее широко используется метод нейтрализации по редукции инфекционных фокусобразующих единиц (РН ФОЕ). В этом случае для индикации инфицированных клеток (фокусов) в монослое клеток после их фиксации используются различные вариации иммунохимического выявления вирусного антигена, включая твердофазный иммуноферментный анализ и хемолюминесценцию [59,60,61,62]. РН является высокоспецифическим методом, но для рутинных целей диагностики он не пригоден, поскольку нейтрализующие антитела появляются позже других и лишь к концу месяца приобретают высокую авидность и аффинность. В то же время этот тест является единственным достоверным методом серологического типирования вирусов и одним из критериев таксономической классификации хантавирусов. Ряд других методов серологической диагностики хантавирусов не получили широкого распространения. Это радиоиммунологичесий метод, методы гемагглютинации и ингибиции гемагглютинации; метод иммунной адгезии; метод агглютинации частиц с высокой плотностью (HDPA); метод связывания комплемента [63,64, 65,66,67]. 23 Диагностика ГЛПС по выявлению вирусной РНК в биологических пробах методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентной метки пока не нашли широкого применения в практике. Ограничением этого метода в качестве диагностического может служить то, что вирусная РНК начинает исчезать из крови вскоре после появления симптомов заболевания. По различным наблюдениям, оптимальный срок выявления РНК в крови больных до 5 дня от начала заболевания[68,69,70]. 1.5 Применение клеточных культур в хантавирусологии В 1981 году вирус Хантаан, штамм 78-118 был адаптирован к размножению в культуре клеток альвеолярного эпителия человека (карцинома легких, А549) [71]. В 1984 году три группы ученых из России, Швеции и США независимо друг от друга изолировали вирус Пуумала от рыжих полевок в культуре клеток Vero E6 (линия клеток почки эмбриона африканской зеленой мартышки) [41,72,73]. Наиболее обширные исследования по определению спектра клеточных культур, чувствительных к размножению хантавирусов, были выполнены финскими учеными на примере вируса Пуумала, штамм Соткамо. В работе были использованы первичные культуры клеток почечных гломерул, эндотелиальных клеток и макрофагов периферической крови человека, а также клеточные линии, полученные из органов человека: легкие (карцинома 24 A-427, диплоидные клетки WI-38 и CCD-11Lu), карцинома почки (A-704), гепатобластома (HepG2), карцинома гортани (Detroit 562),эпидермоидная карцинома подмышечных лимфоузлов (A-253) и нейробластомы(SK-N-MC, SHSYSY). Кроме того, вирус пассировали в первичных культурах почки, селезенки и легких рыжей полевки, природного хозяина вируса Пуумала. За исключением нейробластом человека, все исследовавшиеся культуры в той или иной степени поддерживали размножение штамма Соткамо, однако ни одна из этих культур по эффективности размножения вируса не cоответствовала культуре Vero E6 [74]. Схожие результаты были получены при паcсировании вируса Хантаан, штамм 76-118 в первичной культуре клеток эндотелия вены сафена человека. Примечательно, что в этой культуре по сравнению с репликацией вируса в пермиссивной культуре CV-7 (линия клеток почки зеленой мартышки фибробластного типа) через 3 суток после заражения наблюдалось выраженное снижение уровня репликации вируса. Авторы предположили, что снижение репликации вируса в первичной культуре клеток эндотелия вены сафена человека вызвано индукцией бета-интерферона, поскольку добавление анти-бета-интерферона в культуральную среду восстанавливало размножение вируса [75]. Song с соавторами сообщили об успешном культивировании вирусов Хантаан и Сеул в первичной культуре клеток почек золотистых хомячков, которую использовали для производства инактивированных вакцин [76]. Для 25 производства коммерческих вакцин против ГЛПС на основе штаммов Хантаан и Сеул эти культуры используются по настоящее время. В целом, размножение хантавирусов в характеризуется относительно низкими титрами и клеточных культурах не сопровождается цитопатическим эффектом. В искусственно созданных условиях закисления среды до рН 6,2 на 7 сутки наблюдалось ЦПД в виде синцития, при этом вид его, от очень больших очагов (вирус Сеул) до средних (вирус Хантаан) и очень маленьких (вирус Пуумала) отражал таксономические различия хантавирусов [77]. Адаптация различных вирусов к культуре клеток мутациями на геномном уровне. A. Lundkvist сопровождается с соавторами показали, что адаптация штамма Казань вируса Пуумала к культуре клеток Vero E6 приводила к снижению вирулентности данного штамма для его природного носителя — рыжей полевки, что было связано с появлением мутаций в некодирующем регионе S-сегмента вируса в позициях 26, 1577, 1580 [31]. Таким образом, культивирование хантавирусов в культуре клеток как к изменению фенотипических свойств, привело так и к геномным мутациям. Полный анализ последовательностей S и M сегментов РНК вируса дикого типа и вируса Пуумала, адаптированного к клеткам Vero E6, показал, что адаптация к клеточной культуре сопровождалась накоплением точечных мутаций в не транслируемых участках S сегмента, но не M сегмента. Примечательно, что мутации в S-сегменте на 5’ и 3’-концах молекулы РНК (позиции 26 и 1577) 26 постепенно накапливались в процессе пассажей вируса в культуре Vero E6, начиная с третьего пассажа. После одиннадцати пассажей мутанты S-сегмента представляли абсолютное большинство. На уровне 20 пассажа была выявлена единственная замена в L белке (Ser на Phe) в позиции 2053 [78]. Анализ полных сиквенсов cDNA клонов S сегмента на 20 пассаже подтвердил ранее полученные данные о превалировании в популяции вируса квазивидов с мутацией S-сегмента в не транслируемой области. Заключение Отличительной особенностью хантавирусов является строгая видовая специализация по отношению к своему хозяину, с которым вирус длительно, более сотни тысяч лет, коэволюционировал при отсутствии какого-либо переносчика. Для хантавирусов характерно бессимптомное течение инфекции в организме спонтанно инфицированных вирусоносителей, не влияющее на их жизнедеятельность (рост, размножение, продолжительность жизни). С большой вероятностью, следствием этой уникальной стратегии выживания явились такие свойства хантавирусов, как трудность адаптации к размножению как в организме лабораторных животных, так и в клеточных культурах, отсутствие цитолитического действия при размножении как in vivo, так и in vitro. Анализ литературных источников показал: несмотря на то, что хантавирусы способны размножаться в целом ряде первичных и перевиваемых культур человеческого происхождения, а также в первичных 27 культурах почки золотистых хомячков, монгольских песчанок и рыжих полевок, наиболее часто используемой для изоляции и пассирования хантавирусов является перевиваемая линия клеток почки зеленой мартышки Vero E6. В доступной литературе отсутствует информация, характеризующая динамику размножения и накопления хантавирусов, включая патогенных для человека, в культурах клеток, а также условия, влияющие на этот процесс. В этой связи, несомненный интерес представляют исследования, направленные на освещение этих вопросов. Немаловажным является поиск клеточных культур, которые бы обеспечили более высокий урожай вируса, что является ключевым условием для успешного вакцинных препаратов. 28 производства цельновирионных ЧАСТЬ II СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2. Материалы и методы исследований 2.1 Клеточные культуры VERO– (ATCC CСL-81) перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки. Получена из ВОЗ (WHO VERO cellbank from ECACC, Accession number 991042). Vero E6 – ( ATCC No. CRL-1586) клон VeroC1008 культуры VERO, отличается определенной степенью контактной ингибиции роста. Получена из Каролинского Института, Швеция, на 108 пассаже. Клетки VERO и Vero E6 не секретируют альфа-интерферон в ответ на заражение вирусами, однако имеют рецепторы альфа и бета интерферонов [79]. Культуры клеток 4647, 455, 4184 и ПТ-1 были получены и охарактеризованы Л.Л.Мироновой с сотрудниками в ФГБНУ ИПВЭ им.М.П.Чумакова. 4647- линия гетероплоидных клеток почки взрослой зелёной мартышки, получена на 73 пассаже. При обследовании клеток на разных уровнях пассажей (с 35 по 218) вирусы–контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были [80]. Для пассажей использовалась среда Игла МЕМ с 5% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:5. 455 - линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки, получена на 56 пассаже. При обследовании клеток 29 на разных уровнях пассажей вирусы–контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были[81]. Для пассажей использовалась среда Игла МЕМ с 5% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:6. 4184 - линия перевиваемых клеток почки эмбриона овцы, получена на 81 пассаже. При обследовании клеток на разных уровнях пассажей вирусы–контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были [82]. Для пассажей использовалась среда Игла МЕМ с 5% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:8. ПТ-1 - перевиваемая культура клеток почки теленка, получена на 75 пассаже. На уровне 65 пассажа установлена гетероплоидность клеток ПТ-1 [83]. При обследовании клеток на уровне пассажей 9 и 81 вирусы–контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были [84]. Для пассажей использовалась среда Игла МЕМ с 7% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:4. 2.2 Вирусы В работе использованы вирусы из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок, изолированные и поддерживаемые в пассажах в культуре Vero E6: ПУУ, штаммы K27/ Уфа-85, ТКД/Уфа-97; Добрава/Куркино, штаммы ЕАТ/ Липецк-07, Добрава/Сочи, штамм Ар 1584/Сочи-01; ХТН, штамм P-88/ Хабаровск–89; СЕУ, штамм SR-11. 30 2.3 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела Сыворотки крови больных и реконвалесцентов ГЛПС, а также моноклональные антитела из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок. Иммунные сыворотки крови лабораторных животных любезно предоставлены доктором H.W.Lee и доктором Bo Niklasson. 2.4 Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА) Антитела в сыворотках крови мышевидных грызунов выявляли, используя культуральные антигены вирусов ПУУ, ДОБ, ХТН, СЕУ и антивидовые антитела (кроличьи IgG против мышиных IgG+IgМ), меченных ФИТЦ. Хантавирусные антигены в инфицированных клетках выявляли непрямым МФА. Для приготовления антигенных препаратов суспензии инфицированных клеток (450-550 тыс. кл/мл) вносили по 5 мкл в лунки предметных стёкол с тефлоновым покрытием. После высушивания стёкла помещали на 20 мин в охлажденный ацетон для фиксации клеток и затем высушивали при комнатной температуре. На антигенные препараты наносили соответственно референс анти-ПУУ или анти-ДОБ сыворотки крови реконвалесцентов после ГЛПС заканчивая в разведениях, начиная с 1:64 и разведением, соответствующим титру сыворотки, а также нормальную сыворотку, не содержащую антител к хантавирусам, в разведениях с 1:16 до 1:64. Препараты помещали во влажную камеру и инкубировали при 37±1 0С в течение 30 мин (или при 6±2 0С в течение 18 час). После окончания экспозиции 31 препараты 3-кратно отмывали физиологическим раствором (0,85% NaCl), промывали дистиллированной водой, высушивали и наносили на антиген антивидовые антитела, меченные ФИТЦ. Препараты помещали во влажную камеру и инкубировали при 37 ±1 0 С в течение 30 мин, после чего их промывали 3-х кратно физиологическим раствором, 1-кратно дистиллированной водой, высушивали и исследовали с помощью люминесцентного микроскопа, используя водно-иммерсионный объектив х 65. Зараженные клетки, содержащие антиген (зернистое свечение в цитоплазме) определяли, в пяти случайных полях зрения. Результат выражали как процент заражённых клеток. 2.5 Методы иммуноферментного анализа (ИФА) Для определения антигенов хантавирусов использовали тест-систему «Хантагност» производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П.Чумакова» согласно инструкции производителя. Для детекции антигенов в клеточных культурах был использован также метод ИФА на основе моноклональных антител – «ХАНТА-N» [85]. Основу этого метода составляют моноклональные антитела (мАТ), полученные к культуральному, очищенному гельфильтрацией, инактивированному формалином, вирусу. Схема теста: сенсибилизация твердой фазы мАТ – исследуемый антигенный образец – меченные пероксидазой хрена мАТ. В лунки нечетных рядов панели («Сostar» №9018) вносили по 100 мкл IgG (мАТ ДОБ, клон F1, или мАТ ПУУ, клон D4) в концентрации 1-3 мкг/мл, в четные ряды – мышиные IgG, не имеющие специфичности по отношению к 32 хантавирусам. Через 18 часов контакта при 4 оС вносили по 100 мкл 2 % БСА и через 1 час контакта при комнатной температуре лунки промывали. Далее вносили исследуемый образец в 2- кратных разведениях в ИФА-буфере (PBS + 0,1 % БСА + 0,01 % Твин-20) по 50 мкл/лунку и через 18 часов контакта при 4 оС панель промывали и вносили по 50 мкл/лунку IgG (ДОБ, клон A4), меченые пероксидазой хрена. Через 1 час контакта при 37 0С панель промывали, вносили субстрат-индикаторную смесь (ТМБ) по 100 мкл и выдерживали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. После остановки реакции 2М серной кислотой фотометрировали лунки при длине волны 450 нм (на приборе «Multiskan»). Положительной считали пробу, для которой отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышало показатель оптической плотности в лунке с нормальным иммуноглобулином в 2,1 (индекс P/N). 2.6 Метод индикации фокусобразующих единиц (МФОЕ) ФОЕ выявляли по ранее описанному методу [86]. Монослой клеток Vero E6, выращенных в 24-луночных панелях (фирма Costar), заражали 10кратными разведениями вируса. После контакта с клетками при 37 0С в течение 1часа инокулят удаляли и вносили 0,4% или 0,6% метилцеллюлозное покрытие (800 мкл на лунку). После инкубации при 37 0С в течение 6-7суток, полужидкое покрытие удаляли, клетки один раз отмывали (здесь и далее для отмывки использовали 0,85 % раствор NaCl). Для фиксации монослоя клеток вносили в лунки панели по 400 мкл 96 % этилового спирта и после 20 мин 33 экспозиции при комнатной температуре спирт удаляли, клетки 3-х кратно по 10 мин отмывали и вносили в каждую лунку по 200 мкл специфической антихантавирусной сыворотки в дозе 16 – 32 ед. После контакта при 37 0С в течение 60 мин клетки 3-х кратно по 5 мин отмывали, вносили в лунки по 200 мкл меченные пероксидазой антивидовые антитела (белок «А»). После контакта в течение 60 мин при 37 0С или 18 часов при 4 0С клетки 3-х кратно по 10 мин отмывали и вносили индикатор пероксидазы. В качестве субстратиндикаторной системы применяли 0,05 % диаминобензидинатетрахлорид с добавлением 0,02 % NiCl2 и 0,01 % Н2О2, после чего через 15-20 мин проводили учёт опыта. Количество инфицированных колоний клеток в виде темно-серых пятен определяли визуально и титр вируса выражали как lg ФОЕ в 1 мл вносимого вируссодержащего материала. 2.7 Реакция нейтрализации в культуре клеток (РН) Нейтрализующие антитела в сыворотках крови по отношению к вирусам Пуумала, Хантаан, Сеул и Добрава/Белград определяли в соответствии с ранее описанным методом [86]. Для типирования вирусов были использованы иммунные сыворотки крови переболевших ГЛПС людей, а также экспериментальные иммунные сыворотки крови животных. Сыворотки в 2-х кратных разведениях смешивали в равным объёмом КЖ, содержащей объёме 150 мкл с 50-100 ФОЕ каждого из взятых для идентификации хантавирусов и инкубировали при 4 - 6 0С в течение 18-20 часов, после чего по 0,2 мл вирус-сывороточной смеси наносили на монослой 34 клеток Vero E6 для выявления выжившего вируса. Через 6-7 суток выявляли образовавшиеся в культуре клеток ФОЕ. Титр вируснейтрализующих антител определяли по 80 % подавлению числа ФОЕ. 2.8 Изоляция хантавирусных штаммов Для выделения хантавирусов использовали описанную ранее методику [86]. Материал для заражения брали от грызунов у которых по результатам предварительного исследования были выявлены антитела и/или хантавирусный антиген. В качестве инокулята для заражения культуры клеток использовали 10 % суспензию легочной ткани грызунов. Клетки Vero E6, 4647 и ПТ-1 по достижении 80-90 % монослоя использовали для заражения вирусами. После заражения использовали среду роста (ИМЕМ) без добавления телячьей сыворотки. Через 12-14 дней культивирования при 37 °С заражённые клетки снимали со стекла смесью 0,02 % версена и 2,5 % трипсина в соотношении 1:1. 1/3 клеток использовали для дальнейшего пассирования; 1/3 клеток исследовали для индикации размножения вируса по выявлению хантавирусного антигена в МФА, оставшиеся клетки замораживали и хранили при – 70 0С до окончания процесса изоляции штамма. После 5-6 «слепых» пассажей в случае отрицательного результата пассажные материалы уничтожались. При обнаружении специфического антигена в клетках проводилось дальнейшее пассирование этих клеток до получения не менее 60 % зараженных клеток в поле зрения. Далее вирусным материалом, полученным замораживанием 35 и оттаиванием антиген содержащих пассажных клеток, заражали свежий клеточный монослой, и собранный урожай вируса помещали на хранение при температуре – 70 °С для дальнейших исследований. Для серотипирования хантавирусов использовали два метода: МФА и реакцию нейтрализации в клетках Vero E6 с референс сыворотками. 2.9 Индикация микоплазм в культуре клеток методом ПЦР Контроль клеточных культур на наличие в них микоплазм осуществляли методом полимеразно-цепной реакции, используя готовые наборы (Indicating FTA EluteMicroCard, 1 sample area per card. Productcode:WB120411) по методике производителя. 2.10 Санация клеточных культур ПТ-1 и 4647 от микоплазменной контаминации Для освобождения клеток от микоплазменной инфекции использовались антибиотики широкого спектра действия: ВМ-С-1 (на основе антибиотика Tifmutin) и ВМ-С-2 (на основе антибиотика Minocycline), а также Энросепт (ЭС) – антибиотик, ингибирующий активность фермента ДНК-гиразы. Эти препараты применяли последовательно поочередно. На монослой клеток вносили среду, содержащую ВМ-С(1) из расчёта 0,4 мкл на 1 мл среды. Спустя 3 суток клетки пассировали в присутствии ВМ-С(2) в той же пропорции и выдерживали 4 суток. После 2-х поочередных серий пассирования клеток в присутствии ВМ-С(1) и ВМ-С (2) 36 на клетки воздействовали энросептом (ЭС) в концентрации 0,375 мл ЭС на 1 мл среды. После двух пассажей в присутствии ЭС в среде роста микоплазма не выявлялась. 2.11 ОТ-ПЦР Приготовление образцов. Для выделения вирусной РНК использовали 10 % суспензии органов грызунов в физ. растворе (по объёму лёгкого, печени, сердца или смеси органов), а также КЖ и клетки инфицированных клеточных культур. Суспензии органов получали гомогенизированием на приборе TissueLyser II, QIAGEN и далее хранили при минус 70 0С. Выделение РНК проводили методом хлороформ-фенольной экстракции. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин в лизирующем буфере (TRIZOL, Sigma) в соотношении 900 мкл реагента к 100 мкл суспензии, добавляли по 500 мкл хлороформа и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин при 4 0С, затем к водной фазе добавляли по 500 мкл 100% изопропанола и по 20 мкл 4М хлорида лития (Amresco). После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре центрифугировали при 12000 об/мин при 4 0С. К осадку добавляли по 200 мкл 70% этанола и осаждали при 12000 об/мин 5 мин при 4 0С. Осадок РНК высушивали 2-3 мин при 50 0С и растворяли в 40 мкл воды (RNAsefree water Fermentas) при 60 0С 5 мин К-ДНК получали методом обратной транскрипции. Готовили смесь объёмом 20 мкл, содержащую: 4 мкл 5× буфера (с дитиотреитолом и 37 магнием, Fermentas), 2 мкл 2,5М смеси трифосфатов (СибЭнзим), 2 мкл N6 праймера (0,1о.е.) (СибЭнзим), 0,5 мкл обратной транскриптазы (Thermo Scientific Maxima Reverse Transcriptase, 200 е.а./мкл), 10 мкл раствора РНК. Образцы инкубировали при 25, 42 и 96 0С в течение 10, 30 и 6 мин соответственно. ПЦР осуществляли согласно методике B.Klempa [51]. Внешние праймеры: HAN-L1F: 5`-ATGTAYGTBAGTGCW GATGC-3`; HAN-L1R: 5`AACCADTCWGTYCCRTCATC-3`. Внутренние праймеры (NESTED): HAN-L2F: 5`TGCWGATGCHACIAARTGGTC-3`; HAN-L2R: 5`GCRTCRTCWGARTGRTGDGCAA-3`. Готовили смесь (25 мкл), содержащую: 2,5 мкл буфера (×10), 2,5 мкл 2,5М смеси трифосфатов (СибЭнзим), 2,5 мкл 50 мМ MgCl2 (СибЭнзим), по 10 пМ каждого праймера, 2 мкл к-ДНК (или амплификата), 1 мкл Hot Start Taq ДНК полимеразы (1000 е.а., Сибэнзим). Амплификацию проводили в амплификаторе (терцик) (ДНК-Технология) с маслом (Helicon) в условиях: 95 0 С 15 мин, затем 40 циклов (или 25 в случае NESTED) по 3 сек при 95 0С, 45 сек при 53 0С, 45 сек при 72 0С, терминация 72 0С 6 мин. Детекция амплификации проводилась с помощью горизонтального гель-электрофореза в 2 % агарозе (Amresco) и в трис-боратном электродном буфере. Для электрофореза отбирали по 5 мкл растворов ДНК. В качестве стандарта использовали коммерческий набор ферментов - Gene Ruler 1 kb Plus DNA Ladder Unit Size 50 мкг, Fermentas. 2.12 Методы электронной микроскопии Для морфологической характеристики хантавирусов монослой инфицированных клеток Vero E6 снимали с поверхности флакона смесью трипсина и версена (1:1). Клетки осаждали центрифугированием (5 мин при 38 1000 об/мин) и после удаления супернатанта клеточную взвесь фиксировали глутаральдегидом в течение 1 часа при 4 оС, периодически взбалтывая. Для удаления глутаральдегида клетки осаждали (10000 об/мин х 10 мин) и добавляли раствор Хенкса так, чтобы не разрушить осадок. В таком виде клетки оставляли на ночь, после чего выполняли проводку: раствор Хенкса удаляли и аккуратно, чтобы не повредить клетки, добавляли осмий (1 г OsO2 в 45 мл Н2О), разведенный раствором Хенкса в пропорции 1:3. После инкубирования в течение 2 часов при комнатной температуре осмий удаляли и проводили обезвоживание ацетоном последовательно: 50 % х 15 мин, 70 % х15 мин, 100 % х 30 мин. Затем добавляли 100 % ацетон + окись пропилена (1:1) на 30 мин, после чего образец заливали 1 мл смеси смолы и ацетона в соотношении 1:1 и оставляли на сутки при 56 оС. Образец перекладывали в специальную форму и заливали смесью смолы с 2,4,6 - три диметиламинометил фенол (DMP-30) DMP-30 в соотношении 1 капля DMP-30 на 1 мл смолы. Форма помещалась в термостат на сутки при температуре 56 о С. Для зачистки, с образца, помещенного в специальный зажим клетками вниз, бритвой удаляли лишнюю смолу. Затем зажим устанавливали в ультратом для более точной подгонки образца. После замены ножа на новый, делали полутонкие срезы. Для ультратонких срезов оставляли маленький участок образца квадратной формы, лишнее удаляли бритвой. После выравнивания образцов до ровных квадратов температуру плавно снижали с максимального значения до тех пор, пока образцы не приобретали золотистый или серый цвет, что 39 свидетельствовало об оптимальной толщине ультратонких срезов. Сеточкой прикасались к образцу стороной с подложкой, чтобы образцы прилипли к подложке. Образцы красились цитратом свинца по Рейнольдсу в течение 710 мин. Полученные таким образом образцы готовы для просмотра с помощью электронного микроскопа. 2.13 Статистические методы При статистическом анализе материалов оценивались: среднее арифметическое и среднее геометрическое показатели, средние квадратические отклонения, погрешности средних величин. Достоверность различий выборочных совокупностей оценивались по критериям Стьюдента-Фишера и Вилкоксона. Достоверность их корреляции определялась по коэффициенту корреляции [87]. 40 ГЛАВА 3. Репликация патогенных хантавирусов в клеточных линиях различного происхождения 3.1 Сравнительная оценка эффективности методов индикации размножения хантавирусов в клеточных культурах Для выяснения степени чувствительности способов детекции размножения вируса в клеточных культурах было проведено сравнение методов, основанных на выявлении вирусного антигена с помощью МФА и ИФА, индикации инфекционного вируса методом титрования ФОЕ, а также по определению вирусной РНК методом ОТ-ПЦР. В таблице 1 обобщены результаты индикации размножения вируса Добрава/Сочи в культуре Vero E6. На модели вирусов Добрава/Сочи и Пуумала показано, что методом непрямой иммунофлюоресценции антигенсодержащие клетки можно было наблюдать через 24 часа после заражения культуры, тогда как методом ИФА антиген обнаруживался спустя 96 ч после заражения. Вторым по чувствительности явился метод титрования вируса по ФОЕ: инфекционный вирус обнаруживался в КЖ и в клетках культуры Vero E6 при зараженности более 25 % клеток. Вирусная РНК определялась при титре вируса более 3,5 lg ФОЕ/мл. Похожие результаты были получены и для вируса Пуумала, штамм К-27/Уфа-85. 41 Таблица1 - Индикация размножения вируса Добрава/Белград, шт. Ар1584/Сочи-01 в культуре Vero E6 Часы после заражения 24 48 72 96 120 144 пробы ФОЕ ИФА* ПЦР МФА КЛ отр отр 3,1 3,5 3,6 4 4,4 4,6 4,7 5,2 отр отр не иссл. отр ед.кл. 10-15% отр отр отр + + + + + отр отр + + + + + + КЛ КЖ КЛ КЖ КЛ КЖ КЛ КЖ КЛ 25-30% 50-60% 75-80% 90-95% Примечание: -* ИФА выполнен с использованием тест-системы «ХАНТА-N». Следует отметить, что через ≥ 6 суток после заражения, антиген выявляется и при более низких титрах инфекционного вируса. Так на примере вируса Пуумала было показано, что при наличии вируса в КЖ в диапазоне 2,1-3,1 lg ФОЕ/мл антиген выявлялся в 50 % проб, взятых после 5 дня заражения (таблица 2, рисунок 1). При содержании вируса ≥ 5 lg ФОЕ/мл антиген определялся во всех исследованных пробах. 42 Таблица 2 - Выявление антигена вируса Пуумала в КЖ инфицированных клеток Vero E6 с 6 по12 сутки (тест-система «Хантагност») титр (lg ФОЕ/мл) число % проб полож. % выявления антигена в разведениях КЖ 2,1- 3,0 12 50 н/р* 25 3,1 - 4,0 69 90 5,8 4,3 4,3 10,2 20,3 17,4 20,3 4,1 - 5,0 123 97 6,6 5,7 4,1 7,3 5,1 - ≥ 6 56 100 5,4 5,4 3,6 10,7 25,0 25,0 10,7 14,2 2 4 16,7 8,3 8 0 16 0 32 0 64 0 128 0 7,2 24,4 19,5 17,1 12,2 *- неразведенная КЖ Рисунок 1 – Эффективность выявления антигена вируса Пуумала в КЖ Vero E6. Таким образом, на ранних сроках размножения наиболее чувствительным методом для выявления хантавирусов в клеточных культурах является индикация внутриклеточного антигена методом непрямой иммунофлюоресценции. В зависимости от множественности заражения инфицированные клетки выявлялись через 24-48 ч после заражения. В 43 культуральной жидкости определение вируса по ФОЕ возможно при достижении более 30 % зараженности клеток. Вирусная РНК определяется в клетках методом ОТ-ПЦР при наличии инфекционного вируса в титре ≥ 3,0 lg ФОЕ/мл, а в КЖ ≥ 3,5 lg ФОЕ/мл. Иммуноферментным методом хантавирусный антиген определяется в КЖ/КЛ на 4 сутки при титре вируса ≥ 4 lg ФОЕ/мл. После 6 суток антиген определяется в 50 % проб при более низких титрах инфекционного вируса (в диапазоне 2,1- 3,0), что, по-видимому, связано с избыточной продукцией Nбелка в процессе репликации вируса. Исходя из этих данных, для оценки чувствительности той или иной клеточной линии к размножению хантавирусов были использованы методы индикации вирусспецифического антигена МФА и инфекционного вируса по титрованию ФОЕ. Эти же методы были использованы для контроля остаточной инфекционности вакцинных препаратов. 3.2 Адаптация хантавирусов к размножению в клеточных культурах различного происхождения Геймонен (Geimonen) и соавторами было показано, что размножение патогенных хантавирусов не подавляется альфа-интерфероном, и именно это свойство отличает их от непатогенных хантавирусов [88]. Исходя из этого, теоретически любая клеточная культура, а не только Vero Е6, являющаяся дефектной по выработке альфа интерферона, размножение патогенных хантавирусов. 44 может поддерживать В поисках клеточной культуры пригодной для размножения патогенных хантавирусов, и возможно, более чувствительной, чем Vero Е6, нами была предпринята адаптация штаммов вирусов Пуумала и Добрава/Белград к 4 перевиваемым культурам различного происхождения (почка эмбриона овцы, почка и селезенка зеленой мартышки, почка теленка) из коллекции культур клеток ИПВЭ им. М.П.Чумакова. Кроме этого, нами проведена адаптация штаммов вирусов - возбудителей ГЛПС к размножению в культуре VERO, рекомендуемой ВОЗ для производства вакцин, вводимых людям (Таблица 3). Таблица 3 –Характеристика клеточных культур, использованных для размножения вирусов-возбудителей ГЛПС КульЧувствительны Происхождение Пассаж Сертифицированы тура к вирусам: 4184 Почка эмбриона овцы 81-90 японский энцефалит нет ПТ-1 Почка телёнка 75-85 грипп А, аденовирусы нет 56-64 полиомиелит, рино- и аденовирусы нет адено-, арена-, бунья-, герпес-, парамиксо-, пикорна-, рабдо- и флавивирусы Сертифицированы в РФ для производства иммунобиологических препаратов, вводимых людям 455 Селезёнка зелёной мартышки 4647 Почка зелёной мартышки 73-83 VERO Почка зелёной мартышки 138144 45 Для адаптации вируса к размножению в испытуемых клеточных культурах использовали как пассажи зараженной культуры, так и пассажи вируса из лизата клеток и КЖ инфицированных культур клеток. С первого по 4 пассажи зараженной культуры осуществляли на 12-14 сутки, ориентируясь на максимальное накопление в клетках вирусного антигена. Далее сокращали время между пассажами до 7-8 суток. При снижении количества антигенсодержащих клеток в процессе пассирования зараженной культуры использовали лизат клеток и КЖ из предыдущих пассажей для заражения свежего монослоя клеток. Результаты по адаптации хантавирусов к размножению в различных клеточных культурах представлены в таблицах 4, 5, 6 и рисунках 2, 3, 4, 5. 46 Таблица 4 - Динамика размножения вируса Пуумала, шт. К27/Уфа-85 при пассажах в клеточных линиях различного происхождения Культура ПТ-1 4184 455 4647 VERO Vero Е6 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж 4 пассаж 5 пассаж 6 пассаж 7 пассаж 8 пассаж МФА* ФОЕ** МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ ед.кл. отр 5 отр 20 отр 30 отр 5*** отр 15 отр 40 отр 45 0,8 ед.кл. отр 10 отр 30 отр 20 отр 15 отр ед.*** отр 10 отр 20 отр ед.кл. отр 10 отр 40 отр 10*** отр 60 3,0 40 отр 20*** отр 60 3,5 70 4,1 90 4,3 98 4,9 96 4,6 100 4,9 98 5,1 98 4,9 100 5,1 90 4,8 95 5,2 98 5,4 100 5,5 100 5,9 100 6,0 100 5,8 100 5,9 100 5,6 100 5,8 100 5,8 100 5,6 100 5,8 100 6,1 100 5,9 100 6,0 Примечания к таблицам №№ 4,5,6 Контроль зараженности осуществляли с 7 по 14 день поле заражения. * процент антиген содержащих клеток по результатам контроля методом флюоресцирующих антител; ** титр вируса, выраженный в lg ФOE/мл; *** заражение клеточного монослоя из пассажного материала вируса с максимальным уровнем его размножения в этой культуре. 47 Таблица 5 - Динамика размножения вируса ДОБ/Куркино, шт. ЕАТ/Липецк-07 при пассажах в клеточных линиях различного происхождения Культура 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж 4 пассаж 5 пассаж 6 пассаж 7 пассаж 8 пассаж МФА* ФОЕ** МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ ПТ-1 ед.кл. отр 20 отр 40 отр 30 отр 75 0,2 25 отр 30 отр 75 1,3 4184 10 отр 40 отр 20 отр 30 отр 15*** отр 25 отр 20 отр 20 отр 455 ед.кл. отр 15 отр 50 2,3 10 отр 10*** отр 40 0,7 50 2,6 60 3,6 4647 80 3,8 90 4,2 95 4,6 98 4,8 98 4,5 100 5,0 98 4,8 100 5,0 VERO 90 4,3 95 4,7 98 5,2 98 5,4 100 5,4 98 5,9 100 5,9 98 6,0 Е-6 100 5,7 98 5,6 100 5,8 100 5,7 100 5,6 100 5,7 100 6,1 100 6,1 Таблица 6 - Динамика размножения вируса ДОБ/Сочи, шт. Ар1584/Сочи при пассажах в клеточных линиях различного происхождения Культура 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж 4 пассаж 5 пассаж 6 пассаж 7 пассаж 8 пассаж МФА* ФОЕ** МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ МФА ФОЕ ПТ-1 ед.кл. отр 20 отр 40 отр 10 отр 10*** отр 25 отр 50 1,2 65 0,7 4647 80 3,5 90 4,4 95 4,7 98 5 98 4,5 100 4,9 98 5,2 100 5,2 VERO 90 4,8 90 5,2 98 5,4 98 5,8 100 5,5 98 5,7 100 6,0 100 5,8 Е-6 98 5,5 98 5,5 100 5,8 100 5,9 98 5,7 100 5,9 100 6,1 100 6,0 48 В культуре 4647 после 2-3 пассажей как вируса Пуумала, так и Добрава/Белград, зараженность клеток соответствовала таковой в пермиссивной культуре – т.е. около 100 % (рисунок 2, 4), однако титр вируса в культуральной жидкости на протяжении 8 последовательных пассажей оставался на 0,8-1,3 lg ФОЕ/мл ниже, чем в культуре Vero E6 (рисунок 3, 5). Таким образом, отечественная культура клеток зеленой мартышки, сертифицированная для производства вакцин, оказалась менее чувствительной к размножению хантавирусов - возбудителей ГЛПС, по сравнению с культурами VERO и Vero Е6. % клеток с антигеном 100 Культуры клеток: Vero Е6 Vero 4647 455 ПТ-1 4184 80 60 40 20 0 1 2 3 4 Номер пассажа вируса 5 6 7 8 Рисунок 2 – Динамика накопления внутриклеточного антигена вируса ПУУ. Обозначения: стрелками показано заражение монослоя культуры лизатом клеток предыдущего вирусного пассажа 49 Титр вируса в lg ФОЕ/мл 7 Культуры клеток 6 Е-6 5 Vero 4 4647 3 455 2 ПТ-1 1 4184 0 0 1 2 3 4 5 Номер пассажа вируса 6 7 8 % клеток с антигеном Рисунок 3 – Динамика накопления вируса Пуумала в культуральной жидкости. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Культуры клеток Vero Е6 Vero 4647 455 ПТ-1 4184 1 2 3 4 5 Номер пассажа вируса 6 7 8 Рисунок 4 – Динамика накопления внутриклеточного антигена вируса Добрава/Куркино. 50 Титр виуса в lg ФОЕ/мл Культуры клеток 7 6 5 Е-6 4 3 Vero 4647 2 1 455 0 0 1 2 3 4 5 Номер пассажа вируса 6 7 8 ПТ1 4184 Рисунок 5 – Динамика накопления вируса Добрава/Куркино в культуральной жидкости. Еще более низкий уровень размножения вирусов Пуумала и Добрава/Белград отмечен в культуре клеток селезенки взрослой зеленой мартышки – 455. Максимальная зараженность клеток как вирусом Пуумала, так и Добрава/Белград не превысила 60 %, а титр вируса не достигал 4 lg ФOE/мл через 8 пассажей в этой культуре. Следует отметить, что на первом пассаже обоих вирусов зараженными были лишь единичные клетки, тогда как в культуре 4647 уже на первом пассаже зараженность клеток составляла около 70 %. На втором пассаже вирусов Пуумала и Добрава/Белград в культуре 455 антиген содержащими были около 40 - 50 % клеток, однако интенсивность свечения была слабой, что указывает на низкий уровень репликации вирусспецифических белков; вирус в культуральной жидкости не определялся. После заражения монослоя культуры 455 лизатом клеток с 40 % содержанием антигена вируса Пуумала (4 пас.), зараженность клеток составила на 11 сутки только 10 %, однако уже в следующем пассаже этих клеток антиген содержащими были 60 % с 51 выходом вируса в КЖ с титром 2,3 lg ФOE/мл. В дальнейшем, на 7 и 8 пассажах зараженность клеток не превысила 60 %, а титр внеклеточного вируса – 3,2 lg ФOE/мл. Динамика накопления вируса Добрава/Белград в культуре 455 характеризовалась колебанием количества антиген содержащих клеток со 2-го по 8-й пассажи между 40 – 60 %, при этом инфекционный вирус в КЖ определялся на последних двух пассажах с максимальным титром 3,6 lg ФOE/мл. В культуре клеток почки эмбриона овцы, 4184, оба хантавируса размножались слабо на протяжении 8 последовательных пассажей как инфицированной культуры, так и при заражении монослоя лизатом инфицированных клеток. Количество клеток, инфицированных вирусом Пуумала, не превышало 20 %, вирусом Добрава/Белград – 40 % со слабой интенсивностью свечения антигена; инфекционный вирус в КЖ оставался на не определяемом уровне. В культуре клеток почки теленка, ПТ-1, максимальная зараженность вирусом Пуумала составила 45 %, титр вируса в КЖ – около 2 lg ФOE/мл; максимальная зараженность вирусом Добрава/Белград составила 75 %, титр вируса в КЖ – 2,3 lg ФOE/мл. В отличие от культуры 455 и особенно 4184, в клетках ПТ-1, инфицированных как вирусом Пуумала, так и Добрава/Белград (оба генотипа), антиген интенсивно накапливался, что выражалось ярким гранулярным свечением в цитоплазме при исследовании МФА с гомологичными сыворотками. Способность культуры ПТ-1 интенсивно накапливать внутриклеточный антиген была использована для приготовления антигенных 52 слайдов для МФА. Эти антигенные препараты были применены для выявления анти-хантавирусных флюоресцирующих антител в сыворотках крови мышей при контроле специфической иммуногенной активности вакцинных препаратов. Использование клеток не обезьяньего происхождения в качестве антигенного субстрата позволяет избежать неспецифические реакции, обусловленные иммунным ответом на возможное присутствие в вакцинном препарате белков цитоскелета (клетки VERO, как субстрат вирусного материала). Таким образом, впервые установлена возможность адаптации патогенных хантавирусов Пуумала и Добрава/Белград, изолированных в культуре клеток Vero E6, к размножению в перевиваемых клетках почки овцы и почки теленка. Показано, что после 3-4 последовательных пассажей в культуре VERO размножение вирусов Пуумала и Добрава/Белград поддерживается на уровне пермиссивной клеточной культуры Vero E6. Выявлена бóльшая консервативность вируса Пуумала в сравнении с вирусом Добрава/Белград при адаптации к размножению в клеточных культурах, отличных по происхождению от Vero E6, в которой эти вирусы были изолированы. 3.3 Динамика размножения хантавирусов в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур Основой успешности изготовления цельновирионной убитой вакцины является получение высокоактивного вирусного субстрата – задача особенно сложная применительно к хантавирусам. Для её решения были проведены 53 исследования, направленные на выяснение оптимальных условий получения максимального урожая вирусов ПУУ, ХТН, СЕУ, ДОБ. 3.3.1 Определение оптимальной множественности заражения Множественность заражения (МЗ) является одним из факторов, влияющим на накопление вируса. На рисунках 6, 7, 8, 9 показана динамика накопления вирусов ПУУ, ДОБ, ХТН и СЕО в КЖ. В этих экспериментах на монослой культуры, выращенной в 1 л роллерах вносили по 20 мл КЖ с различным содержанием вируса. Через 1 ч контакта инокулят сливали и вносили среду поддержки. После 4 суток ежедневно делали полную смену среды (с понедельника до пятницы) и также далее с понедельника до пятницы (4 – 15 сутки). Рисунок 6 – Динамика накопления вируса Пуумала в КЖ клеток VERO. 54 Рисунок 7 – Динамика накопления вируса Добрава/Белград в КЖ клеток VERO. Рисунок 8 – Динамика накопления вируса Хантаан в КЖ клеток VERO. 55 Рисунок 9 – Динамика накопления вируса Сеул в КЖ клеток VERO. Были выявлены общие закономерности, указывающие на зависимость времени максимального накопления вируса в КЖ от МЗ, а именно: вместе с уменьшением МЗ увеличивается время, в течение которого титр вируса в КЖ достигает значений от 5,2 lg ФОЕ/мл и более. При низкой МЗ (менее 0,001) титр вируса не достигает 5 lg ФОЕ/мл. На примере вируса Пуумала было проведено исследование по определению оптимальной множественности заражения с использованием большой выборки данных (по 10-15 повторов на каждый вариант МЗ). Основываясь на предыдущем опыте получения вакцинного препарата, нижняя планка содержания вируса в КЖ, используемой в качестве субстрата вакцины, была установлена на уровне 5,2 lg ФОЕ/мл. 56 Рисунок 10 – Определение оптимальной множественности заражения при пассировании вируса Пуумала в культуре клеток VERO. Для заражения использовали КЖ клеток VERO с содержанием вируса ПУУ, шт. К-27/Уфа-85 в титре, обеспечивающем МЗ в диапазоне от 1,5 до 4 (I), от 0,02 до 1(II) и от 0,0005 до 0,0001 (III) ФОЕ/кл. При МЗ-I вирус накапливался в течение короткого времени и уже на четвертые сутки количество вируса в культуральной жидкости достигало 5 ±0,3 lg ФОЕ/мл, а на пятые сутки – своего максимального значения (5,8 ±0,4). Однако, несмотря на достаточно высокие показатели накопления вируса в КЖ в ранние сроки, период сбора вирусного урожая, не продолжителен: всего 2-3 дня из-за резкого снижения титра вируса в сборах КЖ в последующие сутки. 57 При МЗ-II количество накапливаемого вируса превышало отметку в 5 lg ФОЕ/мл (5,3 ±0,3) немного позже, на 5-6 сутки, но при этом, с небольшими колебаниями, длительно оставалось на уровне 5,4 ±0,2 lg ФОЕ/мл, что позволяет увеличить период ежедневного сбора вируса до 6-7 суток. При МЗ-III количество накапливаемого вируса длительно, до 10-12 суток не превышает 4 lg и лишь на короткий срок выходит на уровень около 5 lg ФОЕ/мл (5,1 ±0,3), не достигая уровня максимальных показателей размножения. Основываясь на этих данных, можно сделать вывод, что оптимальная МЗ, обеспечивающая стабильный урожай вируса на уровне > 5,1 lg ФОЕ/мл в течение 6-7 суток при ежедневном сборе КЖ находится в диапазоне от 0,01 до 1. По всей вероятности, верхний предел размножения вируса, ограничен возможностью клеток обеспечить соответствующую скорость синтеза компонентов сборки вируса (РНК, белков) и созревания (отпачковывания) вирионов. 3.3.2 Влияние различных условий на динамику накопления вируса Пуумала в КЖ Были проведены эксперименты по определению: 1) влияния способа заражения (на монослой или во взвесь клеток); 2) времени контакта с клетками, 3) субстрата заражения (КЖ или лизат клеток); 4) присутствия белковых компонентов в среде. 58 Рисунок 11 – Накопление вируса в КЖ при заражении на монослой и во взвесь клеток при МЗ 0,01. Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень накопления вируса не зависит от способа заражения: небольшие различия в титрах вируса на 7, 9, 11 и 14 сутки (± 0,16 lg ФОЕ/мл) после внесения инокулята на монослой или во взвесь клеток укладываются в диапазон значений ошибки опыта (Рисунок 11). На рисунке 12 графически представлены результаты накопления вируса в КЖ после заражения монослоя с МЗ 0,01 и последующего контакта с клетками в течение 1 или 2-х ч. Увеличение продолжительности контакта с вирусом свыше 1 ч при 37 0С не повлияло на результат накопления вируса в КЖ. Все различия укладываются в диапазон погрешности опыта. 59 Рисунок 12 – Зависимость времени накопления и количества вирусного материала от времени контакта. Принимая во внимание тот факт, что в отличие от КЖ в лизате клеток присутствуют, помимо свободных вирусных частиц, компоненты сборки вируса, а также обломки цитоскелета и аппарата Гольджи, модифицированные в процессе созревания вируса, и которые теоретически могут рецепторы связывания вируса на поверхности клетки, блокировать были проведены эксперименты по влиянию на урожай вируса компонентного состава инокулята. В серии опытов при использовании МЗ в диапазоне 0,02 – 0,2 было показано, что нет значимых различий в титре внеклеточного вируса при заражении клеток вируссодержащим материалом в виде культуральной жидкости или в виде клеточного лизата (Рисунок 13). В то же время при хранении маточного, штаммового и рабочего запасов вируса, для его стабилизации, необходимо 60 добавлять в КЖ белковые компоненты, например 5-7 % сыворотки, тогда как в клеточном лизате вирус сохраняется без добавления стабилизаторов при температуре ниже минус 60 0С. В этой связи хранение вирусного материала, включая маточный и посевной запас вируса предпочтительно в виде лизата инфицированных клеток. Рисунок 13 – Динамика накопления вируса в культуральной жидкости при заражении монослоя КЖ или клеточным лизатом. При производстве цельновирионных вакцин минимизация посторонних белковых компонентов в составе среды поддержки обеспечивает снижение потерь вируса при очистке первичного вирусного субстрата. Как правило, в составе среды поддержки используют сыворотку крови телят. 61 Эксперименты показали, что добавление в среду поддержки 1-2 % сыворотки теленка или 0,25 % человеческого сывороточного альбумина не оказывают влияния на урожай вируса Пуумала (Рисунок 14). Рисунок 14 – Влияние добавления белковых компонентов на динамику накопления вирусного материала в КЖ. 3.3.3 Анализ динамики размножения вируса Пуумала в течение длительного периода времени в культуре клеток VERO Было проведено исследование и проанализирована динамика размножения вируса Пуумала в культуре VERO в течение 57 дней. Начиная с 4 суток после заражения монослоя клеток (1 л роллеры) с МЗ 0,2 проводилась полная смена среды (Игла МЕМ с 200 мкг/мл канамицина) еженедельно с понедельника по пятницу. В пробах КЖ определяли титр вируса по ФОЕ, процент инфицированных клеток определяли еженедельно по выявлению 62 антигена МФА в соскобе клеток. На протяжении опыта не отмечено цитопатических изменений и других видимых в световом микроскопе морфологических отличий зараженной и не зараженной культуры. Структура монослоя как зараженных, так и не зараженных клеток, со временем, визуально приобретала вид многослойности. Рисунок 15 – Динамика персистирования вируса Пуумала в культуре VERO. На рисунке 15 представлены кривая накопления вируса в КЖ и процент инфицированных клеток. После достижения к пятым суткам 5,3 lg ФОЕ/мл количество вируса в КЖ до 12 суток оставалось в пределах 5,2-5,5 lg ФОЕ/мл, после чего был отмечен заметный спад до уровня 4,4 lg ФОЕ/мл. Далее количество вируса в диапазоне 3,5 – 4,3 lg ФОЕ/мл сохранялось до конца эксперимента, при этом процент зараженных клеток (97±3%),оставался неизменным на протяжении всего эксперимента. 63 3.3.4 Характеристика инфекционных фокусов патогенных хантавирусов в культурах VERO и Vero E6 Инфекционные фокусы - колония инфицированных клеток, по сути аналог бляшек с той лишь разницей, что фокусы регистрируется с помощью ИФА, что подтверждает специфичность инфекции, в то время как бляшки – это колония клеток, погибших в результате воздействия любого вируса. Бляшки, как фенотипический признак, широко использовался в вирусологии для характеристики биологических свойств штаммов вирусов, как отражение их генетических различий. В наших экспериментах было показано, что в культурах клеток VERO и Vero E6 штаммы хантавирусов ПУУ, ХТН и СЕУ, а также генотипов ДОБ/Сочи и ДОБ/Куркино образуют фокусы, различающиеся по размеру и форме (Рисунок 16 – А, Б): наиболее крупные с фестончатыми краями у вируса Сеул, средние у вируса Хантаан и более мелкие у вируса Пуумала. Отличия Добрава/Белград, образованные наблюдаются также принадлежащим ДОБ/Сочи заметно между различным мельче, ДОБ/Куркино. 64 чем штаммами генотипам: фокусы, вируса фокусы, образованные А Б Рисунок 16 А, Б – Различия фокусов хантавирусов в культуре Vero E6. Таким образом, динамика накопления вируса в культуральной жидкости при инфицировании клеток VERO и Vero E6 штаммами вирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул имеет сходные характеристики: при множественности заражения 1,0–0,01 ФОЕ/кл максимальное накопление вируса в культуральной жидкости достигается на 4-6 сутки, поддерживается на этом уровне, с небольшими колебаниями, до 12 суток, что позволяет ежедневно собирать вирусный урожай с 5-6 по 11-12 сутки. 65 Для заражения монослойной роллерной культуры VERO с одинаковой эффективностью можно использовать как вирусный материал в виде КЖ, так и в виде клеточного лизата. Оптимальное время контакта при заражении – 1 ч при 37 0С, увеличение контакта до 2 ч не влияет на динамику размножения хантавирусов. Динамика размножения хантавирусов в культуре VERO не зависит от присутствия в составе среды поддержки белковых компонентов (сыворотки крови теленка, сывороточного альбумина). Использование без сывороточной среды для размножения вируса обеспечивает технологические преимущества: во-первых, снижается содержание общего белка в первичном вирусном субстрате, во-вторых, снижаются материальные затраты на приобретение белковых компонентов для среды поддержки. Вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, а также штаммы генотипов ДОБ/Сочи и ДОБ/Куркино, отличаются по размеру и форме фокусов, образуемых в культурах VERO и Vero E6, что позволяет рассматривать их как отличительные фенотипические признаки. 66 ГЛАВА 4. Изоляция и идентификация штаммов хантавирусов 4.1 Изолирование хантавирусов в культуре клеток Изоляция хантавирусов в культуре клеток – это, по сути, адаптация их к размножению в другой биологической системе. Для хантавирусов обычно с этой целью используются клетки Vero E6. Нами была предпринята попытка изоляции хантавирусов в других культурах (ПТ-1, 4647) параллельно с культурой Vero E6. В случае удачной попытки изоляции хантавирусов в нескольких, различных по происхождению или другим культуральным характеристикам линиях клеток, предметом интереса являются генетические различия, которые сопровождают адаптацию хантавирусов к размножению в несвойственных им биологических системах. Материал для изоляции штаммов был отобран по результатам обследования на инфицированность хантавирусами более чем 800 мелких млекопитающих, отловленных на территории Большого Сочи (Адлерский, Лазаревский районы) с 2010 по 2013 гг., а также из двух районов Тамбовской области (Тамбовский и Никифоровский) в 2012 г. Для заражения использовали 10 % суспензию ткани легкого грызуна, инфицированность которого хантавирусами была определена по присутствию хантавирусных антигена (ИФА) или антител (МФА). Попытка изоляции вируса от грызунов, инфицированность которых была установлена по наличию только хантавирусных антител, была основана на экспериментах, в которых в 67 параллельных опытах хантавирусная РНК определялась у зверьков с наличием только антител (Таблица 7). В свою очередь, наличие РНК указывает на возможное присутствие в таких биопробах вируса. Таблица 7 - Обнаружение антигена, антител и вирусной РНК определении инфицированности грызунов хантавирусами № образца Вид АГ АТ (ИФА) (МФА) при РНК (ПЦР) 13 Ap.ciscaucasicus - + + 68 Ap.ciscaucasicus + + + 43 Ap. ponticus + + + 79 Ap. ponticus + + + 275 Ap. ponticus - + + 5666 Ap.ponticus - + + 98 M. majori + - + 340 M. majori - + + 5779 M. majori - + + 5844 M. majori + + + Отбор грызунов по видовой принадлежности основывался на их роли в качестве основного хозяина вируса (Таблица 8). Так, кавказская лесная мышь является хозяином вируса ДОБ/Сочи, полевая мышь - хозяином вируса ДОБ/Куркино. Кустарниковая полевка была включена в эти эксперименты ввиду того, что по численности и инфицированности хантавирусами она занимает в разные эпидсезоны второе-третье место среди всех мелких 68 млекопитающих на территории Большого Сочи [98]. Это послужило основанием предположить, что кустарниковая полевка является резервуарным хозяином пока неустановленного хантавируса. Таблица 8 - Эффективность изоляции хантавирусов в культурах Vero E6, 4647, ПТ-1 Вид грызуна Место сбора Vero E6 4647 ПТ-1 Кустарниковая полевка Адлерский р-он 6/0* 3/0 3/0 Microtusmajori Лазаревский р-он 28/0 17/0 17/0 Кавказская лесная мышь Адлерский р-он Apodemusponticus Лазаревский р-он 5/1 7/0 5/0 0 5/0 5/0 Лазаревский р-он 4/0 4/0 0 Тамбовский р-он 11/1 6/0 6/0 4/1 65/3 (4,6%) 4/0 4/0 39/0 40/0 Полевая мышь Apodemus agrarius Никифоровский р-он Всего Примечание - * в числителе число особей, от которых был взят материал на изоляцию вируса; в знаменателе - число особей, от которых был выделен вирус. Всего было взято на выделение вируса: в культуре Vero E6 – 65 биоматериалов, в культуре 4647 – 39, в культуре ПТ-1 – 40. В культурах 4647 и ПТ-1 пассажи биоматериала проводили параллельно с Vero E6. В результате удалось изолировать 3 штамма только в культуре Vero E6 (Таблица 9). Эффективность выделения вируса составила: от кавказской лесной мыши – 8,3 % (1 из 12); от полевой мыши – 10,5 % (2 из 19); от кустарниковой полевки – 0 из 34. 69 Таблица 9 - Штаммы, изолированные в культуре Vero E6 Изоляция вируса Vero E6 4647 ПТ-1 № пробы Вид грызуна Место сбора 835 Apodemus ponticus Адлерский р-он на 4пас 0 не иссл. 55 Apodemus agrarius Тамбовский р-он на 4 пас 0 0 Никифоровский р-он на 4 пас 0 0 120 Вероятно, возможным объяснением неудавшихся попыток выделить вирус от кустарниковых полевок, является особенность этого вируса в плане адаптации к размножению в несвойственной биологической системе. 4.2 Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, РН) Изолированные штаммы были закреплены в последующих 4-5 пассажах и идентифицированы иммунологически в реакции иммунофлюоресценции и по нейтрализации ФОЕ. В качестве прототипных вирусов в опыт были взяты: ДОБ/Куркино, ДОБ/Сочи, ДОБ/Добрава, Хантаан, Сеул, Пуумала. Сыворотки крови реконвалесцентов ГЛПС были предварительно типированы в РН с прототипными вирусами и использованы как источник референс антител. В таблицах 10, 11 представлены результаты опытов МФА и РН, отражающие перекрёстные иммунологические 70 взаимосвязи вновь изолированных штаммов (выделены курсивом) и штаммов прототипных хантавирусов. Полученные результаты позволяют сделать вывод о видовой специфичности и принадлежности штаммов, изолированных от полевых мышей в Тамбовской области, к подтипу ДОБ/Куркино, а штаммов, изолированных от кавказских лесных мышей - к подтипу ДОБ/Сочи. Таблица 10 - МФА. Серотипирование хантавирусных штаммов Сыворотки крови лабораторные животные реконвалесценты ГЛПСДОБ ДОБ ХТН СЕУ ПУУ Тула Тамбов Сочи Bel-1 76-118 SR-11 К-27 Аа4053/Тула-02 2048* 4096 4096 4096 2048 1024 128 Аа55/Тамбов-12 2048 4096 8192 8192 2048 1024 256 Аа120/Тамбов-12 1024 4096 4096 4096 1024 1024 128 Ар 1586/Сочи-01 1024 2048 8192 8192 2048 1024 128 Ар 835/Сочи-12 2048 4096 8192 4096 1024 1024 64 1024 2048 8192 8192 1024 512 128 1024 1024 4096 4096 1024 512 64 512 1024 4096 2048 512 2048 128 32 32 128 64 32 64 4096 Штаммы Вирус ДОБ/Куркино Вирус ДОБ/Сочи Вирус ДОБ/Добрава Belgrad-1 Вирус ХТН 76-118 Вирус СЕУ SR-11 Вирус ПУУ К-27/Уфа-85 *Титры антител, выраженные в величинах, обратных разведению сыворотки. 71 Таблица 11 - Типирование хантавирусных штаммов в РН ФОЕ Штаммы вирусов Сыворотки крови Реконвалесценты лабораторные животные ГЛПС-ДОБ ДОБ ХТН СЕУ ПУУ Тула Тамбов Сочи Bel-1 76-118 SR-11 К-27 Вирус ДОБ/Куркино Аа4053/Тула-02 Аа55/Тамбов-12 Аа120/Тамбов-12 1280* 1280 2560 1280 2560 1280 320 640 320 320 320 640 <40 <40 <40 <40 <40 <40 <40 <40 <40 320 320 320 320 2560 2560 1280 640 <40 <40 <40 <40 <40 <40 320 320 1280 2560 <40 <40 <40 76-118 40 40 40 80 640 40 <40 Вирус СЕУ SR-11 Вирус ПУУ 80 80 40 80 40 640 <40 <40 <40 <40 <40 <40 <40 2560 Вирус ДОБ/Сочи Ар 1586/Сочи-01 Ар 835/Сочи-12 Вирус ДОБ/Добрава Belgrad-1 Вирус ХТН К-27/Уфа-85 Примечание - *Титры антител, выраженные в величинах, обратных разведению сыворотки. Таким образом, была предпринята попытка изоляции хантавирусов в пермиссивной культуре Vero E6, и в культурах 4647 (39 биопроб) и ПТ-1 (40 биопроб). Изолировать штаммы удалось только в культуре Vero E6 от 2-х полевых мышей и одной кавказской лесной мыши. Эффективность изоляции вируса составил 4,6 %. Вновь выделенные штаммы были типированы иммунологически, определена их видовая принадлежность к вирусам ДОБ/Куркино и ДОБ/Сочи. Вновь выделенные штаммы не отличались от ранее изолированных прототипных штаммов вирусов ДОБ/Куркино и ДОБ/Сочи по 72 форме и размеру ФОЕ в культурах VERO и Vero E6, что позволяет предположить, что этот признак является устойчивым фенотипическим признаком, отличающим подтипы вируса Добрава/Белград: Сочи и Куркино. Изолировать штаммы от кустарниковых полевок, несмотря представительный материал исследований – 34 полевки, не удалось. 73 на ГЛАВА 5 Морфологическая характеристика хантавирусов Перед нами стояла задача, используя электронную микроскопию, дать характеристику размножения хантавирусов в клеточных культурах различного происхождения. Была отработана методика приготовления и подготовки культуры незаражённых и зараженных клеток для изучения с помощью электронной микроскопии. После ряда экспериментов, стало понятно, что уровень накопления вирусных частиц в клетках линий 455, 4184 и ПТ-1 недостаточен, чтобы достоверно распознать хантавирусы в клетках. В связи с этим мы сосредоточились на исследовании морфологии вируса Пуумала в культуре Vero E6. Изучению патологических изменений культуры клеток при её заражении хантавирусом предшествовали исследования незаражённой культуры. При светооптическом изучении полутонких срезов выявляется выраженный клеточный полиморфизм (Рисунок 17). Прежде всего, следует отметить, что даже в 3-х дневной культуре обнаруживается очень широкий спектр клеток на разных этапах развития: от молодых небольших размеров клеток без признаков каких-либо нарушений, до клеток с полным разрушением цитоплазмы и клеточной оболочки. Можно выявить последовательные этапы деградации внутриклеточных структур, появление множественных вторичных лизосом (цитосегресом), набухание и изменение 74 цитоплазмы, внутриклеточная гидратация в виде многочисленных вакуолей, что подтверждается при электронно-микроскопическом исследовании (Рисунки 18а, 18б, 19). Рисунок 17 - Выраженный полиморфизм. Незаражённая культура клеток Vero E6. Увеличение 20х60. Таким образом, в незаражённой культуре клеток Vero E6 наблюдаются естественно протекающие процессы инволюции, которые при изучении заражённой культуры можно было бы принять за патологические изменения, вызванные вирусом. Изучение в световом микроскопе культуры клеток на ранних сроках (3 суток) после заражения показало, что и в этом случае наблюдаются естественные процессы клеточной инволюции, практически не отличимые от таковых в незараженной культуре (Рисунок 20). 75 А Б Рисунок 18 - Незаражённая культура клеток Vero E6. А - Молодые клетки с тёмной цитоплазмой и клетка на начальном этапе разрушения. х 6000. Б - Появление вторичных лизосом и вакуолей в цитоплазме. х 8000. Такая же картина наблюдалась и на 7-е сутки после заражения. Это в который раз доказывает, что проникающий в клетку и реплицирующийся в ней хантавирус не вызывает визуально определяемой цитопатической реакции. Наряду с вирионами в цитоплазме молодых клеток (Рисунок 21А), вирусные частицы наблюдаются и в клетках на стадии глубокой инволюции (Рисунок 21 Б). На более поздних сроках после заражения (7 сутки) состояние клеток мало отличается от 3-х суточной культуры. Вместе с тем, в этот период 76 Рисунок 19 - Незаражённая культура клеток Vero E6. Объяснение: полное разрушение внутренней структуры клетки: просветление гиалоплазмы, набухание митохондрий с разрушением крист, множественные первичные и вторичные лизосомы. х 10 000. Рисунок 20 - Культура клеток Vero E6 на 3-и сутки после заражения. Увеличение 20х60 (фрагмент). 77 появляются клетки с гораздо большим содержанием вирионов в цитоплазме (Рисунок 22). Для сравнения следует указать, что титр вируса на 3 сутки составлял 3,6 ±0,4 lgФОЕ/мл, а на 7 сутки достигал максимальных показателей: 5,7 ±0,4 lg ФОЕ/мл. В эти сроки наряду с вирионами в цитоплазме молодых и высокодифференцированных клеток обнаруживались вторичные лизосомы, состоящие преимущественно из миелиноподобных ламелл небольшого размера (150-200 нМ). А Б Рисунок 21 - Клетки, зараженные вирусом Пуумала. Объяснение: А - молодая клетка; Б - разрушающаяся клетка. Вирионы хантавируса обозначены стрелкой. х 10 000. 78 Рисунок 22 - Культура клеток Vero E6 на 7-е сутки после заражения. Большое количество вирионов хантавируса в цитоплазме. Увеличение х 8000. Визуально вирионы имели не только округлую, но и эллипсовидную форму размером около 90 нм в поперечнике и до 300 нм в длину. По абсолютно нормальной (без признаков патологии) картине клетки, представленной на рисунке 22 и большому количеству вирионов можно ещё раз убедиться, что в её цитоплазме вирус активно размножается. Следует отметить, что и при длительной инкубации заражённой культуры клеток инволютивные процессы протекают в культуре независимо от количества вирионов в цитоплазме и, скорее всего, не связаны с процессами вирусной репликации. Разнообразие размеров вирионов в данном случае (как и на всех других рисунках) объясняются тем, что диаметр вируса существенно больше толщины среза, и сам срез может проходить не через центральную часть вириона. 79 Обсуждение Хантавирусы, образующие одноименный род в составе обширного семейства Буньявирусов, единственные в этом семействе не трансмиссивные вирусы. 10 из 23 зарегистрированных в международном каталоге хантавирусов патогенны для человека и вызывают хантавирусные лихорадки с летальностью от 1-2 % до 50 % в зависимости от возбудителя. На евро-азиатском континенте это вирусы Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул, вызывающие геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС), на американском континенте – это, в основном, вирусы Син Нобр и Андес, вызывающие хантавирусный пульмональный синдром (ХПС) [1]. Естественными хозяевами хантавирусов являются грызуны и насекомоядные, в организме которых вирус длительное время коэволюцинировал. Для них характерна строгая видоспецифичность, т.е. наличие у каждого генотипа или геноварианта лишь одного основного хозяина (вида или подвида), связанного с ним эволюционно, у которого хантавирусы вызывают хроническую бессимптомную инфекцию [89]. Хантавирусы с трудом адаптируются к размножению в организме лабораторных животных, а также в клеточных культурах, что вероятно объясняет более чем тридцатилетний период безуспешных попыток изолировать возбудитель ГЛПС, вирусная природа которого уже была доказана [90]. Лабораторная модель хантавирусной инфекции известна только для вируса Андес, это сирийские хомячки, у которых инфекция протекает летально и симптоматически напоминает течение этой инфекции у человека [91]. Размножение вирусов Хантаан и Сеул в лабораторных условиях поддерживают новорожденные 80 белые мыши, вирусов Пуумала и Син Номбр – сирийские хомячки и монгольские песчанки. Возможность использования клеточных культур для культивирования хантавирусов стала активно изучаться после успешной адаптации вируса Хантаан, изолированного на лабораторных мышах, к культуре клеток карциномы легких человека, А549, а в последствии в клетках Vero E6 [71]. В дальнейшем, для изучения различных свойств хантавирусов, в том числе патогенеза хантавирусных инфекций, а также при разработке инактивированных вакцин, были использованы как первичные клеточные культуры: клетки эндотелия, клетки почки, макрофаги человека [75,92,93], клетки почки монгольской песчанки, клетки почки золотистого хомячка [76], так и перевиваемые линии клеток, полученные из органов человека, в том числе опухолевого происхождения, а также почек обезьян и почек сирийского хомяка [74]. Несмотря на многочисленные исследования, подбор клеточной культуры, пригодной в качестве субстрата для производства вакцин против ГЛПС, остается одной из актуальных проблем. К настоящему времени инактивированные хантавирусные вакцины производятся в Китае, КНДР и Южной Корее на основе вирусов Хантаан и Сеул, но они не обладают защитным действием против вируса Пуумала – основного возбудителя ГЛПС у жителей европейской части России, на которую приходится более 98 % всей заболеваемости, регистрируемой в России. Трудности с разработкой культуральной вакцины против хантавируса 81 Пуумала связаны с ограниченным выбором чувствительных к размножению этого вируса клеточных культур и низким уровнем репродукции в них вируса. В поисках клеточной культуры пригодной для размножения патогенных хантавирусов, и, возможно, более чувствительной, чем предпринята Vero Е6, была адаптация штаммов вирусов Пуумала и Добрава/Белград к 4 перевиваемым культурам различного происхождения (почка эмбриона овцы, почка и селезенка зеленой мартышки, почка теленка) из коллекции культур клеток ИПВЭ им. М.П.Чумакова, а также к культуре VERO, рекомендуемой ВОЗ для производства вакцин. При подборе клеточных культур предпочтение было отдано гетероплоидным линиям клеток, так как они обладают высокой пролиферативной активностью, способны расти в промышленных биореакторах, хорошо сохраняются в жидком азоте. Впервые была установлена возможность адаптации хантавирусов Пуумала и Добрава/Белград, изолированных в культуре клеток Vero E6, к размножению в перевиваемых клетках почки овцы и почки теленка. Несмотря на то, что к 8 пассажу уровень размножения вирусов в этих культурах не достиг такового в клетках биологической Vero E6, факт репликации этих вирусов в новой системе открывает возможности дальнейшего изучения вопросов, связанных с преодолением видового барьера, вирусной трансмиссии и экологии хантавирусов. Эти результаты косвенно подтверждают факт неоднородности хантавирусной популяции, наличия в ней «квазивидов», 82 способных узнавать и связываться с лигандами (b3 интегрины) другой видовой специфичности. Кроме того, эти исследования показали бóльшую консервативность вируса Пуумала, сравнительно с вирусом Добрава/Белград, при адаптации к размножению в клеточной культуре, что согласуется с предыдущими наблюдениями о более низкой эффективности изоляции в культуре клеток хантавирусов, эволюционно связанных подсемейства Хомяковых (в том числе вирус Пуумала), с грызунами по сравнению с вирусами, ассоциированными с грызунами подсемейства Мышиных (Хантаан, Сеул и Добрава/Белград) [94]. Практическим выходом адаптации вирусов Пуумала и Добрава/Белград к культуре ПТ-1 было изготовление лаборатрной серии антигенов для МФА. Такие антигены позволяют, более точно отсекать ложноположительные результаты при контроле сывороток крови мышей, иммунизированных вакцинными препаратами, для которых субстратом размножения вирусов были клетки Vero E6 или VERO. В клеточных линиях, полученных из почки (4647) и селезенки (455) зеленой мартышки, репликация вирусов Пуумала и Добрава/Белград также не достигла уровня размножения в клетках Vero E6. Большие надежды возлагались на линию 4647, которая прекрасно зарекомендовала себя в отечественной вакцинологии: на ее основе успешно разработаны ряд вакцин, в том числе против гепатита А и бешенства [95], однако уровень размножения вирусов Пуумала и Добрава/Белград в среднем на 1,2 lg ФОЕ/мл был ниже в этой культуре, по сравнению с Vero E6. 83 Несомненно позитивный результат - это успешная адаптация вирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул к размножению в клетках VERO: после 3-4 пассажей культура поддерживала размножение хантавирусов Пуумала и Добрава/Белград на уровне пермиссивной клеточной культуры Vero E6. На модели вирусов ПУУ, ДОБ, ХТН и СЕУ были определены оптимальные условия, способствующие накоплению максимального вирусного урожая. Было установлено, что оптимальная МЗ, обеспечивающая стабильный урожай вируса на уровне ≥ 5,2 lg ФОЕ/мл на протяжении 6-7 суток при ежедневном сборе КЖ находится в диапазоне от 0,01 до 1 lg ФОЕ/мл. Большая или меньшая МЗ не позволяла добиться более высоких пиковых показателей накопления вируса в КЖ. Верхний предел размножения для вируса Пуумала составил 6,2 lg ФОЕ/мл; Добрава/Белград и Сеул – 6,5 lg ФОЕ/мл, вируса Хантаан – 7,2 lg ФОЕ/мл. Можно предположить, что размножение хантавирусов ограничено скоростью репликации вируса. С другой стороны, принимая во внимание стратегию вируса на сохранение клетки, ограничение может зависеть от возможности клеток обеспечить соответствующую скорость синтеза компонентов сборки вируса (РНК, белков) и созревания (отпачковывания) вирионов на клеточных мембранах, сохраняя жизнеспособность самой клетки. Вероятно, некое равновесие, достигаемое стабилизирует хроническую инфекцию клеток между этими процессами, хантвирусами. Об этом свидетельствует проведенный нами эксперимент длительного, в течение 57 суток, наблюдения за размножением вируса Пуумала в культуре Vero E6: через 12 суток 84 после заражения накопление вируса в среде снижалось и сохранялось до конца эксперимента в диапазоне 3,5 – 4,3 lg ФОЕ/мл. Процент зараженных клеток (98 ±2%), оставался неизменным на протяжении всего эксперимента и внешний вид культуры не отличался от контрольной. В общих чертах динамика вируса и антигена в хронически зараженной культуре повторяет динамику антигена в легких основного хозяина – рыжей полевки: в эксперименте у зараженных вирусом Пуумала полевок персистирование антигена регистрировалось на протяжении 14 месяцев (период наблюдения) [99]. В серии опытов было показано, что накопление внеклеточного вируса не зависит от таких факторов, как: способ заражения – на монослой или во взвесь клеток; увеличение продолжительности контакта с вирусом свыше 1 часа при 37 0С; использования инокулята в виде культуральной жидкости или в виде клеточного лизата. Важным результатом при подборе оптимальных условий сбора вирусного урожая явилась возможность использования бессывороточных сред в качестве среды поддержки. Было показано, что хантавирусы одинаково размножаются как в присутствии в среде поддержки 1-2 % сыворотки теленка или 0,25 % человеческого сывороточного альбумина, так и в отсутствии белковых компонентов среды. Обстоятельство не только удешевляющее производство вирусного вакцинного субстрата, но облегчающее последующие этапы очистки вируса от балластных белков. Следует отметить, что приступая к исследованиям по изучению особенностей размножения хантавирусов в клеточных культурах, нами была установлена 85 эффективность различных методов их индикации в культуре. Было показано, что наиболее чувствительным методом выявления хантавирусов в клеточных культурах является индикация внутриклеточного антигена методом непрямой иммунофлюоресценции и индикация вируса по ФОЕ. Это заключение позволило не только рационально спланировать основные эксперименты, но также явилось основанием для разработки методов (безопасности) определения остаточной инфекционности вакцинных препаратов. Для сравнения: РНК вируса Пуумала выявляется в клетках методом ОТ-ПЦР при наличии инфекционного вируса в титре ≥ 3,0 lg ФОЕ/мл, а в КЖ ≥ 3,5 lg ФОЕ/мл. Иммуноферментным методом хантавирусный антиген в КЖ определялся в 90% проб при титре вируса 3,1 – 4,0 lg ФОЕ/мл. В то же время размножение хантавирусов можно достоверно регистрировать МФА по накоплению внутриклеточного антигена, когда другими методами наличие вируса еще не определяется. Изоляция вируса была предпринята от 64 грызунов, отобранных по результатам иммунологического скрининга (МФА, ИФА) более чем 800 мелких млекопитающих, собранных на эндемичных по ГЛПС территориях юга Краснодарского края и в Тамбовской области. От 40 грызунов вирус выделяли параллельно в культурах 4647 и ПТ-1. Наши эксперименты показали, что наиболее пригодной для изоляции хантавирусов от природных носителей остается культура Vero E6. Только в этой культуре удалось изолировать 3 штамма, предварительно идентифицированные как вирус Добрава/Белград по результатам МФА. В результате иммунологической идентификации в РН 2 86 штамма, выделенные от полевых мышей в Тамбовской области, были идентифицированы как генотип ДОБ/Куркино. Штамм, изолированный от кавказской лесой мыши, идентифицирован как генотип ДОБ/Сочи. Эффективность выделения вируса составила: от кавказской лесной мыши – 8,3 % (1 из 12); от полевой мыши – 10,5 % (2 из 19). На территории Тамбовской области это первое выделение вируса, циркуляция которого ранее была установлена по результатам иммунотипирования сывороток крови полевых мышей и больных ГЛПС [100]. Вновь изолированные штаммы не отличались иммунологически от ранее выделенных (более 10 лет назад) штаммов Липецкая области) вирусов ДОБ/Куркино (Тульская, и ДОБ/Сочи по форме и размеру инфекционных фокусов в культурах VERO и Vero E6. Это наблюдение, как и отличия фокусов, образуемых вирусами СЕУ (крупные), ХТН (средние) и ПУУ (мелкие) в тех же культурах, позволяет предположить, что этот признак является одной из фенотипических характеристик хантавирусов. Похожие данные были получены McCaughey [77] в искусственно созданных условиях закисления среды до рН 6,2. На 7 сутки инкубации в этих условиях наблюдалось ЦПД в виде синцития, при этом вид его, от очень больших очагов (вирус СЕУ) до средних (вирус ХТН) и очень маленьких (вирус ПУУ) отражал таксономические различия хантавирусов [77]. Не удалось выделить вирус от кустарниковых полевок, несмотря на представительный материал исследований – биопробы от 34 зверьков. В то же время хантавирусная РНК была выделена из суспензии легочной ткани 12 полевок. Аналогичная ситуация складывалась с хантавирусом Хоккайдо, 87 основным хозяином которого является красно-серая полевка. На протяжении многих лет исследователям как в нашей стране, так и за рубежом, не удавалось выделить этот вирус, пока не была получена линия клеток из почки его природного хозяина - красно-серой полевки [97]. На основании анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей S, M, L сегментов РНК-изолятов из легочных суспензий кустарниковых полевок был выявлен новый вирус, получивший название Адлер по месту выделения первых РНКизолятов [96]. Предположительно неудача в изоляции вируса Адлер в культуре клеток может быть обусловлена низкой адаптационной способностью (высокой специфичностью по отношению к хозяину) этого хантавируса. Изучение морфологических характеристик вируса Пуумала в культуре Vero E6 привело нас к неожиданным результатам. Вирионы, наблюдаемые при исследовании ультратонких срезов зараженной культуры, имели гетерогенную форму (округлые и эллипсовидные) и разброс в размерах от 90 до 300 нм. Морфология хантавирусов впервые была описана для вируса Хантаан в 1982 году при негативном контрастировании вирусных частиц из вируссодержащей жидкости и лизата зараженных клеток, очищенных и сконцентрированных в градиенте плотности сахарозы [2,4], а также для вируса Пуумала, очищенного из суспензии легких спонтанно инфицированных рыжих полевок [3]. Три независимые группы авторов представили похожие описания вирионов, включая наличие шипиков на внешней оболочке и размеры вирионов от 90 до 120 нм, ставшие таксономическими характеристиками 88 рода Хантавирус. Позднее, методом крио-электронной микроскопии вируса Хантаан было подтверждено, что вирионы имеют сферическую форму, однако средний диаметр их был определен в диапазоне от 120 до 154 нм (в среднем 130 нм) [101]. Вариации в размере вирусных частиц при исследовании, в частности, ультратонких срезов зараженной культуры могут объясняться особенностями методического подхода - диаметр вируса существенно больше толщины среза, поэтому впервые размер вирусной частицы зависит от нами обнаружены вирионы плоскости среза. Однако хантавируса Пуумала вытянутой эллипсовидной формы с максимальным размером около 300 нм. Похожие результаты были получены при электронной криотомографии вируса Тула, непатогенного хантавируса наиболее близкородственного вирусу Пуумала [102]. Было показано, что размер и форма вирионов вируса Тула значительно варьировали, наблюдались сферические частицы размером 120-160 нм и продолговатые вытянутые частицы с диаметром 80 нм в поперечнике и максимальной длиной около 350 нм. Можно предположить, что наличие вирионов вытянутой формы, длина которых почти вдвое превышает ранее описанный средний диаметр хантавирусных вирионов [2,3,4,5,12,101,103], является уникальной особенностью, присущей, по крайней мере, двум близкородственным хантавирусам - Пуумала и Тула, адаптированным к размножению в культуре Vero E6. Морфологических отличий зараженной и не зараженной культуры клеток Vero E6 выявлено не было. 89 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате выполненного исследования получены новые данные, отражающие фундаментальные биологические свойства вирусов – возбудителей ГЛПС: установлены особенности их размножения в перевиваемых клеточных культурах, определены морфологические характеристики вируса Пуумала, адаптированного к размножению в культуре Vero Е6, имеющие существенное отличие от ранее установленных размера и формы вирионов этого вируса. Решены практические вопросы, касающиеся оптимизации условий получения активного вирусного субстрата для цельновирионных инактивированных вакцин против ГЛПС и выбора методов контроля остаточной инфекционности (безопасности) вакцинного препарата. Результаты этих исследований использованы при создании лабораторных серий вакцины против ГЛПС, а также при составлении научно-технической документации на вакцину. Изолированы от природных носителей и депонированы в Государственную коллекцию вирусов новые штаммы, представляющие генотипы вируса Добрава/Белград: ДОБ/Сочи и ДОБ/Куркино. 90 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что культура VERO, сертифицированная для производства вакцин, поддерживает размножение вирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул на уровне наиболее пермиссивной культуры Vero E6 и может использоваться в качестве субстрата при изготовлении вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). 2. Определены закономерности размножения вирусов-возбудителей ГЛПС в пермиссивных клеточных культурах, оптимизированы условия получения вирусного субстрата для вакцинных препаратов. Показано, что использование без сывороточной среды и оптимальной множественности заражения клеток позволяет стабильно получать высокий урожай вируса, а также существенно облегчит дальнейшие этапы концентрирования и очистки полуфабрикатов вакцин. 3. Впервые показана возможность репликации штаммов вирусов Пуумала и Добрава/Белград в не свойственной им биологической системе - перевиваемых клетках, полученных из почки овцы и почки теленка, что открывает возможность дальнейшего изучения вопросов изменчивости хантавирусов, связанных с преодолением видового барьера. 4. В культуре Vero E6 от полевых мышей и кавказской лесной мыши изолированы штаммы вируса Добрава/Белград, идентифицированные как генотипы ДОБ/Куркино и ДОБ/Сочи соответственно. Штаммы генотипов ДОБ/Куркино и ДОБ/Сочи имели различия по очертаниям и размеру фокусов при размножении в культурах Vero и Vero E6, как и штаммы вирусов Пуумала, 91 Хантаан и Сеул, что позволяет рассматривать эти характеристики фокусов как отличительный фенотипический признак. 5. Впервые показано, что вирионы вируса Пуумала, адаптированного к размножению в культуре клеток, по форме и размерам значительно отличаются от хантавирусов, но аналогичных характеристик других патогенных имеют сходство с морфологией близкородственного непатогенного вируса Тула. Морфологических отличий зараженной и незараженной культуры клеток Vero E6 не выявлено. 92 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ткаченко Е.А. Актуальные проблемы современного этапа изучения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России / Е.А. Ткаченко, А.Д. Бернштейн, Т.К. Дзагурова, В.Г. Морозов, Р.А. Слонова, Л.И. Иванов, Д.В. Транквилевский, Д. Крюгер // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2013. – №1. – С. 51-58. 2. White J.D. Hantaan virus, aetiological agent of Korean haemorrhagic fever, has Bunyaviridae-like morphology / J.D. White, F.G. Shirey, G.R. French, J.W. Huggins, O.M. Brand, H.W. Lee //The Lancet. – 1982. – P. 768-771. 3. Donets M.A. Taxonomic features of causative agent of haemorrhagic fever with renal syndrome / M.A. Donets, G.V. Rezapkin, M.B. Korolev, EA.Tkachenko //The Lancet. -1982. – P. 794-795. 4. McCormick J.B. Morphological identification of the agent of Korean haemorrhagic fever (Hantaan virus) as a member of the Bunyaviridae / J.B. McCormick, D.R. Sasso, E.L. Palmer, M.P. Kiley // The Lancet. -1982.- Vol. 1. P. 765-768; 5. Королев М.Б. Морфология и морфогенез вируса ГЛПС в клеточной культуре / М.Б. Королев Е.А. Ткаченко, Т.К. Дзагурова // Актуальные проблемы медицинской вирусологии. – 1985. – C. 143-144. 6. Schmaljohn C. Characterization of Hantaan virions, the prototype virus of hemorrhagic fever with renal syndrome. / C. Schmaljohn S. Hasty, S. A. Harrison, J.M. Dalrymple // The Journal of infectious diseases. – 1983. - Vol.148. – P. 1005-1012. 7. Schmaljohn C. Coding strategy of the Sgenome segment of Hantaan virus / C. Schmaljohn, G. Jennings, J. Hay, J.M. Dalrymple // Virology. – 1986. – Vol. 155. – P. 633-643. 93 8. Schmaljohn C. Hantaan virus mRNA: coding strategy, nucleotide sequence, and gene order / C. Schmaljohn, A. Schmaljohn, J. Dalrymple // Virology. – 1987. – Vol. 157. – P. 31-39. 9. Schmaljohn C. Nucleotide sequence of the L genome segment of Hantaan virus / C. Schmaljohn // Nucleic Acids Research. – 1990. – Vol. 18. – P. 6728. 10. Gavrilovskaya I.N. beta3 Integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure / I.N. Gavrilovskaya, M. Shepley, R. Shaw, M.H. Ginsberg, and E.R. Mackow // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. - 1998. No. 95(12). - P. 7074-7079. 11. Gavrilovskaya I.N. Cellular entry of hantaviruses which cause hemorrhagic fever with renal syndrome is mediated by beta3 integrins / I.N. Gavrilovskaya, E.J. Brown, M.H. Ginsberg, and E.R. Mackow // Journal of Virology. - 1999. No.73(5). - P. 3951-3959. 12. Goldsmith C.S. Ultrastructural characteristics of Sin Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome / C.S. Goldsmith , L.H. Elliott , C.J. Peters , S.R. Zaki // Archives of Virology. - 1995. - No. 140(12). - P. 2107-2122; 13. Jin M. Hantaan virus enters cells by clathrin-dependent receptor-mediated endocytosis / M. Jin, J. Park, S. Lee, B. Park, J. Shin, K.J. Song, T.I. Ahn, S.Y. Hwang, B.Y. Ahn, K. Ahn // Virology. – 2002. – Vol. 294. - P. 60-69. 14. Mackow E.R. Cellular receptors and hantavirus pathogenesis. / E.R. Mackow and I.N. Gavrilovskaya // Current topics in microbiology and immunology . - 2001. No. 256. - P. 91-115. 15. Kolakofsky D. Bunyavirus RNA syntesis: genome transcription and replication / D. Kolakofsky D. Hacker // Current topics in microbiology and immunology . – 1991. – Vol. 169. – P. 143-159. 16. Garcin D. The 5'-ends of Hantaan virus (Buniaviridae) RNAs suggest a primeand-realign mechanism for the initiation of RNA synthesis / D. Garcin, M. Lezzi, 94 M. Dobbs, R.M. Elliot, C. Schmaljiohn, C.Y. Kang, D. Kolakofsky // Journal of Virology. - 1995. - Vol. 69. - P. 5754-5762 17. Lober C. The Hantaan virus glycoprotein precursor is cleaved at the conserved pentapeptide WAASA / C. Lober, B. Anheier, S. Lindow, H.D. Klenk, H. Feldmann // Virology. - 2001. - Vol. 289. - P. 224-229. 18. Ruusala A. Coexpression of the membrane glycoproteins G1 and G2 of Hantaan virus is required for targeting to the Golgi complex / A. Ruusala, R. Persson, C. Schmaljohn, R.Pettersson // Virology. – 1992. – Vol. 186. – P. 53-64. 19. Spiropoulou C. Sin Nombre virus glycoprotein trafficking / C. Spiropoulou, C. Goldsmith, T. Shoemaker // Virology. – 2003. – Vol. 308. – P. 48-63 20. Pensiero M. The Hantaan virus M-segment glycoproteins G1 and G2 can be expressed independently / M. Pensiero, J. Hay // Journal of Virology. – 1992. – Vol. 66. – P. 1907-1914. 21. Pettersson R. Protein localization and virus assembly at intracellular membranes / R. Pettersson // Current topics in microbiology and immunology . – 1991. –Vol. 170. – P. 67-106. 22. Song K. Molecular phylogeny of Hantaan virus, the prototype virus of HFRS / K. Song, S. Kim, Y. Choi etal. // 3rd Internftional Conference on HFRS and Hantaviruses. – Helsinki. – 1995. – P. 48. 23. Plyusnin A. Sequences of wild Puumala virus genes show a correlation of genetic variation with geographic origin of the strains / A. Plyusnin, O. Vapalahti, K. Ulfves // Journal of General Virolgy. – 1994. Vol. 75. – P. 405-409. 24. Khaiboulina S. Genetic variability and natural reassortment of the Puumala hantavirus in Bashkiria, Russia / S. Khaiboulina, S. Jeor, S. Morzunov // 10th Internftional Conference on negative strand viruses. – Dublin. – 1997. – P.155. 95 25. Klempa B. Genetic interaction between distinct Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus agrarius and A. flavicollis in nature / B. Klempa, H. Schmidt, R. Ulrich // Journal of Virology. - 2003. – Vol. 77. – P. 804-809. 26. Ebihara H. Pathogenicity of Hantaan virus in newborn mice: genetic reassortant study demonstrating that a single amino acid change in glycoprotein G1 is related to virulence / H. Ebihara, K. Yoshumatsu, M. Oginoeta // Journal Virology. - 2000. - Vol. 74. - P. 9245. 27. Handke W. Generation and characterization of genetic reassortants between Puumala and Prospect Hill hantavirus in vitro / W. Handke, R. Oelschlegel, R. Franke, L. Wiedemann, D.H. Krüger, A. Rang // Journal of General Virolgy. 2010. - Vol. 9. - P. 2351-2359. 28. Plyusnin A.Quasispecies in wild-type tula hantavirus populations / A. Plyusnin, Y. Cheng, H. Lehvaslaiho, A. Vaheri // Journal Virology. – 1996. – Vol. 70. – P. 9060-9063. 29. Razzauti M. Microevolution of Puumala hantavirus during a complete population cycle of its host, the bank vole (Myodes glareolus) / M. Razzauti , A. Plyusnina, H. Henttonen, A. Plyusnin // Public Library of Science. - 2013. No. 8(5). 30. Razzauti M. Accumulation of point mutations and reassortment of genomic RNA segments are involved in the microevolution of Puumala hantavirus in a bank vole (Myodes glareolus) population / M. Razzauti , A. Plyusnina, H. Henttonen, A. Plyusnin // Journal of General Virology. -2008. - Vol. 89. - P. 1649-1660. 31. Lundkvist Å. Cell culture adaptation of Puumala hantavirus changes the infectivity for its natural reservoir, Clethrionomys glareolus, and leads to accumulation of mutants with altered genomic RNA S segment / Å. Lundkvist, Y. Cheng, K.B. Sjölander, B. Niklasson, A. Vaheri, and A. Plyusnin // Journal of Virology. - 1997. - Vol. 71(12). - P. 9515-9523. 96 32. Arikawa J. Protective role of antigenic sites on the envelope protein of Hantaan virus defined by monoclonal antibodies / J. Arikawa, J.S. Yao, K. Yoshimatsu, I. Takashima, and N. Hashimoto // Archives of Virology. - 1992. - Vol. 126(1-4). - P. 271-281. 33. Koch J. Human recombinant neutralizing antibodies against hantaan virus G2 protein / J. Koch, M. Liang, I. Queitsch, A.A. Kraus, and E.K. Bautz // Virology. 2003. -Vol. 308(1). - P. 64-73 34. Liang M. Generation of an HFRS patient-derived neutralizing recombinant antibody to Hantaan virus G1 protein and definition of the neutralizing domain / M. Liang, M. Mahler, J. Koch, Y. Ji, D. Li, C. Schmaljohn, and E.K. Bautz // Journal of medical virology. - 2003. - Vol. 69(1). - P. 99-107. 35. Van der Groen G. Characterization of Hantaviruses using monoclonal antibodies / G. Van der Groen, K. Yamanishi, J. McCormick, G. Lloyd, EA. Tkachenko // Acta Virologica. - 1987. - Vol. 31(6). - P. 499-503. 36. Sugiyama K. Four serotypes of haemorrhagic fever with renal syndrome viruses identified by polyclonal and monoclonal antibodies / K. Sugiyama, S. Morikawa, Y. Matsuura, E.A. Tkachenko, C. Morita, T. Komatsu, Y. Akao, T. Kitamura // Journal of General Virolgy. - 1987. - Vol. 68. - P. 979-987. 37. Lundkvist A. Antigenic variation of European haemorrhagic fever with renal syndrome virus strains characterized using bank vole monoclonal antibodies / A. Lundkvist, A. Fatouros, B. Niklasson // Journal of General Virolgy. - 1991. - Vol. 72. - P. 2097-2103. 38. Dzagurova T. Antigenic relationships of Hantavirus strains analysed by monoclonal antibodies / T. Dzagurova, E. Tkachenko, R. Slonova // Archives of Virology. – 1995. - Vol. 140 – P. 1763-1773. 97 39. Elliot R. 7th report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Bunyaviridae / R. Elliot, M. Bouloy, C. Calisher // Academic Press. – 2000. – P. 599-621. 40. Lee H.W. Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever / H.W. Lee, P.W. Lee // Journal of Infectious Diseases. - 1978. - Vol. 137. - P. 298-308. 41. Tkachenko E.A. Isolation in Vero E6 cells of Hantavirus from Cl. glareolus captured in the Bashkiria area of the USSR / E.A. Tkachenko, V.N. Bashkirtsev, G. VanderGroen // Ann. Soc. Belge Med. trop. - 1984. - Vol. 64. - P. 425-426. 42. Слонова Р.А. Выделение штаммов вируса ГЛПС на культуре клеток от больных людей и грызунов / Р.А. Слонова, Т.И. Астахова, Е.А. Ткаченко, Т.К. Дзагурова // Вопросы вирусологии. - 1986. - Н. 2. - P. 180-183. 43. Дзагурова Т.К. Эффективность применения культуральных антигенов для серодиагностики ГЛПС с помощью метода иммунофлюоресценции / Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко, В.А. Петров // Вопросы вирусологии. - 1988. - Н. 1. - С. 71-75 44. Ivanov A.P. Enzyme immuno assay for the detection of virus specific Ig G and Ig M antibody in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / A.P. Ivanov, E.A. Tkachenko, V.A. Petrov, A.J. Pashkov, T.K. Dzagurova, T.P. Vladimirova, G.M. Voronkova, and G. VanderGroen. Archives of Virology. - 1988. - Vol. 100. - P. 1-7. 45. Zoller L.G. A novel L-capture enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant proteins for sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome / L.G. Zoller , S. Yang, P. Got, E. K. F. Bautz, G. Darai // Journal of Clinical Microbiology. - 1993. - Vol. 31. - No. 5. - P. 1194-1199. 46. Sjolander K. B. Diagnostic potential of Puumala virus nucleocapsid protein expressed in Drosophila melanogaster cells / K.B. Sjolander, I. Golovljova, A. 98 Plyusnin, Å. Lundkvist // Journal of Clinical Microbiology. - 2000. - Vol. 38. No. 6. - P. 2324–2329. 47. Araki K. Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyping Hantaan, Seoul, and Dobrava Hantavirus infections / K. Araki, K. Yoshimatsu, M. Ogino, H. Ebihara, A. Lundkvist, H.Kariwa, I.Takashima, J.Arikawa.. Journal of Clinical Microbiology. - 2001. - Vol. 39. - No. 7. - P. 2397–2404. 48. Meisel H. Development of novel immunoglobulin G (IgG), IgA, and IgM enzyme immunoassays based on recombinant Puumala and Dobrava hantavirus nucleocapsid proteins / H. Meisel, A. Wolbert, A. Razanskiene, A. Marg, A. Kazaks, K. Sasnauskas, G. Pauli, R. Ulrich, D. H. Kruger // Clinical And Vaccine Immunology. - 2006. - Vol. 13. - No. 12. - P. 1349–1357. 49. Kallio-Kokko H. Evaluation of Puumala virus IgG and IgM enzyme immunoassays based on recombinant baculovirus-expressed nucleocapsid protein for early nephropathiaepidemica diagnosis / H. Kallio-Kokko, O. Vapalahti, Å. Lundkvist, and A. Vaheri,. Clin. Diagn // Virology - 1998. - Vol. 10(1). - P. 83-90. 50. Tkachenko E.A. Immunosorbent assay for diagnosis of HFRS / E.A. Tkachenko, A.P. Ivanov, T.K. Dzagurova, M.A. Donets, G.V. Rezapkin, E.V. Leshchinskaya, I.M. Zagidullin, A.A. Ivanova, N.M. Mustafin, T.I. Savinova // The Lancet. – 1981. – Vol. 2. - P. 257-258. 51. Klempa B. Hemorrhagic fever with renal syndrome caused by two distinct lineages of Dobrava hantavirus emerging in Russia / B. Klempa, E. Tkachenko, T. Dzagurova, Yu. Yunicheva, V. Morozov, N. Okulova, G. Slyusareva, A. Smirnov, D. Kruger // Emerging Infectious Diseases Journal. – 2008. - Vol.14. – No.4. - P. 617-625. 52. Иванов Л.И. Клинико-иммунологическая характеристика заболеваемости ГЛПС в Хабаровском крае / Л.И. Иванов, Е.А. Ткаченко, Н.И. Здановская, Т.К. Дзагурова, А. Г. Ковальский, В. И. Резник // Вопросы вирусологии. 1990. - Вып. 1. - С. 74-76. 99 53. Морозов В.Г. Концентрация специфических иммуноглобулинов класса М в сыворотке крови больных ГЛПС в зависимости от сроков и характера течения болезни / В.Г. Морозов, А.П. Иванов, А.Е. Деконенко, Т.К. Дзагурова, В.И. Рощупкин, Е.А. Ткаченко // Дальневосточный медицинский журнал. - 2003. - H. 3. - С. 107. 54. Иванов А.П. Поликлональная иммуноферментная система для определения антигенов хантавирусов: оценка специфичности с помощью моноклональных антител и полимеразной цепной реакции / А.П. Иванов, А.Е. Деконенко, Т.М. Шуткова, Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко // Вопросы вирусологии. – 1996. - H. 3. - С. 110-112. 55. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П. Иванов, Т.К. Дзагурова, А.Е. Деконенко, П.М. Барановский, В.И. Шервали, Е.А. Ткаченко // Вопросы вирусологии. – 1996. – H. 6. - С. 263-265. 56. Araki K. Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyping Hantaan, Seoul, and Dobrava hantavirus infections / K. Araki, K. Yoshimatsu, M. Ogino, H. Ebihara, A. Lundkvist, H. Kariwa, I. Takashima, J. Arikawa // Journal of Clinical Microbiology. – 2001. – Vol. 39 No. 7. – P. 397-404. 57. Hujakka H. Comparison of a new immunochromatographic rapid test with a commercial EIA for the detection of Puumala virus specific IgM antibodies / H. Hujakka, V. Koistinen, P. Eerikainen, I. Kuronen, A. Laatikainen, J. Kauppinen, A. Vaheri, O. Vapalahti, A. Narvanen // Journal of Clinical Virology. – Vol. 23. – P. 79–85. 58. Hujakka H. Diagnostic rapid tests for acute hantavirus infections: specific tests for Hantaan, Dobrava and Puumala viruses versus a hantavirus combination test / H. Hujakka, V. Koistinen, I. Kuronen, P. Eerikainen, M. Parviainen, A. Lundkvist, A. 100 Vaheri, O. Vapalahti, A. Narvanen // Journal of Virological Methods. – Vol. 108. P. 117-122. 59. Tanishita O. Evaluation of focus reduction neutralization test withper oxidase– antiperoxidase staining technique for hemorrhagic fever with renal syndrome virus O. Tanishita, Y. Takahashi, Y. Okuno, K. Yamanishi, and M. Takahashi // Journal of Clinical Microbiology. - 1984. – Vol. 20(6). - P. 1213-1215. 60. Lee P.W. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests / P.W.Lee, C.J. Gibbs, C. Gajdusek, R. Yanagihara // Journal of Clinical Microbiology. – 1985. – Vol. 22. No. 6. - P. 940-944. 61. Niklasson B. Comparison of European isolates of viruses causing hemorrhagic fever with renal syndrome by a neutralization test / B. Niklasson, M. Jonsson, Å. Lundkvist, J. Hörling, and E. Tkachenko // The Journal of tropical medicine and hygiene. - 1991. – Vol.45(6). - P. 660-665. 62. Heider H. A chemiluminescence detection method of hantaviral antigens in neutralisation assays and inhibitor studies / H. Heider, B. Ziaja, C. Priemer, Å. Lundkvist, J. Neyts, D.H. Krüger, and R. Ulrich // Journal of Virological Methods. – 2001. - Vol. 96(1). - P. 17-23. 63. Tsai T.F. Hemagglutination-inhibiting antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome / T.F. Tsai, Y.W. Tang, S.L. Hu, K.L. Ye, G.L. Chen, and Z.Y. Xu // Journal of Infectious Diseases - 1984. – Vol. 150(6). - P. 895-898. 64.Tang Y.W. Distribution of hantavirus serotypes Hantaan and Seoul causing hemorrhagic fever with renal syndrome and identification by hemagglutination inhibition assay / Y.W. Tang, Y.L. Li, K.L. Ye, Z.Y. Xu, S.L. Ruo, S.P. FisherHoch, and J.B. McCormick // Journal of Clinical Microbiology. - 1991. - Vol. 29(9) - P. 1924-1927. 101 65. Гайдамович С.Я. Реакция непрямой гемагглютинации для индикации вируса ГЛПС и лабораторной диагностики заболеваний / С.Я. Гайдамович, Г.А. Клисенко, Т.К. Дзагурова // Ж. Вопросы вирусологии. – 1984. 66. Sugiyama K. An immune adherence assay for discrimination between etiologic agents of hemorrhagic fever with renal syndrome / K. Sugiyama, Y. Matsuura, C. Morita, S. Shiga, Y. Akao, T. Komatsu, and T. Kitamura // Journal of Infectious Diseases . - 1984. – Vol. 149(1). - P. 67-73. 67. Gresikova M. A simple method of preparing a complement-fixing antigen from the virus of haemorrhagic fever with renal syndrome (Western type) / M. Gresikova, and M. Sekeyova // Acta Virologica. - 1988. – Vol. 32(3). - P. 272-274. 68. Horling J. Detection and subsequent sequencing of Puumala virus from human specimens by PCR / J. Horling A. Lundkvist, K. Persson, M. Mullart, T. Dzagurova, A. Dekonenko, E. Tkachenko, B. Niklasson // Journal of Clinical Microbiology. – 1995. - Vol. 33. - No. 2. - P. 277-282. 69. Морозов В.Г. Генетическая идентификация хантавирусов в крови больных ГЛПС // В.Г. Морозов, С.П. Морзунов, С.Ф. Хайбулина, В.И. Рощупкин, Т.К. Дзагурова, А.П. Иванов, Е.А. Ткаченко // Эпидемиология и иинфекционные болезни – 2004. № 2. - С. 43-47. 70. Dzagurova T.K. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia / T.K. Dzagurova, B. Klempa, E.A. Tkachenko, G.P. Slusareva, V.G. Morozov, B. Auste, D.H. Kruger // Journal of Clinical Microbiology. -2009. - Vol. 47. - No.12. - P. 40294036. 71. French G.R. Korean hemorrhagic fever: propagation of the etiologic agent in a cell line of human origin / G.R. French, R.S.Foulke, O.A. Brand, G.A. Eddy, H.W. Lee, and P.W. Lee //Science. - 1981. - Vol. 211(4486). - P. 1046-108. 102 72. Niklasson B. Isolation of the nephropathiaepidemica agent in Sweden / B. Niklasson and J. Le Duc // Lancet. - 1984. - P. 1012-1013. 73. Yanagihara R. Propagation of nephropathiaepidemica virus in cell culture / R. Yanagihara, D. Goldgaber, P.W. Lee, H.L. Amyx, D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs, Jr., and A. Svedmyr // Lancet. - 1984. - P. 101. 74. Temonen M. Susceptibility of human cells to Puumala virus infection / M. Temonen, O. Vapalahti, H. Holthofer, M. Brummer-Korvenkontio, A.Vaheri and H. Lankinen // Journal of General Virology. - 1993. - Vol. 74. - P. 515-518. 75. Pensiero M.N. Hantaan Virus Infection of Human Endothelial Cells / M.N. Pensiero, J. B. Sharefkin, C.W. Dieffenbach, J. Hay // Journal of Virology. – 1992. - Vol. 66. - No. 10. - P. 5929-5936. 76. Song G. Preliminary human trial of inactivated golden hamster kidney cell vaccine against HFRS / G. Song, Y.C. Huang, C.S. Hang // Vaccine. - 1992. - Vol. 10. – P. 214-216. 77. McCaughey C. Low pH-induced cytopathic effect - a survey of seven hantavirus strains / C. McCaughey, X. Shi, R.M. Elliot, D.E. Wyatt, H.J. O'Neill, P.V. Coyle // Journal of Virological Methods. – 1999. - Vol. 81. – P. 193-197. 78. Nemirov K. Adaptation of Puumala hantavirus to cell culture is associated with point mutations in the coding region of the L segment and in the noncoding regions of the S segment / K. Nemirov, A. Lundkvist, A. Vaheri,. A. Plyusnin // Journal of Virology. – 2003. - Vol. 77. - No. 16. - P. 8793–8800. 79. Desmyter J. Defectiveness of Interferon Production and of Rubella Virus Interference in a Line of African Green Monkey Kidney Cells (Vero) / J. Desmyter, J.L. Melnick, W.E. Rawls // Journal of Virology. - 1968. - Vol. 2. No.10. - P. 955–61. 80. Миронова Л.Л. Способ культивирования вирсов / Л.Л. Миронова, В.П. Грачев, Н.В. Кузнецова, В.Д. Попова // Патент РФ 770195. - 1993. 103 81. Миронова Л.Л. Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, используемой для культивирования вирусов / Л.Л. Миронова, Ю.Х. Хапчаев, В.Д. Попова // Патент РФ № 984214. - 1993. 82. Конюшко О.И. Штамм культивируемых клеток почки эмбриона овцы для размножения вирусов / О.И. Конюшко, Л.Л. Миронова, В.Д. Попова // Патент № 1559700. - 1993. 83. Миронова Л.Л. Штамм гетероплоидных клеток почки теленка Таурус-1, используемый для культивирования вирусов / Л.Л. Миронова, Н.К. Преображенская, Г.С. Шитикова // Патент РФ № 1347448. - 1993. 84. Миронова Л.Л. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике / Л.Л.Миронова, В.Д.Попова, О.И. Конюшко, Ю.Х. Хапчаев, А.С.Акопян // Биотехнология. - 2000. - H. 6. C. 41-47. 85. Дзагурова T.К. Разработка иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом / T.К.Дзагурова, О.Н. Солопова, П.Г. Свешников, Н.А. Коротина, М.В. Баловнева, О.А. Леонович, Н.Е. Варламов, Г.А. Малкин, С.Е. Соцкова, Е.А.Ткаченко // Вопросы вирусологии. – 2013. H. 1. - С. 40-44. 86. Дзагурова Т.К. Выделение и идентификация штаммов хантавирусоввозбудителей ГЛПС в европейской части России / Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко, В.Н. Башкирцев // Медицинская вирусология. -2008. Том XXV. С. 142-150. 87. Гублер Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Гублер Е.В., Генкин А.А. // Медицина. - 1973. 104 88. Geimonen E. Pathogenic and nonpathogenic hantaviruses differentially regulate endothelial cell responses / E. Geimonen, S.Neff, T. Raymond, S.S. Kocer, I. N. Gavrilovskaya, E.R. Mackow // Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. - 2002. - Vol. 99(21). - P. 13837–13842. 89. Бернштейн А.Д. Особенности природной очаговости хантавирусных зоонозов / А.Д.Бернштейн, И.Н.Гавриловская, Н.С.Апекина, Т.К.Дзагурова, Е.А.Ткаченко // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2010. -№2. - С. 513. 90. Смородинцев А.А. Этиология и клиника геморрагического нефрозо-нефрита / А.А.Смородинцев, И.С. Альтшуллер, М.И. Дунаевский, Л.И. Казбинцев // ВИЭМ. – 1944. 91. Hooper J. A lethal disease model for hantavirus pulmonary syndrome / J. Hooper, T. Larsen, D. Custer, C. Schmaljohn // Virology. – 2001. - Vol. 289. - P. 6-14. 92. Yanagihara R. Experimental infection of human vascular endothelial cells by pathogenic and nonpathogenic hantaviruses / R. Yanagihara, D.J. Silverman // Archives of Virology. - 1990. - Vol. 111. - P. 281 -286. 93. Nagai T. Isolation of haemorrhagic fever with renal syndrome virus from leukocytes of rats and virus replication in cultures of rat and human macrophages / T. Nagai, O. Tanishita, Y. Takahashi // Journal of General Virology. - 1985. - Vol. 66. - P. 1271 -1278. 94. Иванов Л.И. Адаптационная способность хантавирусов при изоляции на культуре клеток VERO-E6 в зависимости от вида экологического хозяина / Л.И. Иванов, Н.И. Здановская, Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. − 2000. − № 4. − С. 22-25. 95. Миронова Л.Л. Разные аспекты применения культур клеток в вакцинологии / Л.Л. Миронова // Фундаментальные исследования. - 2009. № 9. - C. 60-62. 105 96. Klempa B. Novel hantavirus identified in Major's pine voles (Microtus majori) in southern European Russia / B. Klempa, P.T. Witkowski, L. Radosa, E. A. Tkachenko, T. K. Dzagurova, N. M. Okulova, Y. V. Yunicheva, V.G. Morozov, G. A. Malkin, D.H. Krüger // Abstract book. IX Internternayional Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses.- 2013. - P. 65. 97. Sanada T. Isolation of Hokkaido virus, genus Hantavirus, using a newly established cell line derived from the kidney of the grey red-backed vole (Myodes rufocanus bedfordiae) / T. Sanada, T. Seto, Y. Ozaki, N. Saasa, K. Yoshimatsu, J. Arikawa, K. Yoshii, H. Kariwa // Journal of General Virology. - 2012. Vol. 93. - P. 2237–2246. 98. Окулова Н.М. Пространственная структура природных очагов хантавирусов на территории Северо-Западного Кавказа / Н.М. Окулова, Л.А. Хляп, А.А. Варшавский, Т.К. Дзагурова, Ю.В. Юничева, Т.Е.Рябова, М.И. Баскевич, Л.Е. Василенко, Е.А. Ткаченко // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. - 2013. № 5. - С. 47 — 53. 99. Апекина Н.С. Варианты иммунореактивности и течения инфекции у рыжей полёвки (Myodesglareolus) при экспериментальном заражении хантавирусам Puumala (PUUV) / Н.С. Апекина, А.Д. Бернштейн, В.Т. Дёмина, И.Н. Гавриловская // Вопросы вирусологии. - 2014. Том 59. № 4. - С. 42-46. 100. Мутных Е. С. Эпидемические, эпизоотологические и этиологические особенности вспышки геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Тамбовской области в 2006-2007 гг / Е. С. Мутных, Т. К. Дзагурова, А. Д. Бернштейн, Е. В. Калинкина, Н. А. Коротина, Н. С. Апекина, С. Е. Соцкова, Г. А. Толстова, А. П. Суворин, Е. А.Ткаченко // Вопросы вирусологии. 2011. № 6. - С. 41-47. 101. A. J. Battisti. Structural Studies of Hantaan Virus /A. J. Battisti,.Y-K. Chu, P. R. Chipman, B.Kaufmann, C.B. Jonsson, M.G. Rossmann // Journal of Virology.2011. - Vol. 85. - No. 2. - P. 835–841. 106 102. Huiskonen J.T. Electron Cryotomography of Tula Hantavirus Suggests a Unique Assembly Paradigm for Enveloped Viruses/ J.T. Huiskonen, J.Hepojoki, P.Laurinmaki, A. Vaheri, H.Lankinen, S. J. Butcher, K.Grunewald // Journal of Virology.-2010.- Vol.24. – No.10.- P. 4889–4897. 103. Ravkov E.V.Polarized entry and release in epithelial cells of Black Creek Canal virus, a New World Hantavirus / E.V.Ravkov, S.T.Nichol, RW.Compans// Journal of Virology.-1997.-Vol. 71.- No. 2.- P. 1147–1154. 104. Tkachenko E.A. Current Status of Hantavirus Vaccines Development / E.A.Tkachenko, T.K.Dzagurova, P.E. Tkachenko// in book Novel Technologies for Vaccine Development, edited by I.S.Lukashevich and H.Shirwan, Springer.2014.- Сh. 5.- P. 113-151. 107