ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ
advertisement
ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВЫХ РАСТЕНИЙ им. И. В. МИЧУРИНА На правах рукописи Ван-Ункан Надежда Юрьевна РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ ИЗ ЭКСПЛАНТОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАН Н.И. Савельев Мичуринск-наукоград РФ 2014 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………..4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………7 1.1. Использование методов культуры in vitro органов и тканей для селекционно-генетических целей……………………….. 7 1.2. Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур…...………13 1.3. Влияние ряда факторов на андрогенез in vitro………....……….14 1.3.1.Влияние генотипа…………………………….…………………15 1.3.2. Стадии развития пыльцы и влияние состава питательных сред..............................................................................................16 1.4. Культура in vitro листовых эксплантов…………………............25 1.5. Клональное микроразмножение растений……………………...27 1.6. Методы адаптации пробирочных растений к нестерильным почвенным условиям…………………………………….........34 1.6. Биологические особенности колонновидных форм яблони…...37 ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ, ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………………………..41 2.1. Цель и задачи исследования…………………………………….41 2.2. Материалы и методы исследования……………………………..42 ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO ПЫЛЬНИКОВ ЯБЛОНИ…………… 48 3.1. Генотип растений-доноров ……….…………………………….48 3.2. Влияние условий формирования пыльников in vivo донорных растений яблони на индукцию андрогенеза in vitro……………………………………………………………………..50 3.3. Стадии развития пыльцы ………………………………….……54 3.4. Инфицированность пыльников 2 яблони в условиях in vitro………………………………………………………………...57 3.5. Холодовая предобработка пыльников ………………………..60 3.6. Подбор питательных сред для индукции каллусогенеза..........62 3.7. Морфологические особенности андрогенных каллусов……..68 ГЛАВА 4. ИНДУКЦИЯ ПРОЦЕССОВ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ ЯБЛОНИ………………………………….72 4.2 Разработка приемов стерилизации листовых эксплантов и введение их в культуру……………………………………………72 4.3. Индукция каллусо- и морфогенеза у различных генотипов яблони………………………………………………………………75. ГЛАВА 5. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ….......81 5.1. Возраст и состояние маточных растений, сроки изоляции, размер инициальных эксплантов ……………………………82 5.2. Введение в культуру in vitro апикальных меристем………….85 ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ПРИЕМОВ РАЗМНОЖЕНИЯ ПОБЕГОВРЕГЕНЕРАНТОВ КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ IN VITRO……………………………………………………………………89 6.1. Собственно микроразмножение…………………………….....89 ГЛАВА 7. УКОРЕНЕНИЕ МИКРОПОБЕГОВ IN VITRO КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ …………………………………93 7.1. Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта...…97 ГЛАВА 8. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИ-ВАНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ………………………………………………..102 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………….…107 3 ВВЕДЕНИЕ В селекционно-генетических исследованиях, проводимых в настоящее время с плодовыми и ягодными растениями, все шире применятся современные биотехнологические методы и приемы, в том числе и такие, как культура in vitro изолированных пыльников, листовых эксплантов, меристем. Их использование позволяет успешнее решать многие как фундаментальные, так и прикладные задачи. Культура изолированных пыльников (метод андрогенеза in vitro) является самым быстрым и эффективным методом получения гаплоидных, а на их основе гомозиготных растений. Использование таких растений в селекционно-генетической практике ускоряет процесс получения новых сортов, повышает эффективность генетических исследований, расширяет существующий генофонд. Это показано на ряде овощных и зерновых культур, у которых с использованием метода культуры пыльников уже получены новые высокоэффективные сорта. Однако у плодовых культур, в частности яблони, метод андрогенеза in vitro генотипов получены разработан недостаточно. Лишь у отдельных андрогенные каллусы, эмбриоиды и растения- регенеранты с небольшой частотой. Метод культуры пыльников (андрогенез) позволяет быстро получать гаплоидные, а на их основе и гомозиготные растения и линии. Разработка таких методов важна для плодовых культур, особенно для яблони, в связи с тем, что она имеет сложную гетерозиготную природу, многолетний цикл развития и не может репродуцироваться из семян. Однако исследования по культуре изолированных органов и тканей в частности пыльников яблони не многочисленны (Höfer M., 1994,1999., Савельев, Олейникова и др., 2009). Остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с индукцией морфогенеза, как прямого, так и непрямого. 4 Интерес к явлению гаплоидии все более возрастает, особенно в последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих современным требованиям производства. Управление явлением гаплоидии открывает перспективы не только в совершенствовании существующих, но и в разработке новых путей и методов генетики, в коренной реконструкции культурных растений. В связи с этим исследование андрогенеза in vitro у плодовых растений, в частности у колоновидных форм яблони, является актуальным. В настоящее время в биотехнологической работе используется также культура in vitro листовых эксплантов. Этот метод применяется в области генной инженерии, для выделения изолированных протопластов из мезофилла и гибридизации соматических клеток, для изучения действия физиологически активных веществ, механизма перехода клеток к дедифференциации, в системах микроразмножения и оздоровления ценных генотипов. Для этого необходимо наличие надежных методов регенерации растений из листовых эксплантов. Однако у колонновидных форм яблони такие методы недостаточно разработаны. Метод клонального микроразмножения служит для оздоровления и быстрого размножения ценных генотипов растений (Рыбалко, 1991; Коршун, Муратова, Иванов, Тугарев, 1996; Дорошенко, 1998; Орлова, Юшев, 2000; Ломовская, 2003). Основными преимуществами данного метода является возможность получения необходимого числа растений из небольшого количества исходного материала и сокращение сроков его получения до одного года, в то время, как при использовании традиционных вегетативных способов размножения у плодовых растений требуется обычно более 3 лет. Имеется ряд исследований по клональному микроразмножению яблони (Верзилин, Иванов и др 1998 г,. Самусь., Семенас 2006 г, Матушкина, Пронина автореферат 2008 г) Однако 5 условия культивирования, разработанные для одних генотипов, часто оказываются неэффективными для других и требуют дополнительных исследований. Воспроизводимость результатов часто бывает весьма низкой. Особое место в современном плодоводстве занимают колонновидные формы яблони, которые имеют несомненные биологические преимущества по сравнению с обычными сортами. Они отличаются небольшой, не более 2,5 метров высотой, особым типом кроны – без бокового ветвления, ранним, уже с первого-второго года посадки, вступлением в плодоношение, необычно высокой продуктивностью в 5-6 раз превышающей обычные сорта. (Кичина, 2006) Все это делает данные формы яблони ценными для селекционногенетических и биотехнологических исследований. Однако многие вопросы, связанные с культурой in vitro пыльников, листовых эксплантов, меристем изучены у них недостаточно, в первую очередь – возможности индукции процессов морфогенеза с учетом их биологических особенностей. Положения, выносимые на защиту: 1. Приемы индукции каллусо- и морфогенеза в культуре in vitrо изолированных пыльников колонновидных слаборослых генотипов яблони. 2. Условия получения регенерантов в культуре листовых эксплантов колонновидных форм яблони. 3. Микроклональное размножение, укоренение и адаптация к условиям in vivo. 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Использование методов культуры in vitro органов и тканей для селекционно-генетических целей Использование современных биотехнологических методов, таких как культура in vitro пыльников, листовых эксплантов, верхушечных меристем позволяет решать важные селекционно-генетические задачи такие, как ускорение селекционного процесса, создание нового ценного для генетики и селекции исходного материала. В настоящее время для совершенствования традиционного селекционного процесса, важное значение приобретает использование биотехнологических методов и приемов, в частности, таких, как культивирование в системе in vitro клеток, тканей и органов растений, направленных на сокращение сроков создания ценных генотипов. Клеточные технологии в селекционной работе можно разделить на две группы: 1) облегчающие и ускоряющие традиционные процессы; 2) создающие генетическое разнообразие и скрининг генотипов с ценными признаками (Бутенко, 1986; Расторгуев, 2009). Одним из таких методов является культивирование in vitro изолированных пыльников и пыльцы (андрогенез in vitro). Основы этого метода заложены Гуха и Магешвари в 1964 г., когда впервые была достигнута индукция гаплоидных эмбриоидов, а затем и целых растений из пыльцы у Datara innoxia (Maheshwari S. C., Rashid A., Gyagi A., 1982). Было установлено, что в условиях in vitro микроспора может отклониться от нормального, гаметофитного пути развития и перейти к спорофитному. Андрогенез in vitro – процесс образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений) – можно охарактеризовать как одно из самых значительных открытий в биологии растений второй половины XX века (Круглова, Горбунова, 1997). 7 Основной интерес к культуре пыльников связан с тем, что это эффективный способ получения гаплоидов. Гаплоидия – процесс, приводящий к получению растений, у которых в хромосомном наборе представлена только одна из гомологичных хромосом, в результате чего общее количество хромосом уменьшено вдвое (n) по сравнению с исходной родительской формой (2n). В пыльнике содержатся тысячи микроспор, каждая из которых потенциально может дать целое гаплоидное растение (Атанасов, 1993). Метод культуры пыльников (андрогенез in vitro) позволяет быстро получать гаплоидные, а на их основе гомозиготные растения и линии. Интерес к явлению гаплоидии все более возрастает, особенно в последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих современным требованиям производства. Управление явлением гаплоидии открывает перспективы не только в совершенствовании существующих, но и в разработке новых путей и методов генетики, в коренной реконструкции культурных растений. Применение гаплоидных растений в селекции позволяет решать многие проблемы. Прежде всего, получать константные, нерасщепляющиеся гомозиготные формы, для получения которых традиционными методами гибридизации и отбора требуется длительный инбридинг; с помощью же культуры пыльников от гибридных растений первого поколения, родители которых различались по ряду признаков, можно получать гомозиготные растения в первой генерации и, таким образом, сократить селекционный процесс на 3-4 генерации, необходимые для обычной схемы селекции (Касаева, 1988). Использование гаплоидных растений упрощает и делает более эффективными исследования в области экспериментального мутагенеза. Это связано с тем, что у гаплоидов гены находятся в гемизиготном состоянии, 8 отсутствует доминирование и все гены имеют фенотипическое проявление, поэтому отбор мутантов возможен уже в первом поколении. Гемизиготное состояние гаплоидов способствует проявлению также летальных генов, которые у диплоидных форм обычно находятся в рецессиве. Такие гаплоиды, как правило, погибают на ранних этапах развития, а те, которые выживают и растут, имеют хороший внутренний генный баланс и поэтому являются ценным материалом для селекции (Lespinasse, Yves, 1987). От гаплоидов можно получать моносомные линии и использовать их в хромосомной инженерии и цитогенетике. Гаплоидные ткани и клетки используются в клеточной селекции для получения протопластов, их слияния и образования гибридных клеток и растений (Гапоненко, 1987). Многие виды при культивировании пыльников образуют каллусную ткань, в которой затем индуцируется органогенез, и формируются растения. Каллусная ткань может содержать, наряду с гаплоидными клетки других уровней плоидности (анеуплоидные, диплоидные, полиплоидные), что служит дополнительным источником генетической изменчивости в селекции (Савельев, Олейникова, 2009). Разработка метода андрогенеза in vitro важна для плодовых культур, которые имеют сложную гетерозиготную природу, многолетний цикл развития и не могут репродуцироваться из семян, и поэтому являются очень трудными объектами для селекционно-генетической работы. Однако исследования по культуре in vitro пыльников плодовых не многочисленны (Савельев, Олейникова и др., 1999; Höfer M., 1999, 2004). Остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с индукцией первичных андрогенных образований (каллусов, эмбриоидов), а также морфогенеза, как прямого, так и непрямого. Создание такого метода явилось бы поистине огромным достижением, позволившим значительно ускорить селекционную работу с этими культурами и повысить результативность генетических исследований. 9 Работы по культуре пыльников плодовых растений проводятся в Германии, Франции, Китае и других странах, но достигнутые результаты весьма ограничены: только у отдельных генотипов получены с небольшой частотой андрогенные новообразования – каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и побеги-регенеранты, среди которых обнаружены удвоенные гаплоиды (Höfer М., 1994, 1999). Определенные положительные результаты получены при культивировании in vitro пыльников земляники (Хамукова, 1994; Высоцкий,1998, 2005). Более значительные успехи по получению гаплоидов методом культуры пыльников достигнуты у зерновых и овощных культур. У них с помощью данного метода уже получены новые высокоэффективные сорта (Graig, 1974; Выскот, Новак, 1975; Шамина, 1981; Кучко, Маруненко, 1983; Кучеренко и др., 1986; Dayuan Wang, 1988; Соколов, Шумный, 1989; Hanre, Viola, 1990; Орлов, 1998; Анапиляев, 2000; Бобков С. В., 2002; Шмыкова Н. А., 2006; Муравлев, 2007). Изучение вопросов гаплоидии и гомозиготности имеет особенно важное значение для такой плодовой культуры как яблоня, так как эти растения – сложные гетерозиготы, они не могут репродуцироваться из семян, имеют многолетний цикл развития и, в связи с этим, представляют трудный материал в генетических исследованиях и селекции. Однако у плодовых растений, в том числе и у колонновидных форм яблони, еще не разработаны на основе андрогенеза in vitro массовые и надежные способы получения гаплоидов, которые обеспечили бы их применение в практической селекции и генетики. Это обусловлено тем, что у данной группы растений морфогенетические процессы индуцируются с большим трудом, характеризуются нестабильностью и плохой воспроизводимостью. У многих генотипов трудно бывает получить даже первичные андрогенные образования – каллусы, эмбриоиды. Условия получения регенерантов, разработанные для одного вида или сорта, как 10 правило, бывают неэффективными для другого и требуют значительных модификаций. Метод клонального микроразмножения служит для быстрого размножения селекционно и генетически ценного материала важных сельскохозяйственных культур, в том числе плодовых и ягодных. Установлено, что на процесс клонального микроразмножения оказывают влияние генетические, физиологические, гормональные и физические факторы (Калашникова, 2003). Их необходимо учитывать при разработке оптимальных приемов более полной реализации мopфoгенетического потенциала эксплантов при микроразмножении растений. Однако для ряда плодовых культур, в том числе колонновидных форм яблони, метод клонального микроразмножения разработан недостаточно. Данная группа растений представляет особый интерес в связи с тем, что ее сорта наиболее полно отвечают современным требованиям интенсивного садоводства, их использование позволяет увеличить продуктивность производственных насаждений до 4000 ц/г (Watkins, Alston, 1973; Tobutt, 1985, 1994). Культура in vitro листовых эксплантов используется как метод для размножения определенных видов растений. Большое значение культура изолированных листьев имеет для выделения изолированных протопластов из мезофилла и последующей их гибридизации с целью получения новых генотипов. Культура сегментов листьев, в том числе яблони, используется для разработки эффективных систем трансформации. Известны работы по культуре in vitro листовых эксплантов плодовых и ягодных культур (Высоцкий, 2008; Соловых, 2009). Однако у гибридов, полученных от скрещивания колонновидных форм и слаборослых генотипов, такие исследования не проводились. Одним из важных этапов получения растений-регенерантов из эксплантов различного происхождения плодовых и ягодных культур является оптимизация условий индукции каллусогенеза. Известно, что 11 способность к каллусообразованию зависит от целого ряда факторов, основными из которых являются генотип исходных растений-доноров и состав культуральных питательных сред – минеральный и гормональный. Минеральная основа включает макро- и микросоли. Существует множество прописей сред, разработанных для различных групп растений, однако, чаще всего, у большинства культур, в том числе плодовых и ягодных используют среду Мурасиге-Скуга. В качестве гормональных компонентов в питательные среды включают преимущественно различные типы ауксинов и цитокининов в определенных концентрациях и соотношениях. В большинстве известных работ для получения каллусных культур используется эмпирический подбор питательных сред по гормональному составу, основным недостатком которого является несистемность используемых вариантов, что может приводить к некорректной оценке полученных результатов. Одним из подходов к оптимизации питательных сред является использование методов планирования эксперимента. Как правило, питательные среды, разработанные для одних культур, оказываются малоэффективными для других, поэтому требуется индивидуальный подход к каждой группе растений (Катаева, Бутенко, 1983). В связи с этим необходимо выяснить закономерности индукции каллусообразования на питательных средах, содержащих экзогенные регуляторы роста в различном диапазоне концентраций. Поэтому одной из целей настоящего исследования было − изучить особенности каллусогенеза in vitro в эксплантах различного происхождения плодовых растений на питательных средах различного состава и установить оптимальные концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции этого процесса. Индукция процессов морфогенеза является ключевым, наиболее трудным и не всегда осуществимым этапом во всех биотехнологических исследованиях, проводимых на различных тканях и органах. Особенно 12 актуальна эта проблема у плодовых и ягодных культур. Это обусловлено тем, что данные растения являются трудными объектами для биотехнологических исследований. В процессе их изучения возникают проблемы с получением даже первичных новообразований (каллусов, эмбриоидов), а процессы морфогенеза вообще индуцируются с очень большим трудом и не у всех генотипов. Поэтому данная проблема является очень актуальной. Ее решение позволило бы сделать биотехнологическую работу с этими культурами более успешной, перспективной и практически значимой для генетики и селекции. К настоящему времени регенерация in vitro в каллусах различного происхождения достигнута лишь у отдельных генотипов яблони, вишни, земляники (Höfer, 2004; Высоцкий, 2008; Савельев, Олейникова и др., 2010). 1.2. Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур Согласно определению андрогенез in vitro – процесс образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры и клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений). Это связано с тем, что в определенных условиях спорогенные клетки могут переключаться с характерного им гаметофитного на принципиально иной – спорофитный путь развития (Круглова, Горбунова 1997). Это явление было открыто в 1964 году Гуха и Махешвари, которые, изучая физиологию мейоза у пыльников Datura innoxsia, наблюдали образование эмбриоидов а затем и целых растений на искусственных питательных средах (Гуха, Mагешвари, 1964). В последующем было доказано, что они возникли из пыльцевых зерен и имели гаплоидный набор хромосом. С этого времени данное направление развивалось очень активно. Открытие андрогенеза in vitro относят к самым значительным в биологии второй половины прошлого столетия (Горбунова, Круглова, Батыгина 1993). 13 У целого ряда одно- и двулетних культур андрогенез in vitro довольно хорошо изучен. При культивировании пыльников были получены эмбриоиды, каллусы, растения-регенеранты (Maheshwari et al., 1982; Шамина, 1981; Батыгина с соавт., 1992; Круглова, Горбунова, 1997; Тюкавин, 2006; Шмыкова, 2006; Муравлев, 2007). В результате проведенных исследований было установлено, что в условиях in vitro репродуктивные клетки пыльников могут развиваться по одному из следующих путей: 1. Прямой андрогенез (эмбриоидогенез) – репродуктивные клетки (микроспоры или клетки пыльцевого зерна) делятся и образуют зародышеподобные структуры – эмбриоиды, которые могут развиваються в гаплоидные растения. 2. Косвенный (непрямой) андрогенез – репродуктивные клетки дедифферинцируются, делятся и образуют недифферинцированный каллус, в котором после переноса на дифференцирующую среду возможна индукция растении-регенрантов. Часто такие растения бывают разной степени плоидности, что обусловлено невозможностью полного исключения размножения диплоидных клеток соматических тканей пыльника (Шамина, 1981; Маруненко, 1988; Горбунова, 1993; Konieczhy, Czaplicki, 2003). 1.3. Влияние ряда факторов на андрогенез in vitro Установлено, что на частоту каллусо-, эмбриогенеза и регенерацию растений из пыльников и пыльцы, влияют многие факторы, основными из которых являются: генотип растений-доноров, состав культуральных питательных сред, стадия развития пыльцы в момент инокуляции пыльников, предварительная подготовка бутонов, физические условия культивирования и условия внешней среды, в которых произрастали растения-доноры пыльников. 14 1.3.1. Влияние генотипа Важным фактором, который обуславливает переключение гаметофитной программы развития микроспор или пыльцевых зерен на спорофитную является генотип исходных растений доноров пыльников (Burbulis, Blinstrubiene, 2009; Круглова и др., 1999; Анапияев, 2002; Муравлев, 2008). Установлено, что не только виды внутри рода, но также сорта одного и того же вида, межвидовые и межсортовые гибриды, как правило, при культивировании in vitro пыльников дают существенные различия по выходу андрогенных новообразований – каллусов, эмбриоидов, растений-регенерантов (Maheshwari et al., 1982; Prakash, Giles, 1987; Атанасов, 1993; Шмыкова, 2006; Гончарова, 2008; Хомякова, 2009). Еще T. W. Оуянг с соавторами (1983) детально исследовали влияние генотипа на индукцию гаплоидного каллуса и регенерацию растений in vitro. Они показали, что андрогенетический потенциал не зависит от материнской цитоплазмы и определяется большим числом генов. В модельном опыте с использованием двух родительских генотипов пшеницы с различной способностью к регенерации через культуру пыльников была выявлена наследуемость показателей интенсивности каллусообразования, регенерации проростков и зеленых растений. Установлено, что интенсивность регенерации проростков из зеленых растений контролировалась двумя доминантными генами (Wang Yu et al., 2007). Показано наличие эффекта материнского растения и комплементарный характер наследования способности к андрогенезу in vitro мягкой пшеницы (Данилова, 2000). В культуре in vitro пыльников риса степень индукции каллуса варьировала по видам от 0 до 11,8% (Ding-Ye-mei et al., 2003). По отзывчивости пыльников на культуру in vitro, то есть по их способности образовывать андроклинные структуры (эмбриоиды, каллусы) исследователи, работавшие с яровой мягкой пшеницей, выделили сорта с 15 высокой, средней и низкой отзывчивостью (Плотников, 1994; Анапияев, 2000; Золотов, 2003). Е. В. Белинская (2007) в коллекции ячменя по способности к андрогенезу in vitro выделила 5 групп генотипов. Так же выделены генотипы, как не образующие зеленые растения при культивировании пыльников, так и с высокой способностью к этому процессу (Masoje et al., 1993). В исследованиях, проведенных на целом ряде сельскохозяйственных культур, таких как пшеница (Горбунова, 2000; Данилова, 2000; Круглова и др., 2001; Дьячук и др., 2004; Сельдимирова и др., 2004; Лаврова 2006; Сельдьмирова, Титова, 2008), рис (Bishnoi, 2000), ячмень (Белинская, 2007); просо (Бобков, 2000, 2002), рожь (Flehing-Haus et al., 1995), кукуруза (Сатарова, 2001), огурец (Xie Miao et al., 2005), горох (Бобков, 2008), капуста (Roulund et al., 1990; Rudolf et al., 1999; Грищенко, 2001; Давыдова, 2008) томат и перец (Zagorska et al., 1998, Кучковская, Молканова, 2002), морковь (Тюкавин, 2006), рапс (Ferrie et al., 1995; Муравлев, 2007), люцерна (Асадова, 2005), земляника (Протасова, 2010) показаны значительные различия между генотипами по способности их пыльников к формированию андрогенных новообразований (каллусов, эмбриоидов, регенерантов). Установлен эффект материнского растения и комплиментарный характер наследования способности к андрогенезу in vitro мягкой пшеницы. Показано, что цитоплазма материнского растения влияет на способность гибрида к андрогенезу in vitro (Данилова, Коновалов 2000). Генотип ячменя сильно влиял на способность пыльников к культуре in vitro, реакция пыльников на культивирование контролировалось доминантным и аддитивным эффектами, второй − был более значим (He Yu-Chi, Ge Ju et al., 2007). Китайские исследователи выделили три типа каллусов, полученных из пыльников земляники (Li Wei-dong, Ge Hui-do et al., 2004). Среди них наиболее ценным был эмбриогенный тип, в котором индуцировали эмбриоиды. Однако данный этап у плодовых растений, в частности яблони, изучен недостаточно. В 16 результате чего нами были изучены факторы, оказывающие влияние на процесс каллусообразования. 1.3.2. Стадии развития пыльцы и влияние состава питательных сред На результаты культивирования пыльников in vitro влияет стадия развития пыльцы. Иногда этот фактор может быть даже решающим. В основном исследователи культивировали пыльники на трех стадиях развития пыльцы - тетрады, одноядерная и двуядерная. Большинство авторов считают, что лучшей для культивирования in vitro пыльников является одноядерная пыльцы. (сильновакуолизированная микроспора) стадия развития На этой стадии у многих растений показатели эмбрио- и каллусогенеза наиболее высокие (Куксо, 2004; Зарянова, Горбунова, 2005;Тюкавин, Наумова, 2006; Протасова, 2010). Но так же хорошие результаты могут давать пыльники с 2-3 ядерной пыльцой (Шамина, 1981; А. Атанасов, 1993). Установлено, что перед посадкой пыльников на культуральные среды бутоны необходимо выдержать при низких положительных температурах 3-5оС в течение определенного времени (Бугара и др., 1985; Горбунова, Круглова, 1995; Sunderland et al., 1997; Xynias et al., 2000, 2001; Абрамов, 2001; Trejo-Tapia Gabriela et al., 2002; Размахин, Чекуров, 2004; Галиева и др., 2005; Лозариду и др., 2005). Продолжительность обработки зависит от вида растения и может варьировать от 1 до 15 дней. Считают, что холодовая предобработка уменьшает гибель микроспор, замедляет нормальное развитие, вызывает изменение оси деления в микроспоре, задерживает дегенерацию тапетума и среднего слоя и, как следствие этого, увеличение эмбрио- и каллусогенеза (Шамина, 1981; Бугара, 1985). Состав питательных сред является главным фактором для индукции и развития новообразований из пыльников и пыльцевых зерен. Он включает 17 минеральную основу, которая состоит из макро- и микроэлементов, и гормональный состав, который представлен, в основном, ауксинами и цитокининами. Существуют различные модификации питательных сред, состав которых указан в методической и справочной литературе (Бутенко, 1964; Гродзинский, 1973; Калинин и др. 1980), но в большинстве случаев для культивирования изолированной минеральной основы дополненную биологически пыльцы используют и среду активными пыльников в качестве Мурасиге-Скуга веществами в (1962), различных концентрациях и соотношениях. Эту среду рекомендуют большинство исследователей (Хамукова, 1994; Высоцкий, Алексеенко, 2005, 2008; Матушкина, Пронина, 2008). Экзогенные фитогормоны считают основными факторами управления андрогенезом in vitro. Накоплен большой эмпирический материал по влиянию различных фитогормонов на индукцию эмбрио-, каллусогенеза и регенерацию растений в культуре изолированных пыльников (Гамбург, 1976; Полевой, 1982; Размахин, Чекуров, 2004). Фитогормоны – органические соединения, сравнительно низкомолекулярные, с их помощью осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов, в малых количествах они необходимы для запуска и реализации физиологических программ (Полевой 1982; Дерфлинг, 1985). Фитогормоны необходимы для запуска и регуляции морфогенетических и физиологических программ (Кефели, 1984). Они действую в очень низких концентрациях и являются сравнительно низкомолекулярными веществами (Гудвин, Мерсер, 1986). Основными представителями фитогормонов являются ауксины, цитокинины, гиббереллины, все они оцениваются как гормоны стимулирующего действия. Показано, что синтезируясь в одних частях растения и транспортируясь в другие его части, они оказывают влияние на многие процессы, в том числе морфогенетического характера (Полевой, 1982). 18 В качестве индукторов андрогенетических процессов в среды включают ауксины и цитокинины. Из ауксинов чаще всего используют ИУК – β-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-масляная кислота, НУК – α-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; цитокининов – кинетин, 6-БАП (Атанасов, 1993; Хамукова, 1994; Сорока, 2004; Тюкавин, 2006; Муравлев, 2007; Yan Li-Xia, Chun-Gen et al., 2007). Выбор необходимой комбинации фитогормонов для культивирования пыльников in vitro зависит от вида растений и задач проводимых исследований. Ауксины влияют на растяжение клеток, деление и дифферинцировку, (основной природный ауксин – гетероауксин). Ряд авторов изучали действие ауксинов на культуру пыльников различных видов растений (Keller et al., 1986; Гамбург и др., 1990; Тивари и др., 1990; Горбунова и др., 1992; Горбунова, 1993; Круглова и др., 1999; Lin Gang et al., 2004; Vaithiyalingan, Nadarajan, 2004; Zhao Sing, Sun Meng-Xiang, 2005; Шмыкова, 2006; Сельдьмирова, Титова, 2008.). Основным местом синтеза ауксинов в растении является апикальная меристема стебля. Кроме этого, ауксины могут синтезироваться в активно растущих меристемах корня, в растущих зародышах и семяпочках, листьях и семядолях. Наиболее выраженный органогенный эффект ауксина – это стимуляция образования корней (Гамбург, 1990). Цитокинины снимают апикальное доминирование и индуцируют развитие пазушных почек, нарушают покой и стимулируют рост покоящихся органов. Они регулируют рост соматических зародышей и формирование растений. Основной природный цитокинин – (зеатин) к ним относятся, также кинетин – 6-фурфуриламинопурин, 6-БАП – 6-бензиламинопурин. Они необходимы для дифференциации стеблевых почек в культуре каллусных тканей и при регенерации побегов из клеток эксплантов. Таким образом, все морфогенетические реакции, используемые при размножении растений, для 19 нормальной реализации нуждаются в экзогенных цитокининах (Катаева, Бутенко1983). Гиббереллины – обширный класс соединений, включающий более 30 веществ. Они усиливают рост и вытягивание стебля, листьев, индуцируют прорастание семян, снимание состояние покоя. Гиббереллины вносят в питательную среду в основном с целью ускорить рост сформировавшихся почек и получить растения с хорошо развитой надземной частью (Катаева, Бутенко1983). Выбор необходимой комбинации фитогормонов для культивирования пыльников в значительной степени зависит от вида растений. Для некоторых растительных систем показано, что для индукции эмбриогенеза необходимо добавление в питательную среду 2,4-Д и цитокининов с последующим исключением ауксинов для дальнейшего развития эмбриоидов, в других случаях положительный эффект наблюдали в комбинации НУК с цитокининами (Атанасов, 1993). Для нормального развития эмбриоидов на ранних стадиях андрогенеза in vitro необходимы микроэлементы и витамины. Наиболее важную роль играют витамины группы В, так как участвуют в процессах фотосинтеза, дыхания и размножения (Бутенко, 1964). Также необходимым элементом на всех стадиях андрогенного развития пыльцевых зерен считается железо в форме хелатов (Атанасов, 1993). На рапсе выявлена положительная корреляция между концентрациями хелата железа в питательной среде и типом эмбриоидов (Муравлев, 2007). В качестве источника углеводов в питательные среды при андрогенезе in vitro включают в основном сахарозу. Установлено, что одни растения требуют условий с низким осмотическим давлением, а другие с высоким, в связи с этим концентрация сахарозы в питательной среде может сильно варьировать – от 20 до 120 г/л (Данвел,1989; Атанасов, 1993; Fang Shu-Gui et 20 al., 2005). Также положительное влияние оказывают аминокислоты и гидролизат казеина (Gou Shu-qiao et al., 2006). При культивировании пыльников в условиях in vitro большинство исследователей используют твердые питательные среды. По мнению Данвела (1989), разные типы агаров могут содержать вещества, способные оказывать вредное действие на выживаемость пыльцы. Поэтому многие исследователи используют жидкие питательные среды (Батыргожин и др., 1991; Молканова, Данилова, 1994; Данилова, Коновалов, 2000). После высадки пыльников на среду, пробирки следует помещать в темноту для стимуляции каллусообразования при температуре +24º...+26ºС и относительной влажности воздуха 70-80%. Для регенерации растений пробирки с каллусами выставляют на свет с интенсивностью освещения 1000-3000 люкс и фотопериодом 16 часов. Дальнейшее культивирование, вплоть до получения целых растений, проводится в этих условиях (Rosati et al., 1975; Вершкова, 1995; Алексеенко, Высоцкая, 2003; Высоцкий, Алексеенко, 2005, 2008; Матушкина, Пронина, 2008; Протасова, 2010). Морфогенез растений – последовательная цепь изменений формы в онтогенезе, приводящих к созданию высокоспецифичной структуры. (Бутенко, 1994). В основе морфогенеза лежит тотипотентность – свойство отдельно взятой культивируемой растительной клетки сохранять способность при последовательных делениях и вторичной дифференциации восстанавливать целый растительный организм со всеми его свойствами. (Бутенко, 1975). Фундаментальное свойство морфогенеза – его возможность образовать более сложные и вместе с тем упорядоченные структуры из менее сложных (Уоддингтон К. 1964). На морфогенез влияют различные условия, основными из которых являются: состав питательной среды, физические факторы культивирования – температурные режимы, интенсивность и качество света (Спивак и др., 1991; Вершкова, 1995; Сорока, 2004; Ананьина и др., 2005; Высоцкий, 21 Алексеенко, 2005; Савельев, Олейникова, 2005; Мишуткина, Гапоненко, 2006; Протасова, 2010). Обязательными компонентами среды при морфогенезе, оказывающими влияние на деление, растяжение и дифференциацию клеток являются ауксины, так как они учувствуют в репликации ДНК. В действии ауксина на морфогенез проявляются черты определенной специфичности – индукция корне- и ксилемообразования (Чайлахян и др., 1972). Часто в культуре пыльников основным компонентом является 6-БАП (Zenkteler et al., 1975; Arnison et al., 1990; Кастрицкая, 2002; Роньжина, 2003; Tretyakova et al., 2006, Муравлев, 2008), а для некоторых видов растений и кинетин (Zenkteler et al., 1975). При добавлении в среды мезоинозита происходит подавление роста стеблевых почек, а также препятствует ризогенезу (Stewart et al., 1977), а при его отсутствии происходит угнетение морфогенеза (Pundir, 1972). Одно из проявлений морфогенеза – каллусогенез в культуре изолированных пыльников. Способность к каллусогенезу как in vivo, так и in virto обнаружена у представителей всех порядков и классов растений, причем почти во всех частях растения. Первые работы, посвященные получению каллуса in virto из изолированных частей растения, появились еще в начале прошлого века (Муромцев, Бутенко 1990). Однако до настоящего времени однозначного определения каллуса нет. По Доддсу и Робертсу (1985), каллус – неорганизованная меристематическая или опухолеподобная масса растительных клеток, формирующихся in virto. R. L. Pierik (1987) в своем словаре определяет каллус, как «активно делящуюся неорганизованную ткань, состоящую из неорганизованных и дифференцированных клеток». Г. С. Муромцев с соавт. (1990) считает каллусом «ткань, возникающую путем неорганизованной пролиферации клеток растений». В культуре изолированных пыльников процесс образования каллусов берет начало от морфогенных, переключившихся на спорофитный путь 22 развития микроспор или клеток пыльцевого зерна. Превращения микроспор в каллусные клетки обусловлено их структурной перестройкой, индукцией и способностью к последовательным делениям (Круглова и др., 1999). Каллусы, возникающие при культивировании пыльников, различаются по морфологическим показателям. Отмечены мягкие, рыхлые каллусы и каллусы компактные, матовые, белого цвета, причем, каллусы именно последнего типа были способны к регенерации растений (Rose, Dunwell, Sunderland, 1986). Существуют различные классификации андрогенных каллусов. Так китайские исследователи Li Wei-dong с соавторами (2004) каллусы, индуцированные из пыльников земляники, разделили на 3 типа: первый отличался медленным ростом, светло-зеленой окраской, комковатой и гранулированной структурой, каллус второго типа напротив характеризовался интенсивным ростом ярко-белой окраской и желеобразной структурой, каллус третьего типа – эмбриогенный, также активно рос, имел ярко желтую окраску и рассыпчатую структуру. Каллусы первого и третьего типа были способны к регенерации, а второго типа этой способностью не обладали. Другие исследователи (Зайцев, 2006) каллусы, полученные при культивировании пыльников пшеницы, разделяли на: морфогенные, неморфогенные, потенциально морфогенные. Установлено, что каллус может брать начало, как от микроспор, так и от клеток соматических тканей стенки пыльника (Горбунова и др., 1992; Круглова, Горбунова, 1997). При этом образуются диплоидные каллусы, которые в последствие регенерируют в диплоидные растения. Также каллусы могут образовываться из тканей тычиночной нити или связника. Обычно такие каллусы – мягкие, водянистые, рыхлые, они не способны к дальнейшей регенерации (Горбунова и др., 1992; Круглова, Горбунова, 1997). Образованные побеги-регенеранты срезают с каллусов и размножают. Для этих целей, чаще всего используют среду МС, содержащую БАП в 23 концентрации от 1 до 3 мг/л (Высоцкий, 1989; Туровская 1989; Высоцкий, 2008;Протасова, 2010). После размножения растений, побеги укореняют. Выявлено, что основным индуктором корнеобразования в культуре in vitro у яблони является ИМК в концентрации 1-3 мг/л для легко укореняющихся форм яблони и 3-4 мг/л у трудно укореняющихся генотипов (Туровская, 1989). Наиболее критическим периодом выращивания пробирочных растенийрегенерантов считается их перенос из стерильных условий в открытый почвенный грунт. При этом растения попадают в стрессовую ситуацию, что во многих случаях приводит к их гибели. Это объясняется многими причинами: биохимическими, физиологическими, анатомическими, так как растения, полученные in vitro, во многом отличаются от растений, полученных in vivo (Pierik, 1987; Катаева, 1986). У пробирочных растений, полученных в условиях in vitro почти при 100% влажности воздуха, устьица широко открыты. В связи с этим наблюдается водный дефицит, создаваемый высокой транспирацией листьев. Поэтому растения, выросшие in vitro, являются гетеротрофами, а в почве они должны стать автотрофами. При переводе растений, полученных in vitro, в условиях открытого грунта необходимо проводить акклиматизацию. При этом сосуды с культурой in vitro оставляют открытыми в стерильных условиях на несколько дней. Плохая адаптация функционированием объясняется и также повышенной недостаточным уязвимостью корневой развитием, системы растений, полученных in vitro. Это связано, главным образом с отсутствием корневых волосков, в связи с этим в грунте необходимо образование новых подземных корневых волосков. Их образованию может способствовать жидкая питательная среда. На протяжении многих лет ведутся интенсивные исследования в направлении совершенствования процесса пересадки пробирочных растений 24 (Корнадский и др., 1989; Высоцкий, 1988). Однако все эти и другие способы адаптации пробирочных растений не всегда дают желаемые результаты. 1.4. Культура in vitro листовых эксплантов Давно известно, что отдельные листья можно сохранять живыми длительное время, в течение которого наблюдается даже некоторое увеличение их размеров. Выращивание изолированных листьев (особенно целых) в нестерильных условиях широко использовалось ранее и используется в настоящее время для решения ряда вопросов. Значительно возрос интерес к культивированию листовых эксплантов в стерильных условиях (Калинин, Сарнацская, Полищюк, 1980). В отличие от других органов растений, лист в изолированных условиях развивается, как и на интактном растении (Steeves, 1973). Это объясняется тем, что лист является самодифференцирующимся органом и представляет хороший объект для изучения морфогенеза растений в целом. Техника культуры тканей листа используется как метод для размножения определенных видов растений. Большое значение культура изолированных листьев имеет для выделения изолированных протопластов из мезофилла и последующей их гибридизацией с целью получения новых генотипов. Культура сегментов листьев, в том числе яблони, используется для разработки эффективных систем трансформации (Калинин, Сарнацская, Полищюк, 1980). Первыми жизнеспособные культуры листьев были получены из покоящихся апикальных почек папоротников Osmunda cinnamomea (Steeves, Sussex, 1957; Sussex, Clutter, 1960; Steeves, 1961). Они показали, что из их примордиев развивались зрелые листья с нормальной морфологией. 25 Позднее было осуществлено культивирование целых листовых пластинок у двудольных и однодольных растений (Калинин, Сарнацская, Полищюк, 1980). В методических рекомендациях ряда авторов указывается, что в зависимости от целей исследования источником культивирования могут служить целые листья, высечки листьев, а так же листья стерильных проростков (Калинин, Сарнацская, Полищюк, 1980). Целые листья и высечки удобны для изучения регенерации, морфогенеза, дедифференциации. Во всех случаях лучше использовать молодые листья. Для образования адвентивных почек важную роль имеет размер экспланта, и место растения, с которого его взяли. В качестве рекомендуют стерилизующих использовать агентов 70%-ный вышеуказанные этанол, 1-5%-ный авторы растворы гипохлорита Са или Nа, 3-5% перекиси водорода, 0,01% -ной сулемы. Продолжительность стерилизации зависит от возраста и размера экспланта. Для культивирования листьев чаще всего используют среды Уайта, Эллера, Мурасиге-Скуга, Гамборга В5 (Калинин, Сарнацская, Полищюк, 1980; Высоцкий, 2008; Соловых, 2009). При культивировании световой режим играет важную роль, который оказывает значительное влияние на процессы регенерации в условиях in vitro. Fasolo et al. (1989) для стимуляции стеблевого органогенеза из листьев яблони сначала выдерживал экспланты в темноте при температуре 25ºС, а затем выращивал на свету. S. Pedieri, F. Malavasi (1989) показали, что листья, которые выдерживают в темноте в течение 25 дней повысило регенерацию из листьев Malus pumila Mill. Р. Г. Бутенко (1990) установил, что условия освещения также влияют и на морфогенез на стадии развития структур, а не на индукции процесса, которые проходят в темноте. D. J. James et al. (1988) изучили влияние внешних и внутренних факторов на частоту регенерации побегов из листовых тканей яблони. 26 Выявлена оптимальная концентрация регуляторов роста для развития адвентивных побегов (2,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л НУК). На регенерационную способность определенное влияние оказал контакт поверхности листовых эксплантов с питательной средой. M. R. Welander (1988), C. D. Onofriо, S. Morini (2003) наблюдали морфогенез в культуре листовых сегментов яблони и сливы как при прямом, так и при соматическом эмбриогенезе. С. В. Долгову с соавторами (1993) из шести сортов вишни удалось достичь частоты регенерации из листовых дисков до 10-15% лишь у вишни Комсомольская. Двухступенчатая методика получения регенерантов через ризогенез позволила повысить образование адвентивных побегов до 35%. В. А. Лебедев и др. (2004), С. А. Муратова (2005) показали, что эффективность регенерации из соматических тканей груши и сливы домашней определяется рядом факторов, основными из которых является генотип растения, состав среды, тип экспланта. Y. Liu, Sanford (1988), Н. В. Соловых (2003) указывают на влияние генотипа у сортов земляники на способность к регенерации при прямом органогенезе. Несмотря на достигнутые выше результаты по стимуляции прямого органогенеза нерешенными из соматических проблемы тканей достаточно плодовых надежного культур, остаются воспроизведения растительного материала с высокой частотой регенерации in vitro. 1.5. Клональное микроразмножение растений Современные методы биотехнологии позволили значительно повысить эффективность клонирования растений. Исследования в области культивирования соматических тканей привели к разработке принципиально новых методов размножения – клональное микроразмножение. В сущности, 27 эти методы аналогичны вегетативному способу размножения и различаются лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro (Высоцкий, 2006; Расторгуев, 2009). В искусственных условиях из клеток изолированных тканей и органов можно ускоренно получать достаточно большое количество растенийрегенерантов. Высокий коэффициент размножения, полная генетическая идентичность прототипу, ускорение перехода регенерантов от ювенильной к репродуктивной стадии развития, возможность длительного хранения пробирочных растений при пониженной температуре, экономия площадей для выращивания и другие преимущества перед размножением in vivo делают эту технологию весьма полезной для быстрого размножения новых сортов и отобранных в ходе селекции особо ценных элитных форм. Размножение растений in vitro возможно осуществить с помощью культуры изолированных апексов, индукции возникновения адвентивных побегов из каллуса и непосредственно из тканей исходных эксплантов, соматического эмбриогенеза. Главное условие клонального микроразмножения – получение растений, полностью сохраняющих генетическую однородность. Поэтому для этих целей предпочтительнее использовать культуру апексов (меристематических верхушек), т.к. в условиях in vitro они являются генетически стабильными, и пролиферирующие ткани всегда остаются диплоидными (Расторгуев, 2009). Одним из первых применил метод меристематических культур для быстрого размножения орхидей G. M. Morel (1963). К настоящему времени приведено много исследований и соответственно опубликовано работ, в которых изучено влияние на это процесс генетических, физиологических, гормональных и физических факторов (Бутенко, 1960, 1964; Jones, 1967; Murashige, 1974; Катаева, Бутенко, 1983; Джонс, 1987; Хасси, 1987; Бутенко, 1990; Мазур, Калашникова, 1998 и др.; Расторгуев, 2009). 28 P. Limasset и P. Cornuet (1949) удалось установить, что концентрация вирусов в растении снижается по мере приближения к меристематической верхушке и меристема может быть свободна от вирусной инфекции. Поэтому культуру меристем in vitro стали использовать для освобождения растений от вирусов и других патогенов (Морель, 1967). Проведенными исследованиями показано, что клональное микроразмножение является новым эффективным способом вегетативного размножения, позволяющим быстро тиражировать отдельные генотипы, получать оздоровленный материал и, главное, сокращать сроки селекционного процесса (Angiboust, 1980; Верзилин, Иванов, Трунов, 1998; Hogue, Neilsen, 1991; Расторгуев, 2009). В настоящее время нет единой классификации методов клонального микроразмножения. Одна из первых классификаций принадлежит Т. Мурасиге (1974). На основе морфогенетических реакций, реализуемых эксплантатами в культуре тканей, им были выделены следующие методы: 1) активация пазушных меристем; 2) индукция образования адвентивных побегов; 3) соматический эмбриогенез. G. Hussey (1975) дополнительно различает образование адвентивных побегов из каллусной ткани и развитие побегов непосредственно из клеток экспланта. M. (1979) Hempel микроразмножения, в также описывает основу которых три метода клонального положено сочетание морфогенетических реакций и этапов культивирования: 1) регенерация растений непосредственно из клеток экспланта; 2) образование почек, из которых развиваются вегетативные, активно пролиферирующие побеги; 3) образование каллуса, его пролиферация и регенерация из него растений. H. W. Kohlenbach (1978) выделяет в соматическом эмбриогенезе три типа, которые могут быть использованы при микроразмножении растений: индукция образования каллуса из тканей вегетативных (1-й тип) или репродуктивных органов (2-й тип) 29 и последующий соматический эмбриогенез; 3-й тип – образование адвентивных эмбриоидов из ювенильных тканей растения, минуя стадию образования каллуса. Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) считают возможным разделить процесс клонального микроразмножения на два принципиально различных типа: 1) активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); 2) индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo, который можно подразделить на три метода: а) возникновение организованных структур непосредственно из специализированных тканей экспланта (тканей репродуктивных органов, эпидермиса, мезофилла чешуй, листа и т.д.); б) из первичного каллуса, образованного клетками экспланта; в) из пересадочной каллусной ткани или клеток, растущих в суспензионной культуре. Клональное микроразмножение состоит из следующих этапов: 1. Введение (инициация) эксплантов в культуру in vitro с последующим культивированием их до образования почек и побегов. Этот этап включает в себя: - выбор маточных растений; - поверхностную стерилизацию отобранного растительного материала; - вычленение экспланта в стерильных условиях и помещение его на питательную среду в пробирку; - культивирование экспланта в климатической комнате со специальным и световым режимом. 2. Собственно микроразмножение, основанное на пролиферации почек и побегов. Размножение in vitro, состоящее из одного или нескольких пересадок на свежую питательную среду, сопровождается разделением конгломератов растеньиц. 3. Укоренение in vitro размноженных микропобегов. 4. Адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям открытого грунта. 30 При клональном размножении различных сортов и подвоев яблони была отмечена значительная сортоспецифичность, что является следствием высокой гетерозиготности рода (Yae, 1987; Бартиш и др., 1994). Для эффективного размножения каждого генотипа необходима разработка индивидуальных условий. Первый этап включает отбор исходных растений, стерилизацию и вычленение эксплантов, создание оптимальных условий для их развития на питательных средах. Для успешного размножения подвоев яблони в качестве исходного материала используют побеги в фазе активного роста (май – июнь) и выведенные из состояния покоя в зимний и ранневесенний периоды (февраль – начало апреля) (Матушкина, Пронина, 2008). Важным фактором на данном этапе микроразмножения является стерилизация исходного материала, так как поверхностные ткани заражены различной микрофлорой. В качестве стерилизующих агентов чаще всего используют 0,1% раствор диацида, 6% раствор гипохлорида кальция, 0,4% раствор нитрата ртути, 30% перекись водорода, раствор «Белизны» в различных концентрациях (Бутенко, 1964; Lee, Wetstein, 1990; Бохорова, Петров, Георгиева, 1991; Ткаченко, 2006, Шорников, 2008). Подробно процессы стерилизации описаны в специальных методических рекомендациях (Калинин, Сарнацская и др., 1980; Волосевич, 2006; Самусь, 2006). Каждый этап микроклонального размножения предусматривает определенный состав питательных сред в соответствии с задачами данного этапа. На этапе введения в культуру in vitro лучшие результаты у подвоев яблони получены на среде с минеральной основой Мурасиге-Скуга (МС), с добавлением 6-БАП в концентрации 1 мг/л, сахарозы – 30 г/л (Calamar Ana, de Klerk (2004). Также успешно применяется многими авторами модификация среды МС для плодовых, ягодных и декоративных растений (Бурдасов, Ильина, Кононова, 1988; Стрыгина, 1988; Барсукова, Фисенко, Андриевская, Сморкалова, 1999; Петрова, Упадышев, 2000; Орлова, Юшев, 31 2000; Кондратенко, Митрофанова, 2003; Куклина, Семерикова, Молканова, 2003). Некоторые авторы на этом этапе рекомендуют добавлять в качестве адсорбента активированный уголь или перлит (Самусь, 2003). Дополнительные трудности на этапе введения в культуру создает интоксикация растительного материала продуктами окисления фенолов, которые выделяются на месте среза растительных тканей. В некоторых методических рекомендациях предлагается использовать для яблони (кроме среды Мурасиге-Скуга) среды Гамбурга (В5), КворинаЛепорье (QL) с включением в них БАП в концентрации от 0,3 до 1,0 мг/л (Матушкина, Пронина, 2008). Минеральный и гормональный состав питательной среды должны соответствовать тем задачам, которые выполняет среда на каждом этапе микроразмножения. На первом этапе в состав питательной среды часто вводят антиоксиданты, которые предупреждают активацию гидролитических ферментов и гибель высаженных эксплантов. Можно, как предлагает Майер (1975), все операции по изолированию эксплантов проводить на фильтровальной бумаге, пропитанной аскорбиновой кислотой. Иногда перед посадкой на питательную среду экспланты целесообразно погружать на несколько часов в дистиллированную воду для удаления фенольных соединений (Сresswell, Nitsch, 1975). По экспериментальным данным ряда исследователей (Monaco L. S., 1977; David H., Isemukali K., David A., 1978; Fridborg G., Pedersen M., 1978; Lopez-Perez et al., 2005), добавление активированного угля благотворно сказывается на росте побегов и образовании эмбриоидов. По их мнению, активированный уголь адсорбирует выделяемые эксплантом токсические вещества. В то же время показано, что активированный уголь адсорбирует из среды и биологические соединения. Поэтому в такие среды вносят более высокие концентрации фитогормонов (Reynolds,1979). 32 По мнению Беачизне (1980), на первом этапе микроразмножения имеет смысл включать в питательную среду и такие вещества, как гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, аминокислоты. Основная цель второго этапа – собственно микроразмножение − является получение наибольшего количества побегов от каждого экспланта путем последовательного культивирования уже имеющихся побегов на свежую питательную среду. На этапе микроразмножения важно снятие апикального доминирования (Катаева, Бутенко, 1983). Для индукции пролиферации пазушных меристем в среду вводят вещества цитокининовой группы: кинетин, 6-БАП, зеатин. Для яблони из перечисленных цитокининов лучше всего использовать 6-БАП в концентрации 2 мг/л, в некоторых случаях до 3 мг/л. По данным Самусь с соавт. (2006), максимальное количество адвентивных побегов наблюдалось на среде, содержащей 5,0 мг/л 6-БАП, 0,2 мг/л ИМК и 0,5 мг/л ГА, при этом экспланты яблони образовывали адвентивные побеги. Эти авторы отмечают, что для подвоев яблони характерна высокая сортовая специфичность при размножении в культуре in vitro. Положительное влияние на процесс пролиферации клоновых подвоев яблони оказывает добавление к 6-БАП аденин-сульфата в концентрации 50100 мг/л. Процесс пролиферации с аденин-сульфатом протекает в 1,5-2,0 раза быстрее и степень ее выше на 15-47%. Количество субкультивирований (пассажей) клоновых подвоев яблони может составлять до 11, с 4-го пассажа обычно начинают укоренение побегов (Матушкина, Пронина, 2008). В некоторых случаях состав питательной среды на втором этапе (этап собственно размножения) остается прежним. В остальных случаях ее обогащают веществами (в основном фитогормонами), способными стимулировать или индуцировать морфогенетические реакции in vitro. На третьем этапе необходима среда, обеспечивающая рост стебля и укоренение 33 растений. Как правило, она более простого состава, без фитогормонов, или содержащая ауксины в небольшом количестве (Катаева, Бутенко, 1983). Укоренение микропобегов является следующим важным и трудоемким этапом, от которого зависит успех микроразмножения. На этапе укоренения in vitro используют побеги длиной 1,5-3,0 см. Индукцию корнеобразования проводят в основном двумя путями: 1) включение препаратов, в основном ауксиновой группы, способствующих корнеобразованию, непосредственно в питательные среды; 2) обработка базальных участков побегов корнеобразующими препаратами с последующим культивированием на средах, свободных от регуляторов роста (Высоцкий,1998 автореф; Матушкина, Пронина, 2008). Некоторые авторы отдают предпочтение последнему способу, по сравнению с введением ауксинов в питательную среду. Однако наиболее простым и легко доступным является введение стимулятора корнеобразования непосредственно в среду в концентрации 1,02,0 мг/л ИМК или 3,0-5,0 мг/л ИУК (Самусь, 2006). В качестве индуктора ризогенеза используют индолилмасляную (ИМК), индолилуксусную (ИУК), нафтилуксусную (НУК) кислоты. Однако НУК менее пригодна из-за обильного затрудняет рост корней (Матушкина, каллусообразования, которое Пронина, 2008). В качестве минеральной основы используют разбавленные вдвое среды Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепорье, или раствор Кноппа с полным содержанием микроэлементов, железа и витаминов как в среде для размножения. 1.6. Методы адаптации пробирочных растений к нестерильным почвенным условиям Одной из проблем в размножении растений, полученных в условиях in vitro, является перенос их в нестерильные условия. На этом этапе происходит значительная гибель растительного материала. Необходимо учитывать силу 34 развития переносимого растения, состав субстрата, влажность воздуха и срок пересадки. В ряде руководств (Катаева, Бутенко, 1983; Жуков и др., 1984; Высоцкий, Герасимова, 1987; Высоцкий, Плотникова, 1988; Туровская, Стрыгина, 1990; Тюленев, Расторгуев, Туровский, 1991; Расторгуев, 1996 и др.) описаны методы адаптации пробирочных растений. Этап адаптации к условиям открытого грунта является одним из наиболее критических периодов при выращивании растений регенерантов полученных в условиях in vitro, так как растения при этом попадают в стрессовую ситуацию, которая во многих случаях приводит к их гибели. Это объясняется физиологическими, биохимическими и анатомическими причинами. Считается, что во время таких пересадок растения теряют определенные эндогенные вещества, которые имеют важное значение для адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта. (Pierik, 1987; Деменко, Трушечкин, 1983;Катаева, 1986; Гиголашвили и др., 1997; Тюкавин, 2008). Пробирочные растения после переноса в нестерильные условия, как установлено, испытывают транспираторный шок, который обусловлен изменением целого ряда условий, в первую очередь влажности воздуха. В культуральных сосудах влажность воздуха близка к 100%, устьичные щели растений остаются открытыми и теряют способность замыкаться (Геринг, 1991; Vegvari, 1999). В связи с этим используют различные мероприятия направленные на постепенную адаптацию растений к нестерильным условиям. Чаще всего с этой целью за 1,5-2 недели до высадки в нестерильные условия с пробирок снимают пробки (Бургутин, 1991). Используют также препараты-индукторы комплексной устойчивости, такие как эмистим и экост в виде внекорневой подкормки (Карпов, 2001) 35 На этапе адаптации основным моментом является создание условий для перевода растений с миксотрофного типа питания на автотрофное (Вечернина и др., 2008). В связи с этим важно правильно подобрать почвенный субстрат. Ряд исследователей рекомендуют высаживать укорененные растения in vitro в ящики со смесью торфа и песка в соотношении 3:1(Ю. Г. Попов, А. С. Равкин, 1979). Е. Н. Джигадло с соавторами (2005) используют субстрат из смеси перегноя и торфа в соотношении 1:2, закрытого сверху стерильным перлитом, насыщенным раствором макросолей. Н. В. Кухарчик и др. (2006) применяют традиционные виды субстратов: перлит, торф со слоем песка сверху, торф в смеси с плодородной землей в соотношении 3:1, крупнозернистый песок, смесь торфа и песка 1:1, а также торфа и бурого угля в соотношении 1:1. Одним из способов улучшения адаптации является использование новых адаптационных субстратов, таких как ионообменные субстраты (ионитных почв). Известны их преимущества для выращивания плодовоягодных и декоративных культур (Солдатов и др., 1978; Тулаева и др., 1990; Судейная, Утыро, 2000; Судейная, Тимофеева, 2003). Также для лучшей адаптации растений применяют предварительную обработку водным раствором ИМК в различных концентрациях и времени воздействия, в зависимости от конкретного генотипа (Муратова, Янковская, Соловых и др.,2008; Пронина, 2008; Лебедев, Азарова, Алпатова и др., 2011). Разработан способ, при котором корни растения, полученного в условиях in vitro, помещают в почвенный субстрат вместе с агаризированной средой, в которой они росли (Высоцкий, Алексеенко, 1997). Также более выгодно, с экономической точки зрения, высаживать растения непосредственно в теплицу, минуя этап адаптации в контейнерах со стерильным субстратом (Ковалева и др., 2000; Клоконос, 2001). При этом способе с января по март растения активно размножают in vitro, затем 36 пересаживают на среды для укоренения и высаживают в грунт в мае-июне (Муратова, Янковская, Тюленев, Соловых, 2003). Лучшим временем для переноса растений в нестерильные условия является период начала активного роста после покоя, поэтому для трудно адаптируемых форм применяют такую технику, как создание искусственного периода покоя. Чтобы создать растениям такие условия их необходимо выдержать в холодильной камере при температуре +5º…+6ºС в течение 40-60 дней. Благодаря этому, перенесенные в почву растения начинают активно расти, быстрее перестраивают систему транспирации и становятся менее зависимыми от патогенной микрофлоры (Кухарчик и др., 2006; Протасова, 2010). В почву растения пересаживают во второй половине мая − начале июня. При этом отмечается наибольший прирост надземной части за летние месяцы вегетации и растения имеют вызревшие побеги, способные зимовать в открытом грунте. 1.7. Биологические особенности колонновидных форм яблони Яблоня относится к роду (Malus Mill.) семейства розоцветные (Rosaceae) − самая распространенная плодовая культура. Она произрастает во многих странах мира. В России яблоня является ведущей культурой среди плодовых насаждений, занимающей более 60% всей площади садов (Кашин, 1995). Она культивируется от субтропиков до районов Восточной Сибири с исключительно суровым климатом. Благодаря сортовому разнообразию яблоня обладает большой изменчивостью и приспособляемостью к самым различным почвенным и климатическим условиям. Широкое ее распространение объясняется многими ценными хозяйственно-биологическими признаками и, прежде всего, меньшей требовательностью к условиям произрастания и более высокой адаптивностью по сравнению с другими плодовыми культурами. 37 В плодах яблони содержится до 16 мг % легкоусвояемых сахаров, органические кислоты (яблочная, винная, лимонная), значительное количество пектиновых и дубильных веществ. В состав яблок входит свыше 40 различных химических элементов (цинк, бор, марганец, железо и другие), которые, несмотря на исключительно малые дозы, играют важную роль в обмене веществ организма человека, витамины С (аскорбиновая кислота), В (тиамин), В2 (рибофлавин), каротин, Р-активные вещества. Гармоническое сочетание вкусовых, питательных и биологически активных веществ (ферментов, витаминов) при большом количестве воды в мякоти плодов (до 85−90%) и сильное воздействие фитонцидов яблок на возбудителей болезней (ангины, дизентерии) позволяют отнести яблоки к разряду лечебных продуктов питания (Метлицкий, 1976; Вигоров, 1979). Плоды яблони являются ценным диетическим продуктом питания и могут использоваться в свежем виде почти круглый год, а также в виде различных продуктов переработки (Причко, 2002; Сизенко, 2004). Яблоня принадлежит к числу наиболее хорошо приспосабливающихся и наименее прихотливых и требовательных плодовых пород. Этим и объясняется ее широкое распространение с юга на север и с запада на восток (Варенцов, 1967). К настоящему времени достигнуты определенные успехи по селекции новых, высокопродуктивных сортов яблони, на долю которых приходится более 65% всего сортимента, рекомендуемого к хозяйственному использованию. Однако не все существующие сорта в полной мере отвечают современным большинства требованиям сортов яблони интенсивного является садоводства. их низкая Недостатком устойчивость к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам (Савельев, 1998). До недавнего времени в селекции яблони не уделялось должного внимания созданию слаборослых сортов с компактной колоннообразной 38 кроной и спуровым типом плодоношения, имеющих потенциал продуктивности 4000 ц/г (Watkins, Alston, 1973; Tobutt, 1985, 1994). Главная задача, стоящая перед садоводством на современном этапе его развития, заключается в дальнейшем повышении скороплодности и продуктивности насаждений при одновременном сокращении затрат труда и средств на единицу получаемой продукции. Эта задача стояла и продолжает стоять перед садоводами всего мира (Муханин, 2001). Интенсивному промышленному садоводству нужны скороплодные сорта с высокой урожайностью и малыми размерами дерева. Надежными среди сортов такого типа были и остаются те, у которых высокий уровень адаптации (зимостойкость, иммунитет и т.д.) (Кичина, 1987). Совершенно новые перспективы открываются в связи с появлением колонновидных сортов яблони. Ряд форм колонновидной яблони обладает исключительной скороплодностью и карликовым типом роста, что позволяет на новой основе реализовать идею сверхплотного сада (Качалкин, 2001). Высокорентабельный яблоневый сад плюс комфортные условия работы среди малогабаритных компактных деревьев и залуженных междурядий – такое производство яблок становится привлекательным (Кичина, 2006). История появления колонновидных форм яблони начинается в 60-х годах XX века, когда в Канаде на пятидесятилетнем дереве Мекинтоша была обнаружена крупная ветка, без боковых ответвлений и вся покрыта кольчатками, копьецами и большим числом яблок на них. Форму яблони размножили на опытной станции. Там же она получила первичную оценку и название Важак (Wijcik) (Кичина, 2006; Кичина, 1994; Кичина, 1993). Сорт Важак размножают во многих странах. Новые сорта с колонновидной кроной с успехом выдерживают испытания в России, Канаде и Англии (Кичина, 1985; Кичина, 2006). Колонновидные яблони попали в Россию в виде пыльцы сорта Важак. Пыльцу использовали в скрещивании с сортом Коричное полосатое. Сеянцы 39 от посева этой семьи были получены в 1973 г. и тогда же было выявлено, что около половины ее гибридов имеют колонновидный габитус. С тех пор началось изучение колонновидных форм яблони в России (Кичина, 1985; Кичина, 2006). Колонны имеют ряд достоинств, среди которых компактность и скороплодность. Высота растений в среднем 150-170 см (до 2-2,5 м). Плодоносить они начинают на 2-3 год после посадки, а некоторые сорта − в первый сезон. Это позволяет очень быстро получить отдачу и с меньшей площади собрать большой урожай. По словам В.В. Кичины (селекционера колонновидных яблонь), ”...саженцы сортов Президент, Медок, элиты 355/106, 355/37 и многие другие колонны на втором урожае дают по 7-15 яблок, в третьем − 25-40. Урожай же этих деревьев в четырех − пятилетнем возрасте с одной сотки составляет около 1 тонны яблок, а при очень хорошем уходе − до 4 тонн. Обычно на одной сотке мы выращиваем по 200 саженцев яблонь колонновидного типа рядами, на расстоянии 40 см в ряду и 90 см между рядами”. Несмотря на высокую стоимость саженцев, затраты на посадку и уход, такой сад уже на третий год окупает все расходы (Петренко, 2011). 40 ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ, ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Цель и задачи исследования Целью получения исследования регенерантов было из разработать эксплантов эффективные различного методы происхождения колонновидных слаборослых генотипов яблони в культуре in vitro. Для реализации поставленной цели решались следующие задачи: 1. Изучить влияние генотипа, состава питательных сред, стадии развития пыльцы, холодовой предобработки пыльников на андрогенез in vitro. 2. Выделить генотипы с высоким андрогенетическим потенциалом. 3. Подобрать условия успешной стерилизации листовых эксплантов в культуре in vitro. 4. Индуцировать в культуре листовых эксплантов морфогенетические процессы. 5.Определить факторы культивирования, обеспечивающие высокую эффективность микроклонального размножения. 6. Разработать условия для активного размножения и укоренения in vitro 7. Определить морфогенетический потенциал колоновидных слаборослых генотипов яблони 8. Усовершенствовать условия адаптации растений-регенерантов к открытому грунту. 41 2.2. Материалы и методы исследования Работа проводилась в 2008-2012 годах в Государственном научноисследовательском учреждении Всероссийский научно- исследовательский институт генетики и селекции сельскохозяйственных культур им. И. В. Мичурина в лаборатории биотехнологии. Материалами исследования служили пыльники, листовые пластинки и диски, апикальные и латеральные почки 8 перспективных форм яблони, полученных на основе гибридизации высокозимостойких форм селекции ВНИИГиСПР им. И. В. Мичурина (32-26, 18-9) производных от Якутской1 с колонновидными формами селекции Кичины КВ-25, КВ-5, а также со слаборослыми карликовыми формами (7-22, 9-26, 5-24). Таблица 2.2.1. – Биологические объекты исследования Форма Происхождение I 32-26×зеленый карлик II 32-26×7-22 III 9-26×32-26 IV 32-26×5-24 V 32-26×5-24 VI 18-9×5-24 VII 7-22×32-26 VIII 32-26×5-24 42 Рис.1. Колонновидные формы яблони в период цветения. В экспериментах по введению in vitro изолированных апексов, листовых эксплантов, их культивированию, приготовление питательных сред, их общепринятые специальные руководства которые стерилизацию, Р. Г. включали применяли Бутенко (1983), Ф.Л. Калининой с соавт. (1980). Все работы, связанные с андрогенезом in vitro, курировала научный сотрудник О. Я. Олейникова. 43 Особое внимание уделяли стерильности на всех этапах работы. Посуду тщательно мыли в теплой воде с моющим средством, промывали несколько раз под проточной водой, а затем дистиллированной. Вымытую посуду стерилизовали сухим жаром в сушильном шкафу в течение 2-3 часов, а инфицированную – в автоклаве 30-40 мин при 2 атм. Работу с пыльниками проводили на различных стадиях развития пыльцы. Для определения стадии пыльцы использовали временные ацетокарминовые давленные препараты. Вычленяли препаровальной иглой пыльники и помещали в каплю ацетокармина на предметное стекло, затем накрывали покровным стеклом и осторожно раздавливали. Препарат рассматривали под микроскопом (Сarl Zeiss Jenamed variant) под малым и большим увеличением. Стадию пыльцы также определяли по внешнему виду и размеру бутона. Собранные бутоны содержали в чашках Петри, на внутреннюю поверхность которых помещали смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу. Для усиления регенерационных процессов бутоны яблони подвергали воздействию низких положительных температур +3º…+5ºС от 0 до 9 суток. Все манипуляции по введению пыльников, листовых эксплантов, меристем, пересадки растительного материала проводили с соблюдением строгой асептики в ламинар-боксах BIO-M и ВНМ (Италия). При культивировании пыльников применяли модифицированные среды, которые содержали макро-, микросоли и витамины по прописи Мурасиге-Скуга (МС) (1962). В эти среды дополнительно включали физиологически активные вещества (ауксины, цитокинины) в различных концентрациях и соотношениях. Для стимуляции процессов каллусообразования в инициальные питательные среды вносили следующие ауксины: ИМК, 2,4-Д, ИУК, НУК в концентрациях от 0,5 до 1 мг/л. Из цитокининов применяли 6-БАП, 44 кинетин 1,0-4,0 мг/л. Концентрация сахарозы составляла 20-30 мг/л, агара 5,6-6,0 г/л. Всего было испытано 7 вариантов инициальных питательных сред для индукции андрогенных каллусов. Пробирки с посеянными пыльниками содержали в полной темноте при температуре +24º±2ºС и влажности 60-70%. В дальнейших экспериментах температура и влажность оставались такими же. Ревизии на каллусообразование проводили с интервалом 1-1,5 месяца. Всего было проведено 3 ревизии. Пробирки с образовавшимися андрогенными каллусами помещали в условия 16-ти часового фотопериода, с интенсивностью освещения 15002000 люкс. Через 7-8 дней полученные каллусы переносили на среды для морфогенеза, которые содержали: ауксины (ИУК, ИМК) в концентрации 1 мг/л, цитокинины (6-БАП, кинетин) от 0,5 до 8 мг/л, ГК 1 мг/л. Всего было испытано 7 сред для морфогенеза андрогенных каллусов. Культивирование листовых эксплантов проводили следующим образом. Сбор листьев осуществляли во второй половине мая, по возможности в первой половине дня в сухую солнечную погоду. С молодых побегов брали первые три настоящих листочка, размер которых составлял не более 1,5 см. Все объекты, взятые из природы, как известно, на этапе введения требуют отработки методики стерилизации. Перед стерилизацией листья промывали в мыльном растворе, затем в течение часа в проточной воде и споласкивали дистиллированной для снижения количества поверхностной микрофлоры. Так как листовые пластинки яблони имеют поверхностное опушение, то процесс промывания проводился с особой тщательностью. В качестве стерилизующих агентов в экспериментах использовали гипохлорит натрия («Белизна»), который 45 соединяли со стерильной дистиллированной водой в объемном соотношении 1:1,5 и 1:1, 6% гипохлорит кальция Са(ClO)2 и 0,1 % раствор хлорида ртути (сулема). Экспозицию обработки определяли эмпирически в зависимости от размера и возраста экспланта. Растительный материал держали в растворе стерилизатора от 40 секунд до 8 минут. После обработки материал промывали 3 раза стерильной дистиллированной водой по 10 минут в каждой порции. Подготовленный таким образом растительный материал помещали на питательные среды. В наших опытах были использованы среды для каллусогенеза и прямого морфогенеза. Минеральной основой всех сред служила среда МС. Каллусогенная среда дополнительно включала: ИУК 0,5 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, кинетин 0,5 мг/л, сахароза 20мг/л. Для индукции морфогенеза использовали 3 среды, которые содержали: ИУК 0,7-1 мг/л, ИМК 0,5-1 мг/л, 6-БАП 2-6 мг/л, сахароза 20-40 мг/л. Как и пыльники, листовые экспланты содержали вначале в темноте, а после образования первичных структур (каллусов и почек) их выставляли на свет. По мнению ряда авторов S. Pedieri, F.F. Malavasi (1983), F. Fasolo et al. (1989), Р. Г. Бутенко (1990) содержание эксплантов первое время в темноте повышает регенерацию из листьев, а также стимулирует стеблевой органогенез in vitro. Затем переносили на среды для морфогенеза (каллусы), в случае образования почек на среду размножения (МС с 1 мг/л ИУК и 2 мг/л 6-БАП). Для введения в культуру in vitro апикальных и латеральных почек использовали молодые побеги, вышедшие из состояния глубокого покоя в феврале-марте, а также непосредственно с вегетирующего растения в весенний период (конец апреля - начало мая). Молодые побеги отмывали мылом и щеткой под проточной водой, протирали спиртом. Затем непосредственно в условиях стерильного бокса выделяли апикальные и латеральные почки с помощью скальпеля, оставляя при этом «пятку», и 46 помещали в чашки Петри со стерильной дистиллированной водой, добавляя аскорбиновую кислоту для предотвращения выделения фенолов. Размер эксплантов составлял 6-8 мм. В качестве стерилизующих агентов мы использовали те же вещества, что и при стерилизации листовых эксплантов. Посев апикальных и латеральных почек проводили на среды с минеральной основой МС. Всего было испытано 2 среды: 6-БАП 0,5-2 мг/л, ИУК 0,5-1 мг/л. Пробирки с почками помещали в условия 16-ти часового фотопериода, с интенсивностью освещения1500-2000 люкс. Через 20-30 дней при образовании регенерантов пересаживали на среду размножения (МС с 1 мг/л ИУК и 2 мг/л 6-БАП). 47 ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO ПЫЛЬНИКОВ ЯБЛОНИ С целью разработки методики получения андрогенных образований было проведено культивирование in vitro пыльников 8 генотипов колонновидных форм яблони. Установлено, что развитие пыльников у всех генотипов проходило по пути образования каллусной ткани, т. е. косвенный андрогенез, образование эмбриоидов не наблюдали. Каллусогенез, таким образом, является важной промежуточной стадией на пути получения из пыльников регенерантов. В связи с этим, были изучены факторы, оказывающие влияние на процесс каллусообразования. Наиболее важными из них являются генотип донорного растения, состав культуральной среды, стадия развития пыльцы. 3.1. Генотип растений-доноров Известно, что на процесс каллусообразования большое влияние оказывает генотип исходных растений-доноров пыльников. Это наглядно показано в исследованиях, проведенных на однолетних культурах. Так, у пыльников риса степень индукции каллуса в зависимости от вида варьировала от 0 до 11,8% (Ding-Yu-mei, Cheng Zai-quan et al., 2003). У яровой мягкой пшеницы в зависимости от способности пыльников образовывать in vitro андроклинные структуры (эмбриоиды, каллусы) были выделены сорта с высокой (20-30%), средней (10-19%) и низкой (0-9%) отзывчивостью пыльников (Золотов, 2003). В исследованиях, проведенных на различных гибридах пшеницы, установлено, что гены, отвечающие за выход андроклинных структур, действуют, как аддитивные или комплиментарные. Это свидетельствует о генетической детерминации данного признака (Золотов, Круглова, 2002). Китайские исследователи (Li 48 Wei-dong, Ge Hui-do et al., 2004) выделили три типа каллусов, полученных из пыльников земляники. Среди них наиболее ценным был эмбриогенный тип, в котором индуцировали эмбриоиды. Однако данный этап у плодовых растений, в частности яблони, изучен недостаточно. В результате чего, были изучены факторы, оказывающие влияние на процесс каллусообразования. У яблони андрогенные образования (каллусы, эмбриоиды) были получены лишь у отдельных сортов и не всегда с высокой частотой (Савельев, Олейникова, 1998; Höfer, 1999). Колонновидные формы яблони в этом отношении не изучены. В связи с этим необходимо было выяснить их способность к индукции андрогенных образований и разработать методику получения таких структур. Реакция пыльников у изученных генотипов была не одинакова. Частота каллусообразования колебалась от 27,6 до 17,5% (Сводная за 3 года табл. 3.1.1). Наибольшая каллусогенная активность была у I, V генотипов, частота Таблица 3.1.1. – Влияние генотипа яблони на каллусогенную активность пыльников (2009-2012 гг.) Посеяно пыльников, шт. шт. % I 693 191 27,6±1,70 V 547 147 26,9±1,90 IV 699 173 24,7±1,63 VII 546 134 24,5±1,84 III 563 136 24,2±1,81 VIII 529 104 19,7±1,73 II 650 116 17,8±1,50 VI 594 104 17,5±1,56 Генотип Получено каллусов 49 Группа по активности каллусообразования Высокая Средняя образования каллусов у них составила около 27%. Наименьшая способность отмечена у форм II, VI (17%). В целом, все изученные нами колонновидные формы яблони по изученному показателю мы условно распределили в две группы: с высокой (более 20%) и средней (менее 20%) каллусогенной активностью пыльников. Первая группа оказалась более многочисленной, в нее вошли пять форм, во вторую – остальные три. Таким образом, проведенные исследования показали, что генотип исходных растений-доноров пыльников колонновидных форм яблони оказывает большое влияние на степень индукции каллусов. Выделено пять генотипов с высокой (более 20%) и три со средней (менее 20%) отзывчивостью пыльников. 3.2. Влияние условий формирования пыльников in vivo донорных растений яблони на индукцию андрогенеза in vitro Процесс индукции новообразований в культуре пыльников колонновидных форм яблони, как показали исследования, в значительной степени зависит от генотипа донорного растения. Однако проведенные исследования и литературные данные свидетельствуют о том, что в общем варьировании данного признака большая роль принадлежит не только генотипу, но и факторам внешней среды в период формирования пыльников, у однолетних растений – периодом выращивания донорных растений. Установлено, что факторы внешней среды влияют на физиологические процессы, которые опосредованно могут способствовать повышению или уменьшению андрогенетической реакции пыльников (Сатарова, Черноусова, 2003). Сведения о влиянии внешней среды и, в частности, погодных условий через донорное растение на андрогенез in vitro не многочисленны и относятся они к однолетним культурам. Исследователями было показано, что на индукцию андрогенных новообразований через донорное растения влияют температурные режимы и сумма осадков в определенные периоды 50 времени (Сатарова, Столяренко, Бондарь 1996; Afele, Kannenberg, Keats et al. 1992). Анализ полученных данных об активности каллусообразовательного процесса у пыльников колонновидных форм яблони за 2009-2012 гг. показал неодинаковую реакцию генотипов в разные годы. У половины изученных колонновидных форм яблони (I, III, IV, VII) самая высокая каллусогененная активность пыльников (34,2-46,9%) отмечена в 2009 году (табл. 3.2.1) Таблица 3.2.1. – Активность каллусообразования у пыльников яблони в 2009-2012 гг. Генотип Образовалось каллусов, % 2009 2010 2011 2012 I 42,8±2,97 16,0±4,23 20,2±2,97 14,6±2,82 II 18,9±2,59 30,9±3,96 5,4±1,86 16,7±3,19 III 46,9±4,14 13,8±3,30 15,4±2,73 19,4±3,42 IV 43,0±3,23 19,8±3,62 9,1±2,05 20,5±3,34 V 29,0±3,52 9,6±2,89 38,8±4,05 25,0±3,77 VI 15,4±2,50 24,2±3,85 10,2±2,79 18,1±3,21 VII 34,2±3,93 7,6±2,20 17,9±3,31 17,4±3,45 VIII 20,8±3,27 8,4±2,15 39,7±4,54 13,0±3,51 Эти генотипы, а также формы V и VIII, показали наиболее низкую активность каллусообразовательного процесса (7,6-16,0%) в 2010 году. У формы IV дальнейшее его снижение наблюдалось и в 2011 году. Только у двух генотипов – II и VI − в 2010 году активность каллусогенеза возросла в 1,5 раза и была самой высокой. Однако в 2011 году они показали наименьшую частоту каллусообразования – 5,4 и 10,2% соответственно. В 2012 году этот показатель у колонновидных форм имел более выровненные, чем в предыдущие два года значения, максимально низких показателей не отмечено. Лучшую способность не только восстанавливать, но и повышать 51 андрогенную активность пыльников, после воздействия на донорные растения экстремальными факторами внешней среды показали формы V и VIII, которые в 2011 году вышли на свою самую высокую активность каллусообразования. Чтобы объяснить полученные результаты, мы проанализировали основные показатели погодных условий с апреля по август 2009-2012 гг., то есть месяцы наиболее активной вегетации плодовых растений: апрель – начало вегетации и закладки генеративных органов, в том числе пыльников; в мае, преимущественно в первой его половине, у яблони проходят основные, завершающие этапы микроспорогенеза, в результате которых образуется одноядерная (микроспоры), двуядерная и полностью сформированная пыльца. Именно в этот период мы собирали бутоны и вводили пыльники в условиях in vitro. Летние месяцы – период наибольшей активности всех физиологических процессов у плодовых растений, которые оказывают основное влияние на их общее состояние, с которым они переходят осенью в период покоя, зимуют, а весной пробуждаются. Для характеристики погодных условий указанных выше месяцев мы взяли три температурных показателя, а также данные по количеству выпавших осадков и относительной влажности воздуха (табл. 3.2.2). Анализ этих данных показал, что температурные режимы апреля резко не отличались по годам, а по количеству осадков самым влажным был апрель 2012 года. Май и летние месяцы 2010 года по температурным показателям были самыми жаркими, а лето экстремально жарким за все годы наблюдений. Максимальные температурные значения превышали 40ºС, в то время, как в другие годы этот показатель не превышал 35ºС. Средняя температура воздуха составила 24,9ºС, в другие годы она доходила только до 21ºС. Летний период 2010 года был также самым сухим за все годы исследований. Сумма выпавших осадков составила всего 41 мм, а относительная влажность воздуха 49,0%, в другие годы эти показатели были соответственно 189,2-253,9 мм и 62,3 – 68,0%. 52 Таблица 3.2.2. – Метеоданные за апрель-август 2009-2012 гг. Год Месяц Средняя tºС воздуха 2009 Апрель 6,3 12,4 Май 14,8 Июньавгуст Апрель 2010 2011 2012 Средняя Максимальная максимальная tºС tºС Осадки, мм Относительная влажность, % (средняя) 26,3 16,6 54,0 21,4 23,8 43,7 55,0 19,2 25,3 33,7 189,2 68,0 8,6 14,6 20,2 11,2 61,0 Май 19,3 26,4 29,7 43,9 50,4 Июньавгуст Апрель 24,9 31,7 40,6 41,0 49,0 8,6 14,5 20,2 11,2 59,2 Май 16,9 23,0 25,0 50,6 57,0 Июньавгуст Апрель 21,4 27,3 35,0 253,9 62,3 10,2 16,0 20,3 45,5 74,8 Май 17,0 24,1 28,7 10,0 52,8 Июньавгуст 20,1 26,8 33,9 239,6 65,8 Таким образом, как показали исследования, на андрогенную активность пыльников яблони, наряду с такими основными факторами как генотип, состав культуральных сред, оказывают также влияние погодные условия месяца сбора бутонов (мая), а также летнего периода года, предшествующего сбору бутонов. Экстремально высокие температуры, низкая относительная влажность воздуха и минимальное количество осадков в эти периоды значительно снижают выход андрогенных каллусов у большинства генотипов яблони. Сорта яблони восстанавливают свое физиологическое состояние через год после экстремальных погодных условий, косвенным подтверждением этого является повышение каллусогенной активности их пыльников, которое произошло в 53 2012 году. Среди изученных колонновидных форм яблони следует отметить формы V и VIII, которые сразу после экстремального 2010 года, т.е. уже в 2011 году, показали свою самую высокую активность каллусообразования. 3.3. Стадии развития пыльцы В исследованиях, проведенных в основном на однолетних сельскохозяйственных культурах, было установлено, что эффективность андрогенеза in vitro в значительной степени зависит от стадии развития пыльцы в момент введения пыльников в культуру. Для большинства растений наиболее вакуолизированных благоприятной микроспор, на является которой стадия отмечается сильно эмбрио- и каллусогенез, а иногда и формирование растений (Круглова, Горбунова, Батыгина, 1993; Куксо, 2003; Тюкавин, Наумова, 2006; Шмыкова, 2006; Бобков, 2010). У некоторых культур лучшие результаты дает культивирование пыльников с двуядерной пыльцой (Шамина, 1981; Атанасов, 1993). Такие исследования были впервые проведены на колонновидных слаборослых генотипах яблони. В исследованиях при изучении влияния на андрогенез in vitro стадии развития пыльцы большое внимание было уделено отбору бутонов, предназначенных для культивирования пыльников. При этом учитывали время сбора, размер бутонов, условия их хранения до инокуляции пыльников, проводился также обязательный цитологический контроль стадии развития пыльцы путем приготовления временных ацетокарминовых препаратов. Было установлено, что бутоны яблони размером 6-8 мм, которые имеют слабо выраженный бело-розовый конус, как правило, содержат микроспоры от средней до поздней вакуолизированных стадий развития (рис.2). Пыльники большинства изученных нами генотипов на этой стадии 54 имеют окраску от зеленоватой (форма V) до светло-желтой (VI), у некоторых – с легким розовым оттенком (VII). . VI VII 55 V Микроспора Рис. 2 Бутоны колонновидных форм яблони (VI, VII, V) с пыльниками на стадии микроспор. Зеленые бутоны размером менее 6 мм имеют пыльцу на стадии тетрад. У бутонов с большим бело-розовым конусом и размером более 8 мм присутствует в основном двуядерная пыльца (рис. 3). Рис. 3 Бутоны колонновидной яблони (форма VII) с двуядерной пыльцой. Культивирование in vitro пыльников с разными стадиями развития проводили у форм IV, VI, VII, VIII на среде С6: ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 мг/л и 6-БАП -1,0 мг/л. На всех испытанных стадиях были получены каллусы (табл. 3.3.1). 56 Таблица 3.3.1. − интенсивность каллусообразования пыльников яблони в зависимости от стадии развития пыльцы в условиях in vitro (2011-2012 гг.) Стадии развития пыльцы тетрады микроспора двуядерная Форма посеяно пыльников, шт. получено каллусов, % посеяно пыльников, шт. получено каллусов, % посеяно пыльников, шт. получено каллусов, % IV 235 17,2±2,07 313 34,5±2,69 284 31,3±2,75 VI 136 10,7±2,65 279 16,8±2,24 238 14,2±2,26 VII 176 12,5±2,04 191 31,4±3,36 148 24,6±5,54 VIII 116 7,2±2,40 202 24,3±3,02 163 15,7±2,85 Наибольшее их количество у всех генотипов отмечено на стадии микроспор и составило от 16,8% (форма VI) до 34,5% (IV). Наименьший выход каллусов получен при культивировании пыльников на стадии тетрад от 7,2% (форма VIII) до 17,2% (IV). Двуядерная стадия развития по этому показателю заняла у всех форм промежуточное положение. Частота каллусообразования на этой стадии колебалась от 14,2 (VI) до 31,3% (IV). Таким образом, установлено, что культивирование пыльников колонновидных форм яблони следует проводить на стадии микроспор c размером бутонов от 6 до 8 мм. 3.4. Инфицированность пыльников яблони в условиях in vitro Известно, что стерилизация бутонов, предназначенных для инокуляции пыльников, может отрицательно сказаться на их дальнейшем поведении в условиях in vitro. В связи с этим, при проведении исследований использовали нестерильные бутоны. Важным преимуществом использования нестерильных бутонов является отсутствие побочного, отрицательного действия стерилизующих факторов на пыльники, а также экономия времени и 57 материальных затрат. инфицированности солнечную Чтобы пыльников погоду, не сбор ранее 11 избежать высокого бутонов проводили часов утра. уровня в сухую Инфицированность пыльников, посеянных из таких бутонов в условиях in vitro, по данным исследований, в большинстве случаев не превышал 10 %, а у некоторых форм в отдельные годы полностью отсутствовала (табл. 3.4.1). Таблица 3.4.1. − Инфицированность пыльников in vitro колонновидных форм яблони (%) Годы Форма Всего, % 2009 2010 2011 2012 II 0 0 9,5±2,41 0 2,2±0,58 VII 5,5±1,89 6,9±2,10 0 0 3,3±0,76 III 13,1±2,80 11,0±2,99 0 6,0±2,05 6,0±1,00 I 4,0±1,16 33,3±5,44 0 8,9±2,27 7,2±0,98 VIII 5,2±1,79 8,4±2,15 9,5±2,72 7,4±2,73 7,6±1,15 V 10,2±2,35 9,6±2,89 4,8±1,78 7,6±2,31 8,0±1,16 IV 26,8±2,89 14,9±3,24 5,1±1,57 0 13,0±1,27 VI 15,4±2,50 33,9±4,25 37,3±4,45 8,3±2,30 21,9±1,70 10,1±0,76 13,4±1,09 4,8±0,65 8,7±1,76 Всего 7,1±0,74 Так у формы II не было инфицированных пыльников в 2009, 2010, 2012 гг., у III формы – в 2011 г., у IV – в 2012, и у VII – в 2011 и 2012 гг. У форм V, VI,VIII инфицированность отмечена во все годы наблюдений (рис.4). 58 Рис. 4 Инфицированность пыльников колонновидных форм яблони в условиях in vitro за 2009-2012 гг. Наибольшей, она была у формы VI и составила в среднем 21,9%, а наименьшей – у II (2,2%) и VII (3,3%). Были отмечены как бактериальная, так и грибная микробиоты. Для форм с высокой инфицированностью пыльников следует использовать дополнительные стерилизаторы. Полученные данные свидетельствуют о том, что генотип исходных растений яблони влияет не только на андрогенетические процессы, но и на степень инфицированности пыльников в условиях in vitro. Лучшими в этом отношении являются колонновидные формы II и VII, у которых инфицированность пыльников была минимальной. Для форм с генетически высоким уровнем инфицированности, а также в годы, когда в период взятия бутонов влажность воздуха превышает 60%, следует использовать их стерилизацию водным раствором гипохлорита натрия (5-9%) в течение 7-10 минут, а затем промывать в 4-5 сменах стерильной дистиллированной воды и подсушивать на стерильных бумажных фильтрах (Савельев, Жуков, Олейникова, 1990). Основным моментом данного процесса является отрицательное действие стерилизующих факторов на пыльники. 59 3.5. Холодовая предобработка пыльников Для (каллусов, повышения частоты эмбриоидов) в образования культуре андрогенных изолированных используют различные методические приемы, является холодовая предобработка – структур пыльников одним из которых воздействие низкими положительными температурами (+3º…+5оС) на бутоны до инокуляции из них пыльников. Ее продолжительность видоспецифична и может варьировать в широких пределах – от 1 до 15-ти и более суток. (Sunderland et al., 1997; Xynias et al., 2000, 2001; Абрамов, 2001; TrejoTapia Gabriela et al., 2002; Галиева и др., 2005; Лозариду и др., 2005). В то же время некоторые авторы (Александрова, Лукьянюк, 1991) указывают на отсутствие стимулирующего влияния холодовой предобработки пыльников на выход андрогенных образований. У таких плодовых культур, как яблоня, данный вопрос изучен недостаточно. В данной работе у 4-х колонновидных форм было изучено влияние продолжительности предобработки пыльников низкими положительными температурами (+3º…+50С) на их андрогенную активность. Были испытаны следующие экспозиции холодовой предобработки: 0 (контроль), 1, 3, 6 и 9 суток (табл.3.5.1). Предобработку пыльников проводили накануне их введения в культуру in vitro. С этой целью бутоны помещали в чашки Петри и содержали в холодильнике при t = +3º…+5ºС. Во всех вариантах опыта отмечено каллусообразование, однако активность его была различной. У форм VI и VII при всех экспозициях холодовой предобработки наблюдалось снижение каллусообразования. Наиболее значительным оно было в варианте 6 суток. У форм IV отмечена стимуляция активности данного процесса. Значительной она была в варианте 1 сутки (23,8 %). У формы VIII экспозиция 1 сутки и трое суток вызывали значительное снижение каллусогенеза (22,9 %), а в варианте 6 суток эти значения были близки к контролю. Таким образом, 60 влияние холодовой предобработки на каллусогенную активность пыльников зависит от конкретного генотипа, оно может оказывать, как положительное, так и отрицательное влияние. Таблица 3.5.1. – Влияние холодовой предобработки пыльников на каллусогенез яблони в условиях in vitro (2011-2012гг.) Генотип Экспозиция, (сутки) IV 0 Посеяно пыльников, шт. 110 1 101 24 23,8±4,24 3 130 20 15,4±3,17 6 79 10 12,7±3,75 9 96 12 12,5±3,38 0 61 16 26,2±5,63 1 71 15 21,1±4,84 3 70 15 21,4±4,90 6 66 12 18,2±4,75 9 68 14 20,6±4,90 0 98 38 38,8±4,92 1 118 30 25,4±4,01 3 84 20 23,8±4,65 6 102 23 22,6±4,14 9 78 22 28,2±5,09 0 79 22 27,9±5,05 1 83 19 22,9±4,61 3 72 21 29,2±5,36 6 73 28 38,4±5,69 9 69 27 39,1±5,87 (32-26×5-24) VI (18-9×5-24) VII (7-22×32-26) VIII (32-26×5-24) 61 Получено каллусов шт. % 20 18,2±3,68 У колонны VIII снижение было только в варианте 1 сутки, во всех остальных наблюдалось повышение частоты каллусообразования, самым высоким (в 1,4 раза) оно было при экспозиции 9 суток (39,1 %). Таким образом, в результате проведенных исследований было показано, что холодовая предобработка пыльников у одних генотипов колонновидных форм яблони стимулирует процесс каллусообразования, а у других снижает его активность. 3.6. Подбор питательных сред для индукции каллусогенеза Известно, что одним из наиболее важных факторов успешной индукции в пыльниках андрогенных новообразований, наряду с генотипом, является определенный минеральный и гормональный состав питательных сред, т.е. их качественное и количественное содержание. Существует много модификаций питательных сред, состав которых приводится в методической и справочной литературе (Бутенко, 1964; Гродзинский, 1973; Калинин и др. 1980), но наиболее часто для культивирования изолированной пыльцы и пыльников в качестве минеральной основы используют среду МС дополненную биологически активными веществами в различных концентрациях и соотношениях. В качестве индукторов андрогенетических процессов в среды включают ауксины и цитокинины. Из ауксинов чаще всего используют ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК; цитокининов – кинетин, 6-БАП (Атанасов, 1993; Хамукова, 1994; Сорока, 2004; Тюкавин, 2006; Муравлев, 2007; Yan Li-Xia, ChunGen et al., 2007). Выбор необходимой комбинации фитогормонов для культивирования пыльников in vitro зависит от вида растений и задач проводимых исследований. В данных исследованиях для культивирования пыльников колонновидных форм и слаборослых генотипов яблони с целью получения первичных андрогенных образований (каллусов, эмбриоидов) 62 в качестве минеральной основы использовалась среда МС, дополненная ауксинами и цитокининами. В качестве ауксинов были испытаны ИУК, 2,4-Д, ИМК, цитокининов – кинетин и 6-БАП. Всего было испытано 7 вариантов питательных сред с различным соотношением в них ауксинов и цитокининов. Испытанные среды имели следующий гормональный состав (мг/л, ауксин : цитокинин) (табл. 3.6.1): Таблица 3.6.1. – Гормональный состав инициальных питательных сред для колонновидных форм яблони Название среды С1 С2 С3 С4 С5 С6 С7 Гормональный состав (мг/л) ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК по 1 ,0; кинетин и 6-БАП по 2,0 ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК по 1 ,0; кинетин и 6-БАП по 4,0 ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК, кинетин и 6-БАП по 1,0 ИУК 3,0, 2,4-Д 1,0 кинетин 2,0 и 6-БАП -1,0 Соотношение ауксин : цитокинин ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0 3:1 ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 и 6-БАП - 1,0 ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК и 6-БАП – 1,0 1,5:1 1:1 1:2 2:1 1,3:1 4:1 Такой подбор биологически активных веществ обусловлен тем, что, как известно, преобладание в питательных средах ауксинов способствует образованию каллусных тканей, а повышенное содержание цитокининов может привести к образованию эмбриоидов. На данных средах провели культивирование колонновидных форм яблони – IV, VI, VIII, VII (табл.3.6.2). 63 пыльников 4-х Таблица 3.6.2. – Эффективность каллусогенеза пыльников различных генотипов яблони в зависимости от гормонального состава питательных сред Порода, генотип Среда (ауксин/цитокинин) Посеяно пыльников, шт. Получено каллусов, % 1 2 3 4 Активность нарастания каллусной массы, (балл) 5 С1 (1:1) 168 19,1±3,03 2,0 С2 (1:2) 144 13,9±2,88 1,0 С3 (2:1) 156 14,1±2,79 2,5 С4 (1,3:1) 156 9,0±2,29 1,5 С5 (3:1) 148 32,4±3,85 4,2 С6 (1,5:1) 128 23,4±3,74 2,7 С7 (4:1) 118 40,7±4,52 3,4 С1 128 21,9±3,65 2,5 С2 122 31,1±4,19 3,7 С3 102 33,3±4,67 3,0 С4 142 21,1±3,42 3,5 С5 148 33,8±3,89 2,9 С6 138 23,2±3,59 4,3 С7 102 14,7±3,51 3,0 С1 94 31,9±4,81 4,0 С2 138 14,4±3,00 3,0 С3 104 23,1±4,13 2,7 С4 86 25,3±4,69 4,5 С5 98 36,7±4,87 3,9 С6 102 37,3±4,79 4,8 С7 154 36,4±3,88 4,0 IV VI VII 64 Продолжение таблицы 3.6.2 1 VIII 2 3 4 5 С1 98 26,5±4,46 4,0 С2 90 33,3±4,97 4,8 С3 116 15,5±3,36 2,3 С4 84 16,7±4,07 4,0 С5 78 23,1±4,77 4,0 С6 88 56,8±5,28 5,0 С7 114 14,0±3,25 3,8 На всех средах у изученных генотипов были получены андрогенные каллусы (непрямой андрогенез), случаев образования эмбриоидов (прямой андрогенез) отмечено не было. Выход каллусов составил – от 9,0% (IV) до 56,8% (VIII). По выходу андрогенных каллусов и по активности нарастания их массы были выделены две наиболее продуктивные питательные среды: С6 (с соотношением ауксин : цитокинин, равным 1,5:1) и С5 (3:1). Среда С6 показала высокие результаты у генотипов VII и VIII, а С5 у форм IV и VI. Для формы IV самый высокий показатель по выходу каллусов был на среде С7, однако по нарастанию каллусной массы эта среда уступала среде С5. Основные физические условия культивирования in vitro пыльников яблони включали содержание пробирок с посеянными пыльниками в темноте при t = 24º-260С и относительной влажности воздуха 60-70%. Другие физические параметры отрицательно сказывались на андрогенной активности пыльников. Так, температурные режимы выше указанных, приводили к быстрому потемнению образовавшихся каллусов и их гибели. 65 Таким образом, в результате проведенных исследований подобраны наиболее эффективные для культивирования пыльников колонновидных форм яблони каллусоиндуцирующие питательные среды с соотношением ауксин : цитокинин равным 3:1 (С5), 1,5:1 (С6). В дальнейшей работе среды С5 и С6 использовались для получения андрогенных каллусов у всех восьми включенных в исследования колонновидных форм и слаборослых генотипов яблони. Полученные за ряд лет данные показали, что все генотипы на этих средах образуют каллусы с частотой от 16,1 до 33,1 % (табл. 3.6.3). Таблица 3.6.3 – Влияние состава питательных сред (С6 и С5) на каллусогенную активность пыльников яблони (2009-2012 гг.) шт. % 2 С6 Посеяно пыльников на среды, шт. 3 348 4 109 5 31,3±2,49 С5 345 82 23,8±2,30 С6 334 64 19,2±2,12 С5 316 52 16,5±2,09 С6 285 72 25,3±2,57 С5 278 64 23,0±2,52 С6 345 97 28,1±2,42 IV С5 354 76 21,5±2,18 V С6 281 59 21,0±2,43 С5 266 88 33,1±2,88 Название формы 1 I II III Среда 66 Образовано каллусов Продолжение таблицы 3.6.3 1 VI VII VIII 2 С6 3 311 4 55 5 17,7±2,16 С5 283 49 17,3±2,25 С6 274 65 23,7±2,57 С5 272 69 25,4±2,64 С6 287 65 22,6±2,47 С5 242 39 16,1±2,36 У форм I, II, IV, VIII показатели по выходу каллусов были несколько выше на среде С6 у V, VII - С5 . VI форма показала одинаковую каллусогенную активность пыльников на обеих средах (рис.5). С5 С6 Рис. 5 Андрогенные каллусы, полученные на средах С5 и С6. В целом следует отметить, что для получения андрогенных каллусов у колонновидных слаборослых генотипов яблони можно использовать, как 67 среду С5 (ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0 мг/л), так и среду С6 (ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 мг/л и 6-БАП - 1,0 мг/л). 3.7. Морфологические особенности андрогенных каллусов В ходе исследований была проведена морфологическая оценка андрогенных каллусов восьми колонновидных форм яблони полученных на 7 питательных средах различного состава. Основными ее критериями служили: окраска, плотность, активность нарастания каллусной массы (табл. 3.7.1). Установлено, что наибольшее количество светлых каллусов, быстро зеленеющих на свету образуется на средах С4 и С7, их выход составил о 81,8 до 100%. Часть полученных каллусов со временем быстро темнела. Таких каллусов больше всего отмечено на средахС1 и С2 (более 50%) Эти каллусы были малоспособными к дальнейшему развитию (рис.6). Таблица 3.7.1 – Морфологические особенности андрогенных каллусов колонновидных форм яблони в зависимости от гормонального состава инициальных питательных сред Окраска Форма Среда темная, % светлая, % рыхлые, % плотные, % 1 2 С1 3 55,0 4 45,5 5 1,0 6 99,0 Активность нарастания каллусной массы (балл) 7 4,0 С2 56,5 43,5 0 100,0 4,8 С3 30,0 70,0 0 100 2,3 С4 0 100 0 100 4,0 С5 45,0 55,0 0 100 4,0 С6 37,4 62,6 0 100 5,0 С7 10,0 90,0 0 100 3,8 VIII Тип каллуса 68 Продолжение таблицы 3.7.1 1 VII IV VI 2 С1 3 45,5 4 54,5 5 0 6 100 7 4,0 С2 20,0 80,0 1,2 98,8 3,0 С3 62,1 37,9 0 100 2,7 С4 0 100 0 100 4,5 С5 46,5 54,5 0 100 3,9 С6 25,0 75,0 0 100 4,8 С7 18,2 81,8 0 100 4,0 С1 70,5 29,5 0 100 2,0 С2 82,1 17,9 0 100 1,0 С3 28,8 71,2 0 100 2,5 С4 0 100 0 100 1,5 С5 17,7 82,3 0 100 4,2 С6 42,2 57,8 0 100 2,7 С7 8,4 91,6 1,4 98,6 3,4 С1 33,2 66,8 0 100 2,5 С2 45,9 54,1 0 100 3,7 С3 35,0 65,0 0 100 3,0 С4 5,0 95,0 0 100 3,5 С5 24,8 75,2 0 100 2,9 С6 32,5 67,5 0 100 4,3 С7 12,4 87,6 0 100 3,8 69 Рис. 6 Потемнение каллуса на среде С2 Подавляющее большинство полученных каллусов имело плотную консистенцию. Среди них отмечено небольшое количество (1,0-1,4%) таких, которые с течением времени превращались в рыхлые (рис.7). Такие каллусы наблюдались у форм VIII, VII, VI. Форма VIII Рис. 7 Перерождение плотного каллуса в рыхлый. 70 Отмечали также активность нарастания массы у полученных каллусов. У большинства генотипов (VII, VIII, VI) самые высокие показатели, более 4 баллов, получены на среде С6 у формы IV – С5 (рис.8). С5 С6 Рис. 8 Активность нарастания каллусной массы в зависимости от состава питательных сред. Исследования показали, что активность нарастания каллусной массы не всегда является показателем их морфогенной способности. Таким образом, наибольший выход светлых быстро зеленеющих на свету каллусов способных к дальнейшему морфогенетическому развитию дают среды С5 ,С6. Разработана методика андрогенеза in vitro колонновидных форм яблони, в которой были подобраны условия для получения первичных андрогенных новообразований с частотой от 33,1 до 16,1%. Данная методика включает культивирование пыльников на одноядерной стадии микроспор (размер бутона 6-8 мм), холодовую предобработку пыльников продолжительностью 6, 9 суток и использования для культивирования 2-х питательных сред (С6 и С5) по прописи Мурасиге-Скуга включающая (мг/л): 1) ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 + 6-БАП − 1,0; (1,5:1) 2) ИУК, 2,4-Д, НУК,6-БАП по 1,0 (3:1) 71 ГЛАВА 4. ИНДУКЦИЯ ПРОЦЕССОВ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ ЯБЛОНИ Выращивание изолированных листьев (особенно целых) в нестерильных условиях широко использовалось ранее и используется в настоящее время для решения ряда вопросов. Также значительно возрос интерес к культивированию листовых эксплантов в стерильных условиях (Калинин, Сарнацская, Полищюк, 1980). В отличие от других органов растений, лист в изолированных условиях развивается, как и на интактном растении (Steeves, 1973). Это объясняется тем, что лист является самодифференцирующимся органом и представляет хороший объект для изучения морфогенеза растений в целом. Техника культуры тканей листа используется как метод для размножения определенных видов растений. Большое значение культура изолированных листьев имеет для выделения изолированных протопластов из мезофилла и последующей их гибридизацией с целью получения новых генотипов. Культура сегментов листьев, в том числе яблони, используется для разработки эффективных систем трансформации. В связи с этим, были проведены исследования по культуре in vitro листовых эксплантов колонновидных форм яблони. Были изучены вопросы стерилизации исходного материала, индукции каллусо- и морфогнеза. 4.1. Разработка приемов стерилизации листовых эксплантов и введение их в культуру При проведении биотехнологических исследований, связанных с культурой in vitro, важным этапом является стерилизация исходного растительного материала, взятого из природных условий, так как его поверхностные ткани, заражены грибами и их спорами, а также бактериями. Известны работы по культуре in vitro листовых эксплантов плодовых и ягодных культур (Высоцкий, 2008; Соловых, 2009). Однако у гибридов, 72 колонновидных слаборослых генотипов яблони, такие исследования не проводились. Для стерилизации листовых эксплантов плодовых и ягодных культур используют 0,1%-ный раствор сулемы, время экспозиции варьирует от 2 до 10 минут (Шипунова, 2003), а также перекись водорода, спирт, гипохлорид кальция и др. (Волосевич, 2006). Целью исследований на этапе введения в культуру листовых эксплантов колонновидных форм яблони было разработать методы стерилизации исходного материала. Было установлено, что для всех испытанных стерилизующих агентов («Белизна», гипохлорид кальция) лучшей является экспозиция 5 минут (рис. 9), так как более продолжительная обработка вызывала сильную некротизацию материала и делала его непригодным для дальнейшего использования в экспериментах (рис. 10). Экспозиция меньше 5 минут приводила к сильному инфицированию исходного материала (более 90%). Рис. 9 Листовые экспланты яблони после стерилизации «Белизной» (1:1,5) в течение 5 минут. 73 Рис. 10 Листовые экспланты яблони «Белизной» (1:1,5) в течение 7 минут. Изучение влияния на выход стерильных после стерилизации эксплантов раствора «Белизна» 1:1,5 показало большой разброс показателей в зависимости от исходного генотипа (табл. 4.1.1). Таблица 4.1.1. – Влияние раствора «Белизна» 1:1,5 на выход стерильных эксплантов яблони Заражено, шт. % заражения I Количество эксплантов, шт. 90 4 4,4±2,16 II 90 50 55,0±5,30 III 90 0 0 IV 90 64 71,1±4,78 V 90 5 5,5±2,40 VI 90 54 60,0±5,16 VII 90 0 0 VIII 90 25 27,8±4,72 Всего 720 202 27,5±1,68 Название формы 74 Средний показатель заражения составил 28,1%. Процент заражения колебался от 0 (формы III и VII) до 71,1% (IV). Это указывает на то, что уровень инфицированности зависит не только от стерилизующих агентов, но и от генотипических особенностей исходных форм. «Белизна» в разведении 1:1 давала показатели инфицированности от 35,6% (форма VI) до 78,8% (форма II) (табл. 4.1.2). Таблица 4.1.2. – Влияние стерилизующих агентов на выход стерильных эксплантов яблони («Белизна» 1:1) II Количество эксплантов, шт. 90 IV 90 66 73,3±4,66 VI 90 32 35,6±5,05 VIII 90 34 37,8±5,11 Всего 360 203 56,4±5,23 Номер формы Заражено, шт. % заражения 71 78,8±4,31 При использовании в качестве стерилизующего агента гипохлорида кальция была отмечена наибольшая инфицированность объектов. Процент заражения колебался от 43,3% (форма III) до 75,5% (IX) (табл. 4.1.3). Таблица 4.1.3. – Влияние стерилизующих агентов на выход стерильных эксплантов яблони (6% гипохлорид кальция) I Количество эксплантов, шт. 90 III 90 39 43,3±5,22 V 90 62 68,8±4,88 VII 90 45 50±5,27 IX 90 68 75,5±4,53 Всего 450 276 61,3±5,13 Номер формы Заражено, шт. % заражения 62 68,8±4,88 75 В среднем выход стерильных эксплантов при обработке водным раствором «Белизны» 1:1,5 составил 72,5 %, при соотношении 1:1 – 43,6%, у гипохлорида кальция – 38,7%. (рис.11) Рис. 11 Эффективность различных стерилизующих агентов на листовых эксплантах яблони. Таким образом, для стерилизации листовых эксплантов колонновидных форм яблони перед их введением в культуру in vitro следует использовать раствор «Белизны» в разведении 1:1,5 с продолжительностью обработки в течение 5 минут. Выход стерильных эксплантов составил при этом 72,5%. Установлено, что уровень инфицированности зависит не только от стерилизующих агентов, но и от генотипических особенностей исходных форм. Наименее инфицируются в условиях in vitro листовые экспланты форм III и VII. 4.2. Индукция каллусо- и морфогенеза у различных генотипов яблони Изучали способность листовых эксплантов колонновидных форм яблони к каллусо- и морфогенезу. В качестве культуральных было испытано 10 вариантов сред по прописи МС с добавлением ауксинов и 76 цитокининов в различных соотношениях и следующих концентрациях: ИУК 0,5-1 мг/л, 2,4-Д 1-2 мг/л, НУК 0,5-1 мг/л, кинетин 0,5-1,5 мг/л, 6БАП 1-3 мг/л, ИМК 0,5-1 мг/л. Среди них были выделены наиболее продуктивные. Лучшей для индукции и пролиферации каллусной ткани оказалась среда, содержащая ИУК 0,5 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, кинетин 0,5 мг/л, для органогенеза - ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3мг/л. На среде каллусогенеза листовые экспланты всех изученных генотипов яблони образовали каллусные ткани. Однако интенсивность нарастания каллусной массы была различной (табл. 4.2.1): наибольшая – выше 4 баллов – отмечена у форм III, V, VII, наименьшая (менее 3 баллов) – у форм I, IV, в среднем этот показатель составил 3,6 балла. Листовые каллусы быстро зеленели на свету и имели плотную консистенцию. На среде органогенеза, так же все генотипы образовывали каллусы с такой же активностью нарастания каллусной массы, как и на среде каллусогенеза (табл. 4.2.2). Таблица 4.2.1 – Активность нарастания каллусной массы из листовых эксплантов колоновидных форм яблони на среде каллусогенеза Средний балл нарастания Название формы Посеяно эксплантов I 20 2,6 II 20 4,0 III 20 4,5 IV 20 2,5 V 20 4,5 VI 20 3,0 VII 20 4,5 VIII 20 3,5 IX 20 3,0 Всего 180 3,6 77 каллусной массы Таблица 4.2.2 − Активность нарастания каллусной массы и регенерация из листовых эксплантов колонновидных форм яблони на среде органогенеза Форма, Число Средний балл Регенерация, происхождение эксплантов, нарастания % шт. каллусной массы I 20 2,2 0,0 II 20 4,0 0,0 III 20 4,5 0,0 IV 20 3,0 0,0 V 20 4,3 0,0 VI 20 3,5 0,0 VII 20 4,5 35,0 VIII 20 3,5 15,0 IX 20 3,5 0,0 Всего 180 3,7 5,6 Однако морфология каллусов отличалась: их консистенция была менее плотной, многие имели бугристую поверхность. У форм VII и VIII образовались настоящие почки (35 и 15% соответственно) и развились регенеранты у формы VII. (рис. 12,13,14) 78 Рис. 12 Образование каллуса на среде каллусогенеза Рис. 13 Образование почки на листовых эксплантах яблони 79 Рис. 14 Образование побегов-регенерантов на листовых эксплантах яблони Полученные регенеранты на среде размножения (МС + 2мг/л 6-БАП + 1мг/л ИУК +1 мг/л ГК) образовали дополнительные побеги. Таким образом, в результате культивирования листовых эксплантов колонновидных форм яблони у всех генотипов были на среде каллусогенеза индуцированы каллусы, а у форм VII и VIII на среде органогенеза содержащей ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3 мг/л отмечено образование почек и получены регенеранты (форма VII). 80 ГЛАВА 5. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ Микроклональное размножение – одно из направлений в биотехнологии, которое используется для получения безвирусного посадочного материала, размножения растений, трудно размножаемых традиционными способами. Этот метод позволяет добиваться высоких коэффициентов размножения растений, проводить работы в течение всего года и экономить площади, необходимые для выращивания посадочного материала. Технологии ускоренного микроклонального размножения разработаны достаточно хорошо для многих сельскохозяйственных, плодовых и ягодных растений (Деменко, 2005; Медведева, Поливара, Подорожный, 2011; Райков, 2011; Фролова, 2011). Однако исследования по клональному микроразмножению такой плодовой культуры, как яблоня не так многочисленны (Матушкина, Пронина, 2008). Существующие разработки, как правило, выполнены на определенных генотипах и не всегда дают хороший эффект при использовании их на других формах. Колонновидные формы яблони занимают особое место в ее общем генофонде, так как имеют ряд только им присущих биологических особенностей. Одной из таких особенностей является слабое образование боковых побегов, а в отдельных случаях отмечается даже их отсутствие, это создает трудности в получении достаточного количества посадочного материала при использовании традиционных способов размножения – прививкой и окулировкой. В связи с этим весьма актуальным является разработка метода клонального микроразмножения для данной группы растений. 81 5.1. Возраст и состояние маточных растений, сроки изоляции апикальных почек и их стерилизация Возраст исходных маточных растений имеет определенное значение для успешного микроклонадьного размножения. В связи с особенностями развития колонновидных форм яблони (они образуют мало боковых побегов, а значит и почек), почки, предназначенные для микроклонального размножения, брали в тот период, когда растения имели оптимальные размеры, чтобы не нанести ущерб их общему состоянию. Этот возраст составлял 4-5 лет. Растения-доноры были без видимых признаков поражения грибными и вирусными заболеваниями. Имеет значение также время сбора почек. Ряд исследователей считает, что наиболее благоприятным периодом для введения в культуру in vitro яблони является фаза выхода растений из состояния покоя (февраль-март) (Матушкина, Пронина, 2008; Муратова, 2008). Проведенные исследования показали, что для колонновидных форм яблони лучшие результаты дает введение в культуру in vitro меристем из апикальных почек, собранных в период начала вегетации растений. В зависимости от погодных условий этот период приходится на середину или конец апреля, когда происходит естественное набухание и распускание почек. Меристемы из почек, собранных в марте, не дали положительных результатов, как по выходу стерильного материала, так и по способности к дальнейшему развитию. В культуру in vitro вводили меристематические верхушки размером 0,2-0,4 см, которые изолировали из развивающихся почек, освобождая их от покровных тканей, что обеспечивало достаточно эффективную стерилизацию. В качестве стерилизующего агента использовали 0,1 % раствор ртути (сулемы), было испытано продолжительностью от 40 сек до 1-й мин (табл. 5.1.1). 82 две экспозиции Лучшие результаты по выходу стерильных эксплантов были получены у всех испытанных генотипов при экспозиции 1 мин. В зависимости от конкретного генотипа уровень инфицированности был различен. Наибольший выход стерильных эксплантов отмечен у форм VII (75,0%), VI (65,0%), V (69,6%), наименьший – у IV (46,4%) и I (39,1%). Экспозиция 40 сек у всех генотипов оказалась недостаточной для получения стерильного материала, его выход составил от 0 до 13,3% (рис.15). Таблица 5.1.1 – Влияние времени стерилизации исходного материала 0,1 % раствором сулемы на выход стерильных и жизнеспособных эксплантов Форма Экспозиция, мин Выход стерильных эксплантов, % VII 40 секунд 13,3 Жизнеспособность почек, %(от числа исходных эксплантов) 13,3 1 минута 75,0 60,0 40 секунд 0 0 1 минута 59,1 36,4 40 секунд 0 0 1 минута 46,4 28,6 40 секунд 11,8 11,8 1 минута 65,0 37,0 40 секунд 0 0 1 минута 39,1 39,1 40 секунд 0 0 1 минута 69,6 69,6 VIII IV VI I V 83 Рис. 15 Инфицированность эксплантов яблони при стерилизации 0,1 % р-ром сулемы в течение 40 секунд. Также в качестве стерилизующего агента был испытан раствор «Белизны» в разведении 1:1,5 при экспозиции 5 мин. Такой вариант обработки использовался на листовых эксплантах и дал положительные результаты. Однако при обработке меристемах выход, как стерильных, так и жизнеспособных почек у всех генотипов был существенно ниже, чем при обработке сулемой (табл. 5.1.2). У форм I, V, VI все почки после стерилизации оказались не жизнеспособными (рис. 16). Таблица 5.1.2 – Влияние стерилизации исходного материала р-ром «Белизны» (1:1,5), 5 мин. на выход стерильных и жизнеспособных эксплантов Форма Выход стерильных эксплантов, % Жизнеспособные почки, % VII 57,1 21,4 VIII 28,6 14,3 IV 42,8 7,1 VI 35,7 0 I 7,1 0 V 42,8 0 84 Рис. 16 Потемнение почек при обработке раствором «Белизна» 1:1,5 в течение 5 мин. Таким образом, при микроклональном размножении для стерилизации апикальных почек колонновидных форм и слаборослых генотипов яблони следует использовать 0,1% раствор сулемы с экспозицией 1 мин. Выход стерильных эксплантов в зависимости от генотипа составляет при этом от 39 до 75%, жизнеспособных – 28,669,6%. 5.2. Введение в культуру in vitro апикальных меристем Изолированные апикальные меристемы помещали на питательную среду МС, содержащую 0,5 мг/л 6-БАП (0-вой пассаж). Введение в состав питательной среды данного цитокинина снимало апикальное доминирование и стимулировало заложение боковых почек. Регуляторы роста ауксиновой природы не добавляли, так как на данном этапе они 85 негативно влияли на процесс морфогенеза и стимулировали нежелательный каллусогенез. Условия культивирования на этапе введения апексов: t = 23º±2оС, 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения 2000-3000 люкс. Анализ полученных результатов показал, что в 0-вом пассаже наиболее высокий уровень развития апексов отмечен у формы VII и VIII на среде МС, по показателям образования розеток листьев с зачатками почек (30%) (рис.17,18). Уже на инициальной среде у формы VII были образованы дополнительные побеги-регенеранты, что говорит о хорошем коэффициенте размножения и о дальнейшей работе в селекционной практике с этой формой (рис.19). Рис.17. Развитие апикальных меристем у формы VII 86 Рис.18. Развитие апикальных меристем у формы VIII Рис. 19. Образование дополнительных побегов-регенерантов на инициальной среде 0,5 мг/л 6-БАП у формы VII 87 У других испытанных сортов в основном было отмечено слабое увеличение размера эксплантов испытанных форм наименьшей и развитие 1-2 примордиев. морфогенетической Из способностью характеризовалась IV. Для форм I, II, III, V (рис. 20), следует несколько оптимизировать гормональный состав питательной среды, за счет изменения концентрации экзогенного цитокинина или его сочетания с синтетическими аналогами ауксина. Рис. 20. Слабое раскрытие почек формы I Следовательно, отмечены определенные генотипические особенности апексов по способности к развитию морфогенных структур в 0-вом пассаже. 88 ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ПРИЕМОВ РАЗМНОЖЕНИЯ ПОБЕГОВ-РЕГЕНЕРАНТОВ КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ IN VITRO 6.1. Собственно микроразмножение Цель этого этапа – добиться максимального получения количества побегов от каждого экспланта путем последовательного культивирования уже имеющихся побегов на свежую питательную среду. При решении этого вопроса играют роль сортовые и видовые особенности растений, происхождение экспланта, состав питательной среды. Для регенерации дополнительных сочетания и побегов плодовых концентрации культур фитогормонов используют цитокининов различные и ауксинов (Роньжина, 2003). Установлено, что по скорости получения новых растений метод клонального микроразмножения дает существенные преимущества по сравнению с традиционным способом размножения (Райков, 2012). На этапе размножения in vitro микропобегов семи генотипов колонновидных форм яблони нами были испытаны питательные среды с тремя различными концентрациями 6-БАП (0,5; 1,0; 2,0 мг/л). В результате исследований, к концу четвертого месяца размножения микропобегов лучшие результаты по выходу дополнительных побегов у большинства форм кроме IV и V были получены при концентрации 6-БАП 0,5 мг/л (табл. 6.1.1)(рис.21). Самый высокий коэффициент размножения (19,0) был на этой среде у формы VIII. Данная среда оказалась наиболее благоприятной и для формы VII (8,2). Среды с 1 и 2 мг/л 6-БАП для большинства изученных генотипов были менее благоприятны. Только для формы IV среда с 2 мг/л оказалась лучшей (15,5) (рис. 22). 89 Таблица 6.1.1. − Коэффициент размножения микропобегов яблони на средах с различными концентрациями 6-БАП Концентрация 6-БАП в питательной среде, мг/л Форма 0,5 1,0 2,0 I 0,5 0 0 III 1,3 0 0,3 IV 0 1,2 15,5 V 0 0 0 VI 0,5 0,8 0 VII 8,2 0 0 VIII 19,0 4,0 0 1 90 2 Рис. 21 Размножение микропобегов колонновидных форм яблони VII (1) и VIII (2) на среде с 0,5 мг/л 6-БАП. Рис. 22 Размножение микропобегов колонновидной формы яблони IV на среде с 2,0 мг/л 6-БАП. 91 В целом, можно отметить, что реакция инициальных побегов на концентрацию 6-БАП в среде размножения зависит от конкретного генотипа, то есть от его генетических особенностей. Для размножения in vitro форм VIII и VII следует использовать среды с 0,5 мг/л 6-БАП, а для IV – 2 мг/л. Остальные формы оказались мало отзывчивыми на испытанные среды (0,3 – 1,3). Форма V не образовала дополнительных побегов не на одной из испытанных сред. Очевидно, для этих генотипов требуется проведение дополнительных исследований в данном направлении. Формы IV, VII, VIII, показавшие высокую способность к размножению, в дальнейшем использовались для изучения способности к укоренению in vitro колонновидных форм и слаборослых подвоев яблони. 92 ГЛАВА 7. УКОРЕНЕНИЕ МИКРОПОБЕГОВ IN VITRO КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ Укоренение микропобегов плодовых культур является следующим важным и трудоемким этапом, от которого зависит успех микроразмножения. Важное значение на этапе ризогенеза отводится регуляторам роста, в первую очередь – ауксинам. Различная их концентрация, тип и способ обработки влияют на процесс укоренения микропобегов в условиях in vitro. Индукцию корнеобразования проводят в основном двумя путями: 1) включение препаратов, в основном ауксиновой группы, способствующих корнеобразованию непосредственно в питательные сред; 2) обработка базальных участков побегов корнеобразующими культивированием на средах, препаратами свободных от с последующим регуляторов роста (Высоцкий, 1998 автореф; Матушкина, Пронина, 2008) Исследователи на этапе укоренения используют ИМК, преимущественно в диапазоне концентраций 0,5 – 2 мг/л (Деменко, 2005; Матушкина, Пронина, 2008; Расторгуев, 2009; Савельев, Олейникова, 2009). На этом этапе, как и на других этапах микроразмножения, следует учитывать и генотипические особенности растений. В исследованиях было изучено влияние различных концентраций ИМК – 0,5 мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л, 3 мг/л на укоренение микропобегов колонновидных форм и слаборослых подвоев, полученных в культуре in vitro из листовых эксплантов и апикальных почек (табл. 7.1). Появление первых зачатков корней было отмечено в конце четвертой недели культивирования побегов, наиболее активное корнеобразование – на 6-7 недели. Проведенные исследования показали, что у всех изученных генотипов самое активное корнеобразование – от 31,0 до 54,1% − дает присутствие в питательной среде ИМК в концентрации 1 мг/л. Близкие 93 показатели по укоренению (32,8 – 43,8%) получены также при концентрации 0,5 мг/л (рис. 23). Таблица 7.1 − Влияние различных концентраций ИМК на ризогенез in vitro Форма IV VII VIII Концентрация Укореняемость ИМК мг/л % 0,5 43,8 Количество корней, шт./раст 2,5 1 54,1 3,7 3,4 2 34,0 2,4 1,6 3 28,7 1,2 0,7 0,5 39,7 2,3 2,4 1 48,9 2,9 3,1 2 37,0 2,2 1,3 3 22,6 1,4 0,6 0,5 32,8 2,4 2,5 1 31,0 2,1 2,7 2 25,2 1,8 1,3 3 20,1 1,1 1,2 94 Длина корней, см 2,7 1 2 Рис. 23 Укоренение микропобегов колонновидных форм яблони IV (1) и VIII (2) на среде с 1 мг/л ИМК. 95 Концентрация ИМК 1 мг/л также дает наибольшую длину корней – до 3,4 см. Более высокие концентрации ИМК (2 и 3мг/л) часто приводили к образованию на базальном участке микропобегов каллуса, это вызывало снижение укореняемости и, как следствие этого, снижало жизнеспособность регенерантов, что приводило в целом к снижению укореняемости микропобегов. Минимальной (20,1 – 28,7%) она была у всех генотипов при 3 мг/л ИМК (рис. 24). Рис. 24 Образование каллуса на базальных участках микропобегов формы IV при концентрации ИМК 3 мг/л. Таким образом, для укоренения in vitro миропобегов колонновидных форм и слаборослых подвоев яблони следует использовать концентрации ИМК 1 и 0,5 мг/л. Они дают наилучшее образование и рост корней. 96 7.1. Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта Заключительным этапом при получении растений методом in vitro из эксплантов различного происхождения является перенос пробирочных растений в нестерильные условия, то есть их адаптация к условиям открытого грунта. Для достижения минимальной гибели растений при их высадке необходимо учитывать целый ряд факторов, основными из которых являются: общее состояние высаживаемых растений (их рост, развитие корневой системы), состав почвенного субстрата, влажность воздуха, сроки высадки и температурный и световой режимы. Большинство исследователей (Муратова, Янковская, Тюленев, Соловых, 2003; Матушкина, Пронина, 2008,) считают, что лучшим сроком высадки растений в открытый грунт является период начала активного роста после покоя – это март-апрель. При высадке растения должны иметь 2 и более корней, длиной 2-3 см, высоту надземной части более 2 см. В качестве субстрата чаще всего используют смесь торфа, песка и почвы в соотношении 1:1:1. Субстрат обычно стерилизуют при температуре около 90ºС в течение 2-3 часов. Наиболее благоприятный температурный режим +22º…+26ºС, влажность воздуха должна составлять в течение первых двух недель адаптации не менее 90%, а в последующем 50-60%. Рекомендуемая освещенность должна составлять 3-5 тыс. люкс при 16-ти часовом фотопериоде. С целью изучения способности к адаптации in vivo пробирочных растений-регенерантов колонновидных формы и слаборослых подвоев яблони использовали формы IV, VII, VIII, которые показали хорошую способность к размножению и укоренению in vitro. В исследованиях для адаптации к нестерильным условиям отбирали растения высотой от 3см и более, которые имели 4-5 настоящих листочков и корни длиной 1,5 и более см. Также использовали не укорененные побеги высотой 3 см и выше. По результатам ряда исследований (Матушкина, 97 Пронина, 2008; Подорожный, Майорова, 2011) для предотвращения развития грибной микрофлоры вокруг корней, которая может приводить к их загниванию и гибели растений, перед посадкой корневую систему тщательно отмывали от остатков питательной среды 1% раствором марганцовокислого калия. Не укорененные in vitro побеги для лучшей адаптации обрабатывали раствором ИМК. Известно, что генотипические особенности исходных форм оказывают часто решающее влияние на подбор оптимальных концентраций ИМК и экспозиций обработки при адаптации in vivo плодовых и ягодных культур. В связи с этим диапазон используемых концентраций ИМК может колебаться в широких пределах – от 5 до 100мг/л, а экспозиции обработки – от 3 мин до 24 часов (Муратова, Янковская, Соловых и др., 2008; Пронина, 2008.). В исследованиях использовалась концентрация ИМК – 50 мг/л. с экспозицией обработки − 30 минут. Этим раствором обрабатывали базальные участки не укорененных побегов. После этого растения переносили в почвенный субстрат. В качестве почвенного субстрата использовали смесь из торфа, песка и дерновой земли в соотношении 1:1:1. Часть этой смеси заранее стерилизовали в сушильном шкафу при температуре 90ºС в течение 3 часов. Для высадки растений использовали торфоперегнойные горшочки размером 5х5 см, которые на 2/3 заполняли нестерилизованным почвенным субстратом, а оставшуюся 1/3 – стерильным. Почву увлажняли раствором минеральных солей по прописи МС. Высадку растений проводили, начиная с середины марта. Горшочки с растениями помещали в контролируемые условия при температуре +22º…+24ºС, освещенности 3-5 тыс. люкс и 16часовом фотопериоде. В начале адаптации растения прикрывали прозрачной пленкой, которую периодически снимали в течение первых 10 дней, постепенно увеличивая продолжительность раскрытия с 30 минут до 8 часов. 98 При этом поддерживали высокую (более 90%) влажность воздуха. По истечении двух недель после посадки, влажность воздуха снижали до 60%. По мере подсыхания почвы ее увлажняли разбавленным вдвое раствором минеральных солей МС с добавлением в него ИМК в концентрации 1мг/л для усиления корнеобразования, в течение первых трех недель, а затем поливали обычной водой (рис. 25). Рис. 25 Образование корневой системы при поливе ИМК 1 мг/л В результате проведенных исследований количество адаптированных к почвенным условиям растений составило от 10,8 до 51,4% (табл. 7.1.1). Наибольший выход адаптированных растений получен в опытах, где использовались укорененные in vitro растения, он составил от 46,7 до 51,4 %. Побеги без корней у всех генотипов адаптировались намного хуже, показатели их адаптации составили от 10,8 до 20,6 %. Подготовленные таким образом растения высаживали в открытый грунт на постоянное место (рис. 26, 27). 99 Таблица 7.1.1 – Результаты адаптации растений-регенерантов яблони к почвенным условиям Высажено растений, шт. 35 34,3±8,02 12 без корней (обработка ИМК) с корнями 37 10,8±5,10 4 30 46,7±9,11 14 без корней (обработка ИМК) с корнями 35 14,3±5,92 5 35 51,4±8,45 18 без корней (обработка ИМК) 34 20,6±6,94 7 Форма Вариант с корнями IV VII VIII Рис. 26 % адаптации Адаптированные растения колонновидных слаборослых генотипов яблони IV (1), 100 2 3 Рис. 27 Адаптированные растения колонновидных слаборослых генотипов яблони VII (2), VIII (3). В результате проведенных исследований было установлено, что у всех изученных генотипов адаптация проходила лучше в вариантах с укоренными in vitro растениями, без дополнительной обработки их стимуляторами. 101 ГЛАВА 8. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИВАНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ В настоящее время колонновидные формы яблони пользуются большой популярностью, что обуславливает повышенный спрос на их посадочный материал. Это связано с высокой экономической эффективностью при их использовании, как в производственных насаждениях, так и в любительском садоводстве. В связи с этим разработка методов их массового и быстрого получения весьма актуальна. Перспективным в этом направлении является получение посадочного материала через культуру in vitro. Этот метод особенно важен для колонновидных форм яблони, так как они в силу своих особенностей дают сравнительно небольшой годовой прирост побегов, что является существенным ограничителем при их размножении в питомнике методом окулировки или прививки. Культура in vitro позволяет от одного исходного экспланта (меристемы, почки), получить до 5 и более дополнительных побегов, а в последующем и растений. По нашим данным, с 1 м.2 культуральной комнаты в условиях in vitro от 400 исходных эксплантов можно получить 719 адаптированных к условиям in vivo растений. Потери при адаптации in vivo растительного материала составили 51,4%. Полные затраты при этом составляют 24 172,7 руб. на 1 м2. В то время как в питомнике с такой же площади при схеме посадки 20×10 выход материала бывает около 35 растений (Куликов, 2005). Результаты расчета и сравнения экономической эффективности производства посадочного материала колонновидных форм яблони через культуру in vitro с последующей адаптацией к условиям in vivo показали, что технология микроразмножения требует меньших капиталовложений на единицу площади с одновременно большим конечным выходом растительного материала, что существенно снижает себестоимость саженца 102 по сравнению со стандартной методикой, в результате чего уровень рентабельности повысился на 97,5%. Таблица 8. − Экономическая эффективность выращивания посадочного материала Показатели Исходное количество Технология размножения растенийрегенерантов с применением метода in vitro 400 в условиях in vivo 1400 35 50 материала на 1 м2, шт. Выход материала с 1 м2 теплицы или культуральной комнаты за 1 пассаж, шт. Выход адаптированных 719 стерильных растений после доращивания in vivo, шт. Полные затраты, руб. 24172,7 1573,2 Себестоимость, руб. 33-62 44-95 130 130 93470 4550 69297,3 2976,7 286,7 189,2 Средняя цена реализации, руб./шт. Стоимость валовой продукции, руб. на 1 га Прибыль, руб. на 1 га Уровень рентабельности, % 103 ВЫВОДЫ 1. В результате проведенных исследований усовершенствованы биотехнологические приемы, способствующие получению андрогенных новообразований, регенерантов из листовых эксплантов и почек колонновидных слаборослых генотипов яблони. 2. Выявлены генотипы (IV, VII, VIII формы) с высоким выходом андрогенных каллусов до 46,9% при культивировании in vitro пыльников, а также способностью к регенерации из листовых эксплантов до 35%, и микроклональному размножению с коэффициентом выхода побегов- регенерантов от 8,2 (VII) до 19,0(VIII). 3. Показано, что для повышения каллусообразующей способности пыльников и улучшения качественных показателей каллуса следует использовать две инициальные питательные среды следующего состава (в мг/л): 1) ИУК, 2,4Д, НУК, 6-БАП по 1,0 2) ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 + 6-БАП − 1,0. 4. Наибольший выход андрогенных новообразований (до 34,5%) дает культивирование пыльников на стадии микроспор (одноядерная), имеющих размер бутона от 6 до 8 мм. 5. Установлено, что предобработка пыльников колоновидных слаборослых генотипов яблони низкими положительными температурами +3º…+5 оС продолжительностью 6 и 9 суток может увеличивать выход андрогенных каллусов в 1,4 раза. 6. Выделены формы V и VIII, которые способны увеличивать андрогенную активность пыльников после воздействия на донорные растения экстремальных факторов внешней среды. 7. Эффективной для культивирования листовых эксплантов является среда, содержащая ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3,0 мг/л., на которой 104 у всех испытанных генотипов были индуцированы каллусы, а у двух форм VII и VIII отмечено образование почек (до 35%) и получены регенеранты. 8. На этапе собственно микроразмножения высокий выход микропобегов дает использование почек размером 3-4 мм, при их культивировании на питательных средах с концентрациями 6-БАП 0,5 и 2,0 мг/л, коэффициент размножения составляет 8,2 – 19,0. 9. При укоренении побегов-регенерантов лучшие результаты (до 50%) дает присутствие в питательной среде 1 мг/л ИМК. 10. Установлено, что укорененные in vitro микропобеги лучше адаптируются к условиям открытого грунта, чем не укорененные, их приживаемость составляет более 40%. 11. Получение посадочного материала колонновидных слаборослых генотипов яблони методом клонального микроразмножения обеспечивает увеличение рентабельности на 97,5%. 105 Рекомендации для производства и селекции 1. Для практического использования в селекционно-генетической и биотехнологической работе рекомендуем колонновидные слаборослые генотипы яблони − IV, VII, VIII, обладающие способностью к андрогенезу in vitro, регенерации в культуре листовых эксплантов и микроклональному размножению. 2. В исследованиях по андрогенезу in vitro у колонновидных форм яблони следует использовать пыльники на стадии микроспор (размер бутона 6-8 мм), проводить их холодовую предобработку низкими положительными температурами +3º…+5оС продолжительностью 6 и 9 суток и культивировать на питательных средах, включающих (мг/л): 1). ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 + 6БАП − 1,0; 2). ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0. 3. Для культивирования листовых эксплантов in vitro рекомендуется использовать питательную среду, содержащую ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3,0 мг/л. 4. При микроклональном размножении колонновидных слаборослых генотипов яблони рекомендуется использовать апикальные почки размером 3-4 мм, проводить их культивирование на питательных средах с 0,5 и 2 мг/л 6-БАП. При укоренении микропобегов использовать ИМК 1 мг/л. 106 Список литературы 1. Абрамов, С. Н. Статусы пыльника пшеницы при холодовом стрессе: Докл. [Годичное собрание Всерос. общ-ва физиологов раст. (ВОФР) Уфа, 19-22 июня, 2001] / С. Н. Абрамов // Вестн. Башк. Ун-та. – 2001. – №2. – С. 100-102. 2. Александрова, Л. Г., Лукьянюк, С. Ф. : Мат. научной конф. по с.-х. биотехнологии. – Целиноград, 1991. 3. Алексеенко, Л. В. Регенерация растений плодовых и ягодных растений из эксплантов различного происхождения / Л. В. Алексеенко // Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие агропромышленного комплекса : Сб. науч. тр. ГНУ ВНИИЦиСК. – Сочи, 2007. – Вып. 40. – С. 376-380. 4. Ананьина, Н. Н. Влияние размера бутонов и питательной среды в культуре пыльников / Н. Н. Ананьина, А. В. Поляков, И. И. Тарасенков, И. Н. Боровикова // Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов : матер. 3 Российской науч.-практ. конф. (Москва, 6-7 июня 2005г.). – М., 2005. – С. 57-58. 5. Анапияев, Б.Б. Влияние генотипа на частоту регенерации растений в культуре микроспор Triticum aestivum L. / Б.Б. Анапиляев // Генетика. – 2000. – Т. 36, № 4. – С. 505–509. 6. Анапияев, Б. Б. Культура микроспор отдаленных гибридов пшеницы / Б. Б. Анапияев, К. М. Искакова, И. Р. Рахимбаев // Актуальные проблемы генетики: Мат. 2-й конф. Московского общества гентиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова: 20-21 февраля, 2003. Т.2. – М., С. 103-104 7. Асадова, С. Т. Влияние различных комбинаций фитогормонов на каллусо- и морфогенез некоторых генотипов люцерны / С. Т. Асадова // Изв. Азербайджана Сер. Биол. – 2002. - №1-6. – С. 355-364. 107 8. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве / А. Атанасов. – Новосибирск, 1993. – 242 с. 9. Барсукова, Е. Н. Микроклонирование in vitro морозостойких подвоев яблони / Е. Н. Барсукова, Р. П. Фисенко, Н. Н. Андриевская, С. Г. Сморкалова // Генофонд растений Дальнего Востока России : матер. конф., посвящ. 70-летию ДВОС ВИР «Итоги и перспективы использования мировой коллекции ВИР и развития с.-х. производства Дальнего Востока». – Владивосток, 1999. – С. 132-133. 10.Бартиш, И. В. Оптимизация методов культивирования in vitro различных сортов и клоновых подвоев яблони (Malus domestica Borkh.) / И. В. Бартиш, В. И. Корховой, С. М. Меркулов, В. П. Копань // Физиология и биохимия культурных растений. – 1994. – Т.26, №6. – С. 587-594. 11.Батыгина, Т. Б. Культура изолированных пыльцевых злаков с позиции эмбриологии растений (Методологические разработки) / Т. Б. Батыгина, Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова. – Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. – 32 с. 12. Батыргожин, Б. А. Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды / Б. А. Батыргожин, Б. Б. Анапияев, Н. Л. Богуслаев : Тез. сообщ. (Иркутск, 8-12 июля, 1991). – Иркутск, 1991. – С. 86. 13.Белинская, Е. В. Признаковая коллекция ячменя по способности к андрогенезу in vitro / Е. В. Белинская // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке. Тез. докл., Санкт-Петербург, 26-30 ноября, 2007. – С. 239-241. 14.Бобков, С. В. Получение корнесобственных регенерантов в культуре пыльников проса / С. В. Бобков // Вестник РАСХН. – 2000. – №5. – С. 41. 15.Бобков, С. В. Культуры изолированных пыльников и микроспор гороха Pisum sativum L. / С. В. Бобков // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тезисы Х Междунар. конф. (Звенигород, 8-12 сент. 2008 г.). – М., 2008. – С. 48. 108 16.Бобков, С.В. Использование улучшенных вариантов среды № 6 для получения регенерантов в культуре пыльников проса / С.В. Бобков // Вестник РАСХН. – 2002. – № 5. – С. 39–42. 17. Бохорова, Н. Семена межвидовых гибридов подсолнечника в культуре in vitro и их морфогенетические способности / Н. Бохорова, А. Петров, Ю. Георгиева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. – М.: Наука, 1991. – С. 114-116. 18.Бугара, А. М. Влияние холодовой предобработки на индукцию андрогенного развития в пыльниках кориандра / А. М. Бугара, Л. А. Егорова, С. А. Резников // Физиология растений. – 1985. – Том 32, вып. 3. – С. 558-564. 19.Бургутин, А. Б. Микроклональное размножение винограда / А.Б. Бургутин // Биология культуры клеток и биотехнология растений. – М.: Наука, 1991.− С. 216-220. 20.Бурдасов, В. М. Особенности микроклонального размножения яблони / В. М. Бурдасов, Е. И. Ильина, Н. В. Кононова // Биология культивируемых клеток и биотехнология : Тез. докл. междунар. конф. (Новосибирск, 2-6 августа 1988). – Новосибирск: Ин-т цитологии и генетики, ИФР им. К. А. Тимирязева, 1988. – С. 360. 21. Бутенко, Р. Г. Применение метода культуры изолированных верхушечных почек для изучения процесса роста и органогенеза растений / Р.Г.Бутенко // Физиология растений. – 1960. – Т.7, вып. 6. – С. 715-723. 22.Бутенко, Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г.Бутенко. – М.: Наука, 1964. – 272 с. 23.Бутенко, Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко. – М.: Наука, 1975. – 51 с. 24.Бутенко, Р. Г. Клеточные технологии в селекционном процессе / Р. Г. Бутенко // Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии: Мат. Всес. конф. – Ленинград, 1986. – С. 29-38. 109 25.Бутенко, Р. Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике / Р. Г. Бутенко // Основы сельскохозяйственной биотехнологии. – М.: Агропромиздат, 1990. – С. 154-235. 26.Бутенко, Р. Г. 1-е Чайлахянское чтение. − Пущино: Пущинск. науч. центр РАН, 1994. − С. 7. 27.Верзилин, А. В. Использование биотехнологии для усовершенствования селекционного процесса клоновых подвоев яблони с целью его ускорения / А. В. Верзилин, Д. В. Иванов, Ю. В. Трунов // Использование биотехнол. методов для решения генет.-селекционных проблем. – Мичуринск, 1998. – С. 63-66. 28.Вечернина, Н. А. Адаптация растений-регенерантов к условиям выращивания ex vitro / Н. А. Вечернина, О. К. Таварткиладзе, И.Д. Бородулина, А. А. Эрст // Современные тенденции развития промышленного садоводства: Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 75летию образования НИИ садоводства Сибири имени М. А. Лисавенко (Барнаул, 18-23 августа 2008 г.). − Барнаул, 2008. – С. 355-360. 29.Вершкова, Л. П. Получение регенерантов земляники в культуре пыльников и листовых эксплантов / Л. П. Вершкова // Молодые ученые – садоводству России: Тез. докл. Всерос. совещ. – М., 1995. – С. 154-156. 30.Вигоров, Л. И. Сад лечебных культур / Л. И. Вигоров. – Свердловск: Среднеурал. кн. изд-во, 1979. – 175 с. 31.Внучкова, В. К. Получение гаплоидов и фертильных антрогенетических линий пшеницы при посадке пыльников in vitro / В. А. Внучкова, Т.М. Чеботарева, Г. И. Глущенко // Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии: Материалы Всесоюз. конф. – Ленинград, 1986. – С. 74-79. 32.Выскот, Б. М. Индуцированный андрогенез in vitro – новый метод получения гаплоидных растений / Б. М. Выскот, Ф. Й. Новак // Генетика. − 1975. – Вып.11. − №1. – С. 136-145. 110 33.Высоцкий, В. А. Клональное микроразмножение плодовых растений и декоративных кустарников / В. А. Высоцкий // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве. − Мичуринск, 1989. − С. 3-8. 34.Высоцкий, В. А. Клональное микроразмножение и получение растенийрегенерантов ремонтантных и нейтральнодневных сортов земляники / В. А. Высоцкий, Л. В. Алексеенко // Биол. клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: тез. докл. VII Междунар. конф. – М., 1997. – С. 405-406. 35.Высоцкий, В. А. Регенерация растений земляники нейтральнодневных и ремонтантных сортов в культуре листовых дисков и пыльников [Текст] / В. А. Высоцкий, Л. В. Алексеенко // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. работ. – М., 2005. – Т. XII. – С. 330-336. 36.Высоцкий, В. А. Регенерация плодовых и ягодных растений в культуре каллусной ткани, пыльников, листовых и стеблевых эксплантов / В.А. Высоцкий, Л. В. Алексеенко // Садоводство и виноградарство. – 2008. − №2. – С. 17-20. 37. Высоцкий, В. А. Клональное микроразмножение малины / В. А. Высоцкий, Н. В. Герасимова : Информ. листок. – МОСОБЛЦНТИ, 1987. – 3 с. 38.Высоцкий, В. А. Методические указания по выращиванию сеянцев вишни из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития / В.А. Высоцкий, Г. А. Плотникова // НИЗИСНП. – М., 1988. – 14 с. 39.Галиева, Э. Р. Влияние низких положительных температур на индукцию эмбриоидогенеза и формирование регенерантов в культуре in vitro пыльников пшеницы / Э. Р. Галиева, Н. Н. Круглова, С. Н. Абрамов // Физиол. и биохимия культ. рас. – 2005. – Вып. 37, №2. – С. 132-138. 40.Гамбург, К.З. Ауксины в культурах тканей и клеток растений / К.З. Гамбург, Н.И. Рекославская, С.Г. Швецов. – Новосибирск : Наука, 1990. – 240 с. 111 41.Гапоненко, А.К. Перспективы использования культуры клеток растений в селекции // Успехи современной генетики. – М., 1987. – Т. 4. – С. 64–68. 42.Геринг, Х. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении / Х. Геринг // Биология культуры клеток и биотехнология растений. – М.: Наука, 1991. – С.197-200. 43.Гиголашвили, специфический Т. С. Условия культуральный микроклонирования фенотип / Т. С. формируют Гиголашвили, О.Н. Родькин, В. Г. Реуцкий // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда : тез. докл. VII Междунар. конф. (25-28 ноября 1997г., Москва). – М., 1997. – С. 130-134. 44.Гончарова, Ю. К. Наследование признака «отзывчивость на культуру пыльников» у риса [Текст] // Вестник РАСХН. – 2008. - № 2. – С. 40–42. 45.Горбунова, В. Ю. Андрогенез in vitro яровой пшеницы : Автореф. дис…докт. биол. наук / В. Ю. Горбунова. – Уфа, 2000. – 48 с. 46. Горбунова, В.Ю. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты / В.Ю. Горбунова, Н.Н. Круглова, Т.Б. Батыгина // Успехи современной биологии. – 1993. –Т. 113, № 1. – С. 19–35. 47.Горбунова, В. Ю. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты / В. Ю. Горбунова, Н. Н. Круглова, Н.Н. Потапова. – Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. – Ч.1. – 63 с. 48. Гришенко, Е. В. Эмбриогенная детерминация развития in vitro пыльцы Brassica napus / Е. В. Гришенко // Ботан. журн. – 2001. – 86, №11. – С.1-9. 49. Гродзинский, А. М. Краткий справочник по физиологии растений / А.М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. – Киев: Наукова думка, 1973. – 590 с. 50.Гудвин, Т. Введение в биохимию растений / Т. Гудвин, Э. Мерсер. – М.: Мир, 1986. – С. 203-267. 51.Гудковский, В. А. Проблемы и перспективы обеспечения свежими фруктами и повышение здоровья людей / В. А. Гудковский // История, 112 современность и перспективы развития садоводства России: Мат. Междунар. конф. – М., 2000. – С 38-45. 52.Давыдова Н. Н. Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleraceae L.) : Автореф. дис. …канд. с.-х. наук / Н. Н. Давыдова. – М., 2008. – 25 с. 53.Данвелл, Дж. М. Культуры гаплоидных клеток / Дж. М. Данвелл // Биотехнология растений: культура клеток. – М.: Агропромиздат, 1989. – С. 33-51. 54.Данилова, Т. В. Оптимизация методики получения гаплоидов мягкой пшеницы в культуре пыльников in vitro и возможности их использования в селекции: автореф. дис…канд. биол. наук / Т. В. Данилова. – Москва, 2000. –16 с. 55.Данилова, Т. В. Оптимизация условий культивирования in vitro пыльников яровой пшеницы, оценка агрономических свойств линий удвоенных гаплоидов / Т. В. Данилова, Ю. Б. Коновалов // 2 Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 1-5 февр.: Тез. докл. Т.1. –СПб, 2000. – С. 101-102. 56. Деменко, В. И. Проблемы и возможности микроклонального размножения садовых растений //Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. – М.: Москва Издательство МСХА, 2005. – С. 48-58. 57.Джонс, О. П. Размножение хозяйственно важных древесных растений in vitro // Биотехнология сельскохозяйственных растений. – М.: Агропромиздат, 1987. – С. 134-152. 58.Джигадло, Е. Н. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / Е. Н. Джигадло, М. И. Джигадло, Л.В. Голышкина. – Орел: ГНУ ВНИИСПК, 2005. – 51 с. 59.Долгов, С. В. Разработка методов регенерации и генетической трансформации вишни (Cerasus vulgaris) / С. В. Долгов, А. П. Фирсов, 113 Я.И. Бурьянов // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Российского симпозиума. – Пущино, 1993. – С. 38-40. 60.Дорошенко, Н. П. Биотехнологические методы в селекции винограда / Н.П. Дорошенко // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем : Сб. докл. XVII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997. – Мичуринск: ВНИИГиСПР, 1998. – С. 42-46. 61.Дьячук, Т. И. Биотехнологические методы в селекции пшеницы, ячменя и тритикале в НИИСХ Юго-Востока / Т. И. Дьячук, С. В. Тучин, С. В. Столяров, Ю. В. Итальянская, Н. Ф. Сафронова, Л. П. Медведева, Е. А. Блюднева // Стратегия адаптивной селекции полевых культур в связи с глобальным изменением климата: Сборник науч. трудов по материалам науч. практ. конф., Саратов, 2004, С. 237-278. 62.Жуков, О. С. Методические рекомендации по получению растенийрегенерантов плодовых пород в культуре пыльников / О. С. Жуков, О.Я. Олейникова, Н. И. Савельев. – Мичуринск, 1984. – 36 с. 63.Зайцев, Д. Ю. Потенциально морфогенные андроклинные каллусы как дополнительный источник дигаплоидов / Д. Ю. Зайцев // Материалы 4 съезда Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (Пущино, 6-7 дек. 2006 г.). – М., 2006. – С. 77-78. 64.Зарянова, Л. Д. Оптимальная фаза развития микроспор изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы при индукции эмбриодогенеза in vitro / Л. Д. Зарянова, В. Ю. Горбунова // Сургут. гос. ун-т. Сб. научных трудов. 2005, №22, - С. 3-8. 65.Золотова, Т. М. Оценка гибридов яровой мягкой пшеницы по отзывчивости пыльников на условия культуры in vitro / Т. М. Золотова, Н. Н. Круглова // Мат. науч. практ. конф., Москва, 26-27 февраля. 2002. – С. 121-122 114 66.Золотов, Л. А. Оценка сортов яровой мягкой пшеницы по отзывчивочти пыльников на условия культуры in vitro / Л. А. Золотов // Биология-наука XXI века, 14-18 апреля, Сборник тезисов. – Пущино, 2003. – С. 173 67.Катаева, Н. В. Клональное микроразмножение растений / Н. В. Катаева, Р. Г. Бутенко. – М.: Наука, 1983. – 96 с. 68.Казаков, И. В. Перспективы селекции ремонтантной малины / И.В. Казаков // Вестник РАСХН. – 2004. − №4. – С. 42-45. 69. Калинин, Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф. Л. Калинин, В. Е. Полищук. – Киев: Наукова думка, 1980. – 399 с. 70.Касаева, К.А. Использование гаплоидии в селекции зерновых культур / К.А. Касаева // Агропромышленное производство: опыт, проблемы и тенденции развития. – 1988. – № 2. – С. 23 – 30. 71.Кастрицкая, М. С. История культуры зародышей in vitro / М.С. Кастрицкая // Плодоводство : Науч. тр. / Институт Плод. НАН Беларуси. – Самохваловичи, 2002. – Т.14 – С. 161-166. 72.Качалкин, М. В. Использование колонновидной яблони в суперинтенсивных насаждениях / М. В. Качалкин // Состояние и перспективы селекции плодовых культур : Материалы междунар. науч.практ. конф. (пос. Самохваловичи, 21-24 авг. 2001 г.) / Белорус. НИИ плодоводства. – Минск, 2001. – С. 78-80. 73.Кефели, В. И. Рост растений / В. И. Кефели. – М.: Колос, 1984. – 175 с. 74. Кичина, В. В. Доноры компактной колоннообразной кроны яблони // Садоводство. – 1985. – №4. – С.24-25. 75.Кичина, В. В. Особенности гибридов яблони с колонновидной кроной // Плодоовощное хозяйство. – 1987. - №10. – С.19-21. 76. Кичина, В. В. Яблони колонновидного типа. – М.: ВСТИСП, 2006. – 162с. 77. Кичина, В. В. Яблоки на колоннах // Приусадебное хозяйство. – 1993. - №1. – С.44-46. 78. Кичина, В. В. Яблоки без веток // Наука и жизнь. – 1994. - №9. – С.104-106. 115 79. Клоконос, Н. П. Культура изолированных тканей ежевики // Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур: Материалы междунар. науч.-практ. конф., 20-22 ноября 2001 г. – М., 2001. – С.105-107. 80.Ковалева, И. С., Данилова, Т. В., Молканова, О. И. Усовершенствование методики микроклонального размножения малино-ежевичного гибрида Тайберри // Бюл. Гл. бот. сада. – 2000. – Вып. 179. – С.136-143. 81.Кондратенко, О. В. Влияние рН питательной среды на рост и развитие миниатюрных роз (Rosa minima L.) in vitro / О. В. Кондратенко, И. В. Митрофанова // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений. Сб. тез. 2-й межд. конф. молодых ученых (19-23 мая 2003 г.). – Харьков: Ин-т растениеводства им. В. Я. Юрьева, УААН, 2003. – С.10-11. 82.Коршун, Н. Д. Клональное микроразмножение клоновых подвоев яблони / Н. Д. Коршун, С. А. Муратова, Д. В. Иванов, Р. В. Тугарев // Сельскохозяйственное производство и высшая школа на переломном этапе реформирования. Мат. обл. науч.-пр. конф. 21-22 марта 1996 г., сборник 2., Плодоводство, ч. 1. – Мичуринск, 1996. – С.40-41. 83.Круглова, Н. Н. каллусогенез как путь морфогенеза в культуре пыльников злаков / Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова // Успехи современной биологии. – 1997. – Т. 117,№1. – С. 83-94. 84.Круглова, Н. Н. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов / Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова, В. А. Куксо // успехи современной биологии. – 1999. – Т. 119, №6. – С. 567-577. 85. Круглова, Н. Н. Культура изолированных пыльников злаков: точка зрения эмбриолога. 4 пути развития спорогенных клеток in vitro / Н. Н. Круглова, П. А. Куско, Т. М. Золотова, О. А. Сельдьмирова // Инф. Бюллетень / Ин-т цитол. РАН. – 2001. - №16. – С.17-19. 116 86. Куклина, Е. В. Опыт клонального размножения голубых жимолостей / А. Г. Куклина, Е. А. Семерикова, О. И. Молканова // Бюл. гл. бот. сада., Вып. 128. – М.: Наука, 2003. – С.160-167. 87. Куксо, П. А. Пути развития микроспор при культивировании in vitro изолированных пыльников пшеницы. Материалы 2 Съезда Общества биотехнологов России, Москва, 13-15 окт., 2004. –М., 2003 С. 68-69 88. Куликов, И. М. Рентабельность клонального микроразмножения винограда и ягодных кустарников / И. М. Куликов, В. А. Высоцкий, А. А. Шипунова // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства: материалы конф., 29-30 июня 2005 г. г. Новочеркасск 2005 г., С.162-168. 89. Кухарчик, Н. В. Адаптация регенерантов ex vitro / Н. В. Кухарчик, Т. А. Красинская, С. Э. Семенас, Е. В. Колобанова // Плодоводство: науч. тр.; Ч. 2: методическое обеспечение устойчивого развития современного плодоводства: материалы междунар. науч. конф., Самохваловичи Минской обл., 6-8 сент. 2006 г. / Ин-т плодоводства НАН Беларуси. – Самохваловичи, 2006. – Т.18, ч. 2. – С.174-181. 90.Кучеренко, Л. А. Использование методов биотехнологии в селекции риса / Л. А. Кучеренко, П. Н. Харченко, Е. Н. Ковалева // Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии : Мат. Всесоюз. конф. – Ленинград, 1986. – С. 92-96. 91.Кучко, А. А. Культура изолированных пыльников картофеля / А.А. Кучко, И. М. Маруненко // Сельскохозяйственная биотехнология. – 1983. − №5. – С. 16-19. 92.Кучковская, Е. В. Проблема получения гаплоидных растений томата в культуре пыльников / Е. В. Кучковская, О. И. Молканова, О. В. Бахеева // Мат. науч. гент. конф., Москва, 26-27 февр., 2002. – С. 198-200 93. Лаврова, Н. В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы / Н. В. Лаврова. – М.: МСХА, 2006. – 124 с. 117 94.Лебедев, В. А. Потенциальные возможности адвентивного органогенеза у различных сортов груши / В. А. Лебедев, В. И. Деменко, С. В. Долгов // Известия ТСХА.− 2004. – Вып. 4. – С. 81-87. 95.Лебедев В. Г. Оптимизация этапов клонального микроразиножения при массовом производстве растений / В. Г. Лебедев, А. Б. Азарова, А.А. Алпатова, М. А. Салмова, Л. А. Шестибратов // Плодоводство и ягодоводство России. − Москва, 2011.− Том XXVI.− С. 307-314. 96.Лозариду, Т. В. Влияние холодовой предобработки на культивируемые пыльники ячменя разных генотипов / Т. В. Лозариду, А. С. Литургидис, С. Т. Котцаманидис, Д. Г. Рупакиас // Физиология растений. – 2005. – 52, №2. – С. 781-785. 97.Ломовская, Л. В. Особенности клонального микроразмножения сортов и перспективных форм груши / Л. В. Ломовская // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве : Матер. к междунар. науч.метод. конф. (Орел, 28-31 июля 2003 г.). – Орел, ГНУ ВНИИСПК, 2003. – С. 204-205. 98. Мазур, А. М. Клональное микроразмножение восточных гибридов лилий / А. М. Мазур, Е. А. Калашникова // Сельскохозяйственная биотехнология : Матер. междунар. науч.-практ. конф. – Горки, 1998. – С. 93-96. 99.Маруненко, И. М. Физиологические аспекты получения гаплоидров картофеля методом культуры пыльников / И. М. Маруненко, А.А. Кучко, Р. Г. Бутенко // Физиология растений.− 1988.− Т.35, в.1. − С. 136-143. 100. Матушнина, О. В. Технология клонального микроразмножения яблони и груши / О. В. Матушнина, И. Н. Пронина / Методические рекомендации. – Мичуринск-наукоград РФ, 2008.− 32 с. 101. Медведева, Н. И. Особенности клонального микроразмножения клоновых подвоев косточковых плодовых культур / Н. И. Медведева, Н. В. Поливара, В. Н. Подорожный // Плодоводство и ягодоводство России. − Москва, 2011.− Т. XXVI.− С. 322-327. 118 102. Метлицкий, Л. В. Основы биохимии плодов и овощей / Л. В. Метлицкий. – М.: Экономика, 1976. – 349 с. 103. Мишуткина, Л. В. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) in vitro / Л. В. Мишуткина, А. К. Гапоненко // Генетика. – 2006. – 42, №2. – С. 210-218. 104. Молканова, О И. Выход гаплоидных растений яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) в культуре пыльников in vitro в зависимости от состава сахаров питательной среды / О. И. Молканова, Т. В. Данилова // Известия Тимирязевской с.-х. акад. –1994. – №4. – С. 69-75. 105. Муравлев, А.А. Культура пыльников в селекции ярового рапса : автореф. дис. ... канд. биол. наук / А.А. Муравлев. – Саратов, 2007. – 24 с. 106. Муратова, С. А. Культивирование in vitro и регенерация из соматических тканей сливы домашней / С. А. Муратова // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства : Матер. конф. – Новочеркасск, 2005. – С. 107-116. 107. Муратова, С. А. Размножение садовых культур in vitro / Методические рекомендации / С. А. Муратова, Д. Г. Шорников, М. Б. Янковская.− Мичуринск, 2008.− 69 с. 108. Муратова, С. А. Оптимизация методов клонального микроразмножения садовых культур / С. А. Муратова, М. Б. Янковская, Н. В. Соловых, Д.Г. Шорников, А. В. Будаговский, Р. В. Папихин // Плодоводство и ягодоводство России. − Москва, 2011.− Т. XXVI.− С. 375-382. 109. Муратова, С. А. Повышение эффективности клонального микроразмножения плодовых, ягодных и декоративных культур / С.А. Муратова, М. Б. Янковская, В. М. Тюленев, Н. В. Соловых // Экология человека: Концепция факторов риска и управления рисками : Сб. матер. VII Всерос. науч.-практ. конф. – Пенза, 2003. – С. 166-168. 119 110. Муромцев, Г. С. Основы сельскохозяйственной биологии / Г. С. Муромцев, Р. Г. Бутенко, Т. И. Тихоненко, М. И. Прокофьев. − М.: Агропромиздат, 1990. – 384 с. 111. Муханин, В. Г. Достижения ВНИИС им. И. В. Мичурина в области создания и возделывания интенсивных садов / В. Г. Муханин // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им. И.В. Мичурина (1931-2001гг.) : Сб. науч. работ / ТГТУ. – Тамбов, 2001. – Т. 1. – С. 29-35. 112. Орлов, П. А. Темпы развития морфогенных структур в культуре пыльников пшеницы в зависимости от генотипа сорта / П. А. Орлов // Сельскохозяйственная биотехнология : Матер. междунар. науч. - практ. конф. – Горки, 1998. – С. 124-128. 113. Орлова, С. Ю. Особенности размножения сортов вишни различного происхождения в культуре in vitro / С. Ю. Орлова, А. А. Юшев // Плодоводство на рубеже XXI века : Матер. междунар. конф., посвящ. 75летию со дня образования Белорусского НИИ плодоводства (Беларусь, пос. Самохваловичи, 9-13 октября 2000 г.). – Минск, 2000. – С. 27-28. 114. Петренко, Н. С. газета "Волшебная грядка" 2011 года № 9. 115. Петрова, А. Д. Хемотерапия и размножение садовых культур на питательных средах с фенолкарбоновыми кислотами / А. Д. Петрова, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России : Сб. науч. раб. – М.: ВСТИСП, 2000. – Т.VII.− С. 67-72. 116. Плотников, Л. Я. Интенсификация метода культуры пыльников пшеницы с использованием данных о влиянии генотипа растенийдоноров на выход гаплоидов / Л. Я. Плотников : Тез. докл. пробл. совещ. по растениеводству, селекции, биотехнол. и семеновод. с.-х. культур Сибири (Барнаул, 26-27 июля, 1994). – Новосибирск, 1994. – С. 24-25. 117. Попов, Ю. Г. Применение метода культуры меристематических верхушек в селекционной работе с земляникой / Ю. Г. Попов, 120 А.С. Равкин // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. – М.: Колос, 1979. – С. 115-123. 118. Причко, Т. Г. Биохимические и технологические основы интенсификации производства, хранения и переработки плодов: автореф. дис…д-ра с.-х. наук / Т. Г. Причко. – Краснодар, 2002. – 53 с. 119. Протасова, Е. С. Совершенствование метода андрогенеза in vitro у земляники (Fragaria ananassa Duch.): дис…канд. с.-х. наук 06.01.05 защищена 29.10.2010 –М., Мичуринск-наукоград РФ, 2010. – 123 с. 120. Размахин, Е. П. Влияние продолжительности холодовой предобработки на стимуляцию андрогенеза у пырея сизого / Е. П. Размахин, В.М. Чекуров // Стрессовые белки растений : Матер. Всерос. науч. конф. (Иркутск, 6-10 сент., 2004 г.). – Иркутск, 2004. – С. 88-90. 121. Райков, И. А. Особенности клонального микроразмножения смородины черной в зависимости от генотипа и применяемого цитокинина / И. А. Райков // Плодоводство и ягодоводство России. − Москва, 2011.− Т. XXVI.− С. 368-374. 122. Расторгуев, С. Л. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины / С. Л. Расторгуев // Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур : Метод. рекоменд. – Мичуринск, 1996. – С. 40-61. 123. Расторгуев, С. Л. Культура изолированных тканей и органов в селекции плодовых растений – Мичуринск : изд-во МичГАУ, 2009. – 170с. 124. Роньжина, Е. С. 6-бензиламинопурин – высокоэффективный экологически безопасный регулятор роста растений / Е. С. Роньжина // Вопросы сельского хозяйства : Междунар. сб. науч. тр. / Калинингр. Гос. тех. ун-т. – Калининград, 2003. – С. 119-127. 125. Рыбалко, А. Е. Экономическая характеристика производства безвирусных мериклонов цветочных культур / А. Е. Рыбалко // Биология 121 культивируемых клеток и биотехнология растений. – М.: Наука, 1991. – С. 227-232. 126. Савельев, Н. И. Генетические основы селекции яблони / Н.И. Савельев. – М.: ВНИИГиСПР им. И. В. Мичурина, 1998. – 304 с. 127. Савельев, Н. И. Андрогенез in vitro у плодовых и ягодных культур [Текст] / Н. И. Савельев, О. Я. Олейникова // Инновационные подходы в селекции цветочно-декоративных субтропических и плодовых культур : Матер. науч.-практ. конф. (Сочи, 21-24 сентября 2005 г.). – Сочи, 2005. – С. 196-200. 128. Савельев, Н. В. Андрогенез плодовых и ягодных растений в культуре in vitro / Н. В. Савельев, О. Я. Олейникова // Методические рекомендации. – Мичуринск-наукоград РФ, 2008.− 52 с. 129. Самусь, В. А. Методика микроразмножения подвоев яблони in vitro. / В. А. Самусь, С. Э. Семенас, Н. В. Кухарчик, А. А. Зимушко // Плодоводство : науч. тр. / Институт плодоводства НАН Беларуси. – Самохваловичи, 2006. – Т. 18, ч. 2. – С. 146-155. 130. Сатарова, Т. Н. Использование культуры пыльников для получения гаплоидов у кукурузы [Текст] / Т. Н. Сатарова // Кукуруза и сорго. – 2001. № 4. – С. 21 – 23. 131. Сельдимирова, О. А. Влияние 2,4-Д на формирование микроспориальных эмбриоидов яровой мягкой пшеницы in vitro / О.А. Сельдимирова, Г. Е. Титова // Биология клеток растений in vitro и биотехнология : тез. IХ Междунар. конф. (Звенигород, 8-12 сент. 2008 г.). – М., 2008. – С. 338. 132. Сельдимирова, О. А. Развитие микроспориальных эмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы / О. А. Сельдимирова, С.Н. Абрамов, Н. Н. Круглова // Физиол. и биохимия культ. раст. – 2004. – 36, №4. – С. 320-326. 122 133. Сизенко, Е. И. Проблемы сельскохозяйственного сырья, продовольствия и продуктов питания / Е. И. Сизенко // Хранение и переработка сельхоз сырья. – 2004.− №6. – С. 11-17. 134. Соколов, В. А. Технология гаплоидов в генетике и селекции растений / В. А. Соколов, В. К. Шумный // Вавиловское наследие в современной биологии. – М., 1989. – С. 247-269 135. Солдатов, В. С. Ионитные почвы / В. С. Солдатов, Н. Г. Перышкина, Р.П. Хорошко. – Минск: Наука и техника, 1978. – 172 с. 136. Сорока, А. И. Влияние состава среды каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников льна / А. И. Сорока // Цит. и генетика. – 2004. – Т.38, №2. – С. 20-25. 137. Спивак, В. А. Влияние физиологически активных веществ на морфогенез пыльников пшеницы в культуре in vitro / В. А. Спивак, О.Н. Головинская, Б. Г. Быховцев // Вопр. биохимии и физиол. раст. и микроорганизмов. – 1991. − №12. – С. 66-73. 138. Стрыгина, О. В. Использование метода культуры тканей для ускоренного размножения сортов малины / О. В. Стрыгина // Биология культивируемых клеток и биотехнология : Тез. докл. междунар. конф. (Новосибирск, 2-6 августа 1988). – Новосибирск, Ин-т цитологии и генетики, ИФР им. К. А. Тимирязева, 1988. – С. 342. 139. Судейная, С. В. Вегетативное размножение Peperomia caperata, Ficus benjamina на ионитных субстратах / С. В. Судейная, В. А. Тимофеева // Изучение биоразнообразия флоры Беларуси и обогащение генофонда культурных растений : Матер. межвуз. сем. ботан. кафедр по проблемам биоразнообразия флоры и селекции культурных растений (Минск, 24-26 апреля 2002 г.) / БГПУ им. М. Танка. – Мн., 2003. – С. 80-83. 140. Судейная, С. В. Испытание ионообменных смол в качестве субстратов при вегетативном размножении перспективных сортов Ribes nigrum L. / С. В. Судейная, Л. Б. Утыро // Обогащение и сохранение генофонда на 123 основе повышения биологического потенциала растительных ресурсов : Сб. науч. тр. / БГПУ им. М. Танка. – Мн., 2000. – С. 89-92. 141. Тивари, Ш. Цитогенетическая гетерогенность андрогенных каллусов ячменя / Ш. Тивари, С. Колумбаева, И. Р. Рихимбаев // Цитология и генетика. – 1990. – С. 12-15. 142. Ткаченко, О. В. Оптимизация метода микроклонального размножения стевии / О. В. Ткаченко // Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования : VII межд. симп., 24-27 мая 2006 г.– Белгород, 2006. – Т.2. − С. 112-114. 143. Тулаева, М. И. Микроклональное размножение винограда на ионитных субстратах / М. И. Тулаева, С. А. Стыцко, З. Н. Белякова и др. // Садоводство и виноградарство. – 1990. − №9. – С. 14-16. 144. Туровская Н. И. Регулирование процесса ризогенеза при микроразмножении яблони / Н. И. Туровская // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве. − Мичуринск, 1989. − С. 8-13. 145. Туровская, Н. И. Микроклональное размножение малины / Н.И. Туровская, О. В. Стрыгина // Садоводство и виноградарство. – 1990. − №8. – С. 26-29. 146. Тюкавин, Г. Б. Основы метода андрогенеза моркови in vitro путем каллусогенеза / Г. Б. Тюкавин. – ГАВРИШ, 2006. − №4. – С. 28-32. 147. Тюкавин, Г. Б. Адаптация андрогенных растений регенерантов моркови in vitro / Г. Б. Тюкавин // Культурные растения для устойчивого с.х. в XXI веке (поиск, интродукция, создание, сохранение и использование в селекции): Научн. труды,. М – 2008. С. 151-155. 148. Тюкавин, Г.Б. Корреляция между морфологическими показателями генеративных органов растений моркови и стадиями развития микроспорогенеза / Г. Б. Тюкавин, С.В. Наумова // Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур : 124 Матер. междунар. науч.-практ. конф. (Москва, 7-9 авг., 2006). − М., 2006.− С. 287-295. 149. Тюленев, В. М. Получение растений-регенерантов из изолированных тканей земляники / В. М. Тюленев, С. Л. Расторгуев, И. И. Туровский // Бюл. Центр, генет. лаб. им. И. В. Мичурина. – Мичуринск, 1991. – Вып. 50. – С. 21-27. 150. Уоддингтон К. Морфогенез и генетика / К. Уоддингтон. − М.: Мир, 1964. – 259 с. 151. Фролова, Л. В. Оптимизация некоторых этапов клонального микроразмножения яблони / Л. В. Фролова // Плодоводство и ягодоводство России. − Москва, 2011.− Т. XXVI.− С. 250-254. 152. Хамукова, Ф. Н. Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения : автореф. дис. …канд. с.-х. наук / Ф. Н. Хамукова. – М., 1994. – 22 с. 153. Хасси, Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro / Г. Хасси // Биотехнология сельскохозяйственных растений. – М.: Агропромиздат, 1987. – С. 105-133. 154. Чайлахян, М. Х. Каллусная модель цветения и перспективы ее изучения / М. Х. Чайлахян, Н. П. Аксенова, Т. В. Баврина // Журнал общей биологии. – 1972. – 33, №5. – С.2 53-538. 155. Шамина, З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор / З.Б. Шамина // Культура клеток растений. – М., 1981. – С. 124–136. 156. Шмыкова, Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур : автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук / Н.А. Шмыкова. – М., 2006. – 48 с. 157. Шорников, Д. Г. Совершенствование технологии размножения редких садовых растений в культуре in vitro и оценка их потенциала 125 устойчивости к абиотическим стрессорам. дис. ... канд. с.-х. наук / Д. Г. Шорников. – М., 2008. – 192 с 158. Alston, F., Watkins, R. Apple breeding at East Malling // Proc. Eucarp. Fruit. Breed. Sump., 1973. – P. 14-29. 159. Angiboust, A. La multiplication vegetative «in vitro» – une nouvelle technique de point au service de lʼarboriculture / A. Angiboust // Arb. Fruit.An. – 1980. – V.27(322). – P. 39-46. 160. Arnison, P. G. Genotype – specific response of cultured broccoli (Brassica oleracea var. italica) anthers to cytokinins / P. G. Arnison, P. Donaldson, A. Jackson, C. Semple, W. A. Keller // Plant Cell Tiss, Org. Cult. – 1990. – V. 20. – P.217-222. 161. Bishnoi U. S. High frequency androgenesis in indica x Basmati rice hybrids using liquid culture media / U. S. Bishnoi, R. K. Jain, K. R. Gupta, V. K. Chowdhury, J. B. Chowdhury // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. – 2000. – 61, №2. C. 153-159. 162. Bryser, S. Wheat: production of haploids, performance of doubled haploids and trials / S. Bryser, Y. Henry // Crops B. – 1986. – V. 1. – P. 73-88. 163. Calamar Ana, de Klerk (Физиология и биохимия растений №3 2004 г) реферат №04.03-04В3.223. стр. 207-212. 164. Cresswell, R., Organ culture of Eucalyptus grandis L. / R. Cresswell, C. Nitsch. − Planta, 1975.− 125, №1.− Р. 87-90. 165. David, H., Isemukali, K., David, A. Obtention de plants de Pin maritime (Pinus pinaster Sol.) a partir de brachyblastes ou d ʼapex caulinaires de tres jeunes sujets cultives in vitro. – C. r. Acad. Sci. 1978, N 4, p. 245-248. 166. Daynan, Wang. Tissue Culture of Fruit Crops in Cina / Wang Daynan, Gui Yao-lin, Sun Jiang-San. – Hortsciehce. – 1988. −V.23, №6. – Р. 962-965. 167. DingYu-mei, Cheng Zai-quan, Hiang Xing-qi, Wang Ling-xian, Wu Chengjun / Xibei Zhiwu xuebao // Acta Bot. Boreali – Occident. Sin. – 2003. -23, №11. – C. 1922-1926. 126 168. Dodds, J.H. Experiments in plant tissue culture / J.H. Dodds, L. W. Roberts. − Cambridge: Cambridge Univ. press, 1985. −P. 157. 169. DʼOnofrio, C. Simultaneous regeneration of different morphogenic structures from quince leaves as affected by growth regulator combination and treatment length / C. DʼOnofri, S. Morini // Biol. Plant. – 2003. – V. 47, №3. – Р. 321-325. 170. Fang Shu-Gui, Zend Xiao-Ling, Zhu Chao-Hui, Lin Bi-Ying, Chen WenHui, Liao Xiao-Zhen. Wuhan Zhiwuxue yanjiu // S. Wuhan Bot. Res. – 2005. – 23, №6. – P. 530-534. 171. Fasolo, F. Adventitious shoot formation on excised leaves of in vitro grown shoots of apple cultivars / F.Fasolo, R. H. Zimmerman, I. Fordham // Plant Cell, Tissus Organ Cult. – 1989. – V. 16, № 2. – Р. 75-87. 172. Ferrie, A. M. Evalnation of Brassica rapa L., genotypes from for microspore culture response and identification of a highly embryogenic line / A. M. Ferrie, L. S. Epp, W. A. Keller // Plant Cell Repts. – 1995. – 14, №9. – P. 580-584. 173. Flehing-Haus, Roux T. Anther – culture ability in Secale cereals L. / Roux T. Flehing-Haus, S. Leimling, H. H. Veiger // Plant Breed. – 1995. – 114, №3. – P. 259-261. 174. Fridborg, G., Pedersen, M., Landstrom, L., Eriksson, T. The effect of activated charcoal on tissue cultures: adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis. – Physiol. Plant., 1978, N 2. p. 104-106. 175. Gou Shu-qiao, Fang Hai-juan, Wang Zhou-fei, Zhang Hong-sheng. Nanjing nongue daxue xuebao // S. Nanjing Agr. Uniw. – 2006. – 29, №2. – P.1-5. 176. Graig, I. Haloid Plants (2n = 21) fromin in vitro Anther culture of Triticum aestivum / I. Graig // Can. J. Genet. Cytol. – 1974. – V. 16. – P. 697-700. 177. Hempel, M. Application of drowth regulators for in vitro propagation of ornamental plants. – Acta hort., 1979, 91, p. 247-260. 127 178. Höfer, M. In vitro androgenesis in apple: Induction regeneration and ploidy level / M. Höfer // Progress in Temperate fruit Breeding. Kluwer Acad. Publ., 1994. – S. 399–402. 179. Höfer, M. Erzeugung von haploiden und DH-Material bei Apfel / M. Höfer // Erwerbs-Obstbau. – 1999. – 41, V. 3–4. – S. 143–148. 180. Hogue, E. J. Rapid production method for Ottawa-3 rootstock and branched apple nursery stock / E. J. Hogue, D. Neilsen // Hort. Sci. – 1991. – V.26(11). – P.1416-1419. 181. Hussey, G. In vitro method of plant propagation. – Sci. Hort., 1975, 27, N 1, p. 16-20. 182. James, D. J. Factors affecting high frequency plant regeneration from apple leaf tissues cultured in vitro / D. J. James, A. J. Passey, E. Rugini // J. Plant Physiol. – 1988. – V. 132, №2. – Р. 148-154. 183. Keller, W. A. Einige morphologische Aspekte bei der Kulture von Antheren / W. A. Keller, E. Klocke, H. B. Schmidt // Biol. Rundsch. – 1986. – V.24, № 6. – P. 367-381. 184. Kohlenbach, H. W. Comparative somatic embryogenesis. – In: Frontiers of plant tissue culture: Proc. 4th Intern. Congr. Plant, Tissue, Cell Cult. Calgary, 1978. P. 59-66. 185. Konieczhy, R. Two pathways of plant regeneration in wheat anther culture / R. Konieczhy, A. Z. Czaplicki, H. Golczyk, L. Przywara // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. – 2003. -73, №2. – P. 177-187. 186. Limasset, P., Cornuet, P. Recherche de virus de la mosaique du tabac (Marmor Tabaci, Holmes) dans les meristemes des plantees infectees. – C. r. Acad. Sci. D, 1949, 228, p. 1971-1972. 187. Li Wei-dong. Hebei nongye daxue xuebao / Li Wei-dong, Ge Hui-bo, Zhou Chun-jiang, Zhang Jie // J. Agr. Hebei. – 2004. –V. 27, №2. – P. 59-63. 128 188. Lin Gang, He Yonggang, Liu Yong, He Guangyuan. Huazhong keji daxue xu-ebao. Ziran Kexue ban // J. Hualhong Univ Sci. and Techol. Natur. Sci. – 2004. – 32, №9. – P. 111-113. 189. Lee, H. In vitro propagation of Muscanide grape by axillary shoot proliferation / H. Lee, H. Y. Wetstein // J. of American society Hortic. Sci. – 1990. – V.115, №2. – Р. 324-329. 190. Lopez-Perez, A. J. High embryogenic ability and plant regeneration of table grapevine cultivars (Vitis vinifera L.) induced by activated charcoal / A.J. Lopez-Perez, J. Carreno, A. Matrinez-Cutillas, M. Dabauza // Vitis. – 2005. – 44, №2. – P. 79-85. 191. Maheshwari, S.C. Haploids from pollen grains – retrospect and prospect / S.C. Maheshwari, А. Rashid, А.К. Gyagi // Amer. J. Bot. – 1982. – V. 69, № 5. – P. 865–879. 192. Masoje, R. Responsiveness to another culture in cultivars and F, cros ses of spring wheat / R. Masoje, O. M. Lukow, R. S. H. McKenzie, N. K. Howes // Can. S. Plant Sci. – 1993. − 73, №3. – P. 777-783. 193. Meyer, M. M. Propagation of tall bearded irises by tissue culture / M.M. Meyer, L. H. Fuchigami, A. N. Roberts. – HortScience.− 1975.− 10, №5.− P. 479-480. 194. Monaco, L. C., Sondahl, M. R., Carvalho, A. et al. Application of tissue culture in the improvement of Coffee. – In: Apple. And fundam. Aspects plant cell, tissue and organ cult. B. etc.: Spring. – Verl., 1977, p. 109-130. 195. Morel, G. M. La culture in vitro du meristeme apical de certaines Orchidees. – C. r. Acad. Sci., 1963, 256, N 23, p. 4955-4957. 196. Murashige, T. Plant propagation through tissue cultures / T. Murashige // Plant Physiol. – 1974. – V.25. – P. 135-166. 197. Pedieri, S. High – frequency shoot regeneration from leaves of the apple rootstock M26 (Malus pumila Mill) / S. Pedieri, F. F. F. Malavasi // Plant Cell, Tissus Organ Cult. – 1989. – V. 17, №2. – Р. 133-142. 129 198. Pierik, R. L. M. In vitro culture of higher plants / R.L.M. Pierik. −Dordrecht: M. Nijhoff Publ., 1987. − P. 344. 199. Prakash, S. Indaction and growth of androgenic haploids / S. Prakash, Z. Giles // Int. Rev. Cytol. – 1987. – V. 107. – P. 273-292. 200. Pundir, N. S. Experimental embryology of Gossypium arboretum L. and G. hirsutum L. and their reciprocal crosses / N. S. Pundir // Bot. Gaz. – 1972. – V. 133, №1. – P. 7-26. 201. Rosati, P. Another culture of strawberry / P. Rosati, M. Devreux, U. Laneri // Hortscience. – 1975. – V. 10. – P. 119-120. 202. Rose Ju. B.,Dunwell J. M., Sunderland N. Plant Cell and Tissue Organ Culture.− 1986.− V. 6, №1.− P. 15. 203. Roulund, N. Effect of genotype, environment and carbohydrate on another culture response in head cabbage (Brassica oleraceae L. Convar. capitata L.) Alef. / N. Roulund, L. Hansted, S. B. Andersen et al.− 1990. – 49, №3. – P. 237-242. 204. Rudolf, K. Microspore culture of white cabbage, Brassica oleraceae var. capitata L.: Genetic improvement of non-responsive cultivars and effect of genome doubling agents / K. Rudolf, B. Bohanes, M. Hansen // Plant Breeed. – 1999. – 118, №3. – P. 237-241. 205. Shi Li-li Tiajin nongxueyuan xuebao / Shi Li-li, Zhang Lei, Zhang Xin, Shi Yeng-Xin, Li Ming, Wang Son-wen // J. Tianjin Agr. Coll. 2007. 14 №2/ - C. 1-4 206. Steeves, T. A. A atudy of the development potentialities of excised leaf primordial in sterile culture. – Phytomorphology, 1961, N 4, p. 346-359. 207. Steeves, T. A., Sussex, I. M. Studies on the development of excised leaves in sterile culture. Amer. J. Bot., 1957, N 8, p. 665-673. 208. Stewart, J. In ovuloe embryo culture and seedling development of cotton (G. hirsutum L.) / J. Syewart, D. Mc, C. L. Hsu // Planta. – 1977. – V.137, №2. – Р. 113-117. 130 209. Sunderland, N. Multicellular pollen formation in cultured barley anther. Independent division of the generative and vegetative cells // N. Sunderland, M. Roberts, L. Y. Evans, D. C. Wildon // S. Exp. Bot. – 1979. – V. 30, w. 119. – P. 1133-1144. 210. Sussex, I. M., Clutter, M. E. A study of the effect of externally supplied sucrose on the morphology of excised fern leaves in vitro. – Phytomorphology, 1960, N 1, p. 87-99. 211. Tobutt, K. Breeding columnar apples // Graving today, 1985, Vol. 2, № 4. – P. 14-15. 212. Trejo-Tapia Gabriela, Amaya Uriel Maldonado, Morales Guadalupe Solcedo, Sancher Antonia De Jesus, Bonfil Blanca Martinez, Rodrigues – Monroy Mario, Jimenez – Apariceo Antonio // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. – 2002. – 71, №1. – P. 41-46. 213. Tretyakova, Sraida N. Induction of androgenic cultures of Siberian larch (Larix sibirica Ledeb) / Sraida N. Tretyakova, Alonya S. Vyazovetskova, Anna S. Svanova // Eurasion S. Forest Res. – 2006. – 9, №1. – Р. 37-44. 214. Vaithiyalingan, M. Effect of 2,4-D casein – hydrolysate on callus induction and differentiation in Pigeon pea (Cajanus cajan) / M. Vaithiyalingan, N. Nadarajan // J. Ecobiol. – 2004. – 16, №2. – P. 119-122. 215. Vegvari G., Vertesy J. Further information to acclimatization of «in vitro» // International Journal of Horticultural Science. – 1999. – V. 5, № 3-4. – P. 54-58. 216. Wang Yu. Mailei zuowu xuebao / Wang Yu, Fan Qing-qi, Zhaug Li, Sui Xin-xia, Li Yen-ying, Chi Xiu-sheng, Zhang Xian-sheng, Hiang Cheng-yan // Acta Tritical Crops. 2007 №5, - C. 755-760. 217. Watkins, R. Breeding apple cultivars for the Future / R. Watkins, F. H. Alston // Fruit-Present and Future. – 1973. – V. 2. – P 65-74. 218. Welander, M. R. Plant regeneration from leaf and stem segments of shoots raised in vitro from mature apple trees / M. R. Welander // J. Plant Physiol. – 1988. – V. 132, №6. – Р. 738-744. 131 219. Xie Miao, Qin Li – ying, Pan Sun – song, He Huan – le, Wu Ai – zhong, Cai Run. Xibei zhiwu xuebao // Acta bot. boreali – occident. sin. – 2005. – 25, № 6. – P. 1096-1100. 220. Xynias, I. N. Lov temperature pretreatment effect on embryoid induction in bread wheat (Triticum aestivum) anther culture / I. N. Xynias, I. A. Zamani, E. Gouli-Vavdinoudi, D. G. Roupakias // Юбилеен собрник научни доклада «75 годани висше лесотехническо образование в България». Секц. Ветеринарна медицина. Агрономство / Лесотехн. Ун-т. – София, 2000. – Р. 270-275. 221. Yae, B. W. Influence of photoperiod, apical meristem and explants orientation on axillary shoot proliferation of apple cultivars in vitro / B. W. Yae, R. H. Zimmerman, I. Fordham, K. S. Ko // J. Amer. Soc. Hort. Sci. – 1987. – V.112, №3. – Р. 588-592. 222. Yan Li-Xia. Yunnan zhiwu yanjin / Yan Li-Xia, Hu Chun-Gen, YaojiaLing // Acta bot. yunnanica. 2007. 29, №1, P. 33-37. 223. Zagorska, Nedialka. In vitro androgenesis in sonre economically important species: [Pop] / Nedialka Zagorska, Roumiana Pundeva // Collog Impost. biotechnol. dans secteur veg. agro – aliment. Amiens 10-12 July, 1989: Bull, Soc. bot. Fr. Actual. bot. – 1990. – 137, № 3-4. – P. 144-145. 224. Zagorska, N. A. Induced androgenesis in tomato: J. Influence of genotype on androgenetic ability / N. A. Zagorska, A. Shtereva, B. D. Dimitrov, M. M Kruleva // Plant Celle Repts. – 1998. – 17, № 12. – P. 968-973. 225. Zenkteler, M. Induction of androgenetic embryoids in the in vitro cultured anthers of several species / M. Zenkteler, E. Misiura, E. Ponitka // Experientia. – 1975. – V.31. – P. 289-291. 226. Zhao Sing, Sun Meng-Xiang. Wuhan Zhiwuxue yanjiu // J. Wuhan Bot. Res. – 2005. – 23, №6. P. 519-523. 132
