Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская
advertisement
1 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук На правах рукописи Кузнецова Марина Валентиновна МИКРОБИОЛОГИЯ НОЗОКОМИАЛЬНОЙ СИНЕГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ: МОНИТОРИНГ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ 03.02.03. – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна доктор медицинских наук, чл.-корр. РАН, профессор Демаков Виталий Алексеевич Пермь – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................................... 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................ 16 1.1. Этиологическое значение Pseudomonas aeruginosa и разнообразие нозологических форм синегнойной инфекции .......................................................................................................... 16 1.2. Микробиологическая характеристика P. aeruginosa .............................................................. 23 1.2.1. Общая характеристика микроорганизма ....................................................................... 23 1.2.2. Продукция факторов патогенности и антибактериальных веществ ........................... 24 1.2.3. Подвижность и пленкообразующая способность ......................................................... 35 1.2.4. Pseudomonas aeruginosa в планктонной и пленочной смешанной культуре in vitro (антагонистическая активность) ............................................................................................... 39 1.2.5. Влияние экзопродуктов P. aeruginosa на функциональную активность нейтрофилов ...................................................................................................................................................... 41 1.2.6. Распространенность фенотипов резистентности .......................................................... 42 1.2.6.1. Молекулярная эпидемиология бактерий P. aeruginosa, продуцирующих карбапенемазы ........................................................................................................................ 44 1.3. Методы микробиологического анализа для идентификации, типирования и оценки патогенного потенциала Pseudomonas aeruginosa .............................................................. 47 1.3.1. Бактериологический метод.............................................................................................. 47 1.3.2. Молекулярные технологии, используемые для генотипической характеристики Pseudomonas aeruginosa............................................................................................................. 50 1.3.2.1. Идентификация и прямая детекция ......................................................................... 50 1.3.2.2. Методы генетического типирования ....................................................................... 53 1.3.3.3. Генотипы вирулентности и антибиотикоустойчивости ........................................ 58 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................... 64 2.1. Анализ медицинской документации ......................................................................................... 64 2.2. Бактериальные штаммы .............................................................................................................. 65 2.3. Среды и условия культивирования ........................................................................................... 66 2.4. Молекулярно-генетические исследования ............................................................................... 67 2.4.1. Идентификация/детекция бактерий................................................................................ 68 2.4.2. Генетическая детерминация эффекторов TTSS ............................................................ 69 2.4.3. Определение детерминант антибиотикоустойчивости ................................................ 70 2.4.4. Проведение секвенирующей реакции ............................................................................ 71 3 2.4.5. Методы генетического типирования .............................................................................. 72 2.5. Фенотипические методы определения факторов патогенности ............................................... 73 2.5.1. Определение степени гидрофобности поверхности бактериальных клеток (BATHтест).............................................................................................................................................. 73 2.5.2. Определение адгезивных свойств................................................................................... 73 2.5.3. Определение биопленкообразующей способности ...................................................... 74 2.5.4. Определение экзопродуктов ........................................................................................... 75 2.5.5. Определение гемолитической активности .................................................................... 76 2.6. Фенотипическая оценка антибиотикоустойчивости................................................................ 77 2.7. Оценка интенсивности биолюминесценции.............................................................................. 77 2.8. Экстракция АТФ из клеток в составе биопленок и определение концентрации внутриклеточного АТФ ......................................................................................................... 77 2.9. Экспериментальные процедуры по изучению антагонистической активности P. aeruginosa и оценке ее роли в межвидовых взаимоотношениях .......................................................... 78 2.9.1. Оценка антагонистической активности супернатантов P. aeruginosa. ....................... 78 2.9.2. Определение токсичности супернатантов P. aeruginosa.............................................. 78 2.9.3. Оценка влияния супернатантов P. aeruginosa на планктонные и биопленочные культуры E. coli. ......................................................................................................................... 79 2.9.4. Совместное культивирование P. aeruginosa и E. coli. .................................................. 79 2.10. Оценка апоптоза, некроза и продукции активных форм кислорода нейтрофилов............. 80 2.11. Микроскопические методы оценки биопленок (атомно-силовая и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия) ................................................................................................. 81 2.12. Статистические методы ............................................................................................................ 81 ГЛАВА 3. МОНИТОРИНГ PSEUDOMONAS AERUGINOSA В СТАЦИОНАРАХ РАЗЛИЧНОГО ПРОФИЛЯ ВЗРОСЛОЙ И ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНСКОЙ СЕТИ................................................................................................................................................... 83 3.1. Инфицированность пациентов и частота встречаемости P. аeruginosa в спектре микробных культур..................................................................................................................................... 83 3.2. Распространенность P. aeruginosа в стационарах хирургического профиля ........................ 86 3.2.1. Частота выделения P. aeruginosа от пациентов, госпитализированных в хирургические стационары различного профиля ................................................................... 86 3.2.2. Характеристика антибиотикоустойчивости изолятов P. aeruginosа........................... 90 3.2.3. Микробные ассоциации с участием P. aeruginosa при гнойно-септических осложнениях у пациентов стационаров хирургического профиля ....................................... 94 4 3.2.4. Роль P. aeruginosa в этиологии инфицированных ожоговых ран .............................. 96 3.3. Особенности циркуляции P. aeruginosa в акушерских стационарах ..................................... 99 ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ В ИДЕНТИФИКАЦИИ/ДЕТЕКЦИИ, ТИПИРОВАНИИ И ОЦЕНКЕ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P. AERUGINOSA ......................................................... 105 4.1. Сравнительный анализ применения культурального и молекулярно-генетического методов для определения видовой принадлежности P. aeruginosa ............................................... 105 4.2. Применение ПЦР-анализа для контроля обсемененности объектов внешней среды ........ 111 4.3. Генотипирование нозокомиальных культур P. aeruginosa ................................................... 112 4.3.1. Сравнительная оценка диагностической значимости RAPD- и Rep-ПЦР при генотипировании клинических изолятов P. aeruginosa ....................................................... 112 4.3.2. Эпидемиологическая характеристика (основные геномоварианты) P. aeruginosae, циркулирующих в ЛПУ различного профиля ....................................................................... 117 4.3.3. Генетическое разнообразие blaOXA-50-like как основа выявления родства изолятов P. aeruginosa ............................................................................................................................. 120 4.4. Молекулярные механизмы устойчивости нозокомиальных штаммов P. aeruginosa к беталактамным антибиотикам .................................................................................................... 123 4.4.1. Распространенность оксациллиназ с БЛРС-фенотипом............................................. 123 4.4.2. Поиск и изучение генов, кодирующих металло-бета-лактамазы. ............................ 125 4.5. Генетические профили цитотоксичности штаммов P. aeruginosa ....................................... 131 4.6. Использование мультилокусной ПЦР-тест системы в оценке клиникоэпидемиологической значимости изолятов P. aeruginosa ................................................ 133 ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P. AERUGINOSA ......................................................... 136 5.1. Разнообразие фенотипов клинических штаммов P. aeruginosa ........................................... 136 5.2. Оценка пигментообразования штаммами P. aeruginosa ....................................................... 138 5.3. Комплексная оценка гемолитической активности P. aeruginosa ......................................... 139 5.3.1. Внеклеточные факторы гемолитической активности................................................. 140 5.3.2. Клеточно-ассоциированный гемолиз ........................................................................... 141 5.4. Особенности формирования биопленок нозокомиальными штаммами P. aeruginosa ...... 146 5.4.1. Взаимосвязь гидрофобных свойств поверхности, адгезивной активности и биопленкообразующей способности клеток бактерий ......................................................... 146 5.4.2. Биопленкообразующая способность как маркер госпитальности клинических изолятов..................................................................................................................................... 155 5 5.5. Оценка потенциальной патогенности клинических штаммов P. aeruginosa биолюминесцентным методом ............................................................................................ 157 5.6. Модификация биологических свойств клинических штаммов P. aeruginosa при многократных пересевах и хранении на искусственных питательных средах .............. 163 ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА СИМБИОТИЧЕСКИХ/АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ P. AERUGINOSА И КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ УПМ В ПЛАНКТОНЕ И БИОПЛЕНКЕ (in vitro) .................................................................................. 170 6.1. Изучение межвидовых взаимодействий нозокомиальных штаммов в биопленках ........... 170 6.1.1. Влияние супернатантов УПМ на пленкообразующую способность P. aeruginosa . 170 6.1.2. Формирование смешанных биопленок P. aeruginosa с представителями других таксонов УПМ .......................................................................................................................... 172 6.2. Влияние экзометаболитов P. aeruginosa на планктонные и пленочные культуры E. coli..173 6.3. Характер взаимоотношений P. aeruginosa и E. coli при совместном культивировании в планктоне и биопленке ........................................................................................................ 179 6.4. Влияние супернатантов смешанной культуры P. aeruginosa и E. coli на апоптоз, некроз и окисислительную активность нейтрофилов ...................................................................... 190 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................................. 193 ВЫВОДЫ ......................................................................................................................................... 205 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................................... 207 СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................. 208 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................ 209 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) является хорошо известным возбудителем инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), у ослабленных больных с тяжелой соматической или хирургической патологией и остается наиболее важным микроорганизмом, ответственным за развитие легочной патологии при муковисцидозе. Как отмечают многие исследователи, синегнойная палочка занимает особое место в развитии инфекционных осложнений в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), доминируя в этиологии нозокомиальной пневмонии, связанной, в основном, с искусственной вентиляцией легких (ИВЛ), и определяя высокий уровень атрибутивной летальности (Torres A., Carlet J., 2001; Lyczak J.B. et al., 2002; Зубков М.Н., 2003; Сидоренко С.В., 2003, 2005; Руднов В.А. и соавт., 2005, 2011; Решедько Г.К. и соавт., 2006; Govan J.R. et al., 2007; Vincent J.L. et al., 2009; Kohlenberg A. et al., 2010; Bertrand X., Dowzicky M.J., 2012 и др.). Способность P. aeruginosa колонизировать практически любой орган или ткань и вызывать разнообразные инфекционные процессы, в том числе с летальным исходом, связана со значительным арсеналом факторов вирулентности. Часть из них ассоциирована с клеточной стенкой (жгутики, пили, «непилевые» адгезины, альгинат, липополисахарид), другие – являются экстрацеллюлярными продуктами (экзотоксин А, гемолизины, протеазы, пиоцианин, пиовердин и др.) (Berka R.M., Vasil M.L., 1982; Frank D.W., 1997; Van Delden C., Iglewski B.H., 1998; Armstrong S. et al., 2002; Davey M. et al., 2003; Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2005; Filloux A., 2011 и др.). Продукция большинства из них контролируется регуляторным комплексом «quorum sensing» (QS), включающим межклеточные сигнальные системы, что позволяет бактериям продуцировать эти факторы скоординированно. Под контролем этой системы находится синтез практически всех внеклеточных энзимов, проявляющих токсические свойства, и образование биопленок, обеспечивающих им защиту от антибактериальных препаратов (АБП), а также влияния иммунной системы макроорганизма. Высокая резистентность к различным классам антимикробных препаратов является важным свойством P. aeruginosa, которое обеспечивается, прежде всего, за счет особенности строения клеточной стенки, ферментативной продукции и систем активного выброса (эффлюкс-систем) антибиотиков (Livermore D.M., 2002; Queenan A.M., Bush K., 2007). Популяции синегнойной палочки гетерогенны по способности к синтезу и секреции различных метаболитов, и принято считать, что нозокомиальные эковары отличает повышенная вирулентность. Однако остается до конца не выясненным, что обеспечивает ее рост: расширение спектра экспрессируемых факторов патогенности или увеличение активности тех 7 из них, которые потенцируются в специфических условиях внутрибольничной среды. Эффективность микробиологического мониторинга в стационарах различного профиля в значительной степени зависит от используемых при этом диагностических тестов. Из многочисленных свойств синегнойной палочки в лабораторной практике в лучшем случае определяют пигментообразование, гемолитическую и фосфолипазную активность при культивировании на соответствующих агаризованных средах, учитывая лишь факт наличия того или иного признака. Такой подход не позволяет оценить истинный уровень вирулентности изолята и делает Многочисленными невозможным сравнительный исследованиями анализ установлена циркулирующих многофакторность штаммов. процесса биопленкообразования у P. aeruginosa (O'Toole G.A., Kolter R., 1998; Klausen M. et al., 2003; Ghafoor A. et al., 2011; Маянский А.Н. и соавт., 2012 и др.), но его значение в контексте внутрибольничной природы изолятов до конца не определено. Пациенты с иммунодефицитными состояниями особенно уязвимы в отношении полиэтиологичных инфекций, частота возникновения которых превышает 50% (Шпрыкова О.В., 2004; Ustin J.S., Malangoni M.A., 2011 и др.). Развитие микст-инфекции зачастую определяется возможностью межвидового взаимодействия и зависит, прежде всего, от антагонистической активности бактерий, входящих в сообщество (Бухарин О.В. и соавт., 2005, 2007). В ассоциациях с другими грамотрицательными и грамположительными бактериями или грибами P. aeruginosa занимает различные позиции (Tomlin K.L., 2001; Bandara H.M. et al., 2010; Yang L. et al., 2011; Machado I.M. et al., 2012; Conway C.A. et al., 2012). Большая часть исследователей рассматривает процессы, происходящие в смешанной культуре, либо только в планктоне, либо только в биопленке (Chu W. et al., 2012; Machado I.M. et al., 2012). Единичные исследования посвящены влиянию экзопродуктов в составе супернатантов P. aeruginosa на рост в планктоне и биопленкообразование E. coli, и наоборот (Valle J. et al., 2006; Lopes S.P. et al., 2011). В доступной литературе не обнаружено информации о смешанной культуре E. coli и внутрибольничной P. aeruginosa с различной предоминантной формой существования («биопленочная» или «планктонная»), тогда как преимущественный фенотип может влиять на физиологическую адаптацию микроорганизмов в многовидовых сообществах. Пока недостаточно данных, связанных с влиянием внеклеточных факторов P. aeruginosa на зрелую/сформированную биопленку других видов бактерий (Irie Y. et al., 2005; Qin Zh. et al., 2009). Для оценки антимикробных свойств экзометаболитов используют подход, основанный на их способности ингибировать биолюминесценцию бактерий-мишеней (Simon L. et al., 2001; Zrimec M.B. et al., 2004; Несчисляев В.А. и соавт., 2002; Дерябин Д.Г., 2009). Включение полного люкс-оперона в E. coli (Данилов В.С. и соавт., 2002) позволяет по биолюминесценции 8 оценить бактериальную метаболическую активность одного из членов ассоциации в смешанной культуре. Но использование биолюминесценции как показателя антагонистических взаимоотношений в многовидовых биопленках не показано. Использование клеточных моделей для изучения взаимодействия бактерий в смешанных культурах показывает, что их уровень цитотоксичности выше по сравнению с моновидовым действием. В доступной литературе чаще описано влияние на клетки макроорганизма «чистых» экзопродуктов P. aeruginosa. Выявлено, что пиоцианин усиливает апоптоз нейтрофилов in vitro (Usher L.R. et al., 2002) и in vivo (Allen L. et al., 2005). Кроме этого, обнаружено, что экзополисахарид P. aeruginosa Psl, участвующий в формировании биопленки, угнетает комплемент-опосредованную опсонизацию бактерий, снижает продукцию реактивных кислородных радикалов нейтрофилами и, соответственно, их фагоцитарную активность (Mishra M. et al., 2012). Показана индукция апоптоза нейтрофилов периферической крови после введения липополисахарида E. coli in vivo (Chikayama Y. et al., 2002). Можно полагать, что от присутствия в среде экзометаболитов микробного происхождения, синтез которых может изменяться в смешанных культурах, зависит функциональная активность нейтрофилов и других эффекторов иммунитета. Идентификация синегнойной палочки в практических бактериологических лабораториях осуществляется культуральным методом согласно Приказу Минздрава СССР от 22.04.85 г. №535 и «Методическим рекомендациям …» МЗ РСФСР от 03.06.1986 г. Для видовой идентификации P. aeruginosa с помощью ПЦР используют различные генетические мишени: toxA, gyrB, cfX, algD, oprI и oprL (Da Silva Filho L.V., 1999; Khan A.A., Cerniglia C.E., 1994; Lavenir R. et al., 2007; Motoshima M. et al., 2007 и др.). В целом проблема привлечения современных технологий для генотипической характеристики нозокомиальных изолятов P. aeruginosa далека от своего решения: нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и соответствующие праймеры для идентификации и типирования P. aeruginosa. Таким образом, высокая распространенность и атрибутивная летальность от внутрибольничного инфицирования P. aeruginosa в сочетании с недостаточно информативной лабораторной оценкой биологических особенностей нозокомиальных изолятов, необходимость внедрения новых технологий микробиологического анализа в диагностику синегнойной инфекции, назревшая потребность в уточнении роли микробного фактора в развитии инфекционного процесса послужили основанием для проведения настоящего исследования. Цель исследования: комплексная оценка фено- и генотипических особенностей нозокомиальных штаммов P. aeruginosa с использованием традиционных и новых технологий 9 микробиологического анализа как основы совершенствования диагностики и мониторинга госпитальной синегнойной инфекции. Задачи исследования: 1. Оценить многолетнюю динамику распространенности P. aeruginosа, определить ее место в общей таксономической структуре микроорганизмов, изолированных в терапевтических, хирургических и акушерских стационарах, а также определить значимость возбудителя при развитии основных клинических форм инфекции. Проанализировать особенности циркуляции P. aeruginosа в детской и взрослой клинике. 2. Оценить целесообразность молекулярно-генетических подходов при определении видовой принадлежности, антибиотикоустойчивости, цитотоксичности изолятов в клинической практике, а также оптимизировать методы их детекции/идентификации и генотипирования для повышения эффективности мониторинга синегнойной инфекции. 3. Дать характеристику биологических свойств нозокомиальных штаммов P. aeruginosа в зависимости от профилизации стационара и исследуемого клинического материала с количественной оценкой продукции пиоцианина, пиовердина, гемолизинов, учитывая влияние различных факторов и сроков хранения культур. 4. Оценить биопленкообразующую способность P. aeruginosа in vitro в зависимости от функциональных Установить особенностей наиболее штаммов информативные и некоторых показатели, абиотических факторов. характеризующие клинико- эпидемиологическую значимость изолятов, и предложить интегральный критерий для оценки их потенциальной патогенности. 5. В экспериментальных условиях изучить характер симбиотических/антагонистических взаимоотношений P. aeruginosа с клинически значимыми условно-патогенными микроорганизмами (УПМ) в планктоне и биопленках. Оценить влияние супернатантов смешанной культуры на апоптоз, некроз и окислительную активность нейтрофилов человека in vitro. Научная новизна работы. Впервые на основе комплексного ретроспективного сравнительного анализа официальных статистических данных охарактеризованы особенности циркуляции штаммов P. aeruginosa в детской (акушерской и подростковой) и взрослой (терапевтической и хирургической) клинике. Предложена принципиальная схема, определяющая значимость эндогенного и экзогенного инфицирования пациентов разных возрастных групп в зависимости от профиля стационара. Дополнены данные по частоте встречаемости у штаммов P. aeruginosa генов, кодирующих эффекторы секреторной системы третьего типа (TTSS), в зависимости от 10 характера и структуры ЛПУ (поликлинические и нозокомиальные изоляты, ОРИТ и «неОРИТ»), биологического материала, присутствия металло-бета-лактамаз (МБЛ). Показана возможность использования мультиплексной ПЦР для одновременной идентификации и детекции маркеров антибиотикоустойчивости и цитотоксичности с целью определения эпидемиологической/клинической значимости изолятов. С использованием комплекса современных лабораторных тестов изучены внутрибольничные штаммы P. aeruginosa и представлена сравнительная характеристика данных о гемолитической активности, продукции пиоцианина и пиовердина, способности к адгезии и биопленкообразованию, в том числе с оценкой корреляционных связей между признаками. Обоснована необходимость использования количественных характеристик таких показателей. Впервые проведена оценка вклада экзометаболитных и клеточно- ассоциированных факторов в гемолитическую активность клинических изолятов, предложен термин «гемолитический профиль» культуры. Изучена взаимосвязь разных факторов, определяющих пленкообразующую способность P. aeruginosa. Впервые на основе ряда признаков с использованием рутинных и специальных методов, включающих атомно-силовую, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию и АТФ-метрию, сформулирована гипотеза о предоминантной форме существования P. aeruginosa – «планктонной» или «биопленочной». Показано, что определяемая в биопленках концентрация внутриклеточного АТФ, характеризующая энергетический статус клеток в определенной фазе формирования биопленки, является важнейшим критерием для отбора штаммов с преимущественной «биопленочной» формой существования. Предложены и апробированы оригинальные тесты и дополнительные критерии для микробиологической характеристики этиопатогенов: 1) метод оценки потенциальной патогенности изолятов P. aeruginosa, основанный на изменении свечения люминесцентного тест-штамма при действии их экзометаболитов; 2) способ оценки характера межмикробных взаимоотношений в смешанных культурах, основанный на сравнении полученной экспериментально и теоретически рассчитанной биомассы многовидовой биопленки; 3) способ контроля бактериальной обсемененности объектов окружающей среды в медицинских учреждениях, основанный на молекулярно-генетическом анализе. Впервые предложено использовать сравнение нуклеотидных последовательностей гена blaOXA50like (SLST) для определения родства штаммов в локальных исследованиях (в ЛПУ замкнутого контура). Впервые проанализирован характер взаимодействия P. aeruginosa в смешанной культуре с учетом ее предоминантной формы существования, которая определяется значительной гетерогенностью, присущей внутрибольничным популяциям данного вида. При этом выявлены однонаправленные эффекты у всех изученных штаммов P. aeruginosa при росте в смешанной 11 культуре, а именно снижение общего уровня пиоцианина и пиовердина, подавление метаболического обмена E. coli, повышение биомассы биопленки в соответствии с детерминированной формой существования. Установлено, что в смешанном биопленочном сообществе биологическая активность ассоциантов подчиняется общим закономерностям, описанным для монокультур. Впервые определен характер межвидовых взаимоотношений в планктонных и пленочных культурах P. aeruginosa и E. coli с использованием биолюминесцентного анализа. Показано, что антагонистическая активность P. aeruginosa в отношении ассоцианта в планктоне сохраняется и в биопленке, способствуя выживанию клеток синегнойной палочки. Более того, при любом типе взаимоотношений с участием P. aeruginosa, последняя, как правило, занимает «выгодное» положение в различных экологических нишах. Впервые изучено модифицирующее влияние ассоциантов на повреждающее действие (апоптоз и некроз нейтрофилов) культуральных супернатантов P. aeruginosa in vitro, что, скорее всего, отражает эффекты при микст-инфекции in vivo. Теоретическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили сформулировать концепцию, дополняющую существующую гипотезу о роли микробного фактора в развитии инфекционного процесса, обусловленного P. aeruginosa. Фенотипическое разнообразие, опосредованное гетерогенностью популяций P. aeruginosa, благоприятствует колонизации различных биотопов макроорганизма, определяет многообразие нозологических форм синегнойной инфекции, течение инфекционного процесса – хроническое или острое, либо присутствие инфекта в микробиоте факультативных видов в качестве комменсалов. Характер межвидовых взаимоотношений с сопутствующей, как правило, также условно патогенной микрофлорой, детерминирован не только высокой антагонистической активностью P. aeruginosa в отношении ассоциантов, но и различными стратегиями выживания с учетом предоминантной формы существования, позволяющим бактериям данного вида занимать наиболее «выгодное» положение в смешанных сообществах. Многокомпонентные биопленки с участием P. aeruginosa отличаются массивностью и часто превосходят совокупные параметры моновидовых биопленок ассоциантов. Однако в их структуре жизнеспособность сохраняет преимущественно синегнойная палочка, используя и/или уничтожая «сожителей» за счет ими же спровоцированной гиперпродукции входящих в матрикс экзометаболитов, которые обеспечивают ее высокий антагонистический потенциал. Можно полагать, что наиболее тяжелое течение и моно-, и микст-инфекций связано с участием особых высоковирулентных клонов P. аeruginosa, которые могут формироваться в ЛПУ, либо попадать в них извне. При этом возникновение смешанных инфекций связано с присоединением P. аeruginosa к УПМ, первично инфицировавшим тот или иной биотоп, но не наоборот. Поэтому, как правило, P. aeruginosae препятствуют развитию других микроорганизмов, однако, легко входят в 12 ассоциации и могут присоединяться к текущему инфекционному процессу. Это определяет и высокую долю полимикробных инфекций с участием P. aeruginosа. Практическая значимость работы. Получены данные, характеризующие распространенность и особенности циркуляции штаммов P. aeruginosa в разных возрастных группах. По результатам исследований создана электронная база основных фенотипов, профилей антибиотикорезистентности и генотипов P. aeruginosae, циркулирующих в стационарах г. Перми, способствующая осуществлению эпиднадзора на территориальном уровне. Определены основные механизмы устойчивости к бета-лактамным антибиотикам в стационарах взрослой и детской медицинской сети. Предложены необходимые бактериологические, биохимические и молекулярно-генетические тесты для комплексной оценки патогенного потенциала Р. aeruginosa, оптимизированы подходы для типирования (определения родства) штаммов и разработан алгоритм их использования в системе эпиднадзора за госпитальными инфекциями на примере данного возбудителя. Предложен способ оценки межмикробных взаимоотношений в смешанных биопленочных культурах, который поможет прогнозировать характер развития инфекционного процесса при микстинфекциях. Использование подхода с применением молекулярно-генетического анализа для контроля обсемененности внешней среды лечебных учреждений повысит его качество. С учетом того, что в хирургических стационарах г. Перми циркулируют штаммы P. aeruginosa генотипа exoU+/blaVIM2, предложена мультиплексная ПЦР для выявления эпидемически значимых нозокомиальных изолятов. Для определения возможного развития микст-инфекции целесообразно оценивать и прогнозировать характер взаимоотношений P. aeruginosa в смешанных культурах in vitro с учетом изменения биолюминесценции тест-штамма, отражающей энергетический статус ассоцианта. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Современной особенностью нозокомиальной синегнойной инфекции является неравнозначность роли P. aeruginosa во взрослой и неонатальной клинике. Сохраняется приоритет возбудителя в ИСМП в хирургических стационарах взрослой сети, с доминированием в этиологии пневмоний, раневых, ожоговых и урологических инфекций, в том числе в составе ассоциаций с K. pneumoniae, A. baumannii и E. coli. В учреждениях родовспоможения P. aeruginosa не играет существенной роли ни в качестве колонизирующего микроорганизма, ни в качестве этиопатогена у новорожденных. 2. Диагностическая чувствительность и специфичность культурального метода и молекулярно-генетических технологий для идентификации P. aeruginosa сопоставимы и взаимозаменяемы в клинической практике. Методы молекулярной детекции маркеров цитотоксичности TTSS exoS и exoU, антибиотикорезистентности blaVIM и intI, а также 13 генотипирования rep-ПЦР и SLST blaOXA-50 оптимальны для быстрой оценки локальной эпидемиологической ситуации. 3. Для характеристики гемолитической активности нозокомиальных штаммов P. aeruginosa целесообразно анализировать «гемолитический профиль» культуры, складывающийся из термолабильного и термостабильного экзометаболитных компонентов, а также самостоятельно значимого клеточно-ассоциированного гемолиза. Штаммовые фенотипические характеристики, основанные на спектрофотометрическом количественном анализе факторов патогенности, коррелируют с предлагаемым индексом потенциальной патогенности, определяемым по изменению биолюминесценции тест-культуры E. coli lux+. 4. Массивность биопленки, жизнеспособность и энергетический статус входящих в нее клеток, наряду с другими морфо-функциональными особенностями, в том числе адгезивная активность и гидрофобность, а также их изменения в разных условиях обитания отражают адаптационные возможности P. aeruginosa и являются важнейшим критерием для отбора штаммов с преимущественной «планктонной» или «биопленочной» формой существования. 5. Различные стратегии выживания P. aeruginosa, обусловленные значительной гетерогенностью внутрибольничных популяций, зависят от ее антагонистической активности, предоминантной формы существования и отражаются на характере взаимоотношений с ассоциантами в планктонных и биопленочных смешанных культурах. Связь работы с научными программами. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ректор – заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор И.П. Корюкина) на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики (№ Государственной регистрации темы 01.2.00709668) в рамках комплексной темы НИР «Общественное здоровье и научные основы обеспечения санэпидблагополучия в Пермском крае» и в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (директор – д.м.н., член-корр. В.А. Демаков). Исследования выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Государственный заказ № 01200709668 по теме «Научные основы обеспечения и эпидемиологические механизмы профилактики различных инфекционных заболеваний» на 2012-13 гг.). Работа также поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (Грант №07-04-96093-р_урал_а «Исследование детерминант устойчивости сапрофитных грамотрицательных бактерий почвенной среды и факультативных комменсалов человека, с оценкой их перспективности для конструирования векторов клонирования», Грант №14-04- 14 01300 «Влияние экзопродуктов смешанных культур Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli на функциональную активность нейтрофилов»). Личный вклад автора. При планировании, организации и проведении исследований по всем разделам работы доля личного участия автора составляла не менее 80%. Автору принадлежит формулирование проблемы, постановка цели, задач и дизайна исследования, анализ фактического материала и обобщение результатов, подготовка научных публикаций и патентов. Ряд экспериментальных исследований был выполнен на базе лабораторий ФГБУН ИЭГМ УрО РАН. Автор благодарит за предоставленную возможность и содействие сотрудников и заведующих лабораториями: д.м.н., профессора Ткаченко А.Г., д.м.н., профессора Ширшева С.В., чл.-корр., д.б.н., профессора Ившину И.Б., а также Авдееву Н.С. (зав. референс-лабораторией, созданной на базе ГБУЗ ПК ГКБ №7 г. Перми, главного бактериолога г. Перми) и Проворову С.В. (зав. лабораторией ООО «ПРО-МЕД») за предоставленные данные по распространенности возбудителя и помощь в сборе культур P. aeruginosa, к.б.н. Эйдельштейна М.В. (зав. лабораторией антибиотикорезистентности НИИ антимикробной химиотерапии, ГБОУ ВПО «СГМА» МЗ РФ) за помощь в работе и ценные советы по интерпретации результатов молекулярно-генетических исследований. Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов исследования подтверждается анализом многолетней медицинской документации референслаборатории и других практических лабораторий города, значительным объемом собственных исследований, выполненных с применением современных, адекватных поставленным задачам бактериологических и молекулярно-генетических методов, использованием референтных штаммов, полученных из различных коллекций. Основные феномены, обнаруженные и изученные в ходе экспериментального исследования, были воспроизведены в опытах с разными клиническими штаммами P. aeruginosa. Полученные результаты обработаны с использованием лицензионных программ и современных методов статистического анализа. Диссертация апробировалась на заседании кафедры микробиологии и вирусологии с циклом КЛД ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ 27 марта 2014 г. (протокол № 9), межкафедральном научном координационном совете по проблемам общественного здоровья и санитарно-эпидемиологического обеспечения населения ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ 11 апреля 2014 г. (протокол № 1) и проблемной комиссии ФГБУН ИЭГМ УрО РАН 25 апреля 2014 г. (протокол №3). Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Современные проблемы эпидемиологии» (Н.Новгород, 2007), Международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008), VII Международной 15 конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет» (Пермь-Н.Новгород, 2008), VII Всероссийской конференции по проблеме «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), Краевой конференции «Проблема синегнойной инфекции в реанимационных отделениях ЛПУ» (Пермь, 2009), Российских выставках «Медицина и здоровье» (Пермь, 2012, 2013), научно-практических конференциях по медицинской микологии – XV и XVII Кашкинские чтения (Санкт-Петербург, 2012, 2014), а также представлены на X, XII и XIV Международных конгрессах по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID (Москва, 2008, 2010, 2012) и 4th Congress of European Microbiologists (Geneva, 2011). Оптимизированные методы идентификации/детекции и генотипирования изолятов P. aeruginosa используются в референс-лаборатории Пермского края на базе ГБУЗ ПК «Городская клиническая больница №7», ГБУЗ «Ордена «Знак Почета» Пермская краевая клиническая больница», МБУЗ «Городская больница №1 имени академика Вагнера Евгения Антоновича» г. Березники. Результаты выполненных исследований используются в лекционном курсе и на практических занятиях при обучении студентов и клинических интернов на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом КЛД ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ. Публикации. Материалы диссертации отражены в 64 печатных работах, опубликованных в международных и российских изданиях, в том числе в 3 обзорах, 22 экспериментальных статьях в журналах, включенных в список ВАК, 6 из которых входят в международные базы цитирования Web of Science/Scopus, а также в монографии и 4 Патентах РФ. 16 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Pseudomonas aeruginosa распространена повсеместно, и существенное значение в природной циркуляции возбудителя имеет вода. P. aeruginosa способна персистировать в разнообразных экологических ареалах, включая речные и морские бассейны (Pellett S. et al., 1983; Kimata N. et al., 2004), сточные воды (Ullah A. et al., 2012), бутилированную воду (AlQadiri H.M. et al., 2006), а также почвенные массивы (Cavalca L. et al., 2000). P. aeruginosa считают представителем нормофлоры человека. Она встречается на кожных покровах (до 2%), слизистой носа (до 3,3%), в ротоглотке (до 6,6%) в желудочно-кишечном тракте (от 2,6 до 24%) (Morrison A.J., Wenzel R.P., 1984). По мнению большого числа авторов P. aeruginosa является «квинтэссенциальным оппортунистическим патогеном», так как она может инфицировать довольно широкий круг хозяев, от амебы до человека (Rahme L.G. et al., 1995; Pukatzki S. et al., 2002; Ledbetter E.C. et al., 2009). Способность выживать в олиготрофных условиях позволяет ей колонизировать и различные госпитальные ниши, включая медицинское оборудование (Donlan R.M., 2001). Широкое представительство P. aeruginosa определено ее метаболической пластичностью и способностью синтезировать многочисленные факторы патогенности, такие как экзотоксин А, цитотоксины/гемолизины (фосфолипазы, рамнолипиды, белки III типа системы секреции), протеазы, пиоцианин, пиовердин, альгинат и др. (Smith R.S., Iglewski B.H., 2003). Часть из них обладает антимикробной активностью по отношению к большинству видов бактерий (Williams J.S., 2003). Регуляция генов, кодирующих основную долю экзопродуктов или участвующих в формировании биопленки, находится под контролем системы QS, в функционировании которой участвуют аутоиндукторы – ацилгомосеринлактоны (Van Delden C., Iglewski B.H., 1998). Важным свойством P. aeruginosa является и высокий уровень природной и приобретенной устойчивости к различным классам антимикробных препаратов, в основном за счет особенности строения клеточной стенки, ферментативной продукции и систем активного выброса (эффлюкс-систем) (Сидоренко С.В., 2003). 1.1. Этиологическое значение Pseudomonas aeruginosa и разнообразие нозологических форм синегнойной инфекции P. aeruginosa принадлежит к бактериям, которые в естественных условиях для человека считаются условно патогенными, так как далеко не во всех случаях развивается заболевание. Она может колонизировать различные участки тела, но для инвазии и возникновения инфекционного процесса необходимо повреждение кожных покровов или слизистых оболочек, либо избыточная доза микроорганизма. Вероятность инфекции значительно повышается у 17 иммунокомпромитированных людей, а также на фоне влияния стрессовых факторов, сопровождающих травмы, ожоги, различные хирургические вмешательства и тяжелую соматическую патологию (Зубков М.Н., 2003; Руднов В.А., 2005; Church D. et al., 2006). Поэтому инфекции, обусловленные P. aeruginosa, возникают чаще всего у госпитализированных больных, и ее доля в структуре нозокомиальных возбудителей составляет 9-20% (Козлов Р.С., 2002). P. aeruginosa является причиной поздних вентилятор- ассоциированных пневмоний, инфекций мочевых путей, раневых инфекций, катетерассоциированных ангиогенных инфекций, бактериемии, инфекций ожоговых ран и глаз (Van Delden C., Iglewski B.H., 1998). Значимость внутрибольничной синегнойной инфекции в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) не вызывает сомнений (Bertrand X. et al., 2001; Руднов В.А., 2002; Решедько Г.К. и соавт., 2006; Илюкевич Г.В. и соавт., 2008; Kohlenberg A. et al., 2010). Результаты многоцентровых европейских исследований свидетельствуют о том, что до 30% случаев внутрибольничных инфекций в ОРИТ вызваны синегнойной палочкой (Vincent J.L. et al., 2009; Bertrand X., Dowzicky M.J., 2012). Частота ее выделения в ОРИТ России по данным национального многоцентрового исследования РИОРИТа составила 29,9% (Руднов В.А. и соавт., 2011). Синегнойная палочка по-прежнему остается наиболее важным микроорганизмом, ответственным за развитие легочной патологии при муковисцидозе (Lyczak J.B. et al., 2002; Govan J.R. et al., 2007). Согласно United States Cystic Fibrosis Foundation Patients Registry (2011) P. aeruginosae составляют 51,7% всех респираторных культур, выделенных от пациентов с фиброзом легких, осложненным персистирующей инфекцией. FitzSimmons S.C. (1993) проанализировал данные микробиологического изучения мокроты 17857 пациентов с фиброзом легких и показал, что P. aeruginosa является наиболее часто выделяемым из дыхательных путей микроорганизмом: 61% – от всех пациентов, 21% – у детей до года и 80% – от пациентов в возрасте 26 лет и старше. У детей, больных муковисцидозом, P. aeruginosa является основным возбудителем легочных осложнений в старшем возрасте, в том числе в составе ассоциаций с другими грамотрицательными неферментирующими микроорганизмами – Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii (Шагинян И.А. и соавт., 2011). По данным Красовского С.А. и соавт. (2011) P. aeruginosa была выявлена в 61,7% случаев осложненного муковисцидоза у взрослых. Показано, что наличие P. aeruginosa в мокроте у таких больных коррелирует с тяжестью течения основного заболевания (Govan J.R.W., Deretic V., 1996; Шагинян И.А. и соавт., 2011). Данный возбудитель играет ведущую роль в этиологии бактериемии при первичных иммунодефицитах, а также у пациентов с лейкемией и другими опухолевыми процессами (Fergie J.E. et al., 1994; Joo E.-J. et al., 2011). Инфицированность синегнойной палочкой 18 пациентов с ВИЧ-инфекцией почти в 10 раз выше, чем здорового населения и является причиной атрибутивной летальности в 50% случаев (Mendelson M.H. et al., 1994). Частота обнаружения P. aeruginosa у больных с нозокомиальной пневмонией варьирует в широких пределах (Руднов В.А., 2001). По результатам зарубежных исследований она составляет от 20 до 35% (Campbell G.D. et al., 2001; Tripathi P. et al., 2011; Goel V. et al., 2012). Российские динамические наблюдения (1997-98 гг. и 2002-03 гг.) показали, что частота выделения P. aeruginosa у пациентов с нозокомиальной пневмонией снизилась практически в 2 раза: с 39,7 до 19% (Гельфанд Б.Р. и соавт., 2003), но этот возбудитель продолжает оставаться доминирующим этиопатогеном при данной нозологии (Чучалин А.Г., Гельфанд Б.Р., 2009). У пациентов травматологических отделений P. aeruginosa является причиной нозокомиальной пневмонии в 11,5% случаев, в том числе в микст-инфекции (Жданюк А.С. и соавт., 2010). Частота выделения синегнойной палочки у пациентов с черепно-мозговыми травмами составила более 30% от всех культур (Слабенко Э.В., 2007). Анализ 190 случаев вентиляторассоциированной пневмонии выявил, что P. aeruginosa и другие псевдомонады высевались в 46,6% случаев (Гельфанд Б.Р. и соавт., 2000). Torres A., Carlet J. и Европейская целевая группа по изучению вентилятор-ассоциированной пневмонии (2001) сообщили, что роль P. aeruginosa как этиологического агента пневмоний увеличивается в более поздние сроки после начала ИВЛ. При нозокомиальных пневмониях, вызванных P. aeruginosa, зарегистрирован самый высокий показатель летальности – до 70-80% (Koenig S.M., Truwit J.D., 2006). P. aeruginosa играет важную роль при осложненных и нозокомиальных инфекциях мочевыводящих путей. По данным Лопаткина Н.А. и Деревянко И.И. (1997) доля P. aeruginosa в спектре возбудителей осложненных инфекций мочевыводящей системы составила 18% и, в частности, пиелонефрита – 22,4%. В исследовании, проведенном Кузнецовой О.П. и соавт. (1997), показано, что синегнойная палочка становится причиной острого пиелонефрита в 7% случаев у пациентов обычных отделений хирургических стационаров и в 17% – у больных ОРИТ. В общенациональном исследовании инфекций мочевыводящей системы, проведенном Обществом химиотерапии Японии, выявлено, что P. aeruginosa выделяется в 47,4% случаев, и чаще всего у пациентов с мочевыми катетерами (Ishikawa K. et al., 2011). В микробиологическом спектре возбудителей нозокомиальных интраабдоминальных инфекционных осложнений P. aeruginosa составила 10%, нозокомиальных инфекций мягких тканей – 11% (Гельфанд Б.Р. и др., 2003). Синегнойная этиология интраабдоминальных инфекций, а также инфекций кожи и мягких тканей является достоверным фактором риска неудач лечения таких поражений (Falagas M.E. et al., 1996). По данным Фоминых С.Г. (2011) P. aeruginosa сохраняет лидирующие позиции в структуре возбудителей раневых инфекций. 19 Усиливается клиническая и эпидемиологическая значимость микробных ассоциаций P. aeruginosa с A. baumannii (18,1%) и Enterococcus spp. (13,6%) (Гельфанд Б. Р. и соавт., 2003). Возрастает роль P. aeruginosa у кардиохирургических больных при медиастините, который заканчивается смертью больного чаще, чем аналогичный процесс, вызванный другими микроорганизмами (Ottino G.M.D. et al., 1987; Okonta K.E. et al., 2011). Главенствующая роль P. aeruginosa в этиологии инфекционных осложнений термических ран показана многими российскими исследователями, в том числе по результатам 30-летних наблюдений в ожоговом центре Института хирургии им. А.В. Вишневского РАМН (Крутиков М.Г., 2003), а также исследований, проведенных в Ожоговом центре Института травматологии и ортопедии г. Нижнего Новгорода за 2008-11 гг. (Гординская Н.А. и соавт., 2012). По данным, представленным в Национальном исследовании нозокомиальных инфекций Центра контроля за заболеваниями в США (National Nosocomial Infections Study of the Center for Disease Control) за 1974-78 гг. и 1980-98 гг. доля P. aeruginosa в ожоговых отделениях устойчиво сохранялась на уровне 20% (Mayhall C.G., 2003). Значимость P. aeruginosa в качестве этиопатогена ГСИ у ожоговых больных существенно выше в развивающихся странах. Исследователи из Ирана сообщили, что в период с 1995 по 1999 гг. полирезистентные штаммы P. aeruginosa были изолированы в 73,1% случаев, и это в конечном итоге привело к закрытию стационара в 2000 г. (Rastegar Lari A.R. et al., 2005). В 8-летнем наблюдении, выполненном в Государственном медицинском колледже и госпитале (Government Medical College and Hospital, Chandigarh) в Индии за периоды 1997-02 гг. и 2002-05 гг. показано, что доля P. aeruginosa в спектре микробных культур составила 58,9 и 51,5% соответственно (Mehta M. et al., 2007). Аналогичные данные приводят турецкие ученые за 2-летний период: P. aeruginosa от ожоговых больных изолировали в 57% случаев (Oncul O. et al., 2009). Существуют данные, что синегнойная палочка способна вызывать послеоперационный эндофтальмит и панофтальмит (Kashkouli M.B. et al., 2007). P. aeruginosa сравнительно редко выделяется из половых путей здоровых женщин, и ранее считалось, что ее роль в этиологии акушерских и гинекологических инфекций невелика (Воропаева С.Д., 2005). В то же время эти бактерии могут быть причиной эндометрита (в том числе послеродового), абсцедирующих формах сальпингита и параметрита, акушерского и гинекологического сепсиса (Подзолков Н.М., Никитина Т.И., 2004; Kaponis A. et al., 2012). При любой локализации первичного очага инфекции, обусловленной P. aeruginosa, возможно развитие бактериемии, существенно ухудшающей прогноз заболевания. По данным многоцентрового исследования SENTRY частота бактериемии, вызванной P. aeruginosa, составила около 5% (Biedenbach D.J. et al., 2004), в Американской группе SENTRY (США, Канада, Латинская Америка, 1997 г.) – 10,6% (Diekema D.J. et. al., 1999), при этом показатели 20 общей летальности достигали 40-75%, атрибутивной – 34-48%. При катетер-ассоциированных инфекциях кровотока P. aeruginosa выделяется в 4,9-6% случаев, контаминация этим микроорганизмом возможна с кожи рук медицинского персонала (Munoz P. et al., 2004; Бережанский Б.В., Жевнерев А.А., 2006). Летальность при синегнойной этиологии катетерассоциированных инфекций кровотока в странах Европы и США составляет до 50% (Зубков В.Н., 2008). Данные за 25-летний период наблюдения в ожоговых отделениях показали, что случаи бактериемии, ассоциированные с P. aeruginosa, выявлены у 10% больных, при этом смертность составила 77%, атрибутивная – 28% (McManus A.T. et al., 1985). Эпидемиология синегнойной инфекции имеет свои особенности в зависимости от профиля стационара: в онкологических и терапевтических отделениях преобладает эндогенное инфицирование, обусловленное колонизацией этим микроорганизмом кишечника. Напротив, у ожоговых и хирургических больных большое число случаев ГСИ связано с экзогенным инфицированием. Вероятность орофарингеальной колонизации P. aeruginosa возрастает по мере увеличения длительности пребывания в стационаре и (или) увеличения степени тяжести заболевания. При этом риск развития нозокомиальной пневмонии у пациентов с колонизацией верхних дыхательных путей неферментирующими бактериями и синегнойной палочкой возрастает почти в 10 раз по сравнению с лицами без заселения ротоглотки данными микроорганизмами (Чучалин А.Г., Гельфанд Б.Р., 2009). Как отмечают многие исследователи, особое место в развитии эпидемического процесса внутрибольничной синегнойной инфекции в хирургических стационарах отводится ОРИТ, характеризующимся чрезвычайно высоким риском возникновения ГСИ, превышающим таковой в других отделениях в 5-10 раз. Доказано, что по мере нахождения пациентов в ОРИТ важную роль приобретает экзогенное инфицирование больных P. aeruginosa (до 50 % случаев) (Bertrand X., 2001; Руднов В.А., 2002; Аветисян Л.Р. и соавт., 2012). P. aeruginosa передается через медицинское оборудование, в первую очередь через аппараты ИВЛ, и некоторые предметы специального ухода за больными (Donlan R.M., 2001). Описан факт инфицирования P. aeruginosa дыхательных путей пациентов при проведении трансэзофагеальной эхокардиографии во время операции на сердце (American Medical Association, 2012). Штаммы P. aeruginosa циркулируют среди персонала больницы и могут передаваться через руки, вызывая вспышки ИСМП (McNeil S.A. et al., 2001). Для выживания P. aeruginosa во внутрибольничной среде практически единственным условием является достаточная влажность. Синегнойную палочку выделяют с поверхности раковин, кранов, посуды, систем кондиционирования воздуха, медицинского инструментария, из препаратов крови и кровезаменителей, остатков пищи. Эти бактерии способны размножаться в широком диапазоне температур. Некоторые штаммы могут расти при 4ºС, что создает опасность контаминации препаратов, хранящихся в холодильнике (Зубков М.Н., 2003). 21 Значимость P. aeruginosa в этиологии внебольничных инфекций, как правило, невелика (Сидоренко и соавт., 1999). Тем не менее, она играет важную роль в развитии инфекций глаз и является самой частой причиной микробного кератита, связанного с применением контактных линз (Лещенко И.А., 2011; Shah A. et al., 2011). Анализ бактериальных случаев кератита в глазных клиниках Великобритании и США показал, что P. aeruginosa была этиопатогеном в 24,8 и 25,7% случаев соответственно (Gao A., 2009). Sirikul T. и соавт. (2008) сообщили, что доля P. aeruginosa вместе с другими Pseudomonas spp. в Таиланде, составляла 55%. В России данные по этиологии кератита крайне ограничены, но опубликованные за последние годы результаты исследований в РФ показывают, что P. aeruginosa вызывает 15,4% таких заболеваний (Шаимова В.А., 2007). Инфекции глаз, опосредованные этим микроорганизмом, приводят к быстрому ухудшению зрения до полной слепоты в связи с перфорацией роговицы, развитием вторичной глаукомы и катаракты (Лещенко И.А., 2011; Gao A., 2009). Результаты исследования структуры возбудителей инфекционных осложнений диабетической стопы при сахарном диабете за период 2006-08 гг. показали, что P. aeruginosa являлась ведущим грамотрицательным этиопатогеном (Привольнев В.В. и соавт., 2009). Ее доля в спектре бактерий, изолируемых в отделяемом язвенных поражений кожи, может составлять до 30% (Sivanmaliappan T.S., Sevanan M., 2011). Еще одним заболеванием преимущественно синегнойной этиологии при сахарном диабете в пожилом возрасте является некротический наружный отит, который в зарубежной литературе называется «злокачественным» и впервые был описан Chandler J. (1968). При хроническом среднем отите P. aeruginosa высевается у трети больных, а при хроническом гнойном среднем отите с холестеатомой – уже в 47,2% случаев (Мингболатова П.А., 2008). Удельный вес P. aeruginosa среди микробных культур, изолированных в детской клинике, достиг пика – порядка 30% – в начале 90-х годов XX столетия (Телятицкий Н.И., Абаев Ю.К., 2010). Она может быть причиной разнообразных патологических состояний у новорожденных, включая сепсис, пневмонию, менингит, диарею, конъюнктивит и инфекции кожи (Мусина Л.Т. и соавт., 1995; Самсыгина Г.А. и соавт., 2001; Телятицкий Н.И., Абаев Ю.К., 2010). По некоторым данным, доля Р. aeruginosa при сепсисе в неонатальном периоде может составлять до 60% (Chacko B., Sohi I., 2005). В обзоре, представленном Newton O., English M. (2007), удельный вес Р. aeruginosa в спектре микробных культур при сепсисе новорожденных составил 9,4% (по 14-ти наблюдениям разных групп). Результаты многоцентрового исследования, проведенного в США, показывают, что Р. aeruginosa высевается только в 3,6% случаев, с возрастанием значимости данного микроорганизма у детей более старшего возраста. Отмечен высокий процент летальных исходов (на втором месте после менингококкового сепсиса) (Watson S.R. et al., 2003). Российские наблюдения свидетельствуют о ее более 22 значительном удельном весе – 25,5% (Ковалева Е.П., Семина Н.А., 2002). Как правило, Р. aeruginosa выступает в роли возбудителя сепсиса у детей в ОРИТ, находящихся на ИВЛ и парентеральном питании, а также у онкогематологических и хирургических больных (Самсыгина Г.А., 2003). По данным зарубежных авторов доля P. aeruginosa в этиологии вентиляторассоциированных пневмоний у детей составляла от 19% до 56,8% (Apisarnthanarak A. et al., 2003; Foglia E. et al., 2007; Yankov I.V., Shmilev T.I., 2012; Cernada M. et al., 2013). Роль этих микроорганизмов возрастала в более старшем возрасте: распространение P. aeruginosa в ОРИТ педиатрической сети достоверно выше, чем в неонатальных отделениях (33,3% против 17%; p=0,01) (Foglia E. et al., 2007). Указывается на полимикробный характер инфекционного процесса (Apisarnthanarak A. et al., 2003). По результатам российских исследований, относительно этиологии вентилятор-ассоциированной пневмонии, у новорожденных в ОРИТ и в отделениях выхаживания наиболее часто встречались K. pneumoniae и P. aeruginosa (Фадеева Г.Б. и соавт., 2001). У недоношенных новорожденных P. aeruginosa выделяли в 15,2% случаев от общего числа микроорганизмов, при этом отмечена ее замедленная элиминация из дыхательных путей (Мархулия Х.М. и соавт., 2005). По данным Самсыгиной Г.А. и соавт. (2001) на долю P. aeruginosa приходилось 30,1% случаев внутрибольничных пневмоний, закончившихся смертью ребенка, при этом P. aeruginosa почти в 50% случаев регистрировалась в составе ассоциаций, а наиболее частыми были ассоциации с K. pneumoniae. Синегнойная палочка нередко является причиной заболеваний мочевыводящей системы у детей разного возраста, при этом P. aeruginosa вызывает упорно текущие варианты инфекции (Захарова И.Н., 2001; Bitsori M. et al., 2012). Бактериологические исследования детей с ифекционным поражением мочевыводящей системы, проведенные Катосовой Л.К. в течение 1983-91 гг., показали, что P. aeruginosa является основным микроорганизмом, ответственным за внутрибольничное инфицирование (Катосова Л.К., 1993). Более поздние исследования показали, что этиологическая значимость кишечной палочки при инфекциях мочевой системы у больных стационара снижается за счет увеличения и/или присоединения P. aeruginosa (около 30%) (Зорькин С.Н., 2010). Доказано, что предварительная госпитализация или лечение антибиотиками является фактором риска для синегнойной этиологии инфекций мочевыводящей системы у детей (Bitsori M. et al., 2012). Принято считать, что роль P. aeruginosa как этиопатогена при вспышках ГСИ в учреждениях родовспоможения менее значима по сравнению с другими грамотрицательными бактериями (Gastmeier P. et al., 2007; Dent A., Toltzis P., 2009). Однако показано, что эти микроорганизмы, персистируя в различных экологических резервуарах (трубки аппаратов ИВЛ, бутылочки с молоком и минеральной водой и др.), могут быть причиной вспышек и в 23 неонатальных отделениях (Garland S.M. et al., 1996; Muyldermans G. et al., 1998; Moolenaar R.L. et al., 2000; Loureiro M.M. et al., 2002; Gras-Le Guen C. et al., 2003; Majumdar S. et al., 2004; Crivaro V. et al., 2009). P. aeruginosa становится причиной младенческой смертности от 18,2 до 100% (62,7% – в среднем по восьми исследованиям) (Garland S.M. et al., 1996; Muyldermans G. et al., 1998; Gras-Le Guen C. et al., 2003; Crivaro V. et al., 2009; Sanchez-Carrillo С. et al., 2009; Naze F. et al., 2010). Факторами риска инфицирования младенцев P. aeruginosa являются предшествующее длительное использование антибактериальных препаратов, многократные инфузии, наличие венозного катетера, низкий вес при рождении (Muyldermans G. et al.,1998; Loureiro M.M. et al., 2002; Gras-Le Guen C. et al., 2003). 1.2. Микробиологическая характеристика P. aeruginosa В 1850 г. французский хирург S.E. Sédillot заметил, что хирургические раневые повязки изменяют окраску и становятся сине-зелеными, а сам пигмент был извлечен фармацевтом M.J. Fordos в 1860 г. Первое описание раневой инфекции, вызванной синегнойной палочкой, принадлежит A. Lucke (1862), который связал наличие пигмента с присутствием в ране палочковидных бактерий (Pitt T.L., 1998). Чистая культура микроорганизма была выделена C. Gessard в 1882 г. Он изучал ее культуральные свойства и опубликовал первую научную работу «Сине-зеленое окрашивание повязок», посвященную данному возбудителю (Classics in infectious diseases, 1984). 1.2.1. Общая характеристика микроорганизма P. aeruginosa по морфологии прямая или искривлённая с закруглёнными концами палочка, 1,0-5,0×0,5-1,0 мкм, амфитрих. Она хемоорганогетеротроф, аэроб/факультативный анаэроб, каталазо- и оксидазоположительная, спор и капсул не образует. P. aeruginosa растет при 42ºC (оптимум – 37ºC) на простых питательных средах: мясопептонный агар (среда окрашивается в сине-зелёный цвет) и бульон (в среде помутнение и пленка также сине-зелёного цвета). Селективными средами являются цитримидный (предложен E.J.L. Lowbury и соавт. в 1951 г.) и ацетамидный (предложен G.L. Gilardi и соавт. в 1974 г., которые показали, что некоторые неферментирующие бактерии продуцирует фермент ацетамидазу) агары. На твердых питательных средах P. aeruginosa диссоциирует на R-, S- и M-формы (Милько Е.С., Мартынкина Л.П., 1996). При росте на плотных средах у многих штаммов наблюдают феномен радужного лизиса. Синтезирует триметиламин, придающий культурам запах жасмина. Протеолитическая активность выражена: разжижает желатин, свертывает сыворотку крови, гидролизирует казеин. Сахаролитическая активность низкая: окисляет только глюкозу, не способна к ферментативному расщеплению многих углеводов. P. aeruginosa продуцирует характерные пигменты: феназиновые, в том числе пиоцианин (окрашивает питательную среду в 24 сине-зеленый цвет, экстрагируется хлороформом), пиовердин (желто-зелёный, флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах пигмент, сидерофор) и пиорубин (бурого цвета). Продукция пиоцианина усиливается при росте на среде КингА, пиовердина – на среде КингВ (King E.O. et al., 1954), но известны и беспигментные штаммы этого вида (Мороз А.Ф. и соавт., 1988). P. aeruginosae являются свободноживущими бактериями, чрезвычайно распространенными в окружающей среде, использующими в качестве источника энергии различные природные органические соединения. Некоторые штаммы осуществляют биодеструкцию углеводородов, в том числе формальдегида. Отличительная способность P. aeruginosa – ограниченная потребность в питательных веществах, обеспечивающая сохранение жизнеспособности в условиях почти полного отсутствия источников питания (Зубков М.Н., 2003). 1.2.2. Продукция факторов патогенности и антибактериальных веществ Способность P. aeruginosa поражать практически любой орган или ткань и вызывать разнообразные инфекционные процессы, в том числе с летальным исходом, связаны со значительным арсеналом факторов вирулентности. Некоторые из них ассоциированы с клеточной стенкой (жгутики, пили, «непилевые» адгезины, альгинат, липополисахарид), другие – являются экстрацеллюлярными факторами вирулентности (экзотоксин А, гемолизины, протеазы, пиоцианин, пиовердин и др.). Продукция большей части факторов контролируется регуляторным комплексом QS, включающим межклеточные сигнальные системы, что позволяет бактериям продуцировать их скоординированно. Под контролем этой системы находится образование биопленок, синтез практически всех внеклеточных энзимов, проявляющих токсические свойства (Van Delden C., Iglewski B.H., 1998). В число факторов вирулентности входят соединения, позволяющие микроорганизму переносить дефицит необходимых веществ, например, белки системы транспорта железа, реутилизации пуринов. Экзотоксин экстрацеллюлярный А. Экзотоксин белок, А обладающий был впервые высокой описан летальной Liu P.V. (1966) как активностью для экспериментальных животных (LD50 для мышей составила 0,2 мкг). Он принадлежит к семейству ферментов моно(АДФ-рибозил)трансфераз и наиболее близок к НАД+-дифтамид АДФ-рибозилтрансферазам (EC 2.4.2.36) (Domenighini M., Rappuoli R., 1996). Энзим с молекулярной массой 66 кДа продуцируется бактериальной клеткой в ферментативно неактивной форме (Leppla S.H. et al., 1978). Молекула экзотоксина А состоит из одной полипептидной цепи длиной 613 аминокислот (GenBank AAB59097), содержит восемь цистеинов, которые формируют четыре дисульфидные связи. Анализ трехмерной структуры экзотоксина А показал, что он состоит из трех отличных функциональных областей: рецептор- 25 связывающей (домен Iа, аминокислотные остатки 1-252), транслокационной (домен II, аминокислотные остатки 253-364) и каталитической (домен III, аминокислотные остатки 405613). Каталитическая область ответственна за инактивацию фактора элонгации 2 (ФЭ-2). Хотя домен III структурно определен в пределах аминокислотной последовательности 405-613, полная каталитическая активность требует части домена Ib (аминокислотные остатки 365-404) (Siegall C.B. et al., 1989). Значимыми аминокислотами в структуре каталитического центра экзотоксина А являются Glu-553, His-440, Tyr-481 и Tyr-470 (Armstrong S. et al., 2002). В основе цитотоксического действия лежит подавление синтеза белка в чувствительных клетках. Процесс происходит в присутствии никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД), а блокирование белкового синтеза осуществляется на этапе элонгации полипептидной цепи на рибосомах. Под действием экзотоксина А происходит ферментативный гидролиз НАД с образованием аденозин-5'-дифосфатрибозильного остатка и никотинамида. АДФ-рибоза связывается с ФЭ-2 в комплекс, не способный участвовать в удлинении полипептидной цепи при синтезе белка, что приводит в конечном итоге к гибели клеток (Armstrong S. et al., 2002). НАД+ → никотинамид + АДФ-рибоза + Н+ АДФ-рибоза + ФЭ-2 → ФЭ-2–АДФ-рибоза Несмотря на сходство внутриклеточного действия экзотоксина А и дифтерийного токсина (Lee H., Iglewski W.J., 1984), обнаружена разница в молекулярном механизме их действия на этапах специфического связывания с чувствительными клетками, что определяется различием в поверхностных рецепторах. Посредством N-концевого домена I фермент связывается с поверхностью клеток-мишеней через рецепторы липопротеинов низкой плотности (LRP1, известные как CD91 или A2MR), входит в клетку путем эндоцитоза (Pastrana D.V. et al., 2005). Молекула экзотоксина подвергается протеолитической обработке сериновой протеазой (разрыв между аминокислотными остатками Arg279 and Gly280 области II) (Ogata M. et al., 1992) и конформационным изменениям, в результате чего высвобождается ферментативно активный центр (Vasil M.L. et al., 1986). Домен II обеспечивает эффективный перенос токсина через внутреннюю мембрану в цитозоль клетки (Sanyal G. et al., 2003). В цитозоли экзотоксин А сталкивается с ФЭ2 и передает АДФ-рибозильную группу от НАД+ к остатку дифтамида, что необратимо инактивирует ФЭ2. НАД-зависимый механизм поражения клеток эукариот довольно широко распространен среди токсинов (Domenighini M., Rappuoli R., 1996). Как известно НАД является кофактором многих биологических окислительно-восстановительных реакций, а также субстратом физиологических внутриклеточных реакций, протекающих по принципу гидролиза и рибозилирования белка-акцептора. Действие экзотоксина А проявляется в общем токсическом эффекте in vivo: отёках, некрозах, артериальной гипотензии с последующим коллапсом, 26 метаболическом ацидозе, дыхательной недостаточности и т.д. Штаммы P. aeruginosa, дефектные по синтезу экзотоксина, менее вирулентны. У пациентов, инфицированных P. aeruginosa, как правило, выявляются высокие титры антител против токсина. Модульная структура и механизм действия экзотоксина А позволяют модифицировать его молекулу путем введения специфичных элементов (лигандов рецепторов и фрагментов антител) для переадресации его мощной цитотоксичности на раковые клетки (Weldon J.E., Pastan I., 2011). Авторы сконструировали рекомбинантный иммунотоксин (PE-based recombinant immunotoxins, RITs), в составе которого домены II и III экзотоксина P. aeruginosa связаны с пептидными цепями антител, узнающими мембранный белок CD22 В-клеток лимфомы. Ранее считали, что экзотоксин А продуцируют около 80% клинических изолятов синегнойной палочки и только 27% штаммов, выделенных из окружающей среды (Vasil M.L. et al., 1986; Мороз А.Ф. и соавт., 1988). Исследования, проведенные Khan A., Cerniglia C.E. (1994) и Nikbin V.S. и соавт. (2012), свидетельствуют о более высоком проценте токсигенных культур: 96 и 90,7% соответственно. При изучении генетических особенностей штаммов P. aeruginosa, изолированных из различного клинического материала, показано, что экзотоксин А встречается у 100% раневых и «бронхиальных» культур и у 81,8% штаммов, выделеных из мочи (Wolska K., Szweda P., 2009). Более того, toxA предложен в качестве мишени для идентификации/детекции и типирования клинических изолятов P. aeruginosa (Khan A.A., Cerniglia C.E., 1994). Белки III типа секреции. Действие некоторых токсинов проявляется только при непосредственном взаимодействии с эукариотическими клетками, например эффекторов III типа системы секреции (TTSS), являющейся контакт-зависимой системой у представителей рода Pseudomonas (Yahr T.L. et al., 1995). Она позволяет осуществлять прямое перемещение бактериальных белков в цитоплазму эукариотических клеток (Vallis A.J. et al., 1999). TTSS P. aeruginosa включает около 36 генов, кодирующих сами эффекторы, а также регулирующие и координирующие белки, сложные взаимодействия которых происходят во время экспрессии tox-генов (Frank D.W., 1997). Большая часть компонентов TTSS находится под контролем транскрипционного активатора ExsA (Hovey A.K., Frank D.W., 1995). Транскрипция белков TTSS-системы усиливается в условиях дефицита ионов кальция (Cornelis G.R., 2010). Белки TTSS P. aeruginosa и аппарат транслокации демонстрируют высокий уровень аминокислотной гомологии с элементами Yop-регулона представителей рода Yersinia. Из всех грамотрицательных бактерий, имеющих систему III типа секреции, только у P. aeruginosa обнаружены гомологичные белки (PcrV) к V антигену (LcrV) Yersinia (Hueck C.J., 1998). Синегнойная палочка использует TTSS для транслокации четырех эффекторных белков – ExoТ, ExoS, ExoU, и ExoY (Frank D.W., 1997; Filloux A., 2011). ExoS и ExoT содержат два функциональных домена: карбокситерминальный фрагмент ферментов обладает АДФ- 27 рибозилтрансферазной активностью, аминотерминальный – активирует GTP-азы (малые Gбелки) (Frank D.W., 1997; Yahr T.L. et al., 1996). Эти токсины вовлечены в изменения цитоскелета, особенно актиновых филаментов (аминотерминальная область), через Rasзависимый путь передачи сигнала в эукариотических клетках (Frithz-Lindsten E. et al., 1997). Kaufman M.R. и соавт. (2000) показали, что АДФ-рибозилтрансферазная активность ExoS важна для стимулирования апоптоза в клетках HeLa, эпителиальных клеточных линиях и линиях фибробластов. Продукция ExoS коррелирует со способностью P. aeruginosa распространяться от эпителиальных мест колонизации до кровотока (Nicas T.I. et al., 1985). АДФрибозилтрансферазная активность ExoT составляет только 0,2% от ExoS, несмотря на 75% аминокислотную гомологию между белками (Frank D.W., 1997). Экзоэнзим ExoY проявляет аденилатциклазную активность (Yahr T.L. et al., 1998), ExoU – самый мощный цитотоксин, функционирующий как фосфолипаза, и может быть классифицирован в пределах этой группы (Sato H., Frank D.W., 2004). Клеточно-опосредованную гемолитическую активность в первую очередь связывают с эффекторным белком ExoU, который также способен вызывать некроз эпителиальных клеток и макрофагов (Finck-Barbancon et al., 1997; Hauser et al., 1998; Sato H., Frank D.W., 2004). Считается, что присутствие ExoU и ExoS, в совокупности с двумя другими эффекторами, определяет характер взаимоотношений P. aeruginosa с эукариотическими клетками: инвазивный или цитотоксический (Fleiszig S.M. et al., 1997). Классические «инвазивные» штаммы (продуцирующие ExoS, ExoT и часто ExoY) колонизируют эпителиальные клетки, переживают и реплицируются в тканях, тогда как цитотоксические изоляты (ExoU, ExoT и часто ExoY) быстро лизируют клетки хозяев (Lin H.H. et al., 2006). Показано, что снижение жизнеспособности макрофагов и эндотелиальных клеток ассоциировано со способностью P. aeruginosa секретировать ExoS и ExoU (Stepinska M., Trafni E.A., 2008). В то же время, Feltman H. и соавт. (2001) не обнаружили четкой корреляции между определенным TTSSгенотипом штамма и его способностью к инвазии или выраженностью цитотоксичности. Dacheux D. и соавт. (2001) показали, что гибель нейтрофилов и макрофагов, а также лизис эритроцитов опосредованы эффекторами TTSS-системы и PcrV, PopB/PopD протеинами P. aeruginosa, но могут быть независимы от токсина ExoU. Высказывается мнение, что у штаммов P. aeruginosa могут встречаться разнообразные эффекторы III типа секреторной системы и их комбинации, а это приводит к различным цитотоксическим фенотипам. Berthelot P. и др. (2003) выделили четыре группы фенотипов на основе их цитотоксичности против макрофагов: ExoU-продуценты, категоризированные как тип I, показывали самую высокую цитотоксичность, II тип был связан с присутствием ExoS (Berthelot P. et al., 2003). В клинических исследованиях присутствие этих токсинов у P. aeruginosa связано с 28 неудовлетворительным исходом болезни среди пациентов при синегнойной инфекции (RoyBurman A., 2001; Lin H.H. et al., 2006). ExoS является ответственным за прямое повреждение ткани при инфекции легких и играет важную роль в бактериальной диссиминации (Nicas T.I. et al., 1995). При исследовании распространенности exoS и exoU в изолятах P. aeruginosa, изолированных от пациентов с вентилятор-ассоциированной пневмонией, оказалось, что присутствие обоих генов коррелировало с тяжестью заболевания (p<0,05). Более того, в группе тяжелых больных (в том числе с летальным исходом) обнаружена связь с присутствием именно exoU (p<0,05 и p=0,14, в отличие от exoU-отрицательных изолятов) (Hauser A.R. et al., 2002). Гены, кодирующие эффекторные белки, распределены по всему геному P. aeruginosa и характеризуются разной частотой встречаемости (Stover C.K. et al., 2000). Они были обнаружены как у клинических, так и природных изолятов, но у штаммов и популяций, ассоциированных с различными заболеваниями, по всей видимости, могут несколько отличаться по своему набору (Feltman H. et al., 2001). Feltman H. и соавт. (2001), исследовав группу из более, чем 100 клинических и природных изолятов, сообщили о присутствии exoS и exoU в 72% и 28% случаях соответственно. Ген, кодирующий эффектор ExoT, встречался практически во всех изолятах P. aeruginosa, exoY – в 89%. Авторы отметили, что штаммы, выделенные от пациентов с муковиcцидозом, в меньшем проценте случаев содержали exoU, но чаще exoS, чем изоляты, полученные при других заболеваниях или из природных источников. Berthelot P. и соавт. (2003) проанализировали генотипы TTSS у 92-х штаммов, изолированных от пациентов с бактеримией, и показали, что exoS содержали 52,2% культур, exoU – 28,3%, но 19,5% случаях не было обнаружено ни exoS, ни exoU. О еще более редкой встречаемости exoU среди штаммов P. aeruginosa сообщили Hirakata Y. и соавт. (2000): в культурах из крови ген детектирован в 13%, из респираторного тракта – в 9% случаях. В то же время, при исследовании распространенности этих генов в изолятах, связанных с язвенным кератитом, оказалось, что большинство штаммов (59%) были ПЦР-положительны на exoU, а не на exoS (38%) (Winstanley C. et al., 2005). При сравнении культур P. aeruginosa, выделенных при кератитах, ассоциированных с контактными линзами и без, оказалось, что изоляты с генотипом exoS-/exoU+ преобладали в первой группе. Эти же авторы показали, что наличие в геноме штамма exoU-гена коррелирует выраженным феноменом биопленкообразования (Choy M.H. et al., 2008). Ряд авторов отметили взаимоисключение между exoS и exoU (Fleiszig S.M. et al. 1997; Lomholt J.A. et al., 2001; Berthelot P. et al., 2003). Фосфолипазы. Штаммы P. aeruginosa вырабатывают одну или более внеклеточных фосфолипаз C (EC 3.1.4.3): гемолитическую/сфингомиелиназу (PlcHR(2)), негемолитическую (PlcN), которые транслоцируются через внутреннюю мембрану TAT-системой (twin-arginine translocation), а также недавно описанную PlcВ, секретируемую посредством Sec-системы 29 (Ostroff R.M. et al., 1990; Voulhoux R. et al., 2001; Barker A.P. et al., 2004; Snyder A. et al., 2006). Фосфолипазы C функционируют совместно со щелочной фосфатазой в освобождении неорганического фосфата из фосфолипидов (Berka R.M., Vasil M.L., 1982). Все три фосфолипазы PlcHR(2), PlcN и PlcB разрушают фосфатидилхолин, присутствующий во внешнем слое мембраны эритроцитов млекопитающих. Кроме того, PlcHR(2) действует на сфингомиелин и другие фосфолипиды внешнего слоя клеточной мембраны, тогда как PlcN специфична в отношении фосфатидилсерина, который присутствует в ее внутреннем слое (Ostroff R.M. et al., 1990). PlcHR(2) предпочтительно гидролизирует фосфолипиды, содержащие четвертичные аммонийные группы, которые найдены, прежде всего, в эукариотических мембранах и сурфактанте легкого, и практически не действует на фосфолипиды прокариотических мембран, например фосфатидилэтаноламин, который является наилучшим субстратом для PlcB (Berka R.M., Vasil M.L., 1982). В последних исследованиях Lopez D.J. и соавт. (2011) по изучению PlcHR(2) P. aeruginosa показана более широкая субстратная специфичность фермента. За исключением фосфатидилсерина PlcHR(2) оказалась специфична в отношении полного состава билипидного слоя мембраны: фосфатидилхолин > сфингомиелин > холестерин > фосфатидилэтаноламин > фосфатидилглицерол (Lopez D.J. et al., 2011). Фосфолипаза PlcB необходима для «дергающейся подвижности»/«twitching motility» и регулируется QS в отличие от двух других ферментов (Barker A.P. et al., 2004). Продукцию PlcHR(2) контролирует 3-х-генный PlcHR-оперон, включающий структурный ген (plcH, ранее plcS), кодирующий 380-аминокислотный пептид, собственно гемолизин и гены plcRI и plcR2, продукты которых участвуют в регуляции синтеза на уровне транскрипции (Cota-Gomez A. et al., 1997). С помощью экспериментальной инфекции на мышах с использованием дикого и изогенного (дефектного по синтезу PlcHR2) штаммов P. aeruginosa показано прямое влияние гемолитической фосфолипазы С на физиологический статус легкого. Сурфактантометрический анализ бронхоальвеолярной жидкости показал, что PlcHR уменьшала легочную функцию сурфактанта (т.н. PlcHR-зависимая дисфункция сурфактанта) (Wargo M.J. et al., 2011). Токсичность для мышей низкая (LD50 – 5 мг). По данным Iglewski B.H. (1998) фосфолипазу C продуцируют приблизительно 70% всех штаммов P. aeruginosa. Wolska K. и Szweda P. (2009) сообщили о более широком распространении: PlcHR(2) – 100% и PlcN – 91,8% клинических изолятов. Рамнолипиды. P. aeruginosa продуцирует два основных растворимых термостабильных гликолипида: монорамнолипид (L-rhamnosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate, Rha-C10C10) и дирамнолипид (L-rhamnosyl-L-rhamnosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate, Rha-RhaC10-C10). Их синтез напрямую связан с синтезом жирных кислот и протекает наиболее активно в 30 средах, лимитированных по фосфатам (Johnson M.K., Boese-Marrazzo D., 1980). Рамнолипиды определяют несколько значимых функций микробных клеток: обусловливают поверхностное натяжение и гидрофобность клеточной стенки (Caiazza N. et al., 2007), облегчают жгутиковую подвижность по полутвердым поверхностям, в биопленочной культуре поддерживают «fluidfilled» каналы, которые являются основной частью архитектуры биопленки и обеспечивают обмен питательными веществами между клетками (Davey M. et al., 2003). Рамнолипиды подобно детергенту солюбилизируют фосфолипиды в растворимые формы, являющиеся субстратами для фосфолипазы С, потенцируя тем самым ферментативную активность (Davey M. et al., 2003; Abdel-Mawgoud A.M. et al., ее 2010). Субстратная специфичность цитолитического действия дирамнолипида показана Sanchez M. и соавт. (2010) на биологических и артифициальных мембранах в ККМ концентрациях (критическая концентрация мицеллообразования). Дирамнолипид обуславливал утечку внутреннего содержимого клетки при использовании однослойной фосфатидилхолиновой мембраны, при этом присутствие в мембране лизофосфатидилхолина ускоряло, а фосфатидилэтаноламина и холестерина уменьшало темп лизиса. Он также вызывал гемолиз человеческих эритоцитов с изменением обычной формы диска эритоцитов (Sánchez M. et al., 2010) и быстрый некроз нейтрофилов (Jensen P.O. et al., 2007). Гены rhlA и rhlB кодируют два полипептида, участвующих в синтезе рамнолипидов: рамнозилтрансферазы RhlA и RhlB соответственно. Оба гена находятся в одном опероне и регулируются второй межклеточной сигнальной rhl-системой (Lequette Y., Greenberg E.P., 2005). Ген rhlC, кодирует белок RhlC, который катализирует присоединение второй рамнозы, формируя дирамнолипид (Maier R., Soberon-Chavez G., 2000). Дирамнолипид проявляет низкую токсичность для мышей при внутрибрюшинном введении (LD50 – 5 мг). Он оказывает повреждающее действие на альвеолярные макрофаги. Известно, что штаммы, изолированные от больных с инфекцией дыхательных путей, продуцируют большее количество термостабильного гемолизина. К антимикробным соединениям, продуцируемым P. aeruginosa, относят пептиды – пиоцины и ряд гетероциклических соединений, в том числе феназинов, хинолинов и фенилпирролов. Предположительно, помогая в колонизации синегнойной палочки, эти вещества уничтожают ряд других микроорганизмов различными путями, в том числе повреждая ДНК или вызывая деполяризацию мембран клеток сопутствующих видов (Kerr J., 2000; Michel-Briand Y., Baysee C., 2002). Часть из них обладает антимикробной активностью по отношению к большинству видов бактерий (например, феназиновые пигменты – пиоцианины), другие действуют только на представителей грамположительных таксонов (хинолиновые 31 производные – псеуданы, фенилпирролы), третьи – с еще более узким спектром действия – на близкородственные виды (бактериоцины – пиоцины) (Williams J.S., 2003). Феназины. гетероциклическими Пиоцианин. Феназины, азотсодержащими выделяемые соединениями, и P. aeruginosa, отличаются являются незначительными модификациями в системе гетероциклического кольца феназин-1-карбоксилата (Kerr J., 2000). В процессе синтеза феназинов задействовано семь генов (phzABCDEFG), организованных в два феназиновых оперона: phzA1-G1 (phz1) и phzA2-G2 (phz2), которые кодируют почти идентичные наборы белков, катализирующих синтез феназин-1-карбоксильной кислоты, ключевого соединения для синтеза всех феназиновых антибиотиков (Рисунок 1). А Б Рисунок 1. Биосинтез основного пути феназинов (А) и пиоцианина (Б) P. aeruginosa (Mavrodi D.V. et al., 2013). Основным предшественником в процессе биосинтеза феназин-1-карбоксилата и его производных является шикимовая кислота, преобразующаяся в хоризмовую кислоту. Хоризмат под влиянием продукта гена phze, превращается в 2-амино-4-дезоксихоризмат, который через ряд превращений трансформируется в феназин-1,6-дикарбоксилат, дающий начало феназину и всем его производным (Mavrodi D.V. et al., 2001). В синтезе пиоцианина участвуют два дополнительных фермента, а именно PhzM и PhzS, их кодирующие гены смежны с phzA1-phzG1 опероном. 32 Как известно, P. aeruginosa, в дополнение к пиоцианину (1-гидрокси-5-метил-феназин), вырабатывает другие молекулы этого класса, в том числе тубермицин В (феназин-1-карбоновая кислота), гемипиоцианин (1-гидроксифеназин), оксихлорорафин, являющийся амидом феназин1-карбоновой кислоты, и недавно описанную 5-метил-феназин-1-карбоновую кислоту (5MPCA) (Gerber N.N., 1973; Gibson J. et al., 2009). Установлена ключевая роль двухкомпонентной GacA/GacS системы, находящейся на вершине регуляторного каскада синтеза феназинов. Выявлено, что экспрессия синтеза феназинов происходит в ответ на увеличение концентрации N-бутаноил-L-гомосерин лактона (C4-HSL), компонента кворумной сигнальной системы, и начинается с биосинтеза прекурсора, феназин-1,6-дикарбоновой кислоты. LasI, LasR и RhlR требуются для полной индукции phzA1 (Kerr J., 2000). Феназины легко вступают в окислительно-восстановительные реакции и, таким образом, выполняют роль переносчиков и конечных акцепторов электронов. В кислород-лимитирующих условиях (в том числе в биопленках) они становятся альтернативным акцептором электронов при окислении НАД*H (Dietrich L.E. et al., 2013). Пиоцианин – низкомолекулярный, голубовато-зеленый водорастворимый пигмент с окислительно-восстановительной активностью, определяющий характерный цвет инфицированного гноя и мокроты. Пиоцианин оказывает токсическое действие на клетки посредством промежуточных активных форм кислорода, таких как супероксид-радикал и перекись водорода (О2– и Н2О2), с последующим снижением внутриклеточного цАМФ (Hassan H.M., Fridovich I., 1980). Высоковирулентные штаммы синтезируют пиоцианин в больших количествах. Концентрация пиоцианина в слюне во время синегнойной инфекции легких, в том числе у больных муковисцидозом, может достигать 100 мкмоль/л (Lau G.W. et al., 2004). Считается, что 90-95% изолятов P. aeruginosa синтезируют пиоцианин, но при выделении культур могут наблюдаться атипичные непигментированные штаммы (Мороз А.Ф. и соавт., 1988; Mavrodi D.V. et al., 2001). Продукция пиоцианина является важным фактором, определяющим тяжесть сепсиса у мышей (Mahajan-Miklos S. et al., 1999), а также способствует закреплению P. aeruginosa в легких (Allen L. et al., 2005). В исследовании Caldwell C.C. и соавт. (2009) показано, что пиоцианин поддерживал хроническую инфекцию в легких у мышей, влияя на адаптивные иммунные реакции (увеличивал количество макрофагов, CD4 T-клеток и нейтрофилов), что вызывало перманентное повреждение легкого. Пролонгированное воздействие пиоцианина усиливало гипер- и метаплазию бокаловидных клеток бронхов, опосредованную продукцией цитокинов Т-хелперами второго типа (Th2-клетки) и активацией транскрипционного фактора Stat6, как описано при других бронхоэктатических заболеваниях (Caldwell C.C. et al., 2009). 33 Антимикробная и антифунгальная активность P. aeruginosa ассоциирована с продукцией феназинов (Li Z. et al., 1995; Gibson J. et al., 2009). Резистентность бактерий к феназинам связана с активацией ряда ферментов антиоксидантного комплекса (в частности, каталазы и супероксиддисмутазы), а также наличием у них устойчивой к феназинам формы ключевого фермента клеточного метаболизма – ацил-СоА-синтетазы. Другой класс гетероциклических молекул, известных как псеуданы, представляют собой группу веществ со структурой 4-гидрокси-2-алкилхинолинов. Они дифференцируются по размерам и степени насыщенности алкильной цепи, а также по наличию или отсутствию Nоксида (Taylor G. et al., 1995). Псеуданы проявляют антимикробные свойства в отношении грамположительных бактерий, включая штаммы S. aureus, устойчивые к метициллину (Taylor G. et al., 1995). Было также обнаружено, что псеудан IX (4-hydroxy-2-nonylquinoline) и псеудан VII (4-hydroxy-2-heptylquinoline) выступают в качестве сидерофоров синегнойной палочки (Royt P.W. et al., 2001). Пиоцины. Пиоцины являются бактериоцинами и были определены как вырабатываемые бактериями белковые соединения, которые «убивают» другие близкородственные виды (Klaenhammer T., 1993). Бактериоцины, продуцируемые P. aeruginosa, делятся на R, F и S типы. Первые два − R и F − представляют собой большие протеиновые комплексы, которые напоминают хвосты бактериофага. R-пиоцины вызывают деполяризацию внутренней цитоплазматической мембраны бактериальной клетки при формировании в ней канала (пороформирующий механизм повреждения). Пиоцины R и F отличаются относительно широким спектром действия, включающим Neisseria spp. и Haemophilus spp. (Michel-Briand Y., Baysse C., 2002). Пиоцины S-типа являются парными полипептидами, схожими с колицинами. Большая субъединица белка оказывает антибактериальное действие, стимулируя распад/деградацию хромосомной ДНК (для пиоцинов S1, S2, S3, AP41), ингибируя функционирование тРНК (для пиоцина S4) или путем пороформирующего механизма (для пиоцина S5) (Michel-Briand Y., Baysse C., 2002; Parret A., De Mot R., 2002). Для некоторых пиоцинов S типа (S2, S3, Sa) показано увеличение активности в условиях дефицита ионов железа. Взаимодействие пиоцинов S2 и S3 с клеткой осуществляется через пиовердиновые рецепторы II типа (FpvAII). Пиоцины продуцируют более 90% всех природных и клинических изолятов P. aeruginosa (Michel-Briand Y., Baysse C., 2002). Сидерофоры. Бактерии нуждаются в железе как в кофакторе для многих метаболических ферментативных процессов. Однако в условиях макроорганизма железо находится не в свободном доступе, а в большей степени связано с белками, такими как трансферрин, лактоферрин и ферритин (Smith K.D., 2007). Низкое содержание свободного железа стимулирует синтез железо-хелатирующих молекул, известных как сидерофоры. P. aeruginosa 34 продуцирует по крайней мере три известных сидерофора при росте в среде, лимитированной по содержанию ионов железа: пиохелин, салициловую кислоту и пиовердин (Folschweiller N. et al., 2000; Lamont I.L. et al., 2009). Пиовердин, связываясь с ионами Fe3+, транспортируется назад в клетку с участием FpvAI-III и TonB-зависимых мембранных рецепторов (Folschweiller N. et al., 2000; De Chial M. et al., 2003). Фагоциты (нейтрофилы и макрофаги) и миелоидные клетки (HL-60 and U937) индуцируют механизм обратного высвобождения железа из низкомолекулярных железохелатирующих комплексов и из сидерофоров P. aeruginosa (Olakanmi O. et al., 1994; Britigan B.E. et al., 2000). Эти данные свидетельствуют о дополнительном защитном механизме хозяина, конкурирующем за сидерофор-связанное железо, и ограничивающем его доступность для микроорганизмов. В то же время, недавно показано, что пиовердин P. aeruginosa не связывался с липокалином, ассоциированным с желатиназой нейтрофилов (neutrophil-gelatinaseassociated lipocalin, NGAL). Липокалины − это, как правило, маленькие секретируемые белки, способные специфически связывать малые гидрофобные молекулы, в частности, сидерофоры. Экспериментальные данные указывают, что пиовердин уклонялся от взаимодействия с NGAL. Авторы предполагают, что пиовердин – «хитрый» сидерофор P. aeruginosa, способствующий формированию хронической инфекции в легких при муковисцидозе (Peek M.E. et al., 2012). Показана корреляция между продукцией пиовердина и темпами бактериального роста, что предполагает его косвенную роль в вирулентности P. aeruginosa. Эта гипотеза подтверждена в экспериментальной инфекции: штаммы, мутантные по синтезу пиовердина, были менее вирулентны (Meyer J.M. et al., 1996). Кроме того, сидерофоры действуют как сигнальные молекулы для стимулирования синтеза трех факторов экзотоксина А, PrpL эндопротеазы и собственно пиовердина, а также участвуют в формировании биопленки (Beare P.A. et al., 2003). В смешанном сообществе в биотопе человека или вне макроорганизма штаммы P. aeruginosa, синтезирующие высокоспецифичные сидерофоры, доминируют в конкурентных взаимоотношениях за доступное железо (Buckling A. et al., 2007). P. aeruginosa продуцирует несколько протеаз, включая эластазы LasA, LasB и щелочную протеазу. Эластаза LasB является Zn-связанной металлопротеазой, действующей на многие белки, включая фибрин, коллаген и эластин. Ее протеолитическая способность приблизительно в 10 раз выше, чем у щелочной протеазы (Galloway D.R., 1991). LasA-эластаза – сериновая протеаза повреждает эластин, делая его более чувствительным к разрушающему действию LasB-эластазы и щелочной протеазы (Van Delden C., Iglewski B.H., 1998). Эластин – основная составляющая ткани легкого, которая ответственна за его расширение и сокращение, кроме того эластин входит в состав стенки кровеносных сосудов, определяя их упругость. 35 Протеазы, как предполагается, играют главную роль при острой синегнойной инфекции в легких, а эластинолитическая активность – причина легочных кровоизлияний. Благодаря широкой субстратной специфичности LasB эластаза может инактивировать вещества, такие как человеческие иммуноглобулины G, лизоцим, компоненты комплемента и ингибитор α1протеиназы. Таким образом, LasB-эластаза не только разрушает тканевые компоненты, оказывая прямое повреждающее действие, но и вмешивается в механизмы защиты хозяина против инфекции. Роль щелочной протеазы в тканевой инвазии и системном воспалении не ясна, однако, ее вклад в инфекциях роговицы может быть существенным (Howe T.R., Iglewski B.H., 1985). Токсичность протеаз для животных не высока (LD50 – 200 мкг). Около 90% всех штаммов P. aeruginosa продуцируют внеклеточные протеазы (Iglewski B.H., 1998). 1.2.3. Подвижность и биопленкообразующая способность В настоящее время наблюдается переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания (O`Toole G.F. et al., 2000; Николаев Ю.А., Плакунов В.К., 2007). Биопленка является ключевой фазой бактериального развития, сопряженного с выживанием бактерий и формированием хронических инфекций (Costerton J.W. et al., 1999; Белобородова Н.В., Байрамов И.Т., 2009; Романова Ю.М., Гинцбург А.Л., 2011). Начальным условием биопленкообразования является непосредственное сближение с поверхностью, случайное (например, с потоком жидкости, текущей по поверхности), либо направленное (например, путем хемотаксиса). У P. aeruginosa есть три способа поверхностной подвижности: роение («swarming motility»), дергание («twitching motility») и скольжение («sliding motility») (Kohler T. et al., 2000; Skerker J.M., Berg H.C., 2001; Murray T., Kazmierczak B., 2008). Первые два типа подвижности ассоциированы с развитием биопленки, а участвующие в них жгутики/флагеллы и пили IV типа, являются факторами патогенности (O'Toole G.A., Kolter R., 1998; Overhage J. et al., 2008). Роящаяся подвижность зависит от толчка полярным жгутиком, который производит вращающий момент с помощью роторной структуры, состоящей из MotA и MotB (статор), а также FliG, FliM и FliN, которые функционируют как регуляторы (Doyle T.B. et al., 2004). Сами жгутики и крюк представлены единственными белками FliC и FlgE соответственно (Berg H.C., 2003). Пили представлены филаментарным белком пилином и расположены на одном полюсе бактерий. Дергающаяся подвижность способствует распространению клеток, создавая их движение (Skerker J.M., Berg H.C., 2001). Немногие детали известны о скольжении в настоящее время, но оно описано как поверхностная подвижность, независимая от пилей и жгутиков (Murray T., Kazmierczak B., 2008). С роением 36 связана быстрая колонизация клетками P. aeruginosa окружающей среды скоординированным способом. Предполагаются различия в экспрессии генов, вовлеченных в синтез сидерофоров, феназинов и белков III типа секреции в клетках на краю зоны роя и расположенных в центре. Ключевым этапом, без которого невозможно образование микробной биопленки, является процесс адгезии микроорганизма к доступной для дальнейшей колонизации поверхности. Гидрофобность является одной из значимых характеристик клеточной поверхности, которая лежит в основе ряда биологических процессов, включая адгезию. Для прокариот характерна четкая корреляция гидрофобных и адгезивных свойств (Van Loosdrecht M.C.M. et al., 1987; Vanhaecke E. et al., 1990). У P. aeruginosa клеточная поверхность значительно менее гидрофобна, чем у многих видов бактерий, тем не менее, диссоциативные варианты бактерий, отражающие различия/изменения в клеточной оболочке, могут существенно отличаться по гидрофобности и адгезивным свойствам (Милько Е.С., Мартынкина Л.П., 1996). Гидрофобность клеточной поверхности штаммов P. aeruginosa более выражена при выращивании культур в бульоне обогащения, чем на агаризованной среде, и при температурном режиме 22ºС, чем при 37ºС (Wolska K. et al., 2002). Специфическая адгезия P. aeruginosa к эукариотическим клеткам происходит посредством пилей IV типа и пилеподобных структур, названных Cup-фимбриями (от англ. chaperone-usher pathway), ответственных за взаимодействие с муцином слизистых оболочек, а также жгутиков, на поверхности которых расположены рецепторные лиганды к эпителиальным клеткам (Feldman M. et al., 1998). Известно, что штаммы P. aeruginosa, изолированные при инфекциях мочевыводящих путей, более адгезивны, чем выделенные из других биотопов. У таких культур была выражена способность к специфической адгезии на эритроцитах, особенно в присутствии папаина и нейраминидазы, при умеренном показателе гидрофобности клеточной поверхности (Izdebska-Szymona K., Laziuk D., 1988). P. aeruginosa хорошо адгезируется (неспецифическая адгезия) на имплантируемых устройствах – катетерах, эндотрахеальных трубках и т.д. (Donlan R.M., 2001). В отличие от других видов бактерий она адгезируется на поверхности из полиэтилена медицинского назначения, что связано с гидрофильностью клеточной стенки и продукцией биосурфактантов (Roosjen A. et al., 2006). На следующем этапе – формирование микроколоний – особую значимость приобретают пили IV типа, обеспечивающие «дергающуюся подвижность», прикрепившихся к поверхности бактерий. Мутанты P. aeruginosa, дефектные по их образованию, адгезируются к поверхности, формируют монослой, но не образуют микроколонии и биопленку (Klausen M. et al., 2003). Дальнейшее развитие зрелой биопленки сопровождается образованием экзополисахаридного матрикса – основного структурного компонента биопленки. По крайней мере три экзополисахарида (альгинат, Psl и Pel) способствуют формированию биопленки у этого 37 микроорганизма (Ghafoor A. et al., 2011). Альгинат P. aeruginosa является линейным многоанионным экзополисахаридом, состоящим из уроновых (D-маннуроновой и Lглюкуроновой) кислот, экзополисахарид Psl обогащен маннозой и галактозой, экзополисахарид Pel – целлюлозоподобный полимер (Ghafoor A. et al., 2011). Экзополисахаридный матрикс играет значительную роль уже на этапе формирования микроколоний, а при его сверхпродукции увеличивается структурная организация зрелой биопленки (Hentzer M. et al., 2001). Показано его участие в образовании полимикробных биопленок, когда формируются коагрегаты за счет слипания клеток через близкие по составу экзополисахаридные компоненты (Маянский А.Н. и соавт., 2012). Известно, что альгинат играет важную роль в защите биопленочных бактерий P. aeruginosa от эффекторов иммунитета (Leid J.G. et al., 2005) и антибактериальных агентов (Hentzer M. et al., 2001). Характерной особенностью бактерий P. aeruginosa PAO1 в биопленке является наличие мембранных пузырьков, содержащих протеазу, щелочную фосфатазу и другие ферменты, которые лизируют часть клеток, служащих источником факторов роста для остального сообщества биопленки (Schooling S.R., Beveridge T.J., 2006). Некоторые штаммы P. aeruginosa продуцируют и упаковывают в везикулы AmpС β-лактамазы, которые затем могут повышать устойчивость клеток в биопленке к β-лактамным антибиотикам (Ciofu O. et al., 2000). Norouzi F. и соавт. (2010) показали, что БЛРС-продуцирующие изоляты обладают более высокими показателями гидрофобности и биопленкообразующей способности. Одними из важных механизмов устойчивости к антибиотикам клеток в биопленках являются селекция небольших субпопуляций бактерий, так называемых «персистеров» и гипермутабельность клеток (Lewis K., 2008; Цветкова Н.А. и соавт., 2013). При истощении источника питания клетки биопленки способны синтезировать ферменты лиазы, разрушающие экзополисахаридный матрикс, что приводит к высвобождению в виде планктонных форм, способных найти более благоприятные условия существования. Еще один механизм дисперсии биопленки связан с синтезом сурфактанта/рамнолипида P. aeruginosa, который предотвращает плотный контакт вновь образованных бактерий внутри пленки и приводит к удалению прикрепленных клеток (Davey M.E. et al., 2003). «Старение» биопленки может быть также связано с инфицированием бактериофагом или с радикальными изменениями в экспрессии генов, в том числе регулирующихся цитоплазматическим сенсорным белком BdlA (Morgan R. et al., 2006). Фазы биопленки зависят от сетевых взаимоотношений регуляторных молекул, которые отвечают за биопленочный цикл (Karatan E., Watnick P., 2009; Маянский А.Н., 2012). Многостадийность и многофакторность биопленкообразования у P. aeruginosa проявляется в фенотипическом разнообразии зрелых биопленок. Туркутюков В.Б. и соавт. (2008) отметили 38 связь между архетиктоникой биопленки, образованной P. aeruginosa, и степенью тяжести инфекционного процесса у пациентов с внутрибольничными пневмониями. Система регуляции внеклеточных факторов патогенности. У большей части грамположительных и грамотрицательных бактерий широкий спектр физиологических процессов регулируется с помощью эффекта QS (Ильина Т.С. и соавт., 2006). У P. aeruginosa идентифицированы две кворумные регуляторные системы: LasI/LasR и RhlI/RhlR (Van Delden C., Iglewski B.H., 1998). Каждая система включает в себя специфический аутоиндуктор (ацилгомосеринлактон) и зависимый от наличия аутоиндуктора активатор транскрипции (Rбелок). Приблизительно от 1 до 10% генома синегнойной палочки контролируется аутоиндукторами (McKnight S.L. et al., 2000). С возрастанием в среде плотности клеток растет плотность аутоиндукторов, и связи транскрипционных аутоиндукторов с белками-регуляторами становятся максимально сильными, а это в конечном итоге приводит к каскадной продукции вирулентных и антибактериальных факторов. LasI участвует в синтезе аутоиндуктора N-(3оксододеканоил)-L-гомосерин лактона (3-оксо-C12-HSL). LasR и 3-оксо-C12-HSL необходимы для активации генов вирулентности, кодирующих эластазы (LasA и LasB), алкалинпротеазу (Apr), экзотоксин А (toxA). QS-система LasI/LasR активирует также экспрессию генов второй QS-системы P. aeruginosa RhlI/RhlR, то есть они взаимодействуют между собой по принципу каскадной иерархии (Van Delden C., Iglewski B.N., 1998). QS-система RhlR/RhlI состоит из активатора транскрипции RhlR и белка RhlI, ответственного за продукцию аутоиндуктора Nбутаноил-L-гомосерин лактона (C4-HSL) (McKnight S.L. et al., 2000). Данная система регулирует продукцию рамнолипидов (RhlAВ), эластаз (LasA и LasB), пиоцианина (PhzA1, PhzA2) и фосфолипазы (PlcB). Описана дополнительная QS-система P. aeruginosa – PQS («Pseudomonas quinolone signal»), имеющая свой сигнальный медиатор 2-гептил-3-гидрокси-4хинолон (Pesci E.C. et al., 1999). Он активирует транскрипцию гена rhlI и частично регулирует экспрессию гена lasB, в то же время, для синтеза аутоиндуктора PQS необходим белок LasR. Недавно идентифицировали новый регулятор транскрипции LasR – TetR-подобный репрессор PA3699. Индукция экспрессии PA3699 в P. aeruginosa PAO1 подавляла активность lasR промотора и соответственно продукцию LasR-зависимых факторов патогенности (Longo F. et al., 2013). Таким образом, QS системы принимают участие в контроле вирулентности P. aeruginosa в сложной, иерархической сети регуляции. После достижения кворума синегнойная палочка производит различные антимикробные соединения, чтобы обеспечить конкурентное преимущество в борьбе за привлекательную позицию (Stead P. et al., 1996). Нарушение коммуникации между клетками, опосредованное природными факторами, в том числе бактериального происхожления, или синтетическими антагонистами клеточной сигнализации, предотвращает продукцию бактериями вирулентных 39 факторов, изменяя патогенность микроорганизма (Calfee M.W. et al., 2001; Smith R.S., Iglewski B.H., 2003). В первую очередь данный феномен может иметь место в смешанном межвидовом сообществе. Внутривидовая конкуренция возможна между клонами, различающимися по синтезу «кворумных» продуктов. Показано, что инфицирование двумя разными клонами P. aeruginosa (полным типом и дефектным по синтезу сидерофоров) дает более низкую вирулентность (летальный исход), чем при инфицировании единственным клоном (полным типом), из-за соревнования, приводящего к социальному «обману», со снижением численности клеток кворум-зависимого микроорганизма (Harrison F. et al., 2006). 1.2.4. Pseudomonas aeruginosa в планктонной и пленочной смешанной культуре in vitro (антагонистическая активность) Известно, что в природной среде микроорганизмы сосуществуют в многокомпонентных сообществах (Smith V.H., 2002). Исследования последних лет, основанные на более эффективной микробиологической диагностике, позволили констатировать, что смешанные инфекции встречаются значительно чаще, чем это представлялось ранее. Это указывает на необходимость тщательного изучения физиологического статуса микроорганизмов в составе популяции, участвующих в инфекционном процессе. В смешанной культуре P. aeruginosa может занимать различные позиции в отношении других грамотрицательных и грамположительных бактерий или грибов (Tomlin K.L., 2001; Bandara H.M. et al., 2010; Yang L. et al., 2011; Machado I.M. et al., 2012; Conway C.A. et al., 2012). Например, клинические штаммы P. aeruginosa и Burkholderia cepacia легко интегрируются в совместной биопленке, тогда как референтный P. aeruginosa PAO1 ингибировал формирование смешанной биопленки (Tomlin K.L., 2001). Значительное увеличение биомассы совместной биопленки в полимикробных сообществах описано для P. aeruginosa и Klebsiella pneumoniae (Murga R. et аl., 1995). Исследования, проведенные Machado I.M. et al. (2011), показали отсутствие увеличения биомассы биопленки в смешанной культуре P. aeruginosa и E. coli (Machado I.M. et al., 2012). Выявлено, что P. aeruginosa препятствовала включению (по КОЕ) различных видов грибов Candida в смешанные биопленки (Bandara H.M.H.N. et al., 2010). Исход совместного культивирования, включая биомассу и характер смешанной биопленки, напрямую зависит от физиологического статуса и биохимической активности ассоциантов в процессе роста. Показано снижение продукции пиоцианина P. aeruginosa и биосинтеза тиосульфата Roseobacter denitrificans при их сокультивировании в планктонной культуре (Conway C.A. et al., 2012). Но в большинстве случаев в смешанных сообществах P. aeruginosa занимает доминирующее положение, которое определяется системой кворума, регулирующей синтез многих бактерицидных и фунгицидных соединений, модулируя, таким образом, механизмы 40 антимикробной защиты (Stead P. et al., 1996). При совместном росте культур P. aeruginosa и Candida albicans у последних была снижена способность к филаментации и биопленкообразованию из-за высокой продукции феназинов синегнойной палочкой (Morales D.K. et al., 2013). Показано значимое участие в подобных эффектах и липополисахарида P. aeruginosa (Bandara H.M. et al., 2013). Исследования Al-Bakri A.G. и соавт. (2004) по включению клеток в состав уже сформированной биопленки другого вида бактерий показали, что P. aeruginosa легко интегрировалась в биопленку B. cepacia, но не наоборот (Al-Bakri A.G. et al., 2004). Регуляция генов, кодирующих экзопродукты, осуществляется через собственные аутоиндукторы и, вероятно, при участии аутоиндукторов сопутствующей микробиоты (Mavrodi D.V. et al., 2001; Duan K.M. et al., 2003). В современной литературе представлено ограниченное количество примеров межвидовой клеточной сигнализации, в том числе примеры индукции и предотвращения клеточных сигнальных каскадов. Так, B. cepacia совместно с P. aeruginosa часто являются возбудителями инфекционных осложнений у пациентов с кистозным фиброзом легких. Как оказалось, клеточная сигнальная система B. cepacia частично регулируется 3-оксо-C12-HSL и C4HSL – аутоиндукторами, синтезируемыми P. aeruginosa. В свою очередь, зависимый от плотности транскрипционный регулятор P. aeruginosa активируется с помощью N-октаноил-L-гомосерин лактона – аутоиндуктора B. cepacia (Lewenza S. et al., 2002). При формировании смешанного сообщества P. aeruginosa и E. coli может измениться производство экзопродуктов обоих видов, их регуляторных молекул и, как следствие, получение конкурентного преимущества одной или обеих культур в борьбе за привлекательную нишу. Например, рост в смешанной культуре с P. aeruginosa стимулирует образование индола у E. coli, который может играть существенную роль в ее выживании, ингибируя работу системы кворума синегнойной палочки (Chu W. et al., 2012). Bhargava N. и соавт. (2012) не обнаружили ингибирующего влияния феназинов P. aeruginosa на рост Acinetobacter baumannii при их совместном культивировании. При этом показано ацилгомосеринлактон-опосредованное межвидовое взаимодействие: экзогенное добавление гетерологичных ацилгомосеринлактонов (из гетерологичных хозяев) к смешанной культуре, в которой один из ассоциантов был дефектным по синтезу аутоиндуктора, приводило к увеличению биомассы совместной биопленки (Bhargava N. et al., 2012). Известно, что P. aeruginosa может продуцировать цис-2-дециноевую (cis-2-decenoic) кислоту, способную ингибировать образование и разрушать сформированные биопленки некоторых грамположительных и грамотрицательных бактерий (Davies D.G., Marques C.N., 2009). Например, внеклеточные факторы P. aeruginosa снижали рост в планктонной культуре и разрушали зрелую биопленку Staphylococcus epidermidis (Qin Zh. et al., 2009). Существуют 41 данные о способности экзополисахаридов/рамнолипидов диспергировать биопленки Bordetella bronchiseptica (Irie Y. et al., 2005). В тоже время, недавно продемонстрировано, что планктонные и биопленочные экзопродукты P. aeruginosa не влияют на рост в планктоне и биопленкообразование E. coli (Lopes S.P. et al., 2011). Наоборот, экзополисахариды (капсульный полисахарид группы II) в составе супернатантов уропатогенной E. coli снижали биопленкообразующую способность P. aeruginosa и других бактериальных культур (Valle J. et al., 2006). 1.2.5. Влияние экзопродуктов P. aeruginosa на функциональную активность нейтрофилов Показано, что пиоцианин усиливал апоптоз нейтрофилов in vitro (Usher L.R. et al., 2002) и in vivo (Allen L. et al., 2005). Проапоптотический эффект пиоцианина является более существенным, чем достигаемый после связи с клеточными рецепторами Fas (Renshaw S.A. et al., 2000). Пиоцианин-индуцированная гибель нейтрофилов человека связана с появлением активных форм кислорода (Usher L.R. et al., 2002) и повышением активности каспазы-3 (Sanghavi D.M. et al., 1998). При экспериментальной инфекции, вызванной диким типом P. aeruginosa, количество нейтрофильных хемокинов (MIP-2, KC) и цитокинов (ИЛ-6, ИЛ1beta) было значительно ниже, чем при инфицировании феназин-дефектным штаммом (Allen L. et al., 2005). Кроме этого, обнаружено, что экзополисахарид P. aeruginosa Psl, участвующий в формировании биопленки, угнетает комплемент-опосредованную опсонизацию бактерий, снижает продукцию реактивных кислородных радикалов нейтрофилами и соответственно их фагоцитарную функцию (Mishra M. et al., 2012). Известно, что щелочная протеаза и эластаза, внеклеточные продукты P. aeruginosa, способны ингибировать миелопероксидазу, которая является одной из главных антибактериальных систем нейтрофилов (Kharazmi A. et al., 1984). Недавно показано, что цитотоксическое действие на нейтрофилы высоких концентраций аутоиндуктора С12-ГСЛ связано с индукцией апоптоза (Дерябин Д.Г. и соавт., 2013). В составе супернатантов P. aeruginosa кроме экзометаболитов, влияющих на функциональную активность нейтрофилов, присутствует и липополисахарид (больше в стационарной фазе), который ингибирует апоптоз нейтрофилов уже на ранних стадиях, являясь активатором фагоцитоза. Показано, что высокая концентрация пиоцианина в составе супернатантов P. aeruginosa (100 мкМ/мл) отменяла антиапоптотическое действие липополисахарида (100 нг/мл) (Usher L.R. et al., 2002). Очевидно, что функциональная активность нейтрофилов зависит от присутствия в среде/очаге метаболитов микробного происхождения, синтез которых может изменяться в смешанных культурах. 42 1.2.6. Распространенность фенотипов резистентности По уровню природной чувствительности к АБП P. aeruginosa существенно отличается от большинства грамотрицательных микроорганизмов, прежде всего от представителей семейства Enterobacteriaceae. К основным группам антибиотиков, обладающих клинически значимой антипсевдомонадной активностью, относятся бета-лактамные антибиотики (БЛА), аминогликозиды и фторхинолоны, но и к ним приобретенная резистентность является весьма распространенным явлением среди P. aeruginosa (Сидоренко С.В. и соавт., 1999). Фенотипы резистентности P. aeruginosa варьируют в различных странах, однако, в целом отмечается достаточно высокий уровень ее устойчивости к антисинегнойным пенициллинам, аминогликозидам и фторхинолонам. В Европе показатели устойчивости к разным группам антибактериальных препаратов являются самыми низкими на северо-западной территории (ниже 10%), особенно в Скандинавии, а самыми высокими (25-50%) на юговостоке, особенно в Греции (European Centre for Disease Prevention and Control, 2012). Высокий процент устойчивых штаммов в Латинской Америке и Юго-Восточной Азии, США занимают промежуточное положение (Bertrand X. et al., 2012). При исследовании 762 штаммов P. aeruginosa, выделенных в госпитале Bichat-Claude Bernard в Париже в 1991 г., 39% изолятов были резистентны к БЛА, 21% – к имипенему и ко всем тестируемым аминогликозидам, 37,5% – к фторхинолонам (Bergogne-Berezin E. et al., 1993). По данным Европейской группы исследования SENTRY, проведенного в двадцати пяти университетских больницах в Европе (1411 штаммов) в 1997-98 гг., устойчивыми к пиперациллину/тазобактаму были 13,2%, к меропенему – 12,7%, амикацину – 12,5%, к ципрофлоксацину – 26,8% штаммов P. aeruginosa (Fluit A.C. et al., 2000). Объединенные данные исследования SENTRY (6631 изолятов) показали, что Европа была единственной областью, где выявлено существенное снижение чувствительности к БЛА и аминогликозидам за период 199799 гг. (Gales A.C. et al., 2001). Отмечено снижение чувствительности P. aeruginosa к имипенему в Канаде и к обоим карбапенемам в Латинской Америке. В общей сложности выделено 218 множественно устойчивых изолятов P. aeruginosa (MDR-PSA; устойчивы к пиперациллину, цефтазидиму, имипенему и гентамицину). По данным исследования MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection), проведенном в 2002-04 гг., доля устойчивых к карбапенемам штаммов также была выше в Европе и Латинской Америке, чем в США и Австралии (Unal S. et al., 2005). Активность основных антибактериальных препаратов всей международной коллекции P. aeruginosa была следующая: пиперациллин/тазобактам (устойчивых 22,3%), меропенем (24,6%), имипенем (30,3%), цефтазидим (30,0%), гентамицин (33,9%), ципрофлоксацин (38,0%). На следующем этапе исследования SENTRY (2008-10 гг.) зафиксировано нарастание устойчивости к меропенему в странах Латинской Америки, которая 43 составила 53,8%, 46,7%, 33,3% и 28,8% для Аргентины, Бразилии, Чили и Мексики соответственно (Gales A.C. et al., 2012). В исследовании 2001-04 гг., проведенном в рамках программы SENTRY (8705 штаммов) по устойчивости P. aeruginosa к полимиксину В, выявлено, что это наиболее активный препарат в отношении данной группы бактерий: резистентность в Европе, США и Латинской Америки составила 1,1%, в АзиатскоТихоокеанском регионе – 2,9% (Gales A.C. et al., 2006). В первом многоцентровом проспективном исследовании в России (NPRS I), выполненном в ОРИТ 10 ЛПУ из разных городов в 1995-96 гг., было выявлено, что уровень устойчивости P. aeruginosa к цефтазидиму составил 10,7%, имипенему – 7,3%, амикацину – 6,9%, ципрофлоксацину – 15,2% (Руднов В.А., 2005). Второй этап исследования (NPRS II) в 1997-99 гг. показал, что устойчивость штаммов к амикацину (6,3%) и карбапенемам (меропенем – 3%) сохранилась на прежнем уровне, но увеличилась в два раза доля культур, нечувствительных к ципрофлоксацину (32,8%) (Страчунский Л.С. и соавт., 2003). Эти данные сопоставимы по уровню антибиотикоустойчивости синегнойной палочки с результатами европейских исследований в этот период времени. В исследовании, проведенном в ОРИТ 31 ЛПУ России (в рамках проекта «РЕЗОРТ» за 2002-2004 гг.), показано, что P. aeruginosa (1053 штаммов) характеризовалась высокой частотой резистентности ко всем антибиотикам, за исключением полимиксина. Нечувствительными к имипенему и меропенему были 39 и 41,4% штаммов соответственно, к цефтазидиму – 47,9%, к остальным цефалоспоринам были устойчивы от 58,6 до 72,6% штаммов. Из аминогликозидов наиболее активным являлся амикацин, нечувствительными к которому оказались 41,6% штаммов, тогда как к гентамицину – 74,7%. К ципрофлоксацину были устойчивы 65,1% культур P. aeruginosa (Решедько Г.К. и соавт., 2006; 2008). В ОРИТ крупных ЛПУ г. Екатеринбурга доля штаммов, резистентных к амикацину, возросла до 56,2%, ципрофлоксацину – до 82,1%, при этом наиболее тревожная ситуация наблюдается в ОРИТ хирургического профиля (Руднов В.А., 2005). По мнению Решедько Г.К. и соавт. (2006) такой скачок резистентности (к отдельным антибиотикам более чем в 10 раз) обусловлен более интенсивным их использованием для терапии нозокомиальных инфекций в ОРИТ. Такое мнение подтверждается выявленной низкой долей штаммов, устойчивых к полимиксину – 5,8%, который не используется в России, а также данными специальных исследований (Ong D.G. et al., 2011). Синегнойная палочка обладает комплексом механизмов резистентности к антибиотикам. В Европе и Северной Америке штаммы P. aeruginosa устойчивы за счет мутаций, которые ограничивают вход препарата (наиболее распространенная причина устойчивости к карбапенемам), инициации хромосомных AmpC лактамаз и механизмов, связанных с выведеним антибиотика из клетки (Livermore D.M., 2002). Приобретенные механизмы 44 антибиотикоустойчивости более важны в Азии и Латинской Америке. Продуценты беталактамаз расширенного спектра (БЛРС), например PER-1, широко распространены в Турции (Kolayli F. et al., 2005), а VEB-1 – в Юго-Восточной Азии (Naas T. et al., 1999). Несмотря на различия по частоте встречаемости МБЛ в разных странах, во всем мире отмечается тенденция быстрого роста числа инфекций, вызванных продуцентами МБЛ (Edelstein M.V. et al., 2013). 1.2.6.1. Молекулярная эпидемиология бактерий P. aeruginosa, продуцирующих карбапенемазы Наиболее распространенными механизмами резистентности к карбапенемам у P. aeruginosa являются: мутации или снижение экспрессии поринового белка OprD (преимущественно для имипенема), активное выведение антибиотика из клетки – эффлюкссистемы (преимущественно для меропенема и дорипенема) и ферментная инактивация. Последний механизм может реализовываться с помощью бета-лактамаз трех классов: некоторыми ферментами классов А и D и металло-бета-лактамазами класса В (Queenan A.M., Bush K., 2007) (Рисунок 2). Рисунок 2. Классификация карбапенемаз (в сокращении). Сериновые лактамазы молекулярного класса А (функциональная группа 2f) описаны более чем 20 лет назад у представителей семейства Enterobacteriaceae (Medeiros A.A., Hare R.S., 1986). Карбапенемазной активностью из них обладают представители четырех главных семейств: NMC/IMI и SME (хромосомные), ферменты KPC и GES (плазмидные), последние долгое время идентифицировали как БЛРС. Первое обнаружение плазмидной KPC-2 (“Klebsiella pneumoniae carbapenemase”) у P. aeruginosa было сделано в Колумбии и нарушило известное представление о развитии распространения этих карбапенемаз (Villegas M.V. et al., 2007). В большинстве случаев отмечено клональное распространение KPC-продуцентов, в том числе и для P. aeruginosa. Быстрая диссеминация KPC показана в медицинских центрах ПуэртоРико (Wolter D.J. et al., 2009). KPC активны в отношении пенициллинов, цефалоспоринов I-V 45 поколений, карбапенемов, азтреонама. Ферменты GES/IBC встречаются редко и сначала были описаны у Enterobacter cloacae в Греции как IBC-1 (“integron-borne cephalosporinase”) и GES-1 (“Guiana extended spectrum”) у K. pneumoniae в Гвиане (Giakkoupi P. et al., 2000; Poirel L. et al., 2000). В 2001 г. Poirel L. и соавт. сообщили о ферменте GES-2 с единственной заменой глицина на аспарагин (Gly170Asn), который был найден в клиническом полирезистентном изоляте P. aeruginosa из Южной Африки (Poirel L. et al., 2001). Недавно была описана карбапенемаза GES-18, идентифицированная в клиническом изоляте P. aeruginosa в Бельгии (Bebrone C. et al., 2013). В России обнаружена бета-лактамаза GES-5 в составе «малого» интегрона у нозокомиалных штаммов P. aeruginosa сиквенс-типа 235 (Воронова О.Л. и соавт., 2012). Ферменты молекулярного класса D (ОХА-бета-лактамазы, оксациллиназы) впервые обнаружены у неферментирующих бактерий A. baumannii и P. aeruginosa, и в ряде работ отмечается проявление высокой ферментативной активности именно этими бактериями (Hall L.M.C. et al., 1993; Danel F.L. et al., 1995). Существует более 400 различных OXA-беталактамаз (“oxacillin-hydrolyzing”), 19 из которых являются бета-лактамазами расширенного спектра и не менее 48 считаются карбапенемазами (Bush K., Jacoby G.A., 2010; www.lahey.org/Studies). БЛРС-оксациллиназы являются производными OXA-10 (OXA-11, 14, 16, 17, 19, 28, 35, 142, 145, 147) или OXA-2 лактамазы (OXA-15, 32, 34, 36, 141, 161, 226). Ферменты имеют плазмидную или интегрон-зависимую локализацию генов, что способствует их быстрому распространению. Большая часть БЛРС-оксациллиназ была найдена в клинических изолятах из Турции (Bradford P.A., 2001). Ферменты этой подгруппы гидролизуют цефалоспорины, хотя и с разной субстратной специфичностью, например OXA-11, OXA-14 и OXA-19 – преимущественно цефтазидим, но не цефепим. В настоящее время описано девять кластеров OXA-бета-лактамаз с карбапенемазной активностью. OXA-50-подобные лактамазы P. aeruginosa формируют седьмую подгруппу в классификации и включают ряд ферментов, которые были упомянуты как PoxB ферменты (Queenan A.M., Bush K., 2007). Более того, присутствие в хромосоме blaOXA-50-like считается видовым признаком P. aeruginosa, но эти ферменты могут экспрессироваться не во всех изолятах (Girlich D. et al., 2004). Для P. aeruginosa описано пять основных групп приобретенных карбапенемаз молекулярного класса В, подкласса В1: VIM, IMP, SPM, GIM, SIM. Все они содержат по два атома цинка и различаются аминокислотными последовательностями. Гены, кодирующие большую часть этих ферментов, в составе генных кассет включены в различные мобильные элементы, в основном интегроны 1-го класса, что обеспечивает их широкое распространение. Особую значимость имеют МБЛ, продуценты которых распространены по всему миру. Карбапенемаза VIM-1 (“Verona integron-encoded metallo-lactamase”) впервые была выделена из нозокомиального штамма P. aeruginosa в Вероне (Италия) в 1997 г. (Lauretti L. et al., 1999). 46 Позднее описан VIM-2-фермент из штамма, изолированного еще в 1996 г. во Франции (Poirel L. et al., 2000). Среди VIM-карбапенемаз выделяют две большие филогенетические линии: подгруппа VIM1 (VIM-1, 4, 5, 12, 14, 19) и подгруппа VIM2 (VIM-2, 3, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 23), в отдельный кластер выделен единственный фермент VIM-7 (Toleman M.A. et al., 2004). Сегодня описано более 30 вариантов этих ферментов и их список постоянно пополняется (http://www.lahey.org/studies/other.asp #table1). МБЛ обладают наиболее широким спектром гидролитической активности, действию которых подвержены все БЛА, за исключением монобактамов. Активность МБЛ не подавляется ингибиторами β-лактамаз – клавулановой кислотой, сульбактамом, тазобактамом, активными в отношении сериновых ферментов. Госпитальные штаммы P. aeruginosa чаще всего продуцируют именно VIM-ферменты (Lee K. et al., 2002; Черкашин Е.А. и соавт., 2006; Иванов Д.В. и соавт., 2009). Анализ нозокомиaльных штaммов, выделенных в рaмкaх нескольких многоцентровых эпидемиологических исследовaний в России, выявил стремительное нaрaстaние доли МБЛ-положительных изолятов P. aeruginosa (от 4,5 до 20,3% в период между 2002-2004 гг. и 2006-2007 гг.), которое в основном было связaно с эпидемическим рaспрострaнением клонa P. aeruginosa ST235 VIM-2. Циркуляция данного клона отмечена не только на всей территории России, но и в нескольких городах Беларусии и Казахстана (Эйдельштейн М.В. и соавт., 2012). Исследование, проведенное в 23-х больницах Кореи, показало, что устойчивость P. aeruginosa к карбапенемам в 10% случаев обеспечивалась карбапенемазами, при этом штаммы, несущие МБЛ VIM-типа, были распространены в 2,5 раза чаще, чем с IMP-типом (Lee K. et al., 2009). Первый фермент IMP-группы (“active on imipenem”) был описан у А. baumannii, изолированного в госпитале Италии (Riccio M.L. et al., 2000). После этого IMP-карбапенемазы найдены во всем мире, включая США и Австралию (Toleman M.A. et al., 2004). В Корее клон P. aeruginosa ST235 с blaIMP-6 распространился по всей стране (Seok Y. et al., 2011). В России широкого распространения штаммы, продуцирующие данные ферменты, пока не получили, но по результатам пролонгированного (1998-10 гг.) исследования грамотрицательных бактерий, продуцирующих МБЛ, у трех генетически родственных изолятов P. aeruginosa (0,4%) отмечена продукция IMP-30 – нового варианта IMP-1, отличающегося заменой одной аминокислоты (Glu59Lys) (Эйдельштейн М.В. и соавт., 2012). GIM-1-фермент (“German imipenemase”) был изучен в Германии в 2002 г. (Castanheira M. et al., 2004). Фермент SPM-1 (“Sao Paulo metallolactamase”) впервые выделен у штаммов P. aeruginosa из Сан-Паулу в Бразилии (Poirel L. et al., 2004), а затем распространился среди госпитальных изолятов, достигнув национального масштаба (Silva F.M. et al., 2011). Штамм-продуцент фермента SIM-1 (“Seoul imipenemase”) описан в Корее (Lee K. et al., 2005). Если носители SPM-, GIM- и SIM-ферментов почти не распространились за пределы страны их происхождения, то VIM и IMP-металло-бета- 47 лактамазы продолжают обнаруживаться не только у P. aeruginosa, но и у других видов бактерий (Queenan A.M., Bush K., 2007). Новый тип МБЛ получил обозначение NDM1 (“New Delhi metallo-beta-lactamase-1”), поскольку первый штамм, продуцирующий этот фермент, был выделен в больнице Нью-Дели (Kumarasamy K.K. et al., 2010). Быстрая диссеминация NDM-1 во всем мире была выявлена в последние годы. Ген blaNDM-1 найден в составе плазмид у штаммов P. aeruginosa в разных странах (Jovcic B. et al., 2011; Flateau C. et al., 2012). 1.3. Методы микробиологического анализа для идентификации, типирования и оценки патогенного потенциала Pseudomonas aeruginosa 1.3.1. Бактериологический метод P. aeruginosa и другие псевдомонады идентифицируют согласно приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» и «Методическим рекомендациям по определению грамотрицательных бактерий потенциально-патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций» МЗ РСФСР от 03.06.1986 г. В объектах окружающей среды (воде, сточных жидкостях, пищевых продуктах) обнаружение и идентификацию P. aeruginosa осуществляют согласно «Методическим рекомендациям …» от 24.05.1984 г. культуральным методом, который включает этап предварительного накопления бактерий в самом исследуемом материале или среде накопления. Первичное выделение и предварительная дифференцировка от ферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий дифференциально-диагностических осуществляют средах (МакКонки, на общих агар (кровяной Клиглера). агар) и Псевдомонады являются подвижными, оксидазоположительными, неферментирущими бактериями (отсутствие ферментации на полиуглеводном агаре Клиглера или в О/F-тесте), они не образуют индол, ацетилметилкарбинол, не продуцируют лизиндекарбоксилазу. Межвидовая дифференциация основана на биохимических/сахаролитических тестах, продукции пиоцианина, пиовердина (флуоресценция), желатиназы, а также способности роста при +42ºС и/или +5ºС, гидролизе мочевины, способности утилизировать цитрат (тест с цитратом Симмонса) и нитрат/нитрит (Таблица 1). Характеристика патогенности выделенных штаммов осуществляется на основе двух признаков: качественной оценки продукции пиоцианина (на среде КингА) и гемолитической активности (на кровяном агаре). Для видовой идентификации P. aeruginosa и других неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ) используют различные ручные и автоматизированные диагностические системы, основанные на определении их биохимической активности в стандартных 96-луночных полистироловых планшетах. К системам этого типа относятся 48 наиболее широко распространенные в нашей стране «НЕФЕРМ-тест 12/24» (Эрба- Lachema,Чехия), API NFT/API 20 NE (BioMerieux, Франция), RapID NF Plus (IDS, США). Учет результатов бактериальных исследований осуществляют либо визуально, либо при помощи специальных ридеров, что повышает достоверность идентификации. Как правило, фирмы, выпускающие системы для биохимической идентификации микроорганизмов, разрабатывают и специальное программное обеспечение для компьютерной обработки результатов. В настоящее время появились системы ускоренной идентификации, которые позволяют получить ответ после 4-6 часов инкубации. Оценка эффективности тест-систем в отношении НГОБ, проведенная в различных лабораториях, дала показатели правильной идентификации 77-90% и выше для разных видов. Проведение дополнительных биохимических тестов, предлагаемых производителями, повышает коэффициент правильной видовой идентификации до 95-96% (Белокрысенко С.С., Дадха Теграни А., 2004). Таблица 1 Основные дифференцирующие признаки флуоресцирующих псевдомонад* Тест/ фермент или субстрат Вид P. aeruginosa P. fluorescens + Цитохромоксидаза + + Пиоцианин + + Пиовердин/Флуоресценция + + Глюкоза -/+ Лактоза -/+ Мальтоза -/+ +/Нитрат/Нитрит + Рост на ацетамидном агаре + Рост при 5ºC + Рост при 42ºC + + Желатиназа Примечание: *Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985 № 535. P. putida + + + -/+ -/+ + - Чувствительность и специфичность культурального метода на сегодняшний день остается «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний, вызванных P. aeruginosa. В то же время, тесты, основанные на биохимических признаках, не всегда эффективны при идентификации P. aeruginosa у пациентов с муковисцидозом, когда изоляты часто теряют способность к пигментообразованию, продукции экзополисахарида и рамнолипида. Идентификацию затрудняет присутствие в мокроте и других неферментирующих грамотрицательных палочек, в том числе рода Pseudomonas (Da Silva Filho L.V. et al., 1999; Coenye T. et al., 2002; Lyczak J.B. et al., 2002). Эффективность микробиологического контроля санитарного состояния в стационарах различного профиля в значительной степени зависит от используемых при этом диагностических тестов. Решение этой задачи осложняется в ряде случаев неэффективностью 49 бактериологической диагностики, поскольку циркуляция госпитальных штаммов может сопровождаться формированием биопленочных форм бактерий, не выявляемых традиционными культуральными методами. Известен способ планового бактериологического контроля в ЛПУ, основанный на определении общего микробного числа и наличия санитарнопоказательных микроорганизмов (стафилококки, бактерии группы кишечной палочки и др.) в соответствии с приказом МЗ СССР № 720 от 31.07.1978 г., приложение №2 и МУ по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями МЗ СССР №28-6/34 от 02.12.87. Предложен способ экспресс-обнаружения P. aeruginosa в различных объектах внутрибольничной среды методом флюоресцирующих антител с моноклональными диагностическими иммуноглобулинами, позволяющий получить предварительный ответ в течение 2-4 часов от начала исследования (Крючкова Т.П., 2005), но этот способ не регламентирован законодательно. С эпидемиологической точки зрения основополагающее значение в процессе осуществления микробиологического мониторинга придается внутривидовому типированию выделенных микроорганизмов. Это особенно важно, если изолированные бактерии являются компонентом нормальной микрофлоры человека или часто обнаруживаются в окружающей среде. Для внутривидовой дифференциации P. aeruginosa применяются методы серо-, фаго- и пиоцинотипирования (International Pseudomonas aeruginosa Typing Study Group, 1994). Типирование культур синегнойной палочки по антигенной структуре проводят методом агглютинации на стекле с использованием набора, состоящего из поливалентных сывороток к 12 групповым О-антигенам или с 23 адсорбированными моноспецифическими сыворотками к 23 факторам О-антигена (Приказ №535 от 22 апреля 1985 г.). Это легко и четко воспроизводимый метод, и дифференциация с его помощью достаточно стабильна из-за моноспецифичности серологических типов. В то же время, выявлены изменения в О-серотипах у лизогенных культур in vitro (Liu P.V., 1969), и in vivo (Lanyi B., Lantos J., 1976). Эта вариабельность обусловлена фаговой лизогенизацией бактерий на одном из этапов эволюции и связана с приобретением гена, ингибирующего полимеризацию О-специфического полисахарида. Дополнительно может происходить изменение или приобретение гена, кодирующего О-ацетилтрансферазу, что приводит к изменению в О-ацетилировании олигосахарида в постполимеризационную фазу (Быстрова О.В. и соавт., 2004). Серотипирование P. aeruginosa имеет ограниченное использование, если О-антигенные детерминанты потеряны (Ojeniyi B. et al., 1985). Показано, что до 70% изолятов P. aeruginosa, изолированных от пациентов с фиброзом легких, могут давать аутоагглютинацию и быть нетипируемыми. Это связано с общей особенностью строения кора липополисахаридного слоя у P. aeruginosa. Показано присутствие двух изомерных гликоформ внешней области кора, одна 50 из которых может присоединять к себе О-антинген, а другая нет (Быстрова О.В. и соавт., 2004). Исследования, основанные на фаголизабельности, редко применяются по отношению к P. aeruginosa, что связано с отсутствием промышленно выпускаемых стандартных наборов фагов. Бактериоцинотипирование P. аeruginosa (пиоциновое типирование – от старого названия микроорганизма Pseudomonas pyocyaneus) является вспомогательным методом и не нашло широкого распространения из-за субъективных факторов (сложная питательная среда, обработка пигментов специальными реактивами, принадлежащими ко 2 группе опасности и т.д.). Таким образом, возможности фенотипических методов ограничены не только вследствие технических причин, а также из-за способности микроорганизмов изменять экспрессию соответствующих генов, что может происходить непредсказуемо или в ответ на влияние различных факторов окружающей среды (Шагинян И.А., 2000). Противоречивые отчеты об источнике и распространении P. aeruginosa в больничной среде связаны, прежде всего, с использованием несоответствующих методов исследования для идентификации и типирования. В США центры по контролю за заболеваниями отказались от использования этих тестов в пользу молекулярных методик (Mims C. et al., 2004). 1.3.2. Молекулярные технологии, используемые для генотипической характеристики Pseudomonas aeruginosa 1.3.2.1. Идентификация и прямая детекция Идентификацию бактерий с помощью молекулярно-генетических методов чаще всего осуществляют с помощью технологии, основанной на процессе искусственного многократного копирования ДНК, известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для выявления P. aeruginosa предложены специфические праймеры детекции algD-гена, кодирующего гуанозиндифосфат-D-манноза-дегидрогеназу (ГДФМ-дегидрогеназа), участвующую в продукции альгината у этого вида бактерий, toxA-гена, кодирующего экзотоксин А, gyrB-гена, ecfX-гена и генов oprI и oprL (Khan A.A., Cerniglia C.E., 1994; De Vos D. et al., 1997; Da Silva Filho L.V. et al., 1999; Lavenir R. et al., 2007; Motoshima M. et al., 2007). Экзотоксин А нарушает биосинтез белка и других метаболических процессов эукариот, инактивируя фактор элонгации II, наподобие дифтерийного токсина и является основным фактором патогенности P. aeruginosa (Armstrong S. et al., 2002). Khan A.A. и Cerniglia C.E. (1994) сообщили, что из 130 изолятов P. aeruginosa 125 содержали toxA-ген (чувствительность – 96%), тогда как другие виды бактерий не приводили к положительным результатам (специфичность – 100%). Позднее, Nikbin V.S. и др. (2012) показали, что чувствительность 51 данной тест-системы была на уровне 90,7%, и авторы объясняют это тем, что не все изоляты P. aeruginosa естественно несут этот ген. Продукция альгината играет центральную роль в патогенезе хронической легочной инфекции при муковисцидозе. Его синтез регулируется несколькими генами, но algD ген, кодирующий ГДФМ-дегидрогеназу, является первым ферментом в альгинатном биосинтетическом пути (Govan J.R.W., Deretic Y., 1996). Da Silva Filho L.V. и соавт. (1999) предложили, и протестировали праймеры к algD-гену на 182 изолятах P. aeruginosa и 20 штаммах близкородственных видов, и показали их 100% специфичность и чувствительность. Тест также оправдал себя при непосредственной детекции возбудителя в клинических образцах. Использование праймеров к гену gyrB при идентификации 224 клинических штаммов P. aeruginosa показало 98,1% чувствительность и 100% специфичность данной технологии (Motoshima M. et al., 2007). Ген кодирует GyrB – одну из субъединиц гетеротетрамера ДНКгиразы (топоизомеразы II типа) – фермента, являющегося мишенью для большинства фторхинолонов. Именно этот ген используется для идентификации синегнойной палочки в российских тест-системах, например компании «Синтол» (www.syntol.ru/productleg.htm). Ген ecfX кодирует один внецитоплазматической группы из 19 описанных альтернативных сигма-факторов (экстрацитоплазматическая функция, ECF), который у P. aeruginosa может играть роль в утилизации железа и вирулентности (Potvin E. et al., 2007). Анализ специфичности и чувствительности ecfX-ПЦР выявил, что он работает со 100% специфичностью и высокой чувствительностью (97-99%) для детекции P. aeruginosa как в клиническом материале, включая сыворотку крови, так и в экологических образцах почвы и воды (Lavenir R. et al., 2007; Cattoir V. et al., 2010). Предложена одновременная амплификация («multiplex-PCR») генов oprI и oprL, экспрессирующих синтез двух липопротеинов наружной мембраны, маркирующих флюоресцентную группу псевдомонад и P. aeruginosa соответственно (De Vos D. et al., 1997). Липопротеины I и L являются внешними мембранными белками, ответственными за видовую устойчивость псевдомонад к антибиотикам и антисептикам (Masuda N. et al., 1995). Поскольку эти белки были найдены только у данных микроорганизмов, они были предложены в качестве мишени для быстрой идентификации P. aeruginosa в клинических образцах. Позднее, наряду с высокой чувствительностью, отмечена низкая специфичность данной технологии. Так, Lavenir R. и соавт. (2007) подтвердили, что все изоляты P. aeruginosa содержали oprI и oprL гены, но выявили ложноположительные реакции с другими видами (чувствительность – 100%, специфичность – 80%). Причину низкой специфичности авторы видят в отсутствии полной расшифровки геномов бактерий, близкородственных с P. aeruginosa, у которых могут быть фрагменты подобных генов (Qin X. et al., 2003). 52 При использовании в качестве мишени fliC, кодирующего С-конец флагеллина, показана 100% чувствительность, но очень низкая специфичность (Lavenir R. et al., 2007), в том числе на изолятах P. aeruginosa, ассоциированных с язвенным кератитом (Winstanley C. et al., 2005). Молекулярной мишенью могут служить нуклеотидные последовательности, кодирующие участки генов 16S-23S рРНК (Widmer F. et al., 1998; Baker G.C. et al., 2003; Spilker T. et al., 2004). Для выявления P. aeruginosa разработан ДНК-микрочип на основе последовательности 23S рДНК. Двести десять клинических образцов были рассмотрены, и 25 из 26 клинических образцов P. aeruginosa были успешно идентифицированы, а оставшиеся 184 образца, содержащие другие виды бактерий, были отрицательными: чувствительность 96,2% и специфичность 100% (Keum K.C. et al., 2006). В ряде работ показано, что вышеназванные гены-мишени можно использовать для непосредственной детекции P. aeruginosa в образцах кожи (биопсий из раны) (De Vos D. et al., 1997), в том числе в количественной ПЦР в реальном времени при исследовании образцов крови (Jaffe R.I. et al., 2001). На настоящий момент нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени, соответствующие праймеры и протоколы для идентификации P. aeruginosa. По данным Lavenir R. и соавт. (2007), которые оценили чувствительность и специфичность ряда предложенных последовательностей, сделан вывод, что гены gyrB, toxA и последовательность 16S-23S рРНК внутреннего транскрибируемого региона (ITS), но не 16S рРНК, oprI, oprL и fliC могут быть применены в качестве мишеней для верификации клинических P. aeruginosa. Наиболее стабильным считают ecfX-ген, при использовании которого в ПЦР показана самая высокая чувствительность и специфичность при исследовании штаммов синегнойной палочки различного происхождения (Lavenir R. et al., 2007). Использование только единственного гена для молекулярной идентификации P. aeruginosa потенциально «страдает» от видового полиморфизма, который усложняет и биохимическую верификацию этого микроорганизма. Показана эффективность использования нескольких пар праймеров (гены ecfX, gyrB) для выявления синегнойной палочки (Anuj S.N. et al., 2009). В одном из последних исследований было проведено сравненение мультиплексной ПЦР (gyrB и ecfX гены) с технологией ПЦР детекции oprL-гена (Le Gall F. et al., 2013) и выявлена более высокая чувствительность oprL ПЦР-РТ (порог – 10 против 730 КОЕ/мл), но лучшая специфичность gyrB/ecfX ПЦР-РТ (90% против 73%). Авторы предлагают протокол ПЦР, объединяющий эти две технологии, который позволит получить чувствительность с порогом 10 КОЕ/мл и 100%-ую специфичность. В Российской мультиплексной Real-time тестсистеме (в том числе для детекции A. baumannii, K. pneumoniae и E. coli), разработанной на базе 53 Центрального НИИ эпидемиологии Минздрава РФ (ИЛС), мишенью для P. aeruginosa также является oprL. 1.3.2.2. Методы генетического типирования Молекулярно-генетический анализ широко используется для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, что особенно ценно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипирование) генотипирование отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации и высокой воспроизводимостью (Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В., 2000). Молекулярные технологии, различающиеся по уровню и сложности исследования структуры ДНК, давно и широко используются для типирования клинических и природных штаммов P. aeruginosa. Основные методы включают: гель-электрофорез в пульсирующем поле (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE, ПЭ) (Schwartz D.C., Cantor C.R., 1984), саузерн-блот типирование с использованием ген-специфических зондов (RFLP-Southern blotting, ПДРФ- саузерн-блотинг) (Southern E.M., 1975), риботипирование – вариант саузерн-блот анализа, в котором в качестве зонда используются последовательности генов 16S и 23S рРНК (Stull T.L. et al., 1988), мультилокусный анализ числа тандемных повторов (Multiple-Locus (Variable-number tandem repeat, VNTR) Analysis, MLVA-типирование) (Jeffreys A.J. et al., 1985; Vergnaud G., Denoeud F., 2000), мультилокусное секвенирование-типирование (Multiple-Locus Sequence Typing, MLST-типирование) (Maiden M.C. et al., 1998), а также ряд ПЦР методов, основанных на амплификации повторяющихся последовательностей (RAPD-ПЦР, Rep-ПЦР, BOX-ПЦР). При RAPD-ПЦР (Random Amplified Polymorphic DNA) используются короткие произвольные праймеры, которые гибридизуются с ДНК-мишенью при низкой температуре отжига, для стандартизации процедуры чаще всего используют консенсусный праймер М13 (Welsh J., McClelland M., 1990; Williams J.G. et al., 1990; Huey B., Hall J., 1989). Rep-ПЦР позволяет амплифицировать палиндромные две основные элементы энтеробактериальные группы (Repetitive повторяющиеся элементов: Extragenic внутригенные повторяющиеся Palindromic экстрагенные (REP) последовательности elements) и (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) sequences), впервые описанные у представителей семейства Enterobacteriacea (Versalovic J. et al., 1991). Еще одной межгенной последовательностью являются BOX-элементы, не связанные ни с REP-, ни с ERIC- последовательностями, которые могут формировать структуры типа стебель-петля благодаря их двойной симметрии (Martin B. et al., 1992). Пульс-электрофорез, как основа молекулярного изучения эпидемиологии микроорганизмов, является наиболее отличительным, и признан «золотым стандартом» для 54 типирования большей части бактерий, включая P. aeruginosa (Bertrand X. et al., 2001; Silva F.M. et al., 2011; Wolska K., Szweda P., 2012). Однако этот метод ограничен технической сложностью и длительной по времени обработкой результатов (Olive D.M., Bean P., 1999). Для генотипирования штаммов P. aeruginosa предложено использовать саузерн-блот гибридизацию с применением разнообразных ген-специфических зондов: toxA (Ogle J.W. et al., 1987), plcSR (Vasil M.L. et al., 1987), 3'кодирующей области полипептида пилина P. aeruginosa (Samadpour M. et al., 1988), algD и lasA (Loutit J.S., Tompkins L.S., 1991), а также широкий спектр зондов рДНК E. coli (для риботипирования) (Blanc D.S. et al., 1993; Gruner E. et al., 1993). Использование в качестве маркера зонда toxA было ограничено в связи с существованием - toxA -изолятов P. aeruginosa (Samadpour M. et al., 1988), а algD и lasA не выявило существенных различий между штаммами (Loutit J.S., Tompkins L.S., 1991). Интернациональной группе по изучению типирования Pseudomonas удалось получить только 54 toxA-типа среди 200 различных культур P. aeruginosa. Дискриминирующая способность этого метода ограничена главным образом тем, что зависит в основном от мутаций в пределах целевой последовательности, игнорируя различия в других частях генома. Был сделан вывод, что уровень дискриминации увеличивается, если только объединить данные исследования разных генов-мишеней (International aeruginosa Typing Study Group, 1994). Позднее Grundmann H. и соавт. (1995) использовали мультилокусный саузерн-блот анализ (комбинацию зондов к генам toxA, 16S и 23S рРНК) для субвидового типирования P. aeruginosa. Pitt T.L. и соавт. (1989) первыми использовали риботипирование для исследования мультирезистентных изолятов P. aenrginosa О12 от пациентов с муковисцидозом. Анализ проводили с применением трех ристрикционных ферментов (HindIII, EcoRI и BclI), что позволило получить 16 риботипов, но этот метод давал меньше различий, чем белковый электрофорез фрагментов эстеразы (Denamur E. et al., 1991). Предполагая, что низкая чувствительность риботипирования P. aeruginosa могла быть связана с ограниченным выбором соответствующих ферментов, Blanc D.S. и соавт. (1993), используя четыре рестриктазы (BamHI, ClaI, EcoRI и PstI), классифицировали 55 изолятов в 33 риботипа. Для оценки ценности риботипирования для эпидемиологических исследований авторы вычислили индекс разнообразия, который составил 0,958 и был сопоставим с таковым для других методов. Gruner E. и соавт. (1993) сравнили восемь ферментов, используемых для риботипирования изолятов P. aeruginosa, и обнаружили, что PvuII обеспечивал самый высокий уровень дискриминации между штаммами. Несмотря на разнообразие ферментов рестрикции и зондов 16S-23S рДНК, показана более низкая разрешающая способность риботипирования в сравнении с ПЭ (Poh C.L. et al., 1992). Например, Poh C.L. и соавт. (1992) при изучении коллекции штаммов P. aeruginosa серотипа О11, изолированных в семи больницах Сингапура, 55 дифференцировали 11 риботипов (с двумя рестриктазами EcoRI и Sacl), тогда как, используя ПЭ (или SpeI, или DraI), они идентифицировали 41 различный геномовариант среди 44 клинических изолятов. К тому же, оба метода являются трудоемкими, относительно затратными и занимают много времени. Метод RAPD-ПЦР, основанный на использовании в ПЦР случайных коротких последовательностей (9-10 оснований), широко используется для типирования P. aeruginosa (Шагинян И.А., 2000; Ortiz-Herrera M. et al., 2004; Аветисян Л.Р. и соавт., 2009, 2012; Nanvazadeh F. et al., 2013). Результаты RAPD-ПЦР, полученные в разных исследованиях, стало возможно сопоставлять с применением в качестве праймера последовательности бактериофага М13 (Huey B., Hall J., 1989; Fonseca A.P. et al., 2008). Проблемы по воспроизводимости и стандартизации метода делают его востребованным при анализе изолятов в пределах одной лаборатории. В сравнении с другими техниками типирования RAPD-ПЦР обладает большей разрешающей способностью, чем ПДРФ-саузерн-блотинг, включая риботипирование с 16S рРНК или фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рРНК. Fonseca A.P. et al. (2008), используя ПЭ и RAPD-ПЦР в эпидемиологическом анализе изолятов, циркулирующих в ЛПУ в течение года, сделали вывод о высокой конкордантности методов. Rep-ПЦР с праймерами, основанными на REP и ERIC последовательностях, может быть выполнена как с единственной, так и с двумя затравками. Liu и соавт. (1996), используя метод ERIC-ПЦР, показали его хорошую разрешающую способность при дифференцировке нозокомиальных штаммов P. aeruginosa, вызвавших бактериемию у больных раком (Liu Y. et al., 1996). Он нозокомиальных был успешно штаммов использован P. aeruginosa, при оценке изолированных генетических от больных особенностей с различными инфекционными осложнениями (Wolska K., Szweda P., 2009) и имел более высокую разрешающую способность по сравнению с риботипированием (Wolska K., Szweda P., 2008). Наконец, несколько исследований показали, что Rep-ПЦР (ERIC) имеет хорошую корреляцию с ПЭ, но с меньшей дискриминирующей способностью (Syrmis M.W. et al., 2004). В то же время недавно введенная полуавтоматическая система DiversiLab (DL) (bio-Mérieux), основанная на Rep-PCR, оказалась несоответствующей для P. aeruginosa (Fluit A.C. et al., 2010). Первоначально примененный для дифференциации Streptococcus pneumoniae метод BOX-ПЦР (похожие BOX-элементы, и в частности boxA, были найдены и в геноме других видов) стали использовать для типирования штаммов рода Pseudomonas, включая Pseudomonas aeruginosa (Dawson S.L. et. al., 2002; Syrmis M.W. et. al., 2004; Marques A.S.A. et. al., 2008; Wolska K. et al., 2011). В исследовании, проведенном Wolska K. и соавт. (2011), с помощью BOX-ПЦР-фингерпринтинга выявлено 38 генетических паттернов, среди которых 7 основных геномогрупп (включающих от трех до восьми изолятов) и 31 уникальный паттерн. Morrelli P. и 56 соавт. (2008) при помощи метода BOX-ПЦР обнаружили 179 генотипов среди 340 изолятов P. aeruginosa от пациентов с муковисцидозом. В отличие от этих двух исследований, ранее Dawson S.L. и соавт. (2002) показали значительную гомологию изолятов P. aeruginosa при использовании этого метода и, наоборот, гетерогенность в пределах других видов, например Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens. Сравнительный анализ двух методов показал сопоставимые результаты при использовании метода ERIC- и BOX-ПЦР (Dawson S.L. et al., 2002; Wolska K, Szweda P., 2009). Syrmis M.W. и соавт. (2004) также показали, что использование повторяющихся ERIC- и BOXэлементов в ПЦР для типирования штаммов P. aeruginosa имеет одинаковую разграничивающую силу и данные методы оказались сравнимы с ПЭ. Они детектировали 6 основных и 58 отдельных клональных групп среди 163 культур, изолированных от взрослых и детей с муковисцидозом, проходивших лечение в госпитале г. Брисбен (Австралия) (Syrmis M.W. et al., 2004). Совершенно противоположные данные получены Fothergill J.L. и соавт. (2010), которые показали несопоставимые результаты трех методов (ПЭ, RAPD-ПЦР и BOX-ПЦР), использовавшихся для типирования штаммов P. aeruginosa, изолированных от пациентов с муковисцидозом в двух разных географических регионах. Более того, ни одна из методик не могла отдифференцировать «Ливерпульскую» группу изолятов от других штаммов (Fothergill J.L. et al., 2010). Только применение SNP генотипирования (single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм) позволило решить поставленную задачу (Wiehlmann L. et al., 2007). Все техники, связанные с ПЦР-фингерпринтингом, просты в исполнении, не продолжительны во времени, характеризуются низкой стоимостью и позволяют дифференцировать бактерии на видовом, субвидовом и штаммовом уровне (Wolska K., Szweda P.A., 2012), однако, межлабораторная воспроизводимость этих методов подвергается сомнению. В геноме практически всех бактерий встречаются фрагменты ДНК, состоящие из повторяющихся нуклеотидных последовательностей (тандемных повторов), число которых может знaчительно варьировать. Для MLVA-типирования P. aeruginosa используют анализ 6 тандемных повторов: ms061, ms127, ms077, ms172, ms142 и ms010, описанных Onteniente L. и соавт. (2003). Выявлена эффективность схемы MLVA-типирования, основанная на анализе девяти тандемных повторов у штаммов P. aeruginosa (Turton J.F. et al., 2010). Протестировав 177 изолятов P. aeruginosa, выделенных от пациентов с муковисцидозом и отличавшихся ПЭпрофилем типирования, авторы делают заключение о схожей дискриминирующей способности методов. Создана международная база данных тандемных повторов (http://vntr.csie.ntu.edu.tw) (Chang C.H. et al., 2007), что открывает хорошие возможности для стандартизации метода. 57 Еще более «глобальный» анализ генетического разнообразия микроорганизмов может быть выполнен методом MLST, который ранее предложен для N. meningitidis (Maiden M.C. et al., 1998). MLST – однозначная процедура для характеристики бактериальных изолятов, в которой используются последовательности внутренних фрагментов 6-7 генов, кодирующих основные функциональные белки (Wolska K., Szweda P.A., 2012). В зависимости от вида микроорганизма отобраны различные наборы генов «домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллелей (более 10) и характеризующихся медленным накоплением мутаций. MLST-типирование P. aeruginosa осуществляют в соответствии со стандартным протоколом, определяя нуклеотидные последовательности участков генов acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA и trpE (http://pubmlst.org/paeruginosa/info/primers.shtml) (Curran B. et al., 2004). В результате каждый штамм имеет специфический «аллельный профиль» (или «сиквенс-тип», ST). С помощью MLST-типирования штаммов определяют генетическое родство и эволюционные связи между штаммами, циркулирующими даже в географически отдаленных регионах (Olive M.D., Bean P., 1999). Так, в исследовании, проведенном Эйдельштейном М.В. и соавт. (2012), MLVA типирование 503 исследованных штаммов бактерий P. aeruginosa, продуцирующих МБЛ, в России, Беларуси и Казахстане определило 44 MLVA-типа. Кластерный анализ позволил отнести все, за исключением трех отдельных MLVA-типов, к двум клональным группам (кластерам). Первый доминирующий кластер включал 36 родственных типов и 684 (96,3%) изолятов, определяющих принадлежность к сиквенс-типу 235 (ST235). Второй по размеру кластер объединял 5 MLVA-типов, к которым принадлежали 23 (3,2%) изолята, и был отнесен по результатам MLST к отдельному сиквенс-типу – ST234. Было сделано заключение об эпидемическом распространении клона P. aeruginosa ST235 VIM-2, циркуляция котрого отмечена не только на всей территории России, но и в нескольких городах Беларуси и Казахстана (Эйдельштейн М.В. и соавт., 2012). Метод MLST-типирования был применен при изучении причин длительной циркуляции штаммов P. aeruginosa в отделениях интенсивной терапии ФНЦТО им. акад. В.И. Шумакова (Воронина О.В. и соавт., 2012). MLST показало, что ведущим генотипом является ST235, остальные штаммы с генотипом ST446, ST598, ST966 содержали функциональную платформу интегрона и могли быть потенциальными акцепторами генов, обеспечивающих адаптацию в стационаре. С помощью MLST была пересмотрена теория о панмиксии P. aeruginosa, которая предусматривала доминирование штаммов с частыми рекомбинационными процессами, то есть эволюционно успешных в эпидемиологическом отношении клонов (Denamur E. et al., 1993; Romling U. et al., 1994). Две независимые группы исследователей, проанализировав большие группы штаммов из разных источников – клинические и природные, пришли к заключению, что 58 частота рекомбинаций среди различных штаммов P. aeruginosa была высокой, но не различалась в обеих группах (Kiewitz C., Tümmler B., 2000; Curran B. et al., 2004). 1.3.3.3. Генотипы вирулентности и антибиотикоустойчивости Широкое распространение штаммов P. aeruginosa во внутрибольничной среде вызывает необходимость усовершенствования организации мониторинга за их эпидемиологическим потенциалом. Для быстрой оценки эпидемиологической ситуации целесообразно применение новых методов индикации, позволяющих одновременно обнаружить микроорганизм и охарактеризовать его значимость (определить наличие маркеров патогенности и антибиотикоустойчивости) (Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В., 2000). Оптимальным решением этой задачи является применение мультилокусной ПЦР. Учитывая, что патогенность P. aeruginosa детерминирована, прежде всего, синтезом экзотоксинов, определение этих факторов необходимо для оценки как клинической значимости, так и эпидемиологической опасности. Нужно отметить, что определение продукции экзотоксинов биохимическими методами в условиях бактериологической лаборатории лечебного учреждения трудновыполнимо. Предложены специфические праймеры для детекции toxA, exoТ, exoS, exoU и exoY генов, кодирующих экзотоксин А и белки III типа секреции (Khan A.A., 1994; Feltman H. et al., 2001). Мультиплексная ПЦР к генам белков TTSS (exoТ, exoS, exoU и exoY), разработанная Ajayi T. и соавт. (2003), показала 100%-ую чувствительность и специфичность и используется для быстрого и точного определения присутствия этих генов в клинических изолятах P. aeruginosa. В то же время, по данным Winstanley C. и соавт. (2005), которые применили данную технологию для анализа распределения белков в штаммах, ассоциированных с ульцеративным кератитом, отмечено два ложноотрицательных результата (Winstanley C. et al., 2005). Возможна детекции эластазы Las B (lasB-ген), гемолитической и негемолитической фосфолиапаз С (phlH и phlN), альгината (algD) (Wolska K., Szweda P., 2009). Для анализа «респираторных» изолятов предложено идентифицировать nan1-ген, кодирующий фермент сиалидазу (нейраминидазу), ответствененную за адгезию клеток бактерий в респираторном тракте (Nikbin V.S. et al., 2012). Слабенко Э.В. (2007) предлагает для оценки эпидемиологической опасности нозокомиальных изолятов P. aeruginosa детектировать pilA и pilB (пили), lasA и lasB, exoS и exoY, но полиморфизм геномовариантов (сочетания генов) не позволил осуществить мониторинг за формированием и циркуляцией госпитальных штаммов. Shi H. и соавт. (2012) определили экзотоксин A, пиоцианин, эластазу и белки TTSS как самые существенные детерминанты вирулентности, которые вызывают наибольшее беспокойство. Они разработали универсальную мультиплексную ПЦР для обнаружения пяти генов (toxA, phzM, lasB, exoU и exoS) и одного гена внутреннего контроля ecfX для P. aeruginosa (Shi H. et al., 59 2012). Проверка 214 изолятов P. aeruginosa, выделенных из питьевой воды и окружающей среды, показала, что exoU, exoS, phzM, toxA и lasB гены были обнаружены в 9, 84, 84, 92 и 80% случаев соответственно. На настоящий момент нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и соответствующие праймеры для идентификации наиболее значимых факторов патогенности P. aeruginosa. Среди большого круга проблем, связанных с резистентностью к антибиотикам госпитальной микрофлоры, наиболее значимой является полирезистентность P. aeruginosa, обусловленная поливалентным набором генетических детерминант в составе мобильных генетических элементов (Martinez E. et al., 2012). Для выявления известных бета-лактамаз молекулярные методы диагностического могут метода либо быть с использованы привлечением в качестве дополнительных самостоятельного методов анализа соответствующих ПЦР-продуктов («ПЦР-ПДРФ» – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК, «ПЦР-SSCP» – конформационный анализ одноцепочечных фрагментов ДНК). Предложены амплификационные методы идентификации генов карбапенемаз, принадлежащих к наиболее распространенным группам и имеющих особую значимость для P. aeruginosa (Queenan A.M., Bush K., 2007). Мультилокусная ПЦР по шести генам (bla: KPC, GES, NDM, IMP, VIM и OXA-48), разработанная для бактерий семества Enterobacteriaceae, позволяет детектировать данные ферменты за три часа в одной реакции (Monteiro J. et al., 2012).Учитывая, что в России наиболее распространены МВЛ VIM и IMP типов, разработана отечественная мультиплексная ПЦР для обнаружения фрагментов генов, кодирующих данные ферменты, в классической реакции и ПЦР в режиме реального времени (Шевченко О.В. и соавт., 2007). Разнообразие детерминант резистентности у P. aeruginosa (известно 10 генетических групп только МБЛ) не позволяет одновременно детектировать большое количество генов в мультиплексной ПЦР из-за ограничивающей способности метода. Перспективным методом идентификации как с точки зрения времени получения результата анализа, так и его информативности является метод гибридизационного анализа на ДНКмикрочипах (Уляшова М.М. и соавт., 2010). Заключение по главе. Таким образом, анализ многочисленных данных литературы отечественных и зарубежных авторов свидетельствует о непреходящем интересе к P. аeruginosa специалистов различного профиля во всем мире. Такое неослабевающее внимание связано, с одной стороны, с уникальностью этого микроорганизма, активно проявляющего себя (участвующего в многочисленных процессах) как в окружающей среде, так и в организме человека. С другой стороны – с расширением спектра инвазивных пособий и, как следствие, ИСМП, а также всевозрастающими возможностями микробиологического анализа, дающего зачастую противоречивые, неоднозначные результаты. Масштабность проводимых 60 исследований требует переосмысления накапливаемой информации и регламентации подходов для дальнейших поисков. Наиболее дискутабельным в контексте нозокомиальной синегнойной инфекции остается вопрос о распространенности и особенности колонизации/инфицирования P. аeruginosa пациентов различных возрастных групп, госпитализируемых в многопрофильные, либо специализированные ЛПУ, а также ОРИТ. Стремление проанализировать сложившуюся многолетнюю ситуацию в условиях крупного промышленного города позволило сформулировать одну из задач исследования. Синегнойная палочка не поражает здоровые ткани, но в случае их повреждения или другого снижения защитных функций организма этот возбудитель, не обладающий тропизмом и избирательностью при колонизации биотопов, может вызвать инфекционный процесс практически в любом органе. Очевидно, что патологические состояния, служащие фоном для синегнойной инфекции, разнотипны, и не ясно, что является основным предиктором, или имеет большую значимость: состояние макроорганизма или набор патогенных свойств возбудителя (биологические особенности самого микроорганизма)? Механизмы патогенного действия P. aeruginosa разнообразны и до конца не ясны, но, безусловно, особенности развития и течения инфекционного процесса детерминируются целой группой факторов. Во внешней среде большинство из них не реализуются, но при попадании бактерий во внутреннюю среду организма запускается их активный синтез. Вопрос о своеобразии фенотипов штаммов, которые циркулируют в определенном отделении/стационаре, остается дискутабельным, как и то, какие из факторов могут иметь приоритетное значение в оценке патогенного потенциала штамма, принадлежности его к госпитальному эковару. Фенотипическое сходство большинства нозокомиальных изолятов при использовании рутинных методов их оценки не позволяют составить представление о его потенциальной опасности. Активное изучение Р. aeruginosa показало высокую гетерогенность ее популяции по способности к синтезу факторов патогенности и персистенции. Морфо-биохимические проявления микроорганизмов подчинены влиянию разнообразных причин, расшифровка механизмов действия которых требует углубленных, зачастую пролонгированных во времени исследований. Получаемые при этом количественные показатели обусловлены экспрессией генов, кодирующих токсины и ферменты, в зависимости от параметров среды обитания. В значительной степени на изучаемые характеристики оказывает влияние тот факт, что бактериальные культуры подвергаются многократным пересевам или длительному хранению на искусственных питательных средах. Например, показано, что у клинических изолятов P. aeruginosa после нескольких пересевов ослабевают интенсивность синтеза пигментов и гемолитические свойства (Аветисян Л.Р. и соавт., 2009). Подобные эффекты могут повлиять на оценку результатов комплексных исследований при мониторинге нозокомиальных штаммов. Исследование по изменению 61 биологических свойств культур P. aeruginosa при многократных пересевах и длительном хранении на искусственных питательных средах может показать и адаптационные возможности штаммов, благодаря чему возможна их длительная персистенция в условиях ЛПУ. В настоящее время существует необходимость экспрессной, экономичной оценки и дифференцировки большого числа штаммов P. aeruginosa, изолируемых в ЛПУ. Однако традиционные микробиологические методы выявления отдельных свойств этих бактерий не позволяют составить целостного представления о патогенном потенциале P. aeruginosa, что обусловлено, в том числе, известными в биологии эффектами взаимовлияния токсических веществ при их совместном действии. На современном этапе в биомедицинских исследованиях и клинической медицине широко используются методики на основе биолюминесцентной реакции (Simon L. et al., 2001). Высокая чувствительность и быстрый ответ на действие различных агентов делают их эффективным инструментом для оценки большого числа ингибиторов биологической активности. Рекомбинантные штаммы E. coli с генами свечения значительно расширяют сферу использования биолюминесценции в медицине и могут решать задачи скринингового анализа (Данилов В.С. и соавт., 2002; Дерябин Д.Г., 2009). Однако данные о применении биолюминесценции как показателя токсигенности P. aeruginosa отсутствуют. В литературе нет исчерпывающей информации о частоте и роли многокомпонентных ассоциаций с P. aeruginosa при различных инфекционных процессах. Межбактериальные взаимодействия, как один из механизмов формирования ассоциаций микроорганизмов при микст-инфекциях и изменения биологических свойств представителей условно патогенных бактерий с учетом их симбиотических связей, изучены недостаточно. Вместе с тем, данные об изменчивости биологических свойств микробов-ассоциантов могут быть использованы как критерии при диагностике инфекционного процесса и оценке результатов клиниколабораторного исследования. Недостаточно сведений об особенностях штаммов P. aeruginosa в межбактериальных взаимоотношениях с ассоциантами как в планктонной, так и в сессильной форме. Большая часть исследований in vitro обсуждает процессы в смешанной культуре, либо в планктоне, либо в биопленке. Если изучается планктон и биопленка вместе, то только в монокультуре. Отдельные исследования посвящены влиянию экзометаболитов P. aeruginosa на рост и формирование биопленки ряда микроорганизмов. В настоящее время в литературе отсутствует информация и о смешанной культуре P. aeruginosa с различной господствующей/предоминантной формой существования (планктонной или биопленочной) в планктоне и биопленке, тогда как, преимущественный фенотип может влиять на физиологическую адаптацию микроорганизмов в природных многовидовых сообществах, в том числе с симбиотическим представителем энтеробактерий E. coli. Для оценки антагонистических 62 свойств экзометаболитов используют подход, основанный на их способности ингибировать биолюминесценцию бактерий-мишеней (Simon L. et al., 2001; Zrimec M.B. et al., 2004). Включение полного люкс-оперона в E.coli позволяет оценить по биолюминесценции бактериальную метаболическую активность одного из членов ассоциации в смешанной культуре. Однако антибактериальное воздействие экзометаболитов P. aeruginosa планктонные и сессильные формы типичного комменсала и ассоцианта на E. coli по биолюминесценции не изучалось. Внедрение в практику метода ПЦР существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой в России до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах. Широкое распространение штаммов P. aeruginosa во внутрибольничной среде вызывает необходимость усовершенствования организации мониторинга за циркуляцией штаммов во внутрибольничной среде. Регламентированные диагностические методы не всегда обеспечивают краткосрочные и точные данные для выявления, типирования и характеристики патогенного потенциала P. aeruginosa, что требует оценки современных экспрессных тестов, способных обеспечить в ЛПУ эффективный контроль. В отечественной и зарубежной литературе предложены мультиплексные тест-системы, но они обслуживают определенные задачи: либо идентификации, либо оценку антибиотикоустойчивости, или вирулентности. Необходимо применить мультиплексные ПЦР-тест-системы для проведения экспресс-анализа идентификации P. aeruginosa с их одновременной характеристикой по признакам эпидемиологической значимости. Использование живых моделей для изучения развития бактерий в смешанной культуре показывает, что микст-инфекция протекает более тяжело (по уровню летальности хозяина), чем моноинфекция. Этот феномен связывают с увеличением конкуренции за ресурсы хозяина и межвидовыми взаимодействиями, которые изменяют продукцию токсинов и других факторов патогенности ассоциантами, приводя к непредсказуемым эффектам воздействия на иммунную систему. Таким образом, особый интерес представляют: 1) анализ в динамике частоты и особенностей инфицирования пациентов стационаров различного профиля во взрослой и педиатрической медицинской сети, роль P. аeruginosa в микробных ассоциациях; 2) оценка клинической целесообразности использования молекулярных методов диагностики (идентификации, антибиотикорезистентности, цитотоксичности) нозокомиальных штаммов P. aeruginosa и диагностической значимости методов генотипирования; 3) определение основных маркеров вирулентности с детальным анализом клинически наиболее значимых признаков (гемолитической активности и пленкообразующей способности) 4) определение 63 стратегии выживания для P. aeruginosa в смешанной культуре с учетом ее предоминантной формы существования, поскольку популяции клинических эковаров характеризуются выраженной гетерогенностью; 5) изучение полимикробных ассоциаций и их взаимоотношений с механизмами врожденного иммунитета. Ответы на эти вопросы позволят обосновать референтный набор критериев, позволяющих оценить патогенный потенциал P. aeruginosa, а также выбор адекватного и доступного методического обеспечения для проведения исследований по идентификации и определению родства изолятов в условиях стационара. Более того, послужат пониманию проблемы эволюции бактерий с учетом адаптивной изменчивости, поведения убиквитарных бактерий в разных экологических нишах, в том числе в смешанных полимикробных сообществах, системах. механизмов сохранения/выживания P. аeruginosa в многокомпонентных 64 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена в период с 2006 по 2014 гг. на базе кафедры микробиологии и вирусологии с курсом КЛД ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ и в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН ИЭГМ УрО РАН. Дизайн исследования схематично представлен на Рисунке. 3. Дизайн исследования Взрослая клиника Педиатрия Акушерство ХИРУРГИЯ ТЕРАПИЯ (ОРИТ/«неОРИТ», ожоговое отделение) - Инфицированность пациентов -Доля в спектре микробных культур -Участие в ассоциациях -Антибиотикоустойчивость ОЦЕНКА ОСОБЕННОСТЕЙ ЦИРКУЛЯЦИИ Динамика анализируемых параметров при хранении и изменении температурного режима Ретроспективный анализ данных учетноотчетной документации бактериологической референслаборатории на базе МУЗ ГКБ №7 за период 2006-12 гг.; бак. лаборатории ООО «ПРО-МЕД» на базе ГКБ №4 за период с 2010-2012 гг., бак. лаборатории на базе ГАУЗ ПК ГКБ №21 г. Перми за 2011-12 гг. Изучение биологических свойств нозокомиальных штаммов P. aeruginosa Гидрофобность Адгезивность Биопленкообразующая способность Гемолитическая активность Пигментообразование Фосфолипазная активность Антагонистическая активность Цитотоксичность Характеристика симбиотических/ антагонистических взаимоотношений P. aeruginosа и клинически значимых УПМ в планктоне и биопленке ОЦЕНКА ПАТОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ В: Идентификации/детекции Типировании Генотипической характеристике изолятов - распространенность оксациллиназ с БЛРС-фенотипом - rep-ПЦР - поиск и изучение генов, кодирующих МБЛ - SLST blaOXA50 - генетические профили цитотоксичности ОЦЕНКА КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ Рисунок 3. Дизайн исследования. 2.1. Анализ медицинской документации Изучены показатели медицинской документации бактериологической референс- лаборатории, созданной на базе ГБУЗ ПК «Городская клиническая больница №7» г. Перми (ГКБ №7), осуществлявшей мониторинг микроорганизмов, выделяемых от пациентов в учреждениях родовспоможения, стационаров хирургического и терапевтического профиля за период с января 2006 г. по декабрь 2010 г. Рассмотрены и проанализированы данные по акушерским стационарам за период с января 2011 г. по октябрь 2012 г. (ГКБ №7), бактериологической лаборатории ООО «ПРО-МЕД» на базе МУЗ «Городская клиническая 65 больница №4» (ГКБ №4) по хирургическим стационарам за период с июля 2010 г. по июль 2012 г., а также ожогового отделения, работающего на базе ГАУЗ ПК ГКБ №21 г. Перми за 201112 гг. Отбор проб и бактериологические исследования в указанных лабораториях выполнялись согласно Приказу МЗ СССР №535 от 22.04.85 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», Приказу МЗ РФ № 345 от 26.10.1997 «О совершенствовании мероприятий по профилактике внутрибольничных инфекций в акушерских стационарах» и согласно методическим рекомендациям «Алгоритм отбора проб клинического материала для бактериологического исследования с целью идентификации возбудителей гнойно-септических инфекций» г. Перми, 2006 г. (при мониторинге колонизации новорожденных). Всего обобщены результаты микробиологического анализа 1422578 проб биологического материала за 2006-10 гг. (ЛПУ взрослой и педиатрической сети), а также 9130 проб (хирургические стационары), 9319 проб (акушерские стационары) и 208 проб (ожоговый центр) за 2010-12 гг. Эпидемиологические показатели – среднемноголетний уровень инфицированности, среднегодовой темп ее прироста и темп прироста за 5 лет вычисляли при помощи программы EpiTrend v.1.4.1. Показатель «инфицированность» был использован в связи с тем, что этиологическая значимость P. aeruginosa рассматривалась не во всех случаях. Данные, отражающие структуру циркулирующей микрофлоры, и характер ее чувствительности к антибиотикам проанализированы с помощью программ «Система микробиологического мониторинга «Микроб-2» v.1.25, «Микроб-автомат» и WHONET v.5.3. 2.2. Бактериальные штаммы Объектами для изучения служили клинические штаммы P. aeruginosa, изолированные в период 2008-13 гг. из различных ЛПУ г. Екатеринбурга (n=41), г. Москвы (n=33) и Пермского края (n=296), в том числе: в МУЗ «Городская клиническая больница №4» (ГКБ №4), МУЗ «Городская клиническая больница №6» (ГКБ №6), ГБУЗ «Ордена «Знак Почета» Пермская краевая клиническая больница» (ККБ), ФБУЗ «Федеральный центр сердечно-сосудистой хирургии» Минздрава РФ (ИС), ГБУЗ ПК «Пермская краевая больница №3 "Центр диализа"» («Центр диализа»), МУЗ «Центральная районная больница» Пермского муниципального района, с. Лобаново (ЛКБ), Родильный дом ГБУЗ «МСЧ №9 им. М.А. Тверье» (РД), ГБУЗ «Детская клиническая больница №13» (ДКБ №13), ГБУЗ ПК «Пермская краевая детская клиническая больница №15» (ДКБ №15), ГБУЗ ПК «Городская детская клиническая больница № 15» (ГДКБ №15), ГУЗ «Пермский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ» (Центр СПИДа), МБУЗ «Городская больница №1 имени академика Вагнера Евгения 66 Антоновича» г. Березники (БЦГБ), МБУЗ «Кунгурская центральная городская больница» (КЦГБ), МБУЗ «Чайковская центральная городская больница» (ЧЦГБ). Все штаммы, изолированные в стационарах, в последующем обозначались нами как нозокомиальные или внутрибольничные. Референтные штаммы P. aeruginosa АТСС®27853, Escherichia coli АТСС®25922, E. сoli АТСС®35218, Klebsiella pneumonia АТСС®700603, Staphylococcus aureus АТСС®25923, Enterococcus faecalis АТСС®29212 получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им Л.А. Тарасевича (сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, г. Москва). Рекомбинантный биолюминесцентный штамм E. coli K12 TG1 lux+ (с полным luxрегулоном Vibrio fischeri, pF1 lux+ Apr) получен из коллекции Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (Данилов В.С. и соавт., 2000). Штамм P. aeruginosa 565, полученный из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии (г. Смоленск), использовали в качестве положительного контроля для детекции генов МБЛ VIM-группы. Лабораторный штамм Pseudomonas fluorescens C32 использовали в качестве отрицательного контроля в молекулярно-генетических исследованиях. Для идентификации и реидентификации бактерий использовали бактериологический и молекулярно-генетические методы исследования. Культуральный метод осуществляли согласно «Методическим рекомендациям по определению грамотрицательных потенциально-патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций» МЗ РСФСР от 03.06.1986 г., в том числе, с использованием коммерческой тест-системы «НефермТест24» (Эрба Лахема, Чешская Республика) в соответствии с инструкцией производителя. Видовая принадлежность клинических изолятов была подтверждена ПЦР-анализом генов 16S рРНК в соответствии с методом, описанным Spilker T. и соавт. (2004). 2.3. Среды и условия культивирования Ацетамидный агар (г/л): ацетамид – 10,0; натрия хлорид – 5,0; калия гидрофосфат – 1,39; калия дигидрофосфат – 0,73; магния сульфат – 0,5; феноловый красный – 0,012; агар-агар – 15,0; pH 6,9±0,2. Агар Мак-Конки, «DIFCO» (г/л): пептон из казеина – 17,0; мясной пептон – 3,0; лактоза – 10,0; соли желчных кислот – 1,5; натрия хлорид – 5,0; нейтральный красный – 0,03; кристаллический фиолетовый – 0,001; агар-агар – 13,5; pH 7,2±0,2. Кинг А, «Tech» (г/л): панкреатический перевар животной ткани – 20,0; магния хлорид – 1,4; калий сернокислый – 10,0; агар-агар – 15,0; глицерол – 10 мл; pH 7,2±0,2. Цетримидный агар готовили на основе среды КингА с добавлением цетримида – 0,3 г/л. 67 Кинг В, «Flo» (г/л): протеозопептон – 20; калий фосфорнокислый двузамещенный безводный – 1,5; магния сульфат – 1,5; агар-агар – 15,0; глицерол – 10 мл; pH 7,2±0,2. Среды готовили по инструкции фирмы-изготовителя. Среда АГВ (г/л): панкреатический гидролизат кильки – 25,0; натрия хлорид – 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный – 1,0; крахмал – 0,5; агар-агар – 13,5; pH 7,4±0,2. Луриа-Бертани (LB) бульон/агар, «Sigma» (г/л): триптон – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; натрия хлорид – 10,0; агар-агар – 15,0; pH 7,0±0,2. Фосфатно-буферная среда (ФБС): 0,1 М KH2PO4 – 19,2 мл; 0,1 М Na2HPO4 – 80,8 мл; дистиллированная вода – до 1 л; pH 7,2±0,2. Для выделения и контроля чистоты P. aeruginosa были использованы цетримидный и ацетамидный агар (инструкция APHA по исследованию воды, 1995, Washington, DC), рекомендованные для выделения и дифференцировки данных микроорганизмов в клинической практике и при исследовании объектов окружающей среды. Выращивание культур P. aeruginosa проводили в LB-бульоне, для культуры E. coli K12 TG1 в среду было внесено 50 мкг/мл ампициллина. Хранение чистых культур осуществляли во флаконах на скошенном LBагаре под вазелиновым маслом при -4ºC. 2.4. Молекулярно-генетические исследования Выделение тотальной ДНК чистых культур. ДНК выделяли по методике, описанной Stone G.G. и соавт. (1994): отдельную колонию каждого штамма ресуспендировали в 0,5 мл сверхчистой воды в пробирках типа «Эппендорф», инкубировали в твердотельном термостате «Термит» (Россия) в течение 10 мин при 98ºC, охлаждали и центрифугировали 5 мин при 13000 об./мин. Надосадочную жидкость использовали для генетических исследований немедленно или после хранения при -18ºС. Смывы и пробоподготовка для ПЦР-анализа. В первом варианте смывы получали стерильным ватным тампоном или марлевыми салфетками размером 5х5 см, для увлажнения которых использовали физиологический раствор. При контроле предметов с большой поверхностью смывы забирали в нескольких местах исследуемого предмета площадью в 100200 см2, при контроле мелких предметов – всего предмета. Тампоны и салфетки помещали во флакон с 100 мл физиологического стерильного раствора. После посева проб на бульонные и агаризованные селективные среды в условиях ламинарного бокса с жестким соблюдением правил асептики и антисептики проводили осаждение бактерий на стерильных нитроцеллюлозных бактериальных фильтрах с фильтрующей поверхностью 25 мм и диаметром пор 0,22 мкм, используя фильтровальную установку с разрежением 150 мм рт.ст. Каждый образец смывов (100 мл) фильтровали через один фильтр. Далее фильтры стерильно 68 переносили в пробирки «Эппендорф» с 1 мл сверхчистой воды, предварительно измельчив их стерильным скальпелем. Пробирки с фильтрами прогревали 10 мин при температуре 98ºC в твердотельном термостате «Термит», центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об./мин, супернатант переносили в другую пробирку. Для концентрирования ДНК осаждали изопропанолом (1:1), центрифугировали 10 мин при 13000 об./мин, удаляли супернатант, подсушивали, осадок растворяли в 25 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТА) и использовали для генетических исследований. Хранение образцов осуществляли при температуре -18ºC. Во втором варианте пробы отбирали стерильными ватными палочками, помещали в 1 мл сверхчистой воды в пробирки «Эппендорф». Тотальную ДНК выделяли с помощью набора реагентов для выделения ДНК из объектов окружающей среды на магнитных частицах «Мсорб-ООМ» - OOM-502 («Синтол», г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Условия проведения амплификации и обнаружения ПЦР-продуктов. Амплификацию осуществляли на термоциклере Termocycler T3 (Biometra, Германия) или DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США) с применением термостабильных ДНК-полимераз (Taq- и Tth-полимеразы) производства ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Синтол» (г. Москва). Для обнаружения ПЦР-продуктов использовали электрофорез в горизонтальном агарозном геле при напряженности электрического поля 6 В/см при комнатной температуре. Применяли трис-боратный буфер (89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, рН 8,0) и 1-1,2% агарозные гели («Helicon», Россия). Для нанесения проб использовали буфер, содержащий 0,25% бромфенолового синего и 30% глицерина в сверхчистой воде. Агарозные гели окрашивали раствором бромистого этидия (1-2 мкг/мл) в течение 10-15 мин. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze («Biometra», Германия) или Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). В качестве метчиков использовали ДНК-маркеры: 100 bp (1 т.п.н.), 100 bp+1,5 Kb, 100 bp+3 Kb («СибЭнзим», Россия), а также маркер молекулярных масс pUC19 ДНК/MspI («Силекс», Россия) и O’GeneRulerTM 100bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва). 2.4.1. Идентификация/детекция бактерий Детекцию/идентификацию проводили путем ПЦР с использованием родо- (Ps-for/Ps-rev) и видоспецифичных (PA-SS-F/PA-SS-R; exoA2-F/exoA2-R) праймеров, а также универсальных праймеров к 16S рРНК (515F/1391R) (Таблица 2-А). Протоколы амплификации соответствовали рекомендациям авторов, предложивших используемые праймеры (Таблица 2-Б). 69 Таблица 2 Праймеры (А), использованные для идентификации, и режимы (Б) амплификации Выявляемый вид, последовательность Pseudomonas spр. P. aeruginosa Праймер Ps-for 5′-ggtctgagaggatgatcagt Ps-rev 5′-ttagctccacctcgcggc PA-SS-F 5′-gggggatcttcggacctca PA-SS-R 5′-tccttagagtgcccacccg 16S рРНК универс. 515F Экзотоксин A А Нуклеотидная последовательность Размер Лит. источник фрагмента, п.н. 5′-gtgccagcmgccgcggtaa 1391R 5′-gacgggcggtgwgtrca exoA2-F 5′-gacaacgccctcagcatcaccagc exoA2-R 5′-cgctggcccattcgctccagcgct 969 Widmer F. et al., 1998 956 Spilker T. et al., 2004 876* Baker G.C. et al., 2003 396 Khan A.A., Cerniglia C.E., 1994 Б Праймеры Ps-for/Ps-rev Режим амплификации начальный цикл денатурации: 95ºС – 5 мин 40 циклов: 94ºС – 30 сек, 65ºС – 60 сек, 72ºС – 70 сек завершающий цикл: 72ºС – 10 мин PA-SS-F/PA-SS-R начальный цикл денатурации: 95ºC – 2 мин 35 циклов: 94ºC – 20 сек, 58ºC – 20 сек, 72ºC – 40 сек завершающий цикл: 72ºC – 1 мин 515F/1391R начальный цикл денатурации: 95ºC – 2 мин 35 циклов: 94ºC – 20 сек, 56ºС – 40 сек, 72ºC – 40 сек завершающий цикл: 72ºC –1 мин exoA2-F/exoA2-R начальный цикл денатурации: 95ºC – 2 мин 30 циклов: 94ºC – 30 сек, 60ºC – 30 сек, 72ºC – 30 сек завершающий цикл: 72ºC – 5 мин Примечание: * – проводили секвенирование ПЦР-продукта. 2.4.2. Генетическая детерминация эффекторов TTSS Присутствие генов, кодирующих эффекторы III типа секреции, определяли с праймерами для генов exoS и exoU (Таблица 3). Режим ПЦР для ExoU-F/ExoU-R включал: 94ºС – 2 мин; далее 25 циклов: 94ºС – 30 сек, 52ºС – 30 сек, 72ºС – 40 сек; завершающий шаг 72ºС – 5 мин. Амплификацию с праймерами ExoS-F/ExoS-R проводили следующим образом: 94ºС – 3 мин; далее 30 циклов: 94ºС – 30 сек, 55ºС – 30 сек (60ºС для ExoS_s-F/ExoS_s-R), 72ºС – 1 мин; 70 завершающий шаг 72ºС – 5 мин. Таблица 3 Праймеры, использованные для детекции эффекторов TTSS Выявляемая последовательность Праймер ExoU ExoU-F 5′-gatcttatttcgctgctcga ExoU-R 5′-ccttctggcgaaaagccac ExoS-F 5′- tcaggtacccggcattcactacgcgg ExoS-R 5′- tcactgcaggttcgtgacgtctttctttta ExoS_s-F 5′-ggcccaggatcggcttgcaa ExoS_s-R 5′-gatccgctgccgagccaaga ExoS ExoS_s Нуклеотидная последовательность Размер Лит. источник фрагмента, п.н. 1038* Hauser A.R. et al., 1998 565 Feltman H. et al., 2001 1800 Dacheux D. et al., 2000 Примечание: * – проводили секвенирование ПЦР-продукта. 2.4.3. Определение детерминант антибиотикоустойчивости Методом ПЦР проводили скрининг генов металло-бета-лактамаз. Для амплификации внутренней «консервативной» последовательности генов ферментов групп VIM и IMP были использованы праймеры, предложенные Tsakris A. и соавт. (2000) и Шевченко О.В. и соавт. (2007) соответственно (Таблица 4). Протокол реакции включал: 95ºС – 15 мин; далее 30 циклов: 95ºС – 15 сек, 50ºС – 15 сек, 72ºС – 15 сек; завершающий шаг 72ºС – 2 мин. Для детекции blaVIM-2-гена применяли праймеры, синтезированные согласно Poirel L. и соавт. (2000), для blaIMP-гена и blaSPM-1-гена – Shibata N. и соавт. (2003), для blaGIM-1-гена – Castanheira M. и соавт. (2004). ПЦР для всех видов праймеров проводили, как описано у Черкашина Е.А. и соавт. (2006): 95ºС – 2 мин; далее 30 циклов: 95ºС – 2 мин, 53ºС – 1 мин, 72ºС – 2 мин; завершающий шаг 72ºС – 10 мин. Наличие интегронов 1-го класса у МБЛ-положительных изолятов проверяли c помощью праймеров INT-F/INT-R, комплементарных «интегразной» последовательности (intI1) (Gutierrez O. et al., 2007) и праймеров 5'CS/3'CS, комплементарных консервативным сегментам интегрона (Levesque C. et al., 1995). Протокол реакции для 5'CS/3'CS был следующим: 94ºС – 30 сек; далее 25 циклов: 94ºС – 30 сек, 50ºС – 20 сек, 72ºС – 1,5 мин; завершающий шаг 72ºС – 5 мин. Для амплификации гена blaOXA-50 были использованы праймеры A/AS, предложенные Girlich D. и соавт. (2004), для blaOXA10 – праймеры ABD1/ABD4 (Danel F. et al., 1995). Режим ПЦР для A/AS включал: 94ºС – 2 мин; далее 25 циклов: 94ºС – 20 сек, 60ºС – 30 сек, 72ºС – 1 мин; завершающий шаг 72ºС – 6 мин. Амплификацию с праймерами ABD1/ABD4 проводили следующим образом: 95ºС – 5 мин; далее 30 циклов: 95ºС – 1 мин, 55ºС – 1 мин, 72ºС – 1 мин; завершающий шаг 72ºС – 5 мин. 71 Таблица 4 Праймеры для ПЦР-анализа генов МБЛ, оксациллиназ и интегронов I класса Выявляемая последовательность Интегрон Праймер Нуклеотидная последовательность 5’CS 5′-ggcatccaagcagcaag 3’CS 5′-aagcagacttgacctga INT-F 5′-ctctcactagtgaggggc INT-R 5′-atgaaaaccgccactgcg VIMcons VIM-1F 5′-agtggtgagtatccgacag (консервативная область группы) VIM-1R 5′-atgaaagtgcgtggagac VIM-2 VIM-2F 5′-atgttcaaacttttgagtagtaag VIM-2R 5′-ctactcaacgactgagcg IMP1-F 5′-accgcagcagagtctttgcc IMP1-R 5′-acaaccagttttgccttacc Интеграза IMP IMPcons Размер Лит. источник фрагмента, п.н. -* Levesque C. et al., 1995 1010 Gutierrez O. et al., 2007 261* Tsakris A. et al., 2000 801* Poirel L. et al., 2000 587 1996 196 Шевченко О.В. и соавт., 2007 786 Shibata N. et al., 2003 748 Castanheira M. et al., 2004 869* Girlich D. et al., IMPсons-F 5′-gctaaagatactgaaaaattagt IMPсons-R 5′-tcatttgttaattcagatgcata SPM-1 GIM-1 OXA-50 OXA-10 и производные SPM-1F 5′-gcgttttgtttgttgctc SPM-1R 5′-ttggggatgtgagactac GIM-1F 5′-agaaccttgaccgaacgcag GIM-1R 5′-actcatgactcctcacgagg A 5′-aatccggcgctcatссatс AS 5′-ggtсggcgaсtgaggсgg его ABD1 5′- tatcgcgtgtctttcgagta ABD4 5′- ttagccaccaatgatgccc Senda K. et al., 2004 775* Danel F. et al., 1995 Примечание: * – проводили секвенирование ПЦР-продукта. ПЦР-ПДРФ. Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов ДНК blaVIM-2гена проводили с помощью эндонуклеазы HindII. Брали 5 мкл ПЦР-продукта, обрабатывали 1 ед. рестриктазы (Fermentas, Литва) с использованием рекомендуемого буфера и при соответствующем температурном режиме (37ºС, 90 мин). Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции проводили в 3% агарозе при напряженности электрического поля 4 В/см – 40 мин, затем 8 В/см 120 мин при комнатной температуре. 2.4.4. Проведение секвенирующей реакции Секвенирование генов (16S рРНК, exoS, exoU, blaOXA-10 и blaOXA-50) проводили с праймерами, используемыми в ПЦР, с применением набора реактивов SEQ Dye Terminator 72 Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Температурный режим секвенирующей реакции: 95ºС – 1 мин; 95ºС – 10 сек, 50ºС – 10 сек, 60ºС – 4 мин; 25 циклов. Полученные последовательности идентифицировали с помощью программы BLAST и базы данных GenBank/EMBL/DDBJ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Далее их анализировали с использованием программ CLUSTAL X v.1.83 (Thompson J.D. et al., 1994), TREECON version 1.3b (Van de Peer Y., DeWachter R., 1994). Анализ первичной структуры белков осуществляли с помощью программы Vector NTI 10 (http://www.catalog.invitrogen.com). Поиск гомологичных последовательностей выполняли с использованием программ BLAST. Выравнивание аминокислотных последовательностей проведено с помощью программы CLUSTAL X v.1.83. Нуклеотидные последовательности гена blaVIM-2 и «внутреннего» фрагмента генов blaVIM устанавливали с помощью набора реактивов DYEnamic ET Dye Terminator Cycle sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 (JSC GE “Healthcare”, США) согласно рекомендациям производителя. 2.4.5. Методы генетического типирования Генетическое типирование штаммов осуществляли посредством RAPD-ПЦР с праймером М13 (5'-GAGGGTGGCGGTTCT), и rep-ПЦР с праймерами ERIC1R/ERIC2 (5'CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA/5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG) и BOXA1R (5'- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG) (Huey B., Hall J., 1989; Versalovic J. et al., 1991; Wolska K. et al., 2011). Амплификацию проводили на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США). Режим амплификации для RAPD-ПЦР включал: начальный цикл денатурации при 94ºС – 1 мин; 35 циклов по схеме: денатурация 94ºС – 20 сек; отжиг 45ºС – 60 сек; синтез 72ºС – 60 сек; завершающий цикл 5 мин при 72ºС; для rep-ПЦР – начальный цикл денатурации – 5 мин при 94ºС; 35 циклов по схеме: денатурация 94ºС – 1 мин; отжиг 48ºС – 2 мин; синтез 72ºC – 2 мин; завершающий цикл 72ºC – 5 мин. При подборе оптимальной температуры отжига для всех типов праймеров температурный градиент составил 45-60ºC, шаг – 1ºC. Режим амплификации: начальный цикл денатурации при 94ºС – 1 мин; 30 циклов по схеме: денатурация 94ºС – 20 сек; отжиг 45-60ºС – 20 сек; синтез 72ºС – 60 сек; завершающий цикл 72ºС – 5 мин. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с помощью системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Дендрограммы филогенетического родства штаммов построены с применением компьютерного обеспечения Quantity One (версия 4.6.1, Bio-Rad Laboratories, США; № лицензии BRQ 1A10276). Для численной оценки дискриминирующей способности методов типирования использовали индекс разнообразия Симпсона (D) согласно Hunter P.R. и соавт. (1988): 73 где N – количество штаммов (выборка), s – количество геномогрупп, nj – количество штаммов, отнесенных к j-той геномогруппе. Индекс Симпсона (коэффициент дискриминации) основан на вероятности того, что два неродственных штамма из выборки будут относиться к разным геномогруппам. 2.5. Фенотипические методы определения факторов патогенности 2.5.1. Определение степени гидрофобности поверхности бактериальных клеток (BATHтест) Гидрофобность поверхности бактериальных клеток оценивали по их относительному распределению между водной фазой и фазой органического растворителя гексадекана (Rosenberg M. et al., 1980). Для этого отбирали аликвоты культур P. aeruginosa в стационарной фазе, выращенных на LB-бульоне, бактериальные клeтки осаждали при 8 тыс. об./мин, дважды промывали в 0,01М ФБС и стандартизовали до ОП600=0,150-0,200. К 3,0 мл суспeнзии клeток, тeрмостатированной при 35ºС, добавляли гeксадeкан (0,5 мл; 1 мл), интeнсивно встряхивали в тeчeниe 1 мин, затeм снова тeрмостатировали в тeчeниe 15 мин при 35ºС и рeгистрировали измeнeниe оптичeской плотности в водной фазe при 590 нм. Срeднee значeниe относитeльного измeнeния (в %) ОП клeточной суспeнзии в водной фазe по сравнeнию с ee пeрвоначальной вeличиной служило мeрой гидрофобности бактeриальных клeток. Расчeт осущeствляли по формулe: % гидрофобности (Г) = (Ас–Aг)/Ас×100, гдe Ас – ОП590 суспeнзии до обработки гeксадeканом, Aг – ОП590 суспeнзии послe обработки гeксадeканом. 2.5.2. Определение адгезивных свойств Определение уровня адгезии бактерий к эритроцитам (специфическая адгезия) осуществляли по методу Брилис В.И. и соавт. (1986). Клеточным субстратом служили формалинизированные эритроциты человека 0(I) группы Rh(+), предварительно дважды отмытые в 0,01М ФБС и стандартизованные до 100 млн./мл. Взвесь микробных клеток, стандартизованную в ФБС до 2,0 по McFarland, и эритроцитов смешивали в равных количествах (0,1 мл) в пробирках «Эппендорф», встряхивали в течение 20 мин при 37ºC и 25ºC, после чего готовили мазки на предметном стекле. Мазки высушивали при комнатной температуре, фиксировали метанолом в течение 10 мин и окрашивали 2% метиленовым синим. Подсчитывали количество микробных клеток, прикрепившихся к 1 эритроциту (не менее 25 эритроцитов). Адгезивные свойства клеток оценивали с помощью индекса адгезивности микроорганизма (ИАМ) – среднее количество бактерий, прикрепившихся к одному эритроциту, участвующему в процессе адгезии (Брилис В.И. и соавт., 1986). Микроорганизмы считали 74 неадгезивными при ИАМ ≤ 1,75, низкоадгезивными − от 1,76 до 2,5, среднеадгезивными – от 2,51 – до 4,0, высокоадгезивными – при ИАМ ≥ 4,0. Определение уровня неспецифической адгезии осуществляли в стеклянных пенициллиновых флаконах (гидрофильная поверхность) согласно Николаеву Ю.А. (2000) и в полистироловых 96-ти луночных плоскодонных планшетах («Медполимер», Россия) (гидрофобная поверхность). Отбирали аликвоты культур P. aeruginosa, выращенных на LBбульоне, бактериальные клетки осаждали при 8000 об./мин, дважды промывали в ФБС, стандартизовали до ОП600=0,150-0,200 и пипетировали во флаконы (3,0) и микропланшеты (0,2). Флаконы и иммунологические планшеты помещали в термостат при 37ºС с перемешиванием 120 об./мин. Под величиной адгезии понимали количество клеток, прилипших на стенки флакона/планшета, выраженное в % от их исходного количества. Показатель адгезии рассчитывали по формуле: А = (ОПнач-ОПмин)/ОПнач×100, где ОПнач и ОПмин – оптическая плотность (ОП600) в момент засева и через 1 час, соответственно (Николаев Ю.А., 2000). 2.5.3. Определение биопленкообразующей способности Биопленкообразование изучали согласно O`Toole G.F. и соавт. (2000). Для получения биопленок использовали полистироловые 96-ти луночные плоскодонные планшеты. В лунки вносили по 0,2 мл бульонной культуры бактерий, предварительно стандартизованной до 2,0 по McFarland и разведенной в LB-бульоне 1:100. Биопленки выращивали статически в термостате при температуре 37ºС в течение 24 часов. Затем содержимое лунок удаляли, промывали двукратно ФБС, высушивали, окрашивали 0,1% водным раствором генцианвиолета (кристаллвиолета) в течение 30 мин. Биомассу биопленки оценивали по уровню экстракции красителя 97º этанолом, который измеряли на микропланшетном ридере Benchmark Plus (BioRad, США) при длине волны 580 нм в единицах оптической плотности (Ед, ОП580) (O`Toole G.F. et al., 2000). Удельное биопленкообразование подсчитывали по отношению биомассы пленки (ОП580) к плотности культуры (ОП600) (Naves P. et al., 2008). Для получения смешанных микробных биопленок готовили смесь из равных количеств двух культур (100 мкл), предварительно стандартизованных до 2,0 по McFarland и разведенных в LB-бульоне 1:100. Контролем служили лунки с монокультурами, в которые добавляли 100 мкл LB-бульона. Формирование биопленки P. aeruginosa в присутствии экзометаболитов УПМ проводили в течение 12 и 24 часов. Ночные культуры УПМ, стандартизованные до 2,0 по стандарту McFarland, количественно засевали в пробирки с бульоном Луриа-Бертани (1,0 мл стандартизованной культуры и 5,0 мл LB-бульона). Экзометаболиты получали стерильно путем центрифугирования 2,0 мл ночных (16 часов) культур УПМ при 13000 об./мин в течение 10 мин 75 на микроцентрифуге «Эппендорф» (Германия) и фильтрованием через мембранные фильтры Millex-MP (0,22 мкм, Nihon Millipore, США). 2.5.4. Определение экзопродуктов Фосфолипазную активность определяли на мясопептонном агаре с добавлением 20% желточной взвеси через 24 ч инкубации культур при 37ºC. Для корректной интерпретации результатов применяли коэффициент, определяемый как отношение диаметра (в мм) зоны радужного венчика к диаметру колонии. Продукцию пиоцианина и пиовердина определяли согласно Deziel E. и соавт. (2001). Штаммы P. aeruginosa с исходным числом клеток 6×108 КОЕ/мл (2,0 по стандарту McFarland) засевали в соотношении 1:4 в LB-бульоне и статически выращивали 18 часов при 37ºС. Экзометаболиты получали стерильно путем центрифугирования 2,0 мл ночной (14-16 часов) культуры P. aeruginosa при 13000 об./мин 10 мин на микроцентрифуге «Эппендорф» (Германия) и фильтрованием через мембранные фильтры Millex-MP (0,22 мкм, Nihon Millipore, США). Содержание пиоцианина в супернатантах оценивали в относительных единицах путем измерения оптической плотности при длине волны 695 нм на многофункциональном микропланшетном ридере Infinite M200 (Tecan, Австрия). Методом спектрофотометрического анализа «чистый» пиоцианин можно детектировать при следующих длинах волн (λ): 312, 375379 и 690-695 нм (Watson D. et al., 1986; Досон Р. и соавт., 1991). При измерении пиоцианина в бесклеточных супернатантах в коротковолновом режиме более выражены шумы, связанные с присутствием других пигментов. Проведенный анализ выявил высокий уровень корреляции показателей при ОП695 и ОП375 (r=0,939; p=0,05), что позволило в ряде экспериментов (в короткие сроки культивирования культур, когда продукция пиоцианина незначительная) использовать λ=375. Уровень продукции пиовердина (f, усл. ед) оценивали путем измерения флюоресценции в супернатантах при длине волны 460 нм (эмиссия) после возбуждения при 400 нм (экстинкция) на микропланшетном ридере Infinite M200 (Tecan, Австрия) (Deziel E. et al., 2001). Результаты представлены в виде общей продукции либо удельной продукции пиоцианина и пиовердина: Пцн/КОЕ, Пвд/КОЕ или Пцн/ОП600, Пвд/ОП600, где КОЕ – количество колониеобразующих единиц, ОП600 – оптическая плотность культуры на момент отбора супернатантов. Количество экзополисахаридов определяли кислотно-фенольным методом согласно Qin и др. (2009). К объему 0,5 мл бесклеточных супернатантов добавляли 0,5 мл 6%-ого фенола, выдерживали в течение 10 мин. Затем вносили концентрированную H2SO4 до 2,5 мл и выдерживали 20 мин. Содержание экзополисахаридов оценивали в относительных единицах путем измерения оптической плотности при длине волны 490 нм. В качестве контроля 76 использовали LB-среду. Для определения количества экзополисахаридов в образце строили калибровочный график, используя результаты измерения контрольных концентраций глюкозы. 2.5.5. Определение гемолитической активности Гемолиз оценивали в двух вариантах: на плотных питательных средах и в суспензии. Эритроциты человека брали от одного донора 0(I) группы Rh(+), бараньи эритроциты получены из Пермского научно-производственного объединения «Биомед» (филиал ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития). Оценку гемолиза проводили на 5% кровяном агаре через 24 часа инкубации культур при 37ºC. Для его корректной интерпретации применяли коэффициент, определяемый как отношение диаметра (в мм) зоны гемолиза к диаметру колонии. Изучение клеточно-ассоциированного гемолиза проводили по Dacheux D. и соавт. (2001). Эритроциты дважды отмывали в ФБС, приготовленной на 0,9% NaCl, и ресуспендировали в этой же среде до конечной концентрации 2% эритроцитов при 4ºC. Суточные культуры бактерий, выращенных на LB-бульоне, центрифугировали при 8000 об./мин и ресуспендировали в ФБС до мутности, эквивалентной 2,0 по стандарту McFarland (6×108 КОЕ/мл). По 1,0 мл суспензии эритроцитов и взвеси бактериальной культуры смешивали в пробирках «Эппендорф», которые затем без центрифугирования либо после центифугирования при 1000 об./мин в течение 10 мин (в параллельных опытах) инкубировали с перемешиванием на вортексе при 100 об./мин при 37ºC и 25ºC в течение 1 часа. После экспозиции пробирки центрифугировали 10 мин при 1000 об./мин и оценивали гемолитическую активность. Гемолитическую активность супернатантов изучали следующим образом. Ночные культуры, стандартизованные до 2,0 по McFarland, количественно засевали в пробирки с LBбульоном (1,0 мл стандартизованной культуры и 5,0 мл LB-бульона). Супернатанты суточных культур, полученные после фильтрования через мембранные фильтры Millex-MP (0,22 мкм, Nihon Millipore, США), смешивали в равных количествах с суспензией эритроцитов. Смесь эритроцитов с нативными супернатантами инкубировали при 37ºC в течение 1 часа. После экспозиции пробирки центрифугировали 10 мин при 1000 об./мин и оценивали гемолитическую активность. Для инактивации термолабильных компонентов бесклеточные супернатанты прогревали на водяной бане при температуре 90ºС в течение 30 мин. После экспозиции 1 ч также проводили количественную оценку гемолитической активности. Выход гемоглобина определяли в 200 мкл супернатантов в лунках 96-луночного полистиролового планшета по оптической плотности (ОП) при 540 нм на спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США). Процент (%) лизиса рассчитывали по формуле (Dacheux D. et al., 2001): 77 X-В % лизиса = –––––×100%, T-В где B – отрицательный контроль (базовый уровень, ОП540 раствора при инкубации эритроцитов с 1,0 мл среды), T – положительный контроль (ОП540 раствора, полученного при лизисе эритроцитов под действием 1,0 мл 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), обеспечивающего максимальный выход гемоглобина), X – ОП540 анализируемого образца. 2.6. Фенотипическая оценка антибиотикоустойчивости При определении антибиотикочувствительности оценку зон ингибирования роста бактерий осуществляли в соответствии с МУК 4.2.1890-04 диско-диффузионным методом. Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) меропенема (от 4 до 512 мкг/мл) проводили в иммунологическом плоскодонном 96-луночном планшете. Для тестирования использовали бактериальную суспензию, соответствующую мутности 0,5 по McFarland. В отдельных лунках готовили контроли роста и стерильности среды. Учет результатов производили на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США) через 24 часа инкубации в условиях термостата (37ºC). Фенотипическую детекцию металло-бета-лактамаз у карбапенеморезистентных культур проводили методом радиальной диффузии с ЭДТА, добавляя 10 мкл 0,5 М ЭДТА в один из дисков с имипенемом (Arakawa Y. et al., 2000). Вывод о наличии карбапенемаз делался на основании разницы между величинами зон задержки роста культуры вокруг дисков. 2.7. Оценка интенсивности биолюминесценции Интенсивность биолюминесценции E. coli lux+ (полный lux-регулон Vibrio fischeri) измеряли в планктонных и пленочных (после удаления планктона и 2-х кратного отмывания лунок) культурах, используя многофункциональный микропланшетный ридер Infinite M200 (Tecan, Австрия). Предварительно планшеты выдерживали 15 мин при комнатной температуре для оптимизации работы люциферазы. Удельную люминесценцию (Iуд) в планктоне оценивали как Iуд=I/ОП600, в пленке Iуд=I/ОП580, где I – интенсивность биолюминесценции, ОП600 – плотность суспензии при 600 нм, ОП580 – биомасса пленки. 2.8. Экстракция АТФ из клеток в составе биопленок и определение концентрации внутриклеточного АТФ Биопленку, выращенную в полистироловом плоскодонном планшете, 2-х кратно отмывали охлажденным 0,89% физиологическим раствором и переносили планшет на лед. В лунки вносили 100 мкл DMSO, выдерживали 15 мин, отбирали по 50 мкл в пробирки 78 «Эппендорф» и замораживали. Концентрацию АТФ определяли, используя стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit (Sigma). Пробы разводили в 10 раз (180 мкл воды на 20 мкл образца). Смешивали 100 мкл образца с 100 мкл реагента, содержащего люциферин и люциферазу светляков (стандартная смесь, разбавленная в 25 раз). Измерение люминесценции проводили на микропланшетном ридере Infinite M200 (Tecan, Австрия). Для определения количества АТФ в образце строили калибровочный график, используя результаты люминесценции контрольных образцов, содержащих известную концентрацию АТФ. 2.9. Экспериментальные процедуры по изучению антагонистической активности P. aeruginosa и оценке ее роли в межвидовых взаимоотношениях 2.9.1. Оценка антагонистической активности супернатантов P. aeruginosa Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали метод отсроченного антагонизма согласно Muriana P. и Klaenhammer T. (1987) с модификацией (Бухарин О.В. и соавт., 2010). Антагонистическую активность штамма выражали как % прироста тест-культуры (E. coli lux+) при её культивировании 3,5 и 5 часов с супернатантами P. aeruginosa, полученными стерильно. Для оценки антагонистической активности при формировании биопленки к 100 мкл тесткультуры УПМ (с концентрацией микробных клеток 6×106 КОЕ/мл) добавляли 100 мкл стерильной культуральной жидкости (цельные экзометаболиты). Контролем служили лунки с монокультурой УПМ, в которые добавляли 100 мкл LB-бульона. Оценивали биомассу биопленки УПМ через 24 часа инкубации. Действие супернатантов P. aeruginosa на сформированную биопленку УПМ оценивали после 24-часового роста в 96-луночной полистироловом планшете, 3х-кратной промывки и последующей экспозиции с ночными цельными супернатантами в течение 2 часов. В контрольные лунки добавляли LB-бульон. Биомассу биопленки определяли вышеописанным способом. 2.9.2. Определение токсичности супернатантов P. aeruginosa Рекомбинантный биолюминесцентный штамм E. coli lux+ (полный lux-регулон Vibrio fischeri) использовали в лиофилизированном виде. Регидратацию проводили охлажденной H2O (1 мл на ампулу) 30 мин при 4оС. Затем взвесь сенсора разводили 0,9% NaCl до рабочего объема и выдерживали 30 мин при 20оС. Штаммы P. aeruginosa с исходным числом клеток 6×108 КОЕ/мл (2,0 по стандарту McFarland) засевали в соотношении 1:4 в LB-бульон и статически выращивали 18 часов при 37оС. Супернатанты получали путем центрифугирования 1-2 мл ночной культуры P. aeruginosa при 13000 об./мин в течение 10 мин на микроцентрифуге «Эппендорф» (Германия). Надосадочную жидкость использовали в анализе немедленно или после замораживания при - 79 18ºС в течение 1 часа. По 50 мкл супернатантов добавляли к 50 мкл сенсора, предварительно разлитого в лунки белого 96-луночного плоскодонного полистиролового планшета. Смесь выдерживали 60 мин при 20оС. Измерения интенсивности биолюминесценции проводили через 15, 30, 45, 60 мин. В ряде экспериментов использовали разведения экзометаболитов в 0,9% NaCl. 2.9.3. Оценка влияния супернатантов P. aeruginosa на планктонные и биопленочные культуры E. coli Для изучения влияния супернатантов P. aeruginosa на рост и пленкообразование E. coli к 100 мкл тест-культуры (с концентрацией микробных клеток 6×108 КОЕ/мл) добавляли 100 мкл стерильной культуральной жидкости (цельные экзометаболиты). Контролем служили лунки с монокультурой E. coli, в которые добавляли 100 мкл LB-бульона. Оптическую плотность культуры (ОП600) измеряли с интервалом в 60 мин. Численность клеток в планктоне определяли через 6, 12 и 24 часа культивирования путем подсчета КОЕ после высева культуры из лунок на среду Мак-Конки с ампициллином 50 мкг/мл. Скорость экспоненциального роста (µ, h-1) вычисляли по формуле (lnxt-lnxo)/(t-to), где xo – начальная плотность бактерий, xt – конечная плотность бактерий в моменты времени to и t. Длительность лаг-фазы (Tl) по формуле tr-(lnxrlnxo)/µ, где xr – плотность культуры на момент времени tr. Интенсивность биолюминесценции в планктонной и биопленочной культуре, биомассу биопленки E. coli оценивали через 6, 12 и 24 часа инкубации. Действие супернатантов P. aeruginosa на сформированную биопленку E. coli оценивали после 24-часового роста в 96-луночном полистироловом планшете, 3-х-кратной промывки и последующей экспозиции с ночными цельными супернатантами в течение 1-3 часов. В контрольные лунки добавляли LB-бульон. Биомассу биопленки определяли вышеописанным способом. 2.9.4. Совместное культивирование P. aeruginosa и E. coli Культивирование проводили статически в 96-луночных полистироловых плоскодонных планшетах при 37ºС в течение 6, 12 и 24 часов. Монокультуру исследуемого штамма засевали в количестве 100 мкл (106 КОЕ/мл) и 100 мкл LB. Смешанная культура представляла смесь из 100 мкл P. aeruginosa (106 КОЕ/мл) и 100 мкл E. coli (106 КОЕ/мл). Бактериальный рост планктона был измерен при OП600. Подсчет КОЕ в планктоне в моно- и смешанных вариантах проводили через 6, 12 и 24 часов культивирования: для P. аeruginosa на ацетамидном агаре, для E. coli на агаре МакКонки с добавлением 50 мкг/мл ампициллина после 10-кратных серийных разведений. Для определения числа КОЕ в биопленке, последнюю дважды отмывали от клеток планктона 0,9% NaCl. После внесения в каждую лунку 100 мкл свежего 0,9% NaCl биомассу биопленки 80 тщательно соскабливали в течение 30 сек с помощью стерильного скальпеля (Bandara H.M.H.N. et al., 2010). Затем содержимое трех лунок для каждого варианта собирали в пробирки «Эппендорф», встряхивали в течение 15 мин, готовили 10-кратные серийные разведения и инокулировали по 20 мкл на селективные среды. Подсчет КОЕ проводили через 24 часа инкубации в условиях термостата, для E. coli проводили контроль светящихся вариантов. Общую и удельную продукцию пиоцианина и пиовердина для P. aeruginosa, биолюминесценцию для E. coli определяли в супернатантах, полученных путем фильтрования, в моно- и смешанных вариантах после 6, 12 и 24 часов инкубации. Биопленкообразование оценивали в те же сроки. Наряду с определением биомассы биопленки определяли концентрацию внутриклеточного АТФ и фиксировали интенсивность биолюминесценции (в вариантах с E. coli). 2.10. Оценка апоптоза, некроза и продукции активных форм кислорода нейтрофилов В работе использовали фракционированные нейтрофилы периферической крови здоровых мужчин в возрасте от 19 до 39 лет (n=8). Клетки выделяли из гепаринизированной (25 МЕ/мл) венозной крови путем центрифугирования (1600 об./мин, 200 g) в двойном градиенте плотности фиколла-урографина (ρ=1,077 и 1,112 г/мл) («Pharmacia», Швеция). Полученную суспензию клеток (1×106 клеток) дважды отмывали раствором Хэнкса и инкубировали при 37ºC в течение 30 и 60 мин с супернатантами суточных бактериальных культур P. aeruginosa, полученных путем центрифугирования и фильтрации как описано выше. Контролем служили пробы, в которых к нейтрофилам добавляли только LB-среду и раствор Хэнкса. После инкубации нейтрофилов с супернатантами P. aeruginosa клетки были дважды отмыты раствором Хэнкса. Жизнеспособность, апоптоз, некроз нейтрофилов оценивали путем окрашивания аннексином V (набор реагентов «ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция) и пропидиум йодидом (PI). Фенотип лейкоцитов определяли методом проточной цитометрии на цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). Метод основан на способности аннексина V, меченого флуоресцеин изотиоцианатом (FITC), связываться с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток при запуске программы апоптоза. Пропидиум йодид, фиксирующий ДНК, позволяет дифференцировать клетки с интактной и проницаемой (поврежденной) мембраной. Количество живых нейтрофилов оценивали как AnV/PI- клетки, с первичным некрозом – AnV-/PI+ клетки, ранним апоптозом – AnV+/PI- клетки (Хайдуков С.В. и соавт., 2011). Лимфоцитарный гейт выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток. Данные каждого показателя даны в процентах. Продукцию внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) нейтрофилов 81 оценивали с использованием 2’,7’-дигидродихлорфлуоресцеин ацетата в течение 90 мин. Замеры проводили каждые 15 мин на мультипланшетном ридере Synergy H1 («BioTec», США) (Loughmana et al., 2011). Результаты представлены в относительных флуоресцентных единицах как процент от максимума флуоресценции, наблюдаемой в ответ на 5 мкМ 4-форбол-12миристат-13-ацетат (ФМА) («Sigma», США). - - + Удельную продукцию АФК рассчитывали с - учетом AnV /PI и AnV /PI клеток после 30 мин контакта. 2.11. Микроскопические методы оценки биопленок (атомно-силовая и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия) Биопленки выращивали в чашках Петри на покровных стеклах (18 × 60 мм), погруженных в LB-бульон, при температуре 37ºС и 22ºС в течение 20 часов. Затем стекла 3-х кратно отмывали в 0,01М ФБС и сушили препарат на воздухе в течение 20 мин. Изучение биопленок проводили с помощью комбинированной системы микроскопирования, состоящей из лазерного конфокального микроскопа Olympus FV1000 (Olympus Corporation, Япония) и атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D (Asylum Research, США) в лаборатории атомно-силовой и конфокальной микроскопии на базе Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского университета. Подсчет и оценку жизнеспособности клеток выполняли на основе полученных конфокальных лазерных сканирующих изображений биопленок после их предварительного окрашивания красителем LIVE/DEAD® (Syto9/пропидиум йодид) BacLightTM Bacterial Viability Kits (Invitrogen, США) и 15 мин инкубирования в темноте. Для возбуждения флуоресценции Syto9 и пропидиум иодида применяли аргоновый (λ=488 нм) и гелий-неоновый (λ=543 нм) лазер, соответственно. Количество жизнеспособных (зеленые) и нежизнеспособных (красные) клеток подсчитывали не менее, чем в пяти полях после нанесения сетки на образец. Профили поверхности биопленок штаммов изучали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Сканирование осуществляли в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS (Asylum Research Inc., США) с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0,5-4,4 Н/м. Толщину биопленки определяли путем построения профиля поверхности на основе АСМ-изображения и послойного сканирования слоев биопленки, предварительно окрашенной с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD. Обработку полученных изображений проводили с помощью программ FV10-ASW (Olympus Corporation) и Igor Pro 6.22A (WaveMetrics). 2.12. Статистические методы Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Office XP Excel и STATISTICA 6.0 82 (Реброва О.Ю., 2006). использованием Вид критериев распределения исследуемых Колмогорова-Смирнова и признаков Шапиро-Уилка. определяли Все с показатели представлены в виде средней арифметической и ее ошибки (M±m). Достоверность отличий определяли по критерию Стьюдента (t). Различая между независимыми группами данных считали достоверными при р≤0,05. В случае, если распределение данных в выборке не могло характеризоваться как нормальное, рассчитывали медиану (Me), квартили [Q1; Q3] и межквартильный размах. Достоверность отличий двух независимых выборок определяли по критерию Манна-Уитни. Если две зависимые выборки были распределены ненормально, то для их сравнения применяли тест Уилкоксона. При p<0,05 делался вывод о наличии статистически значимой разницы между сравниваемыми выборками. Для исследования связи двух признаков в случае их нормального распределения вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (r), статистическая достоверность рассчитывалась при уровне значимости p=0,05. При получении отличного от нормального распределения признаков для исследования связи между ними вычисляли непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R), достоверными считали связи при р<0,05. Силу корреляционной связи оценивали в зависимости от значения коэффициента: |R| ≤ 0,3 – слабая корреляция; 0,3 < |R| < 0,70 – умеренная корреляция; |R| ≥ 0,70 – сильная корреляция. Сравнение качественных признаков выполняли с использованием коэффициента ассоциации (φкритерий) и вычислением χ2. Все программы, которые использовались в данном исследовании, относились к классу свободного/открытого программного обеспечения или были лицензионными. 83 ГЛАВА 3. МОНИТОРИНГ PSEUDOMONAS AERUGINOSA В СТАЦИОНАРАХ РАЗЛИЧНОГО ПРОФИЛЯ ВЗРОСЛОЙ И ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНСКОЙ СЕТИ В ЛПУ различных регионов России и за рубежом регулярно проводится мониторинг распространенности и антибиотикорезистентности возбудителей гнойно-септических инфекций. Результативность обнаружения P. aeruginosa в бактериологических лабораториях колеблется в широких пределах. Такие значительные колебания могут быть связаны, в том числе, с профилизацией стационара и структурой исследуемого клинического материала. 3.1. Инфицированность пациентов и частота встречаемости P. аeruginosa в спектре микробных культур1 В г. Перми за 2006-10 гг. (выборочные исследования) было обследовано 584814 госпитализированных пациентов, из клинического материала которых изолировано 504966 бактериальных и Среднемноголетний грибковых уровень культур, в том инфицированности числе 7922 (1,6%) синегнойной P. aeruginosa. палочкой среди госпитализированных пациентов составил 13,6±1,9 на 1000 обследованных (Таблица 5). Таблица 5 Показатели инфицированности P. aeruginosa разных категорий госпитализированных пациентов в г. Перми за 2006-10 гг. Категория пациентов ЛПУ Количество Количество (n) Выделено В том числе Среднемного- Темп прироста, обследов-х проб (абс.) культур (абс.) P. aeruginosa летний уровень (n) (абс./%) инфицир-сти (на 1000) % Средне- За 5 годовой лет Взрослые 10 301310 769040 287507 4447/1,6 15,0±3,5 0,2 0,8 Дети 5 169981 358076 146855 2610/1,8 15,8±7,5 3,8 16,4 Новорожденные 7 113523 295462 70604 865/1,2 7,9±5,8 -7,0 -21,4 Всего/итого 22 584814 1422578 504966 7922/1,6 13,6±1,9 1,7 6,9 Выравниваниe динамичeского ряда показатeлeй инфицированности выявило общую тенденцию к увеличению со среднегодовым темпом прироста 1,7%. За 5 лет темп прироста данного показателя составил 6,9%. Среднемноголетние показатели уровня инфицированности во взрослых и детских ЛПУ были сопоставимы между собой. В учреждениях родовспоможения их величина была значительно ниже, что, очевидно, обеспечивается более строгим санитарноэпидемиологическим надзором в них. 1 Часть данных получена в соавторстве с ассистентом кафедры микробиологии и вирусологии с курсом КЛД ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ к.б.н. Николаевой Н.В. и опубликована в статье Кузнецова М.В. Pseudomonas aeruginosa в спектре микробных культур, изолируемых от пациентов различных стационаров / М.В. Кузнецова, Т.И. Карпунина, Н.В. Николаева [и др.] // Альманах клинической медицины. – 2012. – №27. С.50-57. 84 Результаты наших наблюдений практически совпали с данными исследований центров по контролю и профилактике болезней США, Европы и Межведомственного научного совета по внутрибольничным инфекциям (Россия), согласно которым частота госпитального инфицирования у новорожденных составляет от 4 до 7% (Телятицкий Н.И., Абаев Ю.К., 2010). Динамика уровня инфицированности в анализируемых группах характеризовалась различными тенденциями: увеличением инфицированности в детских стационарах, стабилизацией ситуации во взрослых ЛПУ и существенным снижением в учреждениях родовспоможения. Среднегодовой темп прироста инфицированности взрослых, детей и новорожденных за 5 лет составил 0,8, 16,4 и -21,4% соответственно. Прослеженная динамика показателей инфицированности новорожденных обусловлена атипичной эпидемиологической ситуацией в 2008 г., когда было выявлено широкое распространение носительства P. aeruginosа среди детей в крупном акушерском стационаре города с последующим распространением в неонатальные отделения детских клиник (второй этап выхаживания новорожденных), осложнившейся формированием госпитального штамма P. aeruginosа (Маркович Н.И., 2011). Структура исследуемого материала, в котором обнаруживалась P. aeruginosа, при обследовании различных контингентов существенно различалась, что связано с особенностями регламентации по отбору проб и спецификой требований, предъявляемых к микробиологическим исследованиям во взрослой, детской и неонатальной клинике (Рисунок 4). Тем не менее, такие биологические среды, как раневое отделяемое и мокрота, сохраняли свою приоритетную значимость в контексте выделения возбудителей и, как следствие, распространения синегнойной инфекции среди всех категорий пациентов (исключая раны новорожденных), оставаясь наиболее актуальным клиническим материалом. При этом установленная доля P. aeruginosa в биопробах, характеризующих раневые и ангиогенные инфекции, согласуется с данными большинства российских и зарубежных исследований, тогда как ее удельный вес в мокроте, моче, секретах слизистых оказался значительно ниже (Рисунок 5-А). Такое распределение, скорее всего, отражает сложившиеся региональные тенденции привлечения лабораторной службы к расшифровке этиологии инфекционных осложнений, а именно – недостаточное использование ее возможностей в общесоматических стационарах города по сравнению с реанимационными и хирургическими отделениями. Так, в структуре микроорганизмов, выделенных только от пациентов хирургических стационаров взрослой сети, роль P. aeruginosa в этиологии нозокомиальных инфекций существенно выше: ее доля в мокроте составила 37,2%, в раневом отделяемом – 11,5%, в моче – 8,3% (Рисунок 5-Б). В связи 85 с этим, представлялось чрезвычайно важным изучить более подробно особенности циркуляции штаммов P. aeruginosa в хирургических стационарах взрослой сети. А Б Рисунок 4. Структура исследуемого материала (%), в котором обнаруживались бактерии P. aeruginosa: А – пациенты взрослой клиники, Б – новорожденные (за 2006-10 гг.). А 86 Б Рисунок 5. Доля культур P. aeruginosa (%) в спектре всех микроорганизмов, изолированных из клинического материала: А – в стационарах различного профиля, Б – в хирургических стационарах взрослой сети. 3.2. Распространенность P. aeruginosа в стационарах хирургического профиля 3.2.1. Частота выделения P. aeruginosа от пациентов, госпитализированных в хирургические стационары различного профиля Если в целом (включая общесоматические отделения) доля синегнойной палочки в спектре нозокомиальных микробных культур, не превышала 2%, то по данным 2010-12 гг., в хирургических стационарах взрослой сети (6 ЛПУ, 20 отделений) бактерии P. aeruginosa были выделены в 10,5% случаев гнойно-септических осложнений (Таблица 6). В «неОРИТ» группе доля синегнойной палочки в спектре всех возбудителей составила 6,7% (Таблица 8). Более высокая частота случаев выделения бактерий P. aeruginosa приходится на отделения экстренной и торакальной хирургии, более низкая – на эндоскопическое и нейрохирургическое отделения (Рисунок 6-А). Оценивая роль изучаемых микроорганизмов в отделениях реанимации, следует отметить, что их доля в ОРИТ существенно выше – 18,1%. Большая значимость синегнойной палочки в реанимационных – 25,3 против 11,5% – в общехирургических отделениях при представлении результатов с учетом количества больных показана в работе Ермолова А.С. и соавт. (2009). Удельный вес P. aeruginosa различался в ОРИТ разных стационаров, а также принимающих больных специализированных отделений в пределах одного стационара (Рисунок 6-Б, 7-А). Разброс данных составил от 11,1% в ГКБ №1 до 26,7% в ПКБ №3 «Центр диализа». 87 Таблица 6 Спектр микроорганизмов, изолированных от пациентов хирургических стационаров (2010-12 гг.) Грамположительные Абс. % Грамотрицательные Абс. % Staphylococcus aureus 802 12,62 Escherichia coli 887 13,96 5 0,08 Klebsiella spp. 674 10,60 Staphylococcus epidermidis 358 5,63 Enterobacter spp. 125 1,97 Staphylococcus haemolyticus 120 1,89 Citrobacter spp. 69 1,08 Другие КОС 109 1,71 Proteus spp. 125 1,97 Стафилококки всего 1394 21,93 41 0,64 Streptococcus pyogenes 46 0,72 Другие виды семейства Enterobactericea Энтеробактерии всего 1921 30,22 Streptococcus agalactiae 57 0,90 P. aeruginosa 666 10,48 Streptococcus pneumoniae 11 0,17 Pseudomonas spp. 33 0,52 Streptococcus spp. (др.) 176 2,77 Acinetobacter baumannii 523 8,23 Стрептококки всего 290 4,56 Acinetobacter spp. 42 0,66 Enterococcus spp. 662 10,42 Другие виды НГОБ 24 0,38 Corynebacterium spp. 350 5,51 Всего НГОБ 1288 20,28 Прочие Грам «+» 25 0,39 Прочие Грам «-» 34 0,52 Грибы рода Candida 392 6,17 6356 100 Другие КПС Всего культур А 88 Б Рисунок 6. Доля штаммов P. aeruginosa в спектре микробных культур, выделенных от пациентов с клиникой ГСИ: А – в «неОРИТ» группе, Б – в ОРИТ. А Б Рисунок 7. Доля штаммов P. aeruginosa в спектре микробных культур, выделенных от пациентов, переведенных в ОРИТ из хирургических (А) и терапевтических (Б) отделений многопрофильного стационара. 89 При сравнении доли штаммов P. aeruginosa в спектре культур, изолированных от пациентов, переведенных в ОРИТ из различных терапевтических и хирургических отделений, значимых различий не выявлено (Рисунок 7-А, Б). Это дало основание предположить, что существенной роли первичное место госпитализации не играет, а инфицирование пациентов и затем распространение штаммов, скорее всего госпитальных, обусловлено их пребыванием в ОРИТ ЛПУ. Роль и место ОРИТ в распространении нозокомиальной синегнойной инфекции.2 Для выявления эпидемиологических связей, оценки роли и места ОРИТ в распространении нозокомиальной синегнойной инфекции в многопрофильном хирургическом стационаре был проведен ретроспективный анализ историй болезни 58 пациентов, находившихся на лечении в многопрофильном хирургическом стационаре в период январь-май 2009 г., инфицированных P. aeruginosa. Установлено, что на определенном этапе стационарного лечения 38 (65,5%) человек из 58 госпитализированных и инфицированных P. aeruginosa являлись пациентами ОРИТ. В 6 случаях P. aeruginosa была выделена от больных до пребывания в ОРИТ, в 16 – после перевода в профилированное отделение, от остальных 16 человек – во время их лечения в ОРИТ. Период пребывания в ОРИТ составлял от 1 до 4 дней, а время от перевода в хирургические отделения из ОРИТ до выделения возбудителя варьировало от 1 до 12 дней. По-видимому, изоляты из других отделений могут иметь «реанимационное» происхождение. Принимая во внимание, что доля пациентов, проходящих через ОРИТ, во всех отделениях достаточно высока (Таблица 7), можно полагать, что колонизация/инфицирование пациентов внутрибольничными штаммами происходит именно в ОРИТ, с последующим распространением по отделениям. Таблица 7 Динамика пребывания пациентов в многопрофильном хирургическом стационаре (данные за 2008 г.) Отделение Число Количество Число Количество Доля пациентов, больных дней пациентов, дней прошедших пребывания в прошедших пребывания в через ОРИТ, % отделении через ОРИТ ОРИТ ОССХ 1165 14-16 250 1 21,5 ТХО 1276 14-16 172 1-6 13,5 ЭХО 1269 9-10 290 1-3 22,9 Примечание: ЭХО – отделение экстренной хирургии, ТХО – торакальное хирургическое отделение, ОССХ – отделение острой сердечно-сосудистой хирургии. 2 Данные получены в соавторстве с ассистентом кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ к.б.н. Николаевой Н.В. и опубликованы в статье Карпунина, Т.И. Эпидемиологические аспекты нозокомиальной синегнойной инфекции в многопрофильном хирургическом стационаре / Т.И. Карпунина, М.В. Кузнецова, Н.В. Николаева, В.А. Демаков // Сибирский медицинский журнал. – 2009. – Т. 24. №4(1). – С. 70-73. 90 P. aeruginosa и неферментирующие грамотрицательные бактерии. В последнее время высказывается мнение, что роль синегнойной палочки как возбудителя внутрибольничных ГСИ снижается, а других видов, относящихся к группе неферментирующих грамотрицательных бактерий, увеличивается. Сравнительный анализ удельного веса НГОБ в микробном спектре культур, изолированных в хирургических стационарах, выявил следующее. Доля НГОБ составила 20,28±0,03% от всех микроорганизмов в целом в хирургии и более 30% в ОРИТ, при этом в «неОРИТ» группе этот показатель был меньше в 2,6 раза (Таблица 8). Таблица 8 Доля различных видов неферментирующих бактерий в спектре микробных культур, изолированных от пациентов хирургических стационаров (2010-12 гг.) Вид микроорганизма Хирургия ОРИТ «неОРИТ» n доля, % n доля, % n доля, % Pseudomonas aeruginosa 666 10,48 382 18,11 284 6,69 Pseudomonas alcaligenes 14 0,22 3 0,14 11 0,26 Pseudomonas putida 7 0,11 1 0,05 6 0,14 Pseudomonas pseudoalcaligenes 6 0,09 0 0,00 6 0,14 Pseudomonas cepacia 5 0,08 2 0,09 3 0,07 Pseudomonas vesicularis 1 0,02 0 0,00 1 0,02 Acinetobacter baumannii 523 8,23 316 14,98 207 4,87 Acinetobacter lwoffii 35 0,55 8 0,38 27 0,64 Acinetobacter calcoaceticus 3 0,05 1 0,05 2 0,05 Acinetobacter haemolyticus 2 0,03 1 0,05 1 0,02 Acinetobacter junii 2 0,03 0 0,00 2 0,05 Alcaligenes faecalis 8 0,13 5 0,24 3 0,07 Stenotrophomonas maltophilia 5 0,08 0 0,00 5 0,12 Burkholderia cepacia 2 0,03 1 0,05 1 0,02 Moraxella catarrhalis 7 0,11 4 0,19 3 0,07 Moraxella sp. 1 0,02 1 0,05 Flavobacterium mizutaii 1 0,02 1 0,05 Всего НГОБ 1288 20,28 726 34,42 562 13,23 Всего культур 6356 2109 4247 P. aeruginosa сохраняет лидирующие позиции в обеих группах: ее удельный вес – 18,11±0,84 и 6,69±0,38% соответственно. Сравнение двух групп («неОРИТ» и ОРИТ) выявило статистически значимые различая в уровне встречаемости и НГОБ, и P. aeruginosa (φ=0,247; 91 p=0,0000 и φ=0,176; p=0,0000 соответственно). Вторым по значимости микроорганизмом был Acinetobacter baumannii. Несмотря на то, что отмечено расширение видового представительства группы НГОБ, в качестве этиопатогенов госпитальных инфекций в хирургии их роль была незначительна: совокупная доля не превышала 2% (кроме P. aeruginosa и A. baumannii). Всего идентифицировано 17 видов (8 родов), в том числе редко встречаемые/описываемые в клинике виды. 3.2.2. Характеристика антибиотикоустойчивости изолятов P. aeruginosа Анализ антибиотикочувствительности изолятов, выделенных за период 2010-12 гг. в ОРИТ и «неОРИТ» 6-ти хирургических стационаров, выявил сходное распределение профилей резистентности штаммов двух групп. Отмечен высокий процент устойчивости «реанимационных» культур P. aeruginosa к гентамицину/амикацину и ципрофлоксацину. Резистентность к ингибитор-защищенным пенициллинам, цефтазидиму, цефепиму, карбапенемам не превышала 30% (Рисунок 8). А Б Рисунок 8. Распределение нозокомиальных штаммов P. aeruginosa по чувствительности к анализируемому спектру АБП: А – ОРИТ, Б – «неОРИТ» группа, *определяли по требованию. 92 Это свидетельствует, с одной стороны, о схожих механизмах формирования антибиотикоустойчивости у P. aeruginosa, но в условиях ОРИТ, где более жесткий селективный «прессинг» АБП на микроорганизмы, его влияние сказывается в наибольшей степени. С другой стороны, регистрация значительной доли чувствительных штаммов может быть связана с инфицированием пациентов внебольничными вариантами P. aeruginosa до их попадания в ОРИТ. Обращает на себя внимание и тот факт, что доля устойчивых к антибиотикам штаммов, выделенных в ОРИТ, несколько ниже, чем по данным многоцентровых Российских и зарубежных исследований. Например, в исследовании «Резорт», проведенном в 34 городах России (2004-06 гг.), устойчивыми к цефтазидиму были 67% «реанимационных» культур (против 25% в г. Перми). Такое «отличие» объясняется, скорее всего, разными системами в оценке учета антибиотикоустойчивости штаммов: в России все медицинские бактериологические лаборатории работают по МУК (2004 г.), тогда как при многоцентровых исследованиях часто используют международные критерии: CLSI, EUCAST и др. Самостоятельный интерес представляет сравнительный анализ антибиотикограмм штаммов P. aeruginosa, выделенных из ОРИТ различных ЛПУ. Несмотря на стандартность схем при лечении синегнойной инфекции в таких отделениях, удельный вес культур, устойчивых к основным «антисинегнойным» антибиотикам, в ОРИТ разных стационаров иногда существенно различался (Рисунок 9). Доля культур, устойчивых к цефтазидиму, варьировала от 18,5% (ГКБ №1) до почти 40% (ГКБ №3). Штаммы, выделенные из ОРИТ ГКБ №3, в наибольшем проценте случаев были устойчивы и к ингибитор-защищенным бета-лактамам. К карбапенемам были чаще чувствительны изоляты P. aeruginosa из ОРИТ МСЧ №9. Если в общехирургических отделениях доля культур, устойчивых к амикацину и ципрофлоксацину, была невысокой, то в ОРИТ всех представленных стационаров она была значительной. Например, в МСЧ №9 такие культуры составили 37,7 и 61,3% соответственно. Кроме того, были проанализированы данные по исследованию 3114 изолятов P. aeruginosa, выделенных в период с июля 2010 по июль 2012 гг. от больных многопрофильного хирургического стационара (ГКБ №4), в том числе из отделения экстренной хирургии (ЭХО) – 796, торакального хирургического отделения (ТХО) – 645, отделения острой сердечно-сосудистой хирургии (ОССХ) – 101, а из отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) – 1572. Во всех отделениях (за исключением ТХО) удельный вес изолятов, нечувствительных к цефтазидиму, одному из основных «антисинегнойных» препаратов, превышал 30% (Рисунок 10). В ЭХО и ОРИТ зафиксирована высокая доля культур, устойчивых к карбапенемам – имипенему и меропенему. Самый высокий процент резистентных штаммов к имипенему (37,6%) и меропенему (32,8%) выявлен в ОРИТ. Сохраняется чувствительность к ингибитор-защищенным цефалоспоринам, но нужно отметить, что растет доля культур с 93 промежуточной устойчивостью к цефоперазону/сульбактаму (особенно в ЭХО и ОРИТ). Удельный вес устойчивых вариантов к гентамицину варьировал от 16,7% в ОССХ до 47,3% в ОРИТ. Доля культур, устойчивых к амикацину, не превышала 20% во всех отделениях, кроме ОРИТ. Сохраняется чувствительность к препаратам фторхинолонового ряда, и в частности, к ципрофлоксацину. Рисунок 9. Распределение штаммов P. aeruginosa, выделенных в ОРИТ различных ЛПУ, по чувствительности к анализируемому спектру АБП: 1 – пиперациллин/тазобактам, 2 – цефоперазон/сульбактам, 3 – цефтазидим, 4 – цефепим, 5 – меропенем, 6 – имипенем, 7 – гентамицин, 8 – амикацин, 9 – ципрофлоксацин. В целом нужно отметить, что в ОРИТ разных ЛПУ доля антибиотикоустойчивых изолятов существенно выше, чем в других отделениях, причем, не только к БЛА, но и к препаратам других групп. Значительную часть составляли культуры с промежуточной устойчивостью, которые в современной интерпретации учета относят к нечувствительным. 94 Таким образом, очевидно, антибиотикорезистентности что позволяют результаты определить локального препарат выбора мониторинга и повысить эффективность этиотропной терапии в конкретном отделении в определенный период времени. Рисунок 10. Распределение штаммов P. aeruginosa, выделенных в различных отделениях многопрофильного ЛПУ, по чувствительности к анализируемому спектру АБП: 1 – пиперациллин/тазобактам, 2 – цефоперазон/сульбактам, 3 – цефтазидим, 4 – цефепим, 5 – меропенем, 6 – имипенем, 7 – гентамицин, 8 – амикацин, 9 – ципрофлоксацин. 3.2.3. Микробные ассоциации с участием P. aeruginosa при гнойно-септических осложнениях у пациентов стационаров хирургического профиля Особого внимания заслуживает анализ встречаемости P. aeruginosa в монокультуре и в составе ассоциаций. В исследовании по составу ассоциаций рассмотрены 666 случаев, при которых штаммы P. aeruginosa были выделены из различного материала хирургических 95 больных взрослой сети (6 ЛПУ, 20 отделений). В целом, оказалось, что в монокультуре P. aeruginosa высевалась только в 30,3% случаев, при этом из крови – в 71,4%, из мочи – в 51,3%, из раневого отделяемого – в 35,4% (Таблица 9). Из мокроты и бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛЖ) как единственный микроорганизм P. aeruginosa выделялась только в 17,7 и 14,6% соответственно. Почти в 70% случаев P. aeruginosa инфицировала материал в составе ассоциаций: из них 63,2% – двухкомпонентные, 25,6% – трехкомпонентные и 11,2% – четырехкомпонентные. Таблица 9 Распределение по биоматериалу штаммов P. aeruginosa, выделенных в монокультуре или в составе ассоциаций Биоматериал Количество Монокультура культур (n) (n/%) 2-х 3-х 4-х Раневое отделяемое 246 87/35,4 106/43,1 39/15,9 14/5,7 Мокрота 232 41/17,7 109/47,0 52/22,4 30/12,9 БАЛЖ 41 6/14,6 21/51,2 11/26,8 3/7,3 Моча 76 39/51,3 29/38,2 4/5,3 4/5,3 Кровь 7 5/71,4 1/14,3 1/14,3 0/0 Аспират 39 15/38,5 17/43,6 7/17,9 0/0 Выпот из брюшной полости 10 1/10 7/70,0 2/20,0 0/0 Другое 15 8/53,3 3/20,0 3/20,0 1/6,7 Всего 666 202/30,3 293/44,0 119/17,9 52/7,8 В ассоциации (n/%) Установлено, что и в ОРИТ, и в «неОРИТ» подразделениях P. aeruginosa выделялась в монокультуре реже, чем в составе ассоциаций (Таблица 10), но в реанимационных отделениях разница была более значительной. Можно полагать, что на фоне особенно тяжелого состояния пациентов в ОРИТ, когда нарушена барьерная функция кожных и слизистых покровов, происходит активная транслокация представителей индигенной микробиоты, способных присоединиться к ведущим этиопатогенам. Таблица 10 Доля штаммов P. aeruginosa, выделенных в монокультуре, и в составе ассоциаций в ОРИТ и «неОРИТ» группах (%) Группа Монокультура В ассоциации Всего 2-х 3-х 4-х ОРИТ 25,80±2,24 74,20±3,24 62,66±2,47 25,81±2,24 11,53±1,63 «неОРИТ» 34,86±2,83 65,14±2,83 66,51±2,94 25,36±2,20 8,13±1,33 96 Анализ видового состава ассоциаций выявил 152 их варианта. Наиболее распространенными были ассоциации P. aeruginosa с грамотрицательными бактериями, в которые чаще других входили Klebsiella pneumoniae (30,4%, n=141), Acinetobacter baumannii (25,9%, n=120) и Escherichia coli (18,5%, n=86). Важно подчеркнуть, что 2-х компонентные ассоциации с этими микроорганизмами также были преобладающими с K. pneumoniae 14,6% (n=68), A. baumannii 11,8% (n=55) и E. coli 8,2% (n=38) случаев. Из грамположительных бактерий среди ассоциантов достаточно часто обнаруживались стафилококки, в том числе Staphylococcus aureus в 9,9% (n=46), коагулазоотрицательные виды в 3,7% (n=17). Число вариантов ассоциаций и их компонентный состав изменялись в зависимости от исследуемого материала. Количество сочетаний нарастало в ряду: моча (22 варианта) → рана (70) → мокрота (95). В мокроте P. aeruginosa чаще всего встречалась в ассоциации с A. baumannii (22,5%, n=43) и K. pneumoniae (21,9%, n=42), а в совокупности, в том числе с другими видами, их доля составила 50% (n=96). В моче доминировали ассоциации P. aeruginosa с E. faecium, E. coli и C. albicans, в раневом отделяемом – с K. pneumoniae, E. coli и S. aureus. 3.2.4. Роль P. aeruginosa в этиологии инфицированных ожоговых ран3 Отдельное исследование было посвящено изучению роли P. aeruginosa в инфицировании ожоговых ран. За период 2011-12 гг. у 190 пациентов из 208 обследованных (91,3%) изолировано 270 бактериальных культур. Из них 38 человек находились на лечении по поводу ожогов I-II-IIIА степени, 152 – IIIБ-IV степени. Микробную колонизацию ран регистрировали на 11±4,1 и 12±7,2 день, для P. aeruginosa на 9±3,5 и 18,4±9,2 день соответственно. Полученные нами данные по частоте встречаемости P. aeruginosa в спектре микрофлоры инфицированных ожоговых ран показали, что она по-прежнему является этиологически значимым возбудителем среди данной категории ГСИ. При этом спектр микрофлоры оказался весьма разнообразным: выделенные бактерии отнесены к 12 родам и 19 видам с сопоставимым представительством грамположительных (51,5%) и грамотрицательных таксонов (48,5%) (Таблица 11). Наряду с P. aeruginosa, доминирующим видом оказался S. aureus – их совокупная доля составила почти 40% от всех выделенных бактерий. Из числа других НГОБ чаще выделяли A. baumannii – 8,89%. Удельный вес остальных видов не превышал 5%. При поверхностных и глубоких термических ранах P. aeruginosa встречалась с одинаковой частотой (φ=0,019; p=0,747). Для выяснения структуры симбиотических взаимоотношений и более полной характеристики микробиоценоза ожоговой раны был посчитан индекс встречаемости представителей различных таксонов, формирующих ее микрофлору. Оказалось, что для P. aeruginosa (наряду со S. aureus) он превышал 25%, все остальные виды отнесены к группе эпизодически встречающихся или случайных. Это подтверждено динамикой выделения 97 бактерий за период наблюдения: штаммы P. aeruginosa выделяли из раневого отделяемого пациентов в течение двух лет с заметным постоянством. Таблица 11 Спектр микроорганизмов, изолированных из отделяемого ожоговых ран Вид микроорганизма Количество штаммов, n Степень ожога Индекс Всего встречаемости I-II-IIIА IIIБ-IV абс./% С*, % Staphylococcus aureus 10 39 49 /18,15 25,79 Staphylococcus epidermidis 7 16 23/8,52 12,11 Staphylococcus haemolyticus 2 17 19/7,04 10,00 Streptococcus porcinus 1 3 4/1,48 2,11 Streptococcus milleri 0 4 4/1,48 2,11 Enterococcus faecalis 4 11 15/5,56 7,89 Enterococcus faecium 2 4 6/2,22 3,16 Corynebacterium xerosis 4 14 18/6,67 9,47 C. paurometabolum 0 1 1/0,37 0,53 Enterobacter cloacae 3 12 15/5,56 7,89 Pantoea (ранее Enterobacter) 1 4 5/1,85 2,63 Escherichia coli 1 8 9/3,33 4,74 Klebsiella spp. 2 13 15/5,56 7,89 Proteus mirabilis 0 3 3/1,11 1,58 Proteus vulgaris 0 3 3/1,11 1,58 Pseudomonas aeruginosa 9 41 50/18,52 26,32 Pseudomonas putida 1 5 6/2,22 3,16 Acinetobacter baumannii 6 18 24/8,89 12,63 Neisseria elongata 0 1 1/0,37 0,53 Всего 53 217 270/100,00 agglomerans Примечание: *Индекс встречаемости рассчитывали по формуле: С=p*100/P, где С – индекс встречаемости, p – число проб, в которых обнаружены бактерии данного вида, P – общее число проанализированных проб (Дедю И.И., 1989). В силу полиэтиологичности ожоговой болезни особого внимания заслуживает анализ выделения P. aeruginosa в монокультуре или в составе ассоциаций. Несмотря на то, что в монокультуре P. aeruginosa изолировали в 30 (60%) случаях (7 – I-II-IIIА, 23 – IIIБ-IV), не 98 выявлено достоверных отличий по частоте встречаемости этого вида в моно- или смешанной культуре. Ассоциации были 2-х и 3-х компонентными (14 и 6 случаев), преобладающее их большинство зафиксировано с другим неферментирующим микроорганизмом A. baumannii. Известно, что в процессе лечения ожоговых больных может быть смена или присоединение другого возбудителя, обусловленные длительностью пребывания в стационаре, а также инвазивными диагностическими и лечебными процедурами, когда возможна вторичная контаминация, в том числе и госпитальными эковарами. При контроле инфицированности в последующих посевах P. aeruginosa выделяли в 13 случаях, из них 8 – во втором, 4 – в третьем, и однократно – в четвертом. При этом только в двух пробах синегнойную палочку не изолировали в первичном посеве. Длительность персистенции P. aeruginosa в ожоговой ране связана с тем, что в отличие от других распространенных возбудителей, таких как стафилококки, микробные клетки псевдомонад локализованы в глубоких слоях тканей, а не на поверхности ран (Bjarnsholt T., 2011). Проведен анализ чувствительности штаммов P. aeruginosa к антибактериальным препаратам (Рисунок 11). Более 50% изолятов P. aeruginosa оказались устойчивы к беталактамным антибиотикам, исключением был цефтазидим, к которому сохраняли чувствительность 66% культур. К амикацину и ципрофлоксацину доля резистентных изолятов была сопоставима и составила около 40%. Наиболее активным в отношении данного вида бактерий остается имипенем: к нему были устойчивы только 21,7% культур. Нужно отметить, что ни в одном случае не было обнаружено устойчивости к полимиксину. Рисунок 11. Распределение штаммов P. aeruginosa по чувствительности к анализируемому спектру АБП, * – определяли по требованию. 3 Данные получены в соавторстве с врачом-хирургом, аспирантом кафедры общей хирургии лечебного факультета ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ Еньчевой Ю.А. и опубликованы в статье Особенности инфицирования ожоговых ран / В.А. Самарцев, Ю.А. Еньчева, М.В. Кузнецова, Т.И. Карпунина // Новости хирургии. – 2014. – Т. 22, №2. – С. 199-206. 99 3.3. Особенности циркуляции P. aeruginosa в акушерских стационарах За анализируемый 5-летний период (2006-10 гг.) изолировано 70 604 культуры УПМ. Средний показатель бактериальной обсемененности проб составил 238,9±0,8 на 1000 исследований. При анализе кожной складки, конъюнктивы и зева здоровых новорожденных – 297,2±1,6, 269,4±2,1 и 299,2±2,1 соответственно. Менее всего были контаминированы заушная складка (60,5±1,2) и внутренняя поверхность катетера пупочной вены (57,3±3,4). Частота выделения микроорганизмов в случае ГСИ из различного клинического материала существенно различалась (Таблица 12). Самой высокой степенью обсемененности отличалась моча, что, повидимому, обусловлено контаминацией ее образцов при их «специфическом» отборе у новорожденных Таблица 12 Частота выделения микроорганизмов в случае ГСИ Биологический материал Количество исследуемых Количество проб с УПМ проб (абс.) абс. на 1000, M±m Отделяемое пупочной ранки 36712 8477 230,9±2,2 Мокрота 8470 1417 167,3±4,1 Кровь 16559 1468 88,7±2,2 Ликвор 969 47 48,5±6,9 Моча 4989 2562 513,5±7,1 Установлено, что удельный вес грамположительной микрофлоры в течение 2006-10 гг. оставался стабильно высоким и составил в среднем 77,9±0,2%, грамотрицательные бактерии обнаружены в 18,6±2,1% случаев (Таблица 13). Как и следовало ожидать, P. aeruginosa и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии, в том числе рода Acinetobacter, не играли существенной роли в спектре культур, изолированных от новорожденных. Бактерии родов Pseudomonas и Acinetobacter практически сравнялись по частоте выделения и составили 1,3±0,1 и 1,1±0,1%. Из других «неферментеров» как единичные находки встречались представители родов Alcaligenes, Moraxella, Stenotrophomonas, Burkholderia. В последние годы отмечено расширение видового спектра за счет ранее не идентифицированных неферментирующих бактерий, что связано, в первую очередь, с качеством бактериологической диагностики, в том числе с появлением новых дифференциальных тест-систем, а также с нацеленностью бактериологов на поиск нетривиальных видов бактерий. В 2011 г. доля P. aeruginosa составила 0,26±0,14% от всех культур, а в совокупности с другими псевдомонадами – 0,39±0,16% (Таблица 14). Удельный вес видов рода Acinetobacter в три раза больше – 1,17±0,27%, в том числе A. baumannii – 0,65±0,21%, Acinetobacter lwoffii – 0,46±0,18%, Acinetobacter junii – 100 0,07±0,08%. Это самый высокий показатель для бактерий данного рода за все годы наблюдения. В 2012 г. доля P. aeruginosa составила 1,23±0,21% от всех культур, что соответствовало посчитанному ранее среднему показателю за пять лет (2006-10 гг.). Таблица 13 Спектр микроорганизмов, изолированных от новорожденных в период 2006-10 гг. Грамположительные Абс. % Грамотрицательные Абс. % S. aureus 4947 7,0 E. coli 5573 7,9 Другие коагулазо «+» 261 0,4 Klebsiella spp. 3443 4,9 S. epidermidis 15499 22,0 Enterobacter spp. 1954 2,8 S. haemolyticus 6616 9,4 Citrobacter spp. 135 0,2 Другие коагулазо «-» 13122 18,6 Proteus spp. 167 0,1 Стафилококки всего 40445 57,4 Morganella morganii 195 0,3 Другие виды семейства 93 0,1 11365 16,0 S. pyogenes Enterobactericea S. agalactiae 278 0,4 Энтеробактерии всего S. pneumoniae 40 0,1 P. aeruginosa 865 1,2 Streptococcus spp. (др.) 2920 4,1 Pseudomonas spp. 78 0,1 Стрептококки всего 3433 4,9 Acinetobacter spp. 798 1,1 Enterococcus spp. 11100 15,7 Другие виды НГОБ 37 0,1 Всего 54978 77,9 Всего 13143 18,6 Таблица 14 Динамика удельного веса неферментирующих грамотрицательных бактерий в спектре культур, изолированных от новорожденных Микроорганизм Удельный вес, % 2006 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г. 2011 г. 2012 г. P. aeruginosa 0,63 1,27 2,62 1,47 0,26 0,26 1,23 Pseudomonas spp. 0,08 0,12 0,21 0,14 0,02 0,13 0,01 Acinetobacter spp. 1,13 1,23 1,11 1,28 0,87 1,17 0,44 Alcaligenes spp. 0,03 0,01 0,05 0,01 0,06 0,00 0,02 Moraxella spp. 0,02 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 S. maltophilia 0,02 0,00 0,00 0,05 0,00 0,05 0,38 B. cepacia - - - - - - 0,04 Все НГОБ 1,91 2,63 3,98 2,95 1,21 1,56 2,12 101 Риск возникновения ГСИ у новорожденных связан, в первую очередь, с незавершенностью формирования защитных механизмов внешних барьеров: недоразвитием рогового слоя кожи, проницаемостью кожных и слизистых покровов. Поэтому особое внимание было уделено видовому представительству и частоте выделения бактерий именно в этих биотопах при колонизации и в случае ГСИ (Таблица 15). Сравнение микробного пейзажа в парах «кожа»-«пупочная ранка» и «зев»-«мокрота», когда материал отбирали у здоровых младенцев (колонизация) и в случае забора материала при подозрении на ГСИ (воспалительный процесс), выявило следующие особенности. Микрофлора отделяемого пупочной ранки близка к микроорганизмам, колонизирующим кожные покровы новорожденных, которые и становятся возбудителями ГСИ, что подтверждает сильная положительная связь в паре «кожа»-«пупочная ранка» (r=0,999, р<0,05). Следует отметить, что роль P. aeruginosa не значима при воспалении пупочной ранки, хотя ее доля увеличивалась в три раза. Сопоставление данных долевого участия УПМ в паре «зев»-«мокрота» показало умеренную положительную корреляцию (r=0,556, р<0,05). В то же время P. aeruginosa изолировали почти в пять раз чаще при ГСИ дыхательных путей, чем в зеве при носительстве (10,9±2,7 против 2,4±0,4). Существенно были представлены в мокроте и другие НГОБ. Таблица 15 Представительство микроорганизмов при исследовании кожи, конъюнктивы, зева, мокроты и отделяемого пупочной ранки новорожденных Микроорганизмы Доля в биотопе/материале, % (M±m) Кожа Конъюнктива Зев Отделяемое Мокрота пупочной ранки Стафилококки 66,5±0,3 75,4±0,4 43,6±0,4 57,2±0,5 20,1±1,0 Стрептококки 2,4±0,1 4,6±0,2 11,5±0,3 1,8±0,1 14,1±0,9 Энтерококки 15,5±0,2 10,9±0,3 14,7±0,3 21,4±0,4 13,3±0,8 Кишечные бактерии 12,7±0,2 5,6±0,2 20,9±0,3 16,7±0,4 26,1±1,1 НГОБ 0,8±0,1 2,6±0,1 3,9±0,2 1,7±0,1 16,3±0,9 в том числе P. aeruginosa 0,2±0,1 0,8±0,1 2,4±0,4 0,6±0,1 10,9±2,7 Грибы рода Candida 2,1±0,1 0,9±0,1 5,4±0,2 1,2±0,5 10,1±0,7 При анализе других материалов выявлено, что в ликворе доля P. aeruginosa составила 6,4±3,6%, удельный вес всех НГОБ – 10,6±4,5%. Результаты микробиологического исследования крови оказались положительными только в 9% случаев, из них бактерии P. aeruginosa встречались в 0,5±0,5%. В смывах с внутренней поверхности катетеров доля синегнойной палочки составила 7,9±1,7%, в моче – 2,0±0,3%, в отделяемом уха – 0,2±0,1%. 102 Анализ антибиотикочувствительности штаммов P. aeruginosa, циркулирующих в акушерских стационарах. Изучали профили антибиотикорезистентности штаммов, изолированных из акушерских ЛПУ за период 2006-10 гг. (1-я группа) и 2011-12 гг. (2-я группа), в отдельную группу выделены штаммы, полученные во время вспышки 2008 г. в крупном акушерском стационаре города и неонатальных отделениях двух детских больниц города (3-я группа). Анализ антибиотикочувствительности штаммов, выделенных от новорожденных в период 2006-10 гг. (без учета вспышки), выявил, что доля изолятов, устойчивых к антибактериальным препаратам различных фармакологических групп, не превышала 20%, за исключением цефоперазона (Рисунок 12-А). Изучение профиля антибиотикорезистентности во время вспышки показало, что более 50% штаммов проявляли устойчивость к цефепиму, около 20% – к цефтазидиму (Рисунок 12-Б). Нечувствительность к карбапенемам и амикацину также встречалась значительно чаще. Наиболее активным в отношении данной группы штаммов оказался ципрофлоксацин, к которому были чувствительны более 95% штаммов. Сравнение антибиотикограмм культур P. aeruginosа, выделенных от новорожденных и с объектов госпитальной среды, выявило, что 80,7% штаммов имели сходные профили резистентности. У большей части изолятов в период вспышки, на фоне сохранения чувствительности к карбепенемам, амикацину и ципрофлоксацину, произошло формирование устойчивости к цефалоспориновой группе антибактериальных препаратов. По-видимому, ситуация осложнилась формированием и распространением госпитального штамма P. aeruginosа, что и нашло отражение в общей структуре антибиотикочувствительности культур в данный период. В 2011-12 гг. устойчивость культур к антибиотикам в акушерских стационарах оставалась на традиционно низком уровне (Рисунок 12-В). Анализ профилей антибиотикорезистентности штаммов P. aeruginosa, изолированных в крупном перинатальном центре города за 2011-12 гг. в ОРИТ (n=11) и «неОРИТ» (n=24) отделениях, не выявил существенной разницы в чувствительности штаммов двух групп. За исключением цефоперазона, остальные апробированные антибиотики были эффективны в отношении всех выделенных культур. Такая благоприятная ситуация в учреждениях родовспоможения свидетельствует о стабильности процессов, обеспечивающих биологическую безопасность медицинских услуг, что, как правило, предотвращает возможность формирования и распространения госпитальных штаммов P. aeruginosа среди новорожденных. 103 А Б В Рисунок 12. Распределение штаммов P. aeruginosa, выделенных от новорожденных, по чувствительности к анализируемому спектру АБП: А – в 2006-10 гг.; Б – в период вспышки (май-август 2008 г.); В – в 2011-12 гг. Таким образом, полученные нами результаты по целому ряду позиций совпадают с общемировыми и российскими наблюдениями, характеризующими распространенность P. aeruginosa в стационарах различного профиля. Вместе с тем показано, что инфицированность синегнойной палочкой и ее доля в спектре микроорганизмов в различных материалах зависит от профилизации стационара и возрастной категории пациентов. 104 Вследствие этого в отделениях ЛПУ, в том числе ОРИТ, формируется специфическая среда, определяющая степень значимости эндогенного и экзогенного инфицирования, что связано, в первую очередь, с особенностями контингента больных, набором лекарственных средств и методов лечебного пособия. Установленные особенности могут быть схематично представлены следующим образом: 105 ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ В ИДЕНТИФИКАЦИИ/ДЕТЕКЦИИ, ТИПИРОВАНИИ И ОЦЕНКЕ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P. AERUGINOSA Внедрение в практику методов молекулярного анализа существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, позволяя точно идентифицировать изоляты, выявлять детерминанты антибиотикорезистентности и специфичные факторы патогенности, проводить внутривидовое типирование штаммов. Опыт последних десятилетий активного освоения молекулярно-генетических технологий в России и многочисленные публикации зарубежных авторов создают предпосылки для оценки их роли и места в клинической лабораторной диагностике. Более того, актуальным является вопрос о клинической целесообразности таких подходов. Учитывая отсутствие регламентирующих документов и протоколов, определяющих обязательные ДНК-исследования, представляем свой опыт в отношении P. aeruginosa. 4.1. Сравнительный анализ применения культурального и молекулярногенетического методов для определения видовой принадлежности P. aeruginosa В работе использовали 159 штаммов P. aeruginosa, выделенных в 2008-11 гг. от больных и из больничной среды крупных хирургических стационаров. В качестве положительного контроля был использован штамм P. aeruginosa АТСС 27853, отрицательного – лабораторный штамм Pseudomonas fluorescens C32. Первичная идентификация проведена в бактериологических лабораториях ЛПУ. Реидентификация с использованием «НефермТеста24» выявила, что 17 штаммов не являлись P. aeruginosa и по его результатам были отнесены к видам Pseudomonas putida, Ochromobacter anthropi, Burkholderia pseudomallei (Рисунок 13). В результате генетической идентификации с помощью родо- и видоспецифичных праймеров (Ps-for/Ps-rev – 16S рРНКPs, размер амплифицируемого фрагмента 969 п.н; PA-SSF/PA-SS-R – 16S рРНКPA, 956 п.н.) было установлено, что 145 (91,2%) штаммов соответствуют виду P. aeruginosa, определенному в первичных бактериологических лабораториях. По результатам ПЦР-анализа четырнадцать культур не принадлежали к данному виду, но 11 (6,9%) были псевдомонадами, и только 3 (1,9%) – не принадлежали к роду Pseudomonas (Рисунок 14, Таблица 16). 106 Рисунок 13. Видовой состав, полученный при реидентификации клинических штаммов P. aeruginosa с помощью «НефермТеста24». 1 2 1 3 2 3 4 5 4 5 6 6 7 7 8 8 9 10 11 12 12 14 15 16 17 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Рисунок 14. Пример электрофореграммы продуктов амплификации гена 16S рРНК с праймерами Ps-for/Ps-rev (верх) и PA-SS-F/PA-SS-R (низ): 1 – маркер молекулярных масс O’GeneRulerTM 1кbp Plus DNA Ladder (“Fermentas”, Литва); 2-17 – клинические изоляты. ДНК штаммов (n=14), с матрицы которых не прошла специфическая амплификация с видоспецифичными праймерами, была использована в ПЦР с универсальными праймерами к гену 16S рРНК (515F/1391R). Проведено определение полученных нуклеотидных последовательностей с помощью секвенирующей реакции. BLAST-анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК подтвердил, что 11 штаммов являются представителями рода Pseudomonas (рРНК группа I) (Anzai Y. et al., 2000). На филогенетическом древе изоляты попали в разные подгруппы псевдомонад: 6 штаммов имели максимальный уровень сходства с 107 P. aeruginosa, два штамма принадлежали к этой же «P. aeruginosa group» и определены как Pseudomonas pseudoalcaligenes/Pseudomonas nitroreducens (Таблица 17, Рисунок 15). Точная видовая идентификация была невозможна из-за малой длины секвенированнного фрагмента. Таблица 16 Род не Pseudomonas 36 36 0 0 36 0 0 ЛПУ 2 66 58 8 3 58 5 3 ЛПУ 3 2 2 0 0 2 0 0 ЛПУ 4 12 12 0 0 12 0 0 ЛПУ 5 4 4 0 0 4 0 0 ЛПУ 6 4 1 3 0 1 3 0 ЛПУ 7 8 8 0 0 8 0 0 ЛПУ 8 7 7 0 0 7 0 0 ЛПУ 9 20 17 3 0 17 3 0 Всего 159 145 14 3 145 11 3 Другие виды Pseudomonas P. aeruginosa «+» детекция с PASS-F/PA-SS-R ЛПУ 1 «-» детекция с Psfor/Ps-rev Число штаммов (n) ЛПУ «-» детекция с PASS-F/PA-SS-R Анализ ПЦР-детекции клинических штаммов P. aeruginosa У трех изолятов исследуемые участки ДНК были на 99,9% схожи с геном 16S рРНК штамма Pseudomonas plecoglossicida FPC951 (GenBank AB009457.1) из «Pseudomonas putida group». Таким образом, шесть штаммов оказались P. aeruginosa, как они и были определены в первичных бактериологических лабораториях, а остальные – принадлежали к близкородственным группам наиболее клинически значимых псевдомонад. Один изолят принадлежал к виду Stenotrophomonas maltophilia (рРНК группа V), выделенному (реклассифицированному) ранее Palleroni N.J. и Bradbury J.F. (1993) в самостоятельный род. У двух штаммов анализируемые нуклеотидные фрагменты имели максимальное сходство с геном 16S рРНК штамма Comamonas sp. EB172 LMG 5323 (GenBank AJ430348.1, семейство Comamonodaceae, рРНК группа III). 108 Таблица 17 Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК № Обозначение Размер Сходство с наиболее близким гомологичным геном штамма секвенированного 16S рРНК из GenBank, % фрагмента, п.н. 1 Pr7 784 P. aeruginosa LMG 1242T, Z76651.1 2 737m 791 P. aeruginosa P-5, JN969044.1 3 746 760 4 1827 791 5 3-5 811 6 3-14** 746 7 DIB7** 629 8 DIB492** 563 9 DIB891** 611 10 3-8 775 P. pseudoalcaligenes JCM 5968T, AB021379.1 11 3-19** 759 P. nitroreducens EAPn13, JF911369.1 12 1-16 819 S. maltophilia ATCC13637T, AB008509.1 100 P. plecoglossicida FPC951, AB009457.1 99100 100 99 S. maltophilia NBRC 12690, AB680319.1 13 3-13** 820 14 3-13-1** 804 Comamonas sp. EB172, EU847238.1 100 Примечание: *жирным выделены штаммы, не принадлежащие к роду Pseudomonas по результатам ПЦР-анализа, **отмечены штаммы, которые совпали по отрицательному результату в ПЦР и «НефермТесте24». Таким образом, данное исследование показало высокую достоверность видовой идентификации P. aeruginosa при использовании рутинного культурального метода, и с учетом ложноотрицательных данных ПЦР-анализа она составила 95% (Рисунок 16). Следует также подчеркнуть, что почти все штаммы, отнесенные нами по 16S рРНК к другим видам, являются близкородственными, и подобные лабораторные «ошибки» при использовании бактериологического метода исследования существенного клинического значения не имеют. Исключение представляет единственный случай «недодиагностики» инфекции, вызванной S. maltophilia, значимость которых в качестве возбудителя нозокомиальных инфекций выросла в последнее время. Известно, что инфекции, вызванные S. maltophilia, очень трудно 109 контролировать, так как клинические изоляты часто резистентны ко многим антимикробным препаратам (Белокрысенко С.С., Дадха Теграни А., 2007). Рисунок 15. Филогенетическое древо, построенное с помощью пакета программ TREECON, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S pДНК видов рода Pseudomonas и некоторых видов β и γ-β субклассов Proteobacteria. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Культуральный метод «НефермТест24» ПЦР-метод 8 ошибок 15 ошибок 6 ошибок «специфичность»* 94,97% «чувствительность» 90,57% «чувствительность» 96,23% Рисунок 16. Оценка различных методов исследования для верификации P. aeruginosa: *по отношению к методу секвенирования ПЦР-фрагментов, полученных с помощью праймеров к 16S рРНК. 110 Сравнительный анализ двух пар праймеров: exoA2-F/exoA2-R и PA-SS-F/PA-SS-R для амплификация участка гена exoA и 16S рРНКPA, детерминирующих синтез экзотоксина А и маркирующих видоспецифичную рибосомальную РНК, предложенных для идентификации P. aeruginosa Khan A.A., Cerniglia C.E. (1994) и Spilker T. и соавт. (2004), показал следующее. В подавляющем большинстве случаев у «PA-SS-F/PA-SS-R»-положительных изолятов детектированы фрагменты ДНК, кодирующие ExoA (143 из 145; 98,6%). Данные праймеры можно использовать в мультиплексной ПЦР с одновременной детекцией обоих фрагментов (Рисунок 17). 1 2 1 3 4 2 exoA 6 7 5 3 8 4 9 10 11 12 1 2 3 Мультиплексная ПЦР 5 6 7 8 4 16S pРНК 5 6 7 8 9 10 9 10 11 12 11 12 Рисунок 17. Пример электрофореграммы продуктов амплификации в моноварианте и мультиплексной ПЦР участка 16S рРНКPA и exoA: 1 – маркер молекулярных масс 700 bp Plus DNA Ladder; 2 – P. aeruginosa АТСС 27853, 3-9 – клинические изоляты P. aeruginosa, 10 – P. fluorescens C32, 11 – E. coli АТСС 25922, 12 – маркер молекулярных масс 100 bp+1,5 Kb. В то же время, исследование идентифицированных бактериологическим методом природных (почвенных) штаммов P. aeruginosa на присутствие двух видоспецифичных мишеней выявило, что фрагменты гена 16S рРНКPA детектировали как минимум в 90%, тогда как exoA обнаруживали менее чем в 50% случаях (Рисунок 18). Из двух реакций амплификация с праймерами к участку 16S рРНКPA оказалась более чувствительной. Очевидно, что exoA не является обязательным геном для P. aeruginosa, но высокая специфичность (аналогичные последовательности не обнаружены для представителей других таксонов), а также частота встречаемости exoA в геноме клинических штаммов позволяют использовать данную последовательность в качестве мишени при видовой идентификации нозокомиальных изолятов. 111 А 1 2 3 4 Б 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 18. Пример электрофореграмм продуктов амплификации участка 16S рРНКPA (А) и exoA (Б): 1, 8 – маркер молекулярных масс 100 bp+1,5 Kb+2,0 Kb; 2-6 – природные штаммы P. aeruginosa, 7 – P. aeruginosa АТСС 27853. 4.2. Применение ПЦР-анализа для контроля обсемененности объектов внешней среды Контроль микробной обсемененности объектов внешней среды и медицинского оборудования бактериями рода Pseudomonas в лечебных учреждениях проведен в трех крупных клиниках г. Перми (всего 15 исследований). Пример 1. В хирургическом отделении крупного многопрофильного стационара взяты пробы со следующих объектов: № 1 – интубационная трубка аппарата для ИВЛ; № 2 – операционный стол, № 3 – кровать в палате интенсивной терапии. Одновременно с ПЦР был сделан прямой посев на кровяной агар и на среду Мак-Конки в соответствии с приложением №2 к Приказу МЗ №720. Результаты ПЦР-анализа проб с родо- и видоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК Pseudomonas spp. (Ps-for/Ps-rev) и P. aeruginosa (PA-SS-F/PA-SSR) представлены на рисунке 19. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1000 п.н – Рисунок 19. Электрофореграмма продуктов амплификации гена 16S рРНК бактерий рода Pseudomonas: 1– маркер молекулярных масс 100 bp; 2, 3 – штамм P. aeruginosa АТСС 27853 (положительный контроль); 4, 5 – проба № 1; 6, 7 – проба № 2; 8, 9 – проба № 3 (2, 4, 6, 8 – с праймерами Ps-for/Ps-rev; 3, 5, 7, 9 – PA-SS-F/PA-SS-R). Был получен положительный результат в материале смыва с интубационной трубки аппарата для искусственной вентиляции легких. Бактериологическое исследование подтвердило 112 наличие в смыве бактерий P. aeruginosa, однако на его проведение потребовалось 3 дня, тогда как ПЦР-исследование позволило получить результат в течение одного рабочего дня. Пример 2. В крупном хирургическом стационаре г. Перми исследованы смывы с объектов окружающей среды и медицинского оборудования (всего 96 проб). Специфическая амплификация фрагмента гена 16S рРНКPA, маркирующего видовую принадлежность к P. aeruginosa, проведенная после обычного забора проб, выявлена только в одном образце. Использование набора реагентов “М-сорб-ООМ” – OOM-502 для выделения ДНК из объектов окружающей среды показало присутствие синегнойной палочки в шести пробах. Таким образом, при проведении в лечебных учреждениях планового, а тем более эпидемически обусловленного бактериологического контроля, наряду с прямыми посевами смывов с оборудования, инструментария, объектов внешней среды и др. на специальные среды, образцы необходимо дополнительно подвергать молекулярно-генетическому анализу для обнаружения генов, маркирующих видовую принадлежность к P. aeruginosa. Важно подчеркнуть, что такой подход обеспечит быстроту получения предварительных результатов анализа, а также качественный контроль бактериальной обсемененности объектов окружающей среды и оборудования в медицинских учреждениях в тех случаях, когда P. aeruginosa не выявляются с помощью существующего регламентированного бактериологического метода (низкая обсемененность, биопленка), но при определенных условиях могут вызвать внутрибольничное инфицирование. 4.3. Генотипирование нозокомиальных культур P. aeruginosa 4.3.1. Сравнительная оценка диагностической значимости RAPD- и Rep-ПЦР при генотипировании клинических изолятов P. aeruginosa Генетическое типирование штаммов осуществляли посредством ПЦР с праймерами М13 (RAPD-ПЦР), ERIC1R/ERIC2 и BOXА1R (Rep-ПЦР). На первом этапе исследования с целью отработки режимов реакции были использованы референтный штамм P. aeruginosa АТСС 27853 и клинический изолят P. aeruginosa 100д, что связано с отсутствием общепринятых стандартных режимов амплификации при использовании данных праймеров. Например, протокол амплификации одной из фирм-производителей праймера М13 определяет температуру отжига в реакции 50ºC, тогда как авторы, предложившие данные праймеры, использовали 40ºC (Huey B., Hall J., 1989). При использовании ERIC-последовательностей для типирования штаммов P. aeruginosa также существуют различные варианты. По данным Wolska K. и Szweda P. (2008) необходимо применять два праймера, а температуру отжига в реакции – 53ºC. Lim K.T. и соавт. (2009) использовали только один праймер ERIC2 и выявили, что в данной реакции разделение штаммов более четкое, чем при REP-ПЦР и ПЭ. Хорошую 113 дискриминирующую способность при типировании клинических и природных изолятов P. aeruginosa с ERIC2-праймером показали Feltman H. и соавт. (2001), но при более низкой температуре отжига – 45ºC. По результатам исследования диапазон оптимальной температуры отжига для праймера М13 составил 42-49ºC, ERIC2 – 48-57 ºC и BOXА1 – 45-50ºC (Рисунок 20). А P. aeruginosa АТСС 27853 М 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 P. aeruginosa 100д М 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 М 56 Б P. aeruginosa АТСС 27853 М 45 46 47 48 49 50 М 50 51 52 53 54 55 56 57 58 54 55 56 57 58 59 60 P. aeruginosa 100д М 45 46 47 48 49 50 М 50 51 52 53 59 60 114 М 45 46 47 48 49 В P. aeruginosa 100д 51 52 53 54 50 55 56 57 58 59 60 М Рисунок 20. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймером М13 (А), ERIC2 (Б) и BOXА1 (В) штаммов P. aeruginosa при разной температуре отжига: М – маркер молекулярных масс 100 bp+1,5 Kb+2,0 Kb; 40-60 – температура (ºC) отжига. Использование праймеров ERIC2 или ERIC1/ERIC2 в параллельных ПЦР для типирования клинических изолятов P. aeruginosa показало, что ERIC-профили существенно отличались (Рисунок 21). Сопоставимое и даже большее количество амплифицированных фрагментов ДНК в первом случае указывает на целесообразность применения ERIC2-праймера в качестве единственной затравки для полимеразы при определении родства изолятов P. aeruginosa. М 1 2 3 А 4 Б 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 21. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймером ERIC2 (А) и ERIC1/ERIC2 (Б): М – маркер молекулярных масс 100 bp+1,5 Kb+2,0 Kb; 1-8 – клинические изоляты. Следующий этап исследования заключался в оценке ПЦР-методов для генотипирования штаммов P. aeruginosa. В анализ были взяты 17 эпидемически не связанных клинических изолятов. Наибольшее количество амплифицированных фрагментов у всей группы было получено в RAPD-ПЦР: на электрофореграммах выявлен 21 фрагмент различной длины (Рисунок 22, Таблица 18). В то же время, максимальное и среднее число фрагментов для одного штамма было сопоставимо при использовании праймеров М13 и ERIC2. ДНК профили после BOX-амплификации оказались наименее разнообразными. Общепризнано, что сравнительный анализ данных RAPD-ПЦР, полученных в разных лабораториях, затруднителен из-за чувствительности метода к изменениям условий реакции, тем не менее, он позволяет выявлять 115 индивидуальные особенности каждого отдельно взятого штамма. BOX-ПЦР, по-видимому, имеет наименьшую дискриминирующую способность при типировании изолятов P. aeruginosa, устанавливая только видовые особенности. Данное предположение подтверждено при вычислении коэффициента дискриминации, который составил 0,993, 0,875 и 0,639 для RAPD-, ERIC- и ВОХ-ПЦР соответственно. Согласно общепринятой практике, приемлемыми считаются методы типирования (или их комбинации), имеющие значение индекса Симпсона (D) 0,9 и выше (Hunter P.R. et al.,1988). М13 ERIC2 BOXA1R Рисунок 22. Электрофореграмма продуктов RAPD и Rep-ПЦР: М – маркер молекулярных масс 100 bp+1,5 Kb; 1-17 – клинические изоляты P. aeruginosa. Дендрограммы филогенетического родства, построены на основе метода невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Unweighted pair group method) с применением компьютерного обеспечения Quantity One (версия 4.6.1, Bio-Rad Laboratories, США). Полученные результаты дополняют накопленный опыт подобных исследований и показывают неравнозначную информативность использованных методик. Первоначально примененный для дифференциации Streptococcus pneumoniae метод BOX-ПЦР (похожие BOXэлементы, а в частности boxA, были найдены в геноме и других видов) стали использовать для типирования бактерий рода Pseudomonas. В исследовании, проведенном Wolska K. и соавт. (2011) и Morrelli P. и соавт. (2008), показано, что BOX-ПЦР является хорошим разрешающим методом для генотипирования изолятов P. aeruginosa. Syrmis M.W. и соавт. (2004) делают вывод, что методы с использованием повторяющихся ERIC- и BOX-элементов для типирования 116 штаммов P. aeruginosa имеют одинаковую разграничивающую силу и сопоставимы с ПЭ. В отличие от этих исследований, ранее Dawson S.L. и соавт. (2002) показали значительную гомологию изолятов P. aeruginosa при использовании BOX-ПЦР и, наоборот, гетерогенность по сравнению с другими видами, например Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens. По нашим данным применение BOX-ПЦР в определении родства P. aeruginosa оказалось не столь эффективным, в среднем 4 полосы на паттерн. Показана различная дискриминирующая способность двух вариантов Rep-ПЦР с преимуществом использования ERIC-ПЦР, причем, только с одним праймером ERIC2. Таблица 18 Количество и размер фрагментов, полученных в RAPD- и Rep-ПЦР Праймер Количество фрагментов, n (всего/макс у одного штамма/среднее) ≈ размер фрагмента, п.н М13 21/ 9/ 4,75±2,2 150, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 510, 550, 600, 700, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1400, 1500, 1700 ERIC2 13/ 9/ 4,25±1,6 200, 300, 350, 480, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1500, 3000 BOXA1R 13/ 6/ 3,65±0,9 200, 300, 420, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1100, 1300, 1500, 1600 Примечание: Жирным шрифтом выделены фрагменты, встречающиеся в генетическом профиле пяти и более штаммов. Таким образом, несмотря на относительно невысокую чувствительность рассмотренных методов (среднее число амплифицированных фрагментов не превышало 5, тогда как в ПЭ – 1215) и воспроизводимость RAPD-ПЦР (заложена в самом методе), использование данных реакций целесообразно для генотипирования штаммов P. aeruginosa. При кратковременных и/или одномоментных исследованиях предпочтительнее применять RAPD-ПЦР, при длительном мониторинге – ERIC-ПЦР или обе реакции одновременно. Учитывая перекрестные диапазоны оптимальной температуры отжига, можно использовать единый протокол амплификации. BOX-ПЦР, ориентированная на внутриродовую дифференцировку бактерий, при эпидемиологических исследованиях самостоятельного значения не имеет и может служить лишь дополнительным диагностическим средством. 117 4.3.2. Эпидемиологическая характеристика (основные геномоварианты) P. aeruginosae, циркулирующих в ЛПУ различного профиля Для определения родства выделенных изолятов и отбора штаммов для дальнейших исследований проведено их генетическое типирование методом RAPD-ПЦР. Штаммы P. aeruginosa (n=296), выделенные в 2008-12 гг. из хирургических стационаров взрослой (8 ЛПУ; n=145) и педиатрической (5 ЛПУ; n=151) сети, включая акушерский стационар и неонатальные отделения детской клиники (3 ЛПУ; n=129), распределились в 24 геномогруппы, а 52 изолята имели индивидуальные RAPD-профили (Рисунок 23). Для этой выборки штаммов P. aeruginosa D составил 0,865. Он оказался несколько ниже, так как нами учитывалось большое число близкородственных штаммов, выделенных при вспышке синегнойной инфекции в акушерском стационаре и детской клинике, а требование D≥0,9 справедливо только для выборки, включающей заведомо неродственные изоляты, представленные в равных пропорциях. Рисунок 23. Распределение штаммов по трем группам стационаров (ЛПУ 1-13): римскими цифрами обозначены геномогруппы (инд. – индивидуальные генотипы), арабскими – количество изолятов, *– изоляты, полученные во время вспышки 2008 г. Практически в каждом «взрослом» ЛПУ были зафиксированы близкородственные штаммы, при этом нужно отметить, что чаще их изолировали от больных ОРИТ. В многопрофильных стационарах обнаружены штаммы, выделенные из разных отделений, но 118 генотипически сходные. Большая часть изолятов от новорожденных относится к короткому «вспышечному» периоду времени, при этом схожие геномоварианты штаммов P. aeruginosa обнаружены при ГСИ детей разных ЛПУ, что указывает на возможность циркуляции близкородственных эковаров в замкнутом контуре «акушерский стационар – неонатальные отделения детской клиники». В хирургическом педиатрическом стационаре ситуация аналогична таковой во «взрослой хирургии», тогда как в терапевтических отделениях обеих возрастных групп обнаружены штаммы только с индивидуальными RAPD-профилями (данные не представлены). Пример использования RAPD-ПЦР при вспышке ГСИ, вызванной P. aeruginosa.2 При расследовании эпизодов циркуляции P. aeruginosa в многопрофильном хирургическом стационаре в период январь-апрель 2009 г. выявлено 58 штаммов, вызвавших ГСИ различной локализации у больных отделения экстренной хирургии (ЭХО) – 20, торакального хирургического отделения (ТХО) – 18, отделения острой сердечно-сосудистой хирургии (ОССХ) – 4 и отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) – 16. На основании антибиотикограмм штаммов P. aeruginosa были выявлены наиболее распространенные антибиотикофенотипы (Таблица 19-А). Учитывая, что подавляющее большинство штаммов образовывало пигмент и проявляло гемолитическую активность, тогда как выраженность фосфолипазной активности (ФЛА) и способность к биопленкообразованию (ПО) варьировали, именно последние два признака были выбраны для популяционной характеристики изолятов (Таблица 19-Б). Таблица 19 Встречаемость профилей антибиотикорезистентности(А) в сочетании с факторами патогенности (Б) у штаммов P. aeruginosa, изолированных в многопрофильном ЛПУ А Профиль антибиотикорезистентности n/% Цефтазидим+цефепим+имипенем+гентамицин+амикацин +ципрофлоксацин 22/37,9 (фенотип А) Цефтазидим+цефепим+имипенем+гентамицин+ципрофлоксацин (фенотип В) Цефепим+имипенем+гентамицин+ципрофлоксацин (фенотип С) Цефтазидим+цефепим (фенотип D) 4/6,9 10/17,2 4/6,9 Другие фенотипы (встречается не более чем у 3-х штаммов) Чувствительные штаммы 16/27,6 2/3,4 Б 119 Сочетание признаков Количество штаммов, n/% Отделение Всего ЭХО ТХО ОРИТ ОССХ Фенотип А + ФЛА + ПО 4 2 8 2 16/27,6 Фенотип А + ПО 2 2 – – 4/6,9 Фенотип С + ФЛА + ПО – 3 2 – 5 /8,6 В связи с высокой частотой встречаемости в различных отделениях сходных по свойствам вариантов закономерно возникал вопрос, не становятся ли госпитализированные в ОРИТ пациенты причиной распространения высоковирулентных штаммов при переводе их в другие отделения. Установлено, что на определенном этапе стационарного лечения 38 (65,5%) человек из 58 госпитализированных и инфицированных P. aeruginosa являлись пациентами ОРИТ. В шести случаях культуры P. aeruginosa были выделены от больных до пребывания в ОРИТ, в шестнадцати – после перевода в профилированное отделение, от остальных 16 человек – во время их лечения в ОРИТ. Молекулярно-генетическое исследование выявило, что большинство штаммов P. aeruginosa, изолированных в ОРИТ, представляют один геномовариант (Рисунок 24-А). Идентичный генетический профиль был обнаружен у ряда культур, изолированных от пациентов других отделений: ЭХО – 6 (30 %) штаммов, ТХО – 4 (22,2 %) штамма, ОССХ – 2 штамма (все пациенты прошли лечение в ОРИТ). Установлено, что некоторые изоляты имели сходные ERIC-паттерны с основным («модальным») вариантом, но отличались на 1-2 генетическое событие и, по-видимому, являлись близкородственными. Наблюдалось некоторое несоответствие между данными фенотипического и генетического анализа: не все штаммы, принадлежащие к одному геномоварианту, были фенотипически идентичны. При использовании только бактериологического метода эти культуры были нами приняты за разные изоляты. Выявлено значительное количество штаммов P. aeruginosa, не имеющих отношения к модальному штамму. Наибольшее число таких культур обнаружено в ТХО – 7 и ЭХО – 6, при этом, среди них встречались и идентичные изоляты (Рисунок 24-Б). Гетерогенность ERICпрофилей возбудителей, изолированных в этих отделениях, может свидетельствовать о внебольничном происхождении большинства штаммов. Наше предположение о циркуляции госпитального штамма в многопрофильном ЛПУ, сделанное на основе фенотипических характеристик культур, подтвердилось с помощью молекулярно-генетического анализа. Идентичные и/или схожие геномоварианты штаммов P. aeruginosa были обнаружены во всех отделениях, причем на протяжении всего периода исследования. Принимая во внимание, что доля пациентов, проходящих через ОРИТ, во всех отделениях стационара составила от 13,5 до 120 22,9%, можно полагать, что колонизация/ инфицирование пациентов внутрибольничными штаммами происходит именно в ОРИТ с последующим распространением по отделениям. Тот факт, что внебольничные варианты зачастую оказывались полирезистентными, свидетельствует о том, что традиционный маркер госпитальности – антибиотикоустойчивость – не является основополагающим применительно к P. aeruginosa. 1 2 3 4 5 6 7 А 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 Б 5 6 7 8 9 10 Рисунок 24. Пример электрофоретического анализа продуктов ERIC-ПЦР клинических изолятов P. aeruginosa, изолированных (А): 1-15 – в ОРИТ; (Б): 1-5 – в ТХО; 6-10 – в ЭХО. 4.3.3. Генетическое разнообразие blaOXA-50-like как основа выявления родства изолятов P. aeruginosa У ряда штаммов P. аeruginosa, выделенных от больных хирургических стационаров взрослой сети г. Перми (ГКБ №4, ККБ, ЛКБ, МСЧ №9), г. Березники (БЦГБ) и г. Чайковский (ЧЦКБ), проведено секвенирование blaOXA-50-ампликонов, полученных с праймерами A/AS (Рисунок 25). М 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 М 1000 п.н. → 700 п.н. → Рисунок 25. Пример электрофоретического анализа продуктов амплификации с праймерами A/AS: М – маркер молекулярных масс 1 kb, 1-16 – изоляты P. aeruginosa. Сравнение нуклеотидных последовательностей blaOXA-50 выявило, P. aeruginosa, выделенные в разных ЛПУ, имели сходные гены, например что штаммы blaOXA-50g-like (GenBank AM117127.1), и, наоборот, в одном ЛПУ могли циркулировать изоляты с различными оксациллиназами (Таблица 20). Следует отметить, что штаммы, отнесенные к одной геномогруппе по результатам генотипирования в RAPD-ПЦР, содержали blaOXA-50- последовательности с идентичными нуклеотидными заменами. По-видимому, обнаружение идентичных оксациллиназ может служить дополнительным критерием их родства. Такая 121 возможность основана на двух известных фактах: продукция данных ферментов может считаться видовым признаком P. aeruginosa, но существует большое число различных OXA50like бета-лактамаз (Girlich D. et al., 2004). Таблица 20 Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов blaOXA-50-like нозокомиальных изолятов P. aeruginosa ЛПУ/ штамм Размер фрагмента, п.н. (расположение на гене Сходство с наиболее близким гомологичным геном P. aeruginosa из тидные blaOXA-50, ген 789 п.н.) ГКБ Нуклео- замены GenBank, % 116 641 c 149 по 789 blaOXA-50a AY306130.1 99 T153C 3-4* 565 c 64 по 628 blaOXA-50g AM117127.1 100 - 3-6* 555 c 97 по 651 3-7* 587 c 62 по 648 3-9* 682 c 35 по 716 7-1 660 c 130 по 789 blaOXA-50c AY306132.1 100 - Пр6** 547 c 75 по 621 blaOXA-50-like AY306135.1 99 C145T Пр9** 688 c 23 по 710 HQ8330.038 99 G500A AY306132.1 99 G222T 100 - AY306134.1 ККБ 197 642 c 148 по 789 blaOXA-50c ОРИТ 198 729 c 61 по 789 blaOXA-50c 203 727 c 62 по 788 60 724 c 66 по 789 blaOXA-50c AY306132.1 99 G67A 712 с 22 по 733 blaOXA-50a AY306130.1 98 T153C ЛКБ МСЧ №9 МПр1 - ОРИТ С327Т А334G С508А А642G МПр5 725 c 6 по 730 blaOXA-50g AM117127.1 100 - БЦГБ Б4 777 С 12 по 789 blaOXA-50g AM117127.1 100 - ЧЦГБ Ч2 608 c 78 по 685 blaOXA-50-like AY306135.1 99 G600A 99 C443T AY306134.1 AM117128.2 Ч3 602 c 24 по 625 blapoxB AY597444.1poxB Примечание: *ОРИТ, **ОССХ – кардиохирургическое отделение. 122 Проверку данной гипотезы осуществили при расследовании вспышки синегнойной инфекции среди новорожденных в г. Перми. В период с января по июнь 2008 г. среди новорожденных, находившихся в ОРИТ крупного акушерского стационара г. Перми, возникла вспышка синегнойной инфекции с количеством пострадавших 37 человек. Фактором риска распространения синегнойной инфекции явилась процедура ИВЛ. Сравнение антибиотикограмм культур P. aeruginosа, выделенных от новорожденных в этот период, выявило, что 80,7% штаммов имели сходные фенотипические характеристики. Поводом для углубленного динамического исследования культур P. aeruginosa послужило широкое распространение носительства синегнойной палочки среди новорожденных, переведенных из акушерского отделения в ОРИТ того же ЛПУ, где проходили роды, а в последующем госпитализированных в неонатальные отделения других детских больниц (второй этап выхаживания новорожденных). Более того, штаммы P. aeruginosa с близким антибиотикофенотипом стали изолировать от детей, поступающих в детские больницы из других акушерских стационаров. Предварительно методом RAPD-ПЦР было проведено генотипирование «вспышечных» штаммов P. aeruginosa (n=125). В результате было обнаружено, что подавляющее большинство (n=111) из них отнесено к 3 геномовариантам и они оценены как близкородственные (Рисунок 26-А). Данные культуры, скорее всего, являлись результатом персистирования «модального» штамма в отделениях акушерского стационара и двух детских больницах. Несколько штаммов имели другие отличающиеся генетические профили. Для подтверждения гипотезы о возможности использования сравнительного анализа нуклеотидной последовательности blaOXA-50 для выявления родства изолятов P. aeruginosa дополнительно выполнена его специфическая амплификация и секвенирование. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что большая часть штаммов P. aeruginosa, циркулирующих в момент вспышки в акушерском стационаре и детских больницах, имеют последовательности на 100% идентичные гену blapoxB (blaOXA-50-like) P. aeruginosa MF 6 (GenBank AY597439.1, AAT09630.1) (Рисунок 26-Б). Геномы 2-х изолятов содержали последовательность blaOXA-50I-like P. aeruginosa KSM PAE0922 (GenBank HQ833036.1, AEK06328.1) и одного – blaOXA-50-like P. aeruginosa P23 (GenBank GQ141728.1, ACS45294.1). Такое единообразие, учитывая вариабельность OXA-50-подобных генов, позволило выявить формирование эпидемически значимого клона в замкнутом контуре: акушерский стационар – неонатальные отделения детской клиники. 123 А Б Рисунок 26. Результаты молекулярно-генетического исследования изолятов: A – пример электрофоретического анализа продуктов RAPD-ПЦР с использованием праймера М13; 1-17 – изоляты, выделенные от новорожденных; Б – древо сходства нуклеотидных последовательностей генов blaOXA-50 бактерий P. aeruginosa, построенное методом UPGMA: 27f39f – анализируемые нозокомиальные штаммы, остальные – номера последовательностей, депонированных в GenBank. 4.4. Молекулярные механизмы устойчивости нозокомиальных штаммов P. aeruginosa к бета-лактамным антибиотикам 4.4.1. Распространенность оксациллиназ с БЛРС-фенотипом Исследовано 178 штаммов P. aeruginosa, выделенных в 2008-09 гг. от больных крупных хирургических, детского и акушерского стационаров г. Перми. Специфическая амплификация с праймерами ABD1/ABD4 к ферменту OXA-10 и его производным была выявлена у 26 изолятов, выделенных преимущественно в трех ЛПУ взрослой сети: ГКБ№4, ККБ и ЛКБ (Рисунок 27), и только в двух случаях в детских ЛПУ. Нужно отметить, что большая часть детектированных 124 фрагментов соответствовала размеру предполагаемого участка гена blaOXA-10 – 775 п.н. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 –1000 п.н –1000 п.н Рисунок 27. Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных с праймерами ABD1/ABD4: 1, 15 – маркеры молекулярных масс; 2-14; 16-31 – клинические изоляты. У семи изолятов из разных ЛПУ (ГКБ 4 – 1-6, 1-12, 1-18; ККБ – 203; ЛКБ – 2пл, №7, №9) определены нуклеотидные последовательности ампликонов, полученных с праймерами ABD1/ABD4, и выявлено, что все они являются оксациллиназами OXA-14-like, которая характеризуется БЛРС-фенотипом (Таблица 21). Фермент отличается от OXA-10 аминокислотной заменой Gly157Asp (443-445 п.н., GGC на GAC). Таким образом, у некоторых исследованных штаммов, фенотипически устойчивых к одному или ряду БЛА, эта устойчивость была связана, в том числе, и с продукцией оксациллиназ (нельзя исключить другие механизмы и возможную продукцию бета-лактамаз иных классов). Таблица 21 Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов blaoxa-10-like Штамм 2F 2пл 4F №7 5F №9 9F 1-6 12F 1-12 13F 1-18 14 F 203 Размер секвенированного фрагмента, п.н. (расположение на гене blaOXA-10) 647 c 119 по 764 692 c 67 по 758 693 c 65 по 757 692 c 66 по 757 681 с 68 по 748 681 с 68 по 748 599 с 67 по 664 Сходство с наиболее близким гомологичным геном Pseudomonas aeruginosa из GenBank, % blaOXA-14 Pseudomonas aeruginosa 455, GenBank L38523, AAA93528.1 100 Источник Danel F. et al., 1995 125 4.4.2. Поиск и изучение генов, кодирующих металло-бета-лактамазы Исследовано 178 штаммов P. aeruginosa, выделенных в 2008-09 гг. от больных крупных хирургических, детского и акушерского стационаров г. Перми. Установлено, что значительный процент культур P. aeruginosa, циркулирующих в лечебных стационарах города, составляли карбапенемоустойчивые штаммы (Таблица 22). Следует отметить, что этот показатель значительно варьировал в разных ЛПУ: от 16,6 % в РД до 89,7% в ГКБ, а все исследованные культуры, полученные из ОРИТ ККБ, ИС и ЛКБ, были устойчивы к карбапенемам. 100%-ая устойчивость изолятов к препаратам этой группы, по-видимому, объясняется небольшой выборкой штаммов, изолированных в короткий период времени (возможно вспышка внутрибольничной инфекции) и не может свидетельствовать об истинной распространенности резистентности к карбапенемам в данных стационарах. Доля меропенемоустойчивых штаммов синегнойной палочки в целом составила 42,1%, имипенемоустойчивых – превысила половину исследованных изолятов. Таблица 22 Встречаемость карбапенемонечувствительных культур в стационарах города (n / %) ЛПУ (n) Антибактериальный препарат Меропенем Имипенем М+И М или И ГКБ (58) 39/67,2 48/82,8 35/60,3 52/89,7 ККБ (6) 6/100 6/100 6/100 6/100 ИС (19) 5/26,3 16/84,2 5/26,3 16/84,2 ЛКБ (8) 4/50 8/100 4/50 8/100 РД (36) 3/8,3 6/16,6 3/8,3 6/16,6 ДКБ (51) 18/35,3 16/31,4 10/19,6 24/47,1 Всего (178) 75/42,1 100/56,2 63/35,4 112/62,9 Примечание: включены штаммы с промежуточной резистентностью. В многопрофильном стационаре и к имипенему, и к меропенему были резистентны 60,3% штаммов P. aeruginosa. Из 48 имипенеморезистентных штаммов нечувствительными к меропенему были 72,9%, а из 39 штаммов, устойчивых к меропенему, нечувствительными к имипенему – 89,7%. Отмечено, что 28 (53,8%) штаммов P. aeruginosa, устойчивых к этим препаратам, оказались нечувствительными и к цефтазидиму. При анализе данных по ассоциированной устойчивости к аминогликозидам и фторхинолонам установлено, что 30 имипенемо- и/или меропенеморезистентных штаммов были резистентны к амикацину и 44 – к ципрофлоксацину. Аналогичная ситуация наблюдалась и в других ЛПУ. В частности, в ЛКБ 62,5% штаммов устойчивы к цефтазидиму и амикацину, и каждый второй – к 126 ципрофлоксацину. В ОРИТ ККБ и ИС все изоляты оказались полирезистентными. Самая благоприятная ситуация выявлена в РД, где 6 штаммов из 36 (16,6%) были устойчивыми к карбапенемам, из которых только один изолят был резистентным к цефтазидиму при 100%-ой чувствительности к ципрофлоксацину и амикацину. В детском стационаре выявлено 24 (47,1%) карбапенеморезистентных штамма P. aeruginosa, из них только 3 культуры оказались устойчивыми к амикацину и 2 – к ципрофлоксацину. Поскольку сочетанная устойчивость к меропенему и имипенему, выявленная у каждого третьего изолята, может быть обусловлена продукцией карбапенемаз, дальнейшее исследование было направлено на поиск этих ферментов. У 49 штаммов синегнойной палочки фенотипически (Рисунок 28-А) выявлена выработка МБЛ: ГКБ – 34, ККБ – 6, ИС – 5, ЛКБ – 4. Для данных культур синегнойной палочки была определена минимальная подавляющая концентрация (МПК) меропенема. У 41 штамма P. aeruginosa МПК меропенема была 32 мкг/мл и выше (Рисунок 28-Б). Высокий уровень устойчивости (МПК>32 мкг/мл) также может свидетельствовать о механизме ферментативной инактивации карбапенемов (Bush K., 1998). А Б Рисунок 28. Пример фенотипической детекции продуцентов МБЛ с помощью метода двойных дисков (А) и распределение положительных в ЭДТА-тесте штаммов P. aeruginosa по значениям МПК меропенема (Б). Среди штаммов, обладающих фенотипическими признаками продукции β-лактамаз класса В, методом ПЦР проведен скрининг на наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей blaVIM-2, blaIMP-2, blaSPM-1, blaGIM-1. Специфичная амплификация с праймерами VIM-1F/R и VIM-2F/R была обнаружена у 34 (19,1%) штаммов, изолированных из трех стационаров (ГКБ, ККБ, ЛКБ) (Рисунок 29). Амплифицированные участки ДНК длиной около 260 п.н. соответствуют по размеру консервативной части генов группы VIM, а ДНКфрагменты размером 801 п.н. – полному blaVIM-2-гену. Амплификация с праймерами к фланкирующим участкам генов других МБЛ не дала положительного результата. 127 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 801 п.н 261 п.н. А Электрофореграмма Рисунок 29. продуктов Б амплификации консервативных последовательностей (А) и полных генов blaVIM-2 (Б), детектированных у изолятов P. aeruginosa: 1, 9 – 129 (ГКБ), 2,10 – 3-16 (ГКБ), 3, 11 – 198 (ККБ), 4, 12 – 2ПЛ (ЛКБ), 5, 13 – 31 (ЛКБ), 6, 14 – 60 (ЛКБ,); 7 – маркер молекулярных масс pUC19 ДНК/MspI; 8 – маркер молекулярных масс O’GeneRulerTM 100bp Plus DNA. ПДРФ-анализ амплифицированных участков. Для выявления сходства и различий между исследуемыми генами, кодирующими VIM-карбапенемазы, был проведен анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных последовательностей. Набор рестрикционных фрагментов, полученный после обработки ампликонов blaVIM-2-гена исследуемых штаммов рестриктазой HindII, был представлен последовательностями ДНК длиной 414 и 387 п.н. (Рисунок 30-А). Длины полученных рестрикционных фрагментов сопоставимы с длинами участков на рестрикционных картах гена blaVIM-2 известных карбапенеморезистентных штаммов P. aeruginosa (Рисунок 30-Б). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 400 п.н.- А Б Рисунок 30. Электрофореграмма гидролиза ПЦР-продуктов амплификации blaVIM-2-гена, обработанных HindII (А): 1,12 – маркер молекулярных масс O’GeneRulerTM 100bp Plus DNA Ladder; 2, 13 – ампликоны blaVIM-2- гена; 3-15 – изоляты P. aeruginosa; и карты расположения сайтов рестрикции эндонуклеазы HindII на генах blaVIM (Б): карты построены с помощью программы Vector NTI для известных последовательностей, кодирующих МБЛ основных ферментов группы VIM (подгруппа VIM-1 – карта на примере blaVIM-1 идентична картам других ферментов 128 данной подгруппы, подгруппа VIM-2 – карта на примере blaVIM-2 соответствует картам остальных ферментов данной подгруппы за исключением blaVIM-13). Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности амплифицированных фрагментов blaVIM-2. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов и полных генов МБЛ группы VIM, амплифицированные с ДНК штаммов P. aeruginosa 3-16, 127, 2ПЛ, 31, 60, 198, являющихся представителями разных геномогрупп. Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов длиной около 260 п.н. исследуемых штаммов показал их 100% сходство между собой, а также с известными последовательностями гена blaVIM-2 на участке с 114 по 353 нуклеотид. Исследуемые фрагменты ДНК размером 615741 п.н. были на 99-100% сходны с последовательностью blaVIM-2-гена известных штаммов (Таблица 23, Рисунок 31). Степень сходства с геном blaVIM-2 референтного штамма P. aeruginosa COL-1 (GenBank AF191564.1) составила 99-100%. Обнаружены точечные нуклеотидные замены в последовательностях исследуемого гена у 4 штаммов. Таблица 23 Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов полных генов blaVIM-2 Штамм Размер секвенированного Сходство с фрагмента, п.н. (расположение на blaVIM-2 гене blaVIM-2 P. aeruginosa COL-1) P. aeruginosa Нуклеотидные Аминокислотные замены* замены* COL-1, % 2ПЛ 665 с 24 п.н. по 689 п.н. 99,9 Т85С S29P 31 637 с 68 п.н. по 704 п.н. 99,9 T85C S29P 60 615 с 51 п.н. по 665 п.н. 100 - - 3-16 741 с 61 п.н. по 801 п.н. 99,9 T85C S29P 127 678 с 97 п.н. по 774 п.н. 99,9 G744A нет замены 198 637 с 63 п.н. по 698 п.н. 100 - - Примечание: * – номер замены соответствует месту нуклеотида и аминокислотного остатка от начала открытой рамки считывания (ORF) blaVIM-2. На основании полученных данных установлены частичные аминокислотные последовательности (193-246 а.о.) фермента. У штаммов P. aeruginosa 2ПЛ, 31 и 3-16 обнаружена точечная мутация blaVIM-2-гена в позиции 85, несущая замену серина на пролин, которая характерна для генов, кодирующих ферменты подгруппы VIM-1 и VIM-7 (Lauretti L. et al., 1999; Toleman M.A. et al., 2007). Учитывая, что эта область лидерного пептида, который отщепляется при транслокации белка через мембрану и не содержится в «зрелом» энзиме, данная замена не влияет на связывание фермента с субстратом – антибиотиком. 129 Рисунок 31. Древо сходства нуклеотидных последовательностей полных генов металлобета-лактамаз (группа VIM) бактерий рода Pseudomonas, построенное методом UPGMA: “Bootstrap”-анализ проведен на 1000 повторностях. Жирным крупным шрифтом выделены штаммы, исследуемые в данной работе. В скобках указаны номера последовательностей, депонированных в GenBank, или обозначение штамма. Таким образом, устойчивость к карбапенемам 34 (19,1%) культур P. aeruginosa, изолированных из стационаров г. Перми и п. Лобаново, обусловлена продукцией ими МБЛ группы VIM, и в частности – фермента VIM-2. Можно предположить, что в ЛПУ взрослой сети Пермского края циркулируют преимущественно продуценты VIM-2-подобных ферментов. Полученные результаты согласуются с литературными данными о распространенности VIM-2обусловленной карбапенеморезистентности внутрибольничных штаммов P. aeruginosa в России и странах Европы (Poirel L. et al., 2000; Эйдельштейн М.В. и соавт., 2012). Необходимо отметить, что продуценты VIM-2 МБЛ встречались в последующий период наблюдения (201012 гг.) как в этих, так и в других ЛПУ Перми и Пермского края (МСЧ №9, КЦГБ, БЦГБ), но следует еще раз подчеркнуть, что подобные штаммы обнаруживали только во взрослой медицинской сети. Недавние исследования, проведенные Фельдблюм И.В. и соавт. (2013), также не обнаружили blaVIM-2 или генов других бета-лактамаз в культурах P. aeruginosa, вызывающих ГСИ новорожденных или циркулирующих во внутрибольничной среде акушерских стационаров. 130 Детекция интегронов. Молекулярный скрининг ДНК штаммов P. aeruginosa, продуцирующих МБЛ, на наличие интегронов 1 класса выявил данные последовательности во всех изолятах, что вполне ожидаемо, учитывая интегрон-зависимую локализацию данной группы ферментов. Интегроны были обнаружены и у ряда штаммов (1-6, 1-8, 1-12, №7, 9-6), продуцирующих оксациллиназы. У 9-и штаммов (197, 198, 203, Н1, Н2, Н3, Н5, 619, 863) детектированы обе группы ферментов. Размер основной части ампликонов был ≈1300 п.н., несколько ампликонов были большего размера ≈1700 п.н. (Рисунок 32). А М 197 198 203 Н1 Н2 Н3 Н5 МПр5 Б4 619 863 127 3-6 3-16 3-22 3-25 М1 Б М1 1-6 6кр 1-9 1-8 1-12 197 891 120 9-6 №7 9-8 203 Рисунок 32. Пример электрофореграммы продуктов амплификации с праймерами 5'CS/3'CS у штаммов P. aeruginosa, продуцирующих МБЛ (А) и оксациллиназы (Б): М – маркер молекулярных масс 1 kb+1,5 kb; М1 – маркер молекулярных масс 1 kb+2 kb+3 kb. При определении нуклеотидных выявлено, что в их составе чаще последовательностей полученных всего присутствует ген aadA6, ампликонов кодирующий аминогликозид(3'')аденилилтрансферазу (Таблица 24). Штамм P. aeruginosa 197, выделенный из ККБ, – ген aac6'-Ib, экспрессирующий аминогликозид(6')ацетилтрансферазу и blaPSE-1. Продукция ацетилтрансферазы AAC(6')-I является наиболее частой причиной резистентности к амикацину у псевдомонад, и кроме амикацина эти ферменты способны ацетилировать такие аминогликозидные антибиотики, как тобрамицин, сизомицин, нетилмицин, канамицин (Решедько Г.К., 1999). Учитывая отсутствие blaVIM-2-генов в составе данных 131 последовательностей, можно полагать, что большинство изолятов несут сразу несколько интегронов 1 класса с разным набором генов антибиотикорезистентности. Таблица 24 Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов, полученных с праймерами 5'CS/3'CS Штамм 197 (ККБ) Размер КонсенСходство с наиболее фрагмента сус, п.н. близким гомологичным п.н. геном из GenBank 2F 876 blaPSE-1 (beta-lactamase PSE-1) HQ832476.1; ADZ16826.1 2R 198 (ККБ) Н5мокрота (ККБ) Н3 ИТТ (ККБ) 3-16 (ГКБ) Пр5 (МСЧ 9) 863 (КЦГБ) 619 (КЦГБ) 864 1F/1R 1236 3F/ 3R 1193 4F/4R 1216 5F/5R 1132 6F/6R 1227 7F/7R 1235 8F/8R 1237 IntI1 (integrase of class 1 integron) aac6'-Ib (aacA4) aminoglycoside acetyltransferase) EU503121.1; ACJ05192.1 aadA6 (aminoglycoside adenylyltransferase) JF826498.1; AET25360.1 gcuD (OrfD, hypothetical protein) AET25359.1 Положе- Штамм-источник, ние в ссылка геноме 1193 P. aeruginosa K-88 (Kuzhelnaya E.N. et 328 al., 2005) 7807 P. aeruginosa 7157 MusCAТ (Philippon L.N., Naas T. et al., 1997) 24180 25415 24209 25405 24178 25350 24180 25311 24208 25434 24178 25415 24181 25416 P. aeruginosa C79 (Martinez E. et al., 2010) 4.5. Генетические профили цитотоксичности штаммов P. aeruginosa Референтный штамм P. aeruginosa АТСС®27853 (exoS+/exoU -) использовали в качестве положительного контроля для детекции exoS. Предварительный анализ секвенированного фрагмента (921 п.н.) ампликона (1038 п.н.), полученного с праймерами ExoUF/ExoUR на матрице ДНК штамма P. aeruginosa 63, показал полную идентичность фрагменту exoU P. aeruginosa PA103 на участке 1521-2440 (GenBank № U97065.1) (Finck-Barbancon V. et al., 1997). Штамм был использован как положительный контроль для последующих исследований. В результате скрининга внутри- и внебольничных штаммов коллекции (n=194) на присутствие генов, кодирующих эффекторы TTSS, выявлено, что специфичная амплификация 132 exoS и exoU была положительной у 109 (56,19%) и 53 (27,32%) штаммов соответственно, в 32 (16,49%) случаях не было обнаружено ни exoS, ни exoU (Рисунок 33). А М 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 М 17 8 М 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 М Б М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 М 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 М В М 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 М Рисунок 33. Пример электрофореграмм продуктов амплификации генов exoS – А и exoU – Б, В у изолятов P. aeruginosa: М – маркер молекулярных масс 1 kb+2kb+3kb; 1-49 – клинические изоляты. При сравнении двух групп: нозокомиальные изоляты (n=164) и штаммы, выделенные от больных, обратившихся в поликлинику (n=30), оказалось, что exoS и exoU присутствовали в геноме первой группы достоверно чаще (φ=0,168; p=0,0191 и φ=0,198; p=0,0058 соответственно), но связь была очень слабая. Анализируя только внутрибольничные изоляты, штаммы разделили на группы ОРИТ и «неОРИТ». Выявлено, что распространенность exoS была выше в «неОРИТ» группе (φ=0,322; p=0,0000), и наоборот, штаммы с генотипом exoS-/exoU+ преобладали среди изолятов ОРИТ (φ=0,466; p=0,0000) (Таблица 25). В геноме штаммов, изолированных из мокроты, гены exoS и exoU обнаружены в 56,63 и 39,76% случаев соответственно. В то же время в исследованиях Lanotte P. и соавт. (2004) и Wolska K. и Szweda P. (2009) exoS детектирован более, чем в 80% «легочных» изолятов. Предположительно, такая разница объясняется тем, что в первом случае авторы исследовали штаммы, полученные только от пациентов с муковисцидозом, а во втором – маленькой выборкой (n=9). Важно подчеркнуть, что в нашем исследовании из 83 штаммов из мокроты 65 были 133 выделены от пациентов ОРИТ, где могут концентрироваться высоковирулентные exoS-/exoU+эковары. Доля exoS+-штаммов, изолированных из мокроты «неОРИТ»-пациентов, составила 77,78%. В изолятах из раневого отделяемого преобладал генотип exoS+/exoU-. Высокая встречаемость гена ExoS-эффектора в изолятах из раневого отделяемого показана и другими авторами (Wolska K., Szweda P., 2009). Из семи изолятов, полученных из перитонеальной жидкости, exoS встречался в двух, а exoU – в четырех случаях. Ген exoS детектировали в пяти штаммах из семи, изолированных из фекалий, exoU в подобных вариантах не обнаруживали. Однако достоверной связи между присутствием соответствующих эффекторов и материалом выделения штаммов не выявлено. Таблица 25 Встречаемость exoS и exoU в геноме клинических изолятов P. aeruginosa Группы Ген-мишень, n/% exoS exoU Мокрота/БАЛЖ (n=83) 47/56,63 33/39,76 Рана (n=46) 33/71,74 5/10,87 ОРИТ (n=95) 44/46,32 47/49,47 «неОРИТ» (n=69) 54/78,26 4/5,80 0/0 38/95 Не продуценты МБЛ (n=124) 98/79,03 13/10,48 Всего (n=164) 98/59,76 51/31,10 Продуценты МБЛ (n=40) Штаммы, не продуцирующие МБЛ, достоверно чаще содержали в геноме exoS (79,03%), а не exoU (10,48%). При этом у 38 (95%) продуцентов МБЛ выявлен exoU, у двух штаммов не обнаружен ни один из исследуемых генов. Возможно, exoU достоверно чаще встречается у МБЛ-продуцентов (φ=0,784; p=0,0000) в связи с эпидемическим распространением клона P. aeruginosa ST235 VIM-2, циркуляция которого на всей территории России показана Эйдельштейном М.В. и соавт. (2012). Факт ассоциации exoU с P. aeruginosa ST235 подтвержден исследованиями последних лет (Maatallah M. et al., 2011; Lee J.Y. et al., 2013). Обнаружена статистически значимая умеренная связь между наличием в геноме blaVIM2 и выделением штамма из ОРИТ (φ=0,369; p=0,0343). 4.6. Использование мультилокусной ПЦР-тест системы в оценке клиникоэпидемиологической значимости изолятов P. aeruginosa Для быстрой оценки эпидемиологической ситуации целесообразно применение новых методов индикации, позволяющих одновременно обнаружить микроорганизм и 134 охарактеризовать его значимость наличие (определить маркеров патогенности и антибиотикоустойчивости) (Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В., 2000). Оптимальным решением этой задачи является применение мультилокусной ПЦР. Проведена оценка экспрессной индикации P. aeruginosa на основе мультиплексной ПЦР, позволяющей одновременно оценивать таксономическую принадлежность, определять наличие маркеров патогенности и антибиотикоустойчивости. Учитывая, что наибольшую проблему в клинической практике представляют изоляты P. aeruginosa, продуцирующие МБЛ, из которых в России наиболее распространены VIM2-ферменты, а также то, что колонизацию и цитотоксичность бактерий связывают в первую очередь с эффекторами TTSS ExoS и ExoU, гены, кодирующие данные последовательности, и были использованы в качестве ДНКмишеней. Использовали восемь штаммов P. aeruginosa, выделенных от пациентов ОРИТ хирургических стационаров. Маркерами для экспрессной индикации P. aeruginosa служили полные нуклеотидные последовательности или фрагменты генов: exoA, exoS, exoU, blaVIM2, экспрессирующих синтез экзотоксина А, эффекторные белки системы III типа секреции и МБЛ подгруппы VIM2 соответственно (Рисунок 34). М 1 2 exoA 3 4 5 6 М1 1 exoS+exoA 2 3 4 5 6 М1 1 blaVIMcons 2 3 4 5 6 7 8 М1 1 2 exoU 3 4 5 6 exoU+blaVIM2 2 3 4 5 6 7 7 8 М1 1 7 exoU+blaVIMcons 8 М1 1 2 3 4 5 6 7 7 8 blaVIM2 1 2 3 4 5 6 7 8 М1 8 1 exoA+exoU+blaVIM2 2 3 4 5 6 7 8 М1 exoA+exoU+blaVIMcons 8 1 2 3 4 5 6 7 8 М1 Рисунок 34. Примеры электрофореграмм продуктов амплификации генов exoA, exoS, exoU, blaVIM2 в моно- и микст вариантах: М – маркер молекулярных масс 700 bp Plus DNA Ladder; М1 – маркер молекулярных масс 1 kb+2kb+3kb; 1 – E. coli, 2 – P. aeruginosa exoS-/exoU-; 135 3,4 – P. aeruginosa exoS+/blaVIM2-; 5,6 – P. aeruginosa exoU+/blaVIM2-; 7,8 – P. aeruginosa exoU+/blaVIM2+. Предложенные на настоящий момент мультиплексные ПЦР чаще всего решают какуюто одну задачу в отношении P. aeruginosa – ее идентификация (Le Gall F. et al., 2013), определение цитотоксичности и/или вирулентности (Ajayi T. et al., 2003; Shi H. et al., 2012), а также наличия детерминант антибиотикорезистентности (Шевченко О.В. и соавт., 2007; Monteiro J. et al., 2012). Использование мультилокусной ПЦР-тест-системы для выявления целых или внутренних фрагментов генов, детерминирующих распространенного типа МБЛ VIM2, маркера цитотоксичности синтез наиболее ExoU с одновременным подтверждением видовой принадлежности, позволяет получить экспрессную комплексную оценку свойств изолятов P. aeruginosa в контексте их эпидемиологической и клинической значимости. Таким образом, наши экспериментальные исследования показали эффективность методов «классической бактериологии», которые совершенно правомерно используются в рутинной лабораторной диагностике при идентификации P. aeruginosa. При эпидемиологическом мониторинге P. aeruginosa, необходимо дополнительно использовать молекулярные методы, эффективность которых повышает применение мультиплексной ПЦР с одновременным обнаружением микроорганизмов, определением детерминант антибиотикоустойчивости и оценкой их патогенного потенциала. Учитывая ограниченную способность фенотипических методов для типирования P. aeruginosa, как по биологическим свойствам, так и по признаку резистентности к АБП, использование молекулярно-генетических технологий для установления родства изолятов также может быть приоритетным. 136 ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P. AERUGINOSA В отличие от многих представителей неферментирующих бактерий синегнойная палочка обладает многочисленными факторами патогенности, спектр и сила проявления которых обеспечивают высокую фенотипическую гетерогенность популяции. Вопросы о своеобразии фенотипов штаммов, циркулирующих в определенном отделении/стационаре, возможности оценки их патогенного потенциала, адаптивных свойств и принадлежность к госпитальному эковару остаются дискутабельными. 5.1. Разнообразие фенотипов клинических штаммов P. aeruginosa Исследовано 143 штамма P. aeruginosa, изолированных от больных крупных хирургических стационаров г. Перми (Таблица 26). Таблица 26 Встречаемость факторов вирулентности у штаммов P. aeruginosa, изолированных в различных хирургических стационарах ЛПУ Отделение Число ПЦН ГА ФЛА изолятов, n n % n % n % ЭХО 20 20 100,00 20 100,00 12 60,00 ТХО 18 18 100,00 18 100,00 16 88,89 ОССХ 4 4 100,00 4 100,00 4 100,00 ОРИТ 20 20 100,00 20 100,00 17 85,00 ККБ ОРИТ 16 14 87,50 14 87,50 16 100,00 МСЧ №9 ОРИТ 3 3 100,00 3 100,00 3 100,00 ТХО 5 4 80,00 4 80,00 3 60,00 ОРИТ 14 12 85,71 14 100,00 14 100,00 РО 12 10 83,33 10 83,33 5 41,67 ЛКБ ОРИТ 8 2 25,00 4 50,00 4 50,00 БЦГБ ОРИТ 18 17 94,44 16 88,89 16 88,89 КЦГБ ОРИТ 3 3 100,00 3 100,00 3 100,00 ЧЦГБ ОРИТ 2 2 100,00 2 100,00 2 100,00 143 129 90,21 132 92,93 115 80,42 ГКБ 4 ИС Всего При традиционном определении факторов патогенности – пиоцианинообразования (ПЦН) и гемолитической активности (ГА) на кровяном агаре и продукции фосфолипазы (ФЛА) 137 на LB-агаре с добавлением желтка, подавляющее большинство изолятов всех ЛПУ проявляли эти признаки. Пиоцианин продуцировало 90% всех исследованных культур, при этом нужно отметить, что не все изоляты, выделенные из ОРИТ, были пигментообразующими, и наоборот, штаммы, выделенные от пациентов из других отделений, в большом проценте, а иногда и в 100% случаев давали изменение окраски среды. Это же показано для гемолитической и фосфолипазной активности. Учитывая, что нет статистически значимой разницы между выделением изолята из ОРИТ и частотой встречаемости признаков, можно предположить, что в большей мере разница в распространенности штаммов, продуцирующих те или иные факторы патогенности, может быть связана не со специализацией отделения, а с биотопом выделения изолята. Анализ встречаемости изучаемых признаков среди штаммов P. aeruginosa, выделенных из различного биоматериала, показал, что чаще всего они были обнаружены у культур, изолированных из мокроты и трахеобронхиального отделяемого (Таблица 27). Таблица 27 Встречаемость изучаемых признаков среди штаммов P. aeruginosa, изолированных из различного биоматериала Материал Признак ПЦН ГА ФЛА n % n % n % Раневое отделяемое (61) 60 98,36 56 91,80 42 68,85 Мокрота, бронхиальный лаваж (72) 61 84,72 69 95,83 66 91,67 Содержимое кишечника (10) 8 80,00 7 70,00 7 70,00 Гемолитическую и фосфолипазную активность штаммы проявляли в 95,8 и 91,7% случаев соответственно. Определение степени «связанности» признаков показало, что только наличие фосфолипазы коррелирует с выделением изолята из мокроты: связь хотя и слабая, но достоверная (φ=0,285; p=0,0006). Благодаря этому свойству бактериям удается разрушать поверхностный сурфактантный слой альвеолярных мембран, содержащий значительное количество фосфолипидов, и закрепляться в зоне колонизации (Chastre J., Fagon J.Y., 2002). Следует отметить, что экспрессия факторов патогенности наблюдалась у большей части штаммов P. aeruginosa, выделенных из содержимого кишечника, что, скорее всего, обусловлено их «легочным» происхождением. Значительный процент штаммов, изолированных из раневого отделяемого, продуцировали пигмент, проявляли гемолитическую активность, но не все из них давали «радужный венчик» на желточной среде. Несмотря на слабую связь, установленную между синтезом пиоцианина и выделением изолята из раневого отделяемого, все же она была статистически значима (φ=0,237; p=0,0047). 138 5.2. Оценка пигментообразования штаммами P. aeruginosa Учитывая, что около 90% штаммов P. aeruginosa продуцируют пиоцианин, качественная оценка не дает исчерпывающей характеристики индивидуального фенотипа изолята, а, следовательно, не позволяет оценить его патогенный потенциал. Представляется также важным количественное определение еще одного экзометаболита – пиовердина, продукцию которого в бактериологических лабораториях оценивают только качественно (есть/нет флюоресценция на среде КингВ) и только для идентификации вида. Он является значимым фактором для роста микроорганизма в сыворотке крови и способствует формированию хронической инфекции в легких (Peek M.E. et al., 2012). Предварительные эксперименты по изучению динамики продукции пиоцианина и пиовердина показали, что уровень пиоцианина увеличивается в течение 3-х суток, пиовердин достигает максимальных значений к 18-24 ч (Рисунок 35). Рисунок 35. Динамика общего уровня продукции пиоцианина (ОП695) и пиовердина (усл. ед, при длине волны 460 нм после возбуждения при 400 нм) на примере P. aeruginosa АТСС 27853. При определении содержания пиоцианина и пиовердина в супернатантах суточных культур P. aeruginosa методом спектрофотометрического анализа выявлено, что штаммы значительно различались по уровню его продукции (более чем в 100 раз), как между двумя группами (внебольничные/«поликлинические» и нозокомиальные изоляты), так и в пределах своих групп (Рисунок 36). У нозокомиальных культур уровень пигментообразования варьировал от 0,065 до 0,910 ОЕ, медиана (квартили) составили 0,376 (0,195-0,587), тогда как у внебольничных штаммов – 0,146 (0,033-0,189) (p=0,000001). Для продукции пиовердина аналогичные показатели составили 4085,3 (2400,5-6280,3) и 393,5 (0-2045,8) усл. ед соответственно (p=0,000110). Корреляционный анализ (n=60) выявил статистически значимую положительную связь между уровнем продукции двух экзометаболитов нозокомиальными 139 изолятами (R=0,382, p=0,002). Анализ продукции пигментов клиническими штаммами с учетом материала выделения показал, что их уровень в двух группах (изоляты из мокроты и из раны) статистически значимо не различался (M-W U-тест, p>0,05). Так, количество пиоцианина (Me(Q1-Q3)) в супернатантах культур из мокроты и из раны составило 0,409(0,291-0,590) и 0,398(0,236-0,625) ОЕ (при λ=375 нм), а пиовердина – 4532,5(2541,5-6376,7) и 3970,05(3518,76414,0) усл. ед соответственно. Пиоцианин Пиовердин Рисунок 36. Уровень продукции пиоцианина и пиовердина (верх) и диапазон показателей количества пигментов (низ) в супернатантах суточных культур P. aeruginosa, изолированных от пациентов поликлиник (n=20) и стационаров (n=60). 5.3. Комплексная оценка гемолитической активности P. aeruginosa Традиционное определение гемолитической активности на кровяном агаре показало, что более 90% клинических изолятов образовывали вокруг колоний зону гемолиза, размер которой варьировал. Это отражает гетерогенность популяции и по данному признаку. Учитывая различные механизмы лизиса эритроцитов у P. aeruginosa, было изучено влияние 140 экзометаболитов (в составе супернатантов) и бактериальных клеток на эритроциты. В работе использовали клинические штаммы, выделенные из разных биотопов (n=12), и референтный штамм P. aeruginosa АТСС 27853. 5.3.1. Внеклеточные факторы гемолитической активности Определение гемолитической активности нативных супернатантов проводили с использованием эритроцитов человека и барана. Сравнение ее уровня в отношении эритроцитов человека и барана выявило сильную положительную корреляцию результатов (R=0,907; p=0,000003), что свидетельствует об их взаимозаменяемости. Вместе с тем, в большинстве случаев процент лизиса эритроцитов человека был выше, что указывает на большую чувствительность последних к действию гемотоксинов P. aeruginosa. Показатели выборочной дисперсии уровней гемолитической активности, полученных при использовании эритроцитов барана и человека, составили 479,31 и 576,18 соответственно. Учитывая, что в контексте изучения патогенетических свойств нозокомиальных штаммов более актуальной представляется информация о цитолитической активности P. aeruginosa в отношении эритроцитов человека, их и использовали во всех последующих экспериментах. Воздействие нативных супернатантов 9-и (69,2%) штаммов, включая референтный, давали уровень лизиса эритроцитов более 50% (Таблица 28). Термообработка супернатантов в большинстве случаев приводила к достоверному снижению уровня гемолитической активности у 11-и штаммов, у 8-и из них степень снижения составила 80% и более. Данный эффект связан с инактивацией фермента фосфолипазы. «Остаточный» гемолиз мог свидетельствовать о работе рамнолипида, а возможно, и других экзометаболитов в составе супернатантов. При использовании нативных супернатантов анализируемых культур обнаружена умеренная положительная связь между проявлением фосфолипазной и гемолитической активностей (R=0,634; p=0,019), которая ослабевала при воздействии супернатантов после термообработки (R=0,569; p=0,042). Сравнение результатов, полученных при 1- и 3-х часовой экспозиции экзометаболитов P. aeruginosa со взвесью эритроцитов, и при высеве культур на кровяной агар, выявило умеренную положительную корреляцию зарегистрированных при этом показателей при более длительной выдержке, но связь была недостоверной (R=0,488; p=0,090). Слабая связь между показателями «терморезистентного» гемолиза и количеством пигмента пиоцианина в супернатантах также была недостоверной (R=0,280; p=0,353). 141 Таблица 28 Показатели гемолитической, фосфолипазной активности и продукции пиоцианина штаммами P. aeruginosa КА2 Штамм ГА, % лизиса эритроцитов после экспозиции в течение 1 ч, 37 ºC P. aeruginosa супернатанты супернатанты нативные после Активность Содержание фосфолипазы, пиоцианина, k3 ОП695 термообработки АТСС27853 1,8±0,4 58,07±13,40 8,91±2,52* 1,2±0,4 0,193±0,010 801 1,4±0,3 68,60±18,91 32,77±12,43* 1,1±0,3 0,226±0,024 5 1,5±0,4 56,56±23,12 2,15±1,5* 1,0±0,3 0,281±0,010 3-7 2,5±0,5 32,01±8,34 10,68±4,55* 1,2±0,4 0,294±0,020 24591 1,5±0,2 51,11±15,67 8,89±3,17* 1,0±0,2 0,253±0,005 2,4±0,3 22,51±7,32 0,46±0,24* 1,0±0,1 0,154±0,004 2,8±0,3 91,90±23,34 72,87±13,23 1,7±0,4 0,245±0,016 Мокрота1 3,0±0,5 58,88±13,45 31,15±12,65* 1,8±0,3 0,233±0,071 9-3 1,1±0,2 72,69±34,30 79,56±32,87 1,7±0,3 0,187±0,012 Дренаж1 2,1±0,3 68,88±12,35 1,18±0,62* 1,4±0,2 0,229±0,007 29а 1,0±0,2 28,87±6,35 0,73±0,34* 1,2±0.3 0,125±0,010 ИТТ1 1,8±0,4 67,30±14,65 8,92±3,76* 1,2±0,3 0,291±0,012 565 1,2±0,2 41,39±12,02 4,53±2,69* 1,0±0,2 0,202±0,070 63 БАЛЖ 1 Примечание: 1 – штаммы изолированы из мокроты или аспирата; 2 – коэффициент, определяемый как отношение диаметра (в мм) зоны гемолиза к диаметру колонии на кровяном агаре, усл. ед; 3 – коэффициент, определяемый как отношение диаметра зоны радужного венчика к диаметру колонии; * – различия статистически значимы при сравнении с нативными супернатантами (р≤0,05). 5.3.2. Клеточно-ассоциированный гемолиз При экспозиции с эритроцитами клеток большинства штаммов P. aeruginosa (37ºC) выявлена их невысокая цитотоксическая активность: уровень гемолиза за счет контактзависимых гемолизинов не превышал 35% (Таблица 29). Центрифугирование, способствующее более тесному контакту между клетками, достоверно увеличивало процент лизиса эритроцитов, который возрастал более чем в 2,5 раза. Подобный эффект описан Dacheux D. и соавт. (2001) для штамма P. aeruginosa CHA. Гемолитическая активность при 25ºC, как правило, была ниже, чем при 37ºC (Рисунок 37). Уровень гемолиза без центрифугирования и после него изменялся сходным образом. Учитывая, что клеточно-ассоциированный гемолиз в естественных условиях 142 возможен только при непосредственном бактериально-клеточном контакте и в значительной степени зависит от специфической адгезии штаммов P. aeruginosa, были проанализированы показатели ИАМ. Индекс у большей части штаммов оказался выше 4,0, на основании чего культуры отнесены к средне- и высокоадгезивным вариантам (данные при 37ºC). Таблица 29 Показатели клеточно-ассоциированного гемолиза и адгезивные свойства клеток нозокомиальных штаммов P. aeruginosa % лизиса эритроцитов Штамм ИАМ P. aeruginosa без центрифугирования после центрифугирования при 37ºС АТСС27853 10,53±2,17 67,60±7,48* 4,45±1,51 801 12,72±3,78 74,81±23,24* 4,65±1,21 5 21,60±5,23 66,34±21,23* 8,52±1,41 3-7 25,31±4,08 72,62±19,98* 8,28±1,40 2459 20,04±3,16 54,07±18,51* 8,17±2,43 63 32,34±7,34 93,65±25,92* 8,09±1,92 БАЛЖ 23,62±2,72 68,99±17,39* 10,67±2,15 Мокрота 13,67±3,74 68,03±14,28* 4,29±1,49 9-3 11,18±1,95 97,02±26,08* 8,82±2,40 Дренаж 6,25±1,23 46,02±6,51* 5,7±1,86 29а 5,74±2,03 46,62±7,72* 3,83±1,47 ИТТ 13,48±4,20 62,22±12,54* 3,77±2,16 565 22,66±5,04 74,80±26,07* 5,67±1,56 Примечание: *– различия статистически значимы при сравнении с данными без центрифугирования (р≤0,05). Заслуживает внимания тот факт, что между значениями ИАМ (при 37ºC) и клеточноопосредованного гемолиза без центрифугирования установлена умеренная положительная связь (R=0,489; p=0,089), которая ослабевает после центрифугирования (R=0,363; p=0,223). Очевидно, что данный тип гемолиза без участия дополнительных факторов, способствующих контакту между эритроцитами и прокариотическими клетками, зависит от адгезивных свойств штаммов. Известно, что способность эффективно прикрепляться к поверхности эукариотических клеток, опосредована у P. aeruginosa пилями IV типа и флагеллами, функционирование которых оптимально при 37ºC. При сравнении адгезивных свойств при 25ºC и 37ºC не выявлено достоверного снижения ИАМ у изучаемых культур (Рисунок 37). Однако при расширении выборки штаммов (Рисунок 42) при температуре 37ºC показатель адгезии 143 составил 8,04±0,39, при 25ºC – 6,87±0,41, и различая в группах были статистически значимыми (р=0,0018). По-видимому, более низкие показатели клеточно-опосредованной гемолитической активности в температурном режиме 25ºC определяются адгезивными свойствами культуры, но в большей степени – функционированием эффекторов TTSS, активность которых выше при температурах, оптимальных для роста культуры. Рисунок 37. Показатели клеточно-ассоциированного гемолиза и ИАМ при разных температурных режимах ряда штаммов P. aeruginosa. * – различия статистически значимы при сравнении с данными при 37ºC (р≤0,05). Связь между зоной просветления на агаре и показателями клеточно-ассоциированного гемолиза была недостоверной (R=0,473, p=0,102 – без центрифугирования) или отсутствовала (R= -0,005, p=0,986 – с центрифугированием). Корреляции между показателями клеточноопосредованной и секретируемой гемолитической активности также не выявлено (R= -0,319, p=0,288 – без центрифугирования; R=0,033, p=0,915 – с центрифугированием). Молекулярно-генетический анализ на наличие эффекторных белков III типа секреции ExoS и ExoU выявил, что exoS-гены присутствовали в геноме 10-и штаммов P. aeruginosa (АТСС 27853 – положительный контроль, 801, 5, 3-7, 2459, БАЛЖ, мокрота, 9-3, 29а, ИТТ), exoU последовательность – только у P. aeruginosa 63 и 565 (Рисунок 38). Высокий уровень клеточноопосредованного гемолиза обнаружен как у штаммов exoU+, так и у таковых, не несущих данный ген. Считается, что ExoU и ExoS имеют тенденцию быть взаимоисключающими, а их наличие, в совокупности с двумя другими эффекторными белками, определяет характер взаимоотношений цитотоксический P. aeruginosa (Fleiszig S.M. с et эукариотическими al., 1997). клетками: Классические инвазивный «инвазивные» или штаммы 144 (продуцирующие ExoS, ExoT и часто ExoY) колонизируют эпителиальные клетки и реплицируются в тканях, тогда как цитотоксические изоляты (ExoU, ExoT и часто ExoY) быстро лизируют клетки хозяев (Lin H.H. et al., 2006). В то же время, Feltman H. и соавт. (2001) не обнаружили четкой корреляции между определенным TTSS-генотипом штамма и его способностью к инвазии или выраженностью цитотоксичности. Dacheux D. и соавт. (2001) показали, что гибель нейтрофилов и макрофагов, а также лизис эритроцитов опосредованы эффекторами TTSS-системы и PcrV, PopB/PopD протеинами P. aeruginosa, но могут быть независимы от ExoU. По-видимому, последний является важным, но не единственным фактором, обеспечивающим клеточно-ассоциированную цитотоксичность у псевдомонад, не исключена роль аденилатциклазы ExoY, а также других токсических продуктов. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 А 1000 п.н. - Б 1800 п.н. - Рисунок 38. Электрофореграмма продуктов амплификации генов exoU (А) и exoS (Б) у изолятов P. aeruginosa: 1, 15 – маркер молекулярных масс 1 kb Ladder DNA («Силекс», Россия); 2 – АТСС 27853; 3 – 801; 4 – 5; 5 – 3-7; 6 – 2459; 7 – 63; 8 – БАЛЖ; 9 – мокрота; 10 – 9-3; 11 – дренаж; 12 – 29а; 13 – ИТТ; 14 – 565. Таким образом, была показана фенотипическая гетерогенность штаммов P. aeruginosa по проявлению ими гемолитической активности. Практически у всех изученных штаммов гемолитическая активность опосредована множественными факторами: токсинами, рамнолипидами/биосурфактантами и ферментами – фосфолипазами С. Выявлен разброс показателей, характеризующих ферментативный гемолиз: например, у штаммов, выделенных от пациентов с патологией бронхо-легочной системы, отмечен высокий процент лизиса эритроцитов (более 50%), что согласуется с данными литературы о более высоком уровне продукции фосфолипазы С изолятами из мокроты (Berka R.M. et al., 1982). Действие фосфолипазы часто усиливалось/сочеталось с термоустойчивыми компонентами, а в ряде случаев лизис зависел именно от них. У большей части штаммов P. aeruginosa зафиксирован самостоятельно значимый клеточно-ассоциированный гемолиз, причем не обнаружено связи между последним и «супернатантным» гемолизом, что подтверждено и отсутствием связи 145 между показателями «клеточного» и определяемого на агаризованной среде гемолиза. Это лишний раз указывает на то, что используемый в лабораторной практике качественный метод оценки гемолитической активности, не выявляет действие значительной части компонентов. Анализ проявления этого свойства изучаемыми культурами показал, что степень выраженности гемолитической активности, набор и соотношение факторов, ее обусловливающих, является штаммовой характеристикой (Рисунок 39). Рисунок 39. Диаграмма «гемолитических профилей» клинических штаммов P. aeruginosa: значения различных типов гемолиза (в %). В этой связи предлагается ввести термин «гемолитический профиль» для ранжирования культур в зависимости от участия различных гемолитических субстанций в проявлении этого свойства клиническими изолятами P. aeruginosa: I тип – высокий уровень (более 50%) клеточно-ассоциированного и «супернатантного» гемолиза; II тип – высокий уровень клеточно-ассоциированного и низкий уровень (менее 50%) «супернатантного» гемолиза; III тип – низкий уровень клеточно-ассоциированного и высокий уровень «супернатантного» гемолиза; IV тип – низкий уровень клеточно-ассоциированного и низкий уровень «супернатантного» гемолиза. По-видимому, первый тип «гемолитического профиля» маркирует высоковирулентные штаммы, встречающиеся в наиболее тяжелых случаях синегнойной инфекции, последний – изоляты при транзиторном носительстве. Два других занимают промежуточное положение, обусловливая, как правило, хроническое (II тип) или острое (III тип) течение инфекции. 146 5.4. Особенности формирования биопленок нозокомиальными штаммами P. aeruginosa 5.4.1. Взаимосвязь гидрофобных свойств поверхности, адгезивной активности и биопленкообразующей способности клеток бактерий Формирование бактериальных биопленок подчинено некоторым общим закономерностям. Вместе с тем, для каждого вида существуют свои особенности роста и развития, в значительной степени зависящие от температуры, среды и условий роста, определяющих формирование микробной биопленки. Гидрофобные свойства поверхности клеток. Показатель гидрофобности клеточной поверхности (Г) свежевыделенных штаммов P. aeruginosa (n=63) не превышал 30%, медиана составила 6,61%, а 75% (третья квартиль) значений укладывались в диапазон 0-16,24% (Рисунок 40-А). После длительного хранения (10 месяцев) клетки псевдомонад становились более гидрофобными (р=0,0091): данный показатель варьировал от 0 до 81%, Ме (Q1-Q3) составили 25,11 (10,37-57,45)%. А Б Рисунок 40. Диапазон показателя гидрофобности клеток свежевыделенных (Г_%) и длительно хранившихся (Г_%_Х) штаммов P. aeruginosa (А) и показателя их адгезии к гидрофобной (А_ГФОБ) и гидрофильной (А_ГФИЛ) поверхностям (Б). Учитывая, что псевдомонады подвергаются расщеплению на диссоцианты R-, S- и Mтипов (Милько Е.С., Мартынкина Л.П., 1996), изучаемые штаммы были разделены по доминирующему морфотипу колоний при росте на LB-агаре. Свежевыделенные штаммы P. aeruginosa формировали колонии преимущественно S- и М-типов. R-штаммы в этой группе отсутствовали, но появлялись после длительного хранения культур, а преимущественным морфотипом становился S-тип. Прослежена взаимосвязь анализируемых показателей среди 147 штаммов с разными морфотипами колоний. Оказалось, что гидрофобность клеток S-штаммов варьировала в широких пределах: выявлены как максимальные для данной выборки, так и нулевые показатели коэффициента гидрофобности. Клетки М-вариантов практически не переходили из суспензии в гексадекан (M±m – 3,62±2,57%). Бактерии R-типа, появившиеся при хранении, устойчиво проявляли гидрофобные свойства с минимальным разбросом показателей коэффициента гидрофобности. Неспецифическая адгезия. Известно, что микроорганизмы родов Pseudomonas обладают ярко выраженной склонностью прикрепляться к твердым носителям благодаря способности клеток к неспецифической адгезии и образованию микроколоний (Klausen M. et al., 2003; Маянский А.Н. и соавт., 2012). Для всей выборки штаммов средний показатель адгезии (А) клеток к гидрофобной поверхности составил 38,99 (22,37-57,22)%, а к гидрофильной – 17,03 (3,58-26,31)% (Рисунок 40-Б). После длительного хранения оба показателя снижались и составили 28,57 (20,37-38,20)% и 0,00 (0,00-12,57)% соответственно, при этом для большей части штаммов это снижение было статистически значимым. Достоверность отличий в группах, различающихся по срокам, показана для значений адгезии как к гидрофильной (р=0,0089), так и к гидрофобной (р=0,0031) поверхности. Необходимо отметить, что показатели адгезии к гидрофобной поверхности снижались, хотя клетки становились более гидрофобными. «Специфическая» адгезия. Уровень адгезивной способности согласно ИАМ при разных температурных режимах для большей части штаммов достоверно не различался, однако при температуре 37ºC средний показатель составил 8,04±0,39, при 25ºC – 6,87±0,41, и различая в высокоадгезивные группах были статистически значимыми (р=0,0018) (Рисунок 42). Рисунок 42. Значения ИАМ ряда штаммов P. aeruginosa при разных температурных режимах. * – различая статистически значимы по сравнению с показателем при 37ºС (р≤0,05). 148 Преобладающая часть штаммов P. aeruginosa отнесена к адгезивным или высокоадгезивным вариантам независимо от температурного режима в эксперименте. Подобные эффекты описаны в литературе и для других бактерий: у патогенной Haemophylus ducreyi специфическая адгезия к эпителиальным клеткам была сопоставима и даже более выражена при 25ºC, а не при 37ºC (Sesupo C. et al., 2001). Биопленкообразование. Анализ биопленкообразующей способности штаммов P. aeruginosa (n=243) в лунках полистиролового планшета показал, что степень проявления данного признака варьировала в широких пределах: от 0,038 до 3,920 ед. ОП580, Ме (Q1-Q3) составили 0,342 (0,143-1,150) (Рисунок 43-А). А Б В Рисунок 43. Диапазон показателя биопленкообразующей способности штаммов P. aeruginosa: А – всей коллекции (ПО_ВСЕ), свежевыделенных (ПО_1ПАСС) и после длительного хранения (ПО_Х); Б – при разных температурных режимах свежевыделенных штаммов. Динамика биопленкообразования у штаммов с различной пленкообразующей способностью (В). 149 После 1 пассажа и последующего длительного хранения культур (n=29) средний показатель пленкообразующей способности снизился с 0,641 (0,392-0,832) до 0,264 (0,2000,556) ед. ОП580 (р=0,0064). По массивности образуемой биопленки, культуры бактерий разделили на 3 группы: «пленкообразующие» (I степень), «склонные к адгезии» (II степень) и «непленкообразующие» (III степень). Максимальная биомасса биопленки для штаммов P. aeruginosa зафиксирована на 12-24 ч (Рисунок 43-В). Процесс дисперсии биопленки для всех культур приостанавливался к 48 ч, и в последующие сроки она находилась в стабильном состоянии. В эксперименте по влиянию температурного режима на степень биопленкообразования (n=40) выявлено статистически значимое увеличение данного показателя при 20ºС (р=0,0003) (Рисунок 43-Б). Так, у 36 штаммов, включая P. aeruginosa АТСС 27853, «массивность» биопленки увеличивалась, при этом в 21 случае статистически значимо, и лишь в трех случаях зафиксировано снижение биопленкообразования (Таблица 30). Определяющими факторами при этом может быть как синтез альгината, который интенсифицируется при 20-25ºС, что существенно ниже температурного оптимума роста P. аeruginosa, так и увеличение показателя гидрофобности клеточной поверхности штаммов P. aeruginosa (Leitao J.H. et al., 1992; Zeraik A.E. et al., 2012). Таблица 30 Пленкообразующая способность штаммов P. aeruginosa при разных температурах Штамм АТСС 27853 Биомасса биопленки, ОП580 37ºС 20ºС 0,663±0,083* 0,378±0,051 1м 0,143±0,019 0,427±0,121* 802 0,186±0,027 0,242±0,023* 818 0,584±0,025 0,592±0,048 834 0,170±0,030 0,267±0,022* 837 0,737±0,103 0,794±0,031 964 0,107±0,037 0,137±0,048 1009 0,378±0,047 0,422±0,034 1098 0,203±0,027 0,222±0,009 1099 0,126±0,028 0,180±0,023* 1154 0,197±0,014 0,409±0,013* 1183 0,419±0,008 0,466±0,111 1185 0,470±0,079 0,498±0,023 1223 0,373±0,019 0,380±0,026 150 1475 0,548±0,041 0,697±0,013* 1508 0,230±0,014 0,249±0,033 1638 1643 0,259±0,025 0,399±0,022* 0,217±0,010 0,279±0,034* 1645 0,260±0,017 0,273±0,019 0,212±0,017 0,217±0,018 1683 0,156±0,016 0,233±0,022* 1687 0,289±0,040 0,295±0,041* 1691 0,283±0,034 0,526±0,016* 1716-1 0,311±0,036 0,304±0,035 1716-111 0,259±0,013 0,241±0,014 1818 0,499±0,066 0,567±0,035 1837 0,778±0,022 0,806±0,019 1854 0,312±0,037 0,469±0,026* 1885 0,334±0,033 0,336±0,035 1875 0,574±0,022 0,660±0,028* 1838 0,500±0,048 0,578±0,033 1891 0,372±0,039 0,387±0,016 9_1 0,904±0,093 3,843±0,139* 9_2 1,108±0,074 0,98±0,392* 9_3 0,981±0,023 0,903±0,116 9_4 2,400±0,394 3,835±0,143* 9_5 0,992±0,129 3,470±0,132* 9_6 1,113±0,087 3,870±0,332* 9_7 1,842±0,105 2,887±0,205* 1647 9_8 1,739±0,118 3,863±0,272* Примечание: * – различая статистически значимы по сравнению с показателем при 37ºС (р≤0,05). Для проверки «альгинатной» гипотезы увеличения биомассы биопленки проведен сравнительный анализ ее толщины и количества бактериальных клеток в биопленках, полученных при разных температурных режимах, с помощью методов лазерной сканирующей конфокальной и атомно-силовой микроскопии (Таблица 31, Рисунок 44, 45). Толщина биопленки, определенная методом послойного сканирования (3,70±0,5 против 9,39±1,7 мкм), и путем построения профиля поверхности на основе АСМ-изображения (8,42 против 14,65 мкм) была достоверно выше при 22ºС только для клинического штамма P. аeruginosa БАЛЖ, 151 обладающего высоким ПО (Рисунок 43-В). Подсчет клеток в срединном слое биопленки показал, что, по сравнению с другими штаммами, их число было выше при 37ºС, и достоверно увеличивалось при 22ºС. При этом в биопленках, образованных при разных температурах, выявлено значительное число жизнеспособных клеток. Толщина биопленки референтного штамма P. aeruginosa АТСС 27853, полученная путем сканирования слоев клеток, не отличалась при разных температурах, тогда как АСМизображение выявило ее увеличение со 164,71 нм до 11,67 мкм (Рисунок 45), что совпадает с данными рутинного метода (с помощью экстракции генцианвиолета). Подсчет клеток в срединном слое биопленки показал, что массивность «клеточной» составляющей биопленки при разных температурных режимах достоверно не изменялась. Необходимо отметить, что доля живых и поврежденных клеток при разных температурах наоборот существенно различалась. Показано, что в 20-часовой биопленке, образованной референтным штаммом, при 22ºС почти половину клеток составляли нежизнеспособные, тогда как при 37ºС их не было вообще. Для штамма P. aeruginosa 9-3 толщина биопленки, полученная всеми способами (сканирование слоев клеток, АСМ-профиль, экстракция генцианвиолета), либо не изменялась, либо снижалась при 22ºС. Необходимо подчеркнуть, что клетки с поврежденной мембраной присутствовали в большом количестве в биопленке, образованной при разных температурах, но со значительным снижением общего числа клеток при 22ºС. Таблица 31 Толщина и количество клеток в биопленке, образованной штаммами P. аeruginosa АТСС 27853, БАЛЖ и 9-3 Штамм Т,ºС ОП580 АТСС БАЛЖ 9-3 Количество клеток на единицу площади2 Толщина биопленки мкм 1 Жизне- Нежизне- способные способные Всего 37 0,378±0,051 4,04±1,2 37,4±16,2 0 37,4±16,2 22 0,663±0,083* 3,73±0,6 22,6±4,5 17,6±2,3* 40,2±3,5 37 1,842±0,105 3,70±0,5 81,2±10,8 3,4±1,1 84,6±11,5 22 2,887±0,205* 9,39±1,7* без счета* 37,4±4,3* без счета* 37 0,981±0,023 3,81±0,6 0,8±0,8 35,4±6,9 36,2±7,7 22 0,903±0,116 4,32±0,9 1,2±0,8 2,2±1,1* 3,4±0,7* Примечание: 1 определяли путем послойного сканирования слоев биопленки, предварительно окрашенной с помощью флюоресцирующей метки Live/Deаd®, 2 подсчитывали не менее, чем в пяти полях, после нанесения сетки на образец, * – различия статистически значимы при сравнении с данными при температуре 37ºС (р≤0,05). 152 А Б В 37ºС Рисунок 44. АСМ-изображение 22ºС 20-часовой биопленки, образованной штаммами P. aeruginosa АТСС 27853 (А), БАЛЖ (Б) и 9-3 (В) на стекле, и конфокальное изображение клеток (вставки), полученное путем сканирования среднего слоя биопленки, предварительно окрашенной с помощью флюоресцирующей метки Live/Deаd®: зеленые клетки – потенциально 153 жизнеспособные (с неповрежденной мембраной), красные – нежизнеспособные (с поврежденной мембраной). 37ºС 20ºС А Б В Рисунок 45. Профили поверхности биопленок штаммов P. aeruginosa АТСС 27853 (А), БАЛЖ (Б) и 9-3 (В), сделанные на основе АСМ-изображения: протяженность (Xa) и высота (Ya) биопленки. На вставке вверху – пример проекции (красная линия) профиля. По-видимому, увеличение биомассы биопленки при более низкой температуре роста культуры, выявленное методом окраски генцианвиолетом, для некоторой части штаммов действительно связно с продукцией полисахаридного матрикса (например, P. aeruginosa АТСС), при этом другие изоляты (например, P. aeruginosa БАЛЖ) увеличивают биопленку в большей степени за счет клеточного компонента. Можно предположить, что штаммы P. aeruginosa могут иметь разные предоминантные формы существования: «планктонную» и «биопленочную». В последнем случае вне макроорганизма, когда отсутствует необходимость в синтезе факторов вирулентности, смена условий, включая изменения температурного режима, 154 позволяет бактериям сохранять свой патогенный потенциал в состоянии малоактивной биопленочной формы. Другим механизмом, обеспечивающим интенсификацию биопленкообразования при более низких температурах, может быть увеличение гидрофобности клеточной стенки. Показано, что гидрофобность штаммов P. aeruginosa была выше при выращивании культур при 22ºС, чем при 37ºС (Wolska K. et al., 2002). Прeдставлялось важным оцeнить, опрeдeляeт ли показатeль гидрофобности иммобилизацию клeточной микроорганизмов, и повeрхности eсть P. aeruginosa ли связь мeжду адсорбционную показатeлями нeспeцифичeского/спeцифичeского взаимодeйствия и конeчным результатом – эффективностью формирования биопленок разными штаммами (Таблица 32). Таблица 32 Связь между гидрофобностью клеточной стенки, адгезией и пленкообразующей способностью штаммов P. aeruginosa Пара сравниваемых признаков n Spearman, R p Гидрофобность/Адгезия Г-фобная 30 0,172 0,363 Гидрофобность/Адгезия Г-фильная 52 -0,009 0,952 Гидрофобность/ИАМ 30 0,133 0,483 Гидрофобность/Биопленкообразование 49 0,269 0,062 Адгезия Г-фобная/Адгезия Г-фильная 30 0,282 0,131 Адгезия Г-фобная/Биопленкообразование 30 0,063 0,741 Адгезия Г-фобная/ИАМ 30 -0,017 0,930 Адгезия Г-фильная/Биопленкообразование 41 -0,372 0,009 Адгезия Г-фильная/ИАМ 30 -0,132 0,486 ИАМ/Биопленкообразование 30 -0,217 0,249 *Примечание: использованы показатели свежевыделенных штаммов, при 37ºС. Как гидрофильныe по BATH-тeсту штаммы P. aeruginosa (в фазу гeксадeкана из водной фазы экстрагировалось нe болee 5-8% клeток), так и болee гидрофобныe псeвдомонады (экстрагировалось до 30%) проявляли высокую плeнкообразующую способность, т.e. in vitro нe было обнаружeно чeткого взаимного соотвeтствия мeжду гидрофильно-гидрофобными свойствами клeточной стeнки бактeрий и стeпeнью плeнкообразования. Болee того, практичeски всe клиничeскиe штаммы с М-морфотипом колоний и низким коэффициeнтом гидрофобности были отнeсeны к плeнкообразующим. Коррeляционный анализ с использованиeм нeпарамeтричeского критeрия Спирмана показал слабую связь мeжду показатeлями гидрофобности клeточной повeрхности и биоплeнкообразованиeм штаммов 155 (R=0,269, p=0,062). Связь мeжду показатeлями, характeризующими нeспeцифичeскую адгeзию к гидрофобной и гидрофильной повeрхности, оказалась нeдостовeрной. Заслуживаeт внимания выявлeнная умeрeнная положитeльная связь между показателем адгезии к гидрофобной поверхности и биомассой биопленки у штаммов с Г≥10% (n=20) (R=0,533, p=0,015). 5.4.2. Биопленкообразующая способность как маркер госпитальности клинических изолятов4 Изучено 148 штаммов P. aeruginosa, выделенных в 2008-10 гг. от пациентов крупных хирургических, акушерского и детского стационаров г. Перми и г. Екатеринбурга. Источниками выделения культур служили раневое отделяемое – 41 штамм, мокрота – 72, содержимое кишечника – 7, отделяемое глаз – 3 и носа – 7, смывы с поверхности катетеров и трахеобронхиальных трубок – 9, смывы с рук персонала и объектов внешней среды – 9. Анализ распространенности биопленкообразующей способности показал, что данный признак (I и II степень) часто определялся у клинических штаммов синегнойной палочки, изолированных в разнопрофильных ЛПУ – 72,3% (n=107) от всех изолятов (Рисунок 44). Рисунок 44. Распределение изолятов P. aeruginosa (%) по степени биопленкообразования в «ОРИТ» и «неОРИТ» группах. Показано, что пленкообразующими было большинство штаммов P. aeruginosa, выделенных как в ОРИТ (75,8%), так и в других отделениях (76,7%) ЛПУ, но «ОРИТ» группа чаще проявляла высокую (I) степень биопленкообразования. Нужно отметить, что значимой связи между выделением штаммов из ОРИТ и высокой степенью ПО культур не зафиксировано (φ=0,157; p=0,05). представлялось проследить проявлениеи вирусологии данного признака у ГБОУ штаммов ДанныеИнтересным получены в соавторстве с ассистентом кафедры микробиологии с курсом КЛД ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» к.б.н. Николаевой Н.В. и опубликованы в статье Кузнецова, М.В. Формирование синегнойной палочки в штаммами зависимости от источника и биологического материала биопленок нозокомиальными Pseudomonas aeruginosa выделения / М.В. Кузнецова, Н.В. Николаева, С.М. Розанова, Карпунина Т.И. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2011. – №4. – С. 8-14. (Таблица 33). 4 156 Таблица 33 Распределение штаммов P. aeruginosa с учетом источника выделения Материал Доля Степень пленкообразующих биопленкообразования, k вариантов (I и II гр.) (М±σ) (М±σ) % (I гр.) (II гр.) Раневое отделяемое (41) 73,2 12,7±4,44 2,8±0,62 Мокрота, БАЛЖ (72) 75,0 9,1±2,05 3,3±0,65 Содержимое кишечника (7) 71,4 5,7±0,15 3,7±0,21 Катетер, трахеобронхиальная трубка (9) 100,0 9,2±1,64 - Смывы (9) 77,8 8,9±1,03 2,7±0,39 Отделяемое глаз (3) 100,0 5,1 4,8±0,14 Отделяемое носа (7) 71,4 9,8±1,28 4,3±0,80 Основная доля штаммов «ОРИТ»-группы, характеризующихся наиболее выраженной пленкообразующей способностью, изолирована из мокроты пациентов с острой сердечной и дыхательной недостаточностью, которым проводили реанимационные мероприятия, в том числе искусственную вентиляцию легких. В подобных случаях нарушения мукоцилиарного транспорта в послеоперационном и посттравматическом периодах могут препятствовать элиминации не только возбудителей, но и транзиторной оппортунистической микрофлоры, создавая условия для их закрепления и персистирования. В этой же группе («ОРИТ») представлены штаммы, выделенные с поверхности катетеров и трахеобронхиальных трубок, биопленкообразующая активность которых связана со способностью к неспецифической адгезии на имплантируемых устройствах в сочетании с механизмами специфическими – некоторые белки плазмы крови комплиментарны адгезинам синегнойной палочки (Руднов В.А., 2002). В других отделениях чаще всего высокая и умеренная биопленкообразующая способность также встречалась у штаммов, изолированных из мокроты, трахеобронхиального отделяемого. Пять из семи изолятов из кишечного содержимого образовывали пленки, что возможно связано с их «легочным» происхождением. Все штаммы, выделенные из смывов с поверхности катетеров, отделяемого глаз новорожденных, обладали пленкообразующей способностью. Реже всего эти штаммы встречались в содержимом кишечника и отделяемом из носа. Широкое распространение пленкообразующей способности у псевдомонад, как правило, сочеталось со значительной вариабельностью степени проявления этого признака. Наиболее высокие показатели способности к формированию биопленки были выявлены у штаммов, изолированных из раневого отделяемого, мокроты, смывов с катетеров. Несмотря на то, что все 157 культуры, выделенные из глаз, оказались пленкообразующими, выраженность этого признака была невысокой. Учитывая, что образование биопленок и экспрессия генов вирулентности у P. aeruginosa регулируется общими системами QS, проведен корреляционный анализ основных признаков, который выявил сильную связь между ПО и ГА для культур, изолированных из раневого отделяемого (r=0,852, p≤0,05) и из мокроты (r=0,816), у последних прослежена связь и между ПО и ФЛА (r=0,677). Эти данные, а также результаты Norouzi F. et al. (2010), которые показали, что БЛРС-продуцирующие изоляты обладали более высокими показателями биопленкообразующей способности, могут свидетельствовать о том, что изоляты с высоким уровнем биопленкообразования и более вирулентны, а возможно и более устойчивы к АБП в условиях внутрибольничной среды. По-видимому, для нозокомиальных изолятов характерно сочетание нескольких признаков, что создает преимущества для закрепления в стационаре, а способность к формированию массивной биопленки можно рассматривать как маркер госпитальности. 5.5. Оценка потенциальной патогенности клинических штаммов P. aeruginosa биолюминесцентным методом Для оценки потенциальной патогенности P. aeruginosa был апробирован способ, основанный на изменении биолюминесценции тест-штамма под влиянием супернатантов ростовых культур синегнойной палочки. В работе использовали экзометаболиты клинических изолятов P. aeruginosa (n=27). Поскольку подавление люминесценции E. coli lux+ рассматривалось как средство оценки потенциальной патогенности P. aeruginosa, для анализа ингибирующего эффекта был предложен индекс потенциальной патогенности (ИПП), вычисляемый по формуле ИПП=(Ik-Io)/Ik×100%, где Ik – интенсивность люминесценции контрольной пробы (E. coli lux+ + LB), Io – интенсивность биолюминесценции опытной пробы (E. coli lux+ + экзометаболиты). В результате проведенных исследований установлено, что хотя экзометаболиты большей части штаммов P. aeruginosa ингибировали свечение E. coli lux+ в пределах 66,0-96,8% уже через 15 мин контакта без последующего усиления, ряд супернатантов обусловливали максимальное падение уровня биолюминесценции в течение 30 мин без достоверных изменений при пролонгации экспозиции. Это время и было использовано во всех последующих экспериментах (Таблица 34). Однократное замораживание бесклеточных экзометаболитов P. aeruginosa не приводило к статистически достоверному снижению их действия на свечение E. coli lux+ (Таблица 35). Таблица 34 158 Индекс потенциальной патогенности штаммов P. aeruginosa при разных сроках контакта ИПП, % Срок контакта, мин Штамм P. aeruginosa 15 30 45 60 АТСС 27853 48,52±3,71 49,10±3,46 47,57±3,83 49,96±3,48 801 96,89±0,35 98,19±0,38* 98,39±0,28* 96,39±0,27 797 90,82±0,10 93,06±0,27* 93,39±0,12* 93,46±0,16 836 66,03±0,92 66,96±0,96 64,09±0,77* 59,20±1,31 8-7 89,50±0,79 93,10±0,52* 93,65±0,43* 93,49±0,49 ИТТ 25,96±2,21 37,38±0,95* 40,80±1,09* 39,50±1,27 711 64,81±1,92 67,05±1,15* 65,11±1,34 61,20±1,68 Примечание: * – достоверная разница по сравнению с 15-мин контактом (р≤0,05). Таблица 35 Индекс потенциальной патогенности экзометаболитов P. aeruginosa Штамм P, aeruginosa ИПП экзометаболитов, % Нативные 1-кратно замороженные 5-кратно замороженные АТСС 27853 49,10±3,46 68,24±1,41* 53,09±0,31 801 98,19±0,38 98,63±0,13 76,74±1,59 797 93,06±0,27 94,46±0,28* 65,29±1,26 836 66,96±0,96 73,51±0,47* 59,58±0,30 8-7 93,10±0,52 93,42±0,15 80,64±0,61 ИТТ 37,38±0,95 39,97±0,43* 27,03±5,21 711 67,05±1,15 72,65±0,70* 32,47±1,81 88р 50,32±0,52 76,78±1,13* 37,06±0,67 8-3 80,69±0,17 93,93±0,14* 89,92±0,24 5 69,45±0,94 92,49±0,27* 82,54±1,48 8-4 н/о 91,68±0,33* 80,65±1,07 3-7 н/о 25,65±3,74* 80,03±2,76 29а н/о 52,70±2,38* 87,23±1,34 Примечание: * – достоверная разница по сравнению с нативными супернатантами (р≤0,05). Более того, в ряде случаев заморозка усиливала ингибирующие свойства экзометаболитов, что, возможно, обусловлено стабилизацией активности ряда протеаз с антибактериальной активностью, продуцируемых P. aeruginosa. Для унификации методики в 159 наших дальнейших экспериментах экзометаболиты проходили обязательный этап «замораживания-оттаивания», что может быть рекомендовано при использовании данного метода в клинических и референтных лабораториях, где не всегда есть возможность анализа ex tempore. Выявлено, что экзометаболиты клинических штаммов P. aeruginosa по-разному влияли на биолюминесценцию сенсора E. coli lux+. На основе сравнительного анализа ряда клинических и референтного штаммов P. aeruginosa по уровню влияния их экзометаболитов на свечение E. coli lux+, изолированные культуры были распределены согласно ИПП по группам (Рисунок 44): I группа ИПП<30% – штаммы с низкой степенью, II группа 30%≤ИПП≤70% – с умеренной степенью, III группа ИПП>70% – с высокой степенью ингибирования люминесценции. Рисунок 44. ИПП штаммов P. aeruginosa (ингибирование свечения E. coli lux+ после экспозиции с экзометаболитами через 30 мин контакта): 1 – АТСС 27853; 2 – 801; 3 – 797; 4 – 836; 5 – 8-7; 6 – ИТТ; 7 – 711; 8 – 8-4; 9 – 9-3;10 – 3-7; 11 – дренаж; 12 – 88р; 13 – 9-8; 14 – 8-3; 15 – 5. Сопоставление клинических штаммов P. aeruginosa с учетом принадлежности к группе по проявлению ими традиционно учитываемых в практике факторов патогенности показало, что ИПП умеренно коррелирует с уровнем продукции пиоцианина во II группе (r=0,398; р≤0,05) и в значительно большей степени – в III группе (r=0,612), а наиболее сильная положительная связь между этими показателями отмечена для всей совокупности изолятов (r=0,808) (Таблица 36). Умеренная и сильная (для III группы) положительная связь выявлена между ИПП и 160 продукцией пиовердина. Кроме того, показана положительная корреляция ИПП штаммов III группы с уровнем гемолитической активности (r=0,480) и пленкообразующей способностью (r=0,868). Участие данных факторов (пиоцианин, фосфолипаза С, рамнолипид) в развитии воспалительного процесса бесспорно, так как они оказывают цитотоксический эффект и вызывают стимуляцию генерализованной воспалительной реакции, а биопленкообразование находится под контролем QS, определяющих экспрессию большинства из них (Руднов В.А., 2005; Smith R.S., Iglewski B.H.P., 2003). Таблица 36 Связь между ИПП и факторами патогенности, антагонистической активностью для штаммов P. aeruginosa Свойства Коэффициент корреляции (r) Группа с учетом ИПП Все штаммы I (n=4) II (n=6) III (n=9) (n=19) Гемолитическая активность -0,343 -0,029 0,480 0,008 Продукция пиоцианина -0,623 0,398 0,612 0,808 Продукция пиовердина 0,479 0,389 0,738 0,474 Пленкообразующая способность н/о 0,253 0,868 0,024 Прирост биомассы тест- 3,5 ч 0,874 -0,513 -0,628 -0,840 штамма E. coli 0,903 -0,269 -0,858 -0,806 5,5 ч Можно полагать, что обнаружение совокупности факторов с высокой активностью у штаммов с ИПП>70%, будет сочетаться с выраженными проявлениями других вирулентных свойств. В соответствии с современными представлениями о госпитальных штаммах они должны иметь широкий набор экспрессируемых факторов патогенности, а также проявлять и/или антагонистическую активность в отношении других видов бактерий (Брусина Е.Б., Рычагов И.П., 2006). При оценке антагонистической активности выявлена сильная отрицательная связь между показателями, характеризующими степень прироста КОЕ E. coli lux+ и степень ингибирования биолюминесценции при учете воздействия метаболитов всех штаммов (r=-0,806), но в особенности в III группе (r=-0,858) (Таблица 36). При этом у штаммов с низким ИПП, наоборот, показана сильная положительная связь с антагонистической активностью. Заслуживает внимания и тот факт, что для всей выборки выявлена корреляция между степенью прироста КОЕ E. coli lux+ и выраженностью гемолиза, хотя и не значительная (r=0,320). Высокая вирулентность и антагонистическая активность обеспечивают 161 конкурентоспособность штамма по сравнению с другими микроорганизмами и, как следствие, способствуют закреплению и распространению в стационаре. Показатель биолюминесценции позволил также определить принятый в токсикологии параметр EC50 (median effective concentration). Зависимость ИПП от %-ого содержания экзометаболитов в двойной логарифмической системе координат представляет собой прямую линию, позволяющую находить точки пересечения прямой со значениями равными EC50 (Рисунок 45). Чем меньше EC50, тем большим патогенным потенциалом обладает изолят. Рисунок 45. Зависимость ИПП от содержания экзометаболитов референтного и клинических штаммов P. aeruginosa:1 – P. aeruginosa АТСС 27853; 2 – P. aeruginosa 836; 3 – P. aeruginosa 801. Определение концентрации экзометаболитов, вызывающих ингибирование свечения E. coli lux+ на 50% от контроля (EC50). Из Рисунка 45 видно, что содержание экзометаболитов P. aeruginosa, вызывающее 50% ингибирование свечения E. coli lux+ (EC50), составило для референтного штамма P. aeruginosa ATCC27853 52,5%, P. aeruginosa 836 – 35,6%, P. aeruginosa 801 – 3,2%. Данный показатель более «корректно» определяет степень антагонистической активности штаммов с ИПП более 90%. Известно, что тест на общую токсичность химических веществ и водных экстрактов с использованием люминесцентных бактерий соответствует показаниям EC50 для эукариот. В работе Kaiser K. (1998) показан высокий уровень корреляции между значениями EC50 (эффективная концентрация химического вещества или объем образца, снижающие свечение сенсора на 50% от контроля) для Vibrio fischeri NRRL B-11177 тест-системы «Microtox» (ISO №11348) и LD50 (median lethal dose) для водорослей, дафний, простейших, рыб (Kaiser K., 1998). 162 Предполагая, что показатель ИПП, определенный в контексте антагонистической активности между микроорганизмами, может свидетельствовать о силе действия экзометаболитов и на клетки млекопитающих/макроорганизма, проведено исследование по влиянию супернатантов суточных культур P. aeruginosa на жизнеспособность и интенсивность апоптоза нейтрофилов. Установлено, что при их воздействии в течение 60 мин доля жизнеспособных клеток (AnV-/PI-) существенно варьировала – от 39,40 до 90,81%. Интенсивность апоптоза нейтрофилов (число клеток, находящихся в ранней и поздней стадии апоптоза в %) статистически значимо увеличивалась при их экспозиции с большей частью бактериальных супернатантов (Рисунок 46). Рисунок 46. Показатели интенсивности апоптоза нейтрофилов, количества пиоцианина в супернатантах и ИПП клинических штаммов P. aeruginosa: 1 – контроль (LB-бульон), 2-7 – клинические штаммы. * – различая достоверны по сравнению с контролем (р≤0,05). При этом обнаружена умеренная отрицательная корреляция между показателями ИПП и количеством жизнеспособных нейтрофилов (r=-0,536, р≤0,05), что может быть связано с действием пиоцианина в составе супернатантов. Действительно, между уровнем пиоцианина и количеством жизнеспособных клеток выявлена еще более сильная отрицательная связь (r=0,724), а также умеренная положительная связь между пигментом и количеством нейтрофилов в стадии «раннего» апоптоза (r=0,649), которая несколько ослабевала в стадии «позднего» апоптоза (r=0,456). Необходимо отметить, что доля клеток AnV-/PI+ (входят нейтрофилы, поврежденные посредством прямого цитолитического действия) превышала контроль: значения варьировали от 3,54 до 35,22%. Но связь в паре ИПП/«неапоптотический» некроз не 163 обнаружена. По-видимому, механизм «первичного» повреждения эукариотических клеток связан не только с «кворум-зависимыми» рамнолипидами (Jensen P.O. et al., 2007), но и другими факторами в составе супернатантов P. aeruginosa. Таким образом, была показана возможность оценки потенциальной патогенности P. aeruginosa, основанной на изменении свечения люминесцентного тест-штамма E. coli при действии экзометаболитов. Такой подход основывается, по крайней мере, на двух соображениях. Во-первых, свечение рекомбинантного штамма E. coli lux+ отражает характер изменения внутриклеточного содержания основных восстановительных эквивалентов (НАД(Ф), ATФ), длинноцепочечных алифатических альдегидов, молекулярного кислорода – субстратов люциферазы, с учетом рецепторного комплекса реципиента. А один из основных факторов патогенности P. aeruginosa – пигмент пиоцианин – продуцируемый более 90% штаммов, способен оказывать токсическое действие на оба типа клеток посредством активных форм кислорода, таких как супероксид-радикал и перекись водорода с последующим снижением внутриклеточного цАМФ (Hassan H.M., Fridovich I., 1980). Во-вторых, особенность сложной, иерархической сети регуляции P. aeruginosa, в которой широкий спектр физиологических процессов, включая синтез большей части факторов патогенности, контролируется с помощью эффекта QS, что в конечном итоге приводит к каскадной продукции как вирулентных, так и антибактериальных факторов. При лабораторной диагностике инфекций, ассоциированных с условно патогенными бактериями, такими как P. aeruginosa, их обнаружение в исследуемом патологическом материале требует ответа на вопрос, является ли изолируемый микроб этиопатогеном, либо это случайная контаминация анализируемого образца. Оценка по степени обсемененности изучаемого образца далеко не всегда является адекватной. Учитывая, что P. aeruginosa обладает большим набором факторов патогенности, их полный учет и интегральная оценка возможного вклада данного микроорганизма в патологический процесс при культуральном исследовании требует значительных материальных и временных затрат. Предлагаемый метод является быстрым, унифицированным и позволяет комплексно оценить патогенный потенциал выделенного штамма для определения его роли в этиологии ГСИ, дать прогноз в отношении возможного развития инфекционного процесса. 5.6. Модификация биологических свойств клинических штаммов P. aeruginosa при многократных пересевах и хранении на искусственных питательных средах В работе использовали референтный штамм P. aeruginosa АТСС 27853 и клинические изоляты (n=14). Ночные культуры P. aeruginosa, стандартизованные до 2,0 по стандарту 164 McFarland, количественно засевали в пробирки с бульоном Луриа-Бертани (1,0 мл стандартизованной культуры и 5,0 мл LB-бульона) и в полистироловые плоскодонные 96луночные панели (стандартизованную культуру разводили 1:100). Через сутки определяли продукцию пиоцианина, пиовердина и биопленкообразующую способность изолятов. Количество пассажей – 5, культуры между экспериментами хранили в течение недели на LBагаре при 4ºС. Факторы патогенности определяли в каждом пассаже, после 1,5- и 10-месячного хранения культур, а также посева на среду Мак-Конки. Установлено, что при первичном посеве клинические изоляты P. aeruginosa существенно различались по продукции экзометаболитов: выявлены суперпродуценты, штаммы со средним и низким уровнем синтеза пиовердина и пиоцианина (Рисунок 47-А). После второго пассажа происходило снижение продукции пиовердина у большей части клинических штаммов (Таблица 37). При последующих пересевах тенденция сохранялась, но с 3-4 пассажа изменения были недостоверны практически у всех изолятов. У 7-и штаммов темп снижения составил более 40% (тенденция выраженная). Однонаправленность эффекта подтверждается сохранением положительной связи между показателями продукции пиовердина во втором и пятом пассаже (R=0,686; p=0,005). После хранения культур в условиях холодильника в течение 1,5 месяцев отмечено снижение, иногда значительное, продукции флюоресцирующего пигмента для 13-и культур (Рисунок 48-А). Следует отметить, что через 1,5 месяца у P. aeruginosa АТСС 27853 уровень синтеза пиовердина снизился в 2,4 раза и восстановился только после 2-3 пересевов (данные не представлены). В то же время у 4-х клинических штаммов изменения были статистически не значимы. После восьми месяцев хранения культур на скошенном агаре (один штамм не вырос) выявлены разнонаправленные эффекты: у 6-и штаммов продукция пиовердина значительно снизилась или полностью утратилась, 6 культур сохранили уровень продукции, сопоставимый с уровнем при первичном выделении, а у двух – он оказался даже выше, чем при выделении. Для всех культур пересев с LB-среды на среду Мак-Конки, содержащую ингибиторы роста – желчные кислоты, приводил к усилению продукции пиовердина, в десяти случаях более чем в 2 раза (Рисунок 48-Б). Схожие эффекты отмечены при оценке уровня пиоцианина после хранения штаммов и смене среды культивирования. Заслуживает внимания тот факт, что сильная положительная связь, выявленная между синтезом двух пигментов в первом посеве, сохранялась и после хранения культур на скошенном LB-агаре при 4ºС в течение 1,5 месяцев (R=0,592; p=0,020), но после 8 месяцев связь становилась недостоверной (R=0,418; p=0,121). А 165 Б Рисунок 47. Уровень продукции пиовердина, пиоцианина (А) и биопленкообразования (Б) при первичном посеве штаммов P. aeruginosa: 1 – АТСС 27853, 2-15 – клинические изоляты. 166 Таблица 37. Изменение продукции экзометаболитов и биопленкообразования штаммами P. aeruginosa при многократных пересевах и хранении Культуры P. aeruginosa Изучаемый пиовердина пиоцианина образование Биопленко- Продукция Продукция признак, пассаж АТСС 27853 Клинические изоляты, n (%) А1 и А2 ↓* ↓ - 7, ↓* - 5 (85,7%) ↑* - 2 (14,3%) А1 и А5 ↓* ↓ - 11, ↓* - 1 (85,7%) ↑* - 2 (14,3%) А1 и Ах ↓ ↓ - 10, ↓* - 2 (85,7%) ↑* - 2 (14,3%) А1 и Ам ↑ А1 и А2 ↑* ↓ - 6, ↓* - 4 (71,4%) ↑* - 4 (28,6%) А1 и А5 ↑* ↓ - 5, ↓* - 2 (50%) ↑ - 2, ↑* - 5 (50%) А1 и Ах ↓ ↓ - 8, ↓* - 2 (71,4%) ↑* - 4 (28,6%) А1 и Ам ↑ А1 и А2 ↑ ↓ - 6, ↓* - 1 (50%) ↑ - 2, ↑* - 5 (50%) А1 и А5 ↑ ↓ - 4, ↓* - 5 (64,3%) ↑ - 4, ↑* - 1 (35,7%) А1 и Ах ↓ ↓ - 7 (50%) ↑- 5, ↑* - 2 (50%) А1 и Ам ↑ ↓* - 1 (7,1%) ↑ - 12, ↑* - 1 (92,9%) ↑ - 14 (100%) ↑ - 12 , ↑* - 2 (100%) Примечание: А1 – первый пассаж, А2 – второй пассаж, А5 – пятый пассаж, Ах – после хранения 1,5 месяца, Ам – пассаж на среде Мак-Конки, * – недостоверный эффект. При изучении способности к образованию биопленок выявлено, что клинические штаммы также различались по этому признаку (Рисунок 47-Б), при этом достоверных связей с продукцией изучаемых пигментов не выявлено (R=0,336; p=0,221 – для пиоцианина и R=0,371; p=0,173 – для пиовердина). При многократных пересевах и хранении на искусственных питательных средах определены разнонаправленные эффекты изменения биопленкообразования, за исключением пассажа на среду Мак-Конки, когда биомасса пленок достоверно увеличивалась у референтного и у 13-и клинических штаммов. Вариабельность пленкообразующей способности может объясняться тем, что данный процесс опосредован разнообразными структурами и физиологическими свойствами бактерий (гидрофобность клеточной стенки, адгезины, жгутики, подвижность, синтез матриксных компонентов экзополисахаридов и др.), которые могут изменяться в процессе пересевов и хранения. Таким образом, при пересевах и хранении нозокомиальных штаммов P. aeruginosa показано следующее: свежевыделенные культуры оказались вариабельными по уровню продукции пиовердина, пиоцианина и способности к формированию биопленок, при этом и высокий, и низкий уровень продукции экзометаболитов мог сочетаться с выраженным биопленкообразованием. Это согласуется с современными представлениями о видовой и 167 популяционной гетерогенности микроорганизмов (Магданова Л.А., Голясная Н.В., 2013), которая, по мнению Л.В. Громашевского (1987), является «важнейшей движущей силой эпидемического (инфекционного) процесса». А Б Рисунок 48. Уровень продукции пиовердина клиническими штаммами P. aeruginosa: А – при многократных пересевах и после хранения (абсолютные значения); Б – при пассаже на среду МакКонки (% усиления). Несмотря на то, что для P. aeruginosa характерно разнообразие тонких механизмов регуляции экспрессии факторов вирулентности, выявлено две основные тенденции: у части 168 штаммов изменения признаков при пересевах или смене среды культивирования были выражены умеренно или незначительно, а при хранении наблюдалось снижение синтеза пиовердина/пиоцианина и биопленкообразующей способности (Рисунок 49). Подобные эффекты выявлены и у P. aeruginosa АТСС 27853. Напротив, другая часть изолятов, как с высоким, так и с низким уровнем проявления признаков вне макроорганизма их утрачивала, но любой провоцирующий фактор – смена условий или среды культивирования – обуславливал быстрое восстановление патогенного потенциала. Такая ответная реакция отражает выраженность адаптивных свойств у ряда штаммов, что позволяет им оптимизировать механизмы паразитирования и обеспечивает максимальную экономичность с энергетической точки зрения (Сидоренко С.В. и соавт., 1999). При пребывании штаммов во внешней среде синтез факторов вирулентности ингибируется, при попадании их во внутреннюю среду организма их продукция интенсифицируется, приводя к развитию острого (штаммы с выраженной активностью) или хронического (штаммы с низкой активностью) инфекционного процесса. Можно полагать, что выявленные различия в поведении штаммов могут свидетельствовать об их различном происхождении: случайный занос во внутрибольничную среду или госпитальная природа. Рисунок 49. Примеры двух тенденций изменения продукции пиовердина штаммами P. aeruginosa Большая часть свойств микроорганизмов, включая синтез факторов патогенности, может проявляться лишь в благоприятных условиях, в том числе при колонизации различных биотопов в организме человека, то есть интенсифицироваться именно в связи с процессами, важными для налаживания отношений между микро- и макроорганизмом. Например, известно, что «легочные» варианты P. aeruginosa продуцируют фосфолипазу в большей степени, чем 169 штаммы, выделенные из других биотопов (Berka R.M. et al., 1981). Такая стратегия более характерна для условно патогенных бактерий, однако, изменение их патогенного потенциала и in vivo, и in vitro зачастую подчиняется различным, трудно прогнозируемым закономерностям. Показано, что при выращивании P. aeruginosa на искусственных питательных средах нередко наблюдается разнонаправленное изменение активности изучаемых факторов в зависимости от условий и состава среды, числа пассажей и времени хранения. Биологические свойства псевдомонад, включая патогенные, в первичном посеве и вектор их изменений при периодических пересевах, зависят, в том числе, и от состава диссоциантов в исходной популяции, выживаемость которых меняется и при хранении (Милько Е.С., Мартынкина Л.П., 1996). По-видимому, в экспериментальных клинических исследованиях, когда особенно важно определение корреляционной зависимости между локусом/биотопом/условиями обитания изолятов и продукцией ими секретируемых факторов патогенности, наиболее корректные результаты могут быть получены лишь при первичном пассаже изолируемых культур. При невозможности проведения анализа ex tempore сроки депонирования штаммов необходимо минимизировать. Вместе с тем, при проведении мониторинга и сравнительном изучении длительно хранящихся изолятов может быть получена дополнительная информация, значение которой требует более углубленного анализа. Представляется, что как минимум два предположения вытекают из наших наблюдений. Во-первых, подход, который традиционно используется для ослабления вирулентности «безусловных» патогенов, основанный на многократных пересевах культур в неблагоприятных разнонаправленную реакцию условиях у условно вне макроорганизма, патогенных зачастую возбудителей. обеспечивает Во-вторых, если большинством исследователей признается, что для оценки этиологической значимости штаммов условных патогенов, изолируемых от пациентов с различными гнойно-септическими инфекциями, важным критерием может служить высокий уровень продукции факторов патогенности, то, по-видимому, для определения их госпитальной природы более важным критерием является выраженная пластичность и адаптационные возможности изолятов, проявляющиеся и в искусственных условиях. Именно эти свойства указывают на преимущества тех или иных штаммов при формировании нозокомиальных эковаров, в том числе за счет их способности сохраняться при циркуляции в изменяющихся условиях внутрибольничной среды. 170 ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА СИМБИОТИЧЕСКИХ/АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ P. AERUGINOSА И КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ УПМ В ПЛАНКТОНЕ И БИОПЛЕНКЕ (IN VITRO) Особое положение среди госпитальных осложнений занимают инфекции полимикробной этиологии. Развитие моно- или микст-инфекции с участием УПМ зачастую определяется возможностью их взаимодействия и зависит, прежде всего, от антагонистической активности бактерий, входящих в сообщество. Выживание различных видов при таком взаимодействии связано в основном с активностью доминантной микрофлоры, выполняющей функцию формирования симбиотической системы, обеспечения ее стабильности и продуктивности путем регуляции численности, интенсивности метаболизма и скорости репродукции микросимбионтов. Одним из главных механизмов межклеточной коммуникации, определяющих ее характер (синергизм, антагонизм), является синтез экзопродуктов, в том числе вторичных метаболитов, антибактериальных веществ, сигнальных химических молекул (Smith V.H., 2002; Бухарин О.В. и соавт., 2005, 2007). В главе рассмотрены некоторые аспекты возможной модификации биологических свойств P. aeruginosa при росте с клинически значимыми УПМ. 6.1. Изучение межвидовых взаимодействий нозокомиальных штаммов в биопленках 6.1.1. Влияние супернатантов УПМ на биопленкообразующую способность P. aeruginosa В экспериментах по влиянию супернатантов бактериальных культур, принадлежащих к различным таксонам, на формирование биопленок P. aeruginosa показано, что в большинстве случаев интенсивность биопленкообразования не зависела от их присутствия: снижения пленкообразующей способности не выявлено ни в одном случае, а ее достоверное увеличение зафиксировано под действием продуктов метаболизма стафилококков и клебсиелл только для одного клинического изолята (Таблица 38). При анализе данных по влиянию супернатантов клинически значимых УПМ на сформированные 24-часовые пленки P. aeruginosa, показано, что 2-х-часовое воздействие не приводило к достоверному снижению биомассы пленки. Зафиксированное в ряде случаев увеличение связано в основном с пассивной адгезией к поверхности биопленки различных белковых комплексов, способствующих удержанию красителя. 171 Таблица 38 Биопленкообразующая способность P. aeruginosa в присутствии экзометаболитов референтных и клинических штаммов УПМ Экзометаболиты бактерий Биомасса биопленки, ед. ОП580 (культуральная жидкость) P. aeruginosa P. aeruginosa 1 P. aeruginosa 2 АТСС 27853 Контроль (LB-бульон) 0,285±0,033 0,249±0,037 0,432±0,018 S. aureus АТСС 25923 0,328±0,064 0,449±0,090* 0,424±0,038 S. aureus АТСС 6538 0,329±0,039 0,493±0,086* 0,370±0,050 S. aureus 1 0,311±0,017 0,415±0,018* 0,497±0,059 E. faecalis АТСС 0,326±0,052 0,305±0,078 0,450±0,035 E. сoli АТСС 35218 0,304±0,026 0,366±0,143 0,383±0,019 E. сoli АТСС 25922 0,288±0,012 0,361±0,115 0,446±0,033 K. pneumoniae АТСС 700603 0,320±0,019 0,361±0,058* 0,498±0,062 K. pneumoniae 720 0,293±0,008 0,333±0,027* 0,450±0,069 K. pneumoniae 1 0,247±0,057 0,435±0,027* 0,444±0,080 Примечание: * – различая достоверны по сравнению с контролем при р≤0,05. Воздействие супернатантов P. aeruginosa на биопленкообразование ряда УПМ, наоборот, в большом проценте случаев снижало пленкообразующую способность представителей как грамположительных, так и грамотрицательных таксонов. Рост и биопленкообразование S. aureus АТСС 6538 подавляли супернатанты трех исследованных штаммов P. aeruginosa. Учитывая, что синегнойная палочка в дополнение к 2-гептил-3гидрокси-4-хинолону, являющемуся медиатором PQS, продуцирует более 55 хинолон/хинолиновых производных, обладающих антибиотической активностью против грамположительных бактерий (Pesci E.C. et al., 1999; Deziel E. et al., 2004), такие результаты были вполне ожидаемы. Разнонаправленное влияние обнаружено при воздействии супернатантов на биопленкообразование E. сoli АТСС 35218 и E. сoli АТСС 25922: штамм P. aeruginosa 1 усиливал, а штамм P. aeruginosa 2 ингибировал биопленкообразование обоих штаммов. Ранее Шаталова Е.В. и Бельский В.В. (1999) также показали, что большая часть микробных культур (S. aureus, E. сoli) были чувствительны к антагонистическому действию экзотоксинов P. aeruginosa, используемых в исследовании. По-видимому, зафиксированное снижение биопленкообразования у УПМ действительно связано, в первую очередь, с бактерицидным действием экзопродуктов P. aeruginosa на планктонные культуры. 172 6.1.2. Формирование смешанных биопленок P. aeruginosa с представителями других таксонов УПМ5 В исследовании при совместном культивировании различных по грампринадлежности микроорганизмов референтных и нозокомиальных штаммов с культурами P. aeruginosa обнаружена способность «бактерий-регуляторов» изменять изначально наблюдаемый у синегнойной палочки уровень биопленкообразования. При этом были выявлены индифферентный, стимулирующий и ингибирующий эффекты взаимодействия. Как следует из Таблицы 39, степень их выраженности колебалась в широких пределах, проявляясь незначительными, а, зачастую, и достоверно значимыми отличиями показателей ОП580. Таблица 39 Биомасса смешанной биопленки, образованной P. aeruginosa и представителями клинически значимых видов УПМ Тест-культура Биомасса биопленки, ед. ОП580 P. aeruginosa 1 P. aeruginosa 2 P. aeruginosa 3 P. aeruginosa 4 Контроль (LB-бульон) 0,249±0,047 0,432±0,018 0,659±0,037 766±0,158 S. aureus АТСС 25923 0,289±0,008 0,364±0,026** нд нд S. aureus АТСС 6538 0,227±0,056 0,605±0,012* нд нд S. aureus 1 0,140±0,004** 0,566±0,168* 0,433±0,065** 0,490±0,128 S. aureus 2 0,163±0,007** 0,891±0,175* 0,418±0,036** 0,838±0,073 S. epidermidis 1 0,311±0,025 0,184±0,073 0,311±0,033** 0,407±0,036** S. epidermidis 2 0,171±0,028 0,473±0,055* 0,363±0,055** 0,470±0,060** 0,416±0,061 нд нд E. faecalis АТСС 29212 0,335±0,028* E. сoli АТСС 35218 0,425±0,056* 0,602±0,043* нд нд E. сoli АТСС 25922 0,398±0,094 0,583±0,074* нд нд E. сoli 1 0,252±0,007 0,189±0,017** 0,334±0,014** 0,351±0,017** E. сoli 2 0,295±0,004 0,221±0,038** 0,328±0,027** 0,295±0,009** K. pneumoniae 0,204±0,038 0,447±0,049 0,536±0,129 K. pneumoniae 1 0,267±0,054 0,289±0,027** 0,372±0,034** 0,466±0,059** K. pneumoniae 2 0,213±0,018 0,118±0,008** 0,393±0,008** 0,508±0,052** нд АТСС700603 Примечание: отсутствие индекса – нейтрализм, * – синергизм, ** – антагонизм (р≤0,05). 5 Часть данных получена в соавторстве с к.б.н. Николаевой Н.В. и к.м.н. Дробковой В.А. и опубликована в БИПМ. – 2012. – № 11. Карпунина Т.И., Кузнецова М.В., Николаева Н.В., Дробкова В.А., Ширева Ю.В. Способ оценки характера межмикробных взаимодействий // Патент РФ №2448161 от 20.04.2012. 173 Обращает на себя внимание тот факт, что при совместном культивировании реже всего прослеживалось усиление пленкообразующей способности P. aeruginosa, в основном при росте со штаммами E. сoli и только в одном случае со S. aureus. Несколько неожиданным было снижение биомассы смешанной биопленки, образованной P. aeruginosa с K. pneumonia, в большинстве вариантов. Ассоциации именно этих бактерий наиболее часто изолировали из патологического материала больных хирургических стационаров (см. 3.2.1.). Более того, ранее Murga R. и соавт. (1995) показали достоверное увеличение биомассы смешанной биопленки, образованной P. aeruginosa с K. pneumoniae, но эти биопленки были выращены в течение недели. Пленкообразующая способность отражает метаболическую активность бактерий, формирующих полимикробные структурированные сообщества. Типы взаимодействия – антагонизм, синергизм и нейтрализм – в бактериальных ассоциациях складываются под влиянием различных факторов, в том числе синтеза бактерицидных веществ, других продуктов обмена и компонентов самих клеток, которые могут оказывать не только сходное, но и разнонаправленное действие на уровень пленкообразования. Мы полагаем, что показатель, характеризующий биомассу смешанной биопленки, наряду с другими, может быть использован для оценки характера межмикробных взаимоотношений. Такой подход послужил основой предлагаемого метода, суть которого заключается в сравнительном анализе массивности сформированных моновидовых и смешанных биопленок на основе регистрации интенсивности поглощения ими красителя по стандартной методике. Если наблюдается аддитивный (суммарный) эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОПmix) достоверно не отличается от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП1 + ОП2) – регистрируют нейтральный характер в межмикробном взаимодействии; если показатель ОПmix > ОП1 + ОП2 – регистрируют синергический характер взаимодействия; если показатель ОПmix < ОП1 + ОП2 – регистрируют антагонистический характер взаимодействия. Установленный тип взаимодействия микроорганизмов, изолируемых одновременно из материала больного, позволяет оценить характер микробной колонизации и прогнозировать развитие микст-инфекции. 6.2. Влияние экзометаболитов P. aeruginosa на планктонные и пленочные культуры E. coli В работе использовали референтный штамм P. aeruginosa АТСС 27853 и два нозокомиальных изолята: P. aeruginosa БАЛЖ и P. aeruginosa 9-3, изолированные из бронхоальвеолярной жидкости и мокроты пациентов хирургического стационара, а также рекомбинантный биолюминесцентный штамм E. coli K12 TG1 lux+. 174 Предварительные исследования по определению экзопродуктов в составе супернатантов ночных культур P. aeruginosa показали, что содержание пиоцианина и пиовердина, было следующим: P. aeruginosa АТСС – 0,53±0,15 и 24,50Е+03±0,66; P. aeruginosa БАЛЖ – 1,83±0,26 и 40,04Е+03±1,63; P. aeruginosa 9-3 – 1,70±0,19 и 24,03Е+03±0,95 соответственно. При росте кишечной палочки в присутствии экзометаболитов клинических штаммов P. aeruginosa происходило увеличение длительности лаг-фазы без снижения скорости экспоненциального роста E. сoli (Таблица 40). Таблица 40 Ростовые показатели и интенсивность свечения планктонных культур E. сoli в присутствии экзометаболитов P. aeruginosa Параметры Вариант опыта, экзометаболиты P. aeruginosa LB (контроль) АТСС БАЛЖ 9-3 0,70±0,20 0,78±0,13 1,06±0,11* 1,72±0,28* 0,27±0,01 0,22±0,01* 0,26±0,01 0,25±0,02 6ч 2,68±0,25 0,63±0,18* 1,18±0,25* 1,45±0,78* 12 ч 6,68±0,46 10,60±2,70* 12,20±0,90* 6,25±1,80 10 мин 1,02±0,05 0,84±0,04* 0,49±0,05* 0,45±0,12* 1,5 ч 4,15±0,48 4,06±0,39 2,96±0,21* 2,16±0,16* 6ч 20,35±3,27 45,57±7,53* 33,85±5,44* 25,64±2,36 12 ч 36,64±3,66 45,51±4,42* 29,85±4,20 28,56±6,39 Длительность лаг-фазы (Tl), ч Удельная скорость роста (µ), ч-1 КОЕ/мл ×108 Iуд ×105 Примечание: * – различая достоверны по сравнению с контролем (среда LB) при р<0,05. К 6 часам детектировано снижение количества КОЕ в планктоне, в 12-ти часовой срок этот показатель был сопоставим с контролем или превышал его. При этом наблюдается прямая зависимость удлинения лаг-фазы E. сoli от содержания пиоцианина (r=0,767; р=0,05) и пиовердина (r=0,372) в супернатантах псевдомонад. Известно, что оба пигмента тормозят рост бактериальных клеток, а уровень продукции феназиновых пигментов, к которым относится пиоцианин, прямо коррелирует с антимикробной активностью у P. aeruginosa (Li Z. et al., 1995; Williams J.S., 2007). Однако по данным Lopes S.P. и соавт. (2010) характер роста клеток E. coli не изменялся в присутствии супернатантов P. aeruginosa. Как показали наши наблюдения, влияние антибактериальных факторов в составе экзометаболитов синегнойной палочки на ростовые характеристики культуры E. coli возможно. 175 При оценке люминесценции (I) планктонной культуры E. сoli зафиксировано следующее: в присутствии экзометаболитов P. aeruginosa АТСС, БАЛЖ и 9-3 достоверно снижалось удельное свечение E. сoli (от контроля) уже через 10 мин экспозиции в 1,2; 2,1 и 2,3 раза соответственно (Таблица 40). Показана обратная зависимость между интенсивностью удельной люминесценции E. сoli и содержанием пиоцианина (r= -0,994) и пиовердина (r= -0,459) в супернатантах псевдомонад. Через 1,5 часа снижение люминесценции E. сoli отмечено только в присутствии экзометаболитов клинических штаммов P. aeruginosa БАЛЖ в 1,4 раза и P. aeruginosa 9-3 в 1,9 раз. К 6 часам культивирования E. сoli зафиксировано возрастание удельной люминесценции планктона во всех вариантах с добавлением в среду супернатантов P. aeruginosa АТСС, БАЛЖ и 9-3, по сравнению с контролем в 2,2; 1,7 и 1,3 раза соответственно. Вероятно, это обусловлено меньшим исчерпанием питательных веществ и кислорода из среды вследствие замедленного роста культуры в присутствии экзометаболитов синегнойной палочки. К 12 часам отмеченная разница в свечении нивелировалась, что может объясняться разрушением наиболее «активной» части экзоферментов, которые перестают действовать на клетки E. сoli. Рисунок 50. Динамика общей люминесценции E. coli при росте в присутствии экзометаболитов P. aeruginosa: 1 – контроль (LB-бульон), 2 – АТСС 27853, 3 – БАЛЖ, 4 – 9-3. Характер изменения общего свечения E. сoli в планктоне в присутствии экзометаболитов представлен на рисунке 50. На раннем сроке (10 мин) зафиксировано ингибирование биолюминесценции (также как и удельной), что объясняется только физиологическим статусом клеток кишечной палочки. На 6 часов значимыми становятся фаза роста культуры, степень снижения активности экзометаболитов P. aeruginosa, уровень и состав которых может 176 различаться в супернатантах, что и может объяснять разнонаправленные эффекты для двух клинических культур. На 12 часов уровень люминесценции в большей степени зависит от количества клеток E. сoli в планктоне, и, действительно, свечение выше в вариантах с максимальным числом КОЕ (в присутствии экзометаболитов P. aeruginosa АТСС и БАЛЖ). Поскольку характер антагонистических взаимоотношений может быть определен не только в планктонных культурах, но и в популяции сессильных клеток, второй этап работы был направлен на изучение формирования биопленки E. сoli в присутствии супернатантов P. aeruginosa и их действия на уже сформированную пленку. При росте E. сoli с супернатантами всех штаммов P. aeruginosa образуется менее выраженная биопленка, чем в контроле на 6, 12 и 24 часов (Рисунок 51-А). А Б Рисунок 51. Влияние супернатантов P. aeruginosa на формирование биопленок E. coli на 6, 12, 24 ч – (А) и сформированные суточные биопленки (после 3-х часовой экспозиции с супернатантами) – (Б): 1 – контроль (LB), 2 – АТСС 27853, 3 – БАЛЖ, 4 – 9-3. * – достоверное отличие от контроля (p≤0,05). 177 По-видимому, в большей степени, это связано с тем, что псевдомонады продуцируют вещества с антиадгезивной активностью, влияющей на способность к поверхностному прикреплению других видов бактерий (Николаев Ю.А., Проссер Дж.И., 2006; Davies D.G., Marques C.N., 2009). Предположение о том, что в присутствии супернатантов с высоким содержанием бактерицидных факторов, влияющих на рост и плотность культуры в планктоне, формируется также и менее массивная биопленка, не подтвердилось в полной мере. Значимое влияние антимикробной активности феназиновых пигментов в планктонной культуре зафиксировано при определении биомассы биопленки E. coli только на 6 часов. Наибольшая биомасса биопленки E. coli, полученная в присутствии супернатанта P. aeruginosa БАЛЖ в более поздние сроки, может свидетельствовать о том, что в этих условиях происходит и более быстрый «уход» культуры в пленку, а также о том, что на формирование биопленки могут влиять не только определяемые нами факторы вирулентности псевдомонад, но другие метаболиты, присутствующие в супернатантах, например экзополисахариды. С другой стороны, оценка общей биомассы пленки может не отражать истинного влияния экзометаболитов на ее формирование. Расчет удельного биопленкообразования (отношение биомассы биопленки (ОП580) к плотности культуры (ОП600) показал, что экзометаболиты клинических штаммов достоверно стимулируют биопленкообразование E. coli на ранних сроках культивирования, но тесной связи между уровнем стимуляции и содержанием пиоцианина в супернатантах не обнаружено. Понижение показателя общего свечения в биопленке в динамике (Рисунок 52) свидетельствует о том, что наращивание толщины пленки предполагает все большее замедление в клетках метаболических процессов. Анализ свечения биопленки E. coli, образованной в присутствии и отсутствие супернатантов P. aeruginosa, после удаления планктона выявил достоверное ингибирование люминесценции на 6 часов во всех вариантах с супернатантами. При расчете удельной люминесценции пленки, образованной E. coli к 6 часам роста, показана стимуляция ее свечения в присутствии супернатантов клинических штаммов P. aeruginosa БАЛЖ и 9-3 в 1,5 и 1,3 раза соответственно (от контроля – без супернатантов). Такой же эффект отмечен в этом сроке и для планктонной культуры (Таблица 40). После экспозиции 12 часов также зафиксировано повышение уровня удельного свечения пленок, образованных при росте культуры с супернатантами P. aeruginosa АТСС в 2,6 раз, БАЛЖ – в 1,6, 9-3 в 3,2 раза. Такая стимуляция может свидетельствовать о большей «чувствительности» клеток, которые подвергались воздействию экзопродуктами, к притоку кислорода при отмывке, в том числе и из-за менее массивной пленки, образованной в этих условиях. 178 А Б Рисунок 52. Показатель общей (А) и удельной (Б) люминесценции клеток биопленки, образованной E. coli при культивировании в присутствии супернатантов P. aeruginosa: 1 – контроль (LB), 2 – АТСС 27853; 3 – БАЛЖ; 4 – 9-3. * – достоверное отличие от контроля (p≤0,05). При анализе данных, связанных с влиянием супернатантов P. aeruginosa на сформированные 24-часовые пленки E. coli, показано, что 3-х часовое воздействие приводило к достоверному снижению биомассы пленки (Рисунок 51-Б), что подтверждалось и уровнем ее биолюминесценции. По-видимому, разрушение пленок не связано с продукцией пиоцианина и пиовердина: наибольшее снижение показателя пленкообразования (ОП580) было отмечено при воздействии супернатанта P. aeruginosa АТСС, который содержал меньшее количество пигментов. Известно, что P. aeruginosa может продуцировать органическое вещество – цис-2дециноевую (cis-2-decenoic) кислоту, способную ингибировать образование и разрушать 179 сформированные биопленки некоторых грамположительных и грамотрицательных бактерий (Davies D.G., Marques C.N., 2009). Существуют данные и о влиянии экзополисахаридов и рамнолипидов на формирование и разрушение биопленок E. coli (Irie Y. et al., 2005; Valle J. et al., 2006). 6.3. Характер взаимоотношений P. aeruginosa и E. coli при совместном культивировании в планктоне и биопленке Преимущественный фенотип одного из ассоциантов может влиять на физиологическую адаптацию микроорганизмов в природных многовидовых сообществах. В этом контексте исследована смешанная культура в планктоне и биопленке, сформированная E. coli и внутрибольничными изолятами P. aeruginosa с различной предоминантной формой существования (планктонной или сессильной). В планктоне оценивали бактериальный рост (по числу КОЕ) каждого вида, продукцию пиоцианина и пиовердина P. aeruginosa и биолюминесценцию E. coli. В биопленках учитывали биомассу в моно- и микст варианте, количество жизнеспособных клеток каждого вида, концентрацию внутриклеточного АТФ, биолюминесценцию E. coli. Планктонный рост моновидовых и смешанных культур P. aeruginosa и E. coli. В присутствии всех штаммов P. aeruginosa наблюдалось значительное снижение количества КОЕ E. сoli после 6 часов культивирования по сравнению с ее ростом в монокультуре (Рисунок 53-А, Б, В). Через 12 часов число КОЕ E. сoli в смешанных культурах с P. aeruginosa 27853 и «планктонным штаммом» P. aeruginosa 9-3 было достоверно выше, чем в монокультуре. Совместный рост с «биопленочным штаммом» P. aeruginosa БАЛЖ не изменил количество КОЕ E. coli. Что касается P. aeruginosa в смешанной культуре, то наблюдалось также значительное снижение числа КОЕ после 6 часов у внутрибольничных штаммов P. aeruginosa БАЛЖ и 9-3 по сравнению с их ростом в монокультуре (Рисунок 53-Б, B). После 12 часов культивирования наблюдались разнонаправленные эффекты присутствия E. сoli на количество КОЕ штаммов P. aeruginosa: у P. aeruginosa 27853 оно увеличилось в тринадцать раз, у «планктонного» штамма P. aeruginosa 9-3 не изменилось, у «биопленочного» штамма P. aeruginosa БАЛЖ снизилось в восемнадцать раз по сравнению с их ростом в монокультуре. 180 А Г Б Д В Е Рисунок 53. Количество жизнеспособных клеток P. aeruginosa и E. coli в планктоне и биопленке при росте в моно- и микст вариантах: A – P. aeruginosa 27853; Б – P. aeruginosa БАЛЖ; В – P. aeruginosa 9-3. * – достоверное отличие между моно- и микст вариантом (p≤0,05). Биопленки в моновидовых и смешанных культурах P. aeruginosa и E. coli. Значимым аспектом взаимодействия P. aeruginosa и E. coli является формирование совместной биопленки. Показано, что клетки обоих видов бактерий интегрировались в смешанную биопленку после 612 часов культивирования. Через 6 часов инкубации было отмечено значительное снижение количества КОЕ E. coli в смешанной биопленке с обоими клиническими штаммами 181 P. aeruginosa по сравнению с собственной биопленкой. В более позднем сроке количество клеток E. coli в пленках всех смешанных культур было сходно c их количеством в моновидовых биопленках (Рисунок 53-Г, Д. Е). Число клеток (по КОЕ) в смешанной биопленке значительно уменьшилось только для «планктонного» штамма P. aeruginosa 9-3 на 6 и 12 часов, для «биопленочного» P. aeruginosa БАЛЖ снизилось только на 12 часов. Соотношение клеток в планктоне и биопленке у разных штаммов существенно отличались, но если для E. coli эти изменения не меняли направленность даже на 12 часов, то для P. aeruginosa выявлены существенные отличая. Так, на 12 часов для P. aeruginosa АТСС в смешанной культуре наблюдалось увеличение количества КОЕ в планктоне, без его изменения в биопленке, по сравнению с монокультурой, а для P. aeruginosa 9-3 численность клеток в планктоне не изменялась, а в биопленке даже снижалась. Показано, что биомасса смешанной биопленки была достоверно выше, чем у биопленки, образованной одним видом на 6, 12, 24 часов (Рисунок 54-А). Интересно, что смешанная культура P. aeruginosa 27853 и E. coli показала более высокую биомассу биопленки, чем теоретически рассчитанная (OП580mix > OП580E.coli + OП580PA27853) (Рисунок 54-Б). В других случаях теоретические и практические значения биомассы биопленки были сопоставимыми. Известно, что действие пиоцианина имеет дозозависимый характер и при субтоксических концентрациях он может способствовать образованию смешанных биопленок P. aeruginosa с другими видами бактерий (Ramos I.B. et al., 2010; Morales D.K. et al., 2013). А 182 Б Рисунок 54. Биомасса биопленки P. aeruginosa и E. coli в моно- и микст вариантах после 12 ч роста (А), где * – достоверное отличие между моно- и микст вариантом (p≤0,05); значения теоретически рассчитанной (OП580микст=OП580 E. coli + OП580PA) и реальной смешанной биопленки (Б). Продукция пиоцианина и пиовердина P. aeruginosa в смешанной культуре. При определении общего содержания пиоцианина (Рисунок 55) и пиовердина в супернатантах суточных монокультур P. aeruginosa, было показано, что продукция экзометаболитов выше у клинических штаммов, чем у референтного, что может указывать на более высокую агрессивность/вирулентность нозокомиальных штаммов. Во всех смешанных культурах общее количество пиоцианина и пиовердина было достоверно ниже, чем у собственных монокультур P. aeruginosa. Максимальный уровень продукции пиоцианина был достигнут через 24 часа и в моновидовых, и в смешанных культурах, в то время как общее количество пиовердина у клинических штаммов увеличивалось к 12 часам, а у референтного – к 24 часам. 183 Рисунок 55. Общий уровень продукции пиоцианина P. aeruginosa в моновидовых и смешанных культурах: 1 – 27853; 2 – 27853 + E. coli; 3 – БАЛЖ; 4 – БАЛЖ + E. coli; 5 – 9-3; 6 – 9-3 + E. coli. Определение позволяющей удельной оценить продукции физиологические экзометаболитов характеристики (Пцн/КОЕ клеток и различных Пвд/КОЕ), штаммов P. aeruginosa, выявило разные тенденции ее изменения в смешанных культурах. У P. aeruginosa БАЛЖ удельная продукция пиоцианина и пиовердина была достоверно выше, а у двух других штаммов (АТСС и 9-3) ниже по сравнению с их ростом в монокультуре в течение 6-24 часов (Таблица 41). Вместе с тем, у клеток референтного штамма разница по удельной продукции экзометаболитов между моновидовой и смешанной культурой уменьшалась к 24 часам, а у клеток обоих клинических штаммов – увеличивались. По-видимому, высокое общее содержание экзометаболитов в супернатантах смешанных культур клинических изолятов достигалось либо усилением их продукции на клетку (P. aeruginosa БАЛЖ), либо экстенсивным ростом культуры (P. aeruginosa 9-3), которое определялось исходной предоминантной формой существования штамма. 184 Таблица 41 Изменение удельной продукции экзометаболитов штаммами P. aeruginosa в смешанной культуре с E. coli Экзометаболит Время, ч P. aeruginosa АТСС 27853 Пиоцианин (Пцн×КОЕ-1 ×10-9) Пиовердин (Пвд×КОЕ-1 ×10-5) 6 но «Biofilm» штамм БАЛЖ +2,2 12 -13,4 α,* +4,8* -3,6* 24 -4,6* +6,3* -26,0* 6 но +2,9* +3,7* 12 -12,8* +17,9* -1,7* 24 -6,5* +7,6* -8,4* Примечание: но – не определяли. α «Planktonic» штамм 9-3 +3,7 – число, показывающее во сколько раз увеличился («+») или снизился («-») показатель удельной продукции Пцн или Пвд P. aeruginosa в смешанной культуре по сравнению с монокультурой; * – достоверные отличая между моновидовой и смешанной культурой (p≤0,05). Биолюминесценция E. coli в смешанной культуре с P. aeruginosa. Для определения метаболического состояния E. coli в моновидовой и смешанных культурах с P. aeruginosa была оценена биолюминесценция в планктоне и биопленке. Показано, что через 6 часов культивирования происходит стимуляция биолюминесценции E. coli в планктоне в 1,4-, 1,8-и 2,8-раза в присутствии клеток P. aeruginosa 27853, БАЛЖ и 9-3, соответственно (Рисунок 56-А). Это связано с низким общим уровнем экзометаболитов P. aeruginosa в среде в этот срок. Однако после 12 часов было отмечено 100-, 14000-, и 2000-кратное подавление биолюминесценции E. сoli в присутствии P. aeruginosa ATCC, БАЛЖ и 9-3 соответственно, по сравнению с монокультурой. Кроме того, при росте с клиническими штаммами P. aeruginosa свечение E. сoli угнеталось в 20-100-раз сильнее в сравнении с эталонным штаммом. Сходные тенденции биолюминесценции E.coli отмечены и через 24 часа культивирования. Интенсивность биолюминесценции E. сoli отрицательно коррелировала с общим уровнем пиоцианина в смешанных культурах с P. aeruginosa 27853 (г = -0,68, р ≤ 0,05) ), БАЛЖ (r = 0,70; p ≤ 0,05), и 9-3 (r = -0,77; p ≤ 0,05) в течение 6-24 часов. Кроме того, на 12 часов отрицательная связь между общим уровнем пиоцианина и пиовердина в смешанных культурах с различными штаммами P. aeruginosa и биолюминесценцией E. сoli была очень сильной: -0,96 и -0,98 (p≤0,05) соответственно (Рисунок 56-Б). Биолюминесценция E. сoli в биопленке и в моно-, и в микст варианте была значительно ниже по сравнению с планктоном. Тем не менее, 185 клинические штаммы P. aeruginosa подавляли свечение E. сoli в смешанной биопленке сильнее, чем референтный, и без связи с биомассой биопленки. А Б Рисунок 56. Биолюминесценция E. coli в смешанной культуре с P. aeruginosa (А): 1 – E. coli; 2 – P. aeruginosa 27853 + E. coli; 3 – P. aeruginosa БАЛЖ + E. coli; 4 – P. aeruginosa 9-3 + E. coli и корреляция между общим уровнем Пцн и Пвд в смешанных культурах с различными P. aeruginosa и удельной биолюминесценцией E. сoli (Б). Определение внутриклеточного АТФ в биопленках, образованных при совместном культивировании P. aeruginosa и E. сoli. Метод АТФ-метрии успешно используют для анализа численности и биологической активности бактерий в планктонной культуре и биопленках (Takenaka T., 1994; Ефременко Е.Н., 2010; Sánchez M. et al., 2013). Мониторинг концентрации внутриклеточного АТФ в клетках биопленок, образованных различными штаммами 186 P. aeruginosa, показал, что в разные фазы роста биопленки клетки характеризовались определенным энергетическим статусом. Корреляционный анализ показателей биомассы биопленки, числа КОЕ и количества АТФ в разные сроки (в ряду штаммов P. aeruginosa АТСС, БАЛЖ, 9-3) выявил умеренную положительную связь между биомассой пленки и [АТФ] или количеством КОЕ на 6 часов (r=0,353 и r=0,403; p=0,05 соответственно), которая усиливалась к 12 часам (r=0,706 и r=0,797). Как и следовало ожидать, зависимость между АТФ/КОЕ (на 12 ч) была линейной (r=0,990), что свидетельствовало об увеличении биомассы биопленки за счет жизнеспособных клеток на этом этапе ее формирования. Для изолята P. aeruginosa БАЛЖ (в ряду данных на 6/12/24 ч) показана сильная корреляция между биомассой биопленки, числом КОЕ и количеством АТФ: биомасса/АТФ (r=0,948), биомасса/КОЕ (r=0,916), АТФ/КОЕ (r=0,742) (Рисунок 57). Биопленка представлена в основном «клеточным компонентом», и большинство клеток в ее составе сохраняли жизнеспособность. * * * 1 Рисунок 57. Биомасса, число КОЕ и внутриклеточная концентрация АТФ биопленок, образованных штаммами P. aeruginosa, в разные сроки экспозиции: 1 – число КОЕ×105/лунку; *– достоверные отличая между сроками. Для штаммов P. aeruginosa АТСС и 9-3 зафиксировано снижение количества АТФ в биопленке уже к 12 часам, при этом число КОЕ нарастало вместе с биомассой биопленки, в связи с чем для этих культур можно предполагать значительное снижение метаболической активности клеток без их гибели. К 24 часам большая часть клеток становилась нежизнеспособной и связи между показателями [АТФ] и числом КОЕ в динамике (6/12/24) для 187 этих штаммов не выявлено (r=0,027 и r=0,151 соответственно). Оценка энергетического статуса клеток в биопленке для трех штаммов P. aeruginosa еще раз подтвердила гипотезу, выдвинутую в Главе 5, о преимущественной «планктонной» или «биопленочной» форме существования для популяций данного вида бактерий. Сравнительный анализ удельной концентрации внутриклеточного АТФ в клетках моновидовых и смешанных биопленок показал, что метаболическая активность клеток и в том и другом случае снижалась по мере «созревания»/«разрушения» биопленки (Таблица 42). То есть, в смешанном биопленочном сообществе биологическая активность ассоциантов подчиняется общим закономерностям, описанным для моновидовых сообществ микроорганизмов. Для более корректной оценки антагонистической активности в биопленке было проведено сравнение показателей «практической» и «теоретической» [АТФ], характеризующей энергетический статус клеток разных видов без влияния ассоцианта. Значение «теоретической» [АТФ] смешанной биопленки было рассчитано следующим образом: ([АТФ]E. coli mono × КОЕE. coli mixt) / КОЕE. coli mono) + ([АТФ]P.a mono × КОЕP.a mixt / КОЕP.a mono). Оказалось, что уровень антагонистических отношений с ассоциантом, выявленный для всех культур P. aeruginosa в 6-ти часовой биопленке, нивелировался в процессе ее созревания, за исключением P. aeruginosa БАЛЖ. Это свидетельствует, в первую очередь о том, что конкурентные межвидовые взаимоотношения сохраняются у бактерий и в прикрепленном состоянии, а уровень антагонизма коррелирует с жизнеспособностью клеток, входящих в биопленку. Таблица 42 Удельная концентрации внутриклеточного АТФ в моновидовых и смешанных культурах P. aeruginosa и E. coli Вариант опыта Удельная [АТФ], пикоМ/биомасса биопленки, ОП580 6ч 12 ч 24 ч E. coli 75,5±7,2 13,3±2,51 3,3±2,11,2 АТСС 27853 9,7±6,6 3,7±0,8 1,7±1,31 E. coli+АТСС27853 27,2±3,4 8,7±7,61 3,4±2,61 БАЛЖ 11,4±3,2 8,9±2,7 4,8±3,41 E. coli+БАЛЖ 18,3±5,2 9,8±1,71 0,9±0,61,2 9-3 18,7±1,5 8,8±2,51 2,0±1,61,2 E. coli+9-3 38,5±12,3 9,2±1,81 3,1±3,01,2 Примечание: различия статистически значимы при сравнении с данными на 6 ч1 и 12 ч2 (p≤0,05). 188 Таким образом, исследования по влиянию супернатантов P. aeruginosa на физиологические свойства E. coli, связанные с ростом в планктоне, биопленкообразованием и метаболическим статусом, выявили, что экзометаболиты P. aeruginosa увеличивали длительность лаг-фазы E. сoli, а в короткие сроки экспозиции ингибировали свечение планктонных клеток. Данные эффекты обеспечиваются бактерицидным действием пиоцианина и пиовердина. Их влияние на формирование и разрушение сформированной биопленки E. сoli спорно, и по-видимому в этих процессах большую значимость имеют другие факторы. Отмеченные эффекты косвенно указывают на то, что P. aeruginosa препятствует развитию других микроорганизмов, и в частности E. сoli, однако сама может присоединяться к текущему инфекционному процессу. При изучении характера взаимоотношений E. coli и P. aeruginosa при совместном культивировании показано, что количество клеток E. coli и P. aeruginosa в смешанном планктоне и биопленке уменьшается сходным образом по сравнению с моновидовыми культурами после 6 часов культивирования, что возможно связано с адаптацией к присутствию другого вида. Тогда как в более поздний срок (на 12 ч) численность КОЕ обеих культур в планктоне при смешанном росте варьирует и не соответствует КОЕ биопленок, что, повидимому, связано с конкуренцией за питание или с влиянием бактериоцинов, кворум-сенсинг регуляторов и других вторичных продуктов, которые выделяются в среду при достижении определенной плотности культур. Не исключен также выход клеток из биопленки после 6 часов. Взаимовлияние и межклеточное взаимодействие в смешанной популяции E. coli P. aeruginosa может быть обусловлено и высокой фенотипической гетерогенностью последней. Если для E. coli выявленные количественные эффекты практически не меняли направленность, то для P. aeruginosa соотношение клеток в планктоне и биопленке существенно отличалось для разных штаммов в соответствии с их предоминантной формой существования. Недавно Machado и соавт. (2012) сообщили, что биомасса биопленки, образованной при совместном росте E. coli и P. aeruginosa, не увеличивалась, что, вероятно, связано с длительным сроком культивирования. В данном исследовании было показано увеличение биомассы всех смешанных биопленок (на 6-24 ч) по сравнению с моновидовыми пленками, что подтверждает однонаправленность изменений фенотипически разных штаммов P. aeruginosa в присутствии ассоцианта. Более того, поскольку смешанная биопленка была массивнее у «сессильного» штамма, чем у «планктонного» изолята P. aeruginosa, то подтверждается тезис, что при взаимодействии с E.coli клинические штаммы не меняли предоминантную форму существования. Общее количество пиоцианина и пиовердина, синтезированных P. aeruginosa, было ниже во всех смешанных планктонных культурах. Несмотря на это, клинические изоляты 189 P. aeruginosa продуцировали большее количество экзометаболитов, чем референтный штамм, в течение всего срока наблюдения, которое достигалось либо увеличением их удельной продукции, либо экстенсивным ростом культуры, что определялось исходной предоминантной формой существования культур. Поэтому, клинические изоляты P. aeruginosa снижали биолюминесценцию E. coli в смешанной культуре более интенсивно (в 20-100 раз), чем референтный штамм, что связано с токсическим воздействием пиоцианина и других токсических продуктов. Однако общее количество пиоцианина в супернатантах и низкий энергетический статус клеток E. coli не влияли на их интеграцию в смешанную биопленку на 12 часов. Тем не менее, сниженная метаболическая активность E. coli, согласно биолюминесценции, дает возможность предположить о снижении синтеза ауторегуляторов и вторичных метаболитов ассоцианта, которые могут в дальнейшем оказывать или не оказывать влияние на проявление вирулентных свойств P. aeruginosa. Обнаруженный эффект снижения биолюминесценции E. coli в смешанной биопленке показал, что антагонистическая активность P. aeruginosa против ассоцианта сохранялась и в этом случае. Вероятно, это может приводить к гибели ассоцианта особенно в составе смешанной биопленки с клиническими штаммами P. aeruginosa. Но поскольку биомасса смешанной биопленки превышает биомассу моновидовой биопленки, ее формирование будет способствовать выживанию P. aeruginosa в условиях стрессовой нагрузки в природных и внутрибольничных условиях. Кроме того, пиоцианин при субтоксических концентрациях может оказывать регуляторный эффект и, возможно, может способствовать образованию смешанных биопленок P. aeruginosa с другими видами бактерий. Действительно, более высокая биомасса смешанной биопленки показана для штамма P. aeruginosa АТСС 27853, у которого в супернатантах был более низкий общий уровень пиоцианина и пиовердина по сравнению с клиническими штаммами. Причем в ранние сроки это может быть обусловлено числом клеток P. aeruginosa и E. coli в составе биопленки, в более поздние сроки – количеством внеклеточного матрикса P. aeruginosa (полисахариды) и E. coli (колановая кислота) (Danese P.N. et al., 2000; Allison D.G., 2003). По-видимому, штаммы P. aeruginosa с низким уровнем продукции экзометаболитов могут дольше существовать в смешанной биопленке. Выявлены однонаправленные эффекты у всех штаммов P. aeruginosa при росте в смешанной культуре, а именно снижение общего уровня пиоцианина и пиовердина, подавление метаболического обмена E. coli, повышение биомассы биопленки в соответствии с детерминированной формой существования. На примере разных штаммов P. aeruginosa было показано, что определяемая в биопленках концентрация внутриклеточного АТФ характеризует энергетический статус клеток в соответствующей фазе роста биопленки и является важнейшим критерием для отбора штаммов с преимущественной «биопленочной» формой существования. 190 Установлено, что в смешанном биопленочном сообществе биологическая активность ассоциантов подчиняется общим закономерностям, описанным для моновидовых сообществ микроорганизмов. Показано, что конкурентные межвидовые взаимоотношения сохраняются у бактерий и в прикрепленном состоянии, а их уровень коррелирует с жизнеспособностью клеток, входящих в биопленку. В целом результаты показывают, что рост бактерий в полимикробном сообществе сопровождается конкуренцией и/или сотрудничеством между его членами. Однако для P. aeruginosa любой из видов межклеточных взаимоотношений в смешанном сообществе является благоприятным/выгодным при выживании, в том числе и при неблагоприятных условиях окружающей среды. 6.4. Влияние супернатантов смешанной культуры P. aeruginosa и E. coli на апоптоз, некроз и окислительную активность нейтрофилов Учитывая, что на жизнеспособность и функции нейтрофилов кроме различных воспалительных медиаторов могут влиять и бактериальные факторы P. aeruginosa и E. coli (Usher L.R. et al., 2002; Дерябин Д.Г. и соавт., 2013), представлялось важным оценить воздействие на нейтрофилы супернатантов, полученных в моно- и микст варианте. В экперименте использовали референтный штамм P. aeruginosa АТСС 27853 и биолюминесцентный штамм E. coli K12 TG1 lux+. Как и следовало ожидать (см. п. 6.3), содержание пиоцианина, пиовердина – экзопродуктов, продуцируемых только P. aeruginosa, и экзополисахаридов, источником которых могут быть оба вида бактерий, было ниже в супернатанте смешанной культуры, чем в моноварианте с P. aeruginosa (Таблица 43). Таблица 43 Содержание внеклеточных экзопродуктов в составе супернатантов смешанной и моновидовых культур P. aeruginosa и E. coli Показатель Пиоцианин (OП695) Пиовердин (FLU 400/460) Экзополисахариды (мг/мл) Варианты супернатантов P. aeruginosa E. coli P. aeruginosa + E. сoli 0,28±0,01 - 0,15±0,02* 460±13 - 448±13* 1,57±0,05 0,61±0,11^ 0,71±0,02* Примечание: * – достоверная разница между супернатантами моновидовой и смешанной культуры P. aeruginosa при p≤0,05; ^ – достоверная разница между супернатантами моновидовых культур при p≤0,05. Установлено, что количество живых нейтрофилов было достоверно ниже при их экспозиции с супернатантами моновидовых культур по сравнению со смешанной культурой и 191 раствором Хенкса (Рисунок 58-А). При воздействии супернатантов, полученных при совместном росте P. aeruginosa и E. coli, число An-/PI- нейтрофилов не изменялось по сравнению с раствором Хенкса и LB-средой. А Б В Г Рисунок 58. Количество живых (А), некротических (Б) и апоптотических (В) нейтрофилов человека при действии супернатантов моновидовых и смешанной культур P. aeruginosa и E. coli. * – достоверная разница между вариантами при p≤0,05. Продукция внутриклеточных АФК нейтрофилами (Г) при действии супернатантов моновидовых и смешанной культур P. aeruginosa и E. coli: 1 – P. aeruginosa, 2 – E. coli, 3 – P. aeruginosa + E. coli. * – достоверная разница между супернатантами моновидовой и смешанной культуры P. aeruginosa при p≤0,05. Доля An-/PI+ клеток была достоверно выше по сравнению с контролем только при воздействии супернатантов P. aeruginosa (Рисунок 58-Б). Некроз нейтрофилов в данном случае может быть обусловлен мембраноповреждающим действием дирамнолипида в комплексе с фосфолипазой (Jensen P.O. et al., 2007), а также пиоцианина (Priyaja P. et al., 2014). Подобное 192 предположение подтверждается тем, что в составе супернатантов, полученных при совместном росте штаммов, детектирован более низкий уровень пиоцианина, который связан с рамнолипидом кворум-зависимым механизмом. Количество нейтрофилов в стадии с раннего апоптоза после 30-минутного воздействия супернатантов во всех вариантах достоверно не отличалось от контроля (Рисунок 58-В). Отсутствие проапоптотического влияния пиоцианина, возможно, связано с его отсроченным действием на морфологические перестройки нейтрофилов. Тем более, что интенсивность апоптоза нейтрофилов статистически значимо увеличивалась при их 60-минутной экспозиции с супернатантами большей части клинических культур P. aeruginosa (см. п. 5.5). Кроме этого известно, что апоптоз нейтрофилов обратимо ингибируется железо-хелатирующими агентами (Mecklenburgh K.I. et al., 2002). Не исключено, что пиовердин, обладающий способностью связывать железо, способен оказывать сходное воздействие. При оценке действия супернатантов на внутриклеточный уровень АФК нейтрофилов установлено, что он существенно возрастает во всех вариантах, но ниже индуцированного ФМА (4-форбол-12-миристат-13-ацетат) (Рисунок 58-Г). Супернатанты смешанной культуры стимулировали окислительную активность сильнее, чем бесклеточные фильтраты P. aeruginosa, но не E. coli, что, по-видимому, связано с более высоким количеством нейтрофилов, сохранивших жизнеспособность (Рисунок 58-А). Так, при расчете удельной продукции АФК нейтрофилов, варианты с моновидовой и смешанной культурами P. aeruginosa не отличались по этому показателю (0,42±0,22 против 0,44±0,12 усл. ед; р≥0,05; 30 мин). Выявленная обратная зависимость между удельным уровнем АФК и содержанием экзополисахаридов, подавляющих функциональную активность нейтрофилов (Bylund J. et al., 2006), отчасти объясняет отсутствие дозозависимого стимулирующего эффекта пиоцианина в составе супернатантов на продукцию АФК нейтрофилами (Usher L.R. et al., 2002) Таким образом, краткосрочное воздействие супернатантов моновидовой культуры P. aeruginosa приводило к увеличению числа некротических клеток, тогда как выраженного влияния на жизнеспособность нейтрофилов супернатантов, полученных в смешанной культуре не выявлено. В свою очередь это определяло большую продукцию АФК нейтрофилов, оказывающих бактерицидное действие. Полученные данные позволяют предположить, что при развитии инфекционного процесса, вызванного ассоциацией двух видов микроорганизмов P. aeruginosa и E. coli, повреждающее действие на ткани в очаге воспаления будет меньшим вследствие низкого уровня продукции бактериальных экзометаболитов и высвобождения цитотоксических белков нейтрофилов. 193 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Многолетняя история изучения P. aeruginosa позволила сформулировать достаточно «объемное» представление о ее биологических свойствах и распространенности в различных экологических нишах, однако интерес к данному возбудителю не угасает. С одной стороны это связано с появлением новой информации о свойствах P. aeruginosa, с другой – внедрением новых технологий и методов, значение которых предстоит определить. В ЛПУ различных регионов России и за рубежом регулярно проводится мониторинг распространенности и антибиотикорезистентности P. aeruginosa (Решедько Г.К. и соавт., 2006; Илюкевич Г.В. и соавт., 2008; Vincent J.L. et al., 2009; Kohlenberg A. et al., 2010; Руднов В.А. и соавт., 2011; Bertrand X., Dowzicky M.J., 2012 и др.). Результаты многоцентровых европейских и российских исследований свидетельствуют о том, что до 30% случаев внутрибольничных инфекций в ОРИТ вызваны синегнойной палочкой (Vincent J.L. et al., 2009; Руднов В.А. и соавт., 2011). Инфекции, обусловленные P. aeruginosa, возникают чаще всего у госпитализированных больных как взрослой, так и педиатрической сети, и ее доля в структуре нозокомиальных возбудителей составляет 9-20% (Козлов Р.В., 2000). Полученные нами результаты по целому ряду позиций совпадают с общемировыми и российскими наблюдениями, оценивающими распространенность P. aeruginosа в стационарах различного профиля. Показано, что P. aeruginosa остается одним из ведущих возбудителей госпитальных инфекций. Среднемноголетний уровень инфицированности составил 13,6±1,9 на 1000 обследованных со среднегодовым темпом прироста 1,7%, а за 5 лет – 6,9%. Вместе с тем, установлены следующие характерные особенности: инфицированность синегнойной палочкой и ее доля в спектре микроорганизмов из исследуемых материалов зависела от профилизации стационара и возрастной категории пациентов. Установлено, что за период наблюдений показатели темпа прироста существенно различались для взрослых, детей и новорожденных: 0,8%, 16,4% и -21,4% соответственно. Несмотря на то, что совокупный показатель встречаемости P. aeruginosa среди нозокомиальных культур не превышал 1,6%, частота их выделения от хирургических больных взрослой сети оказалась наиболее высокой, составив 10,5% в общих и 18,1% в реанимационных отделениях. Более того, не подтверждается предположение о том, что среди возбудителей ИСМП в хирургической клинике снижается удельный вес основного представителя НГОБ – P. aeruginosa, и увеличивается доля других видов. Показано, что сохраняется ведущая роль P. aeruginosa в этиологии пневмоний, раневых инфекций и инфекций мочевыводящих путей, а также ее доминирование, наряду со стафилококком, в ожоговых отделениях. Заслуживает внимания и тот факт, что почти в 70% случаев P. aeruginosa выделяют из биоматериала в составе многокомпонентных ассоциаций, в 194 которых чаще всего присутствуют другие грамотрицательные бактерии: K. pneumoniae, A. baumannii и E. coli. Учреждения родовспоможения наряду с хирургическими стационарами лидируют по показателям заболеваемости ИСМП. Среднероссийский показатель заболеваемости ГСИ новорожденных в последние годы составил 2-4 на 1000 обследованных, но согласно мнению ряда авторов истинная заболеваемость ГСИ новорожденных значительно превышает официально зарегистрированную (Шкарин В.В. и соавт., 2009; Фельдблюм И.В. и соавт., 2011; Маркович Н.И., 2011; Сергевнин В.И., 2014). Среднемноголетний уровень инфицированности новорожденных за пять лет в г. Перми составил 7,9±5,8. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что P. aeruginosa не играет существенной роли ни в качестве колонизирующего микроорганизма, ни в качестве этиопатогена у новорожденных. Наиболее значимой P. aeruginosa может быть только в случае ГСИ дыхательных путей, при всех других воспалительных процессах ее доля меньше 10%. В то же время, вспышки ГСИ, в том числе и в отделениях интенсивной терапии новорожденных, могут вызываться именно этим микроорганизмом. Оценивая частоту встречаемости синегнойной палочки в стационарах различного профиля взрослой и педиатрической сети в г. Перми, можно говорить о сходстве тенденций ее распространенности среди госпитализированных взрослых и подростков и своеобразии выявления в неонатальной клинике. С микробиологической точки зрения мы объясняем прослеженные особенности, в первую очередь тем, что микробиом, формирующийся у новорожденных при благоприятных условиях, не содержит P. aeruginosa. Инфекция возникает в подавляющем большинстве случаев как экзогенная, обусловленная чаще всего заносом или госпитальными штаммами, и ассоциирована с резервуарами внутрибольничной среды, включая медицинский персонал (Zawacki A. et al., 2004; Фельдблюм И.В. и соавт., 2013). С учетом уязвимости контингента, она носит вспышечный характер, но, благодаря жесткости требований к санитарно-эпидемическому режиму в акушерских стационарах, ликвидируется в короткие сроки. Это подтверждается и анализом профилей антибиотикорезистентности изолятов, молекулярно-генетическими исследованиями (типированием, выявлением детерминант антибиотикорезистентности и цитотоксичности). Штаммы, выделенные от новорожденных, в значительном проценте случаев чувствительны к антибиотикам большинства фармакологических групп. Исключение составляют «вспышечные» изоляты, но, учитывая кратковременность персистирования в отделении, поливалентная устойчивость у них, как правило, не формируется, не обнаружено и традиционных маркеров госпитальности – интегронов, blaVIM2, blaOXA14. Такая благоприятная ситуация в учреждениях родовспоможения свидетельствует о стабильности процессов, обеспечивающих биологическую безопасность 195 медицинских услуг, что как правило предотвращает возможность формирования и распространения госпитальных штаммов P. aeruginosа среди новорожденных. С возрастом синегнойная палочка становится тривиальным представителем, прежде всего кишечной микробиоты, риск эндогенного инфицирования значительно возрастает. Очевидно, что стационары различного профиля, включая ОРИТ, представляют собой специфическую среду, в которой существенно различается степень значимости эндогенного и экзогенного инфицирования, что связано, в первую очередь, с особенностями контингента больных, набором лекарственных средств и методов лечебного пособия. Это подтверждается и анализом антибиотикорезистентности изолятов: штаммы ОРИТ устойчивы чаще и к более широкому спектру антибактериальных препаратов, полиантибиотикорезистентных штаммов что в может условиях быть следствием внутрибольничной закрепления среды и формированием госпитальных эковаров. Так, продуценты МБЛ, обладающие высокой каталитической активностью в отношении БЛА и широким спектром субстратной специфичности, выявлены в различных ЛПУ, в основном в ОРИТ, взрослой медицинской сети и, по-видимому, широко распространились на территории Пермского края. Специфика хирургических стационаров, начиная с детского возраста, связана с частотой и разнообразием инфекционных осложнений в их профильных отделениях, требующих адекватной антибиотикотерапии, а иногда и антибиотикопрофилактики. Следствием этого является своеобразие фенотипов, в том числе профилей резистентности, изолируемых в них культур. В хирургических стационарах инфицирование пациентов P. aeruginosa происходит чаще всего госпитальными эковарами в период их пребывания в ОРИТ ЛПУ с последующим распространением возбудителя при переводе больных в другие отделения, при этом первичное место госпитализации существенной роли не играет. Реже источником ГСИ может быть индигенная микрофлора. Таким образом, анализ полученных за последние годы данных подтвердил мнение большинства исследователей о том, что результаты как многоцентровых, так и локальных исследований невозможно полностью экстраполировать на конкретный регион/стационар. Это указывает на целесообразность проведения в них микробиологического мониторинга с целью анализа и прогнозирования нозокомиальных осложнений, создания эффективной системы профилактических и противоэпидемических мероприятий в каждом ЛПУ. Наши экспериментальные исследования показали эффективность методов «классической бактериологии», которые совершенно правомерно используются в рутинной лабораторной диагностике при идентификации P. aeruginosa. Диагностическая чувствительность и специфичность культурального метода практически сопоставима с ПЦР и на сегодняшний день остается «золотым стандартом» в диагностике инфекционных осложнений, вызванных 196 P. aeruginosa. Привлекательность молекулярно-генетических технологий очевидна в сложных, арбитражных случаях при верификации морфологически нетипичных штаммов и мониторинге объектов окружающей среды. При идентификации клинических штаммов P. aeruginosa специфические праймеры для детекции exoA-гена, кодирующего экзотоксин А, и праймеры к участку гена 16S рибосомальной РНК имеют практически равное значение. При проведении в ЛПУ контроля обсемененности наряду с бактериологическим исследованием смывов с оборудования, инструментария, объектов внешней среды и др. целесообразно дополнительно подвергать пробы ПЦР-анализу для обнаружения видовых детерминант клинически значимых бактерий. Включение в схему эпидемиологического надзора ПЦР-метода в качестве дополнительного теста при мониторинге P. aeruginosa повысит ее выявляемость и эффективность борьбы с синегнойной инфекцией в условиях стационара. Поскольку фенотипическое проявление признаков определяется внешними факторами, оценка потенциальной опасности штаммов, циркулирующих в стационаре, с высокой степенью достоверности возможна лишь на основе генетического анализа, позволяющего детектировать возбудитель, определять маркеры цитотоксичности и антибиотикорезистентности, в том числе в составе мобильных генетических элементов. В связи с широким распространением эпидемиологически значимых клонов полирезистентных штаммов P. aeruginosa в Пермском крае в практике необходимость лабораторий внедрения клинической генотипических микробиологической методов службы выявления возникла бета-лактамаз грамотрицательных бактерий. Детекция этого механизма резистентности важна в первую очередь для эпидемиологического анализа распространенности резистентных штаммов и разработки мероприятий инфекционного контроля. Устойчивость к БЛА штаммов P. aeruginosa может быть обусловлена различными механизмами, но среди значимых приобретенных детерминант резистентности выявлена продукция бета-лактамаз молекулярных классов D (оксациллиназы OXA14) и В (металло-бета-лактамазы VIM2). Большинство изолятов несут сразу несколько интегронов 1 класса с разным набором генов антибиотикорезистентности, в том числе гены aadA6 и aac6'-Ib, с экспрессией которых связана устойчивость к аминогликозидам. Обнаружена статистически значимая умеренная связь между наличием в геноме blaVIM2 и выделением штамма из ОРИТ (φ=0,369; p=0,0343). При детекции генов, кодирующих эффекторы TTSS ExoS и ExoU, подтверждено, что они часто встречаются в клинических изолятах P. aeruginosa: exoS определяли в 59,76%, а exoU – в 31,1% случаях, при этом штаммы с генотипом exoS-/exoU+ преобладали в геноме изолятов из ОРИТ (φ=0,466; p=0,0000). Особый интерес в контексте нозокомиальной инфекции представляет встречаемость данных эффекторов у продуцентов МБЛ. Ген exoU чаще обнаруживался и в составе генома МБЛ-продуцентов (φ=0,784; p=0,0004). Достоверной связи 197 между присутствием соответствующих эффекторов и материалом выделения штаммов не выявлено. Эффектор ExoS, продукцию которого связывают с колонизацией и персистенцией, «неспецифичен» и встречается в изолятах из различных биотопов и природных очагов примерно в равной степени. Тогда как ExoU, продукция которого коррелирует с неблагоприятными исходами синегнойной инфекции, может маркировать высоковирулентный и, чаще всего, карбапенемоустойчивый (или даже полиантибиотикорезистентный) госпитальный изолят. Сильная связь между присутствием в геноме exoU и blaVIM2 может объясняться клональным распространением P. aeruginosa ST235 VIM-2. Факт ассоциации exoU с P. aeruginosa ST235 подтвержден исследованиями последних лет (Maatallah M. et al., 2011). Если раньше считали, что тяжелые случаи нозокомиальной синегнойной инфекции связаны исключительно с селекцией и формированием госпитальных эковаров, использование молекулярно-генетических закреплении определенных методов позволило сиквенс-типов, сформулировать которые могут гипотезу иметь о заносе и эпидемиологическое распространение на определенных территориях (Эйдельштейн М.В. и соавт., 2012). Для быстрой оценки эпидемической ситуации целесообразно применение новых методов индикации, позволяющих обнаружить микроорганизм и охарактеризовать его значимость (определить наличие маркеров патогенности и антибиотикоустойчивости). Оптимальным решением этой задачи является применение мультилокусной ПЦР для одновременной идентификации (exoA), детекции генов МБЛ (blaVIM2) и цитотоксичности (exoU) изолятов P. aeruginosa. Учитывая, что мультиплексная способность метода ПЦР, как правило, ограничена и не позволяет одновременно детектировать большое количество генов, предложены различные варианты реакции с наиболее целесообразными для клинической практики мишенями, выбор которых обоснован данными скрининга с учетом региональных особенностей. Учитывая ограниченную способность фенотипических методов для типирования P. aeruginosa, как по биологическим свойствам, так и по признаку резистентности к АБП, использование молекулярно-генетических методов исследования для установления родства изолятов, может быть приоритетным (Шагинян И.А., 2000). Полученные результаты по использованию Rep- и RAPD-ПЦР для эпидемиологической характеристики нозокомиальных изолятов P. aeruginosa дополняют накопленный опыт подобных исследований и показывают неравнозначную информативность предлагаемых методик. Метод BOX-ПЦР, первоначально примененный для дифференциации Streptococcus pneumoniae (похожие BOX-элементы, а в частности boxA, были найдены в геноме и других видов), стали использовать для типирования бактерий рода Pseudomonas. В исследовании, проведенном Wolska K. и соавт. (2011) и Morrelli P. и соавт. (2008), показано, что BOX-ПЦР является хорошим разрешающим методом 198 для генотипирования изолятов P. aeruginosa. Syrmis M.W. и соавт. (2004) делают вывод, что методы с использованием повторяющихся ERIC- и BOX-элементов для типирования штаммов P. aeruginosa имеют одинаковую разграничивающую силу и сопоставимы с ПЭ. В отличие от этих исследований, ранее Dawson S.L. и соавт. (2002) показали значительную гомологию изолятов P. aeruginosa при использовании BOX-ПЦР и, наоборот, гетерогенность по сравнению с другими видами, например Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens. По нашим данным применение BOX-ПЦР в определении родства штаммов P. aeruginosa оказалось не столь эффективным. В то же время возможность применения недорогих и несложных в исполнении методов, что очень важно в условиях практического здравоохранения, показана на примере RAPD-ПЦР (D=0,993) и ERIC-ПЦР (D=0,875): первый, с высокой дискриминирующей способностью для P. aeruginosa предпочтительно использовать при кратковременных исследованиях (вспышки), второй (ERIC-ПЦР) – при пролонгированном мониторинге. В сложных случаях, особенно при переводах пациентов из одного отделения в другое (или в приемственных ЛПУ), может быть применен сравнительный нуклеотидный анализ последовательности OXA50-like, так как обнаружение идентичных оксациллиназ может служить дополнительным критерием родства. Оба метода (rep-ПЦР и SLST) рекомендованы для быстрой оценки эпидемиологической ситуации на уровне стационара или регионального анализа (референс-лаборатория). Известно, что псевдомонады относятся к убиквитарным микроорганизмам, для которых свойственно популяционное разнообразие, дающее возможность виду осваивать практически любые места обитания и выживать в различных биотопах макроорганизма. При расследовании инфекций, связанных с условно патогенными бактериями, дополнительным важным критерием этиологической значимости изолята служит определение у него различных факторов патогенности, а внутрибольничном их широкий набор и происхождении штамма выраженность могут (Зуева Л.П. соавт., и свидетельствовать 2003; о Брусина Е.Б., Рычагов И.П., 2006). Несмотря на то, что выявлена гетерогенность штаммов по фосфолипазной и гемолитической активности, пленкообразующей способности, антибиотикорезистентности и др.), а штаммы, изолированные из ОРИТ, характеризовались широким набором экспрессируемых факторов патогенности и выраженной множественной лекарственной устойчивостью (в том числе по геноиндикации), фенотипические паттерны популяций синегнойной палочки достоверно не различались в разнопрофильных отделениях хирургических стационаров. В связи с высокой частотой встречаемости сходных по свойствам вариантов в различных отделениях, можно полагать, что госпитализированные в ОРИТ пациенты становятся причиной распространения высоковирулентных штаммов при переводе их в другие отделения ЛПУ. В определенной степени популяционное разнообразие 199 обусловливается особенностями биотопа, послужившего источником инфицированного материала. Качественный сравнительный анализ позволил обнаружить слабую достоверную связь между продукцией фосфолипазы и «легочным» происхождением изолята (φ=0,285; p=0,0006), а также между продукцией пиоцианина и выделением культуры из раны (φ=0,237; p=0,0047). При этом количественная оценка уровня продукции пигментов пиоцианина и пиовердина с учетом материала выделения не показала статистически значимой разницы. В то же время нельзя не отметить в целом достоверно более выраженную продукцию пигментов у нозокомиальных изолятов, чем у внебольничных штаммов. По-видимому, изучаемые нами признаки являются доминантными и встречаются у подавляющего большинства природных штаммов P. aeruginosa, но их проявление на уровне модификационной изменчивости зависит от окружающих условий, что и обусловливает гетерогенность популяций синегнойной палочки. Поэтому, при расследовании инфекций, связанных с P. aeruginosa, уровень активности пигментов, регистрируемый посредством спектрофотометрического метода, может быть дополнительным важным критерием этиологической значимости изолята и основанием для прогнозирования возможного течении/исхода инфекционного процесса. Повреждение эукариотических реализуется при участии клеток, многих осуществляемое бактериями факторов, в том P. aeruginosa, числе токсинов, рамнолипидов/биосурфактантов и ферментов (Berka R.M. Vasil M.L. 1982; Vallis A.J. et al., 1999; Armstrong S. et al., 2002; Sato H., Frank D.W., 2004; Jensen P.O. et al., 2007; Sánchez M. et al., 2010 и др.). Действие на эритроциты супернатантов существенно варьировало, в том числе и термоустойчивого компонента, а в ряде случаев, лизис зависел именно от него. У всех нозокомиальных штаммов P. aeruginosa зафиксирован самостоятельно значимый клеточноассоциированный гемолиз, который не связан с секретируемой гемолитической активностью. Уровень гемолиза существенно увеличивался после центрифугирования, обеспечивающего более тесное межклеточное взаимодействие. Адгезивная способность штаммов P. aeruginosa имела значение только при «пассивном» контакте, но, и в этом случае, и после центрифугирования гемолитическая активность оказалась зависимой от температурного режима и была выше при температуре, оптимальной для роста культуры. При сравнении адгезивных свойств при 37ºC и 25ºC не выявлено достоверного снижения ИАМ для большей части штаммов, однако, различая в группах были статистически значимыми (р=0,0018). По-видимому, более низкие показатели клеточно-опосредованной гемолитической активности в температурном режиме 25ºC определяются адгезивными свойствами культуры, но в большей степени – функционированием эффекторов TTSS, активность которых выше при температурах, оптимальных для роста культуры. Необходимо отметить, что клеточно-ассоциированный гемолиз не всегда был детерминирован цитотоксическим генотипом: только два штамма обнаружили в геноме exoU, 200 экспрессирующий убиквитин-активируемую фосфолипазу А2. Остальные культуры, включая референтный штамм, были носителями exoS-гена, еще одного эффектора TTSS. Высказывается мнение, что у штаммов P. aeruginosa могут встречаться разнообразные эффекторы III типа секреторной системы и их комбинации, а это приводит к различным цитотоксическим фенотипам. Berthelot P. и др. (2003) выделили четыре группы фенотипов на основе их цитотоксичности против макрофагов: ExoU-продуценты, категоризированные как тип I, показывали самую высокую цитотоксичность, II тип был связан с присутствием ExoS. Учитывая, что TTSS P. aeruginosa включает около 40 генов, кодирующих сами эффекторы, а также регулирующие и координирующие белки, сложные взаимодействия, которых происходят во время экспрессии tox-генов, роль этой системы в инфекционном процессе, будет проясняться и дальше. Таким образом, показано, что степень выраженности гемолитической активности, набор и соотношение факторов, ее обусловливающих, является штаммовой характеристикой, определяющей «гемолитический профиль» культуры. Это лишний раз указывает на то, что используемый в лабораторной практике качественный метод оценки гемолитической активности, не позволяет проводить сравнительный анализ степени ее выраженности у разных штаммов. Формирование бактериальных биопленок подчинено некоторым общим закономерностям, но вместе с тем, для каждого вида существуют свои особенности, реализующиеся в индивидуальных программах биопленкообразования на видовом, популяционном или штаммовом уровне (Karatan E., Watnick P., 2009; Petrova O.E., Sauer K., 2009; Маянский А.Н. и соавт., 2012). Это предположение, высказанное некоторыми исследователями, справедливо, прежде всего, в отношении P. aeruginosa, учитывая многокомпонентность регуляторных систем, которыми располагает данный возбудитель. При изучении биопленкообразования P. aeruginosa показано, что закрепление этих микроорганизмов на поверхности и ее дальнейшая колонизация далеко не всегда детерминируется гидрофобностью клеток. Показатель гидрофобности клеточной поверхности у свежевыделенных штаммов P. aeruginosa не превышал 30%, при этом зафиксированная слабая связь между показателями гидрофобности и биомассы биопленки (R=0,269; p=0,062) становилась менее значимой при сравнении данных показателей у длительно хранившихся культур, несмотря на то, что гидрофобность при этом увеличивалась. Очевидно, что относительно низкую гидрофобность клеточной поверхности у псевдомонад могут компенсировать другие факторы адгезии, в том числе пили, жгутики, альгинат, гемагглютинин и др. Заслуживает внимание тот факт, что показатели неспецифической адгезии как к гидрофильной, так и к гидрофобной поверхности, снижались при хранении культур. Все штаммы отнесены к адгезивным или высокоадгезивным вариантам при взаимодействии с эритроцитами, в случае «специфической» адгезии, определяющей колонизацию в биотопах макроорганизма. Можно полагать, что у клинических штаммов 201 доминируют механизмы специфической адгезии, а способность эффективно прикрепляться к разным типам абиотических поверхностей обеспечивает выживание псевдомонад в госпитальных условиях. Сочетание этих двух механизмов – одна из основных стратегий выживания бактерий и в окружающей среде, и в организме инфицируемых хозяев. Сохранение, а в ряде случаев увеличение адгезивной и пленкообразующей способности при смене температуры роста культур, изменение гидрофобности клеточной поверхности и массивности биопленки при хранении и др., могут свидетельствовать о больших адаптационных возможностях P. aeruginosa в различных условиях обитания, обеспечивающих быстрый переход культуры из планктонной в биопленочную форму. Кроме этого, по-видимому, в пределах вида можно выделить штаммы P. aeruginosa с предоминантной формой существования бактерий: «планктонной» или «биопленочной». Такая гипотеза основана на результатах, полученных с помощью как рутинных, так и специальных методов исследования, характеризующих различные морфофункциональные особенности биопленок: разброс показателей биомассы пленки у разных штаммов, различные сроки созревания и дезинтеграции «зрелой» биопленки, характер изменения пленкообразующей способности в зависимости от температуры, соотношение «клеточного» и «матриксного» компонента в составе биопленки, а также изменение числа жизнеспособных клеток и их энергетического статуса по мере ее развития. Показано, что концентрация внутриклеточного АТФ, характеризующая метаболический статус клеток в определенной фазе роста биопленки, является важнейшим критерием для отбора штаммов с преимущественной «биопленочной» формой существования. Это возможность обусловлена тем, что метод АТФ-метрии успешно используют для анализа численности и биологической активности бактерий в планктонной культуре и биопленках (Takenaka T., 1994; Ефременко Е.Н., 2010; Sánchez M. et al., 2013). В контексте клинической значимости полученные результаты изучения особенностей формирования биопленок внутрибольничными штаммами P. aeruginosa, а также установленная в ряде случаев связь показателей пленкообразующей способности и других факторов вирулентности, указывают на то, что данный признак может служить одним из маркеров госпитальности, а выявление изолятов с высокой степенью пленкообразования требует новых подходов к организации и проведению дезинфекционных мероприятий по элиминации возбудителя. Фенотипические проявления патогенного потенциала микроорганизмов подчинены влиянию разнообразных факторов, расшифровка механизмов действия которых требует углубленных, зачастую пролонгированных во времени исследований. Получаемые при этом количественные показатели токсино- и/или ферментообразования штаммов характеризуются многофакторной детерминированностью. С учетом того, что для P. aeruginosa характерно разнообразие тонких механизмов регуляции экспрессии факторов вирулентности, выявлено две 202 основные тенденции: у части штаммов при хранении наблюдалось перманентное снижение синтеза пиовердина/пиоцианина и биопленкообразующей способности, а другая часть изолятов, как с высоким, так и с низким уровнем проявления признаков, вне макроорганизма их утрачивала, но любой провоцирующий фактор – смена условий или среды культивирования – обуславливал быстрое восстановление патогенного потенциала. Такая ответная реакция отражает выраженность адаптивных свойств и экологическую пластичность у ряда штаммов, что может свидетельствовать об их различном происхождении: случайный занос во внутрибольничную среду или госпитальная природа. Учитывая широкий набор факторов вирулентности, в настоящее время существует необходимость экспрессной, экономичной оценки и дифференцировки большого числа штаммов P. aeruginosa, изолируемых в ЛПУ. Традиционные микробиологические методы оценки отдельных свойств этих бактерий не позволяют составить целостного представления о патогенном потенциале P. aeruginosa, что обусловлено, в том числе, известными в биологии эффектами взаимовлияния токсических веществ при их совместном действии. Нами изучено влияние экзометаболитов клинических штаммов P. aeruginosa на биолюминесценцию E. coli lux+ и экспериментально обоснована целесообразность использования биолюминесцентного метода для оценки их потенциальной патогенности. Согласно индексу потенциальной патогенности штаммы P. aeruginosa разделены на 3 группы: штаммы с низкой степенью патогенности, умеренно и высоко патогенные варианты. Группа с ИПП≥70% характеризовалась достоверно высоким коэффициентом корреляции с уровнем продукции пиоцианина, пиовердина, гемолитической активностью и пленкообразующей способностью. Выявлено, что интенсивность раннего и позднего апоптоза нейтрофилов статистически значимо увеличивалась при их часовой экспозиции с супернатантами большей части культур P. aeruginosa. При этом обнаружена сильная отрицательная зависимость между показателями ИПП и количеством жизнеспособных клеток (r=-0,536, р=0,05), что связано, в том числе, и с действием пиоцианина в составе супернатантов. Это указывает на возможность использования биолюминесцентного метода в качестве скринингового или дополнительного способа оценки степени вирулентности изолятов P. aeruginosa, в частности при диагностике ГСИ. Известно, что в природной среде микроорганизмы сосуществуют в многокомпонентных сообществах (Smith V.H., 2002; Бухарин О.В. и соавт., 2005, 2007; Маянский А.Н. и соавт., 2012 и др.). Необходимо учитывать, что закрепление транзиторной микрофлоры, представленной условно патогенными и патогенными бактериями, во многом зависит как от стабильности и защитных свойств нормальной микрофлоры макроорганизма, так и от антагонистического воздействия инфекта. При ряде инфекционных процессов, вызванных P. aeruginosa, возможно сочетанное персистирование в очаге других видов, но синегнойная палочка занимает чаще всего 203 доминантное положение. Последнее может осуществляться преимущественно за счет микробных клеток и их компонентов, либо выработки экзометаболитов, а также возможно сочетание двух этих механизмов. Учитывая, что между микробными компонентами при формировании биопленок существуют многообразные метаболические взаимоотношения, при которых взаимодействие имеет либо односторонний характер, либо наблюдается взаимное положительное или отрицательное влияние компонентов сессильных культур друг на друга, показатель, характеризующий биомассу смешанной биопленки, наряду с другими, может быть использован для оценки характера межмикробных взаимодействий. Вовлечение P. aeruginosa в полимикробные ассоциации с некоторыми видами микроорганизмов, включая E. coli, может изменять существующие фенотипические признаки, способствуя ее выживанию в различных местах обитания. Возможность оценивать и прогнозировать характер существования P. aeruginosa в составе смешанных планктонной и пленочной культур реализована in vitro с учетом биолюминесценции E. coli K12 TG1, отражающей изменения энергетического статуса ассоцианта. Наиболее принципиальными данными, полученными при исследовании смешанной культуры, являются следующие: оба ассоцианта взаимно влияют друг на друга при росте в планктонной культуре и при формировании совместной биопленки, а характер взаимоотношений с P. aeruginosa в ассоциации, опосредован уровнем продукции факторов патогенности. При этом выявлены однонаправленные эффекты у всех P. aeruginosa при росте в смешанной культуре, а именно снижение общего уровня пиоцианина и пиовердина, подавление метаболического обмена E. coli, повышение биомассы бинарной биопленки. Однако, несмотря на схожий вектор изменений, показаны разные стратегии выживания и взаимодействия P. aeruginosa в полимикробной ассоциации, которые определяются значительной гетерогенностью клинических популяций и зависят от ее предоминантной формы существования. С одной стороны, возможна значительная интенсификация биопленкообразования в сочетании с высокой удельной продукцией патогенных факторов в планктонной культуре (P. aeruginosa БАЛЖ), с другой – повышенный уровень продукции пигментов осуществляется за счет экстенсивного планктонного роста (P. aeruginosa 9-3). Установлено, что в смешанном биопленочном сообществе биологическая активность ассоциантов подчиняется общим закономерностям, описанным для монокультур, при этом антагонистическая активность клеток P. aeruginosa в отношении ассоцианта в планктоне сохраняется и в биопленке, способствуя их выживанию. Более того, при любом типе взаимоотношений с участием P. aeruginosa, последняя, как правило, занимает выгодное положение в различных экологических нишах. Метаболическая характеристика (включая эффекторы системы кворума) P. aeruginosa при совместном культивировании с типичными представителями микробных ассоциаций, 204 встречающихся в различных биотопах, может быть использована в качестве системной модели, для понимания механизмов дифференцированной колонизационной резистентности и социального поведения бактерий в многокомпонентных системах. Нейтрофилы человека являются главными участниками воспалительного ответа, обеспечивая локальную защиту в тканях при бактериальном инфицировании. Баланс между апоптозом и некрозом нейтрофилов, равно как и реализация ими кислородзависимых механизмов бактерицидности, в большинстве случаев, определяет исход воспаления и степень повреждения тканей при элиминации патогенов. При этом большое значение для модуляции активности нейтрофилов имеет локальное окружение (Хайдуков С.В. и соавт., 2011). В настоящее время появились наблюдения, свидетельствующие о том, что кроме воспалительных медиаторов на жизнеспособность и функции нейтрофилов могут влиять и бактериальные факторы P. aeruginosa и E. coli (Usher L.R. et al., 2002; Дерябин Д.Г. и соавт., 2013). Показано, что при краткосрочном воздействии супернатанты смешанной культуры с P. aeruginosa существенно отличаются от моновидовых по воздействию на нейтрофилы, что проявляется в достоверном увеличении жизнеспособных клеток и снижении процессов некроза нейтрофилов по сравнению с действием супернатантов P. aeruginosa. Супернатанты смешанной культуры стимулировали окислительную активность нейтрофилов сильнее, чем бесклеточные фильтраты P. aeruginosa, что, по-видимому, связано с более высоким количеством жизнеспособных клеток. Полученные данные позволяют предположить, что при развитии инфекционного процесса, вызванного ассоциацией двух видов микроорганизмов, P. aeruginosa и E. coli, повреждающее действие на ткани в очаге воспаления будет меньшим вследствие низкого уровня продукции бактериальных экзометаболитов и высвобождения цитотоксических белков нейтрофилов. Одним из перспективных направлений дальнейших исследований может быть комплексная оценка влияния супернатантов смешанных культур с участием P. aeruginosa на иммунные клетки макроорганизма. 205 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что инфицированность пациентов P. aeruginosa и ее доля в спектре микроорганизмов в различных биологических материалах зависит от профиля стационара и возрастной категории пациентов. P. aeruginosa остается одним из ведущих возбудителей госпитальных нозологий – пневмоний, раневых инфекций и инфекций мочевыводящих путей во взрослой клинике. Частота выделения штаммов P. aeruginosa от хирургических больных взрослой сети оказалась наиболее высокой, составив 10,5% в общих и 18,1% в реанимационных отделениях. До 70% случаев культуры P. aeruginosa выделяют из биоматериала в составе ассоциаций, в которых чаще всего присутствуют другие грамотрицательные бактерии: K. pneumoniae, A. baumannii и E. coli. 2. Показано, что P. aeruginosa не играет существенной роли ни в качестве колонизирующего микроорганизма, ни в качестве этиопатогена у новорожденных. Наиболее значимой P. aeruginosa может быть только в случае ГСИ дыхательных путей, при всех других воспалительных процессах ее доля меньше 10%. 3. На этапе идентификации возбудителя диагностическая значимость культурального метода сопоставима с ПЦР-анализом. Учитывая ограниченную дискриминирующую способность фенотипических методов при микробиологическом мониторинге P. aeruginosa, как по биологическим свойствам, так и по признаку резистентности к антибактериальным препаратам, предпочтительнее использовать молекулярные методы, эффективность которых повышает применение мультиплексной ПЦР с одновременной детекцией микроорганизмов и оценкой их патогенного потенциала. При локальных исследованиях для определения родства изолятов оптимальными тестами являются RAPD-ПЦР и ERIC-ПЦР. 4. Выявлено, что продуценты МБЛ VIM2-типа широко распространены на территории Пермского края в хирургических ЛПУ взрослой медицинской сети. Гены карбапенемаз сцеплены с другими детерминантами антибиотикорезистентности и включены в состав интегронов I класса. Обнаружена статистически значимая сильная связь между наличием в геноме blaVIM2 и присутствием exoU, умеренная – между blaVIM2 и выделением штамма из ОРИТ. Достоверных отличий по распространению эффекторов TTSS exoU и exoS в различных патологических материалах не выявлено. 5. Показано, что фенотипические паттерны популяций P. aeruginosa существенно не различаются в разнопрофильных отделениях стационаров, но могут зависеть от материала/биотопа. Клинические изоляты гетерогенны по уровню продукции пиоцианина и пиовердина, биопленкообразующей способности. Выявлена сильная связь между биопленкообразованием и гемолитической активностью для культур, изолированных из 206 раневого отделяемого и из мокроты, у последних прослежена связь между биопленкообразованием и фосфолипазной активностью. При выращивании P. aeruginosa на искусственных питательных средах наблюдается разнонаправленное изменение активности изучаемых факторов в зависимости от условий и состава среды, числа пассажей и времени хранения, что характеризует адаптационные возможности штаммов. 6. Установлено, что предлагаемый для определения «гемолитический профиль» является основополагающей штаммовой характеристикой и складывается из термолабильного и термостабильного экзометаболитных компонентов, а также самостоятельно значимого клеточно-ассоциированного гемолиза. 7. Показано, что среди высокопленкообразующих штаммов P. aeruginosa встречаются как гидрофильные, так и более гидрофобные по BATH-тесту варианты. Все штаммы отнесены к адгезивным или высокоадгезивным в отношении эритроцитов, что отражает «специфическую» адгезию, определяющую колонизацию в биотопах макроорганизма. При низких температурах увеличивается биомасса пленки большей части штаммов P. aeruginosa, что обусловлено либо увеличением продукции полисахаридного матрикса, либо «клеточным компонентом», в зависимости от предоминантной формы существования псевдомонад – «планктонной» или «биопленочной». Определяемая в биопленках концентрация внутриклеточного АТФ, характеризует энергетический статус клеток в соответствующей фазе формирования биопленки, и является важнейшим критерием для отбора штаммов с преимущественной «биопленочной» формой существования. 8. Экспериментально обоснована целесообразность использования биолюминесцентного метода для интегральной оценки патогенного потенциала нозокомиальных штаммов P. aeruginosa. Сильная положительная связь установлена между предложенным индексом потенциальной патогенности (ИПП) и показателями, характеризующими уровень продукции пиоцианина, гемолитическую активность, биопленкообразующую способность. При этом показана обратная корреляция ИПП с % прироста E. coli lux+ и количеством жизнеспособных нейтрофилов. 9. Выявлены однонаправленные эффекты при росте P. aeruginosa в смешанной культуре, а именно снижение общей продукции синегнойной палочкой пиоцианина и пиовердина, подавление метаболизма E. coli, повышение биомассы биопленки. При этом характер взаимоотношений с E. coli и в планктоне, и в биопленке определяется уровнем антагонистической активности и предоминантной формой существования P. aeruginosa. Биолюминесценция E. coli K12 TG1, отражающая энергетический статус клетки, дает возможность оценивать и прогнозировать тип совместного существования микроорганизмов. 207 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При проведении санитарно-бактериологического контроля (планового и, особенно, по эпидемическим показаниям) в лечебных учреждениях, наряду с прямыми посевами смывов с оборудования, инструментария, объектов внешней среды и др., на специальные среды, образцы необходимо дополнительно подвергать молекулярно-генетическому анализу (на основе ПЦР с видоспецифичными праймерами) для прямой детекции P. aeruginosa. Включение в схему эпидемиологического надзора ПЦР-метода в качестве дополнительного теста при мониторинге P. aeruginosa повысит ее выявляемость и эффективность борьбы с синегнойной инфекцией в условиях стационара. 2. В ходе эпидемиологических исследований для внутривидового типирования изолятов P. aeruginosa предложено использовать RAPD-ПЦР и ERIC-ПЦР, как наиболее доступные с методической и экономической точки зрения реакции, позволяющие адекватно решать поставленные задачи при определении родства штаммов. 3. Предложен оптимальный набор тестов бактериологического анализа для оценки патогенного потенциала определение нозокомиальных трех штаммов параметров: P. aeruginosa, гемолитическую включающий активность, количественное продукцию пигментов (пиоцианина, пиовердина) и биопленкообразование. При проведении мониторинговых исследований целесообразно выявлять «гемолитический профиль» культуры, позволяющий оценивать участие различных субстанций в проявлении гемолитической активности и прогнозировать характер течения инфекционного процесса. 4. При оценке клинической и эпидемиологической значимости изолятов целесообразно определять маркеры вирулентности/цитотоксичности (exoS и exoU) и детерминанты антибиотикорезистентности (blaVIM, int1) в мультиплексной ПЦР. 208 СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ АБП – антибактериальный препарат АДФ – аденозин-5'-дифосфат БЛА – бета-лактамный антибиотик БЛРС – бета-лактамаза расширенного спектра ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИВЛ – искусственная вентиляция легких ИСМП – инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи КОЕ – колониеобразующая единица ЛПУ – лечебно-профилактическое учреждение МБЛ – металло-бета-лактамаза НАД+ – никотинамид-аденин-динуклеотид НГОБ – неферментирующие грамотрицательные бактерии ОП – оптическая плотность ОРИТ – отделение реанимации и интенсивной терапии Пвд – пиовердин Пцн – пиоцианин ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЭ – пульс-электрофорез рРНК – рибосомная рибонуклеиновая кислота УПМ – условно-патогенные микроорганизмы ФЛА – фосфолипазная активность BOX-ПЦР – ПЦР повторяющихся BOX-последовательностей LD50 – полулетальная доза QS – quorum sensing, «чувство кворума» RAPD-ПЦР – ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК TTSS – система секреции III типа 209 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абаев, Ю.К. Госпитальная инфекция у новорожденных / Ю.К. Абаев // Дет. хирургия. – 2006. – № 5. – С.36-41. 2. Белобородова, Н.В. Микробные биопленки / Н.В. Белобородова, И.Т. Байрамов // Гнойно- септические заболевания у детей. Мат. V Моск. конф. с участием регионов России и стран СНГ. – М.: НЦ ССХ им. А.М. Бакулева РАМН, 2009. – С.7-38. 3. Белокрысенко, С.С. Выделение и сравнительная оценка методов идентификации клинических штаммов Stenotrophomonas maltophilia / С.С. Белокрысенко, А. Дадха Теграни // Клин. лаб. диагностика. – 2004. – № 6. – С. 37-38. 4. Бережанский, Б.В. Катетер-ассоциированные инфекции кровотока / Б.В. Бережанский, А.А. Жевнерев // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2006. – Т. 8, № 2. – С. 130-144. 5. Брусина, Е.Б. Внутрибольничные инфекции, обусловленные формированием госпитального штамма / Е.Б. Брусина, И.П. Рычагов // Стерилиз. госпит. инф. – 2006. – № 2. – С. 32-34. 6. Бухарин, О.В. Ассоциативный симбиоз / О.В. Бухарин, Е.С. Лобакова, Н.В. Немцева, С.В. Черкасов – Екатеринбург: УрО РАН, 2007. – 264 с. 7. Бухарин, О.В. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова. – М.: Медицина, 2005. – 367 с. 8. Бухарин, О.В. Характеристика антагонистической активности пробиотических бактерий при их взаимодействии / О.В. Бухарин, А.В. Семенов, С.В. Черкасов // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2010. – Т.12, № 4. – С. 347-352. 9. Влияние бактериальных ауторегуляторных молекул (гомосеринлактонов и алкилоксибензолов) на окислительный метаболизм клеточных эффекторов естественного иммунитета / Д.Г. Дерябин, Т.Г. Свиридова, Г.И. Эль-Регистан, В.А. Черешнев // Микробиология. – 2013. – Т. 82, № 2. – С. 147. 10. Воропаева, С.Д. Микрофлора женских половых путей и ее чувствительность к антибактериальным препаратам / С.Д. Воропаева // Гинекология: реф. журнал. – 2005. – № 11. – С. 64-70. 11. Гельфанд, Б.Р. Этиологическая и нозологическая структура госпитальных инфекций в отделении реанимации хирургического профиля / Б.Р. Гельфанд, Б.З. Белоцерковский, Т.В. Попов // Инфекции в хирургии. – 2003. – Т. 1, № 4. – С. 2-10. 12. Генотипические особенности штаммов Pseudomonas aeruginosa, циркулирующих в хирургическом стационаре / Л.Р. Аветисян [и др.] // Журн. микробиол. – 2009. – № 5. – С. 33-38. 210 13. Гординская, Н.А. Фенотипические и молекулярно-генетические особенности возбудителей раневой ожоговой инфекции / Н.А Гординская, Е.В. Сабирова, Н.В. Абрамова // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2012. – Т. 14, № 4. – С. 342-346. 14. Громашевский, Л.В. Избранные труды. В трех томах. / Л.В. Громашевский. – Киев: Здоров'я, 1987. 15. Дерябин, Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты / Д.Г. Дерябин. – М.: Наука, 2009. – 246 с. 16. Ермолов, А.С. Микробная этиология гнойно-септических осложнений в различных хирургических подразделениях стационара / А.С. Ермолов, Д.Д. Меньшиков, Н.А. Карасев // Стерил. госпит. инфек. – 2007. – Т. 2, № 4. – С. 39-43. 17. Ефременко, Е.Н. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты: автореф. дис. ... док. биол. наук: 03.00.02; 03.00.23 / Ефременко Елена Николаевна. – Москва, 2009. – 51 с. 18. Жданюк, А.С. Нозокомиальная пневмония у травматологических больных: результаты проспективного наблюдательного исследования / А.С. Жданюк, О.У. Стецюк, О.В. Сивая // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2010. – Т. 12, № 2. – С. 106-116. 19. Захарова, И.Н. Инфекции мочевой системы у детей: современные представления об этиологии / И.Н. Захарова // Нефрол. диализ. – 2001. – Т. 3, № 1. – С. 20-23. 20. Зоркин, С.Н. Взгляд на антибактериальную терапию у детей с урологической патологией / С.Н. Зоркин, Л.К. Катосова, З.Н. Музыченко // Лечащий врач. – 2010. – № 8. – С. 6-10. 21. Зубков, М.Н. Диагностика и антимикробная терапия катетер-ассоциированных инфекций кровотока / М.Н. Зубков // Хирургия. – 2008. – № 1. – С. 18-22. 22. Зубков, М.Н. Неферментирующие бактерии: классификация, общая характеристика, роль в патологии человека. Идентификация Pseudomonas spp. и сходных микроорганизмов / М.Н Зубков // Инф. антимикроб. тер. – 2003. – Т. 5, № 1. – С. 1-16. 23. Зуева, Л.П. Эпидемиологическая диагностика / Л.П. Зуева, Р.Х. Яфаев, С.Р. Еремин. – СПб: ГОУ ВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова МЗ России, 2003. – 264 с. 24. Иванов, Д.В. Особенности антибиотикочувствительности важнейших грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций / Д.В. Иванов, Н.Д. Бунятян, Д.Б. Утешев // Вест. Росс. гос. мед. ун-та. – 2009. – № 2. – С. 26-29. 25. Ильина, Т.С. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Мол. генетика, микробиол. вирусол. – 2006. – № 3. – С. 22-29. 26. Илюкевич, Г.В. Синегнойная инфекция в ОРИТ: современное состояние проблемы / Г.В Илюкевич, В.М. Смирнов, Н.Н. Левшина // Медицинские новости. – 2008. – 6 с. 211 27. Инфекции в ОРИТ России: результаты национального многоцентрового исследования / В.А. Руднов [и др.] // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2011. – Т. 13, № 4. – С. 294303. 28. Исследование распространенности метало-бета-лактамаз в Российской Федерации / Черкашин Е.А. [и др.] // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Химия. – 2006. – № 47 (3). – С. 83-86. 29. Ковалева, Е.П. Внутрибольничные инфекции в педиатрии / Е.П. Ковалева, Н.А. Семина // Эпидемиол. инф. бол. – 2002. – № 5. – С. 4-6. 30. Козлов, Р.С. Нозокомиальные инфекции: эпидемиология, патогенез, профилактика, контроль / Р.С. Козлов // Клин. микробиол. антимикро. химиотер. – 2000. – Т. 2. № 1. – С. 16-30. 31. Красовский, С.А. Остеопороз, частота деформаций позвонков и периферических переломов, уровень костных биохимических маркеров и витамина D у взрослых больных муковисцидозом / С.А. Красовский, И.А. Баранова, Н.В. Демин // Материалы Х Национального конгресса «Муковисцидоз у детей и взрослых». – 2011. – С. 52-62. 32. Крутиков, М.Г. Контроль инфекции в ожоговом стационаре [Электронный ресурс] / М.Г. Крутиков // Комбустология. – 2003. 14; http://www.burn.ru/all/number/show/?id=3531. 33. Крючкова, Т.П. Микробиологический мониторинг и эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями в стационарах Краснооктябрьского района г. Волгограда: дис. ... канд. мед.наук: 03.00.07 / Крючкова Татьяна Петровна – Волгоград, 2005. – 123 с. 34. Кузнецова, О.П. Инфекции мочевыводящих путей (I часть) / О.П. Кузнецова, П.А. Воробьев, С.В. Яковлев // Рус. мед. журнал. – 1997. – Т. 5, № 2. – С. 81-90. 35. Лещенко, И.А. Ретроспективный анализ причин и тяжести микробных кератитов, связанных с ношением контактных линз / И.А. Лещенко // Совр. оптометрия. – 2011. – № 9. – С. 22-24. 36. Лопаткин, Н.А. Неосложненные и осложненные инфекции мочеполовых путей. Принципы антибактериальной терапии / Н.А. Лопаткин, И.И. Деревянко // Рус. мед. журнал. – 1997. – Т. 5, № 24. – С. 1579-1588. 37. Лопухов, Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2000. – Т. 2, № 3. – С. 96-100. 38. Магданова Л.А., Голясная Н.В. Гетерогенность как адаптивное свойство бактериальной популяции / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Микробиология. – 2013. – Т. 82, № 1. – С. 3-13. 39. Маркович, Н.И. Эпидемиолого-микробиологические и организационные ресурсы повышения эффективности эпидемиологического надзора и контроля за гнойно-септическими инфекциями новорожденных и родильниц: автореф. дис. … док. мед. наук: 14.02.02 / Маркович Нина Ивановна. – Пермь, 2011. – 49 с. 212 40. Маянский, А.Н. Pseudomonas aeruginosa: характеристика биопленочного процесса / А.Н. Маянский // Мол. генетика микробиол. вирусол. – 2012. – № 1. – С. 3-8. 41. Маянский, А.Н. Межвидовые взаимодействия бактерий и образование смешанной (полимикробной) биопленки / А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь, Н.И. Евтеева // Журн. микробиол. – 2012. – № 1. – С. 93-101. 42. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис [и др.] // Лаб. дело. – 1986. – № 4. – С. 210-212. 43. Методические микроорганизмов к указания МУК 4.2.1890-04 «Определение антибактериальным препаратам» (утв. чувствительности Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.). 158 с. 44. Милько, Е.С. Морфологические и физиолого-биохимические особенности диссоциантов Pseudomonas aeruginosa / Е.С. Милько, Л.П. Мартынкина // Микробиология. – 1996. – Т. 65, № 5. – С. 352-356. 45. Мингболатова, П.А. Влияние бактериального агента на цилиарную активность слизистой оболочки среднего уха / П.А. Мингболатова // Рос. оториноларингол. – 2008. – № 6. – С. 83-88. 46. Мороз, А.Ф. Синегнойная инфекция / А.Ф. Мороз, Н.Г. Анциферова, Н.В. Баскакова // Под ред. А.Ф. Мороз. – М.: Медицина, 1988. – 256 с. 47. Мусина, Л.Т. Этиология и нозология внутрибольничных гнойно-воспалительных заболеваний у новорожденных детей / Л.Т. Мусина, Н.А. Семина, Гладкова К.К. // Рос. вестн. перинатол. педиат. – 1995. – Т. 40, № 1. – С. 39-42. 48. Неферментирующие грамотрицательные возбудители нозокомиальных инфекций в ОРИТ России: проблемы антибиотикорезистентности / Г.К. Решедько [и др.] // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2006. – Т. 8, № 3. – С. 243-259. 49. Николаев, Ю.А. Биопленка – “город микробов” или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 2. – С. 149-163. 50. Николаев, Ю.А. Регуляция адгезии у бактерий Pseudomonas fluorescens под влиянием дистантных межклеточных взаимодействий / Ю.А. Николаев // Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 3. – С. 356-361. 51. Нозокомиальная пневмония у взрослых. Российские национальные рекомендации. Под ред. А.Г. Чучалина, Б.Р. Гельфанда. – М., 2009. – 91 с. 52. Нозокомиальная пневмония, связанная с искусственной вентиляцией легких (НПивл), у хирургических больных / Б.Р. Гельфанд [и др.]. – М., 2000. – 43 c. 53. Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико- диагностических лабораториях лечпрофучреждений. Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.85 г. 213 54. Олигонуклеотидный микрочип для идентификации генов карбапенемаз молекулярных классов A, B и D / М.М. Уляшова [и др.] // Acta Naturae. – 2010. – № 3. – C. 116-125. 55. Особенности микрофлоры нижних дыхательных путей у различных возрастных групп детей больных муковисцидозом / И.А. Шагинян [и др.] // Материалы Х Национального конгресса «Муковисцидоз у детей и взрослых», 2011. – С. 64-71. 56. Персистенция штаммов Pseudomonas aeruginosa среди пациентов ФНЦ трансплантологии и искусственных органов / Л.Р. Аветисян [и др.] // Журн. микробиол. – 2012. – № 4. – С. 99-104. 57. Подзолкова, Н.М. Тяжелые бактериальные инфекции в акушерстве и гинекологии / Н.М. Подзолкова, Т.И. Никитина // Инф. антимикроб. тер. – 2004. – Т. 6, № 3. – С. 89-92. 58. Полное строение липополисахарида Pseudomonas aeruginosa иммунотипа 5 / О.В. Быстрова [и др.] // Биохимия. – 2004. – № 69. – С. 211-217. 59. Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-β-лактамазы, в России, Белоруссии и Казахстане / М.В. Эйдельштейн [и др.] // КМАХ. – 2012. – Т. 14, № 2. – С. 132-152. 60. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. – М.: Медиа-Сфера, 2006. – 312 с. 61. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России / Г.К. Решедько [и др.] // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2008. – Т. 10, № 2. – С. 163-179. 62. Романова, Ю.М. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Журн. микробиол. – 2011. – № 3. – С. 99-109. 63. Руднов, В.А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации / В.А. Руднов // Инф. антимикроб. тер. – 2002. – Т. 4, № 5. – С. 170-177. 64. Руднов, В.А. Антибиотикотерапия госпитальных инфекций, вызванных P. aeruginosa / В.А. Руднов // Рус. мед. журнал. – 2005. – Т. 13, № 7. – С. 485-490. 65. Самсыгина, Г.А. Антибактериальная терапия сепсиса у детей (пособие для врачей) Комиссия по антибиотикополитике МЗ РФ и РАМН / Г.А Самсыгина. – М., 2003. – 12 с. 66. Самсыгина, Г.А. Госпитальные пневмонии у детей: этиология и клинико- морфологические особенности / Г.А. Самсыгина, Т.А. Дудина, М.В. Чебышева // Педиатрия. – 2001. – № 1. – С. 5-8. 67. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / В.С. Данилов [и др.] // Вестник МГУ. Серия Биология. – 2002. – № 3. – С. 20-24. 214 68. Сергевнин, В.И. Вопросы эпидемиологии гнойно-септических инфекций новорожденных / В.И. Сергевнин // Глав. мед. сестра. – 2014. – № 3. – С. 80-85. 69. Сидоренко, С.В. Клиническое значение Pseudomonas aeruginosa / С.В. Сидоренко // Клин. фармакол. и тер. – 2003. – Т. 12, № 2. – С. 1-7. 70. Сидоренко, С.В. Госпитальные инфекции, вызванные P. aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности / С.В. Сидоренко, С.П. Резван, Г.А. Стерхова, С.А. Грудинина // Антиб. химиотер. – 1999. – № 3. – С. 25-34. 71. Слабенко, Э.В. Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов P. aeruginosa – возбудителя внутрибольничных пневмоний у пациентов с черепномозговыми травмами: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 03.00.07 / Слабенко Эллада Владимировна. – Владивосток, 2007. – 25 с. 72. Способ определения антагонистической активности пробиотиков / В.А. Несчисляев [и др.] // Патент на изобретение РФ №2187801 от 10.07.2000. Бюл. № 23, 2002. 73. Справочник биохимика: пер. с англ. / Р. Досон, Д. Эллиот, У Эллиот, К. Джонс. – М.: Мир, 1991. – 544 с. 74. Страчунский, Л.С., Сравнительная активность антисинегнойных антибиотиков в отношении нозокомиальных штаммов P. aeruginosa, выделенных в отделениях реанимации и интенсивной терапии России / Л.С. Страчунский, Г.К. Решедько, О.У. Стецюк, исследовательская группа РОСНЕТ // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2003. – № 5. – С. 35-46. 75. Структура возбудителей и их антибиотикорезистентность при инфекциях нижних конечностей у больных сахарным диабетом / В.В. Привольнев [и др.] // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2009. – Т. 11, № 1. – С. 86-89. 76. Телятицкий, Н.И. Нозокомиальная инфекция у новорожденных детей / Н.И. Телятицкий, Ю.К. Абаев // Мед. журнал. – 2010. – № 2. – С. 27-32. 77. Туркутюков, P. aeruginosa при В.Б. Особенности формирования биологических пленок штаммами внутрибольничных пневмониях / В.Б. Туркутюков, Э.В. Слабенко, Д.В. Фомин // Дальневост. мед. журнал. – 2008. – № 1. – С. 59-61. 78. Фельдблюм, И.В. Сравнительная оценка различных подходов к изучению заболеваемости гнойно-септическими инфекциями среди родильниц в акушерских стационарах / И.В. Фельдблюм, Ю.А. Захарова, С.Г. Деменко // Мед. альманах – 2011. – № 5 (18). – С. 209-212. 79. Фельдблюм, И.В. Эпидемиологическая диагностика внутрибольничных гнойно- септических инфекций синегнойной этиологии на основе внутривидового типирования возбудителя / И.В. Фельдблюм, Ю.А. Захарова, А.М. Николаева, О.С. Федотова // Журн. микробиол. – 2013. – № 1. – С. 14-20. 215 80. Фоминых, С.Г. Раневые инфекции: значение микробиологического мониторинга при составлении больничного формуляра антимикробных препаратов / С.Г. Фоминых // Клинич. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2011. – Т. 13, № 4. – С. 368-375. 81. Хайдуков, С.В. Цитометрический анализ в клинической иммунологии / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка, В.А. Черешнев // Екатеринбург: УрО РАН. 2011. – 220 с. 82. Цветкова, Н.А. Изучение частоты адаптивных мутантов и гетерогенности популяции клеток штаммов Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и с фенотипом мелких колоний в результате действия ципрофлоксацина / Н.А. Цветкова, И.М. Гузачева, Н.В. Голясная, Л.А. Беляева // Фунд. исследования. – 2013. – № 11 (ч.4). – С. 706-710. 83. Шагинян, И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничной инфекции / И.А. Шагинян // Клинич. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2000. – Т. 2, № 3. – С. 82-95. 84. Шагинян, И.А., Чернуха М.Ю. Неферментирующие грамотрицательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности / И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2005. – № 7 (3). – С. 271-285. 85. Шаимова, В.А. Бактериальный кератит. Клинико-иммунологические особенности течения, прогноза, лечения разных форм заболевания (диссертация канд. мед. наук) / В.А. Шаимова. – Челябинск: УГМАДО, 2007. 86. Шаталова, Е.В. Взаимное влияние возбудителей при смешанной инфекции ожоговой травмы / Е.В. Шаталова, В.В. Бельский // Журн. микробиол. – 1999. – № 4. – С. 3-7. 87. Шевченко, О.В. Металло-β-лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий / О.В. Шевченко, М.В. Эйдельштейн, М.Н. Степанова // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2007. – Т. 9, № 3. – С. 211-218. 88. Шкарин, В.В. Эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями: учебное пособие / В.В. Шкарин, О.В. Ковалишена, А.С. Благонравова. – Н.Новгород: НижГМА, 2009. – 124 с. 89. Шпрыкова, О.Н. Микробиологические и эпидемиологические особенности микробных ассоциаций при гнойно-септических инфекциях: автореф. дис. … кан. мед. наук: 14.00.30 / Шпрыкова Ольга Николаевна. – Н.Новгород, 2004. – 23 с. 90. Этиология и микробиологическая диагностика нозокомиальных пневмоний у новорожденных / Г.Б. Фадеева [и др.] // Антиб. химиотер. – 2001. – Т. 46, № 5. – С. 17-22. 91. Этиология ИВЛ-ассоциированных пневмоний у недоношенных новорожденных / Мархулия Х.М. [и др.] // Педиатрия. – 2005. – № 3. – С. 36-40. 216 92. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и антибиотикорезистентность среди их возбудителей / С.В. Сидоренко [и др.] // Антиб. химиотер. – 2005. – № 50(2-3). – C. 33-41. 93. (Bla.sub.VIM-2) cassette-containing novel integrons in metallo-(beta)-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida isolates disseminated in a Korean hospital / K. Lee [et al.] // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2002. – V. 46. – P. 1053–1058. 94. 4-Hydroxy-2-nonylquinoline: a novel iron chelator isolated from a bacterial cell membrane / P.W. Royt [et al.] // Bioorganic Chemistry. – 2001. – V. 29. – P. 387-397. 95. A highly conserved repeated DNA element located in the chromosome of Streptococcus pneumoniae / B. Martin [et al.] // Nucleic Acids Res. – 1992. – V. 20. – P. 3479-3483. 96. A highly selective PCR protocol for detecting 16s rRNA genes of the genus Pseudomonas (sensu stricto) in environmental samples / F. Widmer [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – V. 64(7). – P.2545-2553. 97. A novel extracellular phospholipase C of Pseudomonas aeruginosa is required for phospholipid chemotaxis / A.P. Barker [et al.] // Mol. Microbiol. – 2004. – V. 53 (4). – Р. 1089-1098. 98. A prolonged outbreak of Pseudomonas aeruginosa in a neonatal intensive care unit: did staff fingernails play a role in disease transmission? / R.L. Moolenaar [et al.] // Infect. Control Hosp. Epidemiol. – 2000. – V. 21. – P. 80-85. 99. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis / P. Le Fleche [et al.] // BMC Microbiol. – 2001. – V. 1. – P. 2. 100. A universal primer multiplex PCR method for typing of toxinogenic Pseudomonas aeruginosa / H. Shi [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2012. – V. 95(6). – P. 1579-1587. 101. Abdel-Mawgoud, A.M. Rhamnolipids: diversity of structures, microbial origins and roles / A.M. Abdel-Mawgoud, F. Lepine, E. Deziel // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – V. 86 (5). – P. 13231336. 102. Adaptive response of single and binary Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli biofilms to benzalkonium chloride / I.M. Machado [et al.] // J. Basic Microbiol. – 2012. – V. 52(1). – P. 43-52. 103. Al-Bakri, A.G. Immigration and emigration of Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa between and within mixed biofilm communities / A.G. Al-Bakri, P. Gilbert, D.G. Allison // J. Appl. Microbiol. – 2004. – V. 96(3). – Р. 455-463. 104. Allison, D.G. The biofilm matrix / D.G. Allison // Biofouling. – 2003. – V. 19. – P. 139-150. 105. American Medical Association from the Centers for disease control and prevention. «Pseudomonas aeruginosa respiratory tract infections associated with contaminated ultrasound gel used for transesophageal echocardiography» // JAMA. – 2012. – V. 307(21). – Р. 2248-2250. 217 106. An outbreak of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in an intensive care unit / S. Majumdar [et al.] // J. Hosp. Infect. – 2004. – V. 58. – P. 160-161. 107. Antibiotic exposure and resistance development in Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter species in intensive care units / D.S. Ong [et al.] // Crit. Care. Med. – 2011. – V. 39(11). – P. 24582463. 108. Antibiotic resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients of lower respiratory tract infection / P. Tripathi [et al.] // Afr. J. Microbiol. Res. – 2011. – V. 5(19). – P. 29552959. 109. Antibiotic susceptibility and genotype patterns of Escherichia coli, Klebsiella pneumonia and Pseudomonas aeruginosa isolated from urinary tract infected patients / M.I. Abou-Dobara [et al.] // Pol. J. Microbiol. – 2010. – V. 59 (3). – P. 207-212. 110. Antifungal mechanisms by which a novel Pseudomonas aeruginosa phenazine toxin kills Candida albicans in biofilms / D.K. Morales [et al.] // Mol. Microbiol. – 2010. – V.78. – P.13791392. 111. Armstrong, S. Insight into the catalytic mechanism of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A. Studies of toxin interaction with eukaryotic elongation factor-2 / S. Armstrong, S.P. Yates, A.R. Merrill // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277 (48). – P. 46669-46675. 112. Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state/ L.E. Dietrich [et al.] // J. Bacteriol. – 2013. – V. 195. – Р. 1371-1380. 113. Baker, G.C. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers / G.C. Baker, J.J. Smith, D.A. Cowan // J. Microbiol. Methods. – 2003. – V. 55(3). – P. 541-555. 114. Banin, E. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation / E. Banin, M.L. Vasil, E.P. Greenberg. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2005. – V. 102(31). – P. 11076-11081. 115. Banning, N. Persistence of biofilm associated Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa in groundwater and treated effluent in a laboratory model system / N. Banning, S. Toze, B.J. Mee // Microbiology. – 2003. – V. 149 (1). – P 47-55. 116. BdlA, a chemotaxis regulator essential for biofilm dispersion in Pseudomonas aeruginosa / R. Morgan [et al.] // J. Bacteriol. – 2006. – V. 188. – P. 7335-7343. 117. Beare, P.A. Siderophore mediated cell signalling in Pseudomonas aeruginosa: divergent pathways regulate virulence factor production and siderophore receptor synthesis / P.A. Beare, R.J. For, L.W. Martin, I.L. Lamont // Mol. Microbiol. – 2003. – V. 47. – P. 195-207. 118. Berg, H.C. The rotary motor of bacterial flagella / H.C. Berg // Ann. Rev. Biochem. – 2003. – V. 72. – P. 19-54. 218 119. Berka, R.M. Phospholipase C (heat-labile hemolysin) of Pseudomonas aeruginosa: purification and preliminary characterization / R.M. Berka, M.L. Vasil // J. Bacteriol. – 1982. – V. 152 (1). – P. 239-245. 120. Bertrand, X. Antimicrobial susceptibility among gram-negative isolates collected from intensive care units in North America, Europe, the Asia-Pacific Rim, Latin America, the Middle East, and Africa between 2004 and 2009 as part of the Tigecycline evaluation and surveillance trial / X. Bertrand, M.J. Dowzicky // Clin. Ther. – 2012. – V. 34. – P. 124-137. 121. Bester, E. Planktonic cell yield is linked to biofilm development / E. Bester, E.A. Edwards, G.M. Wolfaardt // Can. J. Microbiol. – 2009. – V. 55(10). – P. 1195-1206. 122. Bhargava, N. N-acyl homoserine lactone mediated interspecies interactions between A. baumannii and P. aeruginosa / N. Bhargava, P. Sharma, N. Capalash // Biofouling. – 2012. – V. 28(8). – Р. 813-822. 123. Biedenbach, D.J. Occurrence and antimicrobial resistance pattern comparisons among bloodstream infection isolates from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2002) / D.J. Biedenbach, G.J. Moet, R.N. Jones // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2004. – V. 50(1). – P. 5969. 124. Biochemical sequence analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum b-lactamase, and the class 1 integron In52 from Klebsiella pneumonia / L. Poirel [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2000. – V. 44. – P. 622-632. 125. Biofilm formation by Escherichia coli is stimulated by synergistic interactions and co-adhesion mechanisms with adherence-proficient bacteria / M.H. Castonguay [et al.] // Res. Microbiol. – 2006. – V. 157(5). – P. 471-478. 126. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants / M. Klausen [et al.] // Mol. Microbiol. – 2003. – V. 48(6). – P. 1511-1524. 127. Bitsori, M. Pseudomonas aeruginosa urinary tract infection in children: risk factors and outcomes / M. Bitsori, S. Maraki, S. Koukouraki, E. Galanakis // J. Urol. – 2012. – V. 187(1). – P. 260-264. 128. Bjarnsholt, T. Biofilm infections / T. Bjarnsholt // Springer. – 2011. – 314 p. 129. Blanc, D.S. Ribotyping of Pseudomonas aeruginosa: discriminatory power and usefulness as a tool for epidemiological studies / D.S. Blanc, H.H. Siegrist, R. Sahli, P. Francioli // J. Clin. Microbiol. – 1993. – V. 31. – P. 71-77. 130. BOX-PCR-based identification of bacterial species belonging to Pseudomonas syringae – P. viridiflava group / A.S.A. Marques [et al.] // Genet. Mol. Biol. – 2008. – V. 31. – P. 1415-1422. 219 131. Bradford, P.A. Extended-spectrum b-lactamases in the 21st Century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat / P.A. Bradford // Clin. Microbiol. – 2001. – V. 14. – P. 933-951. 132. Broad-spectrum biofilm inhibition by a secreted bacterial polysaccharide / J. Valle [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – V. 103. – P. 12558-12563. 133. Burn wound infections / D. Church [et al.] // Clin. Microbiol. Rev. – 2006. – V. 19. – P. 403434. 134. Bush, K. Updated functional classification of b-lactamases / K. Bush, G.A. Jacoby // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2010. –V. 54. – P. 969-976. 135. Caiazza, N. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 / N. Caiazza, J. Merritt, J. Brothers, G. O'Toole // J. Bacteriol. – 2007. – V. 189(9). – Р. 3603-1362. 136. Calfee, M.W. Interference with Pseudomonas Quinolone signal synthesis inhibits virulence factor expression by Pseudomonas aeruginosa / M.W. Calfee, J.P. Coleman, E.C. Pesci // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – V. 98. – P. 11633-11637. 137. Can laboratory reference strains mirror ‘real-world’ pathogenesis? / C.A. Fux [at al.] // Trends. Microbiol. – 2005. – V. 13. – P. 58-63. 138. Capturing interaction between insoluble pyridinium-type polymer and bacterial cells / N. Kawabata [et al.] // Agr. Biol. Chem. – 1987. – V. 51(4). – P. 1085-1090. 139. Caspase-mediated proteolysis during apoptosis: insights from apoptotic neutrophils / D.M. Sanghavi [et al.] // FEBS. Lett. – 1998. – V. 422. – P. 179-184. 140. Cell-mediated cleavage of Pseudomonas exotoxin between Arg279 and Gly280 generates the enzymatically active fragment which translocates to the cytosol / M. Ogata [et al.] // J. Biol. Chem. – 1992. – V. 267. – P. 25396-25401. 141. Chacko, B. Early onset neonatal sepsis / B. Chacko, I. Sohi // Indian J. Pediatr. – 2005. – V. 72. – P. 23-26. 142. Characterization and use of a DNA probe as an epidemiological marker for Pseudomonas aeruginosa / J.W. Ogle [et al.] // J. Infect. Dis. – 1987. – V. 155. – P. 119-126. 143. Characterization of Pseudomonas aeruginosa isolates: occurrence rates, antimicrobial susceptibility patterns, and molecular typing in the global SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997-1999 / A.C. Gales [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2001. – V. 15, N 32(2). – P. 146-155. 144. Characterization of the metallo-beta-lactamase determinant of Acinetobacter baumannii AC54/97 reveals the existence of blaIMP allelic variants carried by gene cassettes of different phylogeny / M.L. Riccio [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2000. – V. 44. – P. 1229-1235. 220 145. Characterization of unusual bacteria isolated from respiratory secretions of cystic fibrosis patients and description of Inquilinus limosus gen. nov., sp. nov. / T. Coenye [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2002. – V. 40. – P. 2062-2069. 146. Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase and its plasmidand integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France / L. Poirel [et al.] // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2000. – V. 44. – P. 891-897. 147. Chastre, J. Ventilator-associated рneumonia / J. Chastre, J.Y. Fagon // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2002. – V. 165. – P. 867-903. 148. Chromosomal β-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa / O. Ciofu [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2000. – V. 45. – P. 9-13. 149. Clinical-epidemiological characteristics and outcome of patients with catheter-related bloodstream infections in Europe (ESGNI-006 Study) / P. Munoz [et al.] // Clin. Microbiol. Infect. – 2004. – V. 10. – P. 843-845. 150. Cloning and characterization of (bla.sub.VIM), a new integron-borne metallo-(beta)-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate / L. Lauretti [et al.] // Antimicrob. Agents. Chemother. – 1999. – V. 43. – P. 1584–1590. 151. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals / L.G. Rahme [et al.] // Science. – 1995. – V. 268. – P. 1899-1902. 152. Comparative diffusion assay to assess efficacy of topical antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa in burns care / F. Aujoulat [et al.] // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. – 2011. – V. 10. – Р. 27. 153. Comparison of cell surface hydrophobicity and biofilm formation among ESBL-and non-ESBLproducing Pseudomonas aeruginosa clinical isolates / F. Norouzi [et al.] // Afric. J. Microbiol. Res. – 2010. – V. 4(11). – P. 1143-1147. 154. Comparison of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from contact lensand non-contact lens-related keratitis / M.H. Choy [et al.] // J. Med. Microbiol. – 2008. – V. 57(12). – P. 1539-1546. 155. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen / C.K. Stover [et al.] // Nature. – 2000. – V. 406(6799). – P. 959-964. 156. Contamination of a milk bank pasteuriser causing a Pseudomonas aeruginosa outbreak in a neonatal intensive care unit / C. Gras-Le Guen [et al.] // Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal. – 2003. – V. 88. – P. 434-535. 157. Control of Candida albicans metabolism and biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa phenazines / D.K. Morales [et al.] // mBio. – 2013. – V. 4. (1). – P. 1-9. 221 158. Convenient test for screening metallo-b-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds / Y. Arakawa [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2000. – V. 38. – P. 40-43. 159. Conway, C.A. Classics in infectious diseases. On the blue and green coloration that appears on bandages. By Carle Gessard (1850-1925) / C.A. Conway, N. Esiobu, J.V. Lopez // Rev. Infect. Dis. – 1984 – V. 6. – P. 775-776. 160. Conway, C.A. Co-cultures of Pseudomonas aeruginosa and Roseobacter denitrificans reveal shifts in gene expression levels compared to solo cultures / C.A. Conway, N. Esiobu, J.V. Lopez // Sci. World Journal. – 2012. doi:10.1100/2012/120108. 161. Cooperation and virulence in acute Pseudomonas aeruginosa infections / F. Harrison [et al.] // BMC Biology. – 2006. – V. 4. – P. 21. 162. Cornelis, G.R. The type III secretion injectisome, a complex nanomachine for intracellular “toxin” delivery / G.R. Cornelis // Biol. Chem. – 2010. – V. 391. – P. 745-751. 163. Correlation between virulence factors and in vitro biofilm formation by Escherichia coli / P. Naves [et al.] // Microb. Pathog. – 2008. – V. 45. – P. 86-91. 164. Costerton, J.W. Bacterial biofilms: a common cause of persistence infections / J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg // Science. – 1999. – V. 284(5418). – Р. 1318-1322. 165. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry. Annual Data Report. Bethesda, MD. 2011. Cystic Fibrosis Foundation. 166. Danese, P.N Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture / P.N. Danese, L.A. Pratt, R. Kolter // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182. – P. 35933596. 167. Das, T. M. Pyocyanin promotes extracellular DNA release in Pseudomonas aeruginosa / T. Das, M. Manefield // PLoS One. – 2012. – V. 7(10). e46718. 168. Davey, M. Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAO1 / M. Davey, N. Caiazza, G. O'Toole // J. Bacteriology. – 2003. – V. 185(3). – P. 1027-1036. 169. Davies, D.G. A fatty acid messenger is responsible for inducing dispersion in microbial biofilms / D.G. Davies, C.N. Marques // J. Bacteriol. – 2009. – V. 191. – P. 1393-1403. 170. Dawson, S.L. A comparative evaluation of five typing techniques for determining the diversity of fluorescent pseudomonads / S.L. Dawson, J.C. Fry, B.N. Dancer // J. Microbiol Meth. – 2002. – V. 50. – Р. 9-22. 171. Dent, A. Descriptive and molecular epidemiology of Gram-negative bacilli infections in the neonatal intensive care unit / A. Dent, P. Toltzis // Curr. Opin. Infect. Dis. – 2003. – V. 16(3). – P. 279-283. 222 172. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure / G.G. Stone // J. Clin. Microbiol. – 1994. – V. 32. – P. 1742-1749. 173. Development of a multilocus sequence typing scheme for the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa / B. Curran [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – V. 42(12). – Р. 56445649. 174. Deziel, E. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities / E. Deziel, Y. Comeau, R. Villemur // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183. – P. 1195-1204. 175. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL / D. De Vos [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1997. – V. 35(6.) – P. 1295-1299. 176. Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa / H. Grundmann [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1995. – V. 33(3). – P. 528-534. 177. Dissemination of IMP-6 metallo-β-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa sequence type 235 in Korea / Y. Seok [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2011. – V. 66. – P. 2791-2796. 178. Distribution of catabolic pathways in some hydrocarbon degrading bacteria from a subsurface polluted soil / L. Cavalca [et al.] // Res. Microbiol. – 2000. – V. 151. – P. 877-887. 179. Diverse mobilized class 1 integrons are common in the chromosomes of pathogenic Pseudomonas aeruginosa clinical isolates / E. Martinez [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2012. – V. 56(4). – P. 2169-2172. 180. DNA microarray based detection of nosocomial pathogenic Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii / K.C. Keum [et al.] / Mol. Cell Probes. – 2006. – V. 20. – P. 42-50. 181. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful genetic markers / J.G. Williams [et al.] // Nucleic. Acids Res. – 1990. – V. 18. – P. 6531-6535. 182. Domenighini, M. Three conserved consensus sequences identify the NAD-binding site of ADPribosylating enzymes, expressed by eukaryotes, bacteria and T-even bacteriophages / M. Domenighini, R. Rappuoli // Mol. Microbiol. – 1996. – V. 21. – P. 667-674. 183. Donlan, R.M. Biofilms and device-associated infections / R.M. Donlan // Emerg. Infect. Dis. – 2001. – V. 7. – P. 277-281. 184. Doyle, T.B. The complex flagellar torque generator of Pseudomonas aeruginosa / T.B. Doyle, A.C. Hawkins, L.L. McCarter // J. Bacteriol. – 2004. – V. 186. – Р. 6341-6350. 185. Driscoll, J.A. The epidemiology, pathogenesis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections / J.A. Driscoll, S.L. Brody, M.H. Kollef // Drugs. – 2007. – V. 67. – P. 351-368. 223 186. Emergence of multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates in neonatal septicemia / R. Moniri [et al.] // J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents. – 2005. – V. 22. – P. 39-44. 187. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units / X. Bertrand [et al.] // Int. Care Med. – 2001. – V. 27. – P. 1263-1268. 188. European Centre for Disease Prevention and Control. European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) (Internet). Solna, Sweden: European Centre for Disease Prevention and Control, 2012. Available from: http://www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/ears-net. 189. Evaluation of a nine-locus variable-number tandem-repeat scheme for typing of Pseudomonas aeruginosa / J.F. Turton [et al.] // Clin. Microbiol. Inf. – 2010. – V. 16(8). – P. 1111-1116. 190. Evaluation of the DiversiLab System for detection of hospital outbreaks of infections by different bacterial species / A.C. Fluit [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2010. – V. 48(11). – P. 3979-3989. 191. Evaluation of the polymorphisms associated with tandem repeats for Pseudomonas aeruginosa strain typing / L. Onteniente [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2003. – V. 41(11). – P. 4991-4997. 192. Examination of the behavior of Escherichia coli in biofilms established in laboratory-scale units receiving chlorinated and chloraminated water / M.N.B. Momba [et al.] // Water Res. – 1999. – V. 33(13). – P. 2937-2940. 193. Exopolysaccharides from Burkholderia cenocepacia inhibit neutrophil chemotaxis and scavenge reactive oxygen species / J. Bylund [et al.] // J. Biol. Chem. – 2006. – V. 281(5). – P. 2526-2532. 194. ExoU expression by Pseudomonas aeruginosa correlates with acute cytotoxicity and epithelial injury / V. Finck-Barbancon [et al.] // Mol. Microbiol. – 1997. – V. 25(3). – P. 547-557. 195. ExoY, an adenylate cyclase secreted by the Pseudomonas aeruginosa type III system / T.L. Yahr [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – V. 95. – P. 13899-13904. 196. Filloux, A. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: an essay on diversity, evolution and function / A. Filloux // Front Microbiol. – 2011. – V. 2. – Р. 155. 197. First identification of Pseudomonas aeruginosa isolates producing a KPC-type carbapenemhydrolyzing-lactamase / M.V. Villegas [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2007. – V. 51. – P. 1553-1555. 198. FitzSimmons, S.C. The changing epidemiology of cystic fibrosis / S.C. FitzSimmons // J. Pediatr. – 1993. – V. 122. – Р. 1-9. 199. Fluit, A.C. Antimicrobial resistance in European isolates of Pseudomonas aeruginosa. European SENTRY Participants / A.C. Fluit, J. Verhoef, F.J. Schmitz // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2000. – V. 19(5). – P. 370-374. 200. Foglia, E. A. Ventilator-associated pneumonia in neonatal and pediatric intensive Care Unit patients / E. Foglia, M.D. Meier, A. Elward // Clin. Microbiol. Rev. – 2007. – V. 20(3). – P. 409-425. 224 201. Frank, D.W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa / D.W. Frank // Mol. Microbiol. – 1997. – V. 26. – P. 621-629. 202. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAO1 / D.V. Mavrodi [et al.] // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183(21). – P. 6454-6465. 203. Gales, A.C. Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli isolated from Latin America: results from SENTRY antimicrobial surveillance program (Latin America, 2008-2010) / A.C. Gales, M. Castanheira, R.N. Jones, H.S. Sader // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2012. – V. 73(4). – P. 354360. 204. Gales, A.C. Global assessment of the antimicrobial activity of polymyxin B against 54 731 clinical isolates of Gram-negative bacilli: report from the SENTRY antimicrobial surveillance programme (2001-2004) / A.C. Gales, R.N. Jones, H.S. Sader // Clin. Microbiol. Infect. – 2006. – V. 12(4) – P. 315-321. 205. Gao, A. Population biology of Propionibacterium acnes and Pseudomonas aeruginosa in ophthalmic infections and the development of novel diagnostic tools / A. Gao // A thesis submitted in fulfilment for the Degree of Doctor of Philosophy in Microbiology. 2009. 206. Genetic features of Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients compared with those of isolates from other origins / P. Lanotte [et al.] // J. Med. Microbiol. – 2013. – V. 62, N 7. – P. 1015-1024. 207. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial / D. Lee [et al.] // Genome Biol. – 2006. – V. 7(10). – P. 90. 208. Genotypic and phenotypic analysis of type III secretion system in a cohort of Pseudomonas aeruginosa bacteremia isolates: evidence for a possible association between O serotypes and exo genes / P. Berthelot [et al.] // J. Infect. Dis. – 2003. – V. 188. – P. 512-518. 209. Genotyping of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from burn patients by RAPD-PCR / F. Nanvazadeh [et al.] // Burns. – 2013. – V. 39(7). – P. 1409-1413. 210. Gerber, N.N. Microbial phenazines. Handbook of Microbiology, Volume III: Microbial Products // CRC Press, eds. Laskin A. I.; Lechevalier H. A., 1973. – P.329-332. 211. GES-2, a class A b-lactamase from Pseudomonas aeruginosa with increased hydrolysis of imipenem / L. Poirel [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2001. – V. 45. – P. 2598-2603. 212. GES-18, а new carbapenem-hydrolyzing GES-type β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa that contains Ile80 and Ser170 residues / C. Bebrone [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2013. – V. 57. – P. 396-401. 225 213. Ghafoor, A. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture / A. Ghafoor, I.D Hay., B.H.A. Rehm // Appl. Environ. Microbiol. – 2011. – V. 77(15). – P. 5238-5246. 214. Gibson, J. Pseudomonas aeruginosa - Candida albicans interactions: localization and fungal toxicity of a phenazine derivative / J. Gibson, A. Sood, D.A. Hogan // J. Appl. Environ. Microbiol. – 2009. – V. 75(2). – P. 504-513. 215. Girlich, D. Biochemical characterization of the naturally occurring oxacillinase OXA-50 of Pseudomonas aeruginosa / D. Girlich, T. Naas, P. Nordmann // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2004. –V. 48. – P. 2043-2048. 216. Goel, V. Ventilator associated pneumonia in a medical intensive care unit: Microbial aetiology, susceptibility patterns of isolated microorganisms and outcome / V. Goel, S.A. Hogade, S.G. Karadesai // Ind. J. Anaesthesia. – 2012. – V. 56(6). – P. 558-562. 217. Govan, J.R.W. Evolving epidemiology of Pseudomonas aeruginosa and the Burkholderia cepacia complex in cystic fibrosis lung infection / J.R.W. Govan, A.R. Brown, A.M. Jones // Future Microbiol. – 2007. – V. 2. – P. 153-164. 218. Govan, J.R.W. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia / J.R.W. Govan, V. Deretic // Microbiol. Rev. – 1996. – V. 60(3). – P. 539-574. 219. Hassan, H.M. Mechanism of the antibiotic action pyocyanine / H.M. Hassan, I. Fridovich // J. Bacteriol. – 1980. – V. 141. – P. 156-163. 220. Hauser, A.R. PepA, a secreted protein of Pseudomonas aeruginosa, is necessary for cytotoxicity and virulence / A.R. Hauser, P.J. Kang, J.N. Engel // Mol. Microbiol. – 1998. – V. 27. – P. 807-818. 221. Hemolytic Phospholipase C inhibition protects lung function during Pseudomonas aeruginosa infection / M.J. Wargo [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2011. – V. 184(3). – P. 345-354. 222. Hentzer, M. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function / M. Hentzer, G.M. Teitzel, G.J. Balzer // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183, N. 18. – P. 53955401. 223. Hovey, A.K. Analyses of the DNA-binding and transcriptional activation properties of ExsA, the transcriptional activator of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon / A.K. Hovey, D.W. Frank // J. Bacteriol. – 1995. – V. 177. – P. 4427-4436. 224. Howe, T.R. Isolation and characterization of alkaline protease-deficient mutants of Pseudomonas aeruginosa in vitro and in a mouse eye model / T.R. Howe, B.H. Iglewski // Infect. Immun. – 1984. – V. 43. – P. 1058-1063. 225. Hueck, C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants / C.J. Hueck // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1998. – V. 62. – P. 379-433. 226 226. Huey, B. Hypervariable DNA fingerprinting in Escherichia coli: minisatellite probe from bacteriophage M13 / B. Huey, J. Hall // J. Bacteriol. – 1989. – V. 171(5). – P. 2528-2532. 227. IBC-1, a novel integron-associated class A -lactamase with extended-spectrum properties produced by an Enterobacter cloacae clinical strain / P. Giakkoupi [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2000. – V. 44. – P. 2247-2253. 228. Identification of Pseudomonas aeruginosa by a duplex real-time polymerase chain reaction assay targeting the ecfX and the gyrB genes / S.N. Anuj [et al.] // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2009. – V. 63(2). – P. 127-131. 229. Identification of type II and type III pyoverdine receptors from Pseudomonas aeruginosa / M. De Chial [et al.] // Microbiology. – 2003. – V. 149 . – P. 821-831. 230. Impact of Pseudomonas aeruginosa genomic instability on the application of typing methods for chronic cystic fibrosis infections / J.L. Fothergill [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2010. – V. 48(6). – P. 2053-2059. 231. Improved reliability of Pseudomonas aeruginosa PCR detection by the use of the speciesspecific ecfX gene target / R. Lavenir [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 2007. – V. 70(1). – P. 20-29. 232. Indole production promotes Escherichia coli mixed-culture growth with Pseudomonas aeruginosa by inhibiting quorum signaling / W. Chu [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2012. – V. 78, N 2. – P. 411-419. 233. Induction of neutrophil apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa exotoxin pyocyanin: a potential mechanism of persistent infection / L.R. Usher [et al.] // J. Immunol. – 2002. – V. 168(4). – P. 1861-1868. 234. Induction of phenazine biosynthesis in cultures of Pseudomonas aeruginosa by L-N-(3oxohexanoyl) homoserine lactone / P. Stead [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1996. – V. 140(1). – P. 15-22. 235. Inflammatory neutrophils retain susceptibility to apoptosis mediated via the Fas death receptor / S.A. Renshaw [et al.] // J. Leukocyte Biol. – 2000. – V. 67(5). – P. 662-668. 236. Influence of the MexAB-OprM multidrug efflux system on quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / K. Evans [et al.] // J. Bacteriol. – 1998. – V. 180, N. 32. – P. 5443-5447. 237. Initial Pseudomonas aeruginosa infection in patients with cystic fibrosis: characteristics of eradicated and persistent isolates / G.A. Tramper-Stranders [et al.] // Clin. Microbiol. Infect. – 2012. – V. 18(6). – P. 567-574. 238. Interaction of Pseudomonas aeruginosa alkaline protease and elastase with human polymorphonuclear leukocytes in vitro / A. Kharazmi [et al.] // Infect. Immun. – 1984. – V. 43. – P. 161-165. 227 239. International Pseudomonas aeruginosa Typing Study Group. A multicenter comparison of methods for typing strains of Pseudomonas aeruginosa predominantly from cystic fibrosis // J. Infect. Dis. – 1994. – V. 169. – P. 134-142. 240. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. EPIC II Group of Investigators / J.L. Vincent [et al.] // JAMA. – 2009. – V. 302(21). – P. 2323-2329. 241. Intracellular targeting of exoenzyme S of Pseudomonas aeruginosa via type III dependent translocation induces phagocytosis resistance, cytotoxicity and disruption of actin microfilaments / E. Frithz-Lindsten [et al.] // Mol. Microbiol. – 1997. – V. 25. P. 1125-1139. 242. Irie, Y. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids disperse Bordetella bronchiseptica biofilms / Y. Irie, G.A. O’Toole, M.H. Yuk // FEMS Microbiol. Lett. – 2005. – V. 250(2). – P. 237-243. 243. Iron acquisition from Pseudomonas aeruginosa siderophores by human phagocytes: an additional mechanism of host defense through iron sequestration? / B.E. Britigan [et al.] // Infect. Immun. – 2000. – V. 68(3). – P. 1271-1275. 244. Izdebska-Szymona, K. Comparison of some adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from respiratory and urinary tract infections / K. Izdebska-Szymona, D. Laziuk // Acta Microbiol. Pol. – 1988. – V. 37(3-4). – P. 281-293. 245. Jaffe, R.I. Real-time identification of Pseudomonas aeruginosa direct from clinical samples using a rapid extraction method and polymerase chain reaction (PCR) / R.I. Jaffe, J.D. Lane, C.W. Bates // J. Clin. Lab. Anal. – 2001. – V. 15. – P. 131-137. 246. Jeffreys, A.J. Individual-specific ‛fingerprints’ of human DNA / A.J. Jeffreys, V. Wilson, S.L. Thein // Nature. – 1985. – V. 316. – P. 76-79. 247. Jin, Y. Biofilm formation of Candida albicans is variably affected by saliva and dietary sugars / Y. Jin, L.P. Samaranayake, Y. Samaranayake // Arch. Oral Biol. – 2004. – V. 49(10). – P. 789-798. 248. Johnson, M.K. Production and properties of heat-stable extracellular hemolysin from Pseudomonas aeruginosa / M.K. Johnson, D. Boese-Marrazzo // Infect. Immun. – 1980. – V. 29(3). – P. 1028-1033. 249. Joo, E.J. Clinical predictors of Pseudomonas aeruginosa bacteremia among Gram-negative bacterial infections in non-neutropenic patients with solid tumor / E.J. Joo , C.I. Kang , Y.E. Ha . // J. Infect. – 2011. – V. 63(3). – P. 207-214. 250. Jovcic, B. Emergence of NDM-1 metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Serbia / B. Jovcic, Z. Lepsanovic, V. Suljagic // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2011. – V. 55(8). – P. 3929-3931. 251. Kaiser, K. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms / K. Kaiser // Environmental Health Perspective. – 1998. – V. 106. – P. 583-591. 228 252. Kaponis, А. Septic shock in obstetrics and gynecology / А. Kaponis, T. Filindris, G. Decavalas // In book: Severe sepsis and septic shock. www.intechopen.com. 253. Karatan, E. Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms / E. Karatan, P. Watnick // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2009. – V. 73(2). – P. 310-347. 254. Kashkouli, M.B. Bilateral Pseudomonas aeruginosa endophthalmitis following bilateral simultaneous cataract surgery / M.B. Kashkouli, S. Salimi, H. Aghaee // Ind. J. Ophthalmol. – 2007. – V. 55. – P. 374-375. 255. Kaufman, M.R. Pseudomonas aeruginosa mediated apoptosis requires the ADP-ribosylating activity of ExoS / M.R. Kaufman, J. Jia, L. Zeng // Microbiology. – 2000. – V. 146(10). – P. 25312541. 256. Kerr, J. Phenazine pigments, antibiotics and virulence factors / J. Kerr // The infectious disease review - microbes of man, animals and the environment. – 2000. – V. 2(4). – P. 184-194. 257. Khan, A.A. Detection of Pseudomonas aeruginosa from clinical and environmental samples by amplification of the exotoxin A gene using PCR / A.A. Khan, C.E. Cerniglia // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – V. 60. – P. 3739-3745. 258. Khare, E. Dual activity of pyocyanin from Pseudomonas aeruginosa – antibiotic against phytopathogen and signal molecule for biofilm development by rhizobia / Khare E., Arora N.K. // Can. J. Microbiol. – 2011. – V. 57(9). – P. 708-713. 259. Kiewitz, C. Sequence diversity of Pseudomonas aeruginosa: Impact on population structure and genome evolution / C. Kiewitz, B. Tümmler // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182. – P. 3125-3135. 260. Kimata, N. Pseudomonas aeruginosa isolated from marine environments in Tokyo Bay / N. Kimata, T. Nishino, S. Suzuki // Microb. Ecol. – 2004. – V. 47. – P. 41-47. 261. King, E.O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein / E.O. King, M.K. Ward, D.E. Raney // J. Lab. Clin. Med. – 1954. – V. 44(2). – P. 301-307. 262. Klaenhammer, T. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria / T. Klaenhammer // FEMS Microbiol. Rev. – 1993. – V. 12. – P. 39-86. 263. Koenig, S.M. Ventilator-associated pneumonia: diagnosis, treatment, and prevention / S.M. Koenig, J.D. Truwit // Clin Microbiol Rev. – 2006. – V. 19(4). – P. 637-657. 264. Kohlenberg, A. Outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa infection in a surgical intensive care unit / A. Kohlenberg, D. Weitzel-Kage, P. Van der Linden // J. Hosp. Infect. – 2010. – V. 74(4). – P. 350-357. 265. Kohler, T. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili / T. Kohler, L.K. Curty, F. Barja // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182(21). – P. 5990-5996. 229 266. Kumarasamy, K.K. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study / K.K. Kumarasamy, M.A. Toleman, T.R. Walsh // The Lancet Inf. Dis. – 2010. – V. 10. – P. 597-602. 267. Lamont, I.L. Iron acquisition by Pseudomonas aeruginosa in the lungs of patients with cystic fibrosis / I.L. Lamont, A.F. Konings, D.W. Reid // BioMetals. – 2009. – V. 22(1). – P. 53-60. 268. Lanyi, B. Antigenic changes in Pseudomonas aeruginosa in vivo and after lysogenization in vitro / B. Lanyi, J. Lantos // Acta Microbiol. Hung. – 1976. – V. 23. – P. 337-351. 269. Lau, G.W. The role of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa infection / G.W. Lau, D.J. Hassett, H. Ran, F. Kong // Trends Mol. Med. – 2004. – V. 10(12). – P. 599-606. 270. Le Gall, F. Proposal of a quantitative PCR-based protocol for an optimal Pseudomonas aeruginosa detection in patients with cystic fibrosis / F. Le Gall, R. Le Berre, S. Rosec // BMC Microbiol. – 2013. – V. 13. – P. 143. 271. Lee, H. Cellular ADP-ribosyltransferase with the same mechanism of action as diphtheria toxin and Pseudomonas toxin A / H. Lee, W.J. Iglewski // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1984. – V. 81. – P. 2703-2707. 272. Lee, J.Y. Selective advantages of two major clones of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates (CC235 and CC641) from Korea: antimicrobial resistance, virulence and biofilmforming activity / J.Y. Lee, K.R. Peck, K.S. Ko // J. Med. Microbiol. – 2004. – V. 53(1). – P. 73-81. 273. Leitao, J.H. Effects of growth temperature on alginate synthesis and enzymes in Pseudomonas aeruginosa variants / J.H. Leitao, A.M. Fialho, I. Sa-Correia // J. General Microbiol. – 1992. – V. 138. – P. 605-610. 274. Leppla, S.H. The exotoxin of Pseudomonas aeruginosa: a proenzyme having an usual mode of activation / S.H. Leppla, О.C. Martin, L.A. Muel // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1978. – V. 81. – P. 532-538. 275. Lequette, Y. Timing and localization of rhamnolipid synthesis gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms / Y. Lequette, E.P. Greenberg // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187(1). – P. 37-44. 276. Lewenza, S. Interspecies communication between Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa / S. Lewenza, M.B. Visser, P.A. Sokol // Can. J. Microbiol. – 2002. – V. 48. – P. 707-716. 277. Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells / K. Lewis // Curr. Microbial. Immunol. – 2008. – V. 322. – P. 107-131. 278. Li, Z. Inhibitory action of metabolites of Pseudomonas aeruginosa against gram-negative bacteria / Z. Li, X. Wang, Y. Guo, J. Zhao // J. Jap. Ass. Infect. Diseases. – 1995. – V. 69(8). – P. 924927. 230 279. Lin, H.H. Presence of the exoU gene of Pseudomonas aeruginosa is correlated with cytotoxicity in MDCK cells but not with colonization in BALB/c mice / H.H. Lin, S.P. Huang, H.C. Teng. // J. Сlin. Microbiol. – 2006. – V. 44(12). – P. 4596-4597. 280. Liu, P.V. Changes in somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa induced by bacteriophages / P.V. Liu // J. Infect. Dis. – 1969. – V. 119. – P. 237-246. 281. Liu, P.V. The roles of various fractions of Pseudomonas aeruginosa in its pathogenesis. 3. Identity of the lethal toxins produced in vitro and in vivo / P.V. Liu // J. Infect. Dis. – 1966. – V. 116(4). – P. 481-489. 282. Liu, Y. Epidemiological investigation of Pseudomonas aeruginosa nosocomial bacteraemia isolates by PCR-based DNA fingerprinting analysis / Y. Liu, A. Davin-Regli, C. Bosi // J. Med. Microbiol. – 1996. – V. 45. – P. 369-365. 283. Livermore, D.M. Multiple mechanisms of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa: our worst nightmare? / D.M. Livermore // Clin. Infect. Dis. – 2002. – V. 34. – P. 634-640. 284. Lomholt, J.A. Epidemic population structure of Pseudomonas aeruginosa: evidence for a clone that is pathogenic to the eye and that has a distinct combination of virulence factors / J.A. Lomholt // Infect. Immun. – 2001. – V. 69(10). – P. 6284-6295. 285. Longo, F. A new transcriptional repressor of the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing receptor gene lasR / F. Longo, G. Rampioni, R. Bondì // PLOS ONE. – 2013. – 8(7). e69554. 286. Lopes, S.P. Role of planktonic and sessile extracellular metabolic by production Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli intra and interspecies relationships / S.P. Lopes, I.M. Machado, M.O. Pereira // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2011. – V. 38(10). – P. 133-140. 287. Loureiro, M.M. Pseudomonas aeruginosa: study of antibiotic resistance and molecular typing in hospital infection cases in a neonatal intensive care unit from Rio de Janeiro City, Brazil / M.M. Loureiro, B.A. De Moraes, V.L. Mendonca // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. – 2002. – V. 97. – P. 387-394. 288. Loutit, J.S. Restriction enzyme and Southern hybridization analyses of Pseudomonas aeruginosa strains from patients with cystic fibrosis / J.S. Loutit, L.S. Tompkins // J. Clin. Microbiol. – 1991. – V. 29. – P. 2897-2900. 289. LRP 1 B functions as a receptor for Pseudomonas exotoxin / D.V. Pastrana [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 2005. – V. 1741. – Р. 234-239. 290. Luminescent method for the detection of antibacterial activities / L. Simon [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001. – V. 57(5-6). – P. 757-763. 291. Lyczak, J.B. Lung infections associated with cystic fibrosis / J.B. Lyczak, C.L. Cannon, G.B. Pier // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – V. 15. – P. 194-222. 231 292. Maier, R. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications / R. Maier, G. Soberon-Chavez // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – V. 54. – P. 625-633. 293. Major sternal wound infection after open-heart surgery: a multivariate analysis of risk factors in 2,579 consecutive operative procedures / G. Ottino [et al.] // Ann. Thorac. Surg. – 1987. – V. 44. – P. 173-179. 294. Masaadeh, H.A. Incident of Pseudomonas aeruginosa in postoperative wound infection / H.A. Masaadeh, A.S. Jaran // Am. J. Infect. Dis. – 2009. – V. 5(1). – P. 1-6. 295. Masuda, N. Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa / N. Masuda, E. Sakagawa, S. Ohya // Antimicrob. Agents Chemother. – 1995. – V. 39. – P. 645-649. 296. Mayhall, C.G. The epidemiology of burn wound infections: then and now / C.G. Mayhall // Clin. Inf. Dis. – 2003. – V. 37. – Р. 543-550. 297. McKnight, S.L. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / S.L. McKnight, B.H. Iglewski, E.C. Pesci // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182(10). – P. 2702-2708. 298. Medeiros, A.A. β-Lactamase-mediated resistance to penems and carbapenems amongst Enterobacteriaceae / A.A. Medeiros, R.S. Hare // Amer. Soc. Microbiol. – 1986. – Washington, DC. abstr. 116. 26th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. 299. Medical microbiology / C. Mims [et al.] // University of Oxford. – 2004. – 660 pp. 300. Mehta M. Bacterial isolates from burn wound infections and their antibiograms: a eight-year study / M. Mehta, P. Dutta, V. Gupta // Indian J. Plast. Surg. – 2007. – V. 40. – Р. 25-28. 301. Menestrina, G. Pore-forming peptides and protein toxins / G. Menestrina, M. Dalla Serra, P. Lazarovici (eds.), Taylor and Francis Group, London, UK. – 2003. – 315 pp. 302. Metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas spp. in Korea: high prevalence of isolates with VIM-2 type and emergence of isolates with IMP-1 type / K. Lee [et al.] // Yonsei Med. J. – 2009. – V. 50. – P. 335-339. 303. Michel-Briand, Y. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa / Y. Michel-Briand, C. Baysee // Biochimie. – 2002. – V. 84(5-6). – P. 499-510. 304. Microbiology of sputum from patients at cystic fibrosis centers in the United States / J.L. Burns [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 1998. – V. 27. – P. 158-163. 305. Modulation of Pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies communication / K.M. Duan [et al.] // Mol. Microbiol. – 2003. – V. 50. – P. 1477-1491. 306. Molecular characterization of In50, a class 1 integron encoding the gene for the extendedspectrum beta-lactamase VEB-1 in Pseudomonas aeruginosa / T. Naas [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1999. – V. 176. – P. 411-419. 232 307. Molecular characterization of β-lactamase gene, blaGIM-1, encoding a new subclass of metalloβ-lactamase / M. Castanheira [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2004. – V. 48. – P. 46544661. 308. Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals / O. Gutierrez [et al.] // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2007. – V. 51. – P. 4329-4335. 309. Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Portuguese Central Hospital / A.P. Fonseca [et al.] // Folia Microbiol. – 2008. – V. 53(6). – P. 540-546. 310. Molecular identification and detection of virulence genes among Pseudomonas aeruginosa isolated from different infectious origins / V.S. Nikbin [et al.] // Iran. J. Microbiol. – 2012. V. 4(3). – P. 118-123. 311. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosaCaenorhabditis elegans pathogenesis model / S. Mahajan-Miklos [et al.] // Cell. – 1999. – V. 96. – P. 47-56. 312. Morrison, A.J. Epidemiology of infections due to Pseudomonas aeruginosa / A.J. Morrison, R.P. Wenzel // Rev. Infect. Dis. – 1984. – V. 6(3). – P. 627-642. 313. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones with populations of pathogenic microorganisms / M.C. Maiden [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1998. – V. 95(6). – P. 3140-3145. 314. Multiple phospholipid substrates of phospholipase C/sphingomyelinase HR2 from Pseudomonas aeruginosa / D.J. Lopez [et al.] // Chemistry. Physics. Lipids. – 2011. – V. 164(1). – P. 78-82. 315. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding Class A carbapenemases / S.S. Hong [et al.] // Ann. Lab. Med. – 2012. – V. 32(5). – P. 359-361. 316. Multiresistant serotype 012 Pseudomonas aeruginosa: evidence for a common strain in Europe / T.L. Pitt [et al.] // Epidemiol. Infect. – 1989. – V. 103. – P. 565-576. 317. Murga, R. Quantitative analysis of biofilm thickness variability / R. Murga, P.S. Stewart, D. Daly // Biotechnol. Bioeng. – 1995. – V. 45(6). – P. 503-510. 318. Murray, T. Pseudomonas aeruginosa exhibits sliding motility in the absence of type IV pili and flagella / T. Murray, B. Kazmierczak // J. Bacteriol. – 2008. – V. 190(8). – P. 2700-2708. 319. Neonatal infections with Pseudomonas aeruginosa associated with a water-bath used to thaw fresh frozen plasma / G. Muyldermans [et al.] // J. Hosp. Infect. – 1998. – V. 39. – P. 309-314. 320. Netherlands reference laboratory for bacterial meningitis. Bacterial meningitis in the Netherlands: annual report 2006. Amsterdam, The Netherlands: AMC/RIVM, 2007. – 53 pp. 321. Newton, O. Young infant sepsis: aetiology, antibiotic susceptibility and clinical signs / O. Newton, M. English // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. – 2007. – V. 101. – P. 959-966. 233 322. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study / H. Wisplinghoff [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2004. – V. 39(3). – P. 309-317. 323. Nosocomial pneumonia. Diagnostic and therapeutic considerations / G.D. Campbell [et al.] // Med. Clin. North. Am. – 2001. – V. 85(1). – P. 179-114. 324. Novel acquired metallo-b-lactamase gene, blaSIM-1, in a class 1 integron from Acinetobacter baumannii clinical isolates from Korea / K. Lee [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2005. – V. 49. – P. 4485–4491. 325. O`Toole, G.F. Biofilm formation as microbial development / G.F. O`Toole, H.B. Kaplan, R. Kolter // Ann. Rev. Microbiol. – 2000. – V. 54. – P. 49-79. 326. Ojeniyi, B. Polyagglutinability due to loss of 0-antigenic determinants in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from cystic fibrosis patients / B. Ojeniyi, L. Baek, N. Hoiby // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B. – 1985. – V. 93. – P. 7-13. 327. Olakanmi, O. Acquisition of iron bound to low molecular weight chelates by human monocytederived macrophages / O. Olakanmi, J.B. Stokes, B.E. Britigan // J. Immunol. – 1994. – V. 153. – P. 2691-2703. 328. Olive, D.M. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms / D.M. Olive, P. Bean // J. Clin. Microbiol. – 1999. – V. 37(6). – P. 1661-1669. 329. Ortiz-Herrera, M. RAPD-PCR characterization of Pseudomonas aeruginosa strains obtained from cystic fibrosis patients / M. Ortiz-Herrera, A. Gerónimo-Gallegos, F. Cuevas-Schacht // Salud. Publica Mex. – 2004. – V. 46(2). – P. 149-157. 330. Ostroff, R.M. Molecular comparison of a nonhemolytic and a hemolytic phospholipase C from Pseudomonas aeruginosa / R. M. Ostroff, A.I. Vasil, M.L. Vasil // J. Bacteriol. – 1990. – V. 172. – P. 5915-5923. 331. O'Toole, G.A. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development / G.A. O'Toole, R. Kolter // Mol. Microbiol. – 1998. – V. 30. – P. 295-304. 332. Outbreak of infections caused by Pseudomonas aeruginosa producing VIM-1 carbapenemase in Greece / А. Tsakris [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2000. – V. 38. – P. 1290-1292. 333. Outbreak of sternal surgical site infections due to Pseudomonas aeruginosa traced to a Scrub Nurse with Onychomycosis / S.A. McNeil [et al.] // Clinical Infectious Diseases. – 2001. – V. 33. – P. 317–323. 334. Outbreaks in neonatal intensive care units – they are not like others / P. Gastmeier [et al.] // Am. J. Infect. Control. –2007. – V. 35. – P. 172-176. 335. OXA-11, an extended-spectrum variant of OXA-10 (PSE- 2) b-lactamase from Pseudomonas aeruginosa / L.M.C. Hall [et al.] // Antimicrob. Agents. Chemother. – 1993. – V. 37. – P. 1637-1644. 234 336. OXA-14, another extended-spectrum variant of OXA-10 (PSE-2) b-lactamase from Pseudomonas aeruginosa / F.L. Danel [at al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 1995. – V. 39. – P. 1881-1884. 337. Pandita, A. Microbial keratitis in Waikato, New Zealand / A. Pandita, C. Murphy // Clin. Exp. Ophthalmol. – 2011. – V. 39 (5). – P. 393-397. 338. Parret, A. Bacteria killing their own kind: novel bacteriocins of Pseudomonas and other gproteobacteria / A. Parret, R. De Mot // Trends Microbiol. – 2002. – V. 10(3). – P. 107-112. 339. Pathogenic phenotype and genotype of Pseudomonas aeruginosa isolates from spontaneous canine ocular infections / E.C. Ledbetter [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. – 2009. – V. 50(2). – P. 729-736. 340. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa / L. Yang [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2011. – V. 62(3). – P. 339-347. 341. PCR identification of Pseudomonas aeruginosa and direct detection in clinical samples from cystic fibrosis patients / L.V. Da Silva Filho [et al.] // J. Med. Microbiol. – 1999. – V. 48. – P. 357361. 342. PCR typing of genetic determinants for metallo-beta-lactamases and integrases carried by gramnegative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron / N. Shibata [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2003. – V. 41. – P. 5407-5413. 343. Pearson, J.P. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals / J.P. Pearson, C. Van Delden, B.H. Iglewski // J. Bacteriol. – 1999. – V. 181(32). – P. 1203-1210. 344. Peek, M.E. Pyoverdine, the major siderophore in Pseudomonas aeruginosa, evades NGAL recognition / M.E Peek, А. Bhatnagar, N.A. McCarty, S.M. Zughaier // Int. Perspectives Inf. Dis. 2012. – ID 843509. – 10 p. 345. Pellett, S. Distribution of Pseudomonas aeruginosa in a riverine ecosystem / S. Pellett, D.V. Bigley, D.J. Grimes // Appl. Environ. Microbiol. – 1983. – V. 45. – P. 328-332. 346. Penetration of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa through MDCK epithelial cell monolayers / Y. Hirakata [et al.] // J. Infect. Dis. – 2000. – V. 181(2). – P. 765-769. 347. PER-1 is still widespread in Turkish hospitals among Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. / F. Kolayli [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 2005. – V. 249. – P. 241-245. 348. Permeabilization of biological and artificial membranes by a bacterial dirhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa / M. Sanchez [et al.] // J. Colloid Interface Sci. – 2010. – V. 341(2). – P. 240-247. 235 349. Petrova, O.E. A novel signaling network essential for regulating Pseudomonas aeruginosa biofilm development / O.E. Petrova, K. Sauer // PLoS Pathog. – 2009. – V. 5(11). e1000668. 350. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence / Y. Anzai [et al.] // Intern. J. Syst. Evolut. Microbiol. – 2000. – V. 50. – P. 1563-1589. 351. Pitt T.L. Pseudomonas, Burkholderia, and related genera. In Microbiology and microbial infections / B.I. Duerden (ed.), Oxford University Press Inc., New York, 1998. – V. 2. – P. 1109-1138. 352. PlcR1 and PlcR2 are putative calcium-binding proteins required for secretion of the hemolytic phospholipase C of Pseudomonas aeruginosa / Cota-Gomez A. [et al.] // Infect. Immun. – 1997. – V. 65(7). – Р. 2904-2913. 353. Poh, C.L. Genome fingerprinting by pulsed field gel electrophoresis and ribotyping to differentiate Pseudomonas aeruginosa serotype 011 strains / C.L. Poh, C.C. Yeo, L. Tay // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 1992. – V. 11. – P. 817-822. 354. Poirel, L. Molecular analysis of metallo-beta-lactamase gene blaSPM-1-surrounding sequences from disseminated Pseudomonas aeruginosa isolates in Recife, Brazil / L. Poirel, M. Magalhaes, M. Lopes, P. Nordmann // Antimicrob. Agents Chemother. – 2004. – V. 48. – Р. 1406-1409. 355. Population structure of Pseudomonas aeruginosa / L. Wiehlmann [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – V. 104(19). – P. 8101-8106. 356. Population structure of Pseudomonas aeruginosa from five Mediterranean countries: evidence for frequent recombination and epidemic occurrence of CC235 / M. Maatallah [et al.] // PLoS One. – 2011. – V. 6(10). e25617. 357. Pore-forming activity of type III system-secreted proteins leads to oncosis of Pseudomonas aeruginosa-infected macrophages / D. Dacheux [et al.] // Mol. Microbiol. – 2001. – V. 40(1). – P. 7685. 358. Potvin, E. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa / E. Potvin, F. Sanschagrin, R.C. Levesque // FEMS Microbiol. Rev. – 2008. – V. 32(1). – P. 38-55. 359. Predisposing factors and etiologic diagnosis of ulcerative keratitis / T. Sirikul [et al.] // Cornea. – 2008. – V. 27(3). – P. 283-287. 360. Prevalence of type III secretion genes in clinical and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa / H. Feltman [et al.] // Microbiology. – 2001. – V. 147. – P. 2659-2669. 361. Price-Whelan, A. Rethinking ‘secondary’ metabolism: physiological roles for phenazine antibiotics / A. Price-Whelan, L.E.P. Dietrich, D.K. Newman // Nat. Chem. Biol. – 2006. – V. 2. – P. 71-78. 362. Priyaja, P. Pyocyanin induced in vitro oxidative damage and its toxicity level in human, fish and insect cell lines for its selective biological applications / P. Priyaja, Р. Jayesh, R. Philip, I.S. Bright Singh // Cytotechnology. – 2014. Aug 5. [Epub ahead of print]. 236 363. Probiotic сharacteristics of newly isolated strains of Lactobacillus plantarum / B. Сisаrovа [et al.] // Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae. – 2009. – V. 56. – P. 54-66. 364. Prospective analysis of nosocomial infections in a burn care unit, Turkey / O. Oncul [et al.] // Ind. J. Med. Research. – 2009. – V. 130(6). – P. 758-764. 365. Pseudomonas aeruginosa bacteremia in immunocompromised children: analysis of factors associated with poor outcome / J.E. Fergie [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 1994. – V. 18. – P. 390-394. 366. Pseudomonas aeruginosa bacteremia in patients with AIDS / M.H. Mendelson [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 1994. – V. 18(6). – P. 886-895. 367. Pseudomonas aeruginosa elastase and elastolysis revisited: recent developments / A.C. Gales [et al.] // Mol. Microbiol. – 1991. – V. 5. – P. 2315-2321. 368. Pseudomonas aeruginosa extracellular products inhibit staphylococcal growth, and disrupt established biofilms produced by Staphylococcus epidermidis / Zh Qin [et al.] // Microbiology. – 2009. – V. 155(7). – P. 2148-2156. 369. Pseudomonas aeruginosa in a neonatal intensive care unit: molecular epidemiology and infection control measures / V. Crivaro [et al.] // BMC Infect. Dis. – 2009. – V. 9. – P. 70. 370. Pseudomonas aeruginosa inhibits in-vitro Candida biofilm development / H.M.H.N. Bandara [et al.] // BMC Microbiology. – 2010. – V. 10. – P. 125. 371. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide inhibits Candida albicans hyphae formation and alters gene expression during biofilm development / H.M. Bandara [et al.] // Mol. Oral. Microbiol. – 2013. – V. 28 (1). – P. 54-69. 372. Pseudomonas aeruginosa outbreak associated with a contaminated blood-gas analyser in a neonatal intensive care unit / S.M. Garland [et al.]. // J. Hosp. Infect. – 1996. – V. 33. – P. 145-151. 373. Pseudomonas aeruginosa outbreak linked to mineral water bottles in a neonatal intensive care unit: fast typing by use of high resolution melting analysis of a variable-number tandem-repeat locus / F. Naze [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2010. – V. 48. – P. 3146-3152. 374. Pseudomonas aeruginosa outbreaks in the neonatal intensive care unit – a systematic review of risk factors and environmental sources / J.M.C. Jefferies [et al.] // J. Med. Microbiol. – 2012. – V. 61. – Р. 1052-1061. 375. Pseudomonas aeruginosa exotoxin pyocyanin causes cystic fibrosis airway pathogenesis / C.C. Caldwell [et al.] // Am. J. Pathol. – 2009. – V. 175, N 8. – Р. 2473-2488. 376. Pseudomonas aeruginosa Psl polysaccharide reduces neutrophil phagocytosis and the oxidative response by limiting complement-mediated opsonization / M. Mishra [et al.] // Cell. Microbiol. – 2012. – V. 14. – P. 95-106. 237 377. Pseudomonas aeruginosa-mediated cytotoxicity and invasion correlate with distinct genotypes at the loci encoding Exoenzyme S / S.M. Fleiszig [et al.] // Infect. Immun. – 1997. – V. 65(2). – P. 579586. 378. Pukatzki, S. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum/ S. Pukatzki, R.H. Kessin, J.J. Mekalanos // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2002. – V. 99. – P. 3159-3164. 379. Purification and structural analysis of pyocyanin and 1-hydroxyphenazine / D. Watson [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1986. – V. 159(2). – P. 309-313. 380. Pyocyanin production by Pseudomonas aeruginosa induces neutrophil apoptosis and impairs neutrophil mediated host defenses in vivo / L. Allen [et al.] // J. Immunol. – 2005. – V. 174. – Р. 36433649. 381. Pyoverdin is essential for virulence of Pseudomonas aeruginosa / J.M. Meyer [et al.] // Infect. Immun. – 1996. – V. 64. – P. 518-523 382. Queenan, A.M. Carbapenemases: the versatile b-lactamases / A.M. Queenan, K. Bush // Clin. Microbiol. Rev. – 2007. – V. 20. – P. 440-458. 383. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa / E.C. Pesci [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – V. 96. – P. 11229-11234. 384. Ramos, I. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales / I. Ramos, L.E.P. Dietrich, A. Price-Whelan, D.K. Newman // Res. Microbiol. – 2010. – V. 161. – P. 187-191. 385. Rao, Y.M. Oxidative-stress-induced production of pyocyanin by Xanthomonas campestris and its effect on the indicator target organism, Escherichia coli / Y.M. Rao, G.K. Sureshkumar // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – V. 25(5). – P. 266-272. 386. Rapid and accurate detection of Pseudomonas aeruginosa by real-time polymerase chain reaction with melting curve analysis targeting gyrB gene / M. Motoshima [et al.] // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2007. – V. 58. – P. 53-58. 387. Rapid detection and identification of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as pure and mixed cultures in bottled drinking water using Fourier transform infrared spectroscopy and multivariate analysis / H.M. Al-Qadiri [et al.] // J. Agri. Food Chem. – 2006. – V. 54. – P. 5749-5754. 388. Rapid detection of carbapenemase genes by multiplex real-time PCR / J. Monteiro [et al.] // J. Antimicrob Chemother. – 2012. – V. 67(4). – P. 906-909. 389. Rapid detection of Pseudomonas aeruginosa from positive blood cultures by quantitative PCR / V. Cattoir [et al.] // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. – 2010. – V. 9(21). – P. 1-5. 238 390. Rapid genotyping of Pseudomonas aeruginosa isolates harboured by adult and paediatric patients with cystic fibrosis using repetitive-element based PCR assays / M.W. Syrmis [et al.] // J. Med. Microbiol. – 2004. – V.53. – P. 1089-1096. 391. Rapid identificationof 4-hydroxy-2-alkylquinolines produced by Pseudomonas aeruginosa using gas chromatography-electron-capture mass spectrometry / G. Taylor [et al.] // J. Chromatography B. – 1995. – V. 664. – P. 458-462. 392. Rapid necrotic killing of polymorphonuclear leukocytes is caused by quorum-sensing controlled production of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa / P.O. Jensen [et al.] // Microbiology. – 2007. – V. 153. – P. 1329-1338. 393. Rastegar, L.A.R. Burn wound infections and antimicrobial resistance in Tehran, Iran: an increasing problem / L.A.R. Rastegar, R. Alaghehbandan, L. Akhlaghi // Ann. Burns Fire Dis. – 2005. – V. 18(2). – P. 68-73. 394. Recent insights into the diversity, frequency and ecological roles of phenazines in fluorescent Pseudomonas spp. / D.V. Mavrodi [et al.] // Environ. Microbiol. – 2013. – V. 15. – P. 675686 395. Recurrent pyelonephritis due to NDM-1 metallo-beta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa in a patient returning from Serbia, France, 2012 / C. Flateau [et al.] // Eurosurveillance. – 2012. – V. 17(45). – Р. 1-4. 396. Relationship between cytotoxicity and corneal epithelial cell invasion by clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa / S.M. Fleiszig [et al.] // Infect. Immun. − 1996. – V. 64(6). – P. 2288-2294. 397. Reservoirs and transmission of Pseudomonas aeruginosa in intensive care unit / A. Lashéras [et al.] // Med. Mal. Infect. – 2006. – V. 36(2). – P. 99-104. 398. Ribotyping of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from surgical intensive care patients / E. Gruner [et al.] // J. Infect. Dis. – 1993. – V. 167. – P. 1216-1220. 399. Risk factors leading to clinical failure in the treatment of intraabdominal or skin/soft tissue infections / M.E. Falagas [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 1996. – V. 15. – P. 913-921. 400. Role of exoenzyme S in chronic Pseudomonas aeruginosa lung infections / T.I. Nicas [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. – 1985. – V. 4. – P. 175-179. 401. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection / M. Feldman [et al.] // Infect. Immun. – 1998. – V. 66. – P. 43-51. 402. Role of the Pseudomonas aeruginosa PlcH Tat signal peptide in protein secretion, transcription, and cross-species Tat secretion system compatibility / A. Snyder [et al.] // J. Bacteriol. – 2006. – V. 188(5). – P. 1762-1774. 239 403. Romling, U. A major Pseudomonas aeruginosa clone common to patients and aquatic habitats / U. Romling, J. Wingender, H. Muller, В. Tummler // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – V. 60. – P. 1734-1738. 404. Roosjen, A. Bacterial factors influencing adhesion of Pseudomonas aeruginosa strains to a poly(ethyleneoxide) brush / A. Roosjen, H.J. Busscher, W. Norde, H.C. Van der Mei // Microbiology. – 2006. – V. 152(9). – P. 2673-2682. 405. Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell surface hydrophobicity / M. Rosenberg, D. Gutnik, E. Rosenberg // FEMS Microbiol. Lett. – 1980. – V. 9. – P. 29-33. 406. Samadpour, M. Biotinylated DNA probes for exotoxin A and pilin genes in the differentiation of Pseudomonas aeruginosa strains / M. Samadpour, S.L. Moseley, S. Lory // J. Clin. Microbiol. – 1988. – V. 26. – P. 2319-2323. 407. Sanyal, G. A transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin hybrid protein undergoes pH-dependent conformational changes conducive to membrane interaction / G. Sanyal, D. MarquisOmer, J.O. Gress, C.R. Middaugh // Biochemistry. – 1993. – V. 32(13). – P. 3488-3497. 408. Sato, H. ExoU is a potent intracellular phospholipase / H. Sato, D.W. Frank // Mol. Microbiol. – 2004. – V. 53. – P. 1279-1290. 409. Schmidt, K.D. Comparative genome mapping of Pseudomonas aeruginosa PAO with Pseudomonas aeruginosa C, which belongs to a major clone in cystic fibrosis patients and aquatic habitats / K.D. Schmidt, B. Tummler, U. Romling // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178(1). – P. 85-89. 410. Schooling, S.R. Membrane vesicles: an overlooked component of the matrices of biofilms / S.R. Schooling, T.J. Beveridge // J. Bacteriol. – 2006. – V. 188(16). – P. 5945-5957. 411. Schwartz, D.C. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis / D.C. Schwartz, C.R. Cantor // Cell. – 1984. – V. 37(1). – P. 67-75. 412. Screening for antibacterial activity in 72 species of wood-colonizing fungi by the Vibrio fisheri bioluminescence method / M.B. Zrimec [et al.] // J. Basic Microbiol. – 2004. – V. 44(5). – P. 407-412. 413. Shah, A. Geographic variations in microbial keratitis: an analysis of the peer-reviewed literature / A. Shah, A. Sachdev, D. Coggon, P. Hossain // Br. J. Ophthalmol. – 2011. – V. 95(6). – P. 762-767. 414. Sharma, M. Metallo-beta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa in neonatal septicemia / M. Sharma, S. Yadav, U. Chaudhary// J. Lab. Physicians. – 2010. – V. 2(1). – P. 14-16. 415. Siderophore-mediated cooperation and virulence in Pseudomonas aeruginosa / A. Buckling [et al.] // FEMS. Microbiol. Ecol. – 2007. – V. 62. – P. 135-141. 416. Siegall, C.B. Functional analysis of domains II, Ib, and III of Pseudomonas exotoxin / C.B. Siegall, V.K. Chaudhary, D.J. FitzGerald, I. Pastan // J. Biol. Chem. – 1989. – V. 264. – P. 14256-14261. 240 417. Silva, F.M. SPM-1-producing Pseudomonas aeruginosa: analysis of the ancestor relationship using multilocus sequence typing, pulsed-field gel electrophoresis, and automated ribotyping / F.M. Silva, M.S. Carmo, S. Silbert, A.C. Gales // Microb. Drug. Resist. – 2011. – V. 17. – P. 215-220. 418. Single-nucleotide-polymorphism mapping of the Pseudomonas aeruginosa type III secretion toxins for development of a diagnostic multiplex PCR system / T. Ajayi [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2003. – V. 41(8). – Р. 3526-3531. 419. Sivanmaliappan, T.S. Antimicrobial susceptibility patterns of Pseudomonas aeruginosa from diabetes patients with foot ulcers / T.S. Sivanmaliappan, M. Sevanan // Intern. J. Microbiol. – 2011. – Article ID 605195. 420. Skerker, J.M. Direct observation of extension and retraction of type IV pili / J.M. Skerker, H.C. Berg // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2001. – V. 98. – P. 6901-6904. 421. Smith, K.D. Iron metabolism at the host pathogen interface: lipocalin 2 and the pathogenassociated iroA gene cluster / K.D. Smith // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2007. – V. 39(10). – P. 17761780. 422. Smith, R.S. P. aeruginosa quorum sensing systems and virulence / R.S. Smith, B.H. Iglewski // Cur. Opin. Microbiol. – 2003. – V. 6(1). – P. 56-60. 423. Smith, V.H. Effects of resource supplies on the structure and function of microbial communities / V.H. Smith // Antonie Van Leeuwenhoek. – 2002. –V. 81(1-4). – P. 99-106. 424. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis / E.M. Southern // J. Mol. Biol. – 1975. – V. 98(3). – P. 503-517. 425. Spilker, T. PCR-Based Assay for Differentiation of Pseudomonas aeruginosa from other Pseudomonas species recovered from cystic fibrosis patients / T. Spilker, T. Coenye, P. Vandamme, J.J. LiPuma // J. Clin. Microbiol. – 2004. – V. 42(5). – Р. 2074-2079. 426. Spread of extensively resistant VIM-2-positive ST235 Pseudomonas aeruginosa in Belarus, Kazakhstan, and Russia: a longitudinal epidemiological and clinical study / M.V. Edelstein [et al.] // Lancet Infect. Dis. – 2013. – V.13. – P. 867-876. 427. Steed, C.J. Common infections acquired in the hospital: the nurse’s role in prevention / C.J. Steed // Nurs. Clin. North. Am. – 1999. – V. 34(2). – P. 443-461. 428. Stenotrophomonas, a new bacterial genus for Xanthomonas maltophilia (Hugh 1980) / N.J. Palleroni [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1993. – V. 43. P. 606-609. 429. Sternal wound infection following open heart surgery: appraisal of incidence, risk factors, changing bacteriologic pattern and treatment outcome / K.E. Okonta [et al.] // Indian J. Thorac. Cardiovasc. Surg. – 2011. – V. 27. – P. 28-32. 430. Stoll, B.J. Infections in VLBW infants: studies from the NICHD Neonatal Research Network / B.J. Stoll, N. Hansen // Semin. Perinatol. – 2003. – V. 27(4). – P. 293-301. 241 431. Study of pyoverdine type and production by Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients: prevalence of type II pyoverdine isolates and accumulation of pyoverdine-negative mutations / D. De Vos [et al.] // Arch. Microbiol. – 2001. – V. 175(5). – P. 384-388. 432. Stull, T.L. A broad-spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA / T.L. Stull, J.J. LiPuma, T.D. Edlind // J. Infect. Dis. – 1988. – V. 157(2). – P. 280-286. 433. Surveillance of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from Puerto Rican medical center hospitals: dissemination of KPC and IMP-18 beta-lactamases / D.J. Wolter [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2009. – V. 53. – P. 1660-1664. 434. Survey of bloodstream infections due to gram-negative bacilli: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, and Latin America for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997 / D.J. Diekema [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 1999. – V. 29(3). – P. 595-607. 435. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance / J. Overhage [et al.] // J. Bacteriol. – 2008. – V. 190. – P. 2671-2679. 436. Takenaka, T. An ATP bioluminescence assay for the analysis of bacterial biofilms / T. Takenaka // Kansenshogaku. Zasshi. – 1994. – V. 68(6). – P. 759-766. 437. The absence of correlation between allozyme and rrn RFLP analysis indicates a high gene flow rate within human clinical Pseudomonas aeruginosa isolates / E. Denamur [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1993. – V. 110. – P. 275-280. 438. The effect of culture conditions on hydrophobic properties of Pseudomonas aeruginosa / K. Wolska [et al.] // Med. Dosw. Mikrobiol. – 2002. – V. 54(1). – P. 61-66. 439. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States / S.R. Watson [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2003. – V. 167(5). – P. 695-701. 440. The exopolysaccharide alginate protects Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria from IFN-γmediated macrophage killing / J.G. Leid [et al.] // Amer. Asst. Immun., Inc. – 2005. – V. 175(11). – P. 7512-7518.. 441. The multiple signaling systems regulating virulence in Pseudomonas aeruginosae / P.N. Jimenez [et al.] // Microbiol. Mol. Biol. – 2012. – V. 76(1). – P. 46-65. 442. The nationwide study of bacterial pathogens associated with urinary tract infections conducted by the Japanese Society of Chemotherapy / K. Ishikawa [et al.]// J. Infect. Chemother. – 2011. – V. 17(1). – P. 126-138. 443. The Pseudomonas aeruginosa patatin-like protein PlpD is the archetype of a novel Type V secretion system / R. Salacha [et al.] // Environ. Microbiol. – 2010. – V. 12. – P. 1498-1512. 242 444. The pyoverdin receptor FpvA, a TonB-dependent receptor involved in iron uptake by Pseudomonas aeruginosa (review) / N. Folschweiller [et al.] // Mol. Membr. Biol. – 2000. – V. 17(3). – P. 123-133. 445. The role of bacterial cell wall hydrophobicity in adhesion / M.C.M. Van Loosdrecht [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1987. – V. 53(8). – P. 1893-1897. 446. Thompson, J.D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment son / J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson // Nucl. Acids. Res. – 1994. – V. 22. – P. 4673-4680. 447. Toleman, M.A. blaVIM-7, an evolutionarily distinct metallo-beta-lactamase gene in a Pseudomonas aeruginosa isolate from the United States / M.A. Toleman, К. Rolston, R. Jones, T.R. Walsh // Antimicrob. Agents Chemother. – 2004. – V. 48(10). – P. 329-332. 448. Tomlin, K.L. Interspecies biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia / K.L. Tomlin, O.P. Coll, H. Ceri // Can. J. Microbiol. – 2001. – V. 47(10). – P. 949-954. 449. Torres, A. Ventilator-associated pneumonia. European Task Force on ventilator-associated pneumonia / A. Torres, J. Carlet // Eur. Respir. J. – 2001. – V. 17(5). – P. 1034-1045. 450. Tosson, A.M. Microbial pathogens causative of neonatal sepsis in Arabic countries / A.M. Tosson, C.P. Speer // J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. – 2011. – V. 24(8). – P. 990-994. 451. Twenty-five year review of Pseudomonas aeruginosa bacteremia in a burn center / A.T. McManus [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. – 1985. – V. 4. – P. 219-223. 452. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections / A. Roy-Burman [et al.] // J. Infect. Dis. – 2001. – V. 183. – P. 1767-1774. 453. Type III protein secretion is associated with poor clinical outcomes in patients with ventilatorassociated pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa / A.R. Hauser [et al.] / Crit. Care. Med. – 2002. – V. 30(3). – P. 521-528. 454. Ullah, A. Prevalence of antimicrobial resistant Pseudomonas aeruginosa in fresh water spring contaminated with domestic sewage / A. Ullah, R. Durrani, G. Ali, S. Ahmed // J. Biol. Food Sci. Res. – 2012. – V. 1(2). – P. 19-22. 455. Unal, S. Аctivity of meropenem and comparators against Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. isolated in the MYSTIC Program, 2002-2004 / S. Unal, J.A. Garcia-Rodriguez // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2005. – V. 53(4). – P. 265-271. 456. Ustin, J.S. Necrotizing soft-tissue infections / J.S. Ustin, M.A. Malangoni // Crit. Care Med. – 2011. – V. 9(9). – P. 2156-2162. 243 457. Validation of ATP bioluminescence as a tool to assess antimicrobial effects of mouth rinses in an in vitro subgingival-biofilm model / M. Sanchez [et al.] // Med. Oral. Patol. Oral. Cir. Bucal. – 2013. – V. 18(1). – P. 86-92. 458. Vallis, A.J. Biological effects of Pseudomonas aeruginosa type III-secreted proteins on CHO cells / A.J. Vallis, V. Finck-Barbancon, T.L. Yahr, D.W. Frank // Infect. Immun. – 1999. – V. 67(4). – P. 2040-2944. 459. Van de Peer, Y. TREECON for Windows a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. DeWachter // Comput. Appl. Biosci. – 1994. – V. 10. – P. 569-570. 460. Van Delden, C. Cell-to-cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections / C. Van Delden, B.H. Iglewski // Emerg. Infect. Dis. – 1998. – V. 4. – P. 551-560. 461. Vanhaecke, E. Kinetics of Pseudomonas aeruginosa adhesion to 304 and 316-L stainless steel: role of cell surface hydrophobicity / E. Vanhaecke, J.-P. Remon, M. Moors, F. Raes // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – V. 56(3). – P. 788-795. 462. Vasil, M.L. Molecular studies of Pseudomonas exotoxin A gene / M.L. Vasil, C. Chamberlain, C.C.R. Grant // Infection. Immunity. – 1986. – V. 52(2). – P. 538-548. 463. Vasil, M.L. Pseudomonas aeruginosa: biology, mechanisms of virulence, epidemiology / M.L. Vasil // J. Pediatr. – 1986. – V. 108(5). – P. 800-805. 464. Ventilator-associated pneumonia in extremely preterm neonates in a neonatal intensive care unit: characteristics, risk factors, and outcomes / A. Apisarnthanarak [et al.] // Pediatrics. – 2003. – V. 112, N 6(1). – Р. 1283-1289. 465. Ventilator-associated pneumonia in newborn infants diagnosed with an invasive bronchoalveolar lavage technique: a prospective observational study / M. Cernada [et al.] // Pediatr. Crit. Care Med. – 2013. – V. 14(1). – P. 55-61. 466. Vergnaud, G. Minisatellites: mutability and genome architecture / G. Vergnaud, F. Denoeud // Genome Res. – 2000. – V. 10. – P. 899-907. 467. Versalovic, J. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes / J. Versalovic, T. Koeuth, J.R. Lupski // Nucleic Acids Res. – 1991. – V. 19. – P. 6823-6831. 468. Vinderola, C.G. Relationship between interaction sites in the gut, hydrophobicity, mucosal immunomodulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteriа / C.G. Vinderola, M. Medici // J. App. Microbiol. – 2004. – V. 96. – P. 230-243. 469. VNTRDB: a bacterial variable number tandem repeat locus database / C.H. Chang [et al.] // Nucleic. Acids. Res. – 2007. – V. 35. – P. 416-421. 244 470. Voulhoux, R. Involvement of the twin-arginine translocation system in protein secretion via the type II pathway / R. Voulhoux, G. Ball, B. Ize // EMBO J. – 2001. – V. 20(23). – P. 6735-6741. 471. Weldon, J.E. A guide to taming a toxin – recombinant immunotoxins constructed from Pseudomonas exotoxin A for the treatment of cancer / J.E. Weldon, I. Pastan // FEBS J. – 2011. – V. 278(23). – Р. 4683-4700. 472. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Res. – 1990. – V. 18. – P. 7213-7218. 473. Bacterial etiology of serious infections in young infants in developing countries: results of a multicenter study. The WHO Young Infants Study Group // Pediatr. Infect. Dis. J. – 1999. – V. 18. – P. 17-22. 474. Williams, J.S. Characterization of bioactive secondary metabolites from Pseudomonas aeruginosa and Porocentrum species / J.S. Williams // Submitted to the University of North Carolina Wilmington in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Master of Science. – 2003. – 91 pp. 475. Winstanley, C. Genotypic and phenotypic characteristics of Pseudomonas aeruginosa isolates associated with ulcerative keratitis / C. Winstanley, S.B. Kaye, T.J. Neal, the Microbiology Ophthalmic Group // J. Medical Microbiology. – 2005. – V. 54. – P. 519-526. 476. Wolska, K. BOX-PCR is an adequate tool for typing of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates / K. Wolska, B. Kot, A. Jakubczak, K. Rymuza // Folia Histochem. Cytobiol. – 2011. – V. 49(4). – P. 734-738. 477. Wolska, K. Genetic features of clinical Pseudomonas aeruginosa strains / K. Wolska, P. Szweda // Pol. J. Microbiol. – 2009. – V. 58(3). – P. 255-260. 478. Wolska, K. Genotyping techniques for determining the diversity of microorganisms / K. Wolska, P.A. Szweda // Genetic Diversity in Microorganisms, Prof. Mahmut Caliskan (Ed.), 2012. ISBN: 978953-51-0064-5, InTech, Available from: http://www.intechopen.com. 479. Wolska, K. А comparative evaluation of PCR ribotyping and ERIC-PCR for determining the diversity of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates / K. Wolska, P.A. Szweda // Pol. J Microbiol. – 2008. – V. 57. – P. 157-163. 480. Woods, C.R. Whole-cell repetitive element sequence-based polymerase chain reaction allows rapid assessment of clonal relationships of bacterial isolates / C.R. Woods, J. Versalovic, T. Koeuth, J.R. Lupski // J. Clin. Microbiol. – 1993. – V. 31. – P. 1927-1931. 481. Yahr, T.L. Transcriptional analysis of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S structural gene / T.L. Yahr, A.K. Hovey, S.M. Kulich, D.W. Frank // J. Bacteriol. – 1995. – V. 177(5). – P. 11691178. 245 482. Yankov, I.V. Ventilator-associated pneumonias in children (i) – diagnostic criteria, etiology and pathogenesis / I.V. Yankov, T.I. Shmilev // Folia Medica. – 2012. – V. 54(1). – P. 5-11. 483. Zeraik, A.E. Influence of growth media and temperature on bacterial adhesion to polystyrene surfaces / A.E. Zeraik, M. Nitschke // Braz. Arch. Biol. Technol. – 2012. – V. 55(4). – P. 569-576.
