ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы «ГРИПП» для выявления и дифференциации

ИНСТРУКЦИЯ
по применению тест-системы «ГРИПП» для выявления и дифференциации
вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции
(организация-производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г.Москва)
Тест-система «ГРИПП» для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и
идентификации субтипов в биологическом материале методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) выпускается в трех форматах:
Формат EPh – для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и идентификации
субтипов H5 и H7 в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
Формат FEP – для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и
идентификации субтипов H5, H7 и Н9 в биологическом материале методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».
Формат FRT – для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A), идентификации
субтипов H5, H7, Н9, и идентификации гриппа свиней А/Н1 в биологическом материале
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени».
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1. Тест-система выпускается в трех форматах.
Формат EPh.
Тест-система «ГРИПП» формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая
контроли, выпускается в двух формах:
Форма 1 включает:
- комплект «РИБО-сорб» вариант 50 - для выделения РНК/ДНК из клинического
материала.
- комплект «РЕВЕРТА-L» вариант 50 – для получения кДНК на матрице РНК.
- «ПЦР-комплект» вариант 50 F - для амплификации кДНК Influenza virus A и
идентификации субтипов H5 и H7.
- комплект «ЭФ» вариант 200 - для электрофоретической детекции продуктов
амплификации в агарозном геле.
Форма 2 включает:
- «ПЦР-комплект» вариант 50 F - для амплификации кДНК Influenza virus A и
идентификации субтипов H5 и H7.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции,
амплификацию кДНК Influenza virus A и электрофоретическую детекцию.
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации кДНК Influenza
virus A. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 1 из 44
реагентов для экстракции РНК, обратной транскрипции электрофоретической детекции,
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FEP.
Тест-система «ГРИПП» формат FEP, рассчитанная на проведение 50 анализов,
включая контроли, выпускается в двух формах:
Форма 1 включает:
- комплект «РИБО-сорб» вариант 50 - для выделения РНК/ДНК из клинического
материала.
- комплект «РЕВЕРТА-L» вариант 50 - для получения кДНК на матрице РНК.
- комплект «ПЦР-комплект» вариант FEP - для амплификации кДНК Influenza virus A
и идентификации субтипов H5, H7 и Н9 с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией по «конечной точке».
Форма 2 включает:
- комплект «ПЦР-комплект» вариант FEP - для амплификации кДНК Influenza virus A
и идентификации субтипов H5, H7 и Н9 с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией по «конечной точке».
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции и
амплификацию кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по
«конечной точке».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации кДНК Influenza
virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке». Для проведения
полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции
РНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FRT.
Тест-система «ГРИПП» формат FRT, рассчитанная на проведение 50 анализов,
включая контроли, выпускается в трех формах:
Форма 1 включает:
- комплект «РИБО-сорб» вариант 50 - для выделения РНК/ДНК из клинического
материала.
- комплект «РЕВЕРТА-L» вариант 50 - для получения кДНК на матрице РНК.
- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - для амплификации кДНК Influenza
virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени».
Форма 2 включает:
- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - для идентификации субтипов H5, H7
и Н9 Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
«реального времени».
Форма 3 включает:
- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT - для идентификации гриппа свиней А/Н1 с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма 4 включает:
- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - для амплификации кДНК Influenza
virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени».
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции и
амплификацию кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме «реального времени».
Формы комплектации 2, 3 и 4 предназначены для проведения амплификации кДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 2 из 44
проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для
экстракции РНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
1.1. Комплект реагентов «РИБО-сорб» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор
1 флакон, 22,5 см3 (мл)
Раствор для отмывки 1
1 флакон, 20,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 3
1 флакон, 50,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 4
1 флакон, 20,0 см3 (мл)
Сорбент
1 пробирка, 1,25 см3 (мл)
РНК-буфер
5 пробирок по 0,5 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на экстракцию РНК из 50 проб, включая контрольные
образцы.
1.2. Комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
RT-mix
5 пробирок по 0,125 см3 (мл)
RT-G-mix-1
5 пробирок по 0,01 см3 (мл)
Ревертаза (MMlv)
1 пробирка, 0,03 см3 (мл)
ДНК-буфер
1 пробирка, 1,2 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 60 реакций обратной транскрипции, включая
контрольные образцы.
Формат EPh: к комплекту «РЕВЕРТА-L» прилагаются следующие реактивы:
ДНК-буфер
3 пробирки по 1,2 см3 (мл)
1.3. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 F состоит из следующих
компонентов:
ПЦР-смесь-1 Influenza virus A
1 пробирка, 0,3 см3 (мл)
2,5х ПЦР-буфер blue
2 пробирки по 1,15 см3 (мл)
Полимераза (TaqF)
2 пробирки по 0,03 см3 (мл)
Минеральное масло для ПЦР
1 флакон, 8,0 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ТЕ-буфер
1 пробирка, 0,5 см3 (мл)
Дополнительные реагенты для идентификации субтипов Н5 и Н7 Influenza virus A:
ПЦР-смесь-1 Influenza virus A H5
1 пробирка, 0,3 см3 (мл)
ПЦР-смесь-1 Influenza virus A H7
1 пробирка, 0,3 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A H5
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A H7
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ОКО
3 пробирки по 1,6 см3 (мл)
1.4. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FEP состоит из следующих
компонентов:
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
ПЦР-буфер-Flu
1 пробирка, 0,42 см3 (мл)
Полимераза (TaqF)
2 пробирки по 0,03 см3 (мл)
ПЦР-смесь-Фон
1 пробирка, 0,5 см3 (мл)
Минеральное масло для ПЦР
1 флакон, 4,0 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ТЕ-буфер
1 пробирка, 0,5 см3 (мл)
Дополнительные реагенты для идентификации субтипов Н5, Н7 и H9 Influenza
virus A:
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A H5, Н7, H9
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A H5, H7, H9
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 3 из 44
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ОКО
3 пробирки по 1,6 см3 (мл)
ВКО STI-rec
5 пробирок по 0,12 см3 (мл)
1.5. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F для идентификации
субтипов Н5, Н7 и H9 Influenza virus A состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A H5, Н7, H9 1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
ПЦР-буфер-Flu
1 пробирка, 0,42 см3 (мл)
Полимераза (TaqF)
2 пробирки по 0,03 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A H5, H7, H9
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ТЕ-буфер
1 пробирка, 0,5 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
1.6. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT для идентификации гриппа
свиней А/Н1 состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A/H1-swine,
раскапана под воск в пробирки объемом 0,2 мл
55 пробирок по 0,008 см3 (мл)
ПЦР-смесь-2-FL
1 пробирка, 0,77 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A/H1-swine
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ПКО STI-88
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ТЕ-буфер
1 пробирка, 0,5 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контрольные
образцы.
1.7. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F для амплификации кДНК
Influenza virus A состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
ПЦР-буфер-Flu
1 пробирка, 0,42 см3 (мл)
Полимераза (TaqF)
2 пробирки по 0,03 см3 (мл)
ПКО кДНК Influenza virus A
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ПКО STI-88
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ТЕ-буфер
1 пробирка, 0,5 см3 (мл)
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ОКО
3 пробирки по 1,6 см3 (мл)
ВКО STI-rec
5 пробирок по 0,12 см3 (мл)
1.8. Комплект реагентов «ЭФ» вариант 200 состоит из следующих компонентов:
Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с
бромидом этидия
1 флакон, 50,0 см3 (мл)
Агароза для электрофореза ДНК
2 флакона по 1,7 г
Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета
100 мл геля - 5 рядов по 24 лунки).
Упаковка и маркировка.
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с
указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе),
номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные
картонные коробки (застегивающиеся пакеты из полиэтилена). На каждую коробку (пакет из
полиэтилена) наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта,
перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок (флаконов) каждого
компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта,
условий хранения, даты изготовления, срока годности.
2.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 4 из 44
Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На
каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой
указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы,
перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок
годности, условия хранения, обозначение ТУ/СТО и надпись «Для животных». В каждую
упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.
Транспортирование и хранение.
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При
получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Комплекты реагентов «РИБО-сорб», «ПЦР-комплект» хранить при температуре от 2 до 8 С,
кроме полимеразы (TaqF). Комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» и полимеразу (TaqF) хранить
при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С.
Формат EPh.
Комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света
месте.
3.
4. Срок годности тест-системы - 12 месяцев с даты изготовления. Тест-системы с истекшим
сроком годности применению не подлежат.
II. ПРИНЦИП ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ
5.
Формат EPh. Метод обнаружения кДНК вируса гриппа А (Influenza virus A) основан на
амплификации специфических участков кДНК за счет многократного повторения циклов
денатурации кДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок
(праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.
Чтобы получить кДНК вируса, предварительно проводят экстракцию РНК вируса из
исследуемого материала и реакцию обратной транскрипции.
6.
Форматы FEP, FRT. Метод обнаружения кДНК вируса гриппа А (Influenza virus A)
основан на амплификации специфических участков кДНК за счет многократного повторения
циклов денатурации кДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных
затравок (праймеров) и зондов, меченных флуоресцентными красителями, и синтеза
комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Чтобы получить кДНК
вируса, предварительно проводят экстракцию РНК вируса из исследуемого материала и
реакцию обратной транскрипции.
III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
7. Отбор материала для исследования.
7.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования,
необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов
внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по
данному вопросу.
7.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.
7.3. Для исследования используют следующий материал от животных:
при исследовании птиц:
- помет (4-5 г) в стерильных контейнерах;
- мазки из клоаки, со слизистой глотки и трахеи берут сухими стерильными зондами с
ватными тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным
тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной
среды (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), стерильного
физиологического раствора или раствора фосфатного буфера. Конец зонда
отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку
пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают;
- трахеальные смывы, получают с помощью стерильного физиологического раствора;
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 5 из 44
внутренние органы (фрагменты трахеи и легких, селезенка, мозг, воздухоносные
мешки, кишечник) в одноразовых стерильных контейнерах;
- яйцо для исследования отправляют целиком, в герметичном контейнере;
- эмбрионы кур целиком в яйце помещают в герметичный контейнер.
при исследовании свиней и лошадей:
- носовые смывы получают с помощью стерильного физиологического раствора в
одноразовых стерильных контейнерах;
- бронхиальный экссудат в одноразовых стерильных контейнерах;
- внутренние органы (фрагменты трахеи и легких) в одноразовых стерильных
контейнерах.
мясо птиц и субпродукты в одноразовых стерильных контейнерах.
комбикорма для племенной птицы, сухие корма для непродуктивных животных,
находящиеся в мешках или небольших насыпях на складе, отбирают по ГОСТ 13496.0
(см. приложение 2).
при исследовании свинины, продуктов ее переработки и субпродуктов:
- пробы мяса, продуктов переработки, субпродуктов в одноразовых стерильных
контейнерах;
- мазки с поверхности мяса, субпродуктов берут стерильными зондами с ватными
тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном)
помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды для
хранения и транспортировки респираторных мазков (производства ФГУН ЦНИИЭ
Роспотребнадзора), стерильного физиологического раствора или раствора фосфатного
буфера. Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно
закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают
7.4. От партии продукта отбирают общую пробу в соответствии с ГОСТом следующим
образом:
- отбор проб от каждой новой партии производится с использованием стерильной
медицинской перчатки;
- от исследуемой партии корма или продукта отбирают из различных мест не менее 10
образцов проб (по 200 г) в чистый полиэтиленовый пакет и перемешивают, формируя
общую пробу (2 кг);
- из общей пробы отбирают среднюю пробу в 20 г, помещают в чистый герметичный
пакет из полиэтилена или в чистый сухой флакон с притертой крышкой, опечатывают
и отправляют на анализ.
7.5. Допускается хранение вышеперечисленного материала до проведения исследования в
течение сут при температуре от 2 до 8 °С или 1 нед - при температуре не выше минус 16 °С.
-
8. Подготовка исследуемого материала.
8.1. Мазки и смывы используют без предварительной обработки.
8.2. Внутренние органы животных, мясо птицы, свинину и субпродукты гомогенизируют
с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию
на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в
пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10 тыс об/мин в течение 30 с. Надосадочную
жидкость используют для экстракции РНК.
8.3. Помет. Для исследования используют 4-5 г помета. Готовят 10% суспензию на
стерильном физиологическом растворе, тщательно ресуспендируют и декантируют в течение
10 мин. Надосадок переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс об/мин
в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для экстракции РНК.
8.4. При исследовании яиц в скорлупе прокалывают отверстие иглой со стерильным
шприцем или пастеровской пипеткой с фильтром и отбирают в пробирку объемом 1,5 мл 1,01,5 мл яичного белка.
8.5. При исследовании куриных эмбрионов в скорлупе прокалывают отверстие иглой со
стерильным шприцем или пастеровской пипеткой с фильтром и отбирают в пробирку объемом
1,5 мл 1,0-1,5 мл аллантоисной жидкости.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 6 из 44
8.6. Корм для исследования тщательно гомогенизируют. Готовят 10% суспензию на
стерильном физиологическом растворе, тщательно ресуспендируют и декантируют в течение
10 мин. Надосадок переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс об/мин
в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для экстракции РНК.
IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР
Формат EPh: ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).
Форматы FEP, FRT: ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях
(зонах).
9.
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
9.1. ЗОНА 1 – Для экстракции РНК из исследуемого материала:
 Стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные
системы», Россия).
 Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 2415», «Биоком», Россия).
 Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например,
«MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
 Центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например, «ТЭТА-2», «Биоком»,
Россия).
 Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной
жидкости (например, «ОМ-1», г.Ульяновск, Россия).
 Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
 Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
микропробирки объемом 1,5 мл (например, «Axygen», США).
 Штативы для микропробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и
наконечников (например, «Axygen», США).
 Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером
до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
 Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например,
«Axygen», США).
 Холодильник от 2 до 8 С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
 Отдельный халат и одноразовые перчатки.
 Ёмкость с дезинфицирующим раствором.
9.2. ЗОНА 2 – Для проведения реакции обратной транскрипции и амплификации:
 Формат EPh: амплификатор (например, «Терцик», «ДНК-технология», Россия).
 Формат FEP: амплификатор (например, «Терцик», «ДНК-технология», Россия или
«GeneAmp PCR System 2700», «Applied Biosystems», США) и флуоресцентный ПЦР-детектор
(«АЛА-1/4», «BioSan», Латвия или «Джин», «ДНК-Технология», Россия).
 Формат FRT: амплификатор («RotorGene» 3000/6000, «Corbett Research», Австралия
или «iCycler iQ» или «iQ5», «Bio-Rad» , США).
 ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С»», «Ламинарные системы», Россия).
 Центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например, «ТЭТА-2», «Биоком»,
Россия).
 Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
 Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,5
(0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
 Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером
до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
 Холодильник от 2 до 8 С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 7 из 44


Отдельный халат и одноразовые перчатки.
Емкость с дезинфицирующим раствором.
9.3. Формат EPh: ЗОНА 3 – для электрофоретического анализа продуктов ПЦР:
 камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например,
«SE-2», «Хеликон», Россия).
 источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В (например, «Эльф-4», «ДНК–
Технология», Россия).
 ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например,
«Биоком», Россия).
 видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов (например,
«Биотест-1», «ЦНИИ Эпидемиологии», Россия; «BioRad», США).
 аквадистиллятор.
 холодильник от 2 до 8 °С для хранения продуктов амплификации.
 микроволновая печь для плавления агарозы.
 колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы
на 250 мл.
 мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).
 штатив для микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
 отдельный механический или электронный дозатор переменного объема 10 - 40 мкл
(например, «Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, «Axygen», США).
 пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид
этидия.
 парафильм.
 отдельный халат и одноразовые перчатки.
10. Порядок работы.
10.1. ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция РНК из исследуемого материала.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
«RNase-free», «DNase-free».
Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре
от 2 до 8 °С) прогреть при температуре от 60 до 65 °С до полного растворения кристаллов.
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл с плотно
закрывающейся крышкой (включая отрицательный контроль экстракции).
Формат EPh: Внести в каждую пробирку по 450 мкл лизирующего раствора.
Промаркировать пробирки.
Форматы FEP, FRT: Внести в каждую пробирку по 450 мкл лизирующего раствора,
по 10 мкл ВКО STI-rec. Промаркировать пробирки.
Если анализируются яйцо, эмбрионы кур, то в пробирки с лизирующим раствором
внести по 100 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером.
Если анализируются мазки со слизистой глотки, трахеи, поверхности мяса, пробы
фекалий, комбикорма и сухие корма, суспензии мяса и внутренних органов, то в
пробирки с лизирующим раствором внести по 50 мкл ОКО и по 50 мкл исследуемого
образца, используя наконечники с аэрозольным барьером.
В пробирку отрицательного контроля (В–) экстракции внести 100 мкл ОКО.
Плотно закрытые пробы тщательно перемешать на вортексе и процентрифугировать в
течение 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней
поверхности крышки пробирки. Инкубировать при комнатной температуре от 3 до 5 мин.
Если в пробирках находятся взвешенные частицы (не растворившийся полностью материал),
центрифугировать при 10 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге и перенести
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 8 из 44
надосадочную жидкость в другие пробирки.
Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным
наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе,
поставить в штатив на 1 мин, еще раз перемешать и оставить на 5 мин.
Процентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс об/мин в течение 30
с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с
колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на
микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с
колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Тщательно ресуспендировать
сорбент на вортексе. Процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге.
Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и
отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить отмывку раствором для отмывки 3.
Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4. Тщательно ресуспендировать
сорбент на вортексе, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге.
Полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником,
используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой.
Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 15 мин для подсушивания
сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки добавить по 50 мкл РНК-буфера, используя наконечники с аэрозольным
барьером, свободные от РНКаз.
Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 60 ºС на 2-3 мин.
Перемешать на вортексе и процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах
микроцентрифуги (12-13 тыс об/мин) в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит
очищенную РНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции.
Реакцию обратной транскрипции следует проводить сразу после получения РНК-пробы.
Отбирать раствор РНК для реакции нужно очень осторожно, не захватывая сорбент. Если
сорбент взмутился, необходимо осадить его на центрифуге.
Очищенная РНК может храниться до 4 ч при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного
хранения препарата необходимо отобрать раствор РНК, не захватывая сорбент, перенести в
стерильную пробирку и хранить в течение года при температуре не выше минус 68 °С.
10.2. ЭТАП 2 (зона 2). Проведение реакции обратной транскрипции (получение кДНК на
матрице РНК) и постановка ПЦР (амплификация участка полученной кДНК).
10.2.1. Постановка реакции обратной транскрипции.
Общий объем реакции - 20 мкл, объем РНК-пробы – 10 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
«RNase-free», «DNase-free».
Порядок работы:
Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 (0,5) мл.
Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с RT-mix внести
5 мкл RT-G-mix-1 и тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки
пробирки.
К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз,
перемешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки.
Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.
Используя наконечник с аэрозольным барьером, добавить 10 мкл РНК-пробы в
пробирку с реакционной смесью. Осторожно перемешать.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 9 из 44
Поставить пробирки в амплификатор (термостат) при температуре 37 °С на 30 мин.
Формат EPh: полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей
постановки ПЦР развести в 5 раз ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником
добавить 80 мкл ДНК-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз).
Форматы FEP, FRT: полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для
последующей постановки ПЦР развести в 2 раза ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным
наконечником добавить 20 мкл ДНК-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз).
Готовый препарат кДНК можно хранить при температуре не выше минус 16 С в
течение нед или при температуре не выше минус 68 °С в течение года.
10.2.2. Постановка ПЦР.
Общий объем реакции - 25 мкл, объем кДНК-пробы – 10 мкл.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
вариант 50 F и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле с
использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200 см. приложение 1.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
вариант FEP см. приложение 2.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
вариант FRT и FRT-50 F с помощью приборов «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000
(«Corbett Research», Австралия) см. приложение 3.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
вариант FRT и FRT-50 F с помощью приборов «iQ5» и «iCycler iQ» («Bio-Rad», США) см.
приложение 4.
V.
МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ
11. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции
одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.
12. Все работы по сбору, транспортированию и подготовке проб биологического и
секционного материалов осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.128503 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП
1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV
групп патогенности».
13. Анализ проводится согласно МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях
методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».
14. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда,
а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос
из одного помещения в другое.
15. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР,
должны обязательно до начала и после окончания работ облучаться ультрафиолетовым
светом.
16. Обеззараживание биоматериалов и реагентов проводят для каждой стадии отдельно,
помещая одноразовую пластиковую посуду, колбы-ловушки вакуумных отсасывателей на
20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующее средство, которое может
быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2% раствор натриевой
соли дихлоризоциануровой кислоты).
17. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным
экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги
лица и слизистой глаз.
18. Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним
использовать одноразовые перчатки.
19. Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 10 из 44
Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 11 из 44
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.
Формат EPh.
ПРОВЕДЕНИЕ
РЕАКЦИИ
АМПЛИФИКАЦИИ,
АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ
Выявление РНК Influenza virus A.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ.
I.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A перемешать на вортексе и сбросить капли
с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1 Influenza
virus A, 2,5x ПЦР-буфер blue, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:
 5 мкл ПЦР-смеси-1 Influenza virus A
 10 мкл 2,5x ПЦР-буфера blue
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на встряхивателе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 или 0,5 мл.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл).
Б.
Проведение амплификации.
Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло,
используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в
реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A.
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1). Когда температура в ячейках
достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку
продолжения программы.
*
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
Таблица 1.
Программа для амплификации кДНК Influenza virus A
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):
«GeneAmp PCR System 2700»
(«Applied Biosystems»);
«Терцик»
«Gradient
Palm Cycler»
«Maxygene» («Axygen»)
(«ДНК-технология»)
(«Corbett Research»);
«iCycler» («BioRad»)
цикл температура время
0
1
2
3
4
95 °С
95 °С
95 °С
63 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
10 с
10 с
10 с
1 мин
хранение
циклы температура время
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
63 °С
72 °С
72 °С
4 °С
пауза
15 мин
10 с
25 с
25 с
1 мин
хранение
циклы температура время
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
63 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
30 с
45 с
45 с
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 12 из 44
Амплификаторы с
матричным регулированием
температуры:
«Biometra», «MiniCycler»,
«PTC-100» («MJ Research»)
цикл температура время
0
1
2
3
4
95 °С
95 °С
95 °С
63 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
1 мин
1 мин
1 мин
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
После окончания реакции пробирки отправить в помещение для анализа продуктов ПЦР
(ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в
течение нед при температуре от 2 до 8 °С (однако перед проведением электрофореза
необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска).
II.
ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В
АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ (ЭТАП 3, проводится в зоне 3).
Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении
сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.
А.
Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.
Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трисборатного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести
дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.
ВНИМАНИЕ! Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним
следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на
кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий
участок водой.
Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать
специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).
Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из
термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы
и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в
микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 мин. Вынуть колбу
с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать содержимое, вращая
колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при
мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и
остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65-70 С.
Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.
Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
Толщина геля должна быть около 0,6 см.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из
него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки
должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к
положительному. Залить в камеру такой объем готового буфера, чтобы он покрывал гель на 5
мм сверху.
Б.
Порядок работы.
Пробирки с продуктами амплификации последовательно выставить в штатив, отобрать изпод слоя масла по 10–15 мкл пробы и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб
используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после
нанесения каждой пробы). В каждом ряду лунок геля должен быть обязательно представлен К+
и, желательно, маркер молекулярных масс.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 13 из 44
Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к
положительному электроду), и включить источник. Если нет нарушения контактов, то при
прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Оптимальное напряжение
электрического поля 10 В/см. При использовании камеры «SE-2» («Хеликон») и источника
питания «Эльф-4» («ДНК-Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В,
стабилизация по напряжению, время электрофореза – 18-20 мин.
Когда краситель пройдет примерно половину длины геля (не менее 1,5 см), выключить
источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально
лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отмечая
порядок нанесения проб, занести в базу данных.
Внимание! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны
быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной!
В.
Дезактивация буфера и гелей.
Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с
плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата
и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при
комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно
перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.
III. УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или
электрофореграмме специфической полосы амплифицированной кДНК.
отсутствию
на
Длина специфической полосы амплифицированного фрагмента кДНК:
Influenza virus A
- 270 п.н.
Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплификации
положительных и отрицательных контролей (см. табл. 2).
Таблица 2.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контрольный
образец
Контролируемый этап ПЦРанализа
Специфическая полоса 270 п.н. на
электрофореграмме
«В–»
Экстракция РНК
Нет
«К–»
ПЦР
Нет
«К+»
ПЦР
Есть
В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна
быть яркая специфическая светящаяся полоса на уровне 270 п.н.
В дорожках, соответствующих отрицательному контролю этапа ПЦР (К-) и
отрицательному контролю этапа экстракции, не должно быть никаких полос.
Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся
полосу на уровне 270 п.н. большей или меньшей интенсивности.
Отрицательными считаются образцы, которые не содержат полосу 270 п.н.
Кроме полосы 270 п.н., в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы
праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 п.н.
Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:
Если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в табл. 2.
Соответствующий этап анализа следует переделать.
В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные
причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках
амплификатора.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 14 из 44
Появление специфической полосы 270 п.н. в любом из отрицательных контрольных
образцов (В–, К-) указывает на контаминацию реактивов или проб. Требуется повторить анализ
проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.
Идентификация субтипов Н5 и Н7 вируса гриппа А.
Для идентификации субтипов H5 и H7 используют образцы кДНК, давшие
положительные результаты на наличие РНК Influenza virus A (с ПЦР-смесью-1 Influenza
virus A).
I.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Для амплификации кДНК Influenza virus A H5 используется ПЦР-смесь-1 Influenza virus
A H5, для амплификации кДНК Influenza virus A H7 используется ПЦР-смесь-1 Influenza
virus A H7.
Пробирки с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 и ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7
перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного
центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1 Influenza
virus A H5, 2,5x ПЦР-буфер blue, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:
 5 мкл ПЦР-смеси-1 Influenza virus A H5
 10 мкл 2,5x ПЦР-буфер blue
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Приготовить аналогичным способом реакционную смесь с ПЦР-смесью-1 Influenza
virus A H7.
Перемешать смеси на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 или 0,5 мл.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл).
Б.
Проведение амплификации.
Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло,
используя наконечники с аэрозольным барьером, внести в пробирку с ПЦР-смесью-1
Influenza virus A H5 и в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7 по 10 мкл каждой из
кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку с
ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 и в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7
внести по 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+5 тип) – вместо кДНК-пробы в пробирку с
ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5.
в) положительный контрольный образец (К+7 тип) – вместо кДНК-пробы в пробирку с
ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7 внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H7.
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 3 и 4). Когда температура в ячейках
достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку
продолжения программы.
*
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
Таблица 3.
Программа для амплификации кДНК Influenza virus A H5
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):
«GeneAmp PCR System 2700»
(«Applied Biosystems»);
«Терцик»
«Gradient Palm Cycler»
«Maxygene» («Axygen»)
(«ДНК-Технология»)
(«Corbett Research»);
«iCycler iQ» («Bio-Rad»)
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 15 из 44
цикл температура время
0
1
2
3
4
95 °С
95 °С
95 °С
58 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
10 с
10 с
10 с
1 мин
хранение
циклы температура время
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
58 °С
72 °С
72 °С
4 °С
пауза
15 мин
10 с
25 с
25 с
1 мин
хранение
циклы температура время
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
58 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
30 с
45 с
45 с
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
Амплификаторы с матричным
регулированием температуры:
«Biometra», «MiniCycler»,
«PTC-100» («MJ Research»)
цикл температура время
0
1
2
3
4
95 °С
95 °С
95 °С
58 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
1 мин
1 мин
1 мин
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
Таблица 4.
Программа для амплификации кДНК Influenza virus A H7
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):
«GeneAmp PCR System 2700»
(«Applied Biosystems»);
«Терцик»
«Gradient Palm Cycler»
«Maxygene» («Axygen»)
(«ДНК-Технология»)
(«Corbett Research»);
«iCycler iQ» («BioRad»)
цикл температура время
0
1
2
3
4
95 °С
95 °С
95 °С
61 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
10 с
10 с
10 с
1 мин
хранение
циклы температура время
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
61 °С
72 °С
72 °С
4 °С
пауза
15 мин
10 с
25 с
25 с
1 мин
хранение
циклы температура время
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
61 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
30 с
45 с
45 с
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
Амплификаторы с матричным
регулированием температуры:
«Biometra», «MiniCycler»,
«PTC-100» («MJ Research»)
цикл температура время
0
1
2
3
4
95 °С
95 °С
95 °С
61 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
1 мин
1 мин
1 мин
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
После окончания реакции пробирки отправить в помещение для анализа продуктов ПЦР
(ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в
течение нед при температуре от 2 до 8 °С (однако перед проведением электрофореза
необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска).
II.
ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В
АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ (ЭТАП 3, проводится в зоне 3).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 16 из 44
Электрофоретический анализ проводится аналогично анализу при выявлении РНК
Influenza virus A.
III. УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или
электрофореграмме специфических полос амплифицированной кДНК.
отсутствию
на
Длина специфических полос амплифицированных фрагментов кДНК:
Influenza virus A H5
- 235 п.н.
Influenza virus A H7
- 360 п.н.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.
табл. 5).
Таблица 5.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Специфическая полоса на Специфическая полоса на
электрофореграмме с
электрофореграмме с
Контролируемый ПЦР-смесью-1 Influenza ПЦР-смесью-1 Influenza
Контроли
этап ПЦР-анализа
virus A H5
virus A H7
полоса 235 п.н.
полоса 360 п.н.
«В–»
Экстракция ДНК
Нет
Нет
«К–»
ПЦР
Нет
Нет
Амплификация не
«К+5 тип»
ПЦР
Есть
проводится
Амплификация не
«К+7 тип»
ПЦР
Есть
проводится
В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+5 тип),
полученному при использовании для амплификации ПЦР-смеси-1 Influenza virus A H5,
должна быть яркая специфическая светящаяся полоса только на уровне 235 п.н.
В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+7 тип),
полученному при использовании для амплификации ПЦР-смеси-1 Influenza virus A H7,
должна быть яркая специфическая светящаяся полоса только на уровне 360 п.н.
В дорожках, соответствующих отрицательным контролям (контролю этапа
экстракции (В–) и контролю этапа ПЦР (К-)), не должно быть никаких полос, за
исключением возможных праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.
Положительными на субтип Н5 (или Н7) вируса гриппа А считаются образцы,
которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 235 (или 360) п.н. большей
или меньшей интенсивности.
Отрицательными на субтипы Н5 и Н7 считаются образцы, которые не содержат полос
на уровнях 235, 360 п.н.
Кроме полос 235, 360 п.н., в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы
праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 п.н.
Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:
Если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в табл. 5.
Соответствующий этап анализа следует переделать.
В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные
причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках
амплификатора.
Появление специфической полосы 235 и/или 360 п.н. в любом из отрицательных
контрольных образцов (В–, К–) указывает на контаминацию реактивов или проб. Требуется
повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 17 из 44
ПРИЛОЖЕНИЕ 2.
Формат FEP.
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ «AЛА-1/4» («BioSan», Латвия); «Джин» («ДНКТехнология», Россия).
Выявление РНК Influenza virus A.
I.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A перемешать на вортексе и
сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT
Influenza virus A, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A
 5 мкл ПЦР-буфера-Flu
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 или 0,5 мл.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл).
Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с аэрозольным
барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A.
Приготовить 2 контрольных образца «Фон». Для этого в две пробирки внести по 10 мкл
ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A и по 15 мкл ПЦР-смеси-Фон.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР.
Б. Проведение амплификации.
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 6). Когда температура в ячейках
достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку
продолжения программы.
*
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
Таблица 6.
Программа для амплификации кДНК Influenza virus A
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в
пробирке):
«GeneAmp PCR System 2700»
(«Applied Biosystems»),
«Терцик»
«Gradient Palm Cycler»
(«ДНК-технология»)
(«Corbett Research»),
«MyCycler» («BioRad»),
«Maxygene» («Axygen»)
цикл температура
время
95 °С
95 °С
95 °С
54 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
10 с
10 с
10 с
1 мин
хранение
0
1
2
3
4
циклы
1
42
1
температура
95 °С
95 °С
95 °С
54 °С
72 °С
72 °С
4 °С
время
пауза
15 мин
10 с
25 с
25 с
1 мин
хранение
Амплификаторы с
матричным регулированием
температуры:
«Biometra»
циклы температура
1
42
1
95 °С
95 °С
95 °С
54 °С
72 °С
72 °С
10 °С
время
пауза
15 мин
25 с
40 с
25 с
1 мин
хранение
циклы
1
42
1
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 18 из 44
По окончании выполнения программы амплификации приступить к детекции
результатов.
II.
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.
А. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин-4» («ДНКТехнология», Россия) с версией программного обеспечения 4.4i.
Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин» проводится согласно
описанию в паспорте «ПЦР-детектора флуоресцентного «Джин-4».
Настройка теста.
Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:
 Наименование теста - «ГРИПП»
 Привязка каналов: FAM – Influenza virus А, HEX – ВК
 Пороговые значения для канала FAM должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.
 Пороговое значение для канала HEX =2.5.
Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список
тестов». Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные
выше, и сохранить изменения при выходе из программы.
Проведение детекции.
Включить прибор и запустить программу «Gene» на компьютере, присоединенном к
прибору.
Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов и количество
фоновых пробирок (2), выбрать нужный тест (ГРИПП) в графе «Тест», нажать кнопку «OK»
(кнопкой мыши) и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке
«Образец»).
В качестве образцов, обозначенных «ФОН», использовать пробирки с контрольными
образцами «ФОН».
Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной
последовательностью (сначала первые 12 образцов) и запустить детекцию, нажав кнопку,
обозначенную значком цветной призмы, в панели активных кнопок (вверху экрана). По
окончании детекции первой группы заменить пробирки на следующую группу пробирок и
продолжить измерения, нажав кнопку «OK». По окончании детекции вынуть пробирки и
нажать кнопку «OK».
Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин».
Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «Gene»
(колонка «Результат» на экране). Положительные образцы обозначаются знаком «+» на
красном фоне; отрицательные образцы – знаком «-» на зеленом фоне; образцы, для которых
получен сигнал, который нельзя однозначно интерпретировать, требующие повторного
анализа, обозначены знаком «?» на желтом фоне.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК
(см. табл. 7).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 19 из 44
Таблица 7.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
Контролируемый
этап
«В–»
Экстракция РНК
«К–»
«К+»
Результат
автоматической
интерпретации
Результат по уровню флуоресценции
«FAM»
«HEX»
«-»
< 2.5
> 2.5 (положительный)
ПЦР
«нд»
< 2.5
< 2.5
ПЦР
«+»
> 2.8 (положительный)
< 2.5
Образцы, в которых отсутствует специфический сигнал как по каналу «FAM», так и по
каналу «HEX», обозначаются в графе результатов знаком «нд» (не детектируется) на желтом
фоне. Эти образцы требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае, если
повторно получен результат «нд», требуется повторить анализ образца, начиная с этапа
экстракции. (Для образца «K-» результат «нд» является нормой).
Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал,
значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по
всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также
предпринять меры по выявлению источника контаминации.
Б. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4» («BioSan»,
Латвия).
Настройка теста.
Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:
 Наименование теста - «ГРИПП»
 Привязка каналов: FAM - Influenza virus А, HEX – ВК
 Пороговые значения для канала FAM должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.
 Пороговое значение для канала HEX =2.5.
Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список
тестов». После ввода указанных значений, следует нажать кнопку «Сохранить».
Проведение детекции.
Включить прибор и запустить программу «ALA-1» на компьютере, присоединенном к
прибору.
Задать протокол измерения. Для этого в главном меню выбрать «Протокол» → «Создать
новый» или «Открыть», чтобы открыть созданный ранее протокол.
В окне протокола необходимо выбрать тип используемого ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2),
ввести номер протокола, выбрать нужный тест (ГРИПП) в меню-вкладке «Тест» и ввести
последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).
Обозначить образцы, которые являются фоновыми для данной группы образцов, как
«ФОН» (используя сочетание клавиш «Ctrl» и «F»). В качестве образцов, обозначенных
«ФОН» использовать пробирки с контрольными образцами «ФОН».
Закрыть окно редактирования протокола, нажав на кнопку Exit в верхнем левом углу
панели. Протокол сохранить.
Поставить пробирки в ячейки ротора в соответствии с заданной последовательностью и
запустить детекцию, выбрав в меню «Протокол» → «Детекция» или значок Детекция по
протоколу на панели инструментов (вверху экрана).
Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4».
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 20 из 44
Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы
«ALA_1». Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений:
«обнаружено» – положительный результат;
«не обнаружено» – отрицательный результат;
«сомнительно» – результат, который нельзя однозначно интерпретировать (сигнал по
каналу, отведенному для детекции специфической ДНК, превышает пороговое значение,
допустимое для отрицательных образцов, но не превышает пороговое значение для
положительных образцов (сигнал в так называемой «серой зоне»);
«нд» – недостоверный результат (в образце не детектируется (не превышает заданного
порогового значения) ни специфический сигнал, ни сигнал ВКО).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК
(см. табл. 8).
Таблица 8.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
Контролируемый
этап
Результат автоматической интерпретации
1 (FAM)
2 (HEX)
«грипп A - не обнаружено»
ВКО+
«В–»
Экстракция РНК
«К–»
ПЦР
«грипп А - нд»
ВКО-
«К+»
ПЦР
«грипп А - обнаружено»
ВКО-
Образцы, для которых получен результат «нд» (кроме «К-»), требуют повторного
проведения ПЦР и детекции. В случае, если повторно получен результат «нд», требуется
повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Для образца «K-» результат «нд»
является нормой.
Образцы, для которых получен результат «сомнительно», требуют повторного
проведения ПЦР и детекции. В случае повторения аналогичного результата образцы считать
положительными.
Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал,
значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по
всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также
предпринять меры по выявлению источника контаминации.
Идентификация субтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А.
Для идентификации субтипов H5, H7 и Н9 используют образцы кДНК, полученные
после реакции обратной транскрипции.
I.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИИ.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A H5, Н7, H9 перемешать на
вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT
Influenza virus A H5, Н7, H9, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую
реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A H5, Н7, H9
 5 мкл ПЦР-буфера-Flu
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 или 0,5 мл.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 21 из 44
Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с аэрозольным
барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5,H7,H9;
Приготовить 2 контрольных образца «Фон». Для этого в две пробирки внести по 10 мкл
ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A H5, H7, H9 и по 15 мкл ПЦР-смеси-Фон. Сверху
добавить по капле минерального масла для ПЦР.
Б. Проведение амплификации.
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 9). Когда температура в ячейках
достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку
продолжения программы.
* Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
Таблица 9.
Программа для амплификации кДНК Influenza virus A H5, Н7, H9
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в
пробирке):
«GeneAmp PCR System 2700»
(«Applied Biosystems»),
«Терцик»
«Gradient Palm Cycler»
(«ДНК-технология»)
(«Corbett Research»),
«MyCycler» («BioRad»),
Maxygene (“Axygen”)
цикл температура
время
95 °С
95 °С
95 °С
54 °С
72 °С
72 °С
10 °С
пауза
15 мин
10 с
10 с
10 с
1 мин
хранение
0
1
2
3
4
циклы
1
42
1
температура
95 °С
95 °С
95 °С
54 °С
72 °С
72 °С
4 °С
время
пауза
15 мин
10 с
25 с
25 с
1 мин
хранение
Амплификаторы с
матричным регулированием
температуры:
«Biometra»
циклы температура
1
42
1
время
циклы
пауза
15 мин
25 с
40 с
25 с
1 мин
хранение
95 °С
95 °С
95 °С
54 °С
72 °С
72 °С
10 °С
1
42
1
По окончании выполнения программы амплификации приступить к детекции
результатов.
II.
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.
А. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора
Технология», Россия) с версией программного обеспечения 4.4i.
«Джин»
(«ДНК-
Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин» проводится согласно
описанию в паспорте «ПЦР-детектора флуоресцентного «Джин-4».
Настройка теста.
Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:
 Наименование теста - «ВГП H5H7H9»
 Привязка каналов: FAM – H5, HEX – H7, ROX – H9
 Пороговые значения для всех каналов должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.
Настройки теста можно установить, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов».
Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные выше, и
сохранить изменения при выходе из программы.
Проведение детекции.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 22 из 44
Включить прибор и запустить программу «Gene» на компьютере, присоединенном к
прибору.
Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов и количество
фоновых пробирок (2), выбрать нужный тест (ВГП Н5Н7H9) в графе «Тест», нажать кнопку
«OK» (кнопкой мыши) и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке
«Образец»).
В качестве образцов, обозначенных «ФОН», использовать пробирки с контрольными
образцами «ФОН».
Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной
последовательностью (сначала первые 12 образцов) и запустить детекцию, нажав кнопку,
обозначенную значком цветной призмы, в панели активных кнопок (вверху экрана). По
окончании детекции первой группы заменить пробирки на следующую группу пробирок и
продолжить измерения, нажав кнопку «OK». По окончании детекции вынуть пробирки и
нажать кнопку «OK».
Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин».
Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «Gene».
Знак «нд» будет соответствовать образцам, в которых не обнаружены субтипы вируса
гриппа, имеющие в своем составе гемагглютинин 5, 7 или 9 типа.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК
(см. табл. 10).
Таблица 10.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
Контролируемый
этап
«В–»
Экстракция РНК
«К–»
ПЦР
«К+»
ПЦР
Результат по уровню флуоресценции
«FAM»
«HEX»
«ROX»
«–»
«–»
«+»
«–»
«–»
«+»
«–»
«–»
«+»
Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз
для всех образцов.
Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал
по любому каналу значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае
результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить
анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.
Б. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4» («BioSan»,
Латвия).
Настройка теста.
Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:
 Наименование теста - «ВГП Н5Н7H9»
 Привязка каналов: FAM – H5, HEX – H7, ROX – H9
 Пороговые значения для всех каналов должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.
Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов».
После ввода указанных значений, следует нажать кнопку «Сохранить».
Проведение детекции.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 23 из 44
Включить прибор и запустить программу «ALA_1» на компьютере, присоединенном к
прибору.
Задать протокол измерения. Для этого в главном меню выбрать «Протокол» → «Создать
новый» или «Открыть», чтобы открыть созданный ранее протокол.
В окне протокола необходимо выбрать тип используемого ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2),
ввести номер протокола, выбрать нужный тест (ВГП Н5Н7H9) в меню-вкладке «Тест» и
ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).
Обозначить образцы, которые являются фоновыми для данной группы образцов, как
«фон» (используя сочетание клавиш «Ctrl» и «F»). В качестве образцов, обозначенных
«ФОН» использовать пробирки с контрольными образцами «ФОН».
Закрыть окно редактирования протокола, нажав на кнопку Exit в верхнем левом углу
панели. Протокол сохранить.
Поставить пробирки в ячейки ротора в соответствии с заданной последовательностью и
запустить детекцию, выбрав в меню «Протокол» → «Детекция» или значок Детекция по
протоколу на панели инструментов (вверху экрана).
Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4».
Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы
«ALA_1». Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений:
«обнаружено» – положительный результат;
«не обнаружено» – отрицательный результат;
«сомнительно» – результат, который нельзя однозначно интерпретировать (сигнал по
каналу, отведенному для детекции специфической ДНК, превышает пороговое значение,
допустимое для отрицательных образцов, но не превышает пороговое значение для
положительных образцов (сигнал в так называемой «серой зоне»).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК
(см. табл. 11).
Таблица 11.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
«В–»
Контролируемый
этап
«К–»
Экстракция РНК
ПЦР
«К+»
ПЦР
Результат автоматической интерпретации
1 (FAM)
2 (HEX)
3 (ROX)
«H5 – не обнаружено»
«Н7 – не обнаружено»
«Н9 – не обнаружено»
«H5 – не обнаружено»
«Н7 – не обнаружено»
«Н9 – не обнаружено»
«H5 – обнаружено»
«Н7 – обнаружено»
«Н9 – обнаружено»
Образцы, для которых получен результат «сомнительно», требуют повторного
проведения ПЦР и детекции. В случае повторения аналогичного результата образцы считать
положительными.
Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал,
значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по
всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также
предпринять меры по выявлению источника контаминации.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 24 из 44
ПРИЛОЖЕНИЕ 3.
Формат FRT.
ПРОВЕДЕНИЕ
АМПЛИФИКАЦИИИ
И
ДЕТЕКЦИИ
ПРОДУКТОВ
АМПЛИФИКАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene»
6000 («Corbett Research», Австралия).
Выявление РНК Influenza virus A («ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F
амплификации кДНК Influenza virus A).
для ПЦР-
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A перемешать на вортексе и
сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT
Influenza virus A, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A
 5 мкл ПЦР-буфера-Flu
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.
В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером,
внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A
в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл
ПКО STI-88.
Б.
Проведение амплификации.
Поместить пробирки в карусель амплификатора Rotor-Gene (ячейки карусели
пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения
проб в амплификаторе).
Запрограммировать прибор.
Программирование амплификатора.
Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene
версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000 - программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build
67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного
обеспечения, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для
англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии
программы «Rotor-Gene» 6000.
Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.
В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска
эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)».
Нажать кнопку «New»/«Новый».
Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне
рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».
Нажать кнопку «Next»/«Далее».
Выбрать объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» -25 мкл. Для
прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 µl oil layer
volume»/«15 μL объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с
помощью мышки).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 25 из 44
Нажать кнопку «Next»/«Далее».
В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».
Задать следующие параметры эксперимента:
1. Hold/Удерж.темп-ры
95 °С - 15 мин
2. Cycling/Циклирование
95 °С - 10 с
54 °С - 20 с
72 °С - 10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.
3. Cycling2/Циклирование2 95 °С - 10 с
54 °С - 20 с - Детекция
72 °С - 10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.
4. Флуоресценцию измеряют при 54 С (во втором блоке циклирования) на каналах
FAM/Green и JOE/Yellow.
5. Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».
В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня
сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/
«Опт.детек-мых».
Для
канала
FAM/Green
установить
параметры
Min
reading/Миним.сигнал –10Fl и Max reading/Максим. сигнал – 20Fl. Для канала
JOE/Yellow установить параметры Min reading/Миним.сигнал –5Fl и Max
reading/Максим. сигнал – 10Fl. Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration
Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию
при 1-м шаге детекции». Окно закрыть, нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку
«Next»/«Далее».
Запустить амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».
Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо
запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку «Edit
samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и
контроли обозначить в меню Samples/Тип как Unknown/Образец.
В. Анализ результатов.
Анализируют результаты амплификации участка кДНК Influenza virus A и ВКО.
Накопление продукта амплификации участка кДНК Influenza virus A детектируется по
каналу FAM/Green, а накопление продукта амплификации ВКО – по каналу для детекции
флуорофора JOE/Yellow.
Анализ результатов амплификации ВКО.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE» («Cycling A.Yellow» для
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть
нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 20%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct, которые должны быть не более 31 для исследуемых образцов и контролей.
Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM» («Cycling A.Green» для
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 26 из 44
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порога.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть
нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct.
Г. Учет результатов.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что
соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в
соответствующей графе в таблице результатов (см. описание для данного прибора).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.
табл. 12).
Таблица 12.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
Контролируемый этап
Результат (значение Сt)
Канал FAM/Green
отсутствует
Канал JOE/Yellow
<31
«В–»
Экстракция РНК
«К–»
ПЦР
отсутствует
отсутствует
«К+»
ПЦР
<31
отсутствует
«ВК+»
ПЦР
отсутствует
<31
Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM/Green менее 33.
Образец считают отрицательным, если по каналу FAM/Green для него значение Сt
отсутствует, а по каналу JOE/Yellow для него определено значение Ct, не превышающее 31.
Если значение Ct на канале FAM/Green больше 33, требуется повторить ПЦР и считать
его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале
FAM/Green менее 33.
Образцы, для которых отсутствует значение Ct как по каналу FAM/Green, так и по
каналу JOE/Yellow, или получено значение Сt по каналу JOE/Yellow более 31, требуют
повторного проведения ПЦР и детекции. В случае, если повторно получен аналогичный
результат, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции.
Возможные ошибки:
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля
экстракции РНК (на канале FAM/Green) и для отрицательного контроля ПЦР (на любом из
каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае
результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить
анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника
контаминации.
Идентификация субтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRT50 F для идентификации субтипов H5, H7, H9 Influenza virus A).
Для идентификации субтипов H5, H7 и Н9 используют образцы кДНК, полученные
после реакции обратной транскрипции.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9 перемешать на
вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 27 из 44
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT
Influenza virus A Н5, Н7, Н9, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую
реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9
 5 мкл ПЦР-буфера-Flu
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.
В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером,
внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5, Н7, Н9;
Б.
Проведение амплификации.
Поместить пробирки в карусель амплификатора Rotor-Gene (ячейки карусели
пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения
проб в амплификаторе).
Запрограммировать прибор.
Программирование амплификатора «Rotor-Gene»:
Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene
версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000- программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build
67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного
обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для
англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии
программы «Rotor-Gene» 6000.
Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.
В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска
эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)».
Нажать кнопку «New»/«Новый».
Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне
рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».
Нажать кнопку «Next»/«Далее».
Выбрать объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» -25 мкл. Для
прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 µl oil layer
volume»/«15 μL объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с
помощью мышки).
Нажать кнопку «Next»/«Далее».
В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».
Задать следующие параметры эксперимента:
1. Hold/Удерж.темп-ры
95 °С - 15 мин
2. Cycling/Циклирование
95 °С - 10 с
54 °С - 20 с
72 °С -10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.
3. Cycling2/Циклирование2 95 °С - 10 с
54 °С – 20 с – Детекция
72 °С -10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 28 из 44
4. Флуоресценцию измеряют при 54С (во втором блоке циклирования) на каналах
FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange.
5. Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».
В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня
сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/
«Опт.детек-мых».
Для
канала
FAM/Green
установить
параметры
Min
reading/Миним.сигнал – 10Fl и Max reading/Максим. сигнал – 20Fl. Для каналов
JOE/Yellow и ROX/Orange установить параметры Min reading/Миним.сигнал –5Fl и Max
reading/Максим. сигнал – 10Fl. Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration
Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию
при 1-м шаге детекции». Окно закрыть, нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку
«Next»/«Далее».
Поместить предварительно подготовленные пробирки в амплификатор. Запустить
амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».
Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо
запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку «Edit
samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и
контроли обозначить в меню Samples/Тип как Unknown/Образец.
В. Анализ и учет результатов.
Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н5 – по каналу FAM/Green, кДНК
Influenza virus A Н7 детектируется по каналу JOE/Yellow, кДНК Influenza virus A Н9 – по
каналу ROX/Orange.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A H5.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM» («Cycling A.Green» для
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть
нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct.
Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM/Green менее 33.
Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале FAM/Green отсутствует.
Если значение Ct на канале FAM/Green больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его
положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале
FAM/Green менее 33.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н7.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE» («Cycling A.Yellow» для
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть
нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.1.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 29 из 44
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct.
Образец считают положительным, если значение Ct на канале JOE/Yellow менее 33.
Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале JOE/Yellow отсутствует.
Если значение Ct на канале JOE/Yellow больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его
положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале
JOE/Yellow менее 33.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A H9.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. ROX» («Cycling A.Orange» для
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть
нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct.
Образец считают положительным, если значение Ct на канале ROX/Orange менее 33.
Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале ROX/Orange отсутствует.
Если значение Ct на канале ROX/Orange больше 33, требуется повторить ПЦР и считать
его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на
канале ROX/Orange менее 33.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.
табл. 13).
Таблица 13.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
Контролируемый этап
«К–»
ПЦР
«К+»
ПЦР
Результат (значение Сt)
Канал FAM/
Канал JOE/
Канал
Green
Yellow
ROX/Orange
отсутствует
отсутствует
отсутствует
< 26
< 26
< 26
Возможные ошибки
Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного
образца и для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов)
свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты
анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех
проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Идентификация субтипа H1 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRT для
идентификации гриппа свиней А/Н1).
Для идентификации субтипа H1 используют образцы кДНК, полученные после
реакции обратной транскрипции.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 30 из 44
A/H1-swine для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб.
На поверхность воска внести по 7 мкл ПЦР-смеси-2-FL, при этом она не должна
проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A/H1swine.
Б.
Проведение амплификации.
В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером,
внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контроль (К+ H1-swine) - в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК
Influenza virus A/H1-swine;
в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл
ПКО STI-88.
В. Программирование амплификатора «Rotor-Gene»:
Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene
версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000- программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build
67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного
обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для
англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии
программы «Rotor-Gene» 6000.
Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.
В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска
эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)».
Нажать кнопку «New»/«Новый».
Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне
рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».
Нажать кнопку «Next»/«Далее».
Выбрать объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» -25 мкл. Для
прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 µl oil layer
volume»/«15 μL объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с
помощью мышки).
Нажать кнопку «Next»/«Далее».
В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».
Задать следующие параметры эксперимента:
1. Hold/Удерж.темп-ры
95 °С - 5 мин
2. Cycling/Циклирование
95 °С - 10 с
54 °С - 20 с
72 °С - 10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.
3. Cycling2/Циклирование2 95 °С - 10 с
54 °С - 20 с – Детекция
72 °С - 10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.
4. Флуоресценцию измеряют при 54С (во втором блоке циклирования) на каналах
FAM/Green и JOE/Yellow.
5. Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».
В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня
сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/
«Опт.детек-мых». Для обоих каналов FAM/Green и JOE/Yellow установить параметры Min
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 31 из 44
reading/Миним.сигнал – 5Fl и Max reading/Максим. сигнал – 10Fl. Пометить галочкой
бокс в строке «Perform Calibration Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st
Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Окно закрыть, нажав кнопку
«Close»/«Закрыть». Нажать кнопку «Next»/«Далее».
Поместить предварительно подготовленные пробирки в амплификатор. Запустить
амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».
Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо
запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку «Edit
samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и
контроли обозначить в меню Samples/Тип как Unknown/Образец.
Анализ и учет результатов.
Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н1 детектируется по каналу
JOE/Yellow, ВКО – по каналу FAM/Green.
Анализ результатов амплификации ВКО.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM» («Cycling A.Green» для
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть
нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 0%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct.
Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н1.
Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE» («Cycling A.Yellow» для
прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».
Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть
нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».
В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»
установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.
В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся
значения Ct.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что
соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в
соответствующей графе в таблице результатов).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации (см. табл. 14).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 32 из 44
Таблица 14.
Контроль
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Значение Сt по каналу
Контролируемый
этап ПЦР-анализа
Канал FAM/Green
Канал JOE/Yellow
К–
ПЦР
Нет значений
Нет значений
K+H1-swine
ПЦР
Нет значений
< 25
ВК+
ПЦР
< 26
Нет значений
В исследуемом образце идентифицирован вирус гриппа А/H1-swine, если имеется
значение Ct по каналу JOE/Yellow.
Если в исследуемом образце отсутствует значение Ct по каналу JOE/Yellow, а значение Ct
по ВКО (канал FAM/Green) не превышает 28 циклов, следует считать, что в этом образце
вирус гриппа А/H1-swine не идентифицирован.
Если в исследуемом образце отсутствуют значение Ct по каналу JOE/Yellow, а значение
Ct по ВКО (канал FAM/Green) превышает 28 циклов или отсутствует, то требуется повторить
анализ данной пробы, начиная с этапа экстракции РНК.
Возможные ошибки.
Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля ПЦР
(ТЕ-буфер) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или
образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными.
Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и
ликвидации источника контаминации.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 33 из 44
ПРИЛОЖЕНИЕ 4.
Формат FRT.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ «iQ5» и «iCycler iQ» («Bio-Rad», США).
Выявление РНК Influenza virus A («ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F для амплификации
кДНК Influenza virus A).
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A перемешать на вортексе и
сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT
Influenza virus A, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-1- FEP/FRT Influenza virus A
 5 мкл ПЦР-буфера-Flu
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.
В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером,
внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A;
в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл
ПКО STI-88.
Б.
Проведение амплификации.
Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не
менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.
Поместить подготовленные пробирки в амплификатор.
Открыть программу iCycler.
Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного
сигнала.
 Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля
Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме
Whole Plate loading. В опции Select and load Fluorophores задать измерение
флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Задать объем
реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок
(Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit
Plate Editing.
 Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup
модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему
расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне
Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение
флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить
схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением .pts) и
нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать
уже использованную ранее схему планшета, для этого в окне Library открыть View
Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением .pts) и нажать кнопку
Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед
использованием. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run
with selected protocol.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 34 из 44
Задать программу амплификации.
Программа «Gripp»:
95 °С –15 мин
10 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с /72 °С – 25 с
35 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с
детекция флуоресценции на 2-м шаге (54 °С) второго блока циклирования
 Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop
нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить
протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках
можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы
протоколов сохраняются в папке Users).
 Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit
Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации
(количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать
шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол,
задав имя файла в окне Protocol Filename (Gripp.tmo) и нажав кнопку Save this
protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать
файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или
отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run
with selected plate setup.
Запустить выполнение выбранной программы «Gripp» с заданной схемой планшета.
 Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить
правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected
Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок
вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать
название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты
данного эксперимента) и нажать OK.
 Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep
следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.
Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well
factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для
запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
После окончания программы приступить к анализу результатов.
Анализ результатов.
Анализируют результаты амплификации участка кДНК Influenza virus A и ВКО.
Накопление продукта амплификации участка кДНК Influenza virus A детектируется по
каналу FAM, а накопление продукта амплификации ВКО – по каналу для детекции
флуорофора JOE.
Полученные данные интерпретируются с помощью программного обеспечения прибора
по наличию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне
пороговой линией (что соответствует наличию значения порогового цикла «Ct» в
соответствующей графе в таблице результатов).
Анализ результатов амплификации ВКО.
 Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля
Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу JOE.
При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted
Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии,
нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на
экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
 Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В
окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse
Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 35 из 44
JOE-530. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line
Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation
выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой
линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю
Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии,
нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу
Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.
Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A.
 Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу FAM, отключив кнопку
JOE. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted
Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии,
нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на
экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
 Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter
выбрать значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа
данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню
Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и
автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать
Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы
установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой
левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице
результатов появятся значения Ct.
Учет результатов.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.
табл. 15).
Таблица 15.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Контроли
Контролируемый этап
Результат (значение Сt)
Канал «FAM»
отсутствует
Канал «JOE»
<31
«В–»
Экстракция РНК
«К–»
ПЦР
отсутствует
отсутствует
«К+»
ПЦР
< 30
отсутствует
«ВК+»
ПЦР
отсутствует
< 30
Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM менее 33.
Образец считают отрицательным, если по каналу FAM для него значение Сt
отсутствует (в графе Сt указывается значение N/A), а по каналу JOE для него определено
значение Ct, не превышающее 31.
Если значение Ct на канале FAM больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его
положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале FAM
менее 33.
Образцы, для которых отсутствует значение Ct как по каналу FAM, так и по каналу JOE,
или получено значение Сt по каналу JOE более 31, требуют повторного проведения ПЦР и
детекции. В случае, если повторно получен аналогичный результат, требуется повторить
анализ образца, начиная с этапа экстракции РНК.
Возможные ошибки:
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного
образца (на канале FAM) и для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из
каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае
результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 36 из 44
анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника
контаминации.
Идентификация субтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRT50 F для идентификации субтипов H5, H7, H9 Influenza virus A).
Для идентификации субтипов H5, H7 и Н9 используют образцы кДНК, полученные
после реакции обратной транскрипции.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9 перемешать на
вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT
Influenza virus A Н5, Н7, Н9, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую
реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9
 5 мкл ПЦР-буфера-Flu
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.
В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером,
внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5, Н7, Н9.
Б.
Проведение амплификации.
Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не
менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.
Поместить подготовленные пробирки в амплификатор.
Открыть программу iCycler.
Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного
сигнала во всех пробирках по каналам FAM, JOE и ROX.
 Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля
Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме
Whole Plate loading. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal
Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему
планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.
 Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup
модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему
расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне
Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение
флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM, JOE и ROX.
Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с
расширением .pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана).
Можно редактировать уже использованный ранее Plate Setup, для этого в окне
Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением
.pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить
перед использованием. Назначить использование данной схемы планшета, нажав
кнопку Run with selected protocol.
Задать программу амплификации.
Программа «Gripp»:
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 37 из 44
95 °С – 15 мин
10 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с /72 °С – 25 с
35 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с
детекция флуоресценции на 2-м шаге (54 °С) второго блока циклирования
 Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop
нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить
протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках
можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы
протоколов сохраняются в папке Users).
 Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit
Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации
(количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать
шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол,
задав имя файла в окне Protocol Filename (Gripp.tmo) и нажав кнопку Save this
protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать
файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или
отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run
with selected plate setup.
Запустить выполнение выбранной программы «Gripp» с заданной схемой планшета.
 Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить
правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected
Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок
вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать
название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты
данного эксперимента) и нажать OK.
 Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep
следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.
Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well
factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для
запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
После окончания программы приступить к анализу результатов.
Анализ и учет результатов.
Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н7 детектируется по каналу JOE,
кДНК Influenza virus A Н5 – по каналу FAM, кДНК Influenza virus A Н9 – по каналу ROX.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A H5.
Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля
Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM. При этом
должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается
по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором
при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку
Results.
Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать
значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base
Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation
выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии.
Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position
выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее
курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles.
В таблице результатов появятся значения Ct.
Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM менее 33.
Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале FAM отсутствует. Если
значение Ct на канале FAM больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 38 из 44
положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале FAM
менее 33.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н7.
Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу JOE, отключив кнопку FAM.
При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit
(выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии нужно перетащить ее
курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов,
нажать кнопку Results.
Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне
Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции
PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530. При этом
должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается
по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки
пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline
Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы
установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке
мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся
значения Ct.
Образец считают положительным, если значение Ct на канале JOE менее 33.
Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале JOE отсутствует. Если
значение Ct на канале JOE больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его
положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE
менее 33.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н9.
Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу ROX, отключив кнопку JOE.
При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit
(выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии нужно перетащить ее
курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов,
нажать кнопку Results.
Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне
Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции
PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала ROX-575. При этом
должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается
по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки
пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline
Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы
установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке
мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся
значения Ct.
Образец считают положительным, если значение Ct на канале ROX менее 33.
Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале ROX отсутствует. Если
значение Ct на канале JOE больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его
положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE
менее 33.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.
табл. 16).
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 39 из 44
Таблица 16.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Результат (значение Сt)
Контроли
Контролируемый этап
«К-»
ПЦР
Канал FAM/
Green
отсутствует
«К+»
ПЦР
< 30
Канал JOE/
Yellow
отсутствует
Канал
ROX/Orange
отсутствует
< 30
< 30
Возможные ошибки
Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного
образца и для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов)
свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты
анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех
проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Идентификация субтипа H1 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRT для
идентификации гриппа свиней А/Н1).
Для идентификации субтипа H1 используют образцы кДНК, полученные после
реакции обратной транскрипции.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus
A/H1-swine для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб.
На поверхность воска внести по 7 мкл ПЦР-смеси-2-FL, при этом она не должна
проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A/H1swine.
Б.
Проведение амплификации.
В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером,
внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку
внести 10 мкл ТЕ-буфера;
б) положительный контроль (К+ H1-swine) - в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК
Influenza virus A/H1-swine;
в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл
ПКО STI-88.
В.
Проведение амплификации.
Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не
менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.
Открыть программу iCycler.
Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного
сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE.
 Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля
Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме
Whole Plate loading. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal
Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему
планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.
 Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup
модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 40 из 44
расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне
Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение
флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить
схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением .pts) и
нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать
уже использованный ранее Plate Setup, для этого в окне Library открыть View Plate
Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением .pts) и нажать кнопку Edit
справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием.
Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected
protocol.
Задать программу амплификации.
Программа «Gripp Н1»:
95 °С – 5 мин
10 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с /72 °С – 25 с
35 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с
детекция флуоресценции на 2-м шаге (54 °С) второго блока циклирования
 Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop
нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить
протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках
можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы
протоколов сохраняются в папке Users).
 Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit
Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации
(количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать
шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол,
задав имя файла в окне Protocol Filename (Gripp Н1.tmo) и нажав кнопку Save this
protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать
файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или
отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run
with selected plate setup.
Запустить выполнение выбранной программы «Gripp Н1» с заданной схемой планшета.
 Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить
правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected
Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок
вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать
название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты
данного эксперимента) и нажать OK.
 Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep
следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.
Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well
factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для
запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
После того, как температура реакционного блока достигнет 95 ºС, нажать кнопку Pause,
открыть крышку и поместить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с
предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора и нажать
кнопку Resume Run (для прибора «iCycler iQ» – кнопку Continue Running Protocol).
После окончания программы приступить к анализу результатов.
Анализ и учет результатов.
Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н1 детектируется по каналу JOE,
ВКО – по каналу FAM.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 41 из 44
Анализ и учет результатов амплификации ВКО.
Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля
Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM. При этом
должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается
по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором
при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку
Results.
Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать
значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base
Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation
выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии.
Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position
выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее
курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles.
В таблице результатов появятся значения Ct.
Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н1.
Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу JOE, отключив кнопку FAM.
При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit
(выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии нужно перетащить ее
курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов,
нажать кнопку Results.
Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне
Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции
PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530. При этом
должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается
по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки
пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline
Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы
установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке
мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся
значения Ct.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что
соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в
соответствующей графе в таблице результатов).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации (см. табл. 17).
Таблица 17.
Оценка результатов анализа контрольных образцов
Значение Сt по каналу
Контроль
Контролируемый
этап ПЦР-анализа
Канал FAM
Канал JOE
К–
K+H1-swine
ВК+
ПЦР
ПЦР
ПЦР
Нет значений
Нет значений
< 33
Нет значений
< 33
Нет значений
В исследуемом образце идентифицирован вирус гриппа А/H1-swine, если имеется
значение Ct по каналу JOE.
Если в исследуемом образце отсутствует значение Ct по каналу JOE, а значение Ct по
ВКО (канал FAM) не превышает 33 циклов, следует считать, что в этом образце вирус
гриппа А/H1-swine не идентифицирован.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 42 из 44
Если в исследуемом образце отсутствуют значение Ct по каналам JOE, а значение Ct по
ВКО (канал FAM) превышает 33 циклов или отсутствует, то требуется повторить анализ
данной пробы, начиная с этапа экстракции РНК.
Возможные ошибки.
Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля
ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов
или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются
недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по
выявлению и ликвидации источника контаминации.
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 43 из 44
Лист вносимых изменений
Редакция
Место внесения
изменений
Суть вносимых изменений
«Вариант» выпуска набора изменен на «формат»
«Выделение» заменено на «Экстракция»
Отрицательный контроль экстракции заменен с «ОК» на «В–»
По тексту
19.02.13
FN
Общие положения
Удалены печать и регистрационный номер
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
Вариант ПЦР-комплекта изменен с FRT на FRT-50 F
Добавлены формы комплектации 1 и 2 для формата EPh и
FEP и форма 4 для формата FRT
Добавлена единица измерения мл к объемам реагентов
Уточнена информация о хранении полимеразы (TaqF):
полимеразу (TaqF) хранить при температуре от минус
24 °С до минус 16 °С
19.03.13
РЕ
08.04.13
FN
28.05.13
FN
Общие положения;
Приложение 3;
Приложение 4
Название реагента ПКО STI заменено на ПКО STI-88
Нижний колонтитул
Исправлены каталожные номера: вместо VET-31-50F, VET45-FEP и VET-46-FRT указаны VET-31-50F-K, VET-45-FEP-K
и VET-46-FRT-K
Нижний колонтитул
Добавлена Форма 3: VET-55-FRT-K2
Общие положения
Нижний колонтитул
Информация о составе комплектов реагентов для форм
комплектации 2, 3, 4 формата FRT расположена по порядку
Удален каталожный номер для формы 2 формата FEP
VET-45-FEP-K
Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;
Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 44 из 44