Document 2291509
advertisement
РЕФЕРАТ Отчет 60 с., 3 табл., 55 рис., 14 источников, 3 прил. Ключевые слова: P53, АПОПТОЗ, ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ, NATLIN-3, TENOVIN-6 PRIMA1, НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК ЛЕГКОГО. Объект исследования: регуляторные молекулы-мишени для новых противопухолевых препаратов, являющиеся компонентами сигнальных путей выживания и пролиферации опухолевых клеток. Соединения, ингибирующие эти молекулы-мишени. Успешная комбинация двух синергично действующих химических веществ: соединения, ингибирующего молекулы сигнальных путей выживания и соединения восстанавливающего активность белка р53 в опухолевых клетках (из числа Natlin-3, tenovin-6 или PRIMA-1). Цель НИР: разработка композиционного противоопухолевого препарата индуцирующего апоптоз в опухолевых клетках, несущих ген ТР53 дикого типа. Методология выполнения работы. Цитотоксическое (или цитостатическое) действие 2-ой серии соединений (ингибиторов src-киназ и белка BCL-XL) было определено на основании IC50 для девяти клеточных линий немелкоклеточного рака легких (НМРЛ – A549, NCI-H292, A427, COR-L23, DV-90, NCI-H1395, NCI-H1944, NCI-H2228) и рака молочной железы (РМЖ – MCF7). Значения IC50 определялись при помощи теста на жизнеспособность с резазурином. Полученные результаты подтверждались при помощи определения уровня экспрессии маркерных генов в опухолевых клетках. Для определения наиболее успешной комбинации было протестировано цитотоксическое действие различных сочетаний рассматриваемых в проекте соединений на линиях клеток резистентных к действию Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. Так активность Natlin-3 в сочетании с соединениями 4-6 была протестирована на резистентных к Natlin-3 линиях A549 и H2228; активность tenovin-6 и соединений 4-6 – на линиях A549 и H2228, а активность PRIMA-1 и соединений 4-6 и – на линиях A427, H292, COR-L23, H1395. При разработке базы данных содержащей перечень и описание генов опухолевых клеток дифференциально-экспрессирующихся после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул были систематизированы результаты исследований действия 331 противоопухолевых соединений на клетки 10 раковых линий человека. Указанное исследование было выполнено ранее в рамках проекта CMAP (http://www.broadinstitute.org/cmap). Для этой задачи использовались методы компьютерного моделирования, реализованные на платформе geneXplain/BioUML. В ходе 4-ого этапа НИР были получены следующие результаты: 1. Иностранным партнером была определена цитотоксическая активность 2-ой серии соединений подавляющих механизмы выживания опухолевой клетки. Рассмотренные соединения включали ингибиторы src-киназ (соединение-4 и соединение-5) и ингибитор белка BCL-XL 3 (соединение-6). Было показано, что соединение-4 обладает цитостатическим действием (т.е. ограничивает пролиферацию) на клетки линий НМРЛ А427, DV-90, A549, H1944 и H2228. Среднее значение IC50 соединения-4 для чувствительных линий НМРЛ составило 2,66±1,1нМ. Схожим образом, соединение-5 обладало цитостатическим действием на клетки линий НМРЛ А427, DV-90 и H1944. Среднее значение IC50 соединения-5 составило 357,7±25,2нМ. В обоих случаях цитостатический эффект соединений 4 и 5 сопровождался значимым (p < 0.05) снижением уровня экспрессии от одного до трех Act1-зависимого генов (из числа AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2). Соединение-6 оказывало цитотоксическое действие на клетки линий НМРЛ A549 и DV-90. Среднее значение IC50 для чувствительных линий НМРЛ составило 3,3±2,1мкМ. Цитотоксическое действие соединения-6 сопровождалось значимым (p < 0.05) увеличением уровня экспрессии генов-регуляторов апоптоза (BAX и PUMA) 2. Исполнителем было протестировано цитотоксическое действие различных сочетаний рассматриваемых в проекте соединений на линиях клеток резистентных к действию Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. Соединение-4 (2.6нМ) увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 на линии A549 и H2228 (IC50 = 15,4 по сравнению с 31,2мкМ и IC50 = 16,6 по сравнению с 33,1мкМ, соответственно, р<0.05), действие tenovin-6 на линию A549 (IC50 = 7,1 по сравнению с 16,8мкМ, р<0.05) и действие PRIMA-1 на линию A427 (IC50 = 51,2 и отсутствие цитотоксического действия одного только соединения PRIMA-1 на клетки А427). Соединение-6 (3,3мкМ) увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 и tenovin-6 на линию A549 (IC50 = 12,3 по сравнению с 31,2мкМ и IC50 = 8 по сравнению с 16,8мкМ, соответственно, р<0.05). Соединение-5 не изменяло действия ни одного из соединений Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1 на клетки линий НМРЛ. 3. Исполнителем было выполнено обобщение и оценка полученных результатов. Определена наиболее успешная комбинация соединений, эффективно индуцирующая апоптоз опухолевых клеток. Наиболее успешной комбинацией является комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ). 4. Исполнителем были подготовлены проект технического задания ОКР на тему «Получение и доклинические испытания лабораторного образца композиционного противоопухолевого препарата, селективно индуцирующего апоптоз в опухолевых клетках с р53 дикого типа» и документация для заключительного отчета о НИР. 5. Иностранным партнером была разработана база данных, включающая в себя перечень и описание генов опухолевых клеток, уровень экспрессии которых изменился после инкубации с перспективными мишени для препаратами из класса малых молекул и вероятные клеточные молекулыэтич соединений. База данных доступна на сайте http://platform.genexplain.com/bioumlweb. 4 Область применения. Полученные в ходе проекта результаты могут быть использованы в фармакологии при выборе белков-мишеней для действия противоопухолевых соединений и при разработке новых лекарственных препаратов для лечения НМРЛ. Прогнозные предложения о развитие объекта исследования. Определенная в результате проекта комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ) обладает цитотоксическим действием относительно клеток НМРЛ. В отношении некоторых линий НМРЛ цитотоксические свойства композиция [соединение-4 & Nutlin-3] в два раза превосходят активность известного препарата Nutlin-3. Следовательно, комбинация [соединение-4 & Nutlin-3] может быть перспективна для разработки нового более эффективного лекарственного средства для лечения НМРЛ. Использование более эффективного препарата на основе комбинации [соединение-4 & Nutlin-3] может обеспечить увеличение продолжительности и качества жизни пациентов с НМРЛ. В работе приняли участие 7 молодых специалистов. Таким образом, при выполнении 4-ого этапа проекта достигнуты все запланированные программные индикаторы и показатели НИР. 5 ОГЛАВЛЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ – ТЕСТИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ 2ОЙ СЕРИИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ............................................................. 10 4.1 Тестирование биологической активности 2–ой серии перспективных химических соединений на линиях опухолевых клеток (выполнено Иностранным партнером)........................................................................... 10 4.1.1 Определение IC50 соединений 4, 5 и 6 для клеток НМРЛ; описание метода..................... 11 4.1.2 Определение относительного уровня экспрессии генов-регуляторов апоптоза и геновмишеней PI3K/Akt1 сигнального пути вклетках линий НМРЛ и РМЖ после добавления тестируемых соединений; описание метода................................................................................................................ 14 4.1.3 Определение активности соединений 4, 5 и 6 для клеток линий НМРЛ и РМЖ; результаты .............................................................................................................................................................. 17 4.2 Тестирование биологической активности 2-ой серии перспективных химических соединений в комплексе с известными соединениями реактивирующими p53 на линиях опухолевых клеток (выполнено Исполнителем).............................................................................................................................................. 30 4.3 Обобщение и оценка полученных результатов (выполнено исполнителем)............................................ 42 4.3.1 Состав комбинации соединений, наиболее эффективно индуцирующей апопотоз клеток опухоли ................................................................................................................................................. 42 4.3.2 Метод увеличения противоопухолевой активности перспективных препаратов из класса малых молекул ...................................................................................................................................... 42 4.3.3 Протокол использования исследованных в ходе НИР химических соединений в комплексе с известными противоопухолевыми препаратами для увеличения их проапоптотической активности. 43 4.3.4 Экспериментальный образец композиционного препарата, наиболее эффективно индуцирующего апоптоз клеток опухоли .............................................................................................. 43 4.4 Технико–экономическая оценка результатов НИР. Разработка рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики (выполнено Исполнителем)........................ 44 4.5 Разработка проекта технического задания для проведения последующего ОКР (выполнено Исполнителем).............................................................................................................................................. 47 4.6 Подведение итогов НИР. Разработка заключительного отчета о НИР и его рассмотрение на учёном совете............................................................................................................................................................ 47 4.8 Написание и направление публикаций в высокорейтинговые российские или зарубежные журналы (выполнено Иностранным партнером).......................................................................................................... 51 4.9 Написание и направление заявки в ФИПС на выдачу патента (выполнено Иностранным партнером)... 51 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................................................ 53 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ........................................................................................ 57 ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное)................................................................................................................. 58 ПРИЛОЖЕНИЕ Б (обязательное)................................................................................................................. 59 ПРИЛОЖЕНИЕ В (обязательное)................................................................................................................. 60 6 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ НМРЛ – немелкоклеточный рак легких РМЖ – рак молочной железы ДНК – дизоксирибонуклеиновая кислота TP53 – обозначение гена, кодирующиего транскрипционный фактор р53 Natlin-3 – соединение восстанавливающее активность белка р53 в клетке tenovin-6 – соединение восстанавливающее активность белка р53 в клетке PRIMA-1 – соединение восстанавливающее активность белка р53 в клетке PASS – Prediction of Activity Spectra for Substances, программное обеспечение для предсказания спектра активности химических соединений. Pa – вероятность вещества быть активным (to be active) Pi – вероятность вещества быть неактивным (to be Inactive) MW – молекулярный вес ССh ID – Сayman Chemical Identification Number PI3K – киназа, один из участников сигнального пути выживания и пролиферации клетки Akt1 – киназа, один из участников сигнального пути выживания и пролиферации клетки Wt – wild type; дикий тип (о последовательности гена не содержащей мутаций) FBS (fetal bovine serum) – сыворотка эмбрионов телят DMSO – диметил сульфоксид, неполярный растворитель IC50 (inhibitory concentration) – концентрация препарата, при которой для 50% клеток в культуре наблюдается ограничение деления. BAX – обозначение генов (регуляторов апоптоза) PUMA – обозначение генов (регуляторов апоптоза) NOXA – обозначение генов (регуляторов апоптоза) AKT1 – обозначение генов (уровень экспрессии которых регулируется Akt1) BIK – обозначение генов (уровень экспрессии которых регулируется Akt1) GPX4 – обозначение генов (уровень экспрессии которых регулируется Akt1) TSPAN1 – обозначение генов (уровень экспрессии которых регулируется Akt1) SLC37A2 – обозначение генов (уровень экспрессии которых регулируется Akt1) кДНК – комплиментарная ДНК Сt – cycle threshold, пороговый цикл реакции амплификации ПЦР – полимеразная цепная реакция 7 ВВЕДЕНИЕ Перспективным направлением лечения онкологических заболеваний считается таргетная терапия, подразумевающая направленное фармакологическое воздействие на ключевой для клеток опухоли регуляторный белок (так называемую, мишень для лекарственного препарата). Одним из таких белков-мишеней является опухолевый супрессор - белок р53. В большинстве случаев в опухолевых клетках происходит инактивация белка р53. Потеря клеткой функции р53 происходит либо за счет мутации в ДНК-связывающем домене гена TP53 (~ 50% всех случаев рака), либо на посттранскрипционном уровне за счет связывания и быстрой деградации белка р53 в клетке. В тех случаях, когда опухолевая клетка содержит ген TP53 дикого типа, эффективными противоопухолевыми препаратами могут оказаться соединения восстанавливающие активность р53 На сегодняшний день известны несколько классов соединений реактивирующих р53 в клетках опухоли. К их числу относятся малые молекулы Natlin-3, tenovin-6, PRIMA-1, и др. Некоторые из этих соединений на сегодняшний день уже проходят стадии клинических испытаний. Клинические и экспериментальные исследования, указанных соединений в целом показывают положительные результаты, однако в ряде случаев опухолевые клетки оказываются нечувствительны к действию препаратов. Одна из причин этого заключается в том что, в опухолевых клетках чрезмерно активированы различные сигнальные пути, обеспечивающие ее пролиферацию и выживание. Благодаря их компенсирующему эффекту, опухолевые клетки могут избежать апоптоза, несмотря на действие индуцирующих клеточную гибель факторов. Добавление к известным препаратам Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1 нового соединения, подавляющего основные механизмы выживания опухолевой клетки адаптирует клетку к действию сигналовиндукторов клеточной гибели и увеличивает суммарный противоопухолевый эффект полученного композиционного лекарственного препарата. Новизна исследования: На сегодняшний день, преимущественно в странах Европы и США, выполняется ряд проектов направленных на преодоление резистентности опухолевых клеток к действию соединений активирующихр53. Однако в полной мере эта задача до сих пор не решена. Выполнению проекта предшествовало проведение патентного исследования по теме «Разработка композиционного противоопухолевого препарата, селективно индуцирующего апоптоз в p53wild опухолевых клетках». Результаты исследования подтверждают актуальность выбранного направления. В частности, обзор патентных и научно-технических источников информации показал, что перспективы увеличения эффективности лечения онкологических заболеваний в настоящее время связывают с таргетной терапией. Среди мишеней таргетной терапии, в том числе и белок р53. 8 Основное разнообразие стратегий направленных на реактивацию р53 связано с применением различных соединений (в том числе и малых молекул) связывающихся с р53 и его белкамирегуляторами и изменяющих их функциональные свойства. В качестве альтернативных мишени для таргетной терапии рассматриваются регуляторные белки путей выживания клетки (в частности PI3K/Akt/mTOR пути) В области указанных направлений сосредоточены десятки исследований. На основании патентного исследования был сделан вывод о возможности патентоспособных технических решений для создания комбинации соединений, синергично индуцирующих гибель опухолевых клеток за счет одновременной реактивации белка р53 и подавления ключевых сигнальных путей выживания опухолевой клетки. Таким образом, поиск комбинации соединений, ингибирующих ключевые сигнальные пути выживания клетки с одной стороны и увеличивающих активность белка р53 с другой и изучение возможности применения найденной комбинации в качестве препарата для противоопухолевой терапии является актуальным направлением. Одна из целей 4-ого этапа исследования – определение цитотоксической (и(или) цитостатической) активности трех новых соединений подавляющих механизмы выживания опухолевых клеток в отношении клеток линий НМРЛ и рака молочной железы (РМЖ). Вторая цель 4-ого этапа исследования – разработка базы данных, содержащая перечень и описание генов опухолевых клеток дифференциально–экспрессирующихся после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул. Для этого решались следующие задачи: Тестирование − биологической активности 2-ой серии перспективных химических 2-ой серии перспективных химических соединений на линиях клеток НМРЛ и РМЖ Тестирование − биологической активности соединений в комплексе с известными соединениями реактивирующими p53 на линиях клеток НМРЛ и РМЖ − Разработка базы данных, содержащая перечень и описание генов опухолевых клеток дифференциально-экспрессирующихся после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул. Перечень промежуточных отчетов: Этап 1. Выбор направления исследований. Инвентарный номер – 1. Этап 2. Теоретические исследования – разработка теории функционирования объекта НИР, разработка плана эксперимента. Инвентарный номер – 2. Этап 3. Экспериментальные исследования – тестирование биологической активности 1–ой серии перспективных химических соединений. Инвентарный номер – 3. 9 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ – ТЕСТИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ 2-ОЙ СЕРИИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ 4.1 Тестирование биологической активности 2–ой серии перспективных химических соединений на линиях опухолевых клеток (выполнено Иностранным партнером). Тестирование биологической активности 2-ой серии перспективных соединений на линиях опухолевых клеток НМРЛ выполнено в соответствии с п. 6.1 технического задания: – для контроля валидности цитоксического анализа будет использован набор стандартных препаратов, охарактеризованных в отношении проапоптотической и цитотоксической активности. – проапоптотическая и цитотоксическая активности препаратов и их композиций будут подтверждаться методом измерения уровня репортерных мРНК с помощью ПЦР в режиме реального времени. В ходе 2-ого этапа проекта были идентифицированы сигнальные пути, активирующиеся в клетках немелкоклеточного рака легких и рака молочной железы. Из их числа были выделены сигнальные пути, обуславливающие пролиферацию, жизнеспособность и подавление р53- зависимого апоптоза опухолевых клеток. Далее были идентифицированы ключевые регуляторные молекулы этих сигнальных путей. Найденные регуляторные молекулы рассматривались нами как перспективные молекулы мишени для действия противоопухолевых химических соединений. Идентификация химических соединений способных взаимодействовать с указанными молекулами-мишенями выполнялась при помощи программного обеспечения PASS v. 11.4.12 (Prediction of Activity Spectra for Substances). Для скрининга соединений, взаимодействующих с регуляторными молекулами мишенями была использована выборка структур, экспортированная из базы данных ChemNavigator (версия 2007 г.), содержащая 24631353 структур химичесих соединений. Прогнозированные при помощи PASS химические соединения с возможной активностью относительно перспективных молекул мишеней характеризовались двумя параметрами: вероятностью Pa «быть активным» («to be active») и вероятностью Pi «быть неактивным» («to be inactive»). В течение 4-ого этапа проекта были проанализированы соединения-ингибиторы молекулымишени BCL-XL с вероятностью Pa > 0.95. BCL-XL – один из негативных регуляторов апоптоза; представляет собой трансмембранный белок, локализованный в подавляет апоптоз митохондриях. BCL-XL за счёт предотвращения освобождения цитохрома С из митохондрий и последующей активации прокаспаз. Увеличение экспрессии BCL-XL имеет место при НМРЛ, раке молочной железы и некоторых других видах рака [1]. Также в течение 4-ого этапа проекта были проанализированы соединения-ингибиторы молекулы-мишени c-Src с вероятностью Pa > 0.90. c-Src – протоонкоген, представляет собой 10 несвязанную с рецептором тирозин-киназу. В опухолевой клетке c-Src активируется множеством трансмембранных рецепторов, таких как рецепторы молекул адгезии, факторов роста, цитокинов, связанные с G-белком рецепторы и др. Активированная киназа c-Src фосфорилирует ряд белковмишеней и тем самым запускает механизмы жизнеспособности, пролиферации и ангиогенеза. Активация c-Src сигнального пути имеет место более чем в 50% опухолей различного происхождения, включая НМРЛ, рак молочной железы, рак печени, рак толстого кишечника и др [2]. Всего было прогнозировано 8 соединений-антагонистов BCL-XL с вероятностью Pa > 0.95 и 6 соединений-ингибиторов src-киназ. Из них коммерчески доступными (Cayman Chemical) оказались только 7 соединений, 4 из которых оказались слабо растворимыми. В итоге, в ходе 4ого этапа проекта были проанализированы 3 соединения: • соединение-4 - ингибитор Src, ССh ID 12030, MW= 530,5; • соединение-5 - ингибитор Src, ССh ID 13338, MW= 371,5; • соединение-6 - ингибитор BCL-XL, ССh ID 10005229, MW= 300,6. Основным ожидаемым результатом биологической активности новых соединений 4-6 является их цитотоксическое и (или цитостатическое) действие на клетки опухоли. Цитотоксическая активность соединений в отношении клеток восьми линий НМРЛ и одной линии рака молочной железы (РМЖ) определялась на основании параметра IC50 (inhibitory concentration) – концентрации соединения, при которой для 50% клеток в культуре наблюдается ограничение деления. Параметр IC50 определялся при помощи теста жизнеспособности c резазурином. В соответствии с техническим заданием (пункт 6,1) цитотоксическая (или цитостатическая) активность соединений подтверждалась при помощи определения уровня экспрессии геноврегуляторов апоптоза и генов-мишеней PI3K/Akt1 сигнального пути. 4.1.1 Определение IC50 соединений 4, 5 и 6 для клеток НМРЛ; описание метода Клетки. Для проведения исследования использовали восемь линий клеток НМРЛ и одну линию РМЖ (таблица 1). Клетки всех линий регулярно тестировали на отсутствие контаминации микоплазмой и использовали, только, если контаминации не было выявлено. 11 Таблица 1 - Описание клеточных линий Клеточная Тип опухоли линия микоплазму НМРЛ, A427 аденокарцинома НМРЛ, A549 тест на TP53 аденокарцинома wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный wt отрицательный НМРЛ, COR-L23 крупноклеточная карцинома DV-90 NCI-H1395 NCI-H1944 NCI-H2228 НМРЛ, аденокарцинома НМРЛ, аденокарцинома НМРЛ, аденокарцинома НМРЛ, аденокарцинома НМРЛ, NCI-H292 мукоэпидермальная аденокарцинома MCF7 РМЖ, аденокарцинома Условия культивирования. Клетки культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, 0.03% глутамина и канамицин в концентрации 100 мкг/мл, при 37˚С и 5%-ном содержании СО2 в атмосфере. По достижении культурой клеток плотности ~ 70% монослоя клетки пересевали с разведением культуры 1:4. Описанные условия культивирования позволяли поддерживать клеточную культуру в экспоненциальной стадии роста. Определение чувствительности клеток НМРЛ к действию соединений 4-6. Клетки из замороженных чистых культур высевались в 25 см2 -культуральные тестированием соединений клетки обязательно пересевались как минимум флаконы. один Перед раз. Для тестирования соединений клетки НМРЛ, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, высевали в лунки 24-луночного планшета по 60 тыс. клеток на лунку. Через 24 часа культуральную среду заменяли на свежую, содержащую одно из соединений: 12 • соединение-4 в концентрациях 5 нМ, 2,5 нМ, 1,25 нМ, 0,6 нМ и 0 нМ (контроль); • соединение-5 в концентрациях 400 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ и 0 нМ (контроль); • соединение-6 в концентрациях 5 мкМ, 2,5 мкМ, 1,25 мкМ, 0,6 мкМ и 0 мкМ (контроль). Соединения 4-6 предварительно растворялись в DMSO в концентрации 10мМ и хранились при -20°С. В качестве максимальной концентрации выбиралась концентрация при которой отсутствовал цитотоксических эффект на культуру клеток нормальных фибробластов человека (данные тестирования не приведены). Тестируемые соединения разводились до необходимой концентрации при помощи DMSO, таким образом, чтобы после добавления соединения к культуральной среде концентрация DMSO была одинаковой во всех лунках (включая и контрольные образцы) и не превышала 0.5%. Каждая точка была представлена в тройном повторе. Через 48 часов после добавления химиопрепарата определяли долю жизнеспособных клеток при помощи теста на жизнеспособность с резазурином. Тест на жизнеспособность с резазурином. Резазурин представляет собой окислительновосстановительный краситель и используется для анализа токсичности соединений в культуре клеток [3]. Анализ основывается на способности метаболически активных клеток восстанавливать резазурин (продукт синего цвета) до резоруфина. Конверсия резазурина в резоруфин осуществляется внутриклеточно и обеспечивается митохондриальными, микросомальными и цитозольными оксидредуктазами. Таким образом, количество резоруфина в культуральной среде соотносится с общим числом и(или) выживаемостью клеток в культуре. Тест на жизнеспособность проводили через 48 часов после инкубации культуры клеток с одним из анализируемых соединений. Для этого из лунок планшета убирали культуральную среду с тестируемым соединением и добавляли 500 мкл раствора Дульбеко (1х), содержащего резазурин (резазурина натриевая соль, Диаэм) в концентрации 50 мкг/мл. В качестве контроля (фон) использовали 500 мкл раствора Дульбеко с резазурином (50 мкг/мл), добавленного в пустую лунку 24-луночного культурального планшета. Продолжительность времени инкубации клеток с резазурином составляло 1 час. Инкубирование осуществлялось в стерильных условиях, при 99% влажности, температуре 37°С и концентрации СО2 – 5%. Накопление резоруфина оценивали при помощи детекции флуоресценции в диапазоне 587/607 нм. Для оценки результатов теста строилась калибровочная кривая изменения флуоресценции в зависимости от числа клеток. 13 Рисунок 1 − Калибровочная кривая зависимости интенсивности флуоресценции резоруфина в среде от числа клеток в культуре. Для построения калибровочной кривой клетки тестируемой линии, были посеяны в 24луночный планшет. Всего высевалось 12 лунок (по шесть лунок в повторах). При этом в две лунки сеяли по 200 тыс. клеток, в следующие две лунки – в 2 раза меньше (100 тыс. клеток), в следующие две лунки – еще в 2 раза меньше (50 тыс. клеток) и т.д. Всего шесть точек с двукратным серийным разведением плотности культуры (каждая точка в повторе). Для каждой серии экспериментов клетки для калибровочной кривой высевались отдельно и анализировались одновременно с тестовыми культурами клеток. Калибровочная кривая определяла диапазон, на котором сохранялась линейная зависимость между интенсивность флуоресценции и числом клеток в культуре (рисунок 1). При помощи калибровочной кривой рассчитывалось количество клеток в культуре после инкубации с тестируемым соединением и в контрольной культуре (концентрация соединения − 0мкМ). Доля выживших клеток определялась относительно контрольной культуры. Полученные пары значений концентрация тестируемого соединения – доля выживших клеток использовались для построения кривой «Доза-Эффект». Значение IC50 рассчитывалось исходя из полученных кривых при помощи программного обеспечения Probit Analysis 1.0 [4]. 4.1.2 Определение относительного уровня экспрессии генов-регуляторов апоптоза и генов-мишеней PI3K/Akt1 сигнального пути вклетках линий НМРЛ и РМЖ после добавления тестируемых соединений; описание метода Для настоящего эксперимента представляли интерес гены-регуляторы апоптоза (BAX, PUMA, NOXA) и гены-мишени PI3K/Akt1 сигнального пути, т.е. гены, активность транскрипции которых регулируется киназой akt1 (AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2) [5]. Определение относительного уровня экспрессии генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2, PUMA, NOXA и BAX осуществлялось при помощи метода ОТ-ПЦР. Кроме интересующих нас р53-зависимых 14 генов определялся также уровень экспрессии контрольных (нормировочных) генов RPL32, b-Act, GAPDH, POLII. Условия культивирования клеточных линий. Клетки линий НМРЛ и РМЖ, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, высевали в шесть лунок 24-луночного планшета по 60 тыс. клеток на лунку Клетки культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, 0.03% глутамина и канамицин в концентрации 100 мкг/мл, при 37˚С и 5%-ном содержании СО2 в атмосфере. Через 24 часа в трех из шести лунок культуральную среду заменяли на свежую, содержащую одно из тестируемых соединений в концентрации соответствующей значению IC50 (значение IC50 определялось предварительно). В оставшихся трех лунках среду заменяли на свежую без добавления соединения. Спустя 12 часов клетки лизировали реагентом Trisol («Invitrogen»). Полученные препараты хранили при −70˚С. Выделение РНК и синтез молекул кДНК. Суммарную клеточную РНК выделяли согласно рекомендациям Invitrogen. Качество препаратов РНК оценивали по итогам электрофоретического разделения в 1,3% агарозном геле. кДНК синтезировали при помощи реакции обратной транскрипции (ОТ). ОТ проводили при 42°С в течение 45 мин в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10мМ Tris-HCl (pH 8,3), 5мМ MgCl2, 10мМ DTT, 50мМ KCl, 0,2мМ dNTP, Stat-9 праймер (10нг/мкл), 100 ед.акт. ДНК зависимой РНК полимеразы MoMLV (Biosan, ИХБФМ СОРАН) и 500нг суммарной клеточной РНК. Амплификация кДНК анализируемых генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2, PUMA, NOXA, BAX и контрольных генов RPL32, b-Act, GAPDH, POLII. Реакция амплификации выполнялась при помощи термоциклера с оптическим блоком для детекции флуоресценции CFX96 (Bio-Rad). Возможность регистрации флуоресценции в режиме реального времени достигалась при помощи добавления в реакционную смесь интекалирующего с двухцепочечной ДНК флуоресцентного красителя SYBR GreenI (Invitrogen). ПЦР проводилась в объеме 25 мкл, реакционная смесь содержала 10 мМ Tris-НСl (рН 8.9); 55 мМ KCl; 0,05% Tween 20; 2,5 мМ MgCl2, 0,2mM dNTP, 300 nМ праймеры (прямой и обратный), 0.5 ед.акт. Taq-ДНК полимеразы (Biosan, ИХБФМ СОРАН), SYBRGreen I [1:25000] и 0.1-5 нг кДНК. Протокол амплификации: § первичная денатурация – 3 минуты при 96ºС; § амплификационный цикл (х 40) o денатурация – 10 секунд при 96ºС o отжиг праймеров – 10 cекунд при 60°С o элонгация – 10 секунд при 72°С 15 o съем сигнала – 10 секунд при t°С (где t°С = температуре плавления продукта амплификации) § построение кривой плавления – нагревание амплификационной смеси с 75 до 95°С, с шагом 0,5°С, сопровождающиеся съемом флуоресцентного сигнала на каждом шаге в течении 10 секунд. Для амплификации использовались соответствующие прямой и обратный праймеры: Act1_F 5’-GGGACCTCAAGCTGGAGAAC-3’ Act1_R 5’-CGCAAAAGGTCTTCATGGT-3’ BIK_F 5’-GGATGTTCTTAGAAGTTTCATGGA-3’ BIK_R 5’-AGCACCTGTTCGCAGGACA-3’ GPX4_F 5’-CATCCTGGGAAATGCCATCA-3’ GPX4_R 5’-GGCAGGTCCTTCTCTATCACCA-3’ TSPAN1_F 5’-CACCATGAAAGGGCTCAAGT-3’ TSPAN1_R 5’-CTTTTGCTTGGTGCAGGTTTC-3’ SLC37A2_F 5’-GCCAATGTGGCTCACTTTAG-3’ SLC37A2_R 5’-CCATTGGTGTAGTCAGAGACGA-3’ PUMA_F 5’- TACGAGCGGCGGAGACAAGA-3’ PUMA_R 5’- ATGCTACATGGTGCAGAGAAAG-3’ NOXA_F 5’- CGGAGATGCCTGGGAAGAA-3’ NOXA_R 5’- CTGAGTTGAGTAGCACACTCGACT-3’ BAX_F 5’-CGAACTGGACAGTAACATGGA-3’ BAX_R 5’-TGCTGGCAAAGTAGAAAAGG-3’ ACTB_F 5’-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’ ACTB_R 5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’ RPL32_F 5’-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3’ RPL32_R 5’-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3’ GAPDH_F 5’-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’ GAPDH_R 5’-TGACTCCGACCTTCACCTTC-3’ POLR2A_F 5’-GCACCACGTCCAATGACAT-3’ POLR2A_R 5’-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3’ Специфичность амплификации подтверждалась при анализе кривых плавления, а также электрофоретическим анализом в 8 % полиакриламидном геле. Анализ результатов ОТ-ПЦР. Для определения количества кДНК генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2, PUMA, NOXA, BAX и контрольных генов RPL32, b-Act, GAPDH, POLII одновременно с анализируемыми образцами амплифицировались 5 стандартных образцов с 16 последовательно уменьшающейся в три раза концентрацией ДНК. На основании значений Сt (cycle threshold, пороговый цикл) реакции амплификации стандартных образцов и десятичного Log их концентрации строили калибровочную кривую. Относительное количество кДНК генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2, PUMA, NOXA, BAX, RPL32, b-Act, GAPDH, POLII определяли исходя из уравнения калибровочной кривой, при этом учитывали эффективность амплификации каждого образца. Определение уровня экспрессии генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2, PUMA, NOXA и BAX достигалось при нормировании количества кДНК этих генов. Для этого использовался «нормировочный коэффициент» рассчитанный как среднее арифметическое значений экспрессии четырех генов-нормализаторов RPL32, b-Act, GAPDH, POLII. В итоге для каждой клеточной линии определялся уровень экспрессии генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2, PUMA, NOXA и BAX в условиях с добавлением и без добавления тестируемого соединения. Для того чтобы оценить, во сколько раз изменился уровень экспрессии генов, рассчитывалось отношение уровня экспрессии анализируемых в условиях с добавлением соединения к уровню экспрессии без добавления тестируемого соединения (т.е. относительный уровень экспрессии). 4.1.3 Определение активности соединений 4, 5 и 6 для клеток линий НМРЛ и РМЖ; результаты Соединение-4 обладало значимым цитостатическим действием на клетки линий НМРЛ А427 (IC50 = 4,3±1,2), DV-90 (IC50 = 1,9±0,8), A549 (IC50 = 3,3±0,7), H1944 (IC50 = 1,8±0,6) и H2228 (IC50 = 2±0,6). Действие соединений на указанные линии приводило к снижению и(или) прекращению пролиферации клеток в культуре, при этом не наблюдалось гибели клеток. Клетки линий НМРЛ – H292, COR-L23, H1395 и клетки РМЖ – MCF7, оказалась резистентными к действию соединения-4. На рисунках 2-10 приведены кривые зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток для девяти линий НМРЛ и РМЖ. . Рисунок 2 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии А427. 17 Рисунок 3 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии Н292. Рисунок 4 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии DV-90. Рисунок 5 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии A549. 18 Рисунок 6 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии COR-L23 Рисунок 7 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии H1395. Рисунок 8 − Кривая зависимости концентрации соединения-1 и доли выживших клеток линии H2228. 19 Рисунок 9 − Кривая зависимости концентрации соединения-1 и доли выживших клеток линии H1944. Рисунок 10 − Кривая зависимости концентрации соединения-4 и доли выживших клеток линии MCF7. Также как и соединение-4, соединение-5 оказывало цитостатическое действие на клетки линий НМРЛ – A427 (IC50 = 380±18), DV-90 (IC50 = 360±21) и H1944 (IC50 = 330±22). Клетки линий НМРЛ – A549, H292, COR-L23, H1395, Н2228 и клетки РМЖ – MCF7, были резистентными к действию соединения-5. На рисунках 11-19 приведены кривые зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток для девяти линий НМРЛ и РМЖ. 20 Рисунок 11− Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии А427. 21 Рисунок 12 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии Н292. Рисунок 13 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии DV-90. Рисунок 14 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии A549. 22 Рисунок 15 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии COR-L23. Рисунок 16 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии H1395. Рисунок 17 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии H2228. 23 Рисунок 18 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии H1944. Рисунок 19 − Кривая зависимости концентрации соединения-5 и доли выживших клеток линии MCF7. Соединение-6 оказывало цитотоксическое действие на клетки линии НМРЛ – A549 (IC50 = 4,8±1,6) и DV-90 (IC50 = 1,8±1,2). Добавление соединения-6 к культуре указанных линий в цитотоксической концентрации приводило к гибели клеток по механизму апоптоза. Клетки линий НМРЛ – A427, H292, COR-L23, H1395, Н2228, Н1944 и клетки РМЖ – MCF7, были резистентными к действию соединения-6. На рисунках 20-28 приведены кривые зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток для девяти линий НМРЛ и РМЖ. 24 Рисунок 20 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии А427. . Рисунок 21 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии Н292. Рисунок 22 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии DV-90. 25 Рисунок 23 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии A549. Рисунок 24 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии COR-L23. Рисунок 25 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии H1395. 26 Рисунок 26 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии H2228. Рисунок 27 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии H1944. Рисунок 28 − Кривая зависимости концентрации соединения-6 и доли выживших клеток линии MCF7. 27 Дополнительно, проапоптотическая активность соединений 4-6 оценивалась по изменению уровня экспрессии генов белков-регуляторов апоптоза – PUMA, NOXA, и BAX в клетках тестируемых линий до и после добавления соединений к культуре. Кроме того, способность соединений 4-6 подавлять механизмы жизнеспобности подтверждали при анализе изменения уровня экспрессии генов-мишеней PI3K/Act1 сигнального пути (AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1, SLC37A2) в клетках тестируемых линий после инкубирования с соединениями. Уровень экспрессии генов PUMA, NOXA, BAX, AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2 измеряли в клетках НМРЛ и РМЖ до и после добавления одного из соединений -4, -5 и -6 в концентрации соответствующей значению IC50 (2,6нМ, 357нМ и 3,3мкМ, соответственно). Относительный уровень экспрессии генов рассчитывали как соотношение уровня экспрессии гена после инкубации с соединением к уровню экспрессии до инкубации с соединением. Для клеточных линий чувствительных к соединениям 4-5 добавление соединения приводило к значимому (p < 0,05) изменению уровня экспрессии одного или нескольких генов из группы генов-мишеней PI3K/Act1 сигнального пути. Так добавление соединения-4 к культуре клеток линии А427 приводило к снижению экспрессии TSPAN1 и SLC37A2 (в 2,9±0,17 и в 2,8±0,28 раза соответственно). Добавление соединения-4 к культуре клеток линии DV90 сопровождалось снижением экспрессии SLC37A2 (в 3,2±0,27 раза); к культуре А459 – снижением экспрессии BIK и TSPAN1 (в 2,4±0,28 и в 2,5±0,29 раза); к культуре H1944 – снижением экспрессии BIK и SLC37A2 (в 2,4±0,1 и в 2,4±0,13 раза) и, наконец, к культуре H2228 – снижением экспрессии BIK (в 3,2±0,18 раза). Действие соединения-5 было менее выраженным. Так добавление соединения-5 приводило к снижению экспрессии гена AKT1 (1,6 ±0,15) в клетках линии A427, снижению экспрессии , BIK, TSPAN1 и SLC37A2 (1,5±0,16; 1,6±0,12 и 1,8±0,09) в клетках линии DV90 и снижению экспрессии BIK, GPX4 и SLC37A2 (1,7±0,2; 1,5±0,16 и 1,6±0,2) в клетках линии H1944). Соединения 4-5 представляют собой ингибиторы src киназ. Семейство src киназ включает в себя девять белков c-Src, Yes, Fyn, Fgr, Yrk, Lyn, Blk, Hck и Lck. Фосфорилирование активными src киназами вторичных мессенджеров приводит к опосредованной активации в клетке PI3K/Act1 сигнального пути – одного из наиболее известных путей регулирующих жизнеспособность и пролиферацию клетки. Таким образом, наблюдаемое нами снижение уровня экспрессии геновмишеней PI3K/Act1 сигнального пути свидетельствует о подавлении активности Act1, связанное по-видимому с антагонистичным действием соединений 4-5 на белки семейства src киназ (рис. 2930). Для клеточных линий чувствительных к соединению-6 добавление соединения приводило к значимому (p < 0,05) увеличению уровня экспрессии генов-регуляторов апоптоза. В клетках линии DV90 – генов BAX и PUMA (в 1,9±0,2 и 1,8±0,3 раза), а в клетках А549 – гена BAX (в 2,5±0,2 раза) (рис. 31). 28 Рисунок 29 − Изменение уровня экспрессии генов PUMA, NOXA, BAX, AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2 в клетках девяти линий НМРЛ и РМЖ в ответ на добавление соединения-4. Рисунок 30 − Изменение уровня экспрессии генов PUMA, NOXA, BAX, AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2 в клетках девяти линий НМРЛ и РМЖ в ответ на добавление соединения-5. 29 Рисунок 31 − Изменение уровня экспрессии генов PUMA, NOXA, BAX, AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2 в клетках девяти линий НМРЛ и РМЖ в ответ на добавление соединения-6. Таким образом, соединения 4 и 5 оказывают схожее цитостатическое действие на клетки линий НМРЛ, при этом действие соединения-4 более выраженное. Среднее значение IC50 для чувствительных линий НМРЛ составило 2,66±1,1нМ – для соединения-4 и 357,7±25,2нМ – для соединения-5. Соединение-6 оказывает умеренное цитотоксическое действие на клетки НМРЛ – DV90 и A549. Среднее значение IC50 для чувствительных линий НМРЛ составило 3,3±2,1мкМ. Следовательно, соединения 4 и 6 могут рассматриваться как перспективные соединения для создания новых противоопухолевых препаратов. 4.2 Тестирование биологической активности 2-ой серии перспективных химических соединений в комплексе с известными соединениями реактивирующими p53 на линиях опухолевых клеток (выполнено Исполнителем) Группа, препаратов реактивирующих транскрипционный фактор р53 в опухолевых клетках включает в себя множество соединений: нутлины (Nutlin3) [7-9]; BDAs (бензодиазепиндионы) [10]; серию Mdm2 ингибиторов (MI-63, MI-219 и MI-43) [11]; теновины (Tenovin-6) [12,13]; RITA, PRIMA-1 [14], CP-31398, MIRA-1 и другие (отчет НИР, этап 1, раздел 1.4). Указанные соединения представляют собой малые молекулы с общим противоопухолевым механизмом действия. А именно – взаимодействие соединений с белком р53 приводит к восстановлению его функциональной активности и последующей индукции апоптоза в опухолевой клетке.. В настоящем проекте исследуется действие соединений реактивирующих р53 на клетки немелкоклеточного рака легких (НМРЛ). В качестве таких соединений для настоящего проекта были выбраны: Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. 30 Действие Natlin-3 приводит к восстановлению активности р53 в клетке за счет ингибирования взаимодействия р53 с белком Mdm2. Белок Mdm2 представляет собой Е3 убиквитин лигазу и играет ключевую роль в регуляции р53 [1]. В клетке Mdm2 связывается с Nконцевым доменом белка р53, при этом происходит инактивация последнего и последующая протеолитическая убиквитин-зависимая деградация р53. В клетках опухоли, как правило, имеет место увеличение экспрессии Mdm2 [2]. В результате этого в опухолевых клетках происходит быстрая деградация р53, что позволяет им избегать р53-зависимого апоптоза. Разрушение комплекса Mdm2-р53 способствует стабилизации р53 и восстановлению его активности, что в свою очередь приводит к остановке пролиферации и (или) гибели опухолевых клеток. На сегодняшний день идентифицированы три класса малых органических молекул, которые в силу своих структурных особенностей способны ингибировать взаимодействие Mdm2 и р53. К ним относятся гетероциклические соединения: Nutlins (нутлины) [3], BDAs (бензодиазепиндионы) [4] и серия Mdm2 ингибиторов (MI) производных спиро-оксиндолов, включающих MI-63, MI-219 и MI-43 [5, 6]. Все три серии соединений имитируют аминокислотные остатки F19, W23 и L26 белка р53 и с высокой афинностью связываются с Mdm2 в области р53-специфичного кармана и, таким образом, вытесняют р53 из Mdm2-р53 комплекс. Из всех соединений ингибирующих взаимодействие белков Mdm2 и р53 наиболее хорошо изучены Nutlins (нутлины). Данные доклинического испытания соединения Nutlin-3а для лечения острого миелоидного лейкоза [7, 8] подтвердили, способность Nutlin-3а индуцировать апоптоз бластных клеток (но не нормальных гематопоэтических клеток крови). В настоящий время препарат Nutlin3/RG7112 (Roche, Penzberg, Germany) находится в стадии-I клинических испытаний для лечения гематологических неоплазий NCT00623870 и NCT00559533. Способность соединения Tenovin-6 активировать р53 связана с ингибированием SirT1 и SirT2 – члены класса III NAD+-зависимых гистоновых ацетилаз, принадлежащих к семейству сиртуинов (sirtuin). SirT1 локализуется в ядре, его мишенями являются различные ацетилированные субстраты (в том числе и р53). SirT2 локализуется преимущественно в цитоплазме, его основной мишенью служит а-тубулин, а также гистон4. Ацетилирование р53 по К382, осуществляемое SirT1, дестабилизирует р53 и уменьшает его ДНК-связывающую активность [9-12]. Как соединения активирующие белок р53 в опухолевых клетках впервые теновины были описаны Sonia Lain и соавт. в 2008 г [13]. Механизм действия PRIMA-1 по всей видимости заключается в том, что PRIMA-1 связывается с р53 и таким образом стабилизирует вторичную структуру его ДНК-связывающего домена. Это было подтверждено в серии экспериментов с применением конформационно специфичных антител [14]. В настоящий момент соединение PRIMA-1MET (Aprea, Solna, Sweden) 31 находится в стадия-I/II клинических испытаний NCT00900614 для лечения гематологических неоплазий и рака предстательной железы. Таким образом, выбранные для настоящего проекта соединения Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1 являются перспективными соединениями реактивирующими белок р53. Тестирование биологической активности перспективных соединений в комплексе с известными соединениями реакивирующими р53 на линиях опухолевых клеток НМРЛ выполнено в соответствии с п. 6.1 технического задания. В ходе работы на 3-ем этапе проекта девять клеточных линий НМРЛ и РМЖ были охарактеризованы на предмет их чувствительности (или резистентности) к действию известных препаратов реактивирующих р53, таких как Nutlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. Были выявлены две линии (A549 и Н2228) резистентные к действию Nutlin-3, эти же две линии были резистентны к действию tenovin-6 и четыре линии (A427, H292, COR-L23, H1395) были резистентны к действию PRIMA-1. Перечисленные клеточные линии использовались нами для тестирования способности соединений 4-6 синергично усиливать цитотоксическое действие препаратов Nutlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. Цитотоксическая активность комбинации соединений 4-6 с одним из соединений Natlin-3 или tenovin-6, или PRIMA-1 определялась на основании параметра IC50. Параметр IC50 определялся при помощи теста жизнеспособности c резазурином (подробное описание метода см. в главе 4.1.1). Клетки НМРЛ, высевали в лунки 24-луночного планшета по 60 тыс. клеток на лунку. Через 24 часа культуральную среду заменяли на свежую, содержащую одно из соединений: • Nutlin3± (Cayman Chemical) в концентрациях 34мкМ, 17мкМ, 8,5мкМ, 4,25мкМ и, 2,2мкМ; • tenovin-6 (Cayman Chemical) в концентрациях 20мкМ, 10мкМ, 5мкМ, 2,5мкМ и 1,25мкМ; • PRIMA-1(Cayman Chemical) в концентрациях 100мкМ, 50мкМ, 25мкМ, 12,5мкМ и 6,25мкМ. Одновременно к клеткам добавляли одно из соединений 4-6 в концентрациях соответствующих средним значениям IC50 (2,6нМ, 357нМ, 3,3мкМ, соответственно). Каждая точка была представлена в тройном повторе. Через 48 часов после добавления химиопрепарата определяли долю жизнеспособных клеток при помощи теста на жизнеспособность с резазурином. В таблице 1 приведены значения цитотоксической концентрации (IC50) для различных линий НМРЛ для препаратов Nutlin-3, tenovin-6 или PRIMA1 и этих же препаратов в комплексе с соединениями 4-6. 32 Таблица 2 - Значения IC50 препаратов Nutlin-3, tenovin-6 или PRIMA1 и этих же препаратов в комплексе с соединениями-4, -5 и -6 в концентрациях соответствующих средним значениям IC50 (2,6нМ, 357нМ и 3,3мкМ, соответственно) для шести линий НМРЛ Новые Клеточные линии соединения H2228 A549 H2228 tenovin-6 nutlin3 A427 H292 COR-L23 H1395 соединение-4 соединение-5 IC50 IC50 IC50 IC50 16.8±3.2 7.1±2.6 19.8±3.9 8.05±1.8 19±2.1 16.8±1.5 22.1±2.1 18.2±1.6 31.2±5.2 15.4±4.3 32.8±4.9 12.3±3.8 33.1±6.7 16.6±1.5 38.1±4.1 31.2±4.6 - 51.2±4.1 92.1±3.6 - - - - - - - - - - - - - -6 Известные соединения A549 соединение - PRIMA1 Как видно, соединение-4 показало способность более чем в два раза увеличивать чувствительность линии А549 к действию Nutlin-3 (IC50=15.4±4.3 по сравнению с IC50=31.2±5.2) и к действию tenovin-6 (IC50=7.1±2.6 по сравнению с IC50=16.8±3.2). Добавление соединения-4 также увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 на клетки Н2228 (IC50=16.6±1.5 по сравнению с IC50=33.1±6.7) и цитотоксическое действие PRIMA1 на клетки A427 (IC50=51.2±4.1). В то же время добавление соединения-4 не изменяло чувствительности клеток Н2228 к действию tenovin-6 и чувствительности клеток H292, COR-L23 и H1395 к действию PRIMA1. Соединение-6 значительно увеличивало чувствительность линии А549 к действию Nutlin-3 (IC50=12.3±3.8±4.3 по сравнению с IC50=31.2±5.2) и к действию tenovin-6 (IC50=8.05±1.8 по сравнению с IC50=16.8±3.2). Для других клеточных линий действие соединения-6 не изменяло цитотоксичского (или цитостатического) эффекта препаратов реактивирующих р53. Соединение-5 ни для одной из клеточных линий не изменяло цитотоксичского (или цитостатического) эффекта Nutlin-3, tenovin-6 или PRIMA1. В таблице 1 приведены значения цитотоксической концентрации (IC50) для различных линий НМРЛ для препаратов Nutlin-3, tenovin-6 или PRIMA1 и этих же препаратов в комплексе с соединениями 4-6. Ниже на рисунках 32-37 приведены кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комплексе с соединениями 4-6 и доли выживших клеток для двух резистентных к действию Nutlin3 линий НМРЛ (А549 и Н2228). На рисунках 38-43 приведены кривые зависимости концентрации 33 tenovin-6 в комплексе с соединениями 4-6 и доли выживших клеток для двух резистентных к действию tenovin-6 линий НМРЛ (А549 и Н2228). И наконец, на рисунках 44-55 приведены кривые зависимости концентрации PRIMA1 в комплексе с соединениями 4-6 и доли выживших клеток для двух резистентных к действию PRIMA1 линий НМРЛ (A427, H292, COR-L23, H1395). Рисунок 32 − Кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А549. Рисунок 33 − Кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А549. 34 Рисунок 34 − Кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А549. Рисунок 35 − Кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии Н2228. Рисунок 36 − Кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии Н2228. 35 Рисунок 37 − Кривые зависимости концентрации Nutlin-3 в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии Н2228. Рисунок 38 − Кривые зависимости концентрации tenovin-6 в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А549. Рисунок 39 − Кривые зависимости концентрации tenovin-6 в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А549. 36 Рисунок 40 − Кривые зависимости концентрации tenovin-6 в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А549. Рисунок 41 − Кривые зависимости концентрации tenovin-6 в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии Н2228. Рисунок 42 − Кривые зависимости концентрации tenovin-6 в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии Н2228. 37 Рисунок 43 − Кривые зависимости концентрации tenovin-6 в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии Н2228. Рисунок 44 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А427. Рисунок 45 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А427. 38 Рисунок 46 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии А427. Рисунок 47 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии H292. Рисунок 48 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии H292. 39 Рисунок 49 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии H292. Рисунок 50 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии COR-L23. Рисунок 51 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии COR-L23. 40 Рисунок 52 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии COR-L23. Рисунок 53 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-4 (2,6нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии H1395. Рисунок 54 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-5 (360нМ) и без соединения и доли выживших клеток линии H1395. 41 Рисунок 55 − Кривые зависимости концентрации PRIMA1в комбинации с соединением-6 (3,3мкМ) и без соединения и доли выживших клеток линии H1395. Таким образом, для некоторых линий немелкоклеточного рака легких соединение-4 и соединение-6 значительно увеличивают цитотоксическое действие известных препаратов восстанавливающих активность белка р53, а именно, препарата nutlin-3 и в меньшей степени препаратов tenovin-6 и PRIMA1. Наиболее успешной комбинацией соединений можно считать комбинацию [соединение-4 & nutlin-3]. Определенная нами комбинация соединения-4 (в концентрации 2,6 нМ) и соединения nutlin-3 (в концентрации 15-16 мкМ) приводит к гибели 50% клеток линий A549 и H2228, тогда как при использование только соединения nutlin-3 тот же эффект достигается при значительно больших концентрациях nutlin-3 (31 мкМ и выше). Следовательно, комбинация [соединение-4 & nutlin-3] может быть перспективным лекарственным препаратом для противоопухолевой терапии при лечении НМРЛ. 4.3 Обобщение и оценка полученных результатов (выполнено исполнителем) 4.3.1 Состав комбинации соединений, наиболее эффективно индуцирующей апопотоз клеток опухоли Наиболее эффективной является комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ). Описание приведено в приложении А. 4.3.2 Метод увеличения противоопухолевой активности перспективных препаратов из класса малых молекул Увеличение противоопухолевой активности перспективного препарата из класса малых молекул – Nutlin-3 достигается за счет его комбинации с тестовым соединением-4. Принцип реализации увеличения приведен в приложении Б. 42 4.3.3 Протокол использования исследованных в ходе НИР химических соединений в комплексе с известными противоопухолевыми препаратами для увеличения их проапоптотической активности Режим использования исследованных химических соединений с известными противоопухолевыми лекарственными средствами для увеличения их проапоптотической активности приведен в приложении В. 4.3.4 Экспериментальный образец композиционного препарата, наиболее эффективно индуцирующего апоптоз клеток опухоли Получен экспериментальный образец композиционного препарата, наиболее эффективно индуцирующего апоптоз клеток опухоли (рисунок 56). Рисунок 56 – Фотография банок с компонентами композиционного препарата. 43 Состав экспериментального образца композиционного препарата. Экспериментальный образец препарата включает два компонента. Компонент-1: 4-[(2,4-дихлоро-5-метоксифенил)амино]-6-метокси-7-[3-(4-метил-1- пиперазинил)пропокси]-3-хинолинокарбонитрил (Cayman Chemical, Каталожный № 12030); Чистота – не ниже 98% Компонент-2 (±Nutlin-3): ±4-[4,5-Бис(4-хлорфенил)-2-(2-шзопрпокси-4-метокси-фенил)-4,5дигидро-имидазол-1-карбонил]-пиперазин (Cayman Chemical, Каталожный № 10004372); чистота – не ниже 98 %; оптическая чистота – избыток (-)-энтиомерной формы не ниже 50%. Для тестирования на клетках НМРЛ компонент-1 и компонет-2 растворяются в неполярном растворителе DMSO (MP Biomedicals, LLC, Каталожный № 196055) в концентрации 10мМ. Финальные концентрации компонентов экспериментального препарата в культуральной среде должны составлять компонент-1 – 2,6нМ, компонент-2 – 15мкМ. Концентрация компонента-2 может быть увеличена до 30 мкМ. 4.4 Технико–экономическая оценка результатов НИР. Разработка рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики (выполнено Исполнителем) Научная проблема на решение которой направлен проект – определение специфических для клеток опухоли белков-мишеней для новых противоопухолевых соединений; разработка новых лекарственных препаратов селективно индуцирующих гибель клеток немелкоклеточного рака легких. Описание основных результатов проекта. В ходе проекта разработана успешная комбинация соединений [соединение-4 & Nutlin-3], обладающая цитотоксическим действием относительно опухолевых клеток немелкоклеточного рака легких. Дополнительным результатом проекта является база данных, включающая в себя перечень и описание генов опухолевых клеток, уровень экспрессии которых изменяется в ответ на действие различных противоопухолевых соединений из класса малых молекул и перечень вероятных белков-мишеней этих соединений. Актуальность полученных результатов. Немелкоклеточный рак легких является серьезной медицинской и социальной проблемой. По данным на 2011г. ежегодная заболеваемость НМРЛ составляет 25,2 случаев на 100 тыс. населения ежегодно. Среди злокачественных опухолей различного происхождения НМРЛ занимает первое место и является наиболее распространенной причиной смерти от онкологической патологии. На сегодняшний день основным методом лечения НМРЛ является хирургическое лечение или хирургическое лечение в комплексе с лучевой или химиотерапией. Однако эффективность лечения остается удручающе низкой. Так при 44 использовании хирургического метода достигается только 30%-я пятилетняя выживаемости пациентов; при комплексном лечении – 40% выживаемость в течение 5 лет. Таким образом, разработка новых подходов к лечению НМРЛ является актуальной задачей современного здравоохранения. Перспективным подходом к лечению онкологических заболеваний считается таргетная терапия, подразумевающая направленное фармакологическое воздействие на ключевой для клеток опухоли регуляторный белок. К числу перспективных таргетных противоопухолевых соединений относятся препараты из класса малых молекул, восстанавливающие активность белка р53 в опухолевых клетках – Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. Клинические и экспериментальные исследования, указанных соединений в целом показывают положительные результаты, однако в ряде случаев опухолевые клетки оказываются нечувствительны к действию препаратов. Преодоление резистентности опухолевых клеток к действию терапевтических препаратов, в том числе к соединениям активирующим р53 – является одной из важнейших задач, к сожалению не решенной на сегодняшний день. Информация об опыте использования препаратов подобных соединениям разрабатываемых в проекте. На сегодняшний день ряд соединений из класса малых молекул, действие которых направлено на восстановление активности р53 в клетке уже прошли этапы доклинического тестирования и находятся на различных стадиях клинического испытания. К их числу относятся: препарат Nutlin/RG7112 (Roche, Penzberg, Германия; стадия-1 клинических испытаний; NCT00623870 и NCT00559533), препарат JNJ-26854165 (Johnson & Johnson, New Brunswick, США; стадия-1 клинических испытаний; NCT00676910) и препарат PRIMA-1MET /APR246 (Aprea, Solna, Швеция; стадии-1 и -2 клинических испытаний;NCT00900614). Испытания указанных препаратов проводятся при лечениии гематологических неоплазий и ретинобластомы. Предварительные результаты – положительные. Разработанный в настоящем проекте композиционный препарат представляет собой комбинацию [соединение-4 & Nutlin-3], где соединение-4 является ингибитором src-киназ и опосредованно подавляет основные пути выживания опухолевой клетки, в том числе PI3K/Akt сигнальный путь. На сегодняшний день ряд соединений ингибиторов PI3K/Akt сигнального пути также проходят стадии клинических испытаний. К их числу относятся: препарат-ингибитор PI3K – PI-10386 (Novartis, США; стадия-1 клинических испытаний; NCT00620594) и ингибиторы Akt1 – Perifosine (Aeterna Zentaris, США; стадия-2 клинических испытаний; NCT00391560) и Tricibine (VioQuest, США; стадия-1клинических испытаний; NCT00301938). Испытания указанных препаратов проводятся при лечении солидных опухолей различного происхождения. Предварительные результаты – положительные. 45 Конкурентные преимущества результатов разработанных в ходе проекта. В настоящем проекте с целью увеличению потивоопухолевого эффекта соединений Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1 указанные препараты дополнялись вторым соединением подавляющим механизмы выживания опухолевых клеток и тем самым синергично усиливающим цитотоксическое действие первого соединения. Наиболее успешной комбинацией двух химических веществ, способных в сочетании друг с другом эффекивно индуцировать апотоз клеток НМРЛ оказалась композиция [соединение-4 & Nutlin-3]. В отношении некоторых линий НМРЛ цитотоксические свойства композиции [соединение-4 & Nutlin-3] в два раза превосходят активность известного препарата Nutlin-3. Следовательно, комбинация [соединение-4 & Nutlin-3] может быть перспективна для разработки нового более эффективного лекарственного средства для лечения НМРЛ. Сравнение уровня исследований с мировыми тенденциями. Тема исследований, разрабатываемая в ходе НИР, отражает ведущие мировые тенденции, что отражается статистикой мировых публикаций. Так, например, в базе данных PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), начиная с 2004 г., было депонировано 421 публикаций зарубежных авторов, посвященных малым молекулам нутлинам (Nutlin-3), из них 93 публикации за последний 2012 г. Полученные при проведении НИР результаты соответствуют мировому уровню, что подтверждается наличием публикаций по результатм НИР (трех публикаций в зарубежных и одной – в отечественном журнале). Экономическая эффективность при возможном внедрении результатов проекта. Использование более эффективного препарата на основе комбинации [соединение-4 & Nutlin-3] может обеспечить увеличение продолжительности и качества жизни пациентов с НМРЛ. При разработке нового лекарственного средства на основе композиции [соединение-4 & Nutlin-3] потребуются менее объемные преклинические и клинические испытания, так как в настоящее время соединение Nutlin-3/RG7112 (Roche, Penzberg, Germany) уже находится в стадии-I клинических испытаний для лечения гематологических неоплазий NCT00623870 и NCT00559533. Рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики. Основным потребителем разрабатываемого ЛС является государство т.к. в соответствии с Федеральным законом о федеральном бюджете онкологические заболевания выделены в группу нозологий, для лечения которых лекарственные средства закупаются централизованно. Именно государство заинтересовано как в снижении затрат на терапию и выполнение социальных гарантий, так и в увеличении эффективности терапии. Борьба с онкологическими заболеваниями является приоритетным направлением современного здравоохранения РФ. Благодаря совершенствованию оборудования и методов биотехнологии 46 становится возможным осуществлять поиск новых функционально-значимых химических соединений на основе объемной теоретической базы. Разработанные таким образом ЛС становятся наиболее эффективными таргетными препаратами. Разработанный в настоящих НИР состав композиционного препарата в дальнейшем должен пройти стадию соответствующих ОКР, в ходе которых буду выполнены преклинические испытания. В случае если будут получены убедительные данные о перспективности композиции как лекарственного средства, необходимо выполнить клинические испытания и зарегистрировать новое лекарственное средство в Росздравнадзоре. Это объемный этап, требующий привлечений других участников, помимо разработчика. 4.5 Разработка проекта технического задания для проведения последующего ОКР (выполнено Исполнителем) Разработан проект технического задания на выполнение опытно-конструкторских работ по теме «Получение и преклинические испытания опытного образца композиционного противоопухолевого препарата, селективно индуцирующего апоптоз в р53wild опухолевых клетках». Документ представлен отдельным приложением. 4.6 Подведение итогов НИР. Разработка заключительного отчета о НИР и его рассмотрение на учёном совете Исполнителем были подведены итоги 4-го этапа НИР, составлен и рассмотрен на ученом совете заключительный научно-технический отчет. Выводы Наиболее эффективной является комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ) Увеличение противоопухолевой активности перспективного препарата из класса малых молекул – Nutlin-3 достигается за счет его комбинации с тестовым соединением-4. Механизм противоопухолевого действия Natlin-3 заключается в вытеснении р53 из комплекса с белком Mdm2, что способствует накоплению р53 в клетке и увеличению его транскрипционной активности. В итоге, активирование р53 приводит к остановке пролиферации и (или) гибели опухолевых клеток. Механизм противоопухолевого действия соединения-4 заключается в ингибировании srcкиназ. Src-киназы действуют как вторичные месенджеры при проведении пролиферативных и анти-апоптотических сигналов от рецепторов молекул адгезии, факторов роста, цитокинов и др. Ингибирование src-киназ приводитк к угнетению PI3K/Akt1 сигнального пути и других механизмов выживания опухолевой клетки. 47 Таким образом, механизмы действия соединения-4 и Nutlin-3 дополняют друг друга. Добавление соединения-4 усиливает цитостатическое действие Nutlin-3. Протокол использования соединения-4 в качестве компонента композиционного противоопухолевого препарата включает процедуру определения цитотоксической концентрации Nutlin-3 в комбинации легких. соединением-4 для конкретной линии клеток немелкоклеточного рака Цитотоксической концентрации Nutlin-3 определяется при помощи теста на жизнеспособность с резазурином. Описание методики приводится в разделе 4.3.3. Экспериментальный образец композиционного препарата, наиболее эффективно активирующего апопотоз клеток опухоли включает два компонента: компонент-1 – 4-[(2,4-дихлоро-5-метоксифенил)амино]-6-метокси-7-[3-(4-метил-1- пиперазинил)пропокси]-3-хинолинокарбонитрил (Cayman Chemical, Каталожный № 12030); чистота – не ниже 98%; компонент-1 (±Nutlin-3) – ±4-[4,5-Бис(4-хлорфенил)-2-(2-шзопрпокси-4-метокси-фенил)4,5-дигидро-имидазол-1-карбонил]-пиперазин (Cayman Chemical, Каталожный № 10004372); чистота – не ниже 98 %; оптическая чистота – избыток (-)-энтиомерной формы не ниже 50%. Для тестирования на клетках НМРЛ компонент-1 и компонет-2 растворяются в неполярном растворителе DMSO (MP Biomedicals, LLC, Каталожный № 196055) в концентрации 10мМ. Финальные концентрации компонентов экспериментального препарата в культуральной среде должны составлять компонент-1 – 2,6нМ, компонент-2 – 15мкМ. Концентрация компонента-2 может быть увеличена до 30 мкМ. 4.7 Разработка базы данных, содержащая перечень и описание генов опухолевых клеток дифференциально–экспрессирующихся после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул (выполнено Иностранным партнером) При реализации проекта на 1-3-ем этапах были усовершенствованы методы статистического анализа данных по изменению транскиптома опухолевых клеток после воздействия противоопухолевых препаратов и алгоритмы моделирования и анализа структурных закономерностей молекулярных взаимосвязей и выбора ключевых молекул сигнальных путей. Для этой задачи использовались методы компьютерного моделирования, реализованные на платформе geneXplain/BioUML. На 4-ом этапе проекта при помощи указанных методов программного комплекса GeneXplain были проанализированы изменения транскриптома раковых клеток под действием различных противоопухолевых соединений. Для анализа использовались данные полученные в ходе проекта Connectivity Map (СMAP) http://www.broadinstitute.org/cmap. Структура проанализированных данных: в ходе проекта СMAP были проанализированы 10 опухолевых клеточных линий человека. Для каждой линии определяли транскрипционный 48 профиль до и после добавления противоопухолевого соединения. Всего было проанализировано 1309 соединений. Транскрипционный профиль определялся при помощи гибридизационных микро-чипов (Affimetrix). Для настоящего проекта мы выбрали данные относящиеся к соединениям из числа перспективных малых молекул (всего было проанализировано 321 химическое вещество). Сравнивая значения уровня экспрессии с контрольными образцами, был выявлены дифференциально эксперссирующиеся гены и ряд потенциальных генов–мишеней для этих химических веществ. Из 321-ого химического соединения 20 оказывали статистически значимое влияние на изменение экспрессии генов с уровнем доверия более 98%. Ниже приведена таблица включающая перечень этих 20-ти соединений с указанием количеств дифференциально экспрессирующихся генов и выявленных генов–мишеней. Для выявления генов мишеней по данным измерений транскрипционных профилей было проделано следующее. На первом этапе все таблицы данных были переведены в формат платформы geneXplain/BioUML и проаннотированы с помощью базы данных Ensembl. Далее для каждого измерения были определены гены с высокой и низкой экспрессией, имеющие статистическую значимость более 0.999. На основе этих двух наборов генов был произведен поиск возможных регуляторов этих генов при помощи анализа сети (графов) известных сигнальных взаимодействий клетки. В качестве источника сети сигнальных реакций эукариотических клеток использовалась база данных TRANSPATH. Подробно все использованные методы вычисления описаны на этапе 1.1. 49 Таблица 3 - 20 наиболее перспективных химических соединений оказывающих статистически значимое влияние на экспрессию генов опухолевых клеток с уровнем значимости более 98% Число Дифференциально экспрессирующиеся гены Число генов с найденных Число генов с увеличенной генов-мишеней экспрессией hyoscyamine 14 115 202 glibenclamide 8 221 128 monobenzone 7 151 103 mi-219 30 169 76 lansoprazole 30 206 130 benzonatate 36 139 134 risperidone 36 39 207 profenamine 40 104 226 letrozole 13 138 124 methylergometrine 23 169 226 baclofen 4 104 97 erythromycin 42 134 103 tolazamide 9 59 130 edrophonium chloride 39 43 43 tranexamic acid 36 220 42 diclofenamide 8 131 51 triamcinolone 35 115 120 primidone 13 117 159 aminoglutethimide 12 137 212 griseofulvin 28 202 146 Химическое вещество подавленной экспрессией Результаты проведенного анализа были депонированы в базе данных доступной на сайте http://platform.genexplain.com/bioumlweb/. Разработанная база данных включает в себя перечень и описание генов опухолевых клеток, уровень экспрессии которых изменился после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул. База данных распространяется на 50 условиях открытого доступа, как для академических институтов, так и коммерческих предприятий и тем самым подтверждает свое высокое научно-практическое значение. 4.8 Написание и направление публикаций в высокорейтинговые российские или зарубежные журналы (выполнено Иностранным партнером) Опубликованы статьи «A Discriminative Approach for Unsupervides Clustering of DNA Secuence Motifs» (журнал PLOS: computational biology Великобритания, дата публикации - март 2013 г.) и «Микоплазма уменьшает цитотоксическое действие Nutlin3 на клетки немелкоклеточного рака легких благодаря активированию NFkB сигнального пути» (журнал Бюллетень экспериментальной медицины и биологии, РФ, дата публикации – 2-ой квартал 2013 г.). 4.9 Написание и направление заявки в ФИПС на выдачу патента (выполнено Иностранным партнером) В ФИПС РФ направлена заявка на получение патента РФ. Способ диагностики чувствительности клеток немелкоклеточного рака легких к действию соединений-ингибиторов взаимодействия MDM2-р53. Для назначения таргетной терапии, основанной на использовании лекарственных соединений, ингибирующих взаимодействие Mdm2-р53, необходимо определить критерии, характеризующие категорию пациентов c НМРЛ, с высокой вероятностью реагирующих на лечение препаратами рассматриваемой группы. Следовательно, существует необходимость в клинических тестах, позволяющих предсказывать чувствительность и(или) резистентность опухолевых клеток при НМРЛ к лечению препаратами-ингибиторами Mdm2-р53. Второй этап проекта включал раздел 2.1: «Идентификация сигнальных внутриклеточных путей активируемых и(или) инактивируемых под действием выбранных противоопухолевых препаратов». При выполнении работы на этапе 2.1 проекта сравнивались профили экспрессии генов в клетках линии А427 НМРЛ до и после инкубации с Nutlin-3 в цитотоксической концентрации и в концентрации не оказывающей видимого эффекта. Полученные данные использовались в патенте при выборе маркеров чувствительности клеток НМРЛ к действию соединений-ингибиторами Mdm2-р53. Кроме того четвертый этапы проекта включали разделы «Тестирование биологической активности 2–ой серии перспективных химических соединений на линиях опухолевых клеток». При выполнении работ на этом этапах был разработан и оптимизован метод определения биологической активности тестируемых химических соединений на основания уровня экспрессии генов-мишеней PI3K/Act1 сигнального пути. Метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени для 51 измерения относительного уровня экспрессии Act1-зависимых генов AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2 описан в изобретении. 52 ЗАКЛЮЧЕНИЕ На 4-ом этапе проекта была определена цитотоксическая активность трех новых соединений подавляющих механизмы выживания опухолевой клетки для девяти клеточных линий НМРЛ (A549, NCI-H292, A427, COR-L23, DV-90, NCI-H1395, NCI-H1944, NCI-H2228) и РМЖ (MCF7). Рассмотренные соединения включали ингибиторы src-киназ (соединение-4 и соединение5) и ингибитор белка BCL-XL (соединение-6). Было показано, что соединение-4 обладает цитостатическим действием (т.е. ограничивает пролиферацию) на клетки линий НМРЛ А427, DV90, A549, H1944 и H2228. Среднее значение IC50 соединения-4 для чувствительных линий НМРЛ составило 2,66±1,1нМ. Схожим образом, соединение-5 обладало цитостатическим действием на клетки линий НМРЛ А427, DV-90 и H1944. Среднее значение IC50 соединения-5 составило 357,7±25,2нМ. В обоих случаях цитостатический эффект соединений 4 и 5 сопровождался значимым (p < 0.05) снижением уровня экспрессии от одного до трех Act1-зависимого генов (из числа AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2). Соединение-6 оказывало цитотоксическое действие на клетки линий НМРЛ A549 и DV-90. Среднее значение IC50 для чувствительных линий НМРЛ составило 3,3±2,1мкМ. Цитотоксическое действие соединения-6 сопровождалось значимым (p < 0.05) увеличением уровня экспрессии генов-регуляторов апоптоза (BAX и PUMA). Для определения наиболее успешной комбинации было протестировано цитотоксическое действие различных сочетаний рассматриваемых в проекте соединений на линиях клеток резистентных к действию Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1. Соединение-4 (2.6нМ) увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 на линии A549 и H2228 (IC50 = 15,4 по сравнению с 31,2мкМ и IC50 = 16,6 по сравнению с 33,1мкМ, соответственно, р<0.05), действие tenovin-6 на линию A549 (IC50 = 7,1 по сравнению с 16,8мкМ, р<0.05) и действие PRIMA-1 на линию A427 (IC50 = 51,2 и отсутствие цитотоксического действия одного только соединения PRIMA-1 на клетки А427). Соединение-6 (3,3мкМ) увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 и tenovin-6 на линию A549 (IC50 = 12,3 по сравнению с 31,2мкМ и IC50 = 8 по сравнению с 16,8мкМ, соответственно, р<0.05). Соединение-5 не изменяло действия ни одного из соединений Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1 на клетки линий НМРЛ. Таким образом, наиболее успешной комбинацией является комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ). Дополнительно, в ходе 4-ого этапа исследования были систематизированы результаты исследований действия 331 противоопухолевых соединений на клетки 10 раковых линий человека. На основании результатов анализа транскрипционных профилей этих линий были выделены гены дифференциально экспрессирующиеся в опухолевых клетках в ответ на действие лекарственных соединений и вероятные молекулы-мишени этих соединений. Результаты проведенного анализа 53 были депонированы в базе данных доступной на сайте http://platform.genexplain.com/bioumlweb/. Разработанная база данных включает в себя перечень и описание генов опухолевых клеток, уровень экспрессии которых изменился после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул. Выводы по результатам 4-ого этапа НИР: • В ходе 4-его этапа НИР были систематизированы результаты исследований действия 331 противоопухолевых соединений на клетки 10 раковых линий человека. На основании результатов анализа транскрипционных профилей этих линий были выделены гены дифференциально экспрессирующиеся в опухолевых клетках в ответ на действие лекарственных соединений и вероятные молекулы-мишени этих соединений. Результаты проведенного анализа были депонированы в базе данных доступной на сайте http://platform.genexplain.com/bioumlweb. База данных распространяется на условиях открытого доступа, как для академических институтов, так и коммерческих предприятий. • В ходе 4-его этапа НИР определена комбинация соединений, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ) эффективно индуцирующая апоптоз в резистентных к действию Nullin-3 линиях А549 и Н2228. • В ходе 4-его этапа НИР подготовлена отчетная документация в соответствии с ГОСТ 7.322001. • В ходе 4-его этапа НИР подготовлен проект технического задания ОКР по теме: «Получение и доклинические испытания лабораторного образца композиционного противоопухолевого препарата, селективно индуцирующего апоптоз в опухолевых клетках с р53 дикого типа» • В ходе 4-его этапа НИР опубликованы две статьи и подготовлена заявка на патент на изобретение по теме «Способ диагностики чувствительности клеток немелкоклеточного рака легких к действию соединений-ингибиторов взаимодействия MDM2-р53» В ходе 4-ого этапа проекта все поставленные задачи были выполнены в срок и в полном объеме. Выводы по результатам НИР: • В ходе НИР была разработана теоретическая база для разработки новых противоопухолевых соединений. В частности, разработан алгоритм математического обеспечения для топологического моделирования каскадов сигнальной трансдукции. Использование данного алгоритма при анализе профилей транскрипции опухолевых клеток 54 в различных условиях позволило определить сигнальные пути активируемые в клетках НМРЛ в ответ на действие препаратов Nutlin-3, tenovin-6 и PRIMA1 и идентифицировать молекулы мишеней новых соединений усиливающих действие Nutlin-3 и др. В заключении была разработана база данных, включающая в себя перечень опухолевых клеток, уровень экспрессии и описание генов которых изменился после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул • В ходе НИР был определен набор новых соединений с высокой вероятностью усиливающих цитотоксическое действие Nutlin-3, tenovin-6 и(или) PRIMA1 на клетки опухоли. • В ходе НИР было протестировано цитотоксическое действие трех соединений реактивирующих белок р53 (Nutlin-3, tenovin-6 и PRIMA1) ), для линий A427, H292, DV-90, COR-L23, H1395, Н2228, А549б Н1944. Линии A427, H292, DV-90, COR-L23, H1395 оказались чувствительными к действию Nutlin-3 и Tenovin-6, среднее значение IC50 составило 14,7±2,5 и 3,7±3,1, соответственно. Линии H2228 и DV-90 оказались чувствительными к действию PRIMA-1, среднее значение IC50 составило 42,1±2,4. Добавление соединений Nutlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1 приводило к значимому изменению уровня экспрессии генов p21, PUMA, NOXA и BTG в клетках чувствительных линий НМРЛ • В ходе НИР было протестировано цитотоксическое (или цитостатическое) действие 6-ти новых соединений на линии клеток. Соединение-1 (антагонист белка BCL2), соединения-2 и -3 (ингибиторы комплекса циклин Е/CDK2), соединения-4 и -5 (ингибиторы src-киназ), соединение-6 (ингибиторы BCL-XL). Соединение-3 показало цитотоксическую активность относительно линий A427, H292, DV-90, Н1944 и Н2228. Среднее значение IC50 для чувствительных линий составило 19.9±10.3мкМ. Соединение-4 показало цитотоксическую активность относительно линий А427, DV-90, A549, H1944 и H2228. Среднее значение IC50 составило 2,66±1,1нМ. Соединение-5 показало цитотоксическую относительно линий активность DV-90, A549 и H1944. Среднее значение IC50 составило 357,7±25,2нМ Соединение-6 оказывало цитотоксическое действие на клетки линий НМРЛ A549 и DV-90. Среднее значение IC50 составило 3,3±2,1мкМ. В клетках чувствительных линий добавление соединений-4 и -5 приводило к значимому уменьшению уровня экспрессии от одного до трех генов (из числа AKT1, BIK, GPX4, TSPAN1 и SLC37A2); добавление соединения-6 приводило к значимому увеличению уровня экспрессии генов BAX и(или) PUMA. • В ходе НИР было Протестировано цитотоксическое действие соединений 1-6 в сочетании соединениями Natlin-3, tenovin-6 или PRIMA-1 на линиях клеток резистентных к действию 55 Natlin-3, tenovin-6 и PRIMA-1, соответственно. Соединение-1 для линии DV-90 уменьшало IC50 Nutlin-3 с 12,9±3.6мкМ до 8.6 ±2.3 мк/мл. Соединение-4 для линии A549 уменьшало IC50 Nutlin-3 с 31,2 до 15,4мкМ и IC50 tenovin-6 с 16.8 до 7.1. Для линии Н2228 соединение-4 уменьшало IC50 Nutlin-3 с 33,1 до 16,6мкМ. Соединение -5 для линии А549 уменьшало IC50 Nutlin-3 с 31,2 до 12.3мкМ и IC50 tenovin-6 с 16.8 до 8мкМ. • В ходе НИР были обобщены полученные результаты и установлено, что наиболее успешной комбинацией является комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ). В ходе выполнения НИР все поставленные задачи были выполнены в срок и в полном объеме. Рекомендации по конкретному использованию полученных результатов. Полученные в ходе проекта результаты могут быть использованы в фармакологии при разработке новых лекарственных препаратов. Так, комбинация [соединение-4 & Nutlin-3] может быть взята за основу при разработке нового композиционного препарата для терапии случаев немелкоклеточного рака легких с геном TP53д дикого типа. Препарат, включающий комбинацию [соединение-4 & Nutlin-3] обещает быть более эффективным, чем исходный препарат Nutlin-3. Разработка новых лекарственных средств для терапии онкологических заболеваний тесно связана с задачей определения клеточных молекул-мишеней для новых противопухолевых препаратов. По своей сути такие молекулы-мишени являются регуляторными элементами клеточных сигнальных путей, активность которых определяет злокачественный фенотип раковых клеток. Разработанная в ходе НИР база данных, включающая в себя перечень и описание генов опухолевых клеток, уровень экспрессии которых изменился после инкубации с перспективными препаратами из класса малых молекул может, быть полезна при определении молекул-мишеней для новых лекарственных препаратов. Кроме того ресурсы базы данных могут быть использованы для прогнозирования молекулярных механизмов обуславливающих резистентность опухолевых клеток к действию перспективных соединений из класса малых молекул. Оценка научно технического уровня НИР. Тема исследований, разработанная в ходе НИР, отражает ведущие мировые тенденции, что отражается статистикой мировых публикаций. Полученные при проведении НИР результаты соответствуют мировому уровню, что подтверждается наличием публикаций по результатам НИР (трех публикаций в зарубежных и одной – в отечественном журнале). 56 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Rahmani M. Dual inhibition of Bcl-2 and Bcl- xL strikingly enhances PI3K inhibition- induced apoptosis in human myeloid leukemia cells through a GSK3- and Bim-dependent mechanism / Rahmani M [ и др.] // Cancer Res. - 2013. - № 73(4) - C. 1340-51 2. Dehm SM. SRC gene expression in human cancer: the role of transcriptional activation / Dehm SM [ и др.] // Biochem. Cell Biol. - 2004. - № 82 (2) - С. 263-74 3. Anoopkumar-Dukie S. Resazurin assay of radiation response in cultured cells / S. Anoopkumar- Dukie [ и др.] // The British Journal of Radiology. - 2005. - № 78 - С. 945-947 4. Finney D. J. Probit Analysis / D. J. Finney. - Cambridge.: Cambridge Un. Press, 1987. - 333 c. 5. Creighton CJ. A gene transcription signature of the Akt/mTOR pathway in clinical breast tumors Creighton CJ // Oncogene, - 2007. - № 26 - Сю 4648-4655 6. Ottenhoff-Kalff AE. Characterization of protein tyrosine kinases from human breast cancer: involvement of the c-src oncogene product / Ottenhoff-Kalff AE [ и др.] // Cancer Res. - 1992. - № 52 (17) - С. 4773-8 7. Vassilev L. T. In vivo activation of the p53 pathway by small- molecule antagonists of MDM2 / L. T. Vassilev [ и др.] // Science. - 2004. - Т. 387, № 5659. - С. 844-848 8. Kojima K. MDM2 antagonists induce p53-dependent apoptosis in AML: implications for leukemia therapy / K. Kojima [ и др.] // Blood. - 2005. - № 106 - С. 3150-3159 9. Secchiero P. The MDM2 inhibitor Nutlins as an innovative therapeutic tool for the treatment of haematological malignancies / P. Secchiero [ и др.] // Curr. Pharm. Des. - 2008. - № 14 - С. 2100-2110 10. Grasberger B. L. Discovery and cocrystal structure of benzodiazepinedione HDM2 antagonists that activate p53 in cells / B. L. Grasberger [ и др.] J Med Chem. - 2005. - № 48 - С. 909-912 11. Ding K. Structure-based design of spiro-oxindoles as potent, specific small- molecule inhibitors of the MDM2-p53 interaction / K. Ding [ и др.] // J Med Chem. - 2006. - № 49 - С. 3432-3435 12. Luo J. Acetylation of p53 augments its site-specific DNA binding both in vitro and in vivo / J. Luo [ и др.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - № 101 - С.2259-2264 13. Sonia L. Discovery, in vivo activity, and mechanism of action of a small- molecule p53 activator / L. Sonia [ и др.] // Cancer Cell. - 2008. - Т. 13, № 5-2 - С. 454-463 14. Jeremy M. R. PRIMA-1 reactivates rutant p53 / M. R. Jeremy [ и др.] // Cancer Cell. - 2009. - № 15 - С. 376-388 57 ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное) Состав комбинации соединений, наиболее эффективно индуцирующей апопотоз клеток опухоли В ходе работы по проекту были идентифицированы соединения, синергично усиливающие противоопухолевую активность известных препаратов реактивирующих р53 (Natlin-3, tenovin-6, PRIMA-1). К числу таких соединений относятся: 1) Соединение-3 (ингибитор комплекса циклин Е/CDK2), в концентрации 50мкМ показало способность незначительно увеличивать цитотоксическое действие Nutlin-3 на линию DV-90 (IC50 для Nutlin-3 в комплексе с соединением-3 уменьшалось с 12,9мкМ до 8.6 мкМ, р<0.05). 2) Соединение-4 (ингибитор src-киназ), в концентрации 2.6нМ увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 на линии A549 и H2228 (IC50 для Nutlin-3 в комплексе с соединением-4 уменьшалось с 31,2 до 15,4мкМ – для клеток линии А549 и с 33,1 до 16,6мкМ – для клеток линии Н2228, р<0.05). Также соединение-4 в концентрации 2.6нМ увеличивало цитотоксическое действие tenovin-6 на линию A549 (IC50 для tenovin-6 в комплексе с соединением-4 уменьшалось с 16,8 до 7,1мкМ, р<0.05). Соединение-4 в концентрации 2.6нМ увеличивало цитотоксическое действие PRIMA-1 на линию A427 (для PRIMA-1 в комплексе с соединением-4 наблюдалось цитотоксическое действие с IC50 = 51,2, в то время как действие только PRIMA-1 на клетки Ф427 не сопровождалось гибелью или снижением пролиферации клеток). 3) Соединение-6 (ингибитор BCL-XL), в концентрации 3,3мкМ увеличивало цитотоксическое действие Nutlin-3 и tenovin-6 на линию A549 (IC50 для Nutlin-3 в комплексе с соединением-4 уменьшалось с 31,2 до 12,3мкМ, а для tenovin-6 – с 16,8 до 8мкМ, р<0.05). Подытоживая полученные результаты, можно сделать вывод, что наиболее эффективной является комбинация, состоящая из соединения-4 (в концентрации 2.6нМ) и Nullin-3 (в концентрации 16-30мкМ). 58 ПРИЛОЖЕНИЕ Б (обязательное) Метод увеличения противоопухолевой активности перспективных препаратов из класса малых молекул Увеличение противоопухолевой активности перспективного препарата из класса малых молекул – Nutlin-3 достигается за счет его комбинации с тестовым соединением-4. Механизм противоопухолевого действия Natlin-3 заключается в восстановлении активности р53 в клетке. Это достигается за счет ингибирования взаимодействия р53 с белком Mdm2. Разрушение комплекса Mdm2-р53 способствует стабилизации р53, накоплению его в клетке и активированию его транскрипционной активности, что в свою очередь приводит к остановке пролиферации и (или) гибели опухолевых клеток. Способ увеличения противоопухолевой активности Nutlin-3 заключается в дополнительном подавлении в опухолевых клетках сигнальных путей жизнеспособности и пролиферации за счет ингибирования src-киназ соединением-4. 59 ПРИЛОЖЕНИЕ В (обязательное) Протокол использования исследованных в ходе НИР химических соединений в комплексе с известными противоопухолевыми препаратами для увеличения их проапоптотической активности При использовании комбинации [соединение-4 & Nutlin-3] необходимо определить цитотоксическую концентрацию Nutlin-3 в комбинации соединением-4 для конкретной линии клеток немелкоклеточного рака легких. Для этого соединение-4 (Cayman Chemical Lot № 13338) и Nutlin-4± (Cayman Chemical Lot № 10004372) растворяют в DMSO (MP Biomedicals, Lot № 5573J) в концентрации 10мМ. Для тестирования соединений клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, высевают в лунки 24-луночного планшета по 60 тыс. клеток на лунку. Клетки культивируют в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, 0.03% глутамина и канамицин в концентрации 100 мкг/мл, при 37˚С и 5%-ном содержании СО2 в атмосфере. Через 24 часа культуральную среду заменяют на свежую, содержащую соединение-4 в концентрации 2,6нМ и Nutlin-3 в концентрациях 30мкМ, 15мкМ, 7,5мкМ, 3,75мкМ, 1,8мкМ и 0мкМ (контроль). Каждая точка должна быть представлена в тройном повторе. Через 48 часов после добавления химиопрепарата определяют процент жизнеспособных клеток при помощи теста на жизнеспособность с резазурином. Результаты теста с резазурином оцениваются при помощи калибровочнго графика изменения флуоресценции в зависимости от числа клеток. Для построения калибровочной кривой клетки НМРЛ необходимо посеять в 24-луночный планшет. При этом в две лунки сеют по 200 тыс. клеток, в следующие две лунки – в 2 раза меньше (100 тыс. клеток), в следующие две лунки – еще в 2 раза меньше (50 тыс. клеток) и т.д. Всего шесть точек с двукратным серийным разведением плотности культуры калибровочного графика должны (каждая точка в повторе). Клетки для построения высеваться и анализироваться одновременно с тестируемой культурой клеток. По результатм теста с резазурином определяют значения цитотоксической концентрации IC50 и IC10 – концентрации Nutlin-3, при которой для 50% и 10% клеток в культуре наблюдается ограничение деления. 60
