препараты нормофлоры - Иркутский государственный
advertisement
ГОУ ВПО ИГМУ РОСЗДРАВА Кафедра технологии лекарственных форм Т.П. Зюбр, И.А. Мурашкина, И.Б. Васильев ПРЕПАРАТЫ НОРМОФЛОРЫ Учебно-методическое пособие Иркутск, 2008 Пособие подготовлено зав. кафедрой технологии лекарственных форм ИГМУ, доцентом Зюбр Т.П., ассистентом, кандидатом фармацевтических наук Мурашкиной И.А., ассистентом кандидатом фармацевтических наук Васильевым И.Б. Пособие предназначено для самостоятельной работы студентов 5 курса фармацевтического факультета очной и заочной форм обучения в соответствии с программой по биотехнологии для фармацевтических вузов и факультетов по специальности 040500 – Фармация. Рецензенты: доцент кафедры микробиологии ГОУ ВПО Иркутский государственный университет, кандидат биологических наук Макарова А.Н., заведующий кафедрой Фармации ГОУ ДПО Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Росздрава, доктор фармацевтических наук, профессор Ковальская Г.Н. Утверждено на заседании ФМС фармацевтического факультета ГОУ ВПО ИГМУ Росздрава, протокол № 5 от 31.10.2008 г. 2 Содержание Введение.......................................................................................................................4 1. Общие представления о нормальной микрофлоре и ее функциях .............4 2. Краткая характеристика отдельных представителей нормофлоры ........14 5. Сравнительная характеристика различных штаммов бифидобактерий 32 6. Современные средства коррекции микробиоценоза ...................................38 6. Производство препаратов нормофлоры .........................................................48 Тесты ..........................................................................................................................52 Ответы на тесты ......................................................................................................55 Список литературы.................................................................................................56 Приложения ..............................................................................................................57 3 Введение Постоянное влияние неблагоприятных техно-, био- и социогенных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности микроэкологической системы человека, характеризует современные условия жизнедеятельности детского и взрослого населения нашей страны и негативным образом отражается на состоянии его здоровья. Вызываемые ими и широко распространенные среди всех возрастных групп нарушения микробиоценоза играют значительную роль в патогенезе различных заболеваний, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиотических состояний как общемедицинскую. Основой биотехнологических процессов является культивирование микроорганизмов, предусматривающее получение максимального количества биомассы, а также продуктов ее жизнедеятельности. При накоплении биомассы основным показателем культивирования является интенсивность роста и размножения микроорганизмов. Для реализации процесса культивирования производство должно располагать штаммом-продуцентом, сырьем для приготовления питательных сред, оборудованием для культивирования, выделения и очистки целевого продукта. Таким образом, первоочередной задачей для отечественного производства пробиотиков, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов человека, является выпуск конкурентоспособных препаратов, не уступающих по своим потребительским свойствам импортным аналогам, которые доминируют в настоящее время на российском фармацевтическом рынке. Это положение диктует необходимость интенсивного развития ряда направлений прикладных исследований, в том числе по расширению номенклатуры выпускаемых лекарственных форм пробиотиков, оптимизации и унификации их технологии. 1. Общие представления о нормальной микрофлоре и ее функциях Микрофлора человека составляет основу его микроэкологии. Организм человека населяют примерно 500 видов бактерий, не считая вирусов, простейших, а также грибов. Нормальную микрофлору принято рассматривать как совокупность микробиоценозов различных частей тела, контактирующих с внешней средой. Совокупность микробиоценозов обозначается как нормобиоценоз или эубиоз. Для здорового человека характерно состояние равновесия микроэкологии организма. Микроэкология – более полное название, поскольку включает в себя данные не только по качественному и количественному равновесию микроорганизмов, но и их биохимическому, метаболическому и иммунологическому состоянию. В организме человека проживает 1014 бактерий, т.е. бактериальных клеток значительно больше, чем клеток самого организма. Они составляют своеобразный «экстракорпоральный» (хорошо организованный) орган. Этот «орган», как и любой орган человека. Имеет свои функции, критерии, показатели функционального состояния, т.е. нормы и отклонения от неё. Велика защитная роль нормофлоры в обеспечении здоровья, поэтому нарушение равновесия между отдельными видами микроорганизмов в местах их постоянного обитания за счёт более интенсивного размножения или гибели какого-либо вида может повлечь нарушение гомеостаза с соответствующими последствиями патологического характера. Дисбиотические состояния приводят к изменениям количественного и качественного состава нормофлоры человека. Микроорганизмы индигенные (постоянные) и транзиторные (случайные), с которыми человек встречается в течение жизни, можно условно разделить на 4 группы: 1) микроорганизмы, не способные к длительному пребыванию в организме человека, нахождение которых в нём носит случайный характер; 2) постоянные представители микрофлоры, приносящие несомненную пользу (бифидо-, лакто- и колибактерии); 3) условно-патогенные представители нормофлоры, которые при определённых условиях могут стать патогенными (стафилококки) 4) микроорганизмы - возбудители инфекционных заболеваний. Нормальная микрофлора человека представлена совокупностью микробных биоценозов, встречающихся в организме здорового человека. При этом микрофлора экониш слизистых отличается не только по качественному, но и количественному составу. Это микрофлора кожи, слизистой верхних дыхательных путей, слизистой урогенитального тракта женщин, желудочно-кишечного тракта. Состав нормальной микрофлоры человека представлен в таблице № 1. Таблица 1 Состав нормальной микрофлоры человека Частота встречаемости Микроорганизмы Аэробные микроорганизмы Грамположительные кокки: Micrococcus spp. Staphylococcus spp. S. aureus S. coagulase Streptococcus spp. Str. Pneumoniae Str. Pyogenes Str. «Viridans» group кожа верхние дыхательные пути влагалище наружные половые органы передняя уретра + + + +++ +++ ++ + +++ ++ +++ ++ ++ + ++ ++ +++ +++ ++ ++ толстый кишечник ++ + + 5 Aerococcus viridans Enterococcus spp. Stomatococcus spp. Грамположительные бациллы: Bacillus spp. Corynebacterium spp. Arcanobacterium spp. Грамотрицательные кокки: Neisseria spp. Moraxella catarrhalis Грамотрицательные бациллы: Burkholderia cepacia Haemophilus spp. Helicobacter spp. Actinobacillus spp. Acinetobacter spp. Cardiobacterium spp. Capnocytophaga spp. Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Аэробные микроорганизмы Грамположительные кокки: Peptostreptococcus spp. + ++ ++ ++ +++ ++ + +++ + +++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ + + + +++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ + +++ + ++ +++ +++ 6 ++ + +++ Грамположительные бациллы: Actinomyces spp. Clostridium spp. Eubacterium spp. Propionibacterium spp. Bifidobacterium spp. Lactobacillus spp. Грамотрицательные кокки: Veillonella spp. Грамотрицательные бациллы: Bacteroides spp. Fusobacterium Leptotrichia buccalis Porphyromonas spp. Prevotella spp. Грибы и дрожжеподобные организмы Candida spp. Torulopsis Treponema spp. Mycoplasma spp. Ureoplasma +++ +++ +++ ++ ++ ++ + ++ + + ++ + +++ + +++ + +++ + +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Примечание: (+++) – обычно присутствуют; (++) – выделяются часто; (+) – выделяются редко. Микрофлора кожи Кожа и слизистые в организме являются основными физиологическими барьерами на пути микробного проникновения, при этом площадь слизистых составляет 200-300 кожи - 2-3 м2. Здоровая кожа является мощным барьером для проникновения патогенных микроорганизмов. Факторы, определяющие барьерно-защитные функции кожи, следующие: 7 1. механические - роговой слой (кератин) - стоек к механическим, химическим и физическим воздействиям; 2. иммунологические - лимфоэпитальные образования кожи имеют аналогичную структуру с тимусом и другими организмами иммуногенеза (лёгкие, кишечник, миндалины). В коже имеются все элементы для осуществления иммунных реакций (тучные клетки, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы). В эпидермисе функции микрофагов выполняют клетки Лангерганса; 3. факторы неспецифической защиты - экстацеллюлярные (комплемент) и интрацеллюлярные (интерферон, лизоцим, жирные кислоты) бактерицидная система кожи; 4.физико-химические - секрет потовых и сальных желез обладает противомикробной активностью путём создания кислой среды из-за содержащихся в нём жирных кислот («кислая мантия кожи») с рН 4,2 - 5,6; пот за счёт наличия в нём солей создаёт высокое осмотическое давление; 5. электростатические - роговой слой кожи, так же как микроорганизмы, имеет отрицательный заряд. В подобных условиях способны выжить в основном грамположительные микроорганизмы, имеющие более мощную клеточную стенку. В основном это различные виды эпидермального стафилококка, коринебактерий и т.д. Данные микроорганизмы, в свою очередь, обладают антагонистической активностью за счёт выработки молочной и пропионовой кислот, помогающих поддерживать кислую реакцию и бактериоцинов, ингибирующих прочие микроорганизмы. Микрофлора слизистой верхних дыхательных путей Верхние дыхательные пути, включая ротовую и носовую полости, носоглотку и гортань, содержат различные микробные ассоциации. Микрофлора ротовой полости представлена многочисленными видами, так как здесь имеются благоприятные условия для развития микроорганизмов (влажность, постоянная температура, остатки пищи и т.д.). Основными параметрами, характеризующими микробиоценоз полости рта, являются: во-первых, его необычайная гетерогенность в смысле составляющих таксономических групп, а во-вторых, наличие динамического равновесия авирулетных и патогенизированных стадий (форм) одних и тех же видов, взаимодействие которых с иммунными и защитными механизмами обеспечивает стабильность симбиоза макроорганизмом. Микрофлора урогенитального тракта у женщин Микробиоценоз влагалища - это среда с определённой популяцией микрофлоры. Её состав индивидуален и относительно постоянен, несмотря на влияние многочисленных факторов, оказывающих временное воздействие на микрофлору, но не вызывающих существенных изменений в биоценозе, и определяется разнообразием взаимоотношений видов микробов, их антагонизмом и синергизмом. 8 Становление микробиоценоза влагалища происходит с момента рождения девочки к 16-18 годам через ряд промежуточных этапов, связанных с созреванием гипоталамо-гипофизарных структур и изменением гормональных влияний. Видовой и количественный состав аутофлоры регулируется иммунной и эндокринной системами и зависит от их состояния. Так у девочек до момента менархе и женщин менопаузального и постменопаузального возраста лактобациллы практически отсутствует, а преобладают бифидобактерии. У здоровых женщин репродуктивного возраста (с 16-18 до 45-50 лет) вагинальная жидкость содержит 10-10 микроорганизмов в 1 мл. Этой жидкости не должно быть более 2 мл. У 100% женщин фертильного возраста 90-98% микроорганизмов представлено лактобациллами. Видовой состав лактобактерий разнообразен и насчитывает около 10 преимущественно облигатно анаэробных видов. Главные их представители - L. acidophylus и L.fennentum. В настоящее время установлено, что лактобациллы здоровых женщин доминируют не только во влагалище, но и в дистальных отделах уретры, предохраняя мочевыделительный тракт от уропатогенных бактерий. Только 2-10% всей микрофлоры влагалища приходится на другие микроорганизмы, которых может насчитываться 20 и более видов у одной женщины. Их наиболее часто выделяемыми представителями являются облигатно и факультативно анаэробные бактерии: бифидобактерии, пептострептококки, мобилонкус, бактероиды, гарднереллы, коринебактерии, стрептококки, грибы рода Candida, спорообразующие анаэробы-клостридии. Gardnerella vaginalis - это обычный обитатель влагалища, обнаруживаемый у 30-40% здоровых женщин. Взаимодействие аутофлоры с патогенными микроорганизмами играет важную защитную роль при инфекционно- воспалительных процессах половых органах. В количественном отношении анаэробные микроорганизмы преобладают над анаэробными и факультативно-анаэробными. Соотношение анаэробов и аэробов в течение менструального цикла колеблется и составляет 2:1; 5:1; 10:1 в фоликулиновую, овуляторную и секреторную фазы соответственно. Микрофлора желудочно-кишечного тракта Видовой состав микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте разнообразен (таблица 1). Микробиоценозы различных отделов пищеварительной трубки отличаются друг от друга по качественному и количественному составу и месту обитания. Микрофлору желудочно-кишечного тракта делят на просветную (П) и мукозную (М) микрофлору. П-микрофлору составляют микробы, локализующиеся в просвете кишечника. В качественном отношении микрофлора испражнений сходна с микрофлорой толстой кишки. М-микрофлору составляют микробы, тесно ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника и образующие плотный бактериальный дерн. Однако это деление является относительным, так как эпителиальный покров толстой 9 кишки обновляется достаточно быстро и постоянно, поэтому микроорганизмы, колонизирующие слизистую кишечника, постоянно попадают в просвет кишки. Микрофлора ротовой полости и пищевода Микрофлора ротовой полости представлена многочисленными видами, так как здесь имеются благоприятные условия для развития микроорганизмов (влажность, постоянная температура, остатки пищи и т.д.). Аэробная и аэротолерантная флора представлена лактобактериями (L. acidophilus, L. fermenti, L. casei и др.), кокковыми формами, среди которых наиболее типичные - Str. salivarius. К анаэробным микробам относят Veilonella alcalescens, Bacteroides melaninogenicus, Fusobacterium nucleatum. В ротовой полости в норме встречаются также коринебактерии, спирохеты и простейшие. Наличие фекальных стрептококков в ротовой полости большинство авторов рассматривают как дисбактериоз. Пищевод не имеет постоянной микрофлоры, и бактерии, которые здесь обнаруживаются, являются представителями микрофлоры полости рта. Микрофлора желудка Микрофлора желудка напрямую зависит от кислотности желудочного сока. При рН 3,0 в 1 мл желудочного содержимого обнаруживается 102-103 микроорганизмов, тогда как при рН>3,0 их количество превышает 105 КОЕ/мл. Наиболее часто обнаруживаются кислотоустойчивые грамположительные лактобациллы (Lactobacillus), стафилококки (Staphylococcus),стрептококки (Streptococcus), микрококки (Micrococcus), а также дрожжеподобные грибы рода Candida, располагающиеся на поверхности эпителиального пласта в толще желудочной слизи. Микрофлора тонкого кишечника По мере продвижения по кишечной трубке количество микроорганизмов возрастает, при этом за счет снижения парциального давления увеличивается количество анаэробных и аэротолерантных видов. В двенадцатиперстной, тощей и проксимальном отделе подвздошной кишки общее количество бактерий составляет 103-104 КОЕ/г, а видовой состав практически не отличается от такового в желудке. Важнейшей бактериологической характеристикой данного биотопа является полное отсутствие облигатно анаэробных и колиформных микроорганизмов. Имеющиеся микроорганизмы локализуются пристеночно, образуя пласт послойно адгезирующихся друг к другу и к рецепторам апикальных поверхностей эпителиоцитов крипт бактериальных клеток. Верхние отделы тонкой кишки по характеру микрофлоры близки к желудку, а в нижних отделах микрофлора ближе к микрофлоре толстой кишки. В тонкой кишке могут встречаться бифидобактерии, лактобактерии и фекальные стрептококки. В дистальном отделе подвздошной кишки к описанным выше микроорганизмам присоединяются грамотрицательная кишечная палочка (Е. coli), фа10 культативные анаэробные энтерококки. (Enterococcus) и облигатные анаэробные бактерии рода Bacteroides (бактероиды), Clostridium (клостридии), Veillonella (вейлонелла), Bifidobacterium (бифидобактерии). В проксимальном отделе микрофлора локализована в мукозном слое, в дистальном отделе подвздошной кишки, содержащей 106-107 микроорганизмов, начинает превалировать просветная микрофлора. Микрофлора толстого кишечника Огромное количество микроорганизмов находится в толстом кишечнике: 17 семейств, 45 родов и около 500 видов. Здесь микрофлора состоит из большого количества различных групп и видов бактерий, число которых колеблется от 400 до 500. На 1 г фекалий общее количество микроорганизмов может достигать 1012 КОЕ. По данным исследователей, до 30% сухой массы фекалий составляют микроорганизмы. При этом они в основном представлены анаэробами. Факультативные анаэробы перестраивают свой метаболизм на анаэробный путь дыхания. По-прежнему просветная микрофлора превалирует над пристеночной: если для подвздошной кишки показатель доминанты составляет 101103, то для ободочной 102- 106 КОЕ/мл. Количество микроорганизмов в дистальном направлении увеличивается от 108-109 в проксимальном отделе ободочной кишки до 1011-1012 в сигмовидной и прямой кишке. Максимальный уровень микроорганизмов в кишечной трубке ограничивается количеством рецепторов на эпителиальных клетках, к которым адсорбируются микроорганизмы. При благоприятных условиях существования нормальная микрофлора ЖКТ (табл.2) человека характеризуется относительным постоянством и мало зависит от характера питания человека. Причиной подобного постоянства является то, что формирование количественного и качественного состава нормофлоры регулируются сложными синергическими, антагонистическими и мутуалистическими отношениями между отдельными ее представителями и макроорганизмом, который оказывает влияние на микрофлору с помощью физиологических факторов (механических, химических, неспецифических и специфических факторов иммунитета). К механическим факторам относят перистальтику кишечника, мукопротеиновое покрытие на апикальных, латеральных мембранах эпителия, постоянное обновление эпителия желудочно-кишечного тракта и баугиниевой заслонки; к химическим - пепсин, соляную кислоту, трипсин, соки кишечника и желчные кислоты; к неспецифическим - лизоцим, интерферон, комплемент, лактоферрин. Специфическая иммунная защита обусловлена лимфоидным аппаратом кишечника, который включает в себя лимфоциты, локализующиеся в мезентеральных лимфоузлах, пейеровых бляшках, слоях стенки кишечника, и секреторным иммуноглобулином А. Количественные характеристики основных представителей нормофлоры достаточно постоянны, поэтому имеются критерии, по которым можно судить о состоянии микробиоценоза кишечника. За последние годы, когда проблеме дисбактериоза стали уделять существенное внимание в связи с его неблагоприятным действием на макроорганизм, появились работы, проводящие некоторые параллели между состоянием макроорганизма и количественными характери11 стиками населяющих его микробов, в связи с чем ужесточились и нормы содержания различных видов микроорганизмов в кишечнике. В табл. 3 и 4 дан анализ изменений: повысились нижние границы облигатных представителей нормофлоры и снизились границы содержания грибов рода Candida. Нормируются границы присутствия в кишечнике других микроорганизмов: лактобактерий, бактероидов, стафилококков и т.д. В табл. 3 представлены критерии, которыми до сих пор пользуются в ЛПУ, в табл. 4 - более новые, которыми предпочтительнее пользоваться при анализе микробиоценоза кишечника человека. Таблица 2 Классификация микрофлоры толстой кишки у человека Типы классификации Микрофлора 1 Облигатная Факультативная (менее 1%) 2 Анаэробы (95-99%), бифидобактерии, бактероиды, лактобактерии Аэробы (1 -5%) кишечная палочка, энтерококки Условно-патогенные энтеробактерии (цитробактер, энтеробактер, протей, клебсиелла, серрация, гафния, неферментирующие грамотрицательные палочки: псевдомонады, ацинетобактеры) Клостридии Стафилококки Дрожжеподобные грибы Индигенная, резидентная, постоянная, обязательная Транзисторная, случайная, временная 3 Главная Сопутствующая Остаточная Примечание. В таблице представлены различные классификации нормальной микрофлоры, которые отличаются по видовому составу микроорганизмов. 12 Таблица 3 Критерии нормы кишечной флоры (по Р.Б. Эпштейн-Литвак и Р.Л. Вильшанской, 1970 г.) Микрофлора 1. Бифидобактсрии 2. Общее количество E.coli 3. Кишечная палочка со слабовыраженными ферментативными свойствами 4. Лактозонегативные энтеробактерии 5. Кокковые формы в общей сумме бактерий 6. Гемолизирующий стафилококк по отношению ко всем кокковым формам, % 7. Энтерококки 8. Микробы рода протея 9. Грибы рода Candida 10. Патогенные микробы семейства кишечных 11. Гемолизирующая E.coli Норма 10-7 и выше 300-400 млн/ч До 10% До 5% До 25% 0% 10-4-10-6 0% 10-4 % 0% 0% Таблица 4 Критерии и нормы кишечной микрофлоры (В.М. Бондаренко и соавт., НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМП, 1998 г.) Наименование микроорганизмов КОЕ/г фекалий 1.Бифидобактерии 108-1010 2.Лактобактерий 106-1010 107-109 3.Бактероиды 106-108 4.Общее количество Е. coli 105-106 5.Пептококки и пептострептококки 6.Стафилококки (гемолитические, плазмокоагулирующие) Не более 103 7. Стафилококки (негемолитические, коагулазоотрицательные и другие) 104-105 109-10ю 8.Эубактерии 103-105 9. Клостридии 105-107 10. Стрептококки Не более 103 11. Дрожжеподобные грибы Не более 12. Условно-патогенные энтеробактерии и неферменти103-104 рующие грамотрицательные палочки Значительное количество микроорганизмов толстого кишечника определяет очень высокую метаболическую активность их, сравнимую с печенью. Микроорганизмы толстого кишечника существенно влияют на физиологию человека, что очевидно из рис. 1. 13 Рис. 1. Функции симбиотной микрофлоры 2. Краткая характеристика отдельных представителей нормофлоры Пробиотики - живые организмы и вещества микробного или иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, а также на биохимические и поведенческие реакции организма хозяина, оптимизируя его микробиологический статус. Симбионт - участник симбиоза - совместного проживания организмов разных видов в одной и той же экологической нише. Симбиоз многоклеточных организмов с одноклеточными - древнейшее явление в эволюции. Оно возникло в тот момент, когда появились многоклеточные организмы. Известно, что в соответствии с научными представлениями жизнь на Земле возникла около 3 - 4 млрд. лет назад в силу естественных причин. При этом первыми живыми существами были микроорганизмы. По некоторым данным их эволюция продолжалась около миллиарда лет. Именно за это время сформировалось все многообразие биохимических реакций, которые лежат в основе центрального метаболизма всех живых существ. Многоклеточные организмы возникли на основе одноклеточных в мировом океане (в одной и той же экологической нише) и симбиоз многоклеточных организмов с одноклеточными наблюдался с самого начала их возникновения. Известно, что в процессе эволюции у многоклеточных организмов сформировались механизмы, обеспечивающие переменчивость внутренней среды, и типы взаимодействия многоклеточных организмов с одноклеточными. На сегодня известны следующие формы: мутуализм взаимовыгодный симбиоз; паразитизм - один из партнеров получает одностороннюю выгоду за счет другого; комменсализм - один из партнеров получает одностороннюю выгоду, не нанося при этом никакого ущерба другому организму; нейтрализм - партнеры не оказывают заметного влияния один на другого. Все эти формы наблюдаются при рассмотрении симбиоза одноклеточных микроорганизмов с многоклеточными. Когда говорят конкретно о симбиозе че14 ловека с микроорганизмами, имеют в виду, что кожные покровы, слизистые оболочки и полости человеческого тела, сообщающиеся с внешней средой, заселены огромным количеством микроорганизмов - симбионтов. Несмотря на огромное позитивное влияние, которое оказывает облигатная микрофлора на состояние человека, необходимо отметить негативное влияние некоторых ее представителей, которое проявляется при нарушении баланса анаэробной и аэробной флоры. В результате этого происходит повышение колонизации различных отделов желудочно-кишечного тракта аэробной флорой и общее соотношение анаэробной и аэробной микрофлоры кишечника смещается в сторону аэробов. В результате возникают различные функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта, часто сопровождающиеся сенсибилизацией организма с клиническими проявлениями аллергического порядка, а также инфекционные процессы, особенно при попадании микроорганизмов в несвойственную им зону обитания. Ниже мы представим краткую характеристику представителей нормофлоры с указанием функций, приписываемых конкретному виду и возможных патогенных свойств. Облигатная микрофлора Бифидобактерии Бифидобактерии - анаэробные грамположительные полиморфные палочки, не образующие спор, неподвижные. В кишечнике человека бифидобактерии находятся как в просвете кишечника, так и в прочной ассоциативной связи со слизистой оболочкой кишечника, превалируя в слепой, восходящей и нисходящей ободочной кишке. Они являются одними из немногих микроорганизмов, патогенное действие которых на человека практически не выявлено. Это наиболее значимые представители облигатных бактерий в кишечнике детей и взрослых, сопровождающие человека всю его жизнь. Количество бифидобактерий колеблется от 90-98% всех микроорганизмов кишечника в зависимости от возраста и составляет у грудных детей 109-1010, у детей старшего возраста и взрослых-108-109. В секрете вагины бифидобактерии обнаруживаются в количестве 106 КОЕ/мл. Свойства бифидобактерий: адгезируясь на слизистой кишечника, осуществляют защитную функцию от проникновения условно-патогенных микроорганизмов и токсинов во внутреннюю среду организма; обладают высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам; участвуют в утилизации пищевых субстратов и активизации; пристеночного пищеварения; синтезируют аминокислоты и белки, витамин К, пантотеновую кислоту, витамины группы В (В1 , В2, В3, В6, В12); способствуют усилению процессов всасывания через стенки кишечника ионов кальция, железа, витамина D; обладают иммуномодулирующим действием: регулируют функции гуморального и клеточного иммунитета, препятствуют деградации секреторно15 го иммуноглобулина А, стимулируют интерферонообразование и вырабатывают лизоцим. Видовой состав бифидобактерий зависит от возраста и характера питания. На первом году жизни ребенка преобладают бифидобактерии, отличающиеся низкой ферментативной активностью в отношении углеводов (как правило, они в состоянии утилизировать только простые сахара или лактозу) - В. bifidum, В. parvulorum, В. breve, В. lactentis. С возрастом, когда в рацион питания ребенка, кроме молока, вводятся другие продукты питания, бифидофлора обогащается микроорганизмами, способными утилизировать большой спектр сахаров и размножаться даже в условиях безмолочного рациона - В. adolescentis, В. longum. Таким образом, спектр бифидобактерий у детей старшего возраста и взрослых представлен видами В. adolescentis, В. longum и В. bifidum. Лактобактерии Лактобактерии - грампозитивные неспорообразующие палочки, аэротолерантные. Область локализации в кишечнике - как просвет, так и слизистая. Кроме того, лактобактерии являются основной индигенной флорой вульвы и вагины. Лактобактерии в желудке обнаруживаются в количестве 102-103 КОЕ/мл, в тонкой кишке - до 103-104 КОЕ/мл, в толстой (в зависимости от возраста)- 106108 КОЕ/г (при этом колонизируют равномерно всю толстую кишку, кроме прямой). Свойства лактобактерий: в кооперации с другими микроорганизмами проявляют высокую антагонистическую активность по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам; иммуномодулирующее действие, в том числе стимуляция фагоцитарной активности нейтрофилов, макрофагов, синтеза секреторных иммуноглобулинов и образования интерферонов А и В, интерлейкина 1 и фактора некроза опухоли; в желудке и тонкой кишке лактобациллы в кооперации с организмом хозяина являются основным микробиологическим звеном формирования колонизационной резистентности; играют определенную роль в рециркуляции желчных кислот и холестерина. Вагинальные лактобактерии Из составляющих микробиоценоз влагалища наибольший интерес по своей значимости представляют лактобациллы (палочки Додерлейна) - грамположительные облигатно-анаэробные бактерии, содержащиеся в количестве 1061010 КОЕ/мл отделяемого (в зависимости от возраста). Основные свойства вагинальных лактобактерий: расщепляют гликоген, содержащийся в клетках многослойного плоского эпителия слизистой оболочки влагалища, до молочной кислоты и под16 держивают рН среды 3,8-4,5, обеспечивая оптимальные условия для своей жизнедеятельности и неблагоприятные - для условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Уровень гликогена в эпителиоцитах зависит от уровня эстрогенного фона, достигая максимума к 10-14-му дню менструального цикла и во время беременности во второй ее половине. В это время количество лактобацилл и бифидобактерий в микробиоценозе влагалища максимально; 93,3% лактобацилл являются перекисьобразующими и подавляют рост условно-патогенных и патогенных микробов. Лактобациллы выделяют вещества антибактериальной природы - бактериоцины, которые обладают бактериостатическим действием против условно-патогенных микроорганизмов; лактобациллы обладают липотейхоевой кислотой, которая обеспечивает их высокую адгезивную способность к поверхности эпителиальных клеток. Прикрепляясь к эпителиоцитам, лактобациллы покрывают стенки влагалища сплошным слоем и препятствуют адгезии к рецепторам эпителиоцитов других микробов, обеспечивая тем самым феномен колонизационной резистентности, причем эндогенные штаммы лактобактерий имеют селективные преимущества адгезивных свойств как перед условно-патогенными бактериями, так и перед экзогенными лактобациллами. Адгезивная способность большинства лактобацилл изменяется под воздействием половых гормонов. Существуют и такие лактобациллы, адгезивная способность которых не изменяется под влиянием гормонов, а адгезивность L. fermentum T-14 всегда повышается под воздействием всех гормонов; мурамилпептид клеточной мембраны лактобактерий способствует образованию секреторного иммуноглобулина А и лизоцима, активации макрофагов и накоплению фагоцитов, т. е. палочки Додерлейна повышают местный иммунитет, взаимодействуя с организмом хозяина. При нарушении аэробно-анаэробного баланса возможен повышенный рост лактобактерий с формированием патологического процесса. Имеется сообщения о случаях бактериального эндокардита с летальным исходом, цитолитического вагиноза и вагинального лактоациллеза, уретритов и стоматологической патологии, обусловленных лактобактериями. Энтеробактерии Энтеробактерии - аэробные представители нормальной микрофлоры кишечника человека. Типичные представители - грамотрицитальные неспорообразующие подвижные бактерии. В кишечнике содержатся в количестве 106-108 КОЕ/г фекальной массы, что составляет менее 0,01% от общего числа нормофлоры. Основные функции эшерихий в организме: способствуют гидролизу лактозы; участвуют в продукции витаминов (К и группы В); вырабатывают колицины - антибиотикоподобные вещества, тормозящие рост энтеропатогенных кишечных палочек; 17 стимулируют антителообразование и оказывают мощное иммуномодулирующее действие; способствуют активизации систем гуморального и местного иммунитета. Наряду с полезными свойствами многие штаммы эшерихий обладают патогенными свойствами, которые относят к энтеропатогенным штаммам Е. coli. В этой связи наибольший интерес представляют энтеротоксигенные кишечные палочки (ЭТГКП), энтерогеморрагические (ЭГКП), энтероинвазивные (ЭИК11) и ограниченно инвазивные кишечные палочки. Доля энтеропатогенных штаммов Е. coli в испражнениях здорового человека составляет от 9,1 до 32,4% от общего их числа. Наиболее патогенными являются энтероинвазивные кишечные палочки, размножение которых в кишечном эпителии протекает с выраженными цитоплазматическими изменениями, образованием язв с резко выраженным воспалением. Многие госпитальные штаммы энтеропатогенных кишечных палочек обладают резистентностью к антибиотикам. Попадая в результате транслокации в несвойственные им экологические ниши, Е. coli могут вызывать различные парентеральные заболевания (отиты, риниты, бронхиты, пневмонии, урогенитальные воспалительные процессы, быть причиной септицемии. Бактероиды Бактероиды - облигатно-анаэробные грамотрицательные палочки, не образующие спор. Содержатся в толстом кишечнике в количестве 107-1011 КОЕ/г. Обитают как в просвете, так и на слизистой оболочке кишки. Функции бактероидов до конца не выяснены, однако известно, что они, находясь в ассоциативной связи со слизистой оболочкой кишечника, вступают в конфликт с фагоцитами, что позволяет впоследствии лимфоцитам воспринимать антигенное раздражение, а также принимают участие в пищеварении, расщепляют желчные кислоты, участвуют в процессах липидного обмена. Многие представители рода Bacteroides обладают патогенными свойствами и при нарушении аэробно-анаэробного баланса или попадании в другие локусы могут вызывать эндогенные инфекции, септицемии, абдоминальные абсцессы, абсцессы брюшной полости, легких и мозга, воспалительные заболевания тазовой области и т.д. Существенную роль бактероиды играют в образовании некоторых канцерогенов. Энтерококки Энтерококки - аэробные представители нормальной микрофлоры человека. Заселяют кишечник новорожденного с первых дней жизни и в небольшом количестве (105-106 КОЕ/г) сопровождают человека всю его жизнь. При смене экологической ниши энтерококки способны вызывать ряд заболеваний. Они встречаются при септических процессах, инфекциях брюшной полости, менингитах, отитах, циститах и других воспалительных процессах урогенитального тракта. 18 Пропионовокислые микроорганизмы Пропионовокислые микроорганизмы - анаэробные бактерии, которые наряду с бифидо- и лактобактериями составляют группу нормальных кислотообразователей. Пропионобактерии реализуют свои антагонистические свойства посредством закисления среды. Известно, что некоторые из них проявляют патогенные свойства: P. acnes, например, является возбудителем инфицированной угревой сыпи у подростков. Пептострептококки Пептострептококки - неферментирующие грамположительные анаэробные стрептококки. В микрофлоре здоровых взрослых людей достигают уровня 109 КОЕ/г фекалий. В процессе жизнедеятельности обробразуют водород, который в кишечнике превращается в перекись водорода; участвует в протеолизе молочных белков, ферментации углеводов. При смене экологических ниш пептострептококки становятся причиной восполительных процессов в ротовой полости (кариес, гингивиты, пародонтозы), при гинекологических заболеваниях, абсцессах при оперативных вмешательствах. Фузобактерии, эубактерии, катенобактерии Фузобактерии, эубактерии, катенобактерии - представители анаэробной микрофлоры толстой кишки. Их значение в микробиоценозе изучено недостаточно, однако известно, что все они проявляют патогенные свойства при нарушении микробиоценоза кишечника и попадании в другие биотопы. Факультативная, условно-патогенная микрофлора Условно-патогенные энтеробактерии К условно-патогенным энтеробактериям относятся: цитробактер, энтеробактер, протей, клебсиелла, серрация, гафния, не ферментирующие грамотрицательные палочки: псевдомонады, ацинетобактеры, которые являются близкими родственниками кишечной палочки и представляют собой аэробные грамотрицательные палочки, не образующие спор. При определенных ситуациях, связанных с нарушениями в облигатной флоре, могут реализовать свои патогенные свойства с развитием диарейных и других синдромов. Бациллы Бациллы могут быть представлены аэробными (Bacillus) и анаэробными (Clostridium) видами. Наибольший интерес представляют С. difficile, содержащиеся в кишечнике в количестве не более 103 КОЕ/г. 19 Клостридии расщепляют белки с образованием скатола и индола. В маленькой концентрации эти токсичные метаболиты стимулируют перистальтику кишечника, являясь одним из звеньев регуляции кишечных функций. При значительном увеличении количества бацилл в кишечнике или в случае их размножения в несвойственных для них нишах в организме могут развиваться гнойно-септические заболевания различной локализации. Дрожжи и дрожжеподобные грибы В норме содержание дрожжеподобных грибов не должно превышать 104 КОЕ/г фекалий. Однако в конкретных случаях обнаружение дрожжеподобных грибов у больных группы риска (малолетние дети, люди со сниженной иммунной резистентностью) даже в небольшой концентрации должно сопровождаться клиническим обследованием с целью исключения кандидозов любой локализации. Грибы рода Candida способны вызывать как локальное усиление бродильных процессов в кишечнике, так и различные кандидозы (молочницу, стоматит, вульвовагинит, уретрит и т.д. вплоть до кандидозного сепсиса). В патологии иммунодефицитных состояний большое значение имеют криптококки. Плесневые грибы не должны встречаться в кишечнике. Наличие же некоторых из них, например аспергиллов, связывают с аллергизацией организма. В целом повышенный рост грибов связывают с нарушением в иммунологическом аспекте САИР, поэтому в случае высева грибов или значительного количества дрожжеподобных грибов у больного необходимо проводить исследование и коррекцию иммунитета. Стафилококки Стафилококки встречаются в кишечнике человека с первых дней жизни в концентрации 103-104 КОЕ/г. Это аэробные грамположительные кокки. Чаще всего определяется непатогенный вид Staphylococcus epidermidis. Патогенные виды стрептококков вызывают формирование патологических процессов при снижении резистентности макроорганизма. Эти микроорганизмы могут быть причиной воспалительных заболеваний, септических процессов, пищевых отравлений. Развитие стафилококковых инфекций возможно и в случае передачи их от здоровых носителей людям с иммунодефицитом. 3. Функции нормальной микрофлоры кишечника а) Обеспечение колонизационной резистентности. Под колонизационной резистентностью пони мают совокупность механизмов, придающих стабильность нормальной микрофлоре и предотвращающих заселение организма хозяина посторонними микроорганизмами. Она обеспечивается целым рядом факторов, среди которых: конкуренция с экзогенными микроорганизмами за рецепторы связывания и факторы питания; комплекс факторов антагонистической активности; 20 адгезивные свойства различных представителей нормофлоры. б) Участие в процессах пищеварения и всасывания. Микробы нормофлоры усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, растворяют клетчатку, стимулируют перистальтику кишечника, принимают участие в печеночно-кишечной циркуляции желчных кислот и холестерина, препятствуют образованию скатола, индола и сероводорода. Нормофлора способствует всасыванию и участвует в синтезе витаминов группы В, витамина К, фолиевой и никотиновой кислот, способствует синтезу незаменимых аминокислот, участвует в адсорбции в кишечнике солей железа, кальция, витамина D, следовательно, обладает антианемическими и антирахитическими свойствами. в) Участие в детоксикации ксенобиотиков. Микроорганизмы нормофлоры являются естественным сорбентом и участвуют в детоксикации ксенобиотиков. г) Антиаллергическое действие. Метаболиты бифидо- и лактобактерий препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и тем самым повышению количества гистамина, т.е. обладают антиаллергическим действием. д) Иммуномоделирующее действие. Бактериальные модулины бифидо- и лактобактерий стимулируют лимфоидный аппарат: синтез иммуноглобулинов, интерферона, цитокинов, увеличивают уровень пропердина и ком плементов, повышают активность лизоцима и способствуют уменьшению проницаемости сосудистых тканевых барьеров для токсичных продуктов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, препятствуют транслокации бактерий во внутренние органы и кровь. и) Участие в процессах синтеза. Анаэробные бактерии вырабатывают биологически активные вещества, такие как (3-аланин, 5-аминовалериановая и у-аминомасляная кислоты, а также медиаторы, влияющие на функцию желудочно-кишечного тракта, печени, сердечно-сосудистой системы, кроветворения, обменные процессы и т.д. к) Выделительная функция. Микрофлора кишечника поддерживает нормальное строение слизистой оболочки кишечника и адекватную моторику, содействует дефекации. Механизмы, определяющие антагонистическую активность нормофлоры Результаты, которые обнаруживаются при применении пробиотиков в комплексном лечении различных заболеваний, побуждают исследователей взяться за расшифровку механизма действия отдельных представителей микро21 биоценоза, и впереди нас ждут результаты исследований в отношении антагонистической активности и влияния на макроорганизм и бифидобактерий, и бактероидов, и других микроорганизмов. Но уже сейчас можно сказать о том, что оптимальная работа нормофлоры проявляется только в симбиозе всех ее представителей. Кислотообразующая активность Основным продуктом метаболизма активных кислотообразователей лактобактерий - является молочная кислота. Ранее считалось, что только снижение рН кишечного содержимого за счет присутствия молочной кислоты обеспечивает ингибирование патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Однако позднее было показано, что наличие только молочной кислоты не дает ожидаемого эффекта. Антимикробная активность зависит не столько от величины рН, сколько от совместного присутствия молочной, уксусной и пропионовой кислот, вырабатываемых различными микроорганизмами (лактои бифидобактериями). Синергизм такого сочетания обеспечивает ингибирование не только бактериальных культур (сальмонеллы, клостридии, эшерихии), но и некоторых видов дрожжей. При этом практически не затрагивается кислотоустойчивая нормофлора. Установлено, что композиция молочной, уксусной, летучих жирных кислот и пропионовой различается по отделам кишечника. В тонком кишечнике в основном содержатся молочная и уксусная кислоты, которые синтезируются содержащимися там лактобактериями. В толстом расширяется спектр микроорганизмов нормофлоры и в основном доминируют пропионовая, бутировая, масляная и летучие жирные кислоты. Другим продуктом метаболизма гетероферментативных видов лактобактерий является СО2, который способствует поддержанию анаэробных условий и выступает в роли акцептора водорода при биосинтезе некоторыми микроорганизмами ацетата из гексозы. Особое место среди метаболитов лактобактерий занимает перекись водорода. В бактериальной клетке перекись водорода вступает в реакцию с тиоционатом, в результате чего образуется токсичный гипотиоционат. Перекись водорода имеет выраженный антагонистический эффект при воздействии на аэробные кишечные палочки, стафилококки и псевдомонады. В кишечнике перекись водорода активизирует потенциальный антибактериальный эффект лактопероксидазной системы (ЛПС) молока и молозива. ЛПС включает в себя лактопероксидазу, ферменты, их ассоциации и компоненты, перекись водорода, тиоцинат и проявляет вариабельное воздействие на микрофлору. Грамположительные микроорганизмы устойчивы к действию ЛПС, грамотрицательные (энтеробактерии, сальмонелла, псевдомонады и т.д.) - весьма чувствительны. Некоторые виды лактобацилл продуцируют диацетил. В комплексе с другими продуктами метаболизма это вещество способно ингибировать рост таких «долгоживущих» микроорганизмов, как М. tuberculosis. Биологический эффект 22 диацетила в сочетании с низким значением рН способствует снижению скорости роста представителей семейства кишечной палочки. Продукция бактериоцинов представителями нормофлоры Наиболее значимыми для реализации антагонистической активности считаются бактериоцины и бактериоциноподобные вещества, продуцируемые бифидо- и лактобактериями, стрептококками и другими представителями нормофлоры. По физико-химическим характеристикам бактериоцины - низкомолекулярные белки, которые фиксируются на специфических клеточных рецепторах большинства бактериальных клеток. Механизм их действия широк и напоминает таковой для многих антибиотиков - от ограничения синтеза белков до лизиса клеточных стенок. Однако бактериоцины, в отличие от антибиотиков, характеризуются избирательным действием на сопутствующую микрофлору: они не задерживают рост и развитие лактобактерий, сапрофитных Е. coli, энтерококков и бифидобактерий. Спектр микроорганизмов, которые подвержены ингибированию бактериоцинами, достаточно широк - это и условно-патогенные микроорганизмы, и облигатные патогены: стрептококки и стафилококки, клостридии, листерии, сальмонеллы, шигеллы, синегнойная палочка, грибы родов Aspergillus и Rhizopus. Помимо бактериостатического действия бактериоцины сдерживают рост опухолевых клеток. Другими продуктами метаболизма лактобактерий являются антибиотикоподобные вещества, отличающиеся от бактериоцинов по химическому составу и чувствительности к амилазам и протеиназам - лактобиотики. Кроме бактериоцинов и лактобиотиков лактобактерии продуцируют неидентифицированные субстанции, обладающие бактериоциноподобным эффектом. Эти низкомолекулярные субстанции пептидной природы прояляют антагонистическую активность в присутствии кислоты и перекиси водорода. Они сдерживают рост не только условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, но и ряда представителей облигатной микрофлоры – бифидобактерий и бактероидов, не затрагивая близкородственных микроорганизмов. Бактериоцины и подобные им субстанции водорастворимы, не имеют вкуса и запаха, неканцерогенны, неаллергенны и активны в малых концентрациях. В то же время они не нашли промышленного применения по ряду причин, среди которых – синтез продукта при совместном культивировании с другими представителями нормофлоры. Примером может служить «система реутерина», которая вырабатывается культурой L. reuteri в присутствии комплекса микроорганизмов, в том числе кишечной палочки. Повышение колонизационной резистентности Микробы нормофлоры участвуют в активации синтеза секреторных иммуноглобулинов Ig А, которые препятствуют адгезии условно-патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам слизистой кишечника, и образования макрофагов и фибробластов. 23 Облигатные микроорганизмы из-за высокого их содержания в кишечнике создают эффект экранирования слизистой от проникновения условнопатогенных микроорганизмов, который заключается в следующем. Условно-патогенные микроорганизмы колонизируют кишечник в следующих областях: сальмонеллы – в слизистой оболочке и глубже; шигеллы – в цитоплазме эпителиальных клеток слизистой; холерный вибрион и энтеротоксические Е.сoli фиксируются на гликокаликсе щеточной каймы и затем колонизируют кишечник по всей этой поверхности. Непосредственно к щеточной кайме примыкает муциновый слой, в котором в огромном количестве развиваются представители автохтонной микрофлоры и создают защитный барьер для проникновения условно-патогенных микроорганизмов к местам их обитания. 4. Дисбактериоз желудочно-кишечного тракта: классификация и характеристика В последние годы значительно увеличилось число исследователей, занимающихся проблемой дисбактериоза. Однако единого взгляда на проблему до сих пор нет. Высказываются диаметрально противоположные мнения, в которых дисбактериоз либо возводится в ранг нозологической единицы, или же ставится под сомнение его клиническое значение и необходимость его коррекции. Критике подвергается сам термин «дисбактериоз». Считается, что дисбактериоз - это микробиологическое понятие, не имеющее какого-либо отношения к клинике. Это действительно так, ибо этот термин отражает сдвиг равновесия в среде микроорганизмов. Но поскольку при этом признается право существования термина «эубиоз», обозначающего состояние динамического равновесия между макроорганизмом и населяющим его микромиром, то и нарушение подобного равновесия, т.е. дисбиоз, тоже имеет право на существование. Спорным может быть отношение к проблеме дисбактериоза и необходимости его коррекции. Однако практически все признают, что микрофлора играет огромную роль в жизнедеятельности человеческого организма, поэтому и нарушения в микромире нельзя считать интактными для человека. Вторым аспектом, который подвергается критике, является само существование дисбактериоза кишечника. Дискутируя вопрос о наличии дисбактериоза, выделяют несколько спорных моментов: 1. это информативность анализа на дисбактериоз. При бактериологическом исследовании кала учитывается узкий спектр микроорганизмов, населяющих кишечник (см. табл. 1, 2); 2. это забор кала для исследования; 3. локализация микроорганизмов в толстом кишечнике; В последнее время отечественному термину «дисбактериоз кишечника» пытаются противопоставить термин, заимствованный из англоязычной литера24 туры - «синдром избыточного роста бактерий». Основные их отличия представлены в таблице 5. Таблица 5 Различия отечественной и зарубежной школ в подходах к дисбактериозу кишечника Рассматриваемый предмет Данные литературы отечественной зарубежной Подразумеваю- Кишечник в целом, толстая Двенадцатиперстная,тощая щийся или ука- кишка кишка и начало подвздошзываемый разной дел Эубиоз (основ- 1)ААФ>>АФ 1) АФ = 0 или мало 9 ные критерии) 2 ААФ > 10 КОЕ/г 2) ААФ = 0-104 КОЕ/мл 12 3)СКМФ=10'°-1О 3)СКМФ = 0-104 КОЕ/мл КОЕ/мл Дисбактериоз ААФ < 107 КОЕ/г СКМФ > 105 КОЕ/мл, (основные кри- Увеличение или появление Появление ААФ терии) УПФ и разновидностей АФ Принятые названия Дисбактериоз кишечника Этиологические факторы Антибиотикотерапия, хронические заболевания органов пищеварения, послеоперационные состояния и осложнения. Латентная, ме- Синдром мальабсорбции и собственно стная и генера- причинного фактора лизованная формы Клинические проявления Синдром перероста бактериального Параклиника Бактериология Фекальных масс Дыхательные тесты Лечение 1) восполнение ААФ 2) подавление УПФ 3) симптоматическое 25 Аспирата начального отдела тонкой кишки 1) перорально - глюкоза или лактоза (Н2-тест) 2) прием С14 ксилозы (С14тест) 1) восполнение ААФ и избыточного СКМФ 2) лечение основного заболевания 3) симптоматическое Примечание. АФ- аэробная флора; ААФ- анаэробная флора; УПФ - условнопатогенная флора; СКМФ - суммарное количество микроорганизмов. Из таблицы 5 следует, что основное отличие данных терминов заключается в содержании, которое вкладывают в эти понятия: при «синдроме избыточного роста бактерий» речь идет не об изменении микробного пейзажа толстой кишки, а об изменении состава микрофлоры тонкого кишечника. Таким образом, «синдром избыточного роста бактерий» и «дисбактериоз кишечника» - не альтернативные, а разные понятия. При этом целесообразно было бы унифицировать их названия. Выделяют следующие термины: «синдром толстокишечного дисбиоза» и «синдром тонкокишечного дисбиоза», которые отражают нарушения микробиоценоза и указывают на локализацию процесса - толстая или тонкая кишка. Таким образом, дисбактериоз - это не заболевание, а отклонение одного из параметров гомеостаза. Дисбактериоз всегда вторичен, но, являясь по сути микробиологическим феноменом, часто сам выступает в качестве начального этапа формирования многих соприродных заболеваний или же усугубляет течение основного патологического процесса. Дисбактериоз не болезнь и не всегда требует коррекции, но он может иметь клинические последствия. Поэтому коррекция микробиоценоза направлена прежде всего на профилактику возможных заболеваний. Часто при выраженных нарушениях в микрофлоре нет никаких клинических проявлений, и наоборот, выраженные клинические проявления сопровождаются незначительными изменениями микробиоценоза. Клинические проявления дисбактериоза и связанных с ним эндогенных инфекций зависят не только от установленных дисбиотических изменений, но и от компенсаторных возможностей организма. В случае, если условнопатогенные микроорганизмы выделяются из крови только однократно, можно говорить о дисбактериозе с кратковременной бактериемией. Дисбактериоз кишечника с бактериемией может протекать декомпенсированно, с генерализацией инфекции и образованием метастатических очагов в различных паренхиматозных органах, с исходом в сепсис и септикопиемию. В клиническом аспекте наиболее удобна классификация клинических форм дисбактериоза кишечника, приведенная в таблице 6. Существует 3 степени дисбактериоза (по Блохиной): первая степень характеризуется снижением количества бифидобактерий, лактобактерий или тех и других вместе на 1-2 порядка. Возможно снижение (менее 106КОЕ/г фекалий) или повышение содержания кишечных палочек (более 108 КОЕ/г) с появлением небольших титров измененных их форм (более 15%); вторая степень определяется при наличии одного вида условнопатогенных микроорганизмов в концентрации не выше 105 КОЕ/г или обнаружении ассоциаций условно-патогенных бактерий в небольших титрах (103-104 КОЕ/г). Для этой степени характерны высокие титры лактозоотрицательных кишечных палочек (более 104 КОЕ/г) или Е. coli с измененными ферментативными свойствами (неспособных гидролизовать лактозу); 26 третья степень регистрируется при выявлении в анализе условнопатогенных микроорганизмов в высоких титрах как одного вида, так и в ассоциациях. Таблица 6 Классификация клинических форм дисбактериоза кишечника (А.Ф.Билибин, 1977) Клинические формы Латентная (субклиническая) Местная (локальная) Распространенная, протекающая - с бактериемией - с генерализацией инфекции, сепсисом, септикопиемией Степени компенсации Компенсированный Микроорганизмы, обуславливающие дисбактериоз Стафилококки Субкомпенсированный Протей Дрожжеподобные грибы Декомпснсированный Ассоциация (стафилококк протей, дрожжеподобные грибы, лактозонегативные эшерихии) Позднее Бондаренко В.М. выделил 4 степени дисбактериоза, что более полно отражает состояние микробиоценоза кишечника организма человека (табл. 7). В.П. Крылов выделяет три типа дисбиотических нарушений: изолированный, комбинированный и дислоцированный, которые реально соответствуют компенсированной форме с субклиническим течением, субкомпенсированной и декомпенсированной форме. Многие авторы классифицируют дисбактериоз по виду доминантного возбудителя: стафилококковый, клебсиеллезный, протейный, бактероидный, клостридиозный, кандидомикозный, смешанный. Таблица 7 Классификация степеней дисбактериозов Степень 1-я 2-я Форма Признаки Латентная, компепсированная Имеются незначительные количественные изменения и аэробной части микробиоценоза, увеличение или уменьшение количества эшерихий. Бифидо- и лактофлора не изменена. Как правило, нет кишечных дисфункций. Субкомпенсированная Наряду с количественными выяв27 ляются качественные изменения эшерихий снижается количество бифидо- и лактобактерий, увеличивается количество условнопатогенных микроорганизмов, псевдо монад и грибов рода Candida. 3-я Декомпенсированная Значительно снижен уровень бифидо- и лактобактерий, резко изменено количество эшерихии. Как правило, возникают кишечные дисфункции 4-я Декомпенсированная Значительные количественные и качественные изменения эшерихии, бифидофлора отсутствует, значительно уменьшено количество лактобактерий, растет количество условно-патогенной и патогенной микрофлоры. Микрофлора появляется в других органах и биологических средах, которые в норме стерильны (кровь, моча и др.), появляются дополнительные очаги инфекции. В целях уточнения диагноза и рационального построения лечебнопрофилактических мероприятий в каждом конкретном случае эти классификации активно используется в клинической практике. Факторы, приводящие к развитию дисбактериоза Факторы, приводящие к нарушению микробиоценоза чело века, можно условно разделить на две группы: 11.1. Экзогенные Неадекватное питание (дефицит пищевых волокон, витаминов, белка, избыток консервированных рафинированных продуктов и т.д.). Воздействие ксенобиотиков (бытовых и промышленных загрязнителей) Избыточное ультрафиолетовое облучение. Лечение антибактериальными препаратами (особенно длительными или повторными курсами препаратов широкого спектра действия). Регулярное употребление слабительных раздражающего действия и солевых. Злоупотребление алкоголем. Физический и эмоциональный стресс. Резкая смена климатических поясов. 28 Жизнь в экстремальных условиях. Эндогенные Здоровье матери во время беременности. Иммунодефицитные состояния различного происхождения. Хронические воспалительные заболевания ЖКТ, особенно с секреторной недостаточностью. Аномалии строения ЖКТ. Стойкие дискинезии ЖКТ. Тяжелые хронические инфекции. Заболевания обмена веществ, в т.ч. сахарный диабет. Онкологические заболевания. Аллергии, особенно связанные с ЖКТ. Оперативные вмешательства. Бактериальные инфекции, пищевые токсикоинфекции, гельминтозы. Возраст (младенческий и старческий). Спектр причин, вызывающих дисбактериоз, достаточно широк. При рассмотрении силы их влияния на микрофлору необходимо отметить, что некоторые из эндогенных факторов вызывают краткие дисбактериальные реакции (за исключением приема лекарственных препаратов), а при воздействии других формируюся стойкие микроэкологические нарушения. Однако в том случае, если фактор формирования дисбактериальной реакции остается стабильным (например, затяжная стрессовая ситуация или неадекватное питание в течение длительного времени), он также приводит к формированию дисбактериоза. Наиболее серьезные нарушения в микробиоценозе возникают как под воздействием патологических состояний человека (даже на ранней стадии), так и под влиянием лекарственных препаратов, используемых в терапии. Среди них на первом месте - препараты, обладающие противовоспалительной активностью. При этом под воздействием антимикробных препаратов микроорганизмы не только погибают, некоторые из них приобретают патогенные и инвазивные свойства. Воздействие различных антибиотиков на микроэкологию желудочнокишечного тракта приведено в таблице 8. Опасным в данной ситуации является размножение в кишечнике антибиотикоустойчивых патогенных микроорганизмов, локализацией которых является преимущественно тонкий кишечник. При этом токсичные продукты метаболизма условно-патогенных микроорганизмов легко и быстро всасываются в кровь. Кроме антибиотиков, значительные нарушения микробиоценоза возникают при приеме таких препаратов, как наркологические, местноанестизирующие вещества, рвотные, обволакивающие, адсорбирующие, слабительные, отхаркивающие, желчегонные и другие средства, которые, изменяя моторику слизистых и нарушая образование муцина (место образования автохтонной микрофлоры), также могут приводить к развитию дисбаланса в составе нормальной микрофлоры. Потенциально дисбиотическими агентами могут быть некоторые психотропные препараты (производные фенотиазина), соли тяжелых металлов, некоторые антигистаминные препараты, лекарства, содержащие эфирные масла, красители, другие антисептики из-за их способности вызывать антимикроб29 ный эффект в отношении различных представителей нормальной микрофлоры. Ряд химических соединений, используемых в качестве добавок к лекарственным препаратам и пищевым продуктам (нитриты, нитраты, некоторые гормоны, противоопухолевые препараты), под влиянием нормальной микрофлоры могут трансформироваться в промутагены или мутагены и канцерогены. Наиболее чувствительными к воздействию выше перечисленных отрицательных факторов оказываются представители облигатной микрофлоры: бифидо- и лакобактерии, Е.соli, бактероиды и эубактерии. Индигенная микрофлора, присутствуя в кишечнике в оптимальном количестве, формирует колонизационную резистентность, препятствуя адгезии клеток патогенных и условнопатогенных микроорганизмов на слизистой кишечника. При снижении количества облигатной микрофлоры возникает возможность активного развития в толстой кишке условно-патогенных микроорганизмов с возникновением локального воспаления (энтерита, колита) и общего нарушения микробиоценоза, т.е. дисбиозов. Особого внимания заслуживает проблема влияния здоровья беременной женщины на формирование дисбактериоза новорожденного. У основного количества младенцев, рожденных от матерей с дисбактериозами, не формируется нормальный микробиоценоз. Анализируя вышеперечисленные факторы формирования дисбиоза, их влияние на представителей нормофлоры, в особую группу надо выделить антибиотики. Очень небольшое число микроорганизмов нормофлоры обладает устойчивостью к воздействию их терапевтических доз. Таблица 8 Возможные нарушения микробиоценоза кишечника под влиянием антибиотиков Антибиотики Окситетрациклин, эритромицин, левомицитин Возможные нарушения в нормофлоре Замещение нормофлоры на антибиотикоустойчивые штаммы Staphylococcus aureus Левомицитин Появление антибиотикоустойчивых энтомопатогенных штаммов кишечной палочки Эритромицин Повышение содержания стрептококков и снижение уровня бифидо- и лактобактерий Тетрациклиновые антибиотики Обладают особой органотропностью к желудочно-кишечному тракту, оказывают токсическое действие на эпителий и ретикулоэндотелиальную систему слизистой оболочки кишечника, создавая благоприятные условия для внедрения и развития устойчивых микробов; соединяясь с 30 белками, приобретают антигенные свойства и сенсибилизируют организм; стимулируют рост грибов рода Candida, стафилококков, клостридий Аминогликозиды (гентамицин, канамицин, мономицин и др.) Группа цефалоспоринов (цефалексин, цефалотин и т.д.) Элиминируют аэробную флору и грамположительные анаэробы, в результате чего после отмены препаратов в кишечнике увеличивается число условно-патогенных микроорганизмов Снижают содержание грамотрицательных кокков, бактероидов и вызывают появление антибиотикорезистентных штаммов псевдомонад, энтеробактера и клостридий Аминопенициллины (ампи- Способствуют росту микробов рода Proteus, циллин, ампиокс и др.) стрептококков, стафилококков, обсеменению (синдрому контаминации) ими тонкой кишки Фунгицидные антибиотики (ниста тин, леворин) Приводят к селективному размножению лактозоотрицательных эшерихий, протея При условии бесконтрольного, продолжительного лечения антибиотиками или повторных их курсов, будет формироваться дисбактериоз, который как показывает практика, сложно поддается коррекции. Таким образом, после любого лечения антибиотиками должны проводиться мероприятия по защите нормальной микрофлоры. Дисбактериоз и его клинико-патогенетическое значение Дисбактериозом кишечника называется синдром, характеризующийся количественными и качественными изменениями в составе нормальной кишечной микрофлоры с расширением среды ее обитания, развивающийся в результате срыва адаптации, нарушения защитных и компенсаторных механизмов. Дисбактериоз не болезнь, он всегда вторичен и существует как микробиологический феномен, но в то же время часто сам выступает в качестве начального этапа формирования многих соприродных заболеваний и может иметь клинические проявления. Дисбактериоз сопряжен с нарушениями в состоянии иммунной системы. При этом возникает вопрос, что является первичным: или процесс начинается с дисбактериоза и ведет к развитию иммуподефицитов, отражаясь на течении основной болезни, или дисбактериоз является следствием неблагоприятных воздействий на организм и его нормофлору существующего патологического состояния, в результате чего снижаются функции иммунной системы. Нарушение нормофлоры, состояние иммунного статуса и проявление болезни необходимо рассматривать в единстве, причем роль пускового механизма в каждом случае может принадлежать любому из этих компонентов. В одних случаях дисбакте31 риоз дает толчок развитию патологического процесса непосредственно, в других случаях – через развитие иммунодефицита, в третьих – вызывает эти взаимосвязанные процессы. Дисбактериоз, как правило, начинает формироваться со снижения активности индигенной микрофлоры, проявления избыточного роста условнопато генных микроорганизмов и снижения уровня облигатной микрофлоры. Поскольку в состоянии дисбиоза индигенная флора перестает осуществлять свои функции в полном объеме, постепенно возникает негативное влияние дисбиоза на организм человека. В результате этого спектр клинических синдромов и патологических состояний, патогенез которых может быть связан с нарушением состава и функций нормальной микрофлоры, характеризуется большим разнообразием и специфичностью. Анализируя основные функции нормофлоры (см. табл.9.) можно предположить, что в случае развития дисбактериоза кишечника у больного могу развиваться состояния, связанные с отрицательным воздействием микрофлоры (см. табл.10). В результате нарушения состава и функций нормальной микрофлоры могут иметь место следующие клинические синдромы и патологические состояния: диарея, запоры, колиты; гастриты, дуодениты, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; гипо- и гипертензия; гипо- и гиперхолестеринемия; ревматоидный артрит, болезни суставов и соединительной ткани; злокачественные опухоли желудка, толстой кишки, груди; снижение эффекта гормональных контрацептивов; нарушение менструального цикла; кариес; мочекаменная болезнь; бронхиальная астма, дерматиты, аллергия; поражение печени; инфекции различной локализации; нарушение водно-солевого обмена. 5. Сравнительная характеристика различных штаммов бифидобактерий Бифидобактсрии являются основными представителями нормофлоры кишечника человека и это - единственный вид, у которого не выявлено патогенных для человека свойств. Поэтому бифидобактерии в настоящее время являются наиболее предпочтительным микроорганизмом нормальной микрофлоры, с использованием которого создаются пробиотики и продукты питания лечебно-профилактического назначения. В настоящее время описано более 10 видов бифидобактерий, различающихся между собой по биохимическим, физиологическим и серологическим признакам: В. bifidum, B. adolescentis, В. infantis, B. breve, B. longum, B. pseudo32 longum, B. thermophilum, B. suis, B. asteroides, B. coryneforme, B. indisum, B. lactentis - более 500 штаммов этих микроорганизмов. Наиболее часто у человека встречаются следующие виды: у детей, находящихся на грудном вскармливании: В. bifidum, B. parvulorum, B. breve, B.longum, B.lactentis; у детей, находящихся на искусственном вскармливании: В. bifidum, B. parvulorum, B. breve, B.longum, B.lactentis,B.adolescentis; у взрослых: B.bifidum, B. adolescentis. B. longum. Наиболее универсальными видами, которые встречаются как у детей, так и у взрослых в значительном количестве, являются виды: В. bifidum , B. longum, B.adolescentis.Эти виды бифидобактерий представляют наибольшии интерес с точки зрения промышленного производства пробиотиков. Штаммы микроорганизмов должны: быть непатогенным и нетоксичным; обладать способностью к выживанию и жизнедеятельности в условиях кишечного микроокружения, т.е. выдерживать низкие значения рН; обладать высокой антагонистический активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам; обладать устойчивостью (по возможности) к антибиотикам; быть толерантным к другим представителям нормофлоры человека; обладать высокой адгезивной способностью; сохранять жизнеспособность в течение длительного времени; присутствовать в микробиоценозе человека всех возрастов. Промышленный штамм должен отвечать следующим требованиям: Таблица 9 Требования к микроорганизмам, используемым в качестве основы пробиотиков Должны быть изолированы из организма тех видов животных и человека, для которых они и будут предназначены Должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями; При введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью к транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду макроорганизма; при длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты Должны обладать колонизационным потенциалом (быть устойчивыми к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, продуцируемым индигенной микрофлорой; хорошо адгезироваться к эпителию соответствующих слизистых оболочек) Должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане Должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близким таковым в кишечном тракте 33 Должны иметь четкую физиолого - биохимическую и генетическую маркировку как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации . Соотношение видов бифидобактерий в кишечнике человека в зависимости от возраста и соответственно характера питания различно. В раннем возрасте преобладающими штаммами являются В. bifidum , B. longum, с возрастом увеличивается содержание В. adolescentis. Это является результатом специфического типа вскармливания с раннего детства материнским молоком или молочной пищей. Смешение количественных соотношений видов бифидобактерий в кишечнике в сторону вида В. adolescentis связывают с отходом особей от доминирующего молочного питания раннего детства по мере взросления. Подобная точка зрения подтверждается данными но биохимической и физиологической активности и тем фактом, что при грудном вскармливании ребенка, когда имеется достаточное количество лактозы и бифидогенных факторов материнского молока, у ребенка в основном содержатся штаммы бифидобактерий longum и bifidum.При переводе его на искусственное вскармливание, когда рацион питания содержит меньшее количество лактозы, увеличивается доля субстратнезависимого штамма В. adolescentis. Сравнительная характеристика сахаролитической активности различных штаммов бифидобактерий представлена в таблице 10. Таблица 10 Ферментативная активность бифидобактерий лактоза целлобиоза инулин маннит сорбит инозит салицин _ _ _ + V _ _ _ _ _ _ а 62 + + _ + _ + _ _ _ _ _ b 95 + + + + _ + _ _ _ _ _ с 97 + + + + + + _ _ _ _ _ без углеводов манноза 67 В. bifidum число штаммов арабиноза ксилоза Вид бифидобактерий В. longum, биовары В. adolescentis, биовары 34 а 4 + + V + + + + + _ + - b 33 + + V + + + + _ _ + _ с 19 + + V + + + _ + _ + _ d 44 + + V + + + _ _ _ + _ Примечание: (-) - отрицательная реакция; (+) - положительная; (v) - вариабельная. Известно, что действие пробиотиков направлено на создание временного искусственного микробиоценоза в кишечнике, во время существования которого создаются условия для активизации собственной микрофлоры. Поэтому очень важно, чтобы пробиотик содержал в своем составе штаммы, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам (продукция бактериоцинов), быстро размножался в кишечнике, т.е. имел хорошую скорость роста, и быстро закислял его содержимое. Приведенные данные показывают, что виды бифидобактерий adolescentis и longum сбраживают большее количество углеводов, что говорит об их субстратнезависимости от молока. Сравнительная характеристика данных параметров различных видов бифидобактерий представлена в таблице 11 и на рис. 2, на котором приведены результаты культивирования семи патогенных микроорганизмов - как отдельно (обозначение на рисунке 2 монокультура), так и совместно с различными штаммами бифидобактерий. Таблица 11 Физиологические свойства бифидобактерий Штамм В. bifidum 1 Активность спирто- и Антагонистическая Активность кислотообразования активность роста, Т 0С рН ацеэта- E. coli Pr.vulgar Staph. млрд is 102 aureus тат, % нол, % КОЕ/мл 209p 0,09 49,4 6,0 0,112 0,030 63,0 80,4 47,5 В. bifidum 791 2,1 82,4 4,8 0,122 0,062 96,5 81,6 81,9 В. adolescentis МС-42 B.longum B 379M 3,8 61,5 4,8 0,290 0,108 98,2 87,2 83,2 0,52 43,3 5,6 0,144 0,003 94,6 82,8 81,1 35 Максимальными показателями ростовой, спирто-, кислото образующей и антагонистической активности обладает вид В. adolescentis и, в частности, штамм В. adolescentis MC-42. Этот штамм обладает также лучшей кислотообразующей и ростовой активностью в молоке, что определяет его технологическую пригодность для промышленного производства продуктов питания лечебнопрофилактического назначения. Рис.2 . Сравнительная антагонистическая активность штаммов бифидобактерий: 1 - Staph. aureus 209р (золотистый стафилококк); 2 - Sh. flexneri 170; 3 - Sh. flexneri 337; 4 - Sh. sonnei 174b , 5 - Proteus vulgaris F-30; 6 - Proteus mirabilis F-196; 7 - E. coli 0-147. Таблица 12 Кислотообразующая активность и развитие бифидобактерий в стерильном молоке Культура В. bifidum 1 Время Титруемая ки- Количество культиви- слотность, °Т клеток в 1 рования, ч см3, млн ед. 48 48±2,0 6±0,3 Время образования сгустка, ч 120 В. longum B-379 M 48 98±0,4 430±70,0 30±2,0 В. bifidum Висби" 48 118±5,0 680±60,0 22±2,0 В. adlolescentis MC-42 16 97±7,0 1380±320,0 13±1,0 Из рассмотренных материалов можно сделать вывод о том, что наиболее активным по своим биохимическим, физиологическим и ростовым характери36 стикам является вид Bifidobacterium adolescentis, в частности, штамм МС-42. Из этого следует, что данный вид бифидобактерий будет обладать наибольшей активностью при коррекции микробиоценозов. Поскольку этот вид бифидобактерий присутствует в кишечнике и новорожденных детей, и взрослых, его можно использовать для нормализации микрофлоры людей всех возрастов. С использованием штамма Bifidobacterium adolescentis МС-42 в качестве закваски разработаны такие продукты питания лечебного назначения, как бифилии и бифидин, а также препараты бифацид, биовестин и биовестин-лакто, прекрасно зарекомендовавшие себя в клинической практике. Данный штамм был выделен в 1978 г. из фекалий грудного ребенка сотрудниками ВНИМИ и в настоящее время разрешен для применения в пищевой промышленности. В настоящеев время для производства препаратов пробиотиков используются определенные виды и штаммы микроорганизмов. Таблица 13 Виды и штаммы микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков Род Lactobacillus Bifidobactericum Streptococcus Enterococcus Saccharomyces Вид L. acidophilus L. rhamnosus L. plantarum L. reuteri L. fermentum L. lactis L. casei L. bulgaricum B. longum B. bifidum B. breve B. adoliscentis B. animalis S. thermophylus E. faecium S. boulardi Штамм L. gasseri L. rhamnosus GG L. plantarum 299 v L. fermentum KLD L. Shirota B. infantis; BB 536 B. lactis Bb 12 Enterococcus SF68 Указанные микроорганизмы можно классифицировать также по происхождению: 1 группа: Кисломолочные штаммы [L acidophilus, L. plantarum, L. bulgaricum, L. casei, L. fermentum, Str. thermophylus, Enterococci L-3, B. lactis) 2группа: Донорские штаммы [Bifidobacteriae bifidum, В. longum, В. infantis, В. adolescents, L. rhamnosus GG, L. gassed, Enterococci faecium, salivarius) 3 группа: Антагонисты. 37 6. Современные средства коррекции микробиоценоза Классификация и характеристика бактерийных препаратов Существующие на сегодняшний день средства, активно влияющие на микробиоценозы человека, условно можно подразделить на 5 групп: 1. пробиотики; 2. пребиотики; 3. синбиотики; 4. бактерийные препараты, обладающие селективной антагонистической активностью; 5. продукты питания с пробиотиками. Пробиотики - препараты микробного происхождения, проявляющие свои позитивные свойства на мaкpоoрганизм через регуляцию кишечной микрофлоры. Пребиотики - препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или активности нормальной микрофлоры кишечника. Синбиотики - препараты, полученные в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков. При этом каждая группа в свою очередь делится на подгруппы. Пробиотики: монокомпонентные, содержащие живые бактерии, относящиеся к представителям нормальных симбионтов (бифидобактерии, лактобактерии, кишечные палочки, пропионовокислые бактерии и др.), или самоэлиминирующие антагонисты (Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, B. licheniformis, Saccharomyces boulardii). К указанным препаратам относятся бифидумбактерин, лактобактерин, колибактсрин, жидкий концентрат бифидобактерий, энтерол, бактисубтил, биоспорин, споробактерин, бактиспорин, биобактон, биофлор, нутралин; поликомпонентные - состоящие из нескольких микроорганизмов: бифилонг (Bifidobacterium bifidum и В.longum), ацилакт (Lactobacillus acidophilus - 3 разных штамма 100 АШ, NK1, КЗ, Ш24), линекс (L. acidophilus, B. bifidum, Enterococcus faecalis}, биоспорин (В. subtilis, B. licheniformis), бифиформ (В. longum, Enterососсus faecium), ацидофилюс (L .acidophilus, L. bulgaricum, Streptococcus thermophilus), бифидин (Bifidobacterium adolescentis и Escherichia coli), бифинорм (B. bifidum, B. adolescentis, B. longum); комбинированные - бифидумбактерин-форте, состоящий из В. bifidum, адсорбированных на активированном угле в виде микроколоний; кипацид, содержащий L. acidophilus и комплексный иммуноглобулин; бифилиз, включающий B.bifidum и лизоцим; аципол, содержащий L. acidophilus и полисахарид кефирных грибков; рекомбинатные или генноинженерные - субалин, который представляет собой штамм В. subtilis, несущий клонированные гены, контролирующие синтез альфа-интерферона. 38 Краткая характеристика пробиотиков Лактобактерин сухой представляет собой микробную массу живых лактобацилл, лиофилизированных в среде культивирования. Эффект лактобактерина основан на антагонистической активности лактобацилл по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, а также на его иммуномодулирующих свойствах. Колибактерин сухой. Лиофилизированная микробная масса живых бактерий Е. coli М-17, обладающих высокой адгезивной способностью к эпителию толстой кишки, муцину, фибронектину и конкавалину А. Препарат показан при нарушении микробиоценоза, вызванного аэробной и факультативно- анаэробной микрофлорой, особенно клебсиеллами и серрациями. Бификол сухой. Комплексный препарат, состоящий из совместно выращенных живых антагонистически активных штаммов бифидобактерий и кишечной палочки М-17. Оказывает корригирующее действие на микробиоценоз и стимулирует репаративные процессы в кишечнике при кишечных инфекциях и дисбактериозе. Ацилакт. Лактосодержащий биологический препарат, представляющий собой смесь антагонистически активных лактобактерий. Оказывает положительное влияние на рост количества лакто- и бифидобактерий в кишечнике, снижает число условно-патогенных микроорганизмов. Показан при острых и затяжных кишечных инфекциях, бациллоносительстве патогенных и условнопатогенных микробов. Аципол. Препарат из ацидофильных лактобактерий, обладающий антагонистической активностью в отношении многих патогенных и условнопатогенных микроорганизмов. Состоит из смеси живых активных штаммов ацидофильных лактобацилл и инактивированных прогреванием кефирных грибков. Биобактон. Высушенная лиофильным способом культура ацидофильной палочки, обладающая выраженными биологическими свойствами за счет антибактериальной и ферментативной активности. Бифидумбактерин сухой. Представляет собой высушенную взвесь живых бифидобактерий штаммов № I. 791, ЛВА-2. Выпускается во флаконах по 5 доз. В одной дозе препарата содержится 109 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц) бифидобактерий. Высокий количественный уровень бифидофлоры и ее преобладание в микробиоценозе способствует нормализации деятельности ЖКТ, улучшает обменные процессы, повышает неспецифическую резистентность организма, препятствует активизации условно-патогенной флоры. Бифидумбактерин-форте. Представляет собой высушенную микробную массу живых бифидобактерий, иммобилизованных на сорбенте. Терапевтиче39 ский эффект бифидумбактерина-форте обусловлен заселением кишечника бифидобактериями, которые в иммобилизованном состоянии обеспечивают высокую локальную колонизацию слизистых оболочек и тем самым быстрее восстанавливают нормофлору кишечника. Бифидумбактерин-форте можно применять одновременно с антибактериальными препаратами. Бифацил. Сухой биопрепарат, вырабатываемый на основе сухого молока и содержащий комплекс живых штаммов бифидобактерий (В. adolescentis B-1) и ацидофильных палочек (Lactobacillus acidophilus), подвергнутых лиофильной сушке. Препарат обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Биовестин. Жидкий концентрат бифидобактерий, содержащий В. adolescentis МС-42. Споробактерин. Живая культура штамма сенной палочки, выделяющая антибактериальную субстанцию, имеющую широкий спектр действия, Подавляет развитие эшерихий, стафилококков, стрептококков, протеев, клебсиелл и других микроорганизмов. Биоспорин сухой. Живые микробные клетки бацилл В. subtilis и В. cereus., обладающие высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Энтерол. Высушенная микробная масса живых дрожжей Saccharomyces boulardii. Обладает выраженными биологическими свойствами за счет антибактериальной и ферментативной активности. Хилак-форте. Стерильный концентрат продуктов метаболизма нормальных кишечных симбионтов, образующих молочную кислоту, лактозу, аминокислоты. Способствует восстановлению нормофлоры и поддержанию физиологической функции слизистой оболочки кишечника. Бактисубтил (Bactisubtile) - препарат на основе устойчивых к действию желудочного сока спор бактерий, прорастание которых происходит в кишечнике. Вегетативные формы бактерий высвобождают энзимы, расщепляющие углеводы, жиры, белки; в результате образуется кислая среда, угнетающая процессы гниения. Препарат препятствует нарушению синтеза в кишечнике витаминов группы В и Р. Форма выпуска - капсулы. Бифилиз (Bifilys) в 1 мл содержит 5 млн живых бифидобактерий, органические кислоты, легкоусвояемый белок, лизоцим. Показан при острых кишечных заболеваниях вируснобактериальной природы. Бифилонг сухой (Bifilong siccum) представляет собой микробную массу живых антагонистически активных двух штаммов Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum. В виде лиофилизата выпускается в ампулах и флаконах. 40 Применяется для лечения острых и хронических заболеваний кишечника, профилактики и лечения дисбактериоза у детей и взрослых. Линекс (Liпех) содержит Lactobacterium acidophilus, Bifidobacterium bifidum, E. faecalis. Поддерживает физиологическое равновесие кишечной микрофлоры. Споробактерин сухой - микробная масса живых бактерий Bacillus subtilis. Применяется для лечения хирургических инфекций мягких тканей, остеомиелита, дисбактериозов. Выпускается в виде лиофилизированной массы в ампулах. Концентрат «Наринэ» - лиофилизированная в среде культивирования микробная масса живого штамма Lactobacilius acidophilus новорожденных детей Армении с добавлением защитной среды сахаро-желатино-молочной. Препарат выпускается в виде порошка кремового цвета, кисломолочного вкуса, во флаконах и пакетах. Краткая характеристика пребиотиков Пребиотики применяются для стимуляции роста микроорганизмов нормофлоры кишечника. Основные виды пребиотических соединений представлены в таблице 14. Таблица 14 Основные виды пребиотических соединений Группа Ростстимулирующее вещество Моносахариды, спирты Ксилит, мелибиоза, ксилобиоза, раффиноза, сорбит и др. Oлигосахариды Лактулоза, лацитол, соевый олигосахарид, латитололигосахарид, фруктоолигосахарид, галактоолигосахарид, изомальтоолигосахарид, диксилоолигосахарид и др. Полисахариды Пектины, пуллулан, декстрин, инулин, хитозан и др. Ферменты β-микробные галактозидазы, протеазы сахаромицетов и др. Пептиды Соевые, молочные и др. Аминокислоты Валин, аргинин, глутаминовая кислота и др. 41 Антиоксиданты Витамины А, С, Е, α-, β-каротины, другие каротиноиды, глутатион, убихинол, соли селена и др. Ненасыщенные жирные кислоты Органические кислоты Эйкозопентаеновая кислота и др. Растительные и микробные экстракты Морковный, картофельный, кукурузный, рисовый, тыквенный, чесночный, дрожжевой и др. Другие Лецитин, парааминометилбензойная кислота, лизоцим, лактоферрин, глюконовая кислота, крахмальная патока и др. Пропионовая, уксусная, лимонная и др. Препараты пребиотиков Лактулоза - это синтетическая клетчатка, дисахарид, полученный из лактозы. Достигая в неизменном виде отдел толстого кишечника, лактулоза под действием ферментов сахаролитических бактерий (бифидо-, лактобактерий, энтерококков) разлагается на фруктозу и галактозу. Моносахариды повышают осмотическое давление в толстой кишке (почти в 4 раза), увеличивается объем, меняется консистенция содержимого кишки, усиливается перистальтика кишечника. Далее моносахариды превращаются в жирные кислоты (молочную, уксусную, масляную, пропионовую), которые снижают рН содержимого кишки до 4,5 Eg, что ещё больше усиливает тонические и пропульсивные сокращения , гладкой мускулатуры толстой кишки, способствуют выведению с калом условно-патогенной флоры (сальмонеллы, шигеллы, иерсинии и пр.). Жирные кислоты угнетают рост и размножение условно-патогенной флоры, усиливают регенерацию кишечного эпителия и его трофику. Лактулозу содержат: Лактусан Нормазе Дюфалак Лактофильтрум Дюфалак (лактулоза). Лактофильтрум - пребиотик нового поколения. Содержит лактозу 15% и гидролизный лигнин 85%. Полифан (медицинский лигнин) - полимер растительного происхождения, продукт переработки древесины. Связывает и выводит из организма эндои экзотоксины, патогенные микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности, то есть это энтеросорбент с высокой сорбционной емкостью. Хилак-форте - капли, которые содержат продукты обмена естественной микрофлоры кишечника (Lactobacillus helveticus, lact. acidophilus, Е. coli), лак42 тозу, аминокислоты, стерильный концентрат продуктов обмена молочной кислоты, биосинтетическую молочную кислоту, молочно-солевой буфер. Пантотенат кальция. Участвует в процессах ацетилирования и окисления в клетках, углеводном и жировом обмене, синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников. Утилизируется бифидобактериями и способствует увеличению их биомассы. Памба (парааминобензойная кислота). Способствует росту бифидобактерий, лактобактерий и кишечных палочек. Эубикор - содержит инактивированные клетки специально селектированного штамма винных дрожжей - Saccharomyces cerevisiae (vini), которые по оригинальной технологии сорбированы на пищевые пшеничные отруби. Растительная клетчатка содержит в основном пектин (растворимые пищевые волокна), которые разлагаются на моносахара, а затем кислоты (молочную, уксусную, пропионовую, бутират). Кислоты снижают рН содержимого толстой кишки, что усиливает перистальтику кишечника, уменьшают адгезию (прилипание) условно-патогенных и патогенных микробов к энтероцитам. Инактивированныс дрожжевые клетки выполняют роль биосорбента. Краткая характеристика синбиотиков Синбиотики представлены на рынке только препаратами биовестинлакто, мальтидофилюс и бифидо-бак. Биовестин-лакто содержит 2 штамма бифидобактерий: фармакопейный В. bifidum 791, характерный для детей первого года жизни, находящихся на грудном вскармливании, и В. adolescentis MC-42, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и устойчивостью к терапевтическим дозам наиболее распространенных антибиотиков, фармакопейный штамм лактобактерий - L. Plantarum 8 РАЗ и бифидогенные факторы. Мaльтидофилюс содержит высушенные L.acidophilus,, L. bulgaricum, B. bifidum и мальтодекстрин. Бифидо-бак - комплекс из бифидо-, лактобактерий и фруктоолигосахаридов из топинамбура. Следует отметить, что пробиотики, пребиотики и синбиотики отличаются по составу содержащихся в них лечебных факторов. Существующие лечебные факторы можно условно разделить на четыре типа: 1. Живые клетки микроорганизмов. 2. Продукты жизнедеятельности микроорганизмов (метаболиты). 3. Вещества, входящие в состав клеток микроорганизмов. 4. Бифидогенные факторы. Механизмы действия указанных типов лечебных факторов также можно разделить на четыре группы: 1. Создание временного искусственного микробиоценоза, который благотворно влияет на представителей нормофлоры и одновременно угнетающе действует на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. 43 2. Улучшение имеющегося микробиоценоза путем воздействия на условия жизнедеятельности входящих в него микроорганизмов. 3. Стимуляция местного и общего иммунитета человека. 4. Детоксикация организма человека. Связь между лечебными факторами и механизмами их терапевтического действия показана в таблице 15. Приведенная классификация лечебных факторов и механизмов их действия наглядно показывает, что наиболее мощным комплексом факторов терапевтического воздействия обладают синбиотики и жидкие пробиотики. По поводу последних нужно заметить, что бифидогенными факторами в них будут служить вещества, выделенные из лизированных клеток. Таблица 15 Связь между лечебными факторами и механизмами терапевтического действия пробиотиков Лечебные факторы Механизм действия живые клетки метаболиты Создание временного искусственного микробиоценоза вещества из бифидогенные клеток мик- факторы роорганизмов + ценоза Улучшение имеющегося микробиоценоза Симуляция иммунитета человека + + + + + + Детоксикация организма человека + + + + Примечание. Знак (+) означает, что соответствующий лечебный фактор действует по указанному механизму. Бактерийные препараты, обладающие селективной антагонистической активностью К данной группе бактерийных препаратов относятся бактериофаги: стафилококковый, клебсиеллезный поливалентный очищенный, пиобактериофаг комбинированный жидкий, колипротейный бактериофаг. 44 Продукты питания с пробиотиками Все бифидосодержащис продукты можно разделить на три группы. В первую входят продукты, обогащенные бифидобактериями. Сами бифидобактерии выращиваются отдельно на специальных средах. Размножение этих микроорганизмов в продукте не предусмотрено. К подобным продуктам относятся бифидокефир, антацидный бифилакт, бифидомолоко, бифидойогурт, бифидомороженое, бифидосметана, вафли диабетические и диетические «На здоровье!» (вафли производятся в г. Новосибирске, обогащаются концентратом бифидобактерий производства 000 «Био-Веста»). Вторая группа бифидосодержащих продуктов включает в себя продукты смешанного брожения, чаще всего сквашенные совместной культурой бифидобактерий и молочнокислых микроорганизмов. Это напитки «Угличский», «Вита». К третьей группе относятся продукты, сквашенные чистыми или смешанными культурами бифидобактерий, в производстве которых активизация роста достигается обогащением молока бифидогенными факторами различной природы. Кроме того, могут использоваться штаммы бифидобактерий адаптированные к молоку и способные расти в аэробных условиях. Среди таких продуктов - бифилин-М, кисломолочный бифидумбактерин. По концентрации бифидобактерий и продуктов их жизнедеятельности первая и вторая группы очень близки. Это объясняется тем, что скорость роста бифидобактерий по сравнению со всеми кисломолочными микроорганизмами очень низка, и при совместном сквашивании количество бифидобактерий увеличивается незначительно. Продукты третьей группы (бифилин-М, кисломолочный бифидумбактерин) наиболее полезны для профилактики и лечения дисбактериозов, так как содержат максимальное количество бифидобактерий и продуктов их метаболизма. Количество бифидобактерий в 200 мл продукта составляет не менее 2,0 – 10,010 живых бифидобактерий и эквивалентно количеству этих бактерий в 40 флаконах лиофилизированного бифидумбактерина. В комплекс продуктов метаболизма входят различные кислоты, бактериоцины и иммуномолулируюшие вещества. Кроме того, в бифилин-М добавляют бифидогенные факторы, активизирующие рост аутоштаммов бифидобактерий. Достоинства сухих и жидких пробиотиков Современные препараты с живыми клетками микроорганизмов делятся на два типа по биологическому состоянию, в которых пребывают клетки. В первом типе препаратов клетки находятся в глубоком анабиозе, что достигается путем лиофильной сушки субстрата с живыми активными клетками. Во втором типе препаратов клетки микроорганизмов остаются постоянно активными. Все эти типы препаратов имеют свои достоинства и недостатки. Лиофильно высушенные культуры способны достаточно долго храниться (до 1 года) и не требовательны к кратковременным изменениям температурных условий хранения. 45 Но есть у них и существенный недостаток - после процесса лиофилизации бактерии ослаблены и плохо приживаются в кишечнике, потому что требуется 8-10 ч для их перехода от анабиоза к активному физиологическому состоянию. Жидкие препараты имеют ряд преимуществ перед сухими: бактерии находятся в активном состоянии и способны к колонизации ЖКТ уже через 2 ч после попадания в организм: жидкие препараты, кроме бактерий, содержат продукты их жизнедеятельности, полезные для организма человека - незаменимые аминокислоты, органические кислоты, интерферонстимулирующие вещества и таким образом, включают в свой состав несколько действующих начал: живые микроорганизмы, пробиотики и метаболитные пробиотики. К недостаткам жидких пробиотиков относится необходимость строгого соблюдения температурных режимов и срока хранения - от 1 до 3 месяцев. Метаболиты бифидо и лактобактерий, входящие в состав жидких пробиотиков (органические кислоты: уксусная, молочная; витамины: С, К), являются мощным фактором, влияющим на состав среды в кишечнике. И при приеме препарата этот фактор позволяет создать такие параметры среды в кишечнике, при которых получают поддержку микроорганизмы нормофлоры и угнетаются патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Жидкие пробиотики богаты веществами, входящими в состав клеток бифидобактерий. Эти вещества, с одной стороны, являются естественным сорбентом, с другой - это фактор стимуляции иммунитета, и с третьей стороны - это своеобразный бифидогенный фактор, так как клеточные вещества служат пищей для живых бифидобактерий. Противопоказания для назначения пробиотиков отсутствуют, однако необходимо учитывать, что в ряде случаев их применение требует осторожности. Препараты бифидумбактерин сухой, бификол, лактобактерин, колибактерин содержат среду, в которой культивировались микробы, а это может привести к развитию аллергических реакций при их введении, поэтому применение этих препаратов должно проводиться под строгим наблюдением врача. Этот недостаток отсутствует у бифидумбактерина сухого лиофильно высушенного в порошке, однако лактоза, входящая в его состав, также может выступать в роли аллергена и поэтому данный препарат необходимо применять с осторожностью у детей младшего возраста и у пожилых людей, для которых высок риск развития лактазной недостаточности. Бактерийный препарат колибактерин показан только при некоторых случаях дизентерии, когда отмечается резкое снижение уровня нормальных кишечных палочек. Необходимость применения препарата колибактерин для коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах является спорной, так как искусственное заселение кишечника при нарушении микробного баланса большим количеством эшерихий, удельный вес которых в норме в составе микрофлоры кишечника незначителен, не приводит к восстановлению уровня бифидобактерий, лактобактерий и нормализации микробиоценоза в целом. Широкое распространение в России, благодаря активному рекламированию, получили бактерийные препараты, в состав которых входят аэробные спорообразующие бактерии, обитающие в почве, в окружающей среде и не 46 входящие в состав представителей нормальной микрофлоры кишечника: бактисубтил (Bacillus cereus) и споробактерин (В. subtilis). Вопрос об использовании этих препаратов в лечебной практике спорный. Некоторые исследователи рекомендуют применять данные препараты при наличии условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, другие - категорически против. Мнение противников бациллярных биопрепаратов кажется нам достаточно аргументированным. Искусственное введение в кишечник этих бактерий в больших количествах и излишнее размножение бацилл в этой нехарактерной для них экологической нише, сопровождающееся распространением бацилл за пределы кишечника, на фоне снижения уровня бактерий, относящихся к представителям облигатной нормальной микрофлоры, может увеличивать степень дисбиотических нарушений и в значительной мере ухудшать общее состояние пациента. Учитывая то, что бациллы, входящие в состав споробактерина, продуцируют протеолитические ферменты, например фибринолизин, а В. сеreus, входящие в состав препарата бактисубтил, синтезируют гемолизины, разрушающие эритроциты крови человека, а также значительно уступают бифидобактсриям и лактобактериям к способности обеспечивать формирование колонизационной резистентности кишечника, использование этих препаратов не является целесообразным. Известны многочисленные клинические случаи инфекционных осложнений, обусловленных бациллами. Авторы препарата споробактерин на основе «живого штамма сенной палочки N 534» сообщают, что он обладает высокой протеолитической активностью и «при приеме внутрь, согласно феномена транслокации, бактерии через здоровую слизистую и небольшом количестве систематически проникают в кровь, лимфу и достигают лимфатических узлов, селезенки, печени. В последующем они концентрируются в очаге повреждения, где выполняют роль «биологической фабрики», продуцируя биологически активные вещества». Из этого следует, что споробактерин обладает рядом свойств, характерных для патогенных микроорганизмов и ни в коем случае не должен назначаться пациентам. Еще одним биопрепаратом микробного происхождения, активно рекомендуемым по целому ряду показаний, в том числе и во время беременности и кормления грудью, является препарат хилак-форте, в форме капель. Как следует из аннотации, предоставляемой производителем, «капли содержат продукты обмена веществ грамотрицательных и грамположительных симбионтов тонкого и толстого кишечника» и далее: «1 капля соответствует биосинтетическим действующим веществам в 100 миллиардах бактерий». Сразу же возникают принципиальные вопросы: если в тонкой и толстой кишке обитают более 400 видов бактерий, то каков количественно-качественный состав этих 100 миллиардов бактерий? За какой период времени синтезированы «биосинтетические действующие вещества» этими 400 различными видами бактерий? Какое количество и каков качественный спектр этих «биосинтетических веществ»? Какова биологическая активность каждого из этих «биосинтетических веществ»? Известно, что продукты метаболизма многих представителей микрофлоры толстой кишки неблагоприятно воздействуют на организм хозяина. Присутствуют ли они в данном препарате, представляющем собой «продукт обмена веществ грампо47 ложительных и грамотрицательных симбионтов тонкого и толстого кишечника»? Если нет, то как их удаляют из препарата? Каковы контроли? Вопросы врача к производителю препарата можно было бы продолжить, но из представленной производителем инструкции и так ясно, что в настоящее время этот препарат не может рассматриваться и применяться как лекарственный. А для подтверждения заявленных изготовителем показаний к применению препарата хилак-форте требуется проведение многолетних исследований. 6. Производство препаратов нормофлоры Необходимым условием массового производства препаратов эубиотиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Бактерийные препараты, содержащие живые микроорганизмы, относятся к наименее стойким, их активность снижается за счет гибели клеток. Микроорганизмы, имея низкий уровень биологической организации, сохраняют жизнеспособность практически при полной потере воды, при этом в них обратимо замедляются или прекращаются обменные процессы. Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры и глубокого вакуума (незначительной концентрации кислорода). По причине гигроскопичности укупорку сухих биопрепаратов проводят под вакуумом или в токе инертного газа. К факторам, оказывающим влияние на выживаемость микроорганизмов в препаратах сухих эубиотиков при хранении, следует отнести: регламентированное содержание остаточной влаги; наличие защитных сред; хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кислород. В целях защиты эубиотиков от кислой среды желудка на таблетированные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте. Производство должно быть организовано в соотвествии с ГОСТ Р 522492004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств (Good Manufacturing Рractice for medicinal products (GMP)». Общая схема технологического процесса производства пробиотиков 1.Подготовка производственных помещений, оборудования, посуды, персонала, вентиляционной системы - проводят в соответствии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами. 2.Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производственной и защитной среды высушивания). Предварительные работы включают качественный подбор необходимых для данной культуры веществ; 3. оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта; 4. нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред. 48 5. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма при температуре 370°С, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и паровой рубашкой. 6. Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию. 7. Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры под углом 750°. Содержимое ампул замораживают при температуре -400 °С, выдерживают при этой температуре 18-24 ч, подвергая сублимации. 8. Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флаконы укупоривают) с газовой защитой. 9. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук. 10.Контроль качества готовой лекарственной формы. Частная технология препаратов нормофлоры Лактобактерин. Для производства лактобактерина применяют штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, который относится к роду Аctobacillococcus. Лактобактерий представляют собой грамположиельные палочки длиной 0,7-3,0 мкм. Растут в атмосфере СО2, N2, O2. Лактобактерин сухой (Lactobacterium siccuum) получают по общей схеме для бактерийных препаратов. Схема производства бактерийных препаратов 1. Приготовление и стерилизация питательных сред: 1.1. Приготовление гидролизованного молока (к прокипяченному обезжиренному молоку с рН 7,7±0,1 добавляют панкреатин и хлороформ, выдерживают при 40±2 °С 72 ч, затем фильтруют, разводят вдвое водой для инъекций, разливают в бутыли и стерилизуют). 1.2. Приготовление дрожжевого аутолизата (хлебопекарные дрожжи разводят в бутылях водой для инъекций и стерилизуют). 1.3. Приготовление среды МРС (к гидролизованному молоку добавляют дрожжевой аутолизат и навески следующих веществ: марганца и магния сернокислого, аммония лимоннокислого, глюкозы и др.). 1.4. Приготовление гидролизата казеина (в реакторе готовят раствор казеина, устанавливают необходимое значение рН, добавляют хлороформ, выдерживают пять суток при 45 °С, затем фильтруют в бутыли и стерилизуют). 1.5. Приготовление казеиново-дрожжевой среды. 1.6. Приготовление защитных сред высушивания (желатин, сахароза, молоко, натрий лимоннокислый и вода). 49 2. Получение маточной культуры (6 пассажей в пробирках, чашках Петри, флаконах и бутылях - в течение 9 суток). 3. Выращивание производственной культуры (в реакторах с жидкой питательной средой в течение 8-12 ч при 370°С; в 1 мл микробной суспензии производственного штамма должно быть не менее 6 млрд живых микробных клеток; к полученной микробной суспензии добавляют защитные среды высушивания - сахарозно-желатозную или обрат молока). 4. Розлив лактобактерина в ампулы (доза зависит от концентрации живых микробных клеток). 5. Лиофилъная (сублимационная) сушка: 5.1. Замораживание ампул с лактобактерином, расположенных наклонно под углом 75°, в течение 18-24 ч в холодильной камере до минус 40°С; 5.2. Лиофилизация (сублимирование) - сушка в условиях глубокого вакуума, длительность сублимации 68-70 ч. 6. Запайка ампул (в режиме газовой защиты - в атмосфере азота). 6. Контроль качества: 6.1. Описание: кристальная или пористая масса желтовато-белого цвета, кисломолочного запаха и вкуса. Определяют органолептически. 6.2. Подлинность определяется наличием характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств в производственных штаммах лактобацилл. 6.3. Показатель рН растворенного препарата должен составлять 5,5±0,5. 6.4. Остаточная влажность лактобактерина в ампулах или флаконах не должна превышать 3,5%, в таблетках 5%. 6.5. Растворимость. Сухой препарат должен растворяться в воде, очищенной и добавленной из расчета 1 мл на 1 дозу, в течение 5 мин образовывать гомогенную взвесь, желтовато-бежевого цвета. Определяют визуально. 6.6. Бактериальная контаминация проверяется бактериоскопически и бактериологически. Бактериоскопически - путем просмотра мазков, приготовленных из взвеси растворенного препарата и окрашенных по Граму. В мазках должны быть клетки, характерные для лактобацилл (грамположительные). Бактериологически - путем посева на питательные среды и инкубации в течение 2-х суток не должно содержаться колоний. Если обнаружили рост хотя бы в одной пробирке или чашке, производят повторный посев удвоенного количества образцов. В случаях повторного роста серию препарата бракуют. Препарат сухой не должен быть контаминирован посторонней микрофлорой. Препарат в таблетках не должен содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; допускается наличие микробов сапрофитов в количестве не более 300 на 1 таблетку. 6.7.Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным для белых мышей при введении его внутрь в количестве одной дозы. Наблюдение 50 за мышами осуществляется в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши контроль повторяют на удвоенном количестве животных. Если мыши не погибнут, препарат считают выдержавшим испытание; в противном случае данную серию препарата бракуют. 6.8.Специфическая активность. По количеству жизнеспособных клеток лактобацилл в 1 дозе препарата и активностью кислотообразования. 6.8.1. Определение количества живых лактобацилл в 1 дозе. Для определения количества живых лактобацилл в одной дозе препарата от каждой серии испытывают не менее 3-х образцов. Содержимое флакона после разведений высевают по 0,1 мл микробной суспензии на 4 чашки Петри. После 44 ч инкубации при 37°С производят подсчет выросших колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. 6.8.2. Определение активности кислотообразования проводят титриметрическим методом при выращивании бифидобактерий в модифицированной печеночной среде. Каждую пробу титруют раствором натрия гидроксида 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина до появления слабо-розового окрашивания. В одной дозе препарата (1 таблетка) при выпуске должно содержаться не менее 2-109 живых лактобацилл. Показатель активности кислотообразования лактобактерина, выраженный в градусах Тернера (ТО), должен быть не менее 200. 6.9. Определение компонентов стабилизирующей среды высушивания и других веществ, входящих в состав препарата. 8. Маркировка и упаковка При производстве таблеток лактобактерина микробную суспензию сушат в кассетах. Сухую микробную массу (СММ) протирают через металлическое сито в бутыли с азотом. Таблеточную массу готовят в шаровой мельнице с добавлением к СММ вспомогательных веществ (лактозы, аэросила, кальция стеарата). В таблеточной массе определяют количество живых лактобактерий и рассчитывают массу таблетки. Таблетирование ведут методом прямого прессования в асептических условиях при строгом соблюдении влажности воздуха (не более 50% при 18 °С). Таблетки передают на фасовку во флаконы. Препарат должен находиться в вакууме, атмосфере азота или стерильного воздуха. С целью защиты бактерийных препаратов от агресивной кислой среды желудка создаются таблетки с ацидорезистентным покрытием, капсулированные формы, иммобилизованные на сорбенте бактерии. Предприняты попытки создания микрокапсулированных форм пробиотиков. Продолжительность процесса производства лактобактерина в ампулах и таблетках составляет соответственно 42 и 66 суток. Хранят препарат в сухом, темном месте при Т= 5±3 °С. Срок годности 12 и 6 месяцев. Срок годности равен 12 месяцам, если в одной дозе при выпуске содержится 4 млрд и более живых лактобацилл; 6 - при содержании от 2 до 3,9 млрд. К концу срока годности должно содержаться 1 млрд живых лактобацилл. 51 Тесты 1. Микроорганизмы, с которыми человек встречается в течение жизни: А- транзиторные; Б- приносящие несомненную пользу; В- условно-патогенные; Г- возбудители инфекционных заболеваний. 2. К положительным функциям нормофлоры кишечника относятся все, КРОМЕ: А- межмикробного антагонизма; Б- синтетической и детоксикационной; В- концентрирования и задержки ксенобиотиков; Г- пищеварительной. 3. К причинам, вызывающим дисбактериоз, относятся: А- использование в рационе пищевых волокон; Б- иммунные нарушения и инфекционные болезни; В- нарушение питания и медикаментозное воздействие; Г- использование в пищу молочнокислых продуктов. 4. Эубиотики (пробиотики) – это: А- убитые микроорганизмы; Б- живые, специально подобранные микроорганизмы; В- ферментные препараты, улучшающие пищеварение; Г- пищевая добавка. 5. Микроорганизмы, используемые для создания эубиотиков, должны обладать: А- устойчивостью к антибиотикам; Б- антагонистической активностью; В- адгезивными свойствами; Г- достаточной скоростью роста. 6.Дисбиоз это: А- сдвиг равновесия в среде микроорганизмов; Б- нарушение равновесия между макроорганизмом и населяющим его микромиром; В- процесс превращения веществ с помощью микроорганизмов в ценные продукты; Г- явление микробного антагонизма. 7.Симбиоз это все, кроме: А- партнеры не оказывают заметного влияния один на другого; Б- явление односторонней выгоды; В- явление микробного антагонизма; Г- взаимовыгодный симбиоз. 8.Формы симбиоза: А- мутуализм; Б- паразитизм; В- дисбактериоз; Г-биоценоз. 9.Симбионт это: А- участник биоценоза; Б- участник антибиоза; В- участник фагоцитоза; Г- участник симбиоза. 10.Свойства бифидобактерий: А- вырабатывают лизоцим; Б- гидролиз лактозы; В-синтез аминокислот, белков, пантотеновой кислоты; Г- иммуномоделирующие. 11.Свойства лактобактерий: А- усиливают всасывание ионов кальция, витамина D; Б- антагонизм к патогенным микроорганизмам; В- синтез иммуноглобулинов, интерферонов; Г- формирование колонизационной резистентности. 12.Функции эшерихий в организме: А- вырабатывают колицины; Б-стимулируют образование антител; В- синтез витаминов группы В, К; Г - рециркуляция желчных кислот и холестерина. 13.К представителям облигатной микрофлоры относятся: А- пептострептококки; Б- дрожжи; В- бифидобактерии; Г- энтерококки. 14.К представителям условно-патогенной микрофлоры относятся: А- стафилококки; Б- бациллы; В- фузобактерии; Г- бактероиды. 15.Экзогенные факторы, приводящие к развитию дисбактериоза: А- стрессы; Б- аллергии; В- онкологические заболевания; Г- неадекватное питание. 53 16.Эндогенные факторы, приводящие к развитию дисбактериоза: А- воздействие ксенобиотиков; Б- лечение антибактериальными препаратами; В- хронические инфекции; Г- аномалии строения ЖКТ. 17.К бактерийным препаратам относятся: А- пребиотики; Б- симбиотики; В- эубиотики; Г- продукты питания с пробиотиками. 18.К пробиотикам относятся следующие препараты: А- хилак-форте; Б- биовестин-лакто; В- ацилакт; Г- колибактерин сухой. 19.Жидкие препараты пробиотиков в своем составе содержат: А- живые микроорганизмы; Б- продукты жизнедеятельности; В- витамины; Г- незаменимые аминокислоты. 20.К монокомпонентным пробиотикам относятся препараты: А- бифиформ; Б- бифидумбактерин; В- споробактерин; Г- бифилак. 21.К поликомпонентным пробиотикам относятся препараты все, КРОМЕ: А- бификол; Б- ацилак; В- линекс; Г- бифидин. 22.Для препаратов нормофлоры общим является: А- способ изготовления; Б- парентеральный способ введения; В- условия производства; Г- биологическая активность. 23.Препараты эубиотиков выпускают в виде: А- таблеток; Б- жидких форм; В- лиофилизированной массы в ампулах и флаконах; 54 Г- порошков в пакетах (сошетках). 24.Длительность (в сутках) процесса производства лактобактерина в ампулах составляет: А- 2; Б- 5; В- 7; Г- 42. 25.Лиофильная сушка – это: А- сушка из замороженного состояния под вакуумом; Б- сушка при атмосферном давлении; В- сушка с помощью адсорбентов. 26.Основоположник бактериотерапии, выдвинувший идею коррекции флоры кишечника, с помощью молока, сквашенного ацидофильными бактериями: А- И.И. Мечников; Б- С. Ганеман; В- Д.И. Менделеев; Г- Л.К. Михалева. Ответы на тесты 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А В БВ Б ВГ АБ В АБ Г АВГ БВГ АБВ 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 55 АБ Г ВГ АБВГ АВГ АБВГ БВ Г В АБВГ Г А Список литературы 1 Дисбактериозы и эубиотики: Тез. докл. науч.-практ. кон. — М., 1996. — С. 40. 2 Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры. Русский медицинский журнал, 2000, №13-14 3 Коноваленко Н.К., Касумова С.А. и др. Использование селекционных штаммов молочно-кислых бактерий при получении лечебно-профилактических продуктов // Микробиол. журн.- 1990.- №8.-С. 45-49. 4 Корниенко Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков // Детские инфекции, 2007, № 3, с. 64-69 5 Кяшковскяя Н.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения биологических микробных препаратов в гинекологии и стоматологии: Автореф. канд. биол. наук. — Москва. 1992. 6 Лазарева Г.И. Изучение физиологических свойств и структурнофункциональной организации бифидобактерий: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Минск, 1991. — С. 24. 7 Михайлова Т.Л., Калинская Т.Ю., Румянцев В.Г. Биопрепараты и пищевые факторы в коррекции дисбактериоза//Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 1999. —№ 3. — С. 67-70. 8 Новокшенова В.А., Феклисова Л.В., Поспелова В.В. и др.// Проблемы медицинской биотехнологии и иммунологии инфекционных болезней: Сб. науч. тр. — М., 1996. —Т. 2. 9 Прищеп Т.П., Чучалин В.С., Зайков К.Л. Основы фармацевтической биотехнологии. Феникс, Томск,- 2006, 252 с. 10 Регистр лекарственных средств России, вып. 16, РЛС-2008, М., 2007, 1154 с. 11 Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чичкалева И.И. Биотехнология. «Академия», М., 2006, 255 с. 12 Типовые тестовые задания для итоговой государственной аттестации выпускников высших медицинских учебных заведений по специальности 060108 (040500) «Фармация», М., ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2006, 210 с. 13 Фармацевтический вестник // №29 (519), 2008.- С. 16. 14 Ханина Г.И., Поспелова В.В., Гаврилов А.Ф. и др. Дисбактериозы кишечника при хронических постинфекционных колитах и их коррекция таблетированными формами микробных биопрепаратов// Тез. докл. 6-го Всерос. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов / Под ред. Б.А. Шендерова. — Н. Новгород, 1991. —С. 134. 15 Циммерман Я.С. О сущности понятия «Дисбактериоз (дисбиоз) кишечника» и правомерности использования этого термина// Рос. жури, гастроэнтерологии, гепато-логии, колопроктологии.— 2000.—№ 1. — С. 81-84. 16 Шеведева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. — 1999. — № 2. — С. 3239. 17 Шендсров Б.А. Нормальная микрофлора и се роль в поддержании здоровья человека// Рос. жури, гастроэнтерологии, гепатолопш, колопроктологии.— 1998.— № 1. — С. 61-65. Приложения Приложение 1 57 Приложение 2 Препараты нормофлоры Характеристика препаратов, их состав и режим применения Группа Название Штамм 1 2 3 Монокомпонентные Бифидумпробиотики бактерин (порошок, в свечах) Форма, кол-во микробов 4 B.bifidum 1 порошок в 1 пакете 5х 108 мкг. тел свеча - 1 доза Биобактон L.acido-philus флакон 5 ДОЗ Доза Курс* Возраст Показания 5 6 7 8 1-2 пакета 2-4 недели с О * 2-4 раза в день свеча 1-2 раза в день 1 флак. х 2 2-3 нед раза сО 1-5 доз х 2- 2-3 нед Зр. в день, свеча 1-2 р. сО Лактобактерин L.plantarum 8RA3 флакон 5 доз, табл 1-5 доз, свеча – 1 доза Колибактерин E.coli M-17 флакон-5 1-3 дозы х 2 нед доз, табл,- 2-Зраза в 2-20 доз день Монокомпонентные Бифидумсорбированные бактерин пробиотики форте B.bifiduml, пакет 5х сорбирован- 107 КОЕ/г ные на актив, угле Пробифор B.bifiduml, пакет 5х сорбирован- 108 КОЕ/г ные на актив, угле Поликомпонентные Ацилакт пробиотики 3 штамма L. Флакон – Acidophilus 5 доз Свеча – 1 доза Бифиформ Bif. longum Е. faecium, лактулоза капсула 2х 107 КОЕ/ г 58 1-2 пакета 2-3 нед. х 2-3 р. в день, в высоких дозах детям по 5 пакетов 6р. в день, взрослым по 10 пакетов 3 раза в день для профилактики и лечения ком пеней р. дисбакт. II ст., при легких формах ОКИ с 6 мес. при затяжном колите сО для профилактики и лечения дисбактериоза I-III ст., при ОКИ 1-3 пакета 10-15 дней с 1 х 2-Зр. в года день, для антидиарейного эффекта по 2 пакета через 1 час х Зраза для лечения дисбактериоза II-III ст., при ОКИ, в т.ч. при тяжелых формах 1-5 доз * 2- 2-3 недели с 0 3 раза в день, свеча – 2-3 раза в день для лечения дисбактериоза I-III ст., ОКИ 1-2 капле. 2-3 нед. х2-3 раза в день с грудного Комбинированные пробиотики Бификол B.bifidum 1 E.coli М17 107 КОЕ/г флакон 5 доз 1-5 дозх 2- До 2-3 не- с 6 мес. 3 раза в дел ь день Линекс L.acidoкапе. (1г)- 1-2 капе. х 2 нед. philus, S. fae- 107 КОЕ/ З раза в cium г день B.infantis Аципол 4 штамма таблетка / 1-10 доз-2- 2-3 нед. L.acidophi-lus капсула - 3 раза в + поли5доз день сахарид кефирного грибка Бифилиз B.bifidum 1 107 КОЕ /г 10 мг лизоцима флакон 5 доз Биофлор E.coli M17 экстр. овощ прополис флакон 1-2 ст.л. х (суспен- Зр. в день зия) 100 и 200 мл 2,5-5 доз х от 5-10 2-Зр. в дней доз день нед. Споробак - Вас. subtillis терин 534 Метаболические пробиотики капсулы 109КОЕ/ г сО от 5-7 дней с 3 лет и более Биоспорин B.subtillis амп, флак. 1-2 доз.х 2- 5-10 дней B.licheniformi 1,2ДО 3 раза в s ДОЗ день БактиБациллы IP 5832 Пробиотики из ба- субтил, цилл и непатоген- Флониви н ных грибов при торпидных колитах у взрослых, у детей по строгим показанис грудного для профилактики и лечения дисбактериоза 1 ст., ОКИ сО для лечения дисбактериоза I-III ст., ОКИ 1 капс. х 26 раз в день флакон 0,5-1 мл 2 109 КОЕ/г раза в день в 1 мл с1г дисбак ОКИ преимущественно у взрослых элиминационный курс при дисбактериоза II-III ст., при лечении ОКИ с 3 лет с1г Энтерол Sacharomy- Капсулы, ces boular-dii- пакеты 250 мг по 250 МГ X 1-2 р. в день Детям и взрослым Хилакфорте Метаболиты флакон кишечной (капли) флоры 15-40 ка- 2-3 пель 3 раза недели в день сО 59 для лечения дисбактериоза II-III ст., для иммунной коррекции для профилактики и лечения дисбактериоза 1-II
