Современные молекулярно-биологические методы

Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Сибирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России)
научно-популярные материалы для школьников и школьных
учителей
При поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы»
Соглашение на предоставление гранта от 23 октября 2012 г. № 8302
Томск, 2013
На сегодняшний день инструментарий
исследователя постоянно расширяется и
прочно входит в практику не только научную,
но и клиническую, позволяя проводить точную
лабораторную диагностику различных
заболеваний.
Представленная презентация позволит
познакомиться с существующими
современными методами исследования.
В основе всех иммунологических методов лежит реакция
взаимодействия антиген-антитело.
Антиген – это молекула, чаще белок или полисахарид, образованная в
организме или поступившая из вне, вызывающая образование
специфического антитела.
Антитело – это молекула,
обладающая способностью
избирательно связываться
с антигеном.
Антиген и антитело
подходят друг другу
как ключ и замок.
К иммунологическим методам относятся: ИФА, иммунофлуоресцентная
микроскопия, иммуноблоттинг, иммуногистохимия,
иммунохроматография, проточная цитофлуориметрия
Объектом исследования
является кровь,
сыворотка, ликвор.
Антиген прикреплен к лунке
планшета, если в
исследуемом образце
вносимом в лунку
присутствует антитело,
Исследователь видит:
содержимое лунки
окрасится в цвет.
Окрашивание происходит
благодаря ферменту,
который связан с
антителами против
анализируемых антител.
В качестве метки используют такие
ферменты как: пероксидаза хрена,
щелочная фосфатаза, галактозидаза и др.
Для визуального учета реакции используют
хромогенные субстраты, растворы
которых, изначально бесцветные, а в
процессе ферментативной реакции
способны приобретать окраску,
интенсивность которой пропорциональна
количеству фермента. Так, для
выявления активности пероксидазы хрена
в качестве субстрата используют 5аминосалициловую кислоту, дающую
интенсивное коричневое
окрашивание, орто-фенилендиамин,
образующий оранжево-желтое
окрашивание. Для выявления активности
щелочной фосфатазы и β-галатозидазы
используют нитрофенилфосфаты и
нитрофенилгалактозиды соответственно.
Необходимое оборудование:
Для отмывки необходим прибор вошер, для инкубации с
антителами - шейкер, и для оценки окраски – ридер.
Пример:
определение титра антител к вирусу гепатита С, диагностика
клещевого энцефалита.
Объектом исследования
являются ткани, взятые у
человека (биопсия,
соскоб).
На ткань наносится антитело
содержащее
флуоресцентную метку.
Если в ткани присутствует
соответствующий антиген,
то он светится в
ультрафиолетовом свете.
Необходимое оборудование:
Люминесцентный микроскоп
Пример: выявление возбудителя инфекций,
например передающихся половым путем.
Исследователь видит:
Объектом исследования
являются клетки, взятые у
человека.
На ткань наносится антитело
содержащее ферментную
метку. Если в ткани
присутствует
соответствующий антиген,
то он окрашивается в цвет
расщепленным с помощью
фермента красителем.
Необходимое оборудование:
Световой микроскоп
Пример: определение типа
опухоли
Исследователь видит:
Объектом исследования
является белок.
В агарозный гель вносится
смесь беков, после чего они
разделяются с помощью
электрофореза и переносятся
на мембрану. Затем на
мембрану наносится антитело
содержащее флуоресцентную
метку. Если в смеси белков
присутствует
соответствующий антиген, то
он светится оставляя
опечаток на рентгеновской
пленке.
Необходимое оборудование:
Камера для электрофореза и
трансфера (переноса)
Пример: диагностика ВИЧ
инфекции
Исследователь видит:
Объектом исследования
являются любые
биологические жидкости.
Антитела находятся на
бумажной тест-полоске. При
смачивании под действием
капилярных сил жидкость
распределяется к
противоположному концу.
Если в жидкости имелись
искомые антигены, то место
прикрепления антител ,
окрашивается в цвет.
Необходимое оборудование:
Иммунохроматографический
анализатор, для некоторых
тестов оборудование не
требуется, оценка
проводится визуально
Пример: тест на беременность
Исследователь видит:
Объектом исследования
являются клетки.
К исследуемым клеткам
добавляют антитела несущие
флуоресцентную метку, если
соответствующий антиген
имеется на поверхности либо
внутри клетки, то после
отмывки излишек антител,
связавшиеся останутся и
будут светиться. Далее
клеточная взвесь поступает в
проточный цитофлуориметр,
где с помощью двух лазерных
лучей происходит оценка
размеров и свечения клеток.
Необходимое оборудование:
Проточный цитофлуориметр
Пример: диагностика лейкозов
Исследователь видит:
В основе лежит свойство комплементарности
нуклеиновых кислот, т.е. образования
водородных связей между аденином—
тимином (или урацилом в РНК)
и гуанином—цитозином при
взаимодействии цепей нуклеиновых
кислот.
Принцип метода основан на копировании
участка ДНК с помощью специфических
праймеров и фермента.
На первом этапе под действием высокой
температуры (940С) двойная цепь ДНК
расходится.
На втором этапе происходит присоединение
специфических коротких цепочек
нуклеиновых кислот к цепям ДНК.
На третьем этапе фермент под названием
ДНК-полимераза производит
достраивание цепи, таким образом
удваивая количество исследуемого
фрагмента и так происходит от 30 до 40
раз, что позволяет экспоненциально
увеличивать количество анализируемого
фрагмента.
Затем с помощью электрофореза
реакционная смесь разделяется и
фрагменты светятся в ультрафиолетовом
свете, что позволяет их визуально
идентифицировать.
Пример: диагностика герпеса
Отличается от классической
ПЦР методом детекции
продукта. С помощью
флуоресцентных
красителей, либо
специфических
флуоресцентных
олигонуклеотидных меток
после каждого цикла
специальный прибор
считывает уровень
свечения и выдает
исследователю график, по
которому возможно
оценить не только
наличие продукта, так и
его количество.
На исследуемые клетки
наносят специфический
ДНК-зонд с
флуоресцентной меткой,
если в геноме клетки
есть комплементарный
этому зонду участок, то
происходит их
связывание.
Необходимое
оборудование:
гибридайзер,
люминесцентный
микроскоп
Пример: диагностика
синдрома Дауна
Основана на сравнении
тестируемой и
контрольной ДНК,
меченных разными
флуорохромами, которые
смешиваются в
соотношении 1:1 и
гибридизуются на
метафазных хромосомах
кариотипически
здорового человека.
Позволяет выявлять
грубые нарушения в ДНК
человека.
Это определение последовательности
нуклеотидов в ДНК или РНК. Дает
наиболее полную характеристику
генетического кода человека, позволяет
выявлять мутации.
Представляют собой подложку с множеством
нанесённых молекулам белков или
нуклеиновых кислот. Позволяют
одновременно проводить большое число
анализов в одном образце.
В зависимости от нанесенных молекул механизм
действия биочипов основывается либо на
связывании антител с антигенами, либо на
взаимодействии комплементарных цепей ДНК.
Область применения биочипов от определения
концентрации веществ в крови до выявления
мутаций в геноме.
Применение представленных методов анализа
биологического материала помогает врачам
прогнозировать развитие заболевания,
устанавливать диагноз и оценивать
эффективность проводимого лечения, а также
ученым разрабатывать новые средства
диагностики и способы лечения.