Разработка и изучение рекомбинантных антител против вируса
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН На правах рукописи Байков Иван Константинович Разработка и изучение рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент Н.В. Тикунова Новосибирск – 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................10 1.1. Структурно-функциональная организация природных антител ...................................10 1.2. Рекомбинантные антитела ................................................................................................15 1.2.1. Химерные антитела .....................................................................................................16 1.2.2. Гуманизированные антитела ......................................................................................17 1.2.3. Полноразмерные антитела человека .........................................................................20 1.2.4. Мини- и нано-антитела ...............................................................................................22 1.2.5. Изотипы, используемые для создания терапевтических антител ..........................24 1.3. Получение рекомбинантных антител ..............................................................................25 1.3.1. Этапы процесса разработки и производства полноразмерных рекомбинантных антител....................................................................................................................................25 1.3.2. Очистка рекомбинантных антител ............................................................................25 1.4. Вирус клещевого энцефалита как мишень для иммунотерапии ...................................30 1.4.1. Таксономия рода Flavivirus ........................................................................................30 1.4.2. Строение вириона ВКЭ...............................................................................................30 1.4.3. Строение поверхностного гликопротеина Е ВКЭ ...................................................31 1.4.4. Жизненный цикл ВКЭ ................................................................................................34 1.4.5. Моноклональные антитела против ВКЭ и других флавивирусов ..........................40 1.4.6. Исследование механизмов нейтрализации флавивирусов антителами .................43 1.4.7. Способы профилактики и лечения вирусного клещевого энцефалита .................47 1.4.8. Разработка терапевтических антител против ВКЭ и других флавивирусов .........48 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..............................................................................54 2.1. Реактивы и материалы .......................................................................................................54 2.1.1. Список реактивов ........................................................................................................54 2.1.2. Антигены ......................................................................................................................55 2.1.3. Растворы .......................................................................................................................55 2.1.4. Культуральные среды .................................................................................................55 2.1.5. Плазмидные ДНК ........................................................................................................56 2.1.6. Бактерии .......................................................................................................................56 2.1.7. Клеточные линии ........................................................................................................56 2.1.8. Олигонуклеотиды ........................................................................................................56 2.2. Методы ................................................................................................................................57 2.2.1. Исследование протективных свойств препаратов моноклональных и рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита ....................................57 2.2.2. Выделение суммарной РНК из гибридомных клеток..............................................57 2.2.3. ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)......................................58 2.2.4. ПЦР ...............................................................................................................................58 2 2.2.5. Амплификация участков ДНК, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов ........................................................................................59 2.2.6. Встраивание VH- и VL-фрагментов плазмиду pUC19 ..............................................59 2.2.7. Лигирование ДНК .......................................................................................................59 2.2.8. Ферментативный гидролиз ДНК ...............................................................................60 2.2.9. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК .....................................................60 2.2.10. Выделение плазмидной ДНК ...................................................................................60 2.2.11. Определение концентрации нуклеиновых кислот .................................................60 2.2.12. Электрофоретическое фракционирование ДНК ....................................................61 2.2.13. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК ......................................61 2.2.14. Конструирование векторных плазмид pCH2 и pCL2 ............................................61 2.2.15. Встраивание VH- и VL-фрагментов в векторные плазмиды pCH2 и pCL2 ..........63 2.2.16. Выделение плазмидной ДНК, не содержащей эндотоксинов ..............................63 2.2.17. Электрофоретический анализ белков......................................................................64 2.2.18. Масс-спектрометрический анализ антител ............................................................64 2.2.19. Дегликозилирование антител ...................................................................................65 2.2.20. Трансфекция и культивирование клеток ................................................................65 2.2.21. Хроматографическое выделение рекомбинантных антител .................................66 2.2.22. Анализ олигомерных форм антител с использованием высокоэффективной гель-фильтрации ....................................................................................................................67 2.2.23. Вестерн-блот анализ .................................................................................................67 2.2.24. Твердофазный иммуноферментный анализ ...........................................................68 2.2.25. Исследование сродства антител к рекомбинантному белку Е с использованием оптического биосенсора ProteOn XPR 36 ...........................................................................68 2.2.26. Изучение нейтрализующей активности антител in vitro в реакции ингибирования фокусообразования ....................................................................................69 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................................71 3.1. Оценка протективной активности мышиных моноклональных антител против ВКЭ in vivo с целью выбора прототипного антитела .....................................................................71 3.2. Получение ДНК-фрагментов, кодирующих вариабельные домены МКА 14D5, 1B1 и 13D6, и определение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов ....................72 3.3. Электрофоретический и масс-спектрометрический анализ образца МКА 14D5 ........79 3.4. Конструирование кассетных плазмидных ДНК для экспрессии полноразмерных рекомбинантных антител с константной частью иммуноглобулинов человека IgG1/каппа81 3.5. Конструирование плазмидных ДНК для экспрессии химерных антител на основе МКА 14D5..................................................................................................................................88 3.6. Наработка и очистка химерных антител ch14D5a и ch14D5b .......................................89 3.7. Масс-спектрометрический анализ химерных антител ch14D5a и ch14D5b. Проверка наличия гликозилирования у полученных антител. ..............................................................94 3.8. Определение иммунохимических свойств антител ch14D5a и ch14D5b ...................102 3.9. Нейтрализация инфекционности ВКЭ антителом ch14D5а и МКА 14D5 in vitro ....105 3 3.10. Протективная активность антитела ch14D5a против ВКЭ in vivo ............................106 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ...................................................................108 ВЫВОДЫ................................................................................................................................115 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .............................................116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................118 ПРИЛОЖЕНИЕ ....................................................................................................................150 БЛАГОДАРНОСТИ .............................................................................................................157 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Антитела (иммуноглобулины) – гликопротеины сыворотки крови, которые образуются клетками иммунной системы в ходе иммунного ответа на чужеродные для организма соединения, называемые антигенами, и необходимы для их нейтрализации и деградации. В настоящее время антитела и их производные широко используются в медицине для лечения, предотвращения и диагностики различных заболеваний и нарушений (Saylor C. et al., 2009; Berry J. D. et al., 2011). Использование сывороточных антител человека и моноклональных антител животных в терапии ограничено, что связано либо с их поликлональным характером, либо с чужеродностью таких антител для человека (Chames P. et al., 2009). Широкое развитие получили различные варианты рекомбинантных (искусственных) антител, таких как химерные, гуманизированные и полноразмерные инженерными человеческие методами и антитела. получают Такие антитела биотехнологически конструируют в культурах генноклеток, контролируя их свойства и обеспечивая однородность от партии к партии (Chames P. et al., 2009). Благодаря возможности изменять и добавлять функциональные участки в молекуле антитела, технология создания рекомбинантных антител позволяет получать биомолекулы, специализированные для решения конкретной задачи. В результате, рекомбинантные антитела являются активным компонентом многих современных противораковых и противовирусных препаратов, а также препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний (Nelson A. L. et al., 2010). Одной из проблем здравоохранения Российской Федерации, ряда европейских стран, а также северного Казахстана, Монголии и Китая является клещевой энцефалит, вызываемый вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) (Suss J., 2010). Ежегодно в мире клещевым энцефалитом заболевают от 6 до 12 тысяч человек в зависимости от года, при этом более половины случаев приходится на территорию России (Lindquist L. et al., 2008). В России и Казахстане для профилактики и этиотропной терапии клещевого энцефалита применяют «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита» (ФГУП «НПО «Микроген», Россия), получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания (Пеньевская Н. А. и др., 2010). Дефицит и высокая стоимость данного препарата, а также возможный биологический риск при его применении приводят к необходимости поиска альтернативных терапевтических 5 средств. В качестве альтернативы могут быть использованы рекомбинантные полноразмерные антитела, такие как химерные или гуманизированные варианты мышиных антител против вируса клещевого энцефалита. Цель данной работы – создание протективного химерного антитела против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита и изучение его иммунохимических и противовирусных свойств. В соответствии с поставленной целью было необходимо решить следующие задачи: 1) клонировать гены гибридомной линии клеток, кодирующие вариабельные домены протективного моноклонального антитела против вируса клещевого энцефалита; 2) сконструировать кассетные векторные плазмиды для экспрессии генов, кодирующих полноразмерные антитела с константными доменами иммуноглобулинов человека, в эукариотических клетках и получить на их основе плазмиды с генами лёгкой и тяжёлой цепей химерного антитела против ВКЭ; 3) провести очистку химерного антитела, наработанного путём транзиентной экспрессии в эукариотических клетках, и исследовать его структурные характеристики: молекулярную массу, число лёгких и тяжёлых цепей, степень и тип гликозилирования; 4) определить сродство химерного антитела к белку Е вируса клещевого энцефалита и исследовать противовирусные свойства этого антитела по отношению к вирусу клещевого энцефалита. Научная новизна работы. В настоящей работе впервые было сконструировано химерное антитело, способное защищать мышей от введения сотен летальных доз ВКЭ. Определены нуклеотидные последовательности участков, кодирующих вариабельные домены ряда перспективных мышиных моноклональных антител (МКА) против ВКЭ. Полученные последовательности депонированы в базу данных GenBank. Показано, что введение химерного антитела ch14D5a в субнейтрализующей дозировке не вызывает антителозависимого усиления инфекции на мышиной модели клещевого энцефалита. 6 Основные научные положения, выносимые на защиту. 1. Впервые сконструировано химерное антитело, способное защищать мышей от введения сотен летальных доз ВКЭ. 2. Структурная организация сконструированного химерного антитела, включая тип гликозилирования, соответствует характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках CHO и применяемых в терапии. 3. Гибридомная линия клеток 14D5 продуцирует протективные антитела против ВКЭ с двумя типами вариабельных доменов лёгкой цепи, отличающимися по последовательности а.к.о. и относящимися к разным семействам VL-генов мыши. 4. Сконструированные плазмиды pCH2 и pCL2 позволяют ускорить процесс получения новых полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках по сравнению с предыдущими плазмидами pCH и pCL. Практическая и теоретическая значимость работы. Получено химерное антитело ch14D5a против ВКЭ, которое обладает терапевтическим потенциалом и может быть использовано для создания новых эффективных средств профилактики и лечения клещевого энцефалита, отвечающих современным стандартам. Сконструированы плазмидные шаттл-векторы pCH2 и pCL2, предназначенные для экспрессии в эукариотических полноразмерных рекомбинантных клетках генов тяжёлых и легких цепей антител, содержащих константные домены иммуноглобулинов IgG1/каппа человека. Эти плазмиды могут быть использованы для получения различных полноразмерных антител, в частности с их помощью были получены полноразмерные человеческие антитела против ортопоксвирусов (Khlusevich Y. A. et al., 2014; Байков И. К. и др., 2013), ДНК-гидролизующие полноразмерные антитела (Morozova V. V. et al., 2013), а также антитела против интерлейкина-18 (данные не опубликованы). Сконструированы плазмиды pCH2-14D5 и pCL2-14D5a, кодирующие цепи химерного антитела против ВКЭ. С помощью этих плазмид возможно получение вариантов антитела ch14D5a в экспрессионных системах, отличных от клеток CHO, например, для получения различных гликоформ этого антитела. 7 Полученные в данной работе нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные домены некоторых наиболее перспективных МКА против ВКЭ, могут быть использованы для анализа и сравнения с последовательностями других антител. Для антитела ch14D5a определены иммунохимические и противовирусные свойства, такие как сродство к белку Е ВКЭ, индекс нейтрализации (IC50) и протективная активность на мышиной модели ВКЭ. Эти значения могут быть использованы для анализа и сопоставления со свойствами других антител против ВКЭ. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК и 2 в рецензируемых зарубежных журналах. Кроме этого получен патент РФ. Материалы диссертации были также представлены на различных Российских и зарубежных конференциях: XLVI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, экологическая Россия, студенческая 2008); конференция МЭСК–2008 «Экология – Международная XIII России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (Новосибирск, Россия, 2008); IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009); Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 2009); ХХII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, Россия, 2010); V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, Россия, 2011); XLIХ Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2011); Международная научная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Иркутск, 2012); Международная научная конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2012); 38th FEBS Congress (СанктПетербург, 2013); Научно-практическая конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2013); “17th Annual Meeting of the European Society for Clinical Virology” (Прага, Чехия, 2014); “3rd Antivirals Congress” (Амстердам, Нидерланды, 2014). Вклад автора. Большинство экспериментов и анализ полученных данных сделаны лично автором. Автор благодарен коллегам, которые помогли выполнить некоторые эксперименты, без которых работа была бы неполной. В частности, протективная активность антител была исследована в НПО «Микроген», г. Томск. 8 Изучение вируснейтрализующей активности in vitro выполняли совместно с к. б. н. А. Б. Рыжиковым, ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”. Некоторые стадии при создании генетических конструкций, кодирующих химерное антитело, выполнены при содействии И.Н. Бабкиной. Трансфекцию и культивирование эукариотических клеток для наработки химерных антител осуществлял А. Л. Матвеев. При секвенировании ДНК капиллярный электрофорез подготовленных проб выполняли сотрудники Центра коллективного пользования “Геномика” СО РАН. В масс-спектрометрических исследованиях определение масс-спектров подготовленных образцов выполнено сотрудниками Центра масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН либо сотрудником Лимнологического института СО РАН И. Г. Кондратовым. 9 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структурно-функциональная организация природных антител Иммуноглобулины, или антитела, представляют собой гликопротеины, которые вырабатываются клетками иммунной системы (B-лимфоцитами) в ответ на чужеродный агент – антиген. Антитела распознают и связывают определенный антиген, а также запускают механизмы уничтожения и выведения этого антигена из организма (Мейл Д., 2007). Антитела млекопитающих подразделяют на пять классов, которые различаются по структуре молекул и по выполняемым в организме функциям. Эти классы обозначены IgA, IgG, IgD, IgE и IgM, где буквы Ig являются сокращением от immunoglobulin. У птиц и рептилий выделяют отдельный класс IgY, у акул и скатов дополнительно выделяют класс IgW. Подавляющее большинство природных иммуноглобулинов состоит из нескольких тяжёлых и нескольких лёгких цепей, которые отличаются друг от друга размером и, соответственно, молекулярной массой (Рисунок 1). Структура молекулы антитела и принадлежность к тому или иному классу определяется принадлежностью тяжёлых цепей к одному из пять типов: α (альфа), γ (гамма), δ (дельта), ε (эпсилон), μ (мю). Основные различия между типами тяжёлых цепей заключаются как в аминокислотной последовательности, так и в ковалентносвязанных олигосахаридах, присутствующих на поверхности тяжелых цепей. Легкие цепи в молекуле антитела любого класса могут быть одного из двух типов – κ (каппа) или λ (лямбда). тяжёлая цепь лёгкая цепь J-цепь секреторный компонент Рисунок 1. Классы иммуноглобулинов млекопитающих. Изображение переработано на основе http://absoluteantibody.com/ 10 Среди всех классов иммуноглобулинов в организме количественно преобладают иммуноглобулины класса IgG, подразделяемые на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 (Рисунок 2), которые в свою очередь делят на аллотипы и могут находиться в различных гликоформах (Vidarsson G. et al., 2014). В сыворотке крови млекопитающих иммуноглобулины IgG составляют около 75% от общего количества антител. Они представляют собой симметричные, Y-образные молекулы, состоящие из двух тяжелых и двух легких цепей, которые соединены между собой дисульфидными мостиками и стабилизированы нековалентными взаимодействиями (Wang W. et al., 2007). По данным рентгеноструктурного анализа, цепи антител имеют доменную структуру, поддерживаемую за счёт внутримолекулярных дисульфидных связей и нековалентных взаимодействий (Wang W. et al., 2007; Narciso J. E. et al., 2011) (Рисунок 3). Все домены имеют сходную структуру – так называемый иммуноглобулиновый тип фолдинга (Bork P. et al., 1994), – которая сформирована двумя β-листами. Рисунок 2. Подклассы иммуноглобулинов IgG млекопитающих. Рисунок заимствован из (“Kuby Immunology”, 2009). Легкие цепи состоят из двух доменов – вариабельного (VL) и константного (CL). Первый обладает повышенной гетерогенностью аминокислотной последовательности, в то время как последовательность константного домена практически идентична для лёгких цепей одного типа (каппа или лямбда). Тяжелые цепи содержат один вариабельный домен, обозначаемый VH, и три или четыре константных домена (CH1, CH2, CH3 …) в зависимости от класса тяжелой цепи. Между доменами СН1 и СН2 расположена шарнирная область (Рисунок 3), обогащенная 11 остатками пролина, которые обеспечивают конформационную гибкость молекулы (Furtado P. B. et al., 2004; Wang W. et al., 2007). Б) А) Fab Fab Fc шарнирный участок Рисунок 3. Трехмерная структура молекулы антитела (PDB_1IGT), полученная рентгеноструктурным анализом. Фронтальная (А) и боковая (Б) проекции. Желтым и голубым отмечены тяжёлые цепи, оранжевым и зелёным – легкие цепи антитела. Шариками отмечена углеводная часть молекулы. В молекуле антител домены VH и VL образуют комплекс, который формирует антигенсвязывающий центр. Комплекс стабилизирован водородными связями, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями (Padlan E., 1994; Wang W. et al., 2007). За счёт константных доменов CH2 и CH3 реализуются эффекторные функции антител в организме, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность и комплементзависимая цитотоксичность (Shade K. C. et al., 2013; Vidarsson G. et al., 2014). Эти домены содержат участки узнавания компонента C1q системы комплемента (Kishore U. et al., 2000; Ghai R. et al., 2007), а также различных рецепторов на поверхности клеток иммунной системы (Suzuki T. et al., 2010). Домены относительно устойчивы к протеолитическому гидролизу, однако междоменные области, в особенности шарнирный участок антитела, чувствительны к действию некоторых протеаз. Папаин расщепляет молекулу IgG на два Fab-фрагмента (Fragment antigen binding), способных связываться с антигеном, и один Fc-фрагмент (Fragment crystallizable), который относительно легко кристаллизуется, но не связывает антиген. Fab-фрагмент состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH и CH1- домены. Fc-фрагмент является димером (CH2+CH3)2 (Wang W. et al., 2007; Johnson M., 2013). Пепсин расщепляет молекулу IgG с образованием CH3-димера (Fc’) и F(ab’)2-фрагмента, содержащего два антигенсвязывающих центра. Фрагменты тяжелых 12 цепей в F(ab’)2-фрагменте ковалентно связаны дисульфидным мостиком (Johnson M., 2013). Антигенсвязывающий центр иммуноглобулинов образуется при взаимодействии вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. При сравнении аминокислотных последовательностей ряда иммуноглобулинов было выявлено, что в вариабельных доменах некоторые участки обладают повышенным разнообразием. Такие участки, названные гипервариабельными или CDR (complementary determining regions), соответствуют гипервариабельным петлям, которые связываются с антигеном (Padlan E., 1994). Менее вариабельные участки, называемые каркасными или FR (framework regions), формируют структуру вариабельного домена и содержат последовательности, определяющие взаимодействие вариабельных доменов тяжёлой и лёгкой цепей между собой. Иммуноглобулины классов IgM, IgA, IgD и IgE содержатся в организме млекопитающих в меньшем количестве и выполняют другие функции. Иммуноглобулины IgM вырабатываются в организме в качестве первичного иммунного ответа. Такие антитела являются наиболее крупными иммуноглобулинами и обладают молекулярной массой около 970 кДа. Молекулы IgM представляют собой пентамеры основной четырёхцепочечной единицы и содержат десять антигенсвязывающих центров, благодаря чему обладают высокой авидностью (Мейл Д., 2007). Антитела класса IgA подразделяют на сывороточные и секреторные. Основные функции секреторных IgA заключаются в защите слизистых оболочек дыхательных и мочеполовых путей, а также желудочно-кишечного тракта от инфекций. Молекулы секреторных IgA представляют собой димеры основной четырёхцепочечной единицы и характеризуются молекулярной массой около 385 кДа (Мейл Д., 2007). Антитела класса IgD составляют менее 1% от общего количества иммуноглобулинов сыворотки крови людей. Трансмембранная мономерная форма IgD (mIgD) служит антиген-специфическим рецептором зрелых B-клеток (Мейл Д., 2007). Антитела класса IgE являются самыми редкими, их концентрация в сыворотке крови людей составляет менее 0,05 мкг/мл, однако антитела этого класса распространены на поверхности базофилов и тучных клеток. Молекулы IgE состоят из одной четырёхцепочечной единицы и имеют молекулярную массу около 190 кДа (Мейл Д., 2007). 13 Природные Углеводные иммуноглобулины остатки являются всех важной классов являются структурной гликопротеинами. особенностью антител и необходимы для взаимодействия с белками иммунной системы (обзор в Shade K. C. et al., 2013). В частности, состав и структура полисахаридных остатков антитела влияют на сродство к про- и противовоспалительным рецепторам FcγR, неонатальному рецептору FcRn, рецептору DC-SIGN и компоненту C1q системы комплемента (Vidarsson G. et al., 2014). Каждый класс иммуноглобулинов обладает уникальным профилем гликозилирования. Иммуноглобулины IgG наименее гликозилированы среди всех иммуноглобулинов: каждая тяжёлая цепь содержит один консервативный сайт Nгликозилирования Asn297, а масса углеводной части составляет 2-3% от массы молекулы (Arnold J. N. et al., 2007). Сайт гликозилирования иммуноглобулинов IgG расположен в CH2-домене таким образом, что углеводные цепи направлены друг к другу (Рисунок 3), удерживая Fc-область антитела в открытой конформации (Feige M. J. et al., 2009). Искусственное удаление гликанов приводит к сближению тяжёлых цепей, при этом Fcчасть антитела принимает закрытую конформацию (Feige M. J. et al., 2009). Молекулы антитела в такой конформации обладают существенно сниженным сродством к рецепторам FcγR и компоненту C1q системы комплемента, что приводит к резкому снижению антителозависимой клеточной цитотоксичности и комплементзависимой цитотоксичности таких антител (Jefferis R. R., 1993; Jefferis R. et al., 2002). N-гликаны иммуноглобулинов IgG представляют собой разветвлённые углеводы, которые состоят из инвариантной центральной части и некоторого набора дополнительных углеводных остатков (Рисунок 4). Профиль гликозилирования иммуноглобулинов IgG у людей разнообразен, обнаружено более 30 различных гликоформ тяжёлой цепи (Jefferis R. R., 2012; Arnold J. N. et al., 2007; Zauner G. et al., 2013). Комбинирование различных гликоформ двух тяжёлых цепей приводит к дальнейшему увеличению разнообразия гликоформ иммуноглобулинов IgG (Shade K. C. et al., 2013). Фукозилированные гликаны антител IgG человека, которые составляют более 92% от общего числа, подразделяют на три основных гликоформы: G0F, G1F и G2F в зависимости от числа терминальных остатков галактозы (Рисунок 4). Около 11% полисахаридов Fc-участка иммуноглобулинов IgG человека имеют биcсекторный остаток N-ацетилглюкозамина (гликоформа G0B), около 5 – 10% содержат один 14 терминальный остаток сиаловой кислоты (гликоформа S1), и менее 1% содержат два таких остатка (Stadlmann J. et al., 2009; Zauner G. et al., 2013). Сродство про- и противовоспалительных рецепторов иммунной системы к Fc-участку молекулы антитела зависит от гликоформы и в совокупности определяет эффекторные функции, проявляемы антителом (Anthony R. M. et al., 2012; Vidarsson G. et al., 2014). биcсекторный GlcNAc Asn297 Asn297 Asn297 Asn297 G0F G1F G2F G0B Asn297 S1 Man Fuc Gal GlcNAc Сиаловая кислота (NANA) Рисунок 4. N-гликозилирование иммуноглобулинов IgG человека. 1.2. Рекомбинантные антитела Рекомбинантные антитела – это получаемые методами генетической инженерии искусственные белки, специфичные к некоторому антигену и имеющие структурное сходство с природными иммуноглобулинами. Наиболее распространёнными видами полноразмерных рекомбинантных антител являются химерные, гуманизированные и человеческие антитела, молекулярная организация которых не отличается от организации природных иммуноглобулинов класса IgG (Рисунок 5) (Chadd H. E., 2001; Деев С. М., 2009; Альтшулер Е. П. и др., 2010). Кроме того, разработаны нано- и миниантитела, которые не имеют природных аналогов (Siontorou C. G. et al., 2013; Muyldermans S., 2013). Благодаря возможности изменять и добавлять функциональные участки в молекуле антитела, технология создания рекомбинантных антител позволяет получать биомолекулы, предназначенные для решения конкретной задачи. Поэтому для терапевтического применения определённые 15 виды рекомбинантных антител превосходят по эффективности препараты на основе сывороточных антител человека или моноклональных антител животных (Presta L. G., 2008; Chames P. et al., 2009; Nelson A. L. et al., 2010). исходное моноклональное антитело замена вариабельных доменов полноразмерное антитело человека замена гипервариабельных участков химерное антитело гуманизированное антитело Рисунок 5. Виды полноразмерных рекомбинантных антител. 1.2.1. Химерные антитела Химерные антитела (англ. chimeric antibody, chimaeric antibody, chAb) – это иммуноглобулины, в которых константные домены тяжёлых и лёгких цепей человеческого антитела объединены с вариабельными доменами тяжёлых и лёгких цепей мышиного моноклонального антитела или антитела другого животного. Такие антитела сохраняют специфичность исходного моноклонального антитела, и при этом способны запускать механизмы антителозависимой клеточной цитотоксичности и комплементзависимой цитотоксичности в организме человека. Другим преимуществом химерных антител является сниженная иммуногенность для человека по сравнению с исходным моноклональным антителом, т.к. доля чужеродных аминокислотных последовательностей в молекуле химерного антитела составляет менее 33% (Almagro J. C. et al., 2009). В случае непродолжительных курсов лечения иммунный ответ на химерные антитела, как правило, не развивается. 16 Исследования по получению химерных антител человека проводились параллельно несколькими группами исследователей в США, Канаде и Японии, и в середине 80-х гг. были получены первые химерные антитела. В 1984 году была опубликована работа, в которой описано получение химерного антитела против фосфохолина на основе вариабельных доменов мышиного антитела класса IgA и генов константных доменов человеческих антител IgG1 и IgG2 (Morrison S. L., 1984). Антитела были функционально активны и гликозилированы, однако профиль гликозилирования тяжёлых цепей соответствовал мышиным антителам. В том же 1984 году была опубликована работа канадских исследователей, которые получили химерное антитело изотипа IgM, обладающее специфичностью против тринитрофенола (Boulianne G. L., 1984). Позже была опубликована работа японских исследователей, которые сконструировали aнти-неопластическое химерное антитело (Takeda S., 1985). В 1985 году была опубликована работа группы учёных из Кембриджа, в которой в результате трансфекции миелоидных клеток препаратом ДНК, содержащим гены константных доменов иммуноглобулинов человека, было получено химерное антитело класса IgE/лямбда1 против 4-гидрокси-3-нитро-фенилацетата (Neuberger M. S. et al., 1985). К настоящему времени сделано много исследований в этой области, и сейчас ряд препаратов на основе химерных антител одобрен и успешно используется для лечения различных заболеваний. В таблице 1 приведена информация о некоторых из этих препаратов. 1.2.2. Гуманизированные антитела При длительном лечении химерные антитела в некоторых случаях вызывают сильный иммунный ответ в организме пациента (Tan P. et al., 2002). Для снижения иммуногенности были разработаны гуманизированные антитела, в которых от исходного моноклонального антитела остаются только гипервариабельные петли, а оставшаяся часть молекулы идентична по аминокислотной последовательности человеческим иммуноглобулинам. Работы по созданию гуманизированных и химерных антител начались приблизительно в одно и то же время, и первое гуманизированное антитело было создано в 1986 году (Jones P. T. et al., 1986). В этой работе было продемонстрировано, что аффинность гуманизированного антитела к антигену практически не отличалась от аффинности исходного моноклонального антитела. Вскоре были также созданы 17 гуманизированные антитела против антигена CD52 и лизоцима (Riechmann L. et al., 1988; Verhoeyen M. et al., 1988). Таблица 1. Терапевтические препараты на основе химерных антител Название Специфичность Применение Abciximab Интегрин альфа-IIb (CD41) Предотвращение агрегации тромбоцитов Basiliximab Альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 (CD25) Предотвращение отторжения трансплантантов Cetuximab Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) Лечение рака толстого кишечника, опухолей головы и шеи Clenoliximab Ко-рецептор CD4 Лечение ревматоидного артрита Ecromeximab Ганглиозид GD3 Лечение злокачественной меланомы Galiximab Антиген CD80 Лечение В-клеточных лимфом Gomiliximab CD23 (рецептор антител IgE) Лечение аллергической астмы Infliximab Фактор некроза опухолей-альфа Лечение ревматоидного артрита и ряда аутоиммунных заболеваний Keliximab Ко-рецептор CD4 Лечение хронической астмы Rituximab B-лимфоцитарный антиген CD20 Лечение лимфом, лейкемий, а также некоторых аутоиммунных нарушений Volociximab Интегрин α5β1 Лечение солидных опухолей Конструирование гуманизированных антител является более трудоёмким по сравнению с конструированием химерных антител. Критичен выбор подходящей каркасной последовательности человеческого антитела, т.к. от этого зависит конформация, которую примут пересаживаемые гипервариабельные участки. Изменение их пространственного расположения может привести к значительному снижению сродства гуманизированого антитела к антигену по сравнению с исходным антителом (Benny K. C., 2003). Современные подходы основаны на пространственно-структурной классификации гипервариабельных петель мышиных и человеческих антител, согласно которой разнообразие структур этих петель сводится к конечному числу канонических форм (Chothia C. et al., 1987; Chothia C. et al., 1989; Tramontano A. et al., 1990; Chothia C. et al., 1992). Канонические структуры установлены для всех гипервариабельных 18 участков кроме третьего гипервариабельного участка тяжёлой цепи (HCDR3), который слишком разнообразен. Полагают, что участок HCDR3 вносит существенный вклад во взаимодействие антитела с антигеном, поэтому сохранение его конформации является важной и нетривиальной задачей (Benny K. C., 2003). Другие методы выбора каркасных областей гуманизированного антитела основаны на сходстве аминокислотных последовательностей либо на соответствии классов вариабельных доменов мышиных иммуноглобулинов вариабельным доменам человеческих антител. В некоторых случаях конформация гипервариабельного участка зависит от наличия определённого аминокислотного остатка (а.к.о.) в конкретном положении каркасного участка, и единичные мутации в каркасных участках могут приводить к значительному изменению аффинности рекомбинантного антитела (Riechmann L. et al., 1988; Queen C. et al., 1989; Foote J 1992). Для большинства канонических структур установлены точные позиции и характер необходимых а.к.о. (Bendig M. M. et al., 1996), поэтому результат гуманизации антител стал более предсказуемым. В некоторых случаях а.к.о. каркасных участков непосредственно участвуют в контакте с антигеном (Mian I. S. et a1., 1991), и их замена приводит к снижению сродства антитела. Такие особенности можно выявить на основе пространственной структуры антитела, полученной методом рентгеноструктурного анализа или в результате моделирования. Экспериментально снижение иммуногенности гуманизированных антител по сравнению с химерными было подтверждено с использованием антител против фактора некроза опухоли-альфа (Tan P. et al., 2002). Пациентам с болезнью Крона вводили химерные и гуманизированные варианты антител, при этом в случае гуманизированных антител иммунный ответ был заметно ниже. Несмотря на общее снижение иммуногенности гуманизированных антител по сравнению с химерными, в некоторых случаях гуманизированные антитела способны вызывать сильный иммунный ответ. Например, при клинических испытаниях гуманизированного антитела A33 против рака толстой кишки, у 65% пациентов был обнаружен иммунный ответ по отношению к этому препарату, что в конечном итоге привело к прекращению испытаний (Ritter G. et al., 2001). 19 Для того чтобы ещё сильнее снизить иммуногенность препарата, от исходного моноклонального антитела оставляют только те аминокислотные остатки, которые непосредственно участвуют в связывании антигена. Такие антитела называют улучшенными гуманизированными антителами (англ. SDR-grafted antibodies, где SDR – specificity determining residues – аминокислотные остатки, определяющие специфичность) (Kashmiri S. V. S. et al., 2005). В настоящее время активно ведутся исследования в этом направлении, однако сложно оценить долю таких антител на рынке, поскольку их часто также называют гуманизированными. При разработке рекомбинантного антитела следует учитывать, что гуманизированные антитела, как правило, значительно менее иммуногенны по сравнению с химерными, однако процесс их разработки более затратный. Поэтому для однократного введения или непродолжительных курсов лечения возможно использовать химерные антитела. При длительном лечении, например, онкологических заболеваний, иммуногенность препарата является серьёзным препятствием, поэтому в таких случаях предпочтительно использовать гуманизированные либо полностью человеческие антитела. В таблице 2 приведена информация о некоторых имеющихся на фармацевтическом рынке препаратах гуманизированных антител. 1.2.3. Полноразмерные антитела человека Наименее иммуногенными для человека полноразмерными рекомбинантными антителами являются полностью человеческие антитела (англ. fully human antibody, fhAb). Большинство человеческих антител получено иммунизацией трансгенных мышей, в которых мышиные гены иммуноглобулинов заменены человеческими, с последующим получением гибридомной линии клеток (Jakobovits A., 1995; Marasco W. A. et al., 2007). В настоящее время значительных успехов в этой области добились компании Medarex в составе Bristol Myers Squibb, Abgenix в составе Amgen, Regeneron’s VelocImmune technology, Kymab и др. Альтернативным подходом является получение человеческих антител in vitro с использованием методов фагового или клеточного дисплея на основе комбинаторных библиотек генов антител (Тикунова Н. В. и др., 2009; Geyer C. R. et al., 2012; Tohidkia M. R. et al., 2012; Shukra A. M. et al., 2014). Методы дисплея основаны на обогащении 20 Таблица 2. Терапевтические препараты на основе гуманизированных антител Название официальное/торговое Специфичность Применение Alemtuzumab Антиген CD52 Лечение хронического лимфоцитарного лейкоза, рассеянного склероза, неходжкинских лимфом Bevacizumab/ Avastin Васкулярный эндотелиальный фактор роста А, VEGF-A Лечение метастаз, ретинопатии недоношенных Daclizumab/Zenapax СD25 (α-цепь рецептора IL-2) Предотвращение реакции отторжения трансплантата Eculizumab/Soliris Белок C5 системы комплемента Лечение пароксизмальной ночной гемоглобинурии Mogamulizumab/Poteligeo СС-хемокиновый рецептор 4 (CCR4, CD194) Т-клеточная лимфома взрослых Natalizumab/Tysabri Интегрин α4 Лечение рассеянного склероза и болезни Крона Nimotuzumab/TheraCIM Theraloc Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) Лечение опухолей головы и шеи, рака носоглотки и глиом Obinutuzumab B-лимфоцитарный антиген CD20 Лечение хронического лимфоцитарного лейкоза Omalizumab/Xolair Fc-участок иммуноглобулинов Лечение/предотвращение IgE аллергической астмы Palivizumab/Synagis Abbosynagis Белок F респираторного синцитиального вируса человека Профилактика инфекций респираторным синцитиальным вирусом человека Pembrolizumab/Keytruda Рецептор программируемой клеточной смерти 1 (PD-1) Лечение злокачественной меланомы Pertuzumab/Perjeta Рецептор HER2/neu Лечение рака молочной железы Talizumab Fc-участок иммуноглобулинов Предотвращение аллергических IgE реакций Tocilizumab/Actemra Рецептор IL-6 Лечение ревматоидного артрита Trastuzumab/ Herceptin Рецептор HER2/neu Лечение рака молочной железы Vedolizumab/Entyvio Интегрин α4β7 Лечение язвенного колита и болезни Крона 21 исходной популяции только теми микроорганизмами, которые несут на своей поверхности антитела, взаимодействующие с целевым антигеном. После нескольких раундов обогащения из отдельных клонов выделяют ДНК-фрагменты генов целевых антител, которые используют для создания рекомбинантных антител. Методы дисплея эффективны в тех случаях, когда иммунизация трансгенных животных не даёт результата, например, при получении антител против аутоантигенов или токсичных соединений. Различают два типа комбинаторных библиотек – наивные и иммунные. Иммунные иммунизированных библиотеки доноров либо содержат доноров гены c антител, полученные аутоиммунными из заболеваниями. Использование иммунных библиотек вместо наивных повышает эффективность методов дисплея, поскольку в этом случае в библиотеке уже содержатся гены антител, сформировавшихся в организме в результате иммунизации или аутоиммунных расстройств (Тикунова Н. В. и др., 2009). В таблице 3 приведена информация о некоторых имеющихся на фармацевтическом рынке препаратах на основе полностью человеческих антител. 1.2.4. Мини- и нано-антитела Кроме полноразмерных антител, на основе генов природных иммуноглобулинов созданы нано- и мини-антитела, не имеющие природных аналогов (Рисунок 6). одноцепочечное антитело полноразмерное антитело гидролиз пепсином F(ab’)2 димерное одноцепочечное антитело гидролиз папаином Fab однодоменное антитело иммунотоксин Рисунок 6. Виды рекомбинантных мини- и нано-антител. 22 иммунофлуоресцентный зонд Таблица 3. Терапевтические препараты на основе полностью человеческих антител Название Специфичность Применение Adalimumab/Humira Фактор некроза опухолей альфа Лечение ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, псориатического артрита и хронического псориаза Belimumab/Benlysta Фактор активации B-клеток (BAFF, CD257) Лечение системной красной волчанки Canakinumab/Ilaris Интерлейкин 1-β Лечение криопирин-ассоциированных периодических синдромов Denosumab/Prolia Xgeva Цитокин семейства факторов некроза опухоли TNFSF11, (RANKL) Лечение остеопороза Golimumab/Simponi Фактор некроза опухолей альфа Лечение ревматоидного артрита, язвенного колита, псориатического артрита Ipilimumab/Yervoy Белок CTLA-4 Лечение меланом Ofatumumab/Arzerra B-лимфоцитарный антиген CD20 Лечение хронического лимфоцитарного лейкоза Panitumumab/Vectibix Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) Лечение колоректального рака Ustekinumab/Stelara IL-12 и IL-23 Лечение рассеянного склероза, псориатического артрита и псориаза Такие антитела образованы одним или несколькими вариабельными доменами, которые формируют антигенсвязывающую область. Одноцепочечные антитела с молекулярной массой около 27 кДа образуются в результате объединения вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей исходного антитела при помощи гибкого пептидного линкера (Bird R., 1988; Glockshuber R., 1990). Нано-антитела с молекулярной массой около 14 кДа состоят из одного вариабельного домена тяжёлой цепи и являются самыми компактными рекомбинантными антителами (Holt L. J. et al., 2003; Деев С. М., 2009; Harmsen M. M. et al., 2007; Muyldermans S., 2013). Уменьшение молекулярной массы способствует лучшему проникновению миниантител в ткани организма и ускоряет выведение таких антител из организма (Holliger P. et al., 2005; Thruber G. M. et al., 2008; Bumbaca D. et al., 2012). Однако сродство 23 моновалентных мини-антител к мультивалентному антигену, такому как вирион, часто снижено на несколько порядков по сравнению с бивалентными полноразмерными антителами (Edeling M. A. et al., 2014). Уменьшение длины линкера, соединяющего VH- и VL-домены, препятствует их внутримолекулярному объединению и способствует агрегации нескольких таких цепей, в результате чего образуются димерные, тримерные и тетрамерные мини-антитела. При объединении вариабельных доменов нескольких различных антител образуются полиспецифичные антитела. Другим распространённым типом мини-антител являются Fab-фрагменты, а также их димеры F(ab’)2. Такие фрагменты можно получить ферментативным гидролизом моноклональных антител, а также методами генетической и белковой инженерии (Nelson A. L. et al., 2010). На основе мини-антител и Fab-фрагментов создают флуоресцентные зонды для цитофлуориметрических и иммуногистохимических исследований, а также разрабатывают биосенсоры, используемые при мониторинге исследуемых молекул в реальном времени. (Thakur M. S. et al., 2013; Emami M. et al., 2014). Иммунотоксины, в которых мини-антитело объединено с токсином, используют в медицине для воздействия на ткани, клетки и рецепторы (Pastan I. et al., 2007; Sharkey R. M. et al., 2008; Shapira A., 2010; Mazor R. et al., 2014). 1.2.5. Изотипы, используемые для создания терапевтических антител Исследование эффективности комплемент-опосредованного лизиса и антителозависимой клеточной цитотоксичности, вызываемой антителами различных изотипов, продемонстрировало, что комплемент-опосредованный лизис клеток в большей степени вызывали антитела изотипов IgM и IgG1, а антитела изотипов IgG3 и IgG2 проявляли меньшую активность. Антитела других изотипов не вызывали лизиса клеток (Bruggemann M. et al., 1987; Bindon C. I. et al., 1988). Наибольшую антителозависимую цитотоксичность проявляли антитела IgG1, далее антитела IgG3; остальные изотипы оказались неактивны (Shaw D. R. et al., 1988; Steplewski Z. et al., 1988). Эти результаты были подтверждены во второй серии экспериментов, в которой были исследованы антитела изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 против лейкоцитарного антигена CD52, также известного как CAMPATH-1(Gorman S. D. et al., 1990). 24 Аналогично предыдущим результатам, антитела изотипа IgG1 проявляли наибольшую активность в обоих тестах, меньшую активность наблюдали для антител IgG3, антитела IgG2 в незначительной степени способствовали комплементзависимому лизису клеток, а антитела IgG4 вовсе не проявляли активности. В обоих экспериментах в качестве эффекторных клеток для антителозависимой клеточной цитотоксичности были использованы FcRIII(CD16)-положительные лимфоциты (Gorman S. D. et al., 1990). Полагают, что цитотоксическая активность улучшает терапевтические свойства рекомбинантных антител (Chames P. et al., 2009; Nelson A. L. et al., 2010). Поэтому изотип IgG1 человека является предпочтительным при создании терапевтических рекомбинантных антител (Chadd H. E. et al., 2001; Chames P. et al., 2009). 1.3. Получение рекомбинантных антител 1.3.1. Этапы процесса разработки и производства полноразмерных рекомбинантных антител Процесс разработки и производства полноразмерных рекомбинантных антител сводится к нескольким этапам. Сначала из гибридомной линии клеток, продуцирующих моноклональное антитело необходимой специфичности, выделяют фракцию мРНК, которую используют для синтеза фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные домены этого антитела. Полученные фрагменты встраивают в плазмиду или несколько плазмид таким образом, чтобы они находились в одной рамке трансляции с участками, кодирующими лидерные пептиды и константные домены антитела необходимого изотипа. Полученные плазмиды вводят в подходящую систему экспрессии методами липофекции либо электропорации. Для продукции рекомбинантных полноразмерных антител в настоящее время используют клетки китайского хомячка CHO (chinese hamster ovary), мышиную миелому NS0, клетки человека HEK 293 (human embryonic kidney), а также другие линии клеток (Pacis E. et al., 2011). Рекомбинантное антитело, образующееся в результате культивирования штамм-продуцента, выделяют и очищают в несколько хроматографических стадий. 1.3.2. Очистка рекомбинантных антител Процесс выделения и очистки антител, называемый также нисходящим процессом (англ. downstream process), является ключевым этапом при получении антител, и на его 25 долю приходится до 80% стоимости производства антитела (Thommes J. et al., 1996). Разработано множество способов выделения иммуноглобулинов, в том числе осаждение этанолом (метод Кона), сульфатом аммония и другими соединениями (Cohn E. J. et al., 1946; Radosevich M. et al., 2010; Tscheliessnig A. et al., 2014; Hammerschmidt N. et al., 2015), однако в настоящее время преимущественно используются хроматографические методы, позволяющие добиться высокой степени чистоты конечного препарата. Процесс очистки начинают со сбора биомассы и отделения культуральной жидкости от клеток и клеточного дебриса центрифугированием. При производстве антител для этого используют центрифуги непрерывного действия с проточными роторами (Li F., 2005). Осветлённую культуральную жидкость фильтруют глубинной фильтрацией и затем микрофильтрацией. Выделение антитела из культуральной жидкости, называемое также стадией захвата (англ. capture), чаще всего осуществляют аффинной хроматографией на сорбентах, содержащих белок А в качестве лиганда (Marichal-Gallardo P. A. et al., 2012). Природный белок А представляет собой компонент клеточной стенки Staphylococcus aureus с молекулярной массой 42 кДа и содержит пять иммуноглобулин-связывающих доменов, которые способны связываться с Fc-доменами иммуноглобулинов различных классов, выделенных из различных организмов. Широкое распространение белок А получил благодаря высокому сродству к антителам, до 107 М-1, а также за счёт доступности, вызванной наличием рекомбинантных продуцентов (Huse K. et al., 2002). Также разработаны рекомбинантные модификации белка А и сорбенты на их основе, такие как “MabSelect SuRe” (GE Healthcare), “rProtein A sepharose 4 Fast flow” (GE Healthcare) и т.п., использование которых обеспечивает более высокую ёмкость, лучшую устойчивость к жестким условиям регенерации, а также меньшее содержание диссоциированного белка А в элюате, содержащем антитело (Hale G. et al., 1994). Стрептококковый белок G также используют для выделения иммуноглобулинов. Это компонент характеризуется клеточной стенки молекулярной стрептококков массой 40 – 65 группы кДа и C и G, содержит который несколько иммуноглобулин-связывающих доменов, а также альбумин-связывающий домен (Sjobring U. et al., 1991). В рекомбинантных белках G альбумин-связывающий домен отсутствует. Сродство к антителам белков A и G, а также их производных зависит как от класса и подкласса антитела, так и от организма, из которого выделено антитело 26 (Gagnon P., 1996). В случае рекомбинантных человеческих антител, когда возможно использование обоих белков, предпочитают белок А, т.к. стоимость белка G в 3-5 раз выше. Кроме того, для элюции антител при использовании белка G необходим более кислый буфер (pH 2,5 вместо pH 3,0), что повышает вероятность денатурации антитела, особенно если оно является нестабильным. Кроме белков A и G существует рекомбинантый химерный вариант – белок A/G, который сочетает свойства обоих белков (Eliasson M. et al., 1988). Этот белок подходит в тех случаях, когда необходимо выделять поликлональные антитела из различных организмов. Сорбенты на основе белков A или G обладают динамической ёмкостью около 2040 г/л, при этом для достижения максимальной ёмкости необходимо обеспечить время пребывания в сорбенте (англ. residence time) не менее 3 мин (Hahn R. et al., 2003). Значения pH и ионной силы культуральной жидкости должны быть в пределах 5,5 – 8,5 и 0 – 200 мМ, соответственно. Человеческие иммуноглобулины элюируют буфером с pH 3,0 (pH 2,5 в случае белка G). В кислых условиях ковалентная связь между лигандом и матрицей сорбента нестабильна, что приводит к отщеплению лиганда и контаминации им антитела. Концентрация белка A в элюате при этом обычно составляет около 5 нг/мл. Диссоциация белка А с сорбента экспоненциально увеличивается с ростом температуры, поэтому хроматографический процесс рекомендуют проводить в диапазоне от +4 до +15 °С. (Li F., 2005) Аффинные сорбенты на основе белков A или G регенерируют кратковременным пропусканием водного раствора, содержащего 50 – 500 мМ NaOH, 1М NaCl, при этом существенное снижение ёмкости наступает только через 100 – 500 циклов (Hale G. et al., 1994; Yan Z. et al., 2000). При получении антител, предназначенных для лабораторного использования, в большинстве случаев ограничиваются аффинной хроматографией. Промышленное производство терапевтических антител включает также несколько дополнительных хроматографических стадий (англ. polishing steps), обеспечивающих удаление вирусов, клеточных белков и ДНК, эндотоксинов, белка А, который является митогеном для Bклеток, а также агрегатов и вариантов антитела. Для эффективны удаления примесей, катионообменная и оставшихся после анионообменная 27 аффинной хроматографии. хроматографии, Эти методы позволяют отделить антитела c изоэлектрической точкой pI = 6,8 – 7,5 от нуклеиновых кислот (pI ~ 5), вирусов (pI ~ 6), белка А (pI = 5,5), эндотоксинов, а также подавляющего большинства клеточных белков. Полагают, что нейтральные и щелочные клеточные белки удаляются за счёт наличия отрицательно заряженных областей на своей поверхности (Weaver J., 2013). Катионообменная хроматография нередко используется в качестве второй хроматографической стадии. В буферных растворах с pH ~ 6,5 антитело сорбируется, а примеси остаются в растворе. Антитело элюируют линейным градиентом либо ступенчато, при этом линейный градиент обеспечивает лучшее разделение форм антитела, а ступенчатая элюция позволяет получить более концентрированный раствор антитела, что ускоряет и удешевляет процесс (Weaver J., 2013). Элюция градиентом pH по сравнению с градиентом соли позволяет получить пул антитела с более низкой электропроводностью, совместимой с последующими хроматографическими стадиями. Анионообменная хроматография, в отличие от катионообменной, используется практически при любом производстве антител и проводится во фронтальном (проточном) режиме, когда антитело проходит через сорбент, а примеси сорбируются. При производстве антител широко используются сильные анионообменные сорбенты с четветричными аминогруппами, такие как “Q Sepharose FastFlow” (GE Healthcare) и “Sartobind Q” (Sartorius). Они обладают низким неспецифическим связыванием, однако емкость таких сорбентов падает в среднесолевых буферных растворах с электропроводностью более 10 мСм/см (Weaver J., 2013). Поэтому пул антител, полученный на предыдущей стадии, необходимо разбавлять в несколько раз, что увеличивает расход жидкости, затраты на объём промежуточных емкостей, а также время на проведение анионообменной хроматографии. Слабые анионообменные сорбенты на основе первичных и вторичных аминогрупп, такие как “Sartobind STIC” (Sartorius) или “ChromaSorb” (Millipore), обладают более высокой ёмкостью и эффективны в буферных растворах с концентрацией соли до 1000 – 1500 мМ и электропроводностью до 20 – 30 мСм/см (Johansson B. et al., 2003; Yang T. et al., 2007). Вместе с тем, такие сорбенты более склонны к неспецифическому связыванию целевого антитела, а также нормально функционируют только в буферных растворах на основе однозарядных анионов, таких как ацетат или ион трис(гидроксиметил)аминометана, 28 тогда как растворы на основе мультизарядных анионов, таких как фосфат- и цитратанионы, существенно снижают ёмкость сорбента (Weaver J., 2013). В последнее время большую популярность для проведения хроматографии при производстве биопрепаратов приобрели мембранные сорбенты (Ghosh R., 2002; Liu H. F., 2010). Основным преимуществом таких сорбентов является крупнопористая структура, позволяющая проводить хроматографию при высоких скоростях подвижной фазы без снижения динамической ёмкости. В случае классических гранулярных сорбентов скорость сорбции контролируется диффузией молекул через мелкие поры, поэтому для крупных молекул, таких как антитела, наблюдается существенное снижение динамической ёмкости сорбента с ростом скорости подвижной фазы. Входной контроль сырья, а также использование рабочего банка клеток позволяют свести к минимуму вероятность попадания вирусных частиц в культуральную жидкость, содержащую антитело. Тем не менее, производственный процесс должен обеспечивать глубокую вирусную очистку. Так, согласно требованиям Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (U S Food and Drug Administration, FDA), для валидации процесса очистки, соответствующего стандартам GMP, необходимо продемонстрировать уменьшение вирусной нагрузки в 1012 – 1020 раз с использованием по крайней мере четырёх различных модельных вирусов (Li F., 2005). Хроматографические стадии, описанные выше, позволяют существенно снизить вирусную нагрузку. Дополнительно к ним используют кислую инактивацию вирусов, а также фильтрацию через 20-нм фильтр. Для инактивации вирусов раствор антитела после элюции с аффинного сорбента выдерживают 45 – 60 мин при комнатной температуре в кислом элюирующем буфере (Li F., 2005). В таких условиях эффективно разрушаются вирусы, неустойчивые к низким значениям pH, например, вирус лейкемии мышей. Время инкубации и значение pH подбирают в зависимости от стабильности антитела. Использование хроматографических стадий, стадий фильтрации и инкубации в кислом буферном растворе позволяет получить препарат антитела с уровнем примесей, не превышающим норм. 29 1.4. Вирус клещевого энцефалита как мишень для иммунотерапии 1.4.1. Таксономия рода Flavivirus Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), представитель рода Flavivirus семейства Flaviviridae, является высоко патогенным для человека инфекционным агентом и способен вызывать заболевание, приводящее к серьезным поражениям нервной системы (Kaiser R., 2012). Это небольшой вирус диаметром около 50 нм, покрытый липидной оболочкой и содержащий РНК-геном положительной полярности. ВКЭ широко распространён в странах Западной, Центральной и Восточной Европы, а также на азиатской территории России и в северных районах Казахстана, Монголии и Китая (Suss J., 2010). Род Flavivirus подразделяют на три кластера: 1) вирусы, переносимые клещами; 2) вирусы, переносимые комарами и 3) вирусы, не переносимые членистоногими (Dobler G. et al., 2012). Переносимые клещами флавивирусы подразделяют на вирусы морских птиц и вирусы млекопитающих, к которым в частности относится и ВКЭ. К настоящему времени выделено три субтипа ВКЭ –дальневосточный, сибирский и европейский, которые различаются по клиническим проявлениям вызываемых заболеваний и области распространения (Lehrer A. T., 2011). Кроме того, в комплекс ВКЭ входят вирус омской геморрагической лихорадки, вирус шотландского энцефаломиелита овец, вирус Повассан и др. (Dobler G. et al., 2012). К переносимым комарами флавивирусам относятся вирус Западного Нила, вирус лихорадки Денге, вирус японского энцефалита и вирус желтой лихорадки. Вместе с ВКЭ эти вирусы способны вызвать опасные инфекции и представляют наибольшую клиническую значимость среди флавивирусов (Sautto G. et al., 2013). 1.4.2. Строение вириона ВКЭ Вирионы ВКЭ и других флавивирусов имеют сферическую форму с диаметром около 50 нм (Рисунок 7 А). Геном ВКЭ длиной 10 – 11 тыс. нукл. содержит одну открытую рамку трансляции (ОРТ), ограниченную нетранслируемыми областями на 5’ и 3’-концах (Рисунок 7 В). В отличие от представителей рода Pestivirus и Hepacivirus, также входящих в семейство Flaviviridae, геномы которых содержат участки внутренней посадки рибосомы (англ. internal ribosome entry site, IRES), геномы флавивирусов содержат кэп первого типа, необходимый для инициации трансляции. ОРТ кодирует 30 полипептид длиной около 3400 а.к.о., состоящий из трёх структурных белков (C, prM, и E) и семи неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, вирусная протеаза NS3, NS4A, NS4B и РНК-зависимая РНК-полимераза NS5). Полипептид расщепляется и модифицируется клеточными и вирусными ферментами с образованием капсидного белка C и гликозилированных форм оболочечных белков Е и prМ (Lindebach B. D., 2007). Геном вируса упакован в капсид, сформированный 180 молекулами белка C. Липидная оболочка, окружающая нуклеокапсид, содержит 180 молекул гликопротеина Е и 180 молекул гликопротеина М (Sanchez-San Martin C. et al., 2009; Kaufmann B. et al., 2011; Zhang X. et al., 2013)(Рисунок 7 Б). А) Б) В) Рисунок 7. Строение вириона флавивирусов на примере вируса Западного Нила. А) Криоэлектронномикроскопическая реконструкция вириона; Б) Центральное сечение трехмерной модели вириона, реконструированной на основе данных криоэлектронной микроскопии; В) Схематическое изображение генома. Источник изображения: Kramer LD et al., 2007. 1.4.3. Строение поверхностного гликопротеина Е ВКЭ Гликопротеин Е является мажорным белком оболочки вируса и осуществляет связывание с клеточными рецепторами при инфицировании. Этот белок с молекулярной массой около 56 кДа является главной мишенью для нейтрализующих антител и вызывает протективный иммунный ответ (Chambers T. J. et al., 1990; Heinz F. X. et al., 1991; Lindebach B. D. et al., 2007; Sautto G. et al., 2013). Гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита и других флавивирусов принадлежит ко второму классу мембранных вирусных белков слияния (Harrison S. C., 31 2008; Dowd K. A. et al., 2011). В отличие от белков класса I, таких как гемагглютинин вируса гриппа, белки класса II находятся в зрелом вирионе в метастабильном состоянии в виде гомодимеров типа «голова к хвосту», которые стабилизированы другим оболочечным белком (белок М в случае ВКЭ) (Harrison S. C., 2008). Зрелый вирион ВКЭ содержит 90 гомодимеров, расположенных параллельно поверхности, которые формируют гладкую и плотную оболочку псевдоикосаэдрической симметрии (Kuhn R. J. et al., 2002; Harrison S. C., 2008; Mukhopadhyay S. et al., 2003). Пространственная структура гликопротеина Е, а также функциональная организация этого белка были установлены с помощью рентгеноструктурного анализа сначала для ВКЭ, а потом для других флавивирусов (Rey F. A. et al., 1995; Zhang W. et al., 2003; Nybakken G. E. et al., 2006). Полноразмерный гликопротеин Е не кристаллизуется, поэтому анализ проводили на кристаллах растворимого фрагмента гликопротеина Е (Heinz F.X., 1991). Молекулы кристаллизованного фрагмента образовывали гомодимеры аналогичные тем, которые образует гликопротеин Е на поверхности вириона. Комплекс, размеры которого составляют около 150Å x 55Å x 30Å, изображен на рисунке 8. На боковой проекции отчётливо виден незначительный изгиб, предположительно соответствующий кривизне сферической поверхности вириона (Rey F. A. et al., 1995). На внешней поверхности димера расположены углеводные остатки. Кроме того, на фронтальной проекции видны две полости, образующиеся при формировании димера. Рисунок 8. Трёхмерная структура димера, образованного растворимым фрагментом гликопротеина Е ВКЭ. А – проекция, вид сверху; Б – боковая проекция. Красным обозначен домен DI, жёлтым – домен DII, синим – домен DIII. Зелеными линиями отмечены дисульфидные связи. Трансмембранный C-концевой домен не обозначен. Источник изображения: Rey F. A. et al., 1995. 32 Пространственная организация гликопротеина Е, определённая для различных представителей рода Flavivirus, консервативна (Kaufmann B. et al., 2011). Белок представляет собой единый полипептид размером около 500 а.к.о., который при сворачивании образует три домена: центральный домен DI, димеризационный домен DII и рецепторный домен DIII, которые формируют протяжённую структуру, расположенную на поверхности вириона и называемую эктодоменом. Вторичная структура всех трёх доменов представлена β-листами. C-концевой трансмембранный участок полипептида содержит преимущественно гидрофобные а.к.о. и необходим для закрепления гликопротеина в липидной оболочке вириона (Chambers T. J. et al., 1990). Домен DI является центральным и представляет собой β-бочку, которая сформирована тремя сегментами (а.к.о. 1 – 51, 137 – 189, 285 – 302), общая протяжённость которых составляет около 120 а.к.о. Протяжённые домен DII сформирован двумя участками (а.к.о. 52 – 136 и 189 – 285), которые расположены между сегментами первого домена. Эта часть гликопротеина ответственна за образование гомодимеров и гомотримеров, а также содержит на конце пептид слияния, сформированный β-листами c и d (а.к.о. 98 – 113) (Allison S. L., 2001). Сd-петля, также называемая пептидом слияния или петлёй слияния (англ. fusion loop), содержит гидрофобные а.к.о. и участвует в проникновении гомотримера гликопротеина Е в липидную мембрану эндосомы. Показано также, что домен DII взаимодействует с ламининовыми рецепторами клеток (Bogachek M. V. et al., 2008). Домен DIII (а.к.о. 303–395) по своей пространственной структуре принадлежит к иммуноглобулиновому типу фолдинга и содержит RGD-мотив (Pytela R. et al., 1987; Bork P. et al., 1994; van der Most R. G. et al., 1999). Такой тип фолдинга характерен для белков иммунной системы, клеточных рецепторов и белков, взаимодействующих с рецепторами, поэтому полагают, что домен III гликопротеина Е флавивирусов непосредственно участвует в связывании с рецепторами инфицируемых клеток (Harrison S. C., 2008; Bhardwaj S. et al., 2001; Simmons M. et al., 1998a, 1998b, 2001a, 2001b). Доменная внутридоменными структура гликопротеина Е стабилизирована шестью дисульфидными связями, которые высоко консервативны и присутствуют в гомологичных белках всех флавивирусов. Эти связи помогают 33 сохранить пространственную структуру доменов при pH-зависимом перестроении гомодимеров белка Е в гомотримеры. Структура C-концевой части гликопротеина Е (а.к.о. 396 – 496) установлена на основе результатов крио-электронной микроскопии зрелых частиц вируса Денге и вируса Западного Нила (Zhang W. et al., 2003; Zhang W. et al., 2013; Zhang X. et al., 2013). Эта часть гликопротеина содержит около 100 а.к.о. на C-конце, которые формируют четыре α-спирали. Первые две спирали по аминокислотному составу амфипатические и образуют стволовой участок (англ. stem region) на поверхности липидного бислоя, взаимодействуя с липидными головками (Allison S. L. et al., 1999). Третья и четвёртая спирали погружены в липидную мембрану вириона (Zhang W. et al., 2003). Для pH-индуцированного перестроения гомодимеров гликопротеина Е необходимо наличие липидной мембраны. В отсутствие липосом гомодимеры эктодомена белка Е обратимо разрушаются при закислении раствора, но не переходят в гомотримеры (Stiasny K. et al., 1996). При добавлении в раствор липосом происходит необратимое образование гомотримеров, которые находятся в связанном с мембранами состоянии (Stiasny K. et al., 2002). Обработка таких комплексов неионным детергентом позволяет получить свободные гомотримеры эктодомена, способные кристаллизоваться (Stiasny K., 2004) 1.4.4. Жизненный цикл ВКЭ Результаты исследования жизненного цикла флавивирусов представлены в обзорах: Mukhopadhyay S. et al., 2005; Sanchez-San Martin C. et al., 2009; Kaufmann B. et al., 2011; Pierson T. C. et al., 2013; Acosta E. G., 2014; Brinton M. A. 2014. Флавивирусы проникают в клетки, используя клатрин-зависимый эндоцитоз (Nawa M. et al., 2003; Chu J. J. H. et al., 2004a), и могут заражать разнообразные типы клеток, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки и нейроны у млекопитающих, а также клетки комаров и клещей (Cheng G. et al., 2010; Brinton M. A., 2014). На первой стадии происходит прикрепление вирусных частиц к поверхности инфицируемой клетки (Gollins S. W. et al., 1985)(Рисунок 9). Установлено несколько типов молекул, которые могут выполнять роль рецепторов для флавивирусов: глюкозаминогликаны, в том числе гепарансульфаты (Chen Y. et al., 1997; Lee E. et al., 2000; Kroschewski H. et al., 2003; Mandl C. W. et al., 2001; Martínez-Barragán J. J. et al., 2001; Goto A. et al., 2003), интегрины (Протопопова Е. В. и др., 1997; Chu J. J. H. et al., 2004b; Lee J. W. et al., 2006; Богачек М. В. и др., 2010), 34 высокоаффинный ламининовый рецептор (Протопопова Е. В. и др., 1997; Protopopova E. et al., 1999; Thepparit C. et al., 2004; Bogachek M. V. et al., 2008), молекулы клеточной адгезии (Navarro-Sanchez E. et al., 2003; Tassaneetrithep B. et al., 2003), маннозный рецептор (Miller J. L. et al., 2008) и другие (Hershkovitz O., 2009; Perera-Lecoin M. et al., 2013). Кроме того, для ВКЭ обнаружено наличие низко- и высокоаффинных рецепторов (Maldov D. G. et al., 1992). Роль каждого из этих потенциальных рецепторов установлена не до конца, и ни один из них не является необходимым и достаточным для проникновения вируса в клетку (Kozlovskaya L. I. et al., 2009; Austin S. K. et al., 2014). Рисунок 9. Жизненный цикл ВКЭ. Рисунок переработан на основе http://www.niaid.nih.gov/labsandresources/labs/aboutlabs/lvd/viralpathogenesissection/Pages/ default.aspx Использование клатрин-зависимого эндоцитоза для проникновения флавивирусов в клетки подтверждено несколькими исследованиями (Nawa M. et al., 2003; Chu J. J. H. et al., 2004a; Heinz F.X., 2004; Krishnan M. N. et al., 2007; Acosta E. G. et al., 2008). В частности, наблюдение за единичным вирионом вируса лихорадки Денге позволило установить, что после прикрепления к поверхности клетки вирион перемещается по 35 поверхности до тех пор, пока не встретится с покрытой клатрином окаймлённой ямкой (van der Schaar H. M. et al., 2008). Вместе с тем, некоторые исследования подтверждают существование альтернативных клатрин-независимых путей проникновения флавивирусов в клетки (Acosta E. G. et al., 2009; Suksanpaisan L. et al., 2009). Проникновение вирусного нуклеокапсида в цитоплазму клетки происходит в результате слияния вирусной и эндосомальной мембран (обзоры в Pierson T. C. et al., 2013; Austin S. K. et al., 2014). Слияние мембран хорошо изучено и описано для различных вирусов (обзоры в Harrison S. C., 2008; Cosset F. L., 2011; Plemper R. K., 2011). Скоординированные перестроения во внешней оболочке частиц флавивирусов, приводящие к слиянию, напоминают процессы слияния для других вирусов, таких как ВИЧ-1 и вирус гриппа (Pierson T. C. et al., 2013). Однако в случае флавивирусов весь процесс от попадания в среду с пониженным значением pH до слияния мембран и выхода нуклеокапсида протекает сравнительно быстро и занимает несколько секунд при температуре 37 °C (Moesker B., 2010). Попадание вириона в слабокислое окружение c pH ~ 6,5 приводит диссоциации димеров гликопротеина Е и повороту домена DII в сторону от домена DI и вирусной мембраны (доменная структура гликопротеина Е рассмотрена ниже). Оптимум значения pH, необходимый для изменения структуры, составляет 6,3, однако процесс начинается уже при 6,9 ед. pH (Moesker B., 2010). При диссоциации димеров петля слияния одной молекулы гликопротеина Е выходит из гидрофобного кармана соседней молекулы гликопротеина Е и проникает в мембрану эндосомы. За счёт кооперативного взаимодействия доменов DI и DII соседних молекул, находящихся в «вытянутом» состоянии, образуются гомотримеры, напоминающие по форме шипы и ориентированные в сторону от поверхности вириона (Allison S. L. et al., 1995). Окончательная структура гомотримера, называемая «шпилькой», образуется при смещении доменов DIII в сторону эндосомальной мембраны, при этом стволовые участки молекул гликопротеина перемещаются в образовавшиеся бороздки и подтягивают трансмембранные участки по направлению к эндосомальной мембране (Stiasny K. et al., 2013). Структура «шпильки» более стабильна по сравнению с предшествующими структурами, а образующаяся при конформационных изменениях энергия необходима для преодоления потенциального барьера при слиянии мембран (Sanchez-San Martin C. et al., 2009). В результате этого вирусная и эндосомальная 36 мембраны максимально сближаются и объединяются, высвобождая нуклеокапсид внутрь цитоплазмы. Молекулы капсидного белка C флавивирусов в растворе образуют гомодимеры, которые с одной стороны имеют высокий положительный заряд, а с другой – неполярную поверхность, образованную консервативными гидрофобными участками белка (Ma L. et al., 2004). Полагают, что неполярная область димера взаимодействует с мембранами, в том числе и со внутренней стороной вирусной оболочки, тогда как положительно заряженная область связывается с геномной РНК (Brinton M. A., 2014). После слияния вирусной и эндосомальной мембран димеры капсидного белка, повидимому, остаются связанными с внешней (цитоплазматической) поверхностью эндосомы. Вероятно, вирусный геном при этом остаётся связанным с молекулами капсидного белка, что с одной стороны, защищало бы геном от клеточных нуклеаз и РНК-сенсоров, а с другой стороны, являлось бы остовом для генома во время ранних раундов репликации и трансляции (Brinton M. A., 2014). Во время ранней фазы жизненного цикла вируса, в клетке находится небольшое число копий генома, которые попеременно выполняют функции мРНК для трансляции вирусного полипротеина и функции матрицы для синтеза минус-цепи вирусного генома. При трансляции используется линейная форма генома, тогда как для инициации синтеза РНК-геном принимает циклическую форму за счёт взаимодействий между 5’- и 3’некодирующими участками генома (Khromykh A. A. et al., 2001; Lo M. K. et al., 2003; Corver J. et al., 2003; Alvarez D. E. et al., 2005). Трансляция вирусного полипротеина на ранней фазе жизненного цикла происходит кэп-зависимым образом на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭР) (Brinton M. A., 2014). Вирусный полипротеин содержит много трансмембранных доменов, которые определяют, будут ли белки, образующиеся после расщепления полипротеина, находится на цитоплазматической или на внутренней поверхности ЭР. Так, белки C, NS3 и NS5 расположены на цитоплазматической стороне, а белки prM, E и NS1 – на внутренней стороне ЭР. Малые белки NS2A, NS2B, NS4A и NS4B расположены внутри бислоя мембраны ЭР (Lindenbach B. D. et al., 2007). NS2A, NS2B, NS4A и NS4B представляют собой небольшие гидрофобные белки, не имеющие характерных мотивов каких-либо известных ферментов. Структуры и функции этих белков недостаточно изучены, однако известно, что эти белки имеют по 37 два-три трансмембранных участка, а также обеспечивают сборку и/или заякоривание репликативных комплексов на мембране ЭР (Mackenzie J. M. et al., 1998; Westaway E. G. et al., 2002; Miller S. et al., 2006; Miller S. et al., 2007). Белок NS2B также является кофактором для C-концевого домена белка NS3, обладающего протеолитической активностью (Erbel P. et al., 2006). Кроме того, эксперименты in silico подтвердили возможность белка NS4A вызывать искривление мембраны, регистрируемое в области репликативных комплексов (Lin M. H. et al., 2014). На ранних стадиях происходит активный синтез вирусных белков, необходимых для репликации генома и сборки новых вирусных частиц, а также для противодействия клеточным системам противовирусной защиты (Liu W. J. et al., 2005; Keller B. C. et al., 2006; Laurent-Rolle M. et al., 2010; Brinton M. A., 2014). Вирусные белки запускают пролиферацию мембраны ЭР, а также вызывают впячивания этой мембраны, на которых собираются репликативные комплексы (Lindenbach B. D. et al., 2007; Welsch S. et al., 2009; Gillespie L. K. et al., 2010). На ранних стадиях после инфицирования клетки, вплоть до 6 – 8 ч, уровень синтеза РНК низкий, при этом копии РНК положительной и отрицательной полярности образуются приблизительно в равных количествах (Brinton M. A., 2014). Уровень отрицательной цепи РНК остаётся низким в течение всего репликативного цикла вируса. Однако как только копии РНК отрицательной полярности попадают в репликативные комплексы, наступает фаза экспоненциального синтеза копий вирусного генома. При этом РНК непрерывно копируется с одной и той же матрицы полуконсервативным образом (Chu P. W. et al., 1987; Brinton M. A., 2014). Образование кэпа на 5’-конце РНКгеномов происходит с помощью N-концевого домена белка NS5, который обладает несколькими метилтрансферазными активностями (Ray D. et al., 2006; Zhou Y. et al., 2007; Issur M. et al., 2009). В течение фазы экспоненциального синтеза генома появляющиеся копии РНК выходят из репликативного комплекса через пору и, вероятно, попадают в специализированный отдел в цитозоле, который обеспечивает защитное окружение (Welsch S. et al., 2009; Miorin L. et al., 2013). Полагают, что копии генома связываются с положительно заряженной областью димеров капсидного белка, которые своей неполярной поверхностью взаимодействуют с цитоплазматической стороной мембраны ЭР (Ma L. et al., 2004; Dokland T. et al., 2004). Многочисленные копии белков E и prM, 38 расположенные в той же области, но с внутренней стороны мембраны ЭР, способствуют отпочковыванию незрелых вирусных частиц в просвет ЭР (Brinton M. A., 2014). Механизм отпочковывания окончательно не установлен, в этом процессе вероятно участвует белок NS2A(Xie X. et al., 2013). В незрелых вирионах, в отличие от зрелых, каждая молекула гликопротеина Е нековалентно связана с молекулой гликопротеина prM. Гетеродимеры E-prM образуют тримеры (E-prM)3, организованные на поверхности вириона в икосаэдрической симметрии в виде радиально направленных шипов (Zhang Y., 2003; Zhang Y., 2007) (Рисунок 10). Полагают, что белок prM защищает петлю слияния и предотвращает слияние мембран при прохождении созревающих вирусных частиц через слабокислое окружение транс-сети Гольджи. Низкие значения pH в транс-сети Гольджи вызывают реорганизацию молекул гликопротеина Е, что приводит к экспонированию сайта расщепления белка prM. Расщепление молекул гликопротеина prM фуриновой протеазой приводит к образованию трансмембранного гликопротеина М и N-концевого pr-пептида, который остаётся связанным с гликопротеином Е и защищает петлю слияния от взаимодействия с клеточными мембранами (Yu I. M. et al., 2008). Выход вируса из клетки в среду с нейтральным значением pH сопровождается диссоциацией молекул pr-пептида и вириона. Инфекционность образовавшихся вирионов зависит от полноты расщепления гликопротеина prM и диссоциации pr-пептида (Li L. et al., 2008). А) Б) Рисунок 10. Незрелая и зрелая формы вирионов флавивирусов на примере вируса Денге. Реконструкция на основе данных криоэлектронной микроскопии. А) Незрелый вирион вируса Денге (Zhang Y. et al., 2007); Б) Зелый вирион вируса Денге (Zhang Y. et al., 2003). Источник изображения: Perera R. et al., 2008. 39 1.4.5. Моноклональные антитела против ВКЭ и других флавивирусов Иммунизация животных флавивирусами или их компонентами вызывает образование антител, часть которых обладает вируснейтрализующей и протективной активностями (обзоры в Roehrig J. T., 2003; Sautto G. et al., 2013). Эпитопы вируснейтрализующих антител расположены на всех трёх доменах гликопротеина Е (Dowd K. A. et al., 2011). При иммунизации мышей антитела с наиболее высокой вируснейтрализующей активностью образуются на домен DIII, в особенности на боковое ребро DIII-LR (англ. lateral ridge) (Roehrig J. T., 2003; Oliphant T. et al., 2005; Sánchez M. D. et al., 2005). Кросс-реактивные антитела, направленные на консервативные участки гликопротеина Е, обеспечивают более слабую нейтрализацию, чем вирусоспецифические антитела (Roehrig J. T., 2003). К настоящему времени создано несколько панелей моноклональных антител, направленных к гликопротеину Е (Матвеев Л. Э., 1989; Guirakhoo F. et al., 1989; Matveeva V. A. et al., 1995; Holzmann H. K. et al., 1995; Протопопова Е. В. и др., 1997). Так, в работе Матвеева Л. Э. были получены антитела ко всем трем доменам гликопротеина Е, однако наибольшую вируснейтрализующую активность проявляли антитела 13D6, 14D5 и 1B1, при этом два последних антитела обладали сродством к ВКЭ около 109 М-1 (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). По данным эпитопного картирования, эпитопы для этих трёх антител перекрываются. Кроме того, антитело 14D5, по-видимому, направлено на домен DIII гликопротеина Е, поскольку оно связывалось с фрагментом гликопротеина Е с 375 по 471 а.к.о. (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). В работе Guirakhoo F. с соавторами также были получены вируснейтрализующие антитела к различным доменам гликопротеина Е ВКЭ (Guirakhoo F. et al., 1989). В последующих работах были исследованы вируснейтрализующие свойства этих антител и локализованы их эпитопы (Mandl C. W. et al., 1989; Allison S. L. et al., 2001; Kiermayr S. et al., 2009). Для антител B1, B2, B4 и IM3, направленных на домен DIII гликопротеина Е ВКЭ, сродство к вирусу находилось в пределах (1,4 – 4,9)•10-9 М, индекс нейтрализации составлял около 10 – 80 мкг/мл, а максимальное число молекул антитела, связывающееся с вирионом при насыщении, варьировало в диапазоне 35 – 45 молекул на вирион. При этом установлено, что эпитопы антител B1, B2 и B4 содержат 40 а.к.о. 389, 391 и 384, соответственно, расположенные на боковом ребре домена DIII (Mandl C. W. et al., 1989; Kiermayr S. et al., 2009). Набор антител против ВКЭ, а также анти-идиотипических антител был получен в работе (Протопопова Е. В. и др., 1996). С их помощью были исследованы предполагаемые рецепторы, участвующие в связывании ВКЭ с клетками, и в частности выявлен ламининовый рецептор (Протопопова Е. В. и др., 1997; Protopopova E. V. et al., 1999; Bogachek M. V. et al., 2005). Панель моноклональных антител была получена к вирусу шотландского энцефаломиелита овец, входящему в комплекс ВКЭ. Одно из антител, 4.2, также нейтрализовало ВКЭ (Venugopal K. et al., 1992; Jiang W. et al., 1993; Jiang W. et al., 1994). Это антитело связывалось с эпитопом, который расположен на домене DIII гликопротеина Е и включает область с 308 по 311 а.к.о. Широкий набор моноклональных антител с разнообразными свойствами получен против всех серотипов вируса лихорадки Денге: Денге-1 (Shrestha B. et al., 2010; Fibriansah G. et al., 2014), Денге-2 (Roehrig J. T. et al., 1998; Halstead S. B., 2003; Crill W. D. et al., 2004; Gromowski G. D., 2008; Sukupolvi-Petty S. et al., 2007; Sukupolvi-Petty S. et al., 2010), Денге-3 (Brien J. D. et al., 2010; Wahala W. M. et al., 2010) и Денге-4 (Sukupolvi-Petty S. et al., 2013), а также кросс-реактивные антитела (Lok S. M. et al., 2008; Rajamanonmani R. et al., 2009). При этом антитела, направленные на петлю слияния гликопротеина Е, часто оказывались кросс-реактивными и кросс- нейтрализующими (Crill W. D. et al., 2001; Stiasny K. et al., 2006). Так, антитело 2A10G6, полученное при иммунизации мышей инактивированным вирусом лихорадки Денге серотип 2, связывало консервативный 98 DRXW101-мотив в области петли слияния гликопротеина Е (Deng Y. Q. et al., 2011). Это антитело обладало протективной и вируснейтрализующей активностью против всех известных серотипов вируса лихорадки Денге, а также было способно нейтрализовать инфекционность вируса желтой лихорадки и вируса Западного Нила. Оно также связывалось с ВКЭ и вирусом японского энцефалита, однако не нейтрализовало их инфекционность. Кросс-реактивное антитело 2H12, полученное при иммунизации мышей рекомбинантным DIII-фрагментом гликопротеина Е вируса лихорадки Денге (далее Денге-2), связывало все четыре серотипа вируса лихорадки Денге и нейтрализовало инфекционность серотипов 1, 3 и 4 (далее Денге-1, Денге-3 и Денге-4) (Midgley C. M. et 41 al., 2012). Индекс нейтрализации IC50 составлял около 30 – 150 нМ для различных серотипов. Несколько панелей мышиных моноклональных антител получено против вируса Западного Нила (Oliphant T. et al., 2005; Sánchez M. D. et al., 2005; Oliphant T. et al., 2006; Razumov I. A. et al., 2005; Lelli D. et al., 2012), вируса японского энцефалита (Gangwar R. S. et al., 2011) и вируса желтой лихорадки (Brandriss M. W. et al., 1986; Lobigs M. et al., 1987; Daffis S. et al., 2005; Julander J. G. et al., 2014). Наибольшей вируснейтрализующей активностью среди этих антител против вируса Западного Нила обладает антитело E16, направленное к боковому ребру домена DIII гликопротеина Е. Установлено, что это антитело блокирует ранние конформационные изменения молекул гликопротеина Е, сопровождающие слияние вирусной и эндосомальной мембран (Kaufmann B. et al., 2009). Стоит отметить, что репертуар антител, возникающих при флавивирусных инфекциях у людей, отличается от репертуара, возникающего при иммунизации мышей (Austin S. K. et al., 2014). У мышей основная часть антител против флавивирусов направлена на боковое ребро домена DIII (Chambers T. J. et al., 1998; Beasley D. W. et al., 2002; Volk D. E. et al., 2004; Oliphant T. et al., 2005; Sánchez M. D. et al., 2005). В то же время у людей иммунный ответ развивается в основном против петли слияния домена DII (Gould L. H. et al., 2005; Throsby M. et al., 2006; Oliphant T. et al., 2007; Vogt M. R. et al., 2009; Beltramello M. et al., 2010; de Alwis R. et al., 2012; Costin J. M. et al., 2013; Smith S. A. et al., 2013). Так, например, истощение сывороток крови людей по отношению к антителам против DIII-домена гликопротеина Е вируса лихорадки Денге практически не повлияло на вируснейтрализующую активность этих сывороток (Wahala W. M. et al., 2009). В результате иммунизации мышей флавивирусами, а также в результате иммунного ответа у людей на флавивирусные инфекции наряду с антителами против гликопротеина Е образуются антитела к белку NS1 (Falconar A. K. et al., 1991; Matveeva V. A. et al., 1995; Матвеева В. А. и др., 1998; Chung K. M. et al., 2006; Lee T. H. et al. 2012), prM/M (Богачек М. В. и др., 2007; Calvert A. E. et al., 2011; Hirota J. et al., 2013), капсидному белку (Noda M. et al., 2012; Chabierski S. et al., 2013), а также белкам NS3 и NS5 (Wong S. J. et al., 2003; Faggioni G. et al., 2012). Несмотря на отсутствие белка NS1 в составе вириона, некоторые антитела к этому белку обладают протективными 42 свойствами (Chung K. M. et al., 2006). Человеческие антитела к белкам prM/M, как правило, проявляют слабые вирус-нейтрализующие свойства и часто вызывают антителозависимое усиление инфекции (Rodenhuis-Zybert I. A. et al., 2010; Dejnirattisai W. et al., 2010; Beltramello M. et al., 2010). 1.4.6. Исследование механизмов нейтрализации флавивирусов антителами Для флавивирусов установлено два основных механизма антитело-зависимой вирусной нейтрализации: блокирование связывания с клеточными рецепторами (Crill W. D. et al., 2001; Nybakken G. E. et al., 2005) и ингибирование слияния вирусной и эндосомальной мембран (Butrapet S. et al., 1998; Gollins S. W. et al., 1986; Roehrig J. T. et al., 1998; Stiasny K. et al., 2007; Thompson B. S. et al., 2009; Vogt M. R. et al., 2009). Полагают, что антителозависимая нейтрализация флавивирусов, как и других вирусов, соответствует модели множественного взаимодействия (англ. multiple-hit model). Согласно этой модели нейтрализация происходит, если число связавшихся с вирионом молекул антитела превышает пороговое значение (обзор в Dowd K. A. et al., 2011; Parren P. W. et al, 2001; Austin S. K. et al., 2014). Это значение соотносится с размерами вириона и составляет 4—5 молекул на вирион для полиовирусов и более 200 молекул антитела для вируса бешенства (Flamand A. et al., 1993; Dowd K. A. et al., 2011). При нейтрализации флавивирусов антителами, распознающими эпитопы на боковом ребре домена DIII, в частности антителами E16 и E33 против вируса Западного Нила, вирус блокируется при связывании с ним около 30 молекул антител (Pierson T. C. et al., 2007; Mehlhop E. et al., 2009). Вместе с тем вероятно, что стехиометрический порог нейтрализации флавивирусов может варьировать в зависимости от механизма, по которому происходит нейтрализация антителом, а также от эпитопа (Dowd K. A. et al., 2011; Austin S. K. et al., 2014). Для нейтрализующих эпитопов, расположенных за пределами бокового ребра домена DIII гликопротеина Е, порог нейтрализации пока не установлен (Dowd K. A. et al., 2011; Austin SK et al., 2014) Нейтрализующая активность конкретного антитела определяется, по крайней мере, двумя факторами: аффинностью антитела и пространственной доступностью соответствующих эпитопов (Dowd K. A. et al., 2011). Аффинность антитела определяет заселённость пространственно-доступных эпитопов молекулами антитела при определённой концентрации антитела (Klasse P. J. et al., 2001; Klasse P. J. et al., 2002). 43 При концентрации антитела, равной его равновесной константе диссоциации KD, половина доступных эпитопов находится в связанном состоянии, что следует из закона действующих масс (Dowd K. A. et al., 2011). При насыщающих концентрациях антитела связаны все доступные для этого антитела эпитопы. Из двух антител, направленных на один и тот же эпитоп, для нейтрализации вируса более аффинным антителом будет достаточно более низких концентраций (Austin S. K. et al., 2014). Поэтому аффинность антитела часто коррелирует с его вируснейтрализующей активностью in vitro (Dowd K. A. et al., 2011). Пространственная доступность эпитопа в случае гликопротеина Е – это отношение числа молекул гликопротеина, с которыми может одновременно связаться направленное к этому эпитопу антитело при насыщении, к общему числу молекул гликопротеина Е в вирионе (Dowd K. A. et al., 2011). Недоступные (скрытые) эпитопы существуют на поверхности отдельного белка, но скрыты в вирионе, поэтому антитела к такому эпитопу не связываются с вирусом. Доступные эпитопы расположены на поверхности вириона таким образом, что при насыщающих концентрациях антитела с ними может связаться большое число молекул антитела, существенно превышающее порог нейтрализации. Труднодоступные эпитопы занимают промежуточное положение между доступными и скрытыми эпитопами. Доступность эпитопа оказывает существенное влияние на нейтрализующие свойства соответствующих антител. В качестве примера можно привести антитела E16 и E53, направленные к различным эпитопам гликопротеина Е вируса западного Нила. Несмотря на сходную аффинность, нейтрализующая активность антитела E16 на несколько порядков выше, т.к. это антитело связывается с пространственно-доступным эпитопом на боковом ребре домена DIII, а антитело E53 – с труднодоступным эпитопом в области петли слияния, которая в зрелых вирионах скрыта (Nelson S. et al., 2008; Oliphant T. et al., 2005; Oliphant T. et al., 2006; Pierson T. C. et al., 2007). Связывание антител, направленных к труднодоступным эпитопам, даже в насыщающих концентрациях находится на грани порога нейтрализации либо в вовсе не обеспечивает необходимого минимума. Пространственная доступность эпитопа зависит от нескольких факторов. Наибольшее значение оказывает структурная организация вириона. Икосаэдрическая симметрия вириона флавивирусов подразумевает наличие трёх типов гликопротеина E в 44 зависимости от близости к осям симметрии 2-го, 3-го и 5-го порядка. Ни одно из известных на настоящий момент антител против флавивирусов не способно связать все 180 молекул гликопротеина Е (Dowd K. A. et al., 2011; Austin S. K. et al., 2014). Fabфрагмент высоконейтрализующего антитела E16 вируса Западного Нила при насыщающей концентрации связывается со 120 эпитопами. Связыванию с остальными 60 молекулами гликопротеина Е, расположенными рядом с осями симметрии 5-го порядка, мешает слишком плотное расположение DIII-доменов этих молекул (Kaufmann B. et al., 2006). Для ВКЭ подобные исследования не опубликованы. Вторым фактором, который оказывает значительное влияние на доступность эпитопов у различных вирусов, является подвижность вириона (Dowd K. A. et al., 2011). В природных условиях вирион имеет гибкую и подвижную структуру, поэтому некоторые эпитопы оказываются частично доступными в течение небольших промежутков времени. В случае флавивирусов подвижность вириона также оказывает значительное влияние на доступность эпитопа. В качестве примера можно привести моноклональное антитело 1A1D-2, нейтрализующее серотипы 1, 2 и 3 вируса лихорадки Денге и направленное к A-цепи домена DIII гликопротеина Е (Lok S. M. et al., 2008; Roehrig J. T. et al., 1998). При анализе доступности а.к.о. гликопротеина, вовлечённых в связывание антитела 1A1D-2, были обнаружены пространственные ограничения, которые должны блокировать связывание антитела с молекулами гликопротеина Е зрелого вириона во всех вариантах пространственно-симметричного расположения (Lok S. M. et al., 2008). Экспериментально это предположение подтвердилось при температуре 4 °C, но при температуре 37 °C антитело связывалось с вирусом. Анализ структуры комплекса вириона с антителом, реконструированной по данным криоэлектронной микроскопии, выявил значительное вращение молекул гликопротеина Е наружу по сравнению с интактным зрелым вирионом. Так была установлена одна из множества потенциальных конформаций, которые вирион может принимать. Моноклональное антитело E53, направленное на петлю слияния гликопротеина Е вируса Западного Нила, является ещё одним примером того, как вирусная динамика влияет на доступность эпитопа. При кратковременной инкубации это антитело неспособно нейтрализовать зрелые вирионы вируса Западного Нила, поскольку петля слияния, содержащая эпитоп для этого антитела, скрыта. Увеличение времени и температуры инкубации приводят к возрастанию нейтрализующей активности антитела 45 E53 (Dowd K. A. et al., 2011; Austin S. K. et al., 2014). Пространственная доступность меняется также и у исходно доступных эпитопов. Так, для моноклонального антитела E16 также обнаружен незначительный рост нейтрализующей активности при увеличении времени и температуры инкубации с вирусом Западного Нила. Полагают, что такой рост активности вызван вовлечением части из 60 труднодоступных эпитопов в связывание с антителом (Austin S. K. et al., 2014). Третьим фактором, влияющим на пространственную доступность эпитопа, является степень зрелости вириона (Nelson S. et al., 2008; Dowd K. A. et al., 2011; Pierson T. C. et al., 2012). Неполное расщепление вирусного шаперона prM во время созревания приводит к образованию не только зрелых, но и в различной степени незрелых вирионов (Nelson S. et al., 2008; Rodenhuis-Zybert I. A. et al., 2010). В частности, для вируса лихорадки Денге согласно некоторым исследованиям более 90 % вирионов частично содержат нерасщеплённый белок prM (Junjhon J. et al., 2010). По крайней мере, некоторые из этих частично зрелых частиц являются инфекционными (Guirakhoo F. et al., 1992; Davis C. W. et al., 2006). Молекулы гликопротеина Е в таких частицах существуют как в виде димеров «голова-к-хвосту», которые характерны для зрелых вирионов, так и в виде шипов, направленных от центра вириона, которые характерны для полностью незрелых вирусных частиц (Dowd K. A. et al., 2011; Plevka P. et al., 2011). В результате этого такие вирионы имеют разнородный набор антигенных детерминант (Guirakhoo F. et al., 1992; Heinz F. X. et al., 1994). Неоднородность вирусных частиц оказывает влияние на антителозависимую нейтрализацию флавивирусов. Антитела, направленные к труднодоступным или недоступным на зрелом вирионе эпитопам, в частности антитело E53, не способны нейтрализовать зрелые вирионы вируса Западного Нила (Nelson S. et al, 2008). При нейтрализации разнородной популяции вирусных частиц, полученной без вмешательства в процесс созревания, 100% нейтрализация такими антителами не достигается. Это связывают с существованием субпопуляции зрелых или практически зрелых вирионов, которые содержат недостаточное количество шипов и соответствующих эпитопов и устойчивы к нейтрализации при любых концентрациях таких антител. Для терапевтического применения антител важна не столько вируснейтрализующая активность in vitro, сколько протективная активность in vivo 46 (Chames P. et al., 2009). Механизмы, обеспечивающие протективную активность антител, более разнообразны (Vogt M. R. et al., 2011). Вместе с тем установлено, что между нейтрализующими и протективными свойствами антител существует значительная корреляция (Roehrig J. T., 2003). 1.4.7. Способы профилактики и лечения вирусного клещевого энцефалита Ежегодно в мире клещевым энцефалитом заболевают по разным оценкам от 6 до 12 тысяч человек, при этом около половины случаев приходится на территорию России (Lindquist L. et al., 2008). Для профилактики этого заболевания разработан ряд вакцин: «ЭнцеВир» (ФГУП «НПО «Микроген», Россия), «Клещ-Э-Вак» и «Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сухая» (ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН», Россия), «ФСМЕИммун» (Baxter, Австрия) и «Энцепур» (Novartis Vaccines, Германия), применение которых продемонстрировало их высокую эффективность. Вместе с тем, количество пострадавших от укуса клещей на территории России остаётся по-прежнему высоким (400 000 – 600 000 ежегодно), а доля вакцинированных людей среди обратившихся в лечебно-профилактические учреждения с клещевым укусом в среднем по России остаётся достаточно низкой: 8,4% в 2014 г., 8,1% в 2013 г. и 7,2% в 2012 г. (согласно письму от 04.03.2015 №01/2170-15-32 “Об эпидемиологической ситуации по инфекциям, передающимся клещами, на территории Российской Федерации в 2014 году и прогнозе на 2015 год” Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека). При этом отмечают, что «… благодаря вакцинации против КВЭ иммунная прослойка населения страны постепенно увеличивалась с 5,86% в 2001 г до 6,01% в 2014 г.» (там же). Заболеваемость клещевым энцефалитом в России составила 1,56 в 2013 г и 1,36 в 2014 г, в некоторых областях этот показатель превышает 10 человек на 100 тысяч населения (там же). В Новосибирской области заболеваемость составила 7,82 в 2013 г и 5,57 в 2014 г согласно государственному докладу "О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения области в 2014 году", в Новосибирской URL: http://54.rospotrebnadzor.ru/c/document_library/get_file?uuid=c53f6d57-a687-45be-b4a81543cb4bdc9d&groupId=117057 (дата обращения: 31.07.2015). 47 В настоящее время в Европейских странах отсутствуют утверждённые схемы специфического лечения ВКЭ. В то же время, инфекции, вызванные западным подтипом ВКЭ, который преобладает в этих странах, в большинстве случаев протекают мягко. Инфекции, вызванные сибирским и дальневосточным подтипами ВКЭ, циркулирующими на территории РФ, протекают тяжелее и приводят к более высокой смертностью (Mandl C. W., 2005). Поэтому в России и Казахстане для профилактики и этиотропной терапии клещевого энцефалита применяют «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита» (ФГУП «НПО «Микроген», Россия), получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания (Bröker M. et al., 2008; Charrel R. N. et al., 2004; Пеньевская Н. А. и др., 2010). Этот препарат характеризуется выраженным терапевтическим эффектом, однако обладает определенными недостатками, свойственными препаратам донорской крови. Так, согласно требованиям ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств», донорскую кровь в РФ, как и в большинстве стран, тестируют лишь на антитела к вирусу иммунодефицита (ВИЧ 1, 2), антитела к вирусу гепатита С, на поверхностный антиген гепатита B (HBs Ag), а также на РНК вируса гепатита С (ГОСТ Р 52249-2009, Приложение 14). Поскольку донорская кровь может содержать и другие инфекционные агенты, аутоантитела, прионы, введение таких препаратов всегда сопровождается определённым биологическим риском. Кроме того, в некоторые эпидемические сезоны возникает дефицит человеческого иммуноглобулина, вызванный повышенным спросом и нехваткой донорской крови. В связи с недостатками сывороточных антител, а также учётом эпидемиологической ситуации в отношении ВКЭ, необходимы увеличение доли вакцинированного населения и разработка альтернативных иммунологических препаратов на основе рекомбинантных антител. 1.4.8. Разработка терапевтических антител против ВКЭ и других флавивирусов Рекомбинантные моноклональные антитела представляют большой интерес в качестве терапевтических средств (Chames P. et al., 2009; Nelson A. L. et al, 2010; Berry J. D. et al., 2011), в том числе против флавивирусных инфекций (Sautto G. et al., 2013). 48 Несмотря на значительное количество моноклональных антител к ВКЭ, лишь несколько потенциально терапевтических антител было опубликовано. Антитело 13D6 (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993) было использовано для создания одноцепочечного варианта sc13D6 и химерного антитела ch13D6 (Леванов Л. Н. и др., 2009; Levanov L. N. et al., 2010). Для этих антител показана вируснейтрализующая активность in vitro, индекс нейтрализации IC50 составил 11,2 – 16,7 и 1,9 – 4,5 мкг/мл, соответственно (Levanov L. N. et al., 2010). Одноцепочечное антитело 4.2 (Jiang W. et al., 1994) нейтрализовало ВКЭ с индексом IC50 около 400 мкг/мл. Это же антитело обеспечило частичную защиту мышей от летальной дозировки вируса шотландского энцефаломиелита. На основе перспективного моноклонального антитела E16 против вируса Западного Нила (Nybakken G. E. et al., 2005) был создан химерный вариант этого антитела Ch-E16, а также несколько гуманизировнных вариантов, отличающихся единичными заменами а.к.о. в каркасных районах вариабельного домена: Hm-E16, HmE16.1, Hm-E16.2 и Hm-E16.3 (Oliphant T. et al., 2005). Эти рекомбинантные антитела проявляли сходные вируснейтрализующие свойства, показатель PRNT50 (концентрация, обеспечивающая 50% ингибирование в реакции бляшкообразования) составил 4 – 18 нг/мл для разных штаммов вируса Западного Нила. Наибольшую протективную активность проявило антитело Hm-E16.3, в последующих работах обозначенное hE16, MGAWN1 и Hu-E16 (Morrey J. D. et al., 2006; Lai H. et al., 2010). Введение этого антитела в дозировке 4 мкг/мышь через 2 дня после инфицирования мышей вирусом Западного Нила (100 БОЕ/мышь) обеспечило 67% выживаемость (Oliphant T. et al., 2005). Высокий уровень протекции наблюдался также у хомячков при введении антитела на 5 и 6 день после инфекции (Morrey J. D. et al., 2006; Morrey J. D. et al., 2007). Для проведения клинических испытаний гуманизированного антитела Hu-E16 были отработаны схемы его получения, в том числе в растениях табака Nicotiana benthamiana и салата Lactuca sativa (Lai H. et al., 2010; Lai H. et al., 2012). Отличия в профилях гликозилирования антитела pHu-E16, полученного в растениях, по сравнению с антителом Hu-E16, полученным в клетках млекопитающих, привели к снижению сродства антитела pHu-E16 к компоненту C1q системы комплемента человека. Однако протективные свойства этих вариантов антител достоверно не различались (Lai H. et al., 2010). 49 В ходе первой фазы клинических испытаний антитела Hu-E16, кодовое название MGAWN1, было установлено, что дозы вплоть до 30 мг/кг были успешно перенесены с незначительным числом мягких побочных эффектов (Beigel J. H. et al., 2010; Sautto G. et al., 2013; Lim S. P. et al., 2013). В 2009 г компания MacroGenisc, Inc. начала вторую фазу клинических испытаний этого http://ir.macrogenics.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=792717 антитела (URL: (дата обращения: 31.07.2015)). Испытания были досрочно прекращены, официальная причина – невозможность набрать необходимое число добровольцев (URL: http://clinicaltrials.gov/show/NCT00927953 (дата обращения: 31.07.2015)) (Lim SP et al., 2013). В настоящее время антитело MGAWN1 отсутствует в списке исследований компании MacroGenisc, Inc. В то же время активно разрабатываются альтернативные рекомбинантные варианты этого антитела, получаемые в растениях (Lai H. et al., 2014; He J. et al., 2014). Полноразмерные человеческие антитела CR4374, CR4353, CR4354 и CR4348 против вируса Западного Нила также рассматриваются как потенциально терапевтические (Throsby M. et al., 2006; Marasco W. A. et al., 2007; Vogt M. R. et al., 2009). Антитела CR4374 и CR4353 обеспечивали 50% уровень протекции в дозировке около 13 мкг/кг и 360 мкг/кг, соответственно, при введении за 24 ч до инфекции мышам, инфицированным 20 ЛД50 вируса Западного Нила. При этом аффинность антител к инактивированному вирусу составила около 56 нМ и 6 нМ, соответственно (Throsby M. et al., 2006). Антитела CR4348 и CR4354 обеспечивали 100% уровень протекции в дозировке около 1,4 мкг/мышь и 0,4 мкг/мышь, соответственно, при введении за 24 ч до инфекции мышам, инфицированным вирусом Западного Нила (Vogt M. R. et al., 2009). Наличие протективных свойств также установлено для одноцепочечных антител против вируса Западного Нила, а также их конъюгатов с Fc-фрагментом антител (Gould L. H. et al., 2005). Протективные и терапевтические свойства также показаны для аденовирусного вектора, доставляющего ген конъюгата одноцепочечного антитела с Fcфрагментом человеческого антитела (Pereboev A. et al., 2008). Против вируса лихорадки Денге разрабатывается несколько потенциально терапевтических антител. Для мышиного моноклонального антитела E60, которое получено против вируса Западного Нила и направлено на эпитоп в области петли слияния гликопротеина Е, а также связывается с гликопротеином E серотипа 2 вируса 50 лихорадки Денге, сконструировано два химерных варианта, обозначенных E60-hIgG1 и E60-N297Q (Oliphant T. et al., 2006; Balsitis S. J. et al., 2010). Мутация в CH2-домене второго варианта препятствует гликозилированию этого антитела, благодаря чему это антитело, в отличие от варианта E60-hIgG1 с нормальным гликозилированием, не вызывает антителозависимого усиления инфекции ни in vitro, ни in vivo. Более того, в экспериментах по протекции мышей от летальных доз серотипа 2 вируса лихорадки Денге негликозилированное антитело проявило активность как в профилактике, так и в терапии, тогда как гликозилированный вариант в той же дозировке 20 мкг/мышь не проявил протективных свойств (Balsitis S. J. et al., 2010). Широкий набор человеческих моноклональных антител был получен на основе Bлимфоцитов доноров, инфицированных либо перенесших в прошлом лихорадку Денге (Beltramello M. et al., 2010). Среди них были антитела против петли слияния, которые составляли большинство, а также антитела против домена DIII гликопротеина Е, в том числе кросс-реактивные и кросс-нейтрализующие. Кроме того, часть полученных антител была направлена к белкам prM, NS1, NS3 и капсидному белку. Авторы работы отмечают, что все полученные антитела в некотором диапазоне концентраций вызывали антителозависимое усиление инфекции, причём для антител против белков prM этот диапазон был особенно широким (Beltramello M. et al., 2010). В отличие от исходных антител, негликозилированные варианты, полученные для наиболее перспективных антител DV87.1, DV22.3 и DV82.11, не вызывали антителозависимого усиления инфекции ни in vitro, ни in vivo. Использование этих антител в совокупности продемонстрировало высокую протективную активность на мышиной модели с использованием летальных доз серотипа 2 вируса лихорадки Денге. Человеческие моноклональные антитела 1F4, 2D22 и 5J7 также являются потенциально терапевтическими антителами против вируса лихорадки Денге (de Alwis R. et al., 2012). Эти антитела способны нейтрализовать серотипы 1, 2 и 3 вируса лихорадки Денге, соответственно, с индексом нейтрализации IC50 < 0,2 мкг/мл. Среди этих антител только 5J7 способно связываться с молекулами рекомбинантного гликопротеина Е, два других антитела связываются с гликопротеином Е только в составе вирионов. Эпитопы этих антител расположены в шарнирной области между доменами DI и DII, при этом они перекрываются с эпитопом вируснейтрализующего и 51 протективного антитела CR4354 против вируса Западного Нила (Vogt M. R. et al., 2009; de Alwis R. et al., 2012). Гуманизированное антитело hDB32-6 против второго серотипа вируса лихорадке Денге было получено на основе мышиного моноклонального антитела DB32-6 (Li P. C. et al., 2012). Это антитело направлено на домен DIII гликопротеина Е (а.к.о. K310 и E311), а его сродство к рекомбинантному домену DIII составляет около 0,18 нМ. В дозировке 5 мкг/мышь антитело hDB32-6 обеспечило 94% выживаемость животных при введении через 1 сутки после инфицирования. Животные были предварительно инфицированы вирусом лихорадки Денге, серотип 2, в дозировке 25 ЛД50. Кроме того, в этой работе также описан вариант антитела hDB32-6 с модифицированным Fc-участком, который сохранил вируснейтрализующую активность in vitro, но при этом не вызывал антителозависимого усиления инфекции in vitro (Li P. C. et al., 2012). Для вируса лихорадки Денге наряду антителами, направленными на определённых серотип, получены также кросс-реактивные антитела (Smith S. A. et al., 2013; Costin J. M. et al., 2013). В целом кросс-реактивные антитела направлены, как правило, на труднодоступные эпитопы в области петли слияния гликопротеина Е и поэтому обладают низкой вируснейтрализующей и протективной активностью (Dejnirattisai W. et al., 2010; de Alwis R. et al., 2012). Однако человеческое моноклональное антитело 1C19 оказалось высоконейтрализующим антителом, способным нейтрализовать все четыре серотипа вируса лихорадки Денге с индексом нейтрализации менее 0,1 мкг/мл (Smith S. A. et al., 2013). Эпитоп антитела находится в области bc-петли домена DII, расположенной рядом с петлёй слияния, благодаря чему антитело 1C19 блокирует связывание слабонейтрализующих антител (Smith S. A. et al., 2013). Протективная активность антитела была изучена на мышах с использованием сублетальных доз вируса, при этом введение антитела 1C19 достоверно снижало концентрацию вируса в крови животных по сравнению с контрольной группой. Ещё одна группа кросс-реактивных вируснейтрализующих человеческих антител против вируса лихорадки Денге получена в работе Costin J. M. et al., 2013. Несмотря на то, что антитела 4.8A, D11C и 1.6D получены трансформацией B-лимфоцитов, выделенных из трёх выздоравливающих доноров с различными историями болезни, свойства этих антител во многом сходны. Эти антитела направлены на эпитопы в области петли слияния гликопротеина Е (а.к.о. W101, L107 и G109), умеренно 52 нейтрализуют все четыре серотипа вируса лихорадки Денге, а также вызывают антителозависимое усиление инфекции in vitro для всех серотипов. Кроме того показано, что эти антитела нейтрализуют вирусную активность на стадии слияния клеточной и вирусной мембран (Costin J. M. et al., 2013). Против вируса желтой лихорадки известно об одном потенциально терапевтическом антителе 2C9-cIgG (Thibodeaux B. A. et al., 2012; Julander J. G. et al., 2014). Это химерное антитело, созданное на основе мышиного моноклонального антитела 2C9, направлено на домен DII гликопротеина Е вируса желтой лихорадки, а.к.о. 71, 72 и 125 (Brandriss M. W. et al., 1986; Lobigs M. et al., 1987). Антитело 2C9-cIgG проявило выраженные протективные свойства в профилактике и терапии при использовании как мышиной модели заболевания, так и на хомячках. Таким образом, изложенные выше данные свидетельствуют о перспективности разработки препаратов на основе иммуноглобулинов для терапии флавивирусных инфекций. При этом создание терапевтических рекомбинантных предпочтительно на основе изотипа IgG1 иммуноглобулинов человека. 53 антител Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Реактивы и материалы 2.1.1. Список реактивов Реактивы, использованные для электрофореза: акриламид, бромистый этидий, додецилсульфат натрия, ксиленцианол, N,N'-метиленбисакриламид, персульфат аммония, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, трис(гидроксиметил)аминометан (трис), этилендиаминтетрауксусная кислота (Amresco). Глицин, бромфеноловый синий, агароза (Helicon). Глицерин, красителя “Coomassie Brilliant Blue R-250” (Sigma). Дитиотреитол (“LOBA”, Австрия). Агароза с низким эндоэлектроосмосом (“АмплиСенс”, Россия). Реактивы, использованные для культивирования Escherichia coli: агар-агар и триптон Bacto (“Difco”, США); дрожжевой экстракт (“Fluka”, Швеция). Реактивы и пластик, использованные для трансфекции и культивирования культуры клеток CHO-K1: реагент для трансфекии “Lipofectamine 2000” (Invitrogen), культуральная среда “DMEM F12 advanced” (Life technologies), сыворотка с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Life technologies); 6-ти и 12-ти луночные культуральные планшеты (Nunc). Реактивы для иммуноферментного анализа: бычий сывороточный альбумин, конъюгат щелочной фосфатазы с моноклональными антителами мыши против константной части антител IgG1 человека (Sigma); детергент tween-20, пара-нитрофенилфосфат (Serva). Реактивы для вестерн-блот анализа: нитроцеллюлозная мембрана (Sigma), нитроблю тетразолий (NBT), 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) (Fermentas); Реактивы для масс-спектрометрии: трипсин и химотрипсин для масс- спектрометрии (Promega), ацетонитрил и вода для масс-спектрометрии (Panreac), гидрокарбонат аммония (Panreac). Прочие реактивы: диметилсульфоксид, дезоксирибонуклеозид-5`-трифосфаты, 3-[N-морфолино]пропансульфоновая кислота (MOPS) (Sigma); фенилметансульфонил фторид (PMSF) (Amresco). Готовые коммерческие наборы: “QIAquick Gel Extraction Kit”, “RNeasy Mini Kit” и “OneStep RT-PCR Kit”(QIAGEN); “PureYield plasmid midiprep system” (Promega); “Titan One Tube RT-PCR kit” (Roche). 54 Ферменты: эндонуклеазы рестрикции EcoRV, HindIII, XhoI, Acc65I, ApaI и XbaI (Fermentas), ДНК-лигаза фага T4, Taq-ДНК полимераза (Fermentas); ингибитор РНКаз RNAguard® (“Pharmacia Biotech”, Швеция). 2.1.2. Антигены Рекомбинантный белок Е вируса клещевого энцефалита (Нетёсова Н.А., 1999) был приобретён в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». 2.1.3. Растворы Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР): 100 мМ NaCl, 50 мМ Na2HPO4 (pH 7,4); Фосфатно-солевой буферный раствор с детергентом (ФСБР-tween): 100 мМ NaCl, 50 мМ Na2HPO4, 0,05% Tween-20 (pH 7,4); Буфер № 1 для трансформации: 10 мМ МОРS, 10 мМ RbCl (pH 7,0); Буфер № 2 для трансформации: 100 мМ МОРS, 10 мМ RbCl, 50 мМ СаСl2, (pH 6,5); ТАЕ-буфер для электрофореза ДНК (50-кратный): 242 г трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0), вода до 1 л; АР-буфер для щелочной фосфатазы: 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 100 мМ трис-HCl (pH 9,5); Трис-глициновый буфер для электрофореза белков: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% ДСН (pH 8,3); Буфер двухкратный для внесения белковых проб, с дитиотреитолом: 0,1 M дитиотреитол, 4% ДСН, 0,2% бромфеноловый синий, 20% глицерин, 100 мМ трис-HCl (pH 6,8); Буфер двухкратный для внесения белковых проб: 4% ДСН, 0,2% бромфеноловый синий, 20% глицерин, 100 мМ трис-HCl (pH 6,8); Примечание: значения pH растворов приведены для температуры 25 ºС. 2.1.4. Культуральные среды Среда 2×YT (на 1 л): триптон – 16 г, дрожжевой экстракт – 10 г, NaCl – 5 г (pH 7,2); 55 Плотная среда 2×YT-агар (на 1 л): триптон – 16 г, дрожжевой экстракт – 10 г, NaCl – 5 г, агар-агар – 15 г (pH 7,2). 2.1.5. Плазмидные ДНК pCH и pCL (Шингарова Л. Н. и др., 2007); pEGFP-N1 (Clontech). 2.1.6. Бактерии Escherichia coli штамм XL1-Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac [F’ proAB, lacIqZΔM15, Tn10 (Tet’)]. 2.1.7. Клеточные линии CHO-K1 (Life Technologies). 2.1.8. Олигонуклеотиды Олигонуклеотиды, использованные в работе, были получены стандартным фосфитамидным методом в Лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН: mouse_kappa_dir: 5' CC GAA TTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA mouse_kappa_const_rev: 5' GG GAA GCT TGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC MH1_dir: 5' CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC mouse_IgHG1_const_rev: 5' GGC AAG CTT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC mouse_lambda_dir: 5' G GCG AAT TCC CAG GCT GTT GTG ACT CAG GAA TCT GC mouse_lambda_const_rev: 5' GTT AAG CTT GAG CTC CTC AGA GGA AGG TGG AAA CA m13/pUC_dir(-46): 5' GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACG A M13/pUC_rev(-46): 5' GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG VH_dir_XhoI: 5' GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG VH_rev_Acc65I: 5' GAC GGT GAC CAG GGT ACC CTG GCC VL_dir_EcoRV: 5' GG GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCC CC VL_rev_HindIII: 5' CCG TTT GAT CTC AAG CTT GGT CCC Lconn_dir: 5' ATC GTC GAC AGC GGC CGC A Lconn_rev: 5' AGC TTG CGG CCG CTG TCG ACG AT Hconn_dir: 5' TCG AGG TCG ACA GCG GCC GCG Hconn_rev: 5' GTA CCG CGG CCG CTG TCG ACC 56 2.2. Методы 2.2.1. Исследование протективных свойств препаратов моноклональных и рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита Протективные свойства препаратов моноклональных и рекомбинантных антител исследовали на периферической мышиной модели ВКЭ (Тимофеев А. В. и др., 2001). Эксперименты проводили в томском отделении НПО «Микроген» на мышах линии BALB/c весом 10 г, по 10 животных в каждой группе, с использованием штамма «Абсеттаров» ВКЭ. Препарат вируса представлял собой суспензию головного мозга мышей-сосунков, зараженных вирусом, разведённую в 0,9% растворе хлорида натрия с добавлением 2% сыворотки крупного рогатого скота. В начале эксперимента мышам внутрибрюшинно водили по 0,2 мл суспензии в рабочем разведении, что соответствовало ориентировочной дозе заражения 100 ЛД50. Реальную летальную дозу препарата рассчитывали по методу Рида-Менча (Reed L. J. et al., 1938). Через 24 ч после заражения животным вводили в хвостовую вену препараты антител в исследуемой дозировке, разведённые в 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Мышей наблюдали в течение 21 суток после заражения. Кроме того, осуществляли контроль летальности ВКЭ, а также контроль качества животных и случайной гибели. В первом случае через 24 ч после заражения животным вводили 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия, во втором мыши не заражались тестштаммом и не получали никаких препаратов. 2.2.2. Выделение суммарной РНК из гибридомных клеток Выделение РНК проводили с помощью набора реагентов “RNeasy Mini Kit” (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Около 106 гибридомных клеток осаждали 5 мин при 300 g. Осадок ресуспендировали в 350 мкл лизирующего буфера RLT, затем гомогенинировали пропусканием 8 – 10 раз через 1 мл шприц с иглой. Добавляли 350 мкл 70% этанола и перемешивали пипетированием. Образец помещали в спин-колонку и центрифугировали 15 с при 12000 g. В колонку добавляли 350 мкл буфера RW1 и центрифугировали 15 с при 12000 g. Помещали в колонку 80 мкл раствора, содержащего 30 ед. акт. ДНКазы I в буфере RDD (QIAGEN), и инкубировали 15 мин. Колонку промывали 350 мкл буфера RW1, затем 500 мкл буфера RPE с 57 центрифугированием 15 с при 12000 g. Повторно промывали колонку 500 мкл буфера RPE с центрифугированием 2 мин при 12000 g. Смывали РНК с колонки 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз, центрифугированием 1 мин при 12000 g. После измерения концентрации раствор РНК хранили при -70 ºС. 2.2.3. ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) была проведена с использованием набора “Titan One Tube RT-PCR kit” (Roche) согласно инструкции производителя. При синтезе фрагментов тяжелых цепей использовали олигонуклеотиды MH1_dir и mouse_IgHG1_const_rev, а для синтеза VL-фрагментов – олигонуклеотиды mouse_kappa_dir и mouse_kappa_const_rev, а также mouse_lambda_dir и mouse_lambda_const_rev. В результате оптимизации были подобраны следующие условия: обратная транскрипция – 52 ºС/30 мин, денатурация ДНК и инактивация обратной транскриптазы – 94 ºС/3 мин. Далее 35 циклов: денатурация – 94 ºС/30 с; отжиг праймеров – 55 ºС/30 с (52 ºС/30 с) в случае амплификации VH (VL) фрагментов; элонгация – 68 ºС/1 мин. Заключительная стадия элонгации длилась 5 мин. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 6% полиакриламидном геле. Участки геля, содержащие необходимые фрагменты ДНК, (размером ~ 350 п.н. для VH-фрагметов и ~ 325 п.н. а в случае VL-фрагментов) вырезали, измельчали и проводили водную экстракцию ДНК из геля трехкратным замораживанием-размораживанием. Полученный раствор использовали в качестве раствора матричной ДНК для проведения дополнительной амплификации методом ПЦР. 2.2.4. ПЦР ДНК-фрагменты получали на амплификаторе “GeneAmp PCR System 9700” (Applied Biosystems). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала по 10 пмоль праймерных олигонуклеотидов, 5 нмоль каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (Fermentas), 0,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы, 1 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas), 5 мкл 10х буфера для Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и 1 – 100 пг матричной ДНК. Пробы помещали в амплификатор, предварительно прогретый до 95 ºС. Проводили 30 циклов ПЦР по схеме: денатурация – 95 ºС, 30 с; отжиг праймеров – 58 30 с; элонгация – 72 ºС, время элонгации зависело от длины фрагмента. Финализация – 72 ºС, 5 мин. 2.2.5. Амплификация участков ДНК, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов Для получения фрагментов тяжелых цепей проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидов MH1_dir и mouse_IgHG1_const_rev, температура отжига составляла 55 ºС. Для получения VL-фрагментов – ПЦР с использованием олигонуклеотидов mouse_kappa_dir и mouse_kappa_const_rev, температура отжига составляла 52 ºС. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле, вырезали необходимые участки геля (фрагмент размером ~ 350 п.н. для VH-фрагментов и ~ 325 п.н. в случае VLфрагметов) и экстрагировали ДНК с помощью набора “QIAquick Gel Extraction Kit” (Qiagen) по инструкции производителя. 2.2.6. Встраивание VH- и VL-фрагментов плазмиду pUC19 Плазмидную ДНК, а также VH- или VL-фрагмент гидролизовали эндонуклеазами EcoRI и HindIII (Fermentas). Гидролизованные продукты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле. Фрагменты, соответствующие по размеру ожидаемым продуктам, вырезали и проводили экстракцию ДНК из геля с помощью набора для выделения ДНК “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN) по инструкции производителя. ДНК-фрагменты лигировали, полученной смесью трансформировали E. coli, анализировали клоны и выделяли плазмидную ДНК. 2.2.7. Лигирование ДНК Лигирование осуществляли в 20 мкл смеси, содержащей 1 ед. акт. ДНК-лигазы бактериофага T4 (Fermentas), 2 мкл 10х лигазного буфера и около 100 нг ДНК, в которой векторный фрагмент и фрагмент-вставка взяты в молярном соотношении 1 : 5. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli XL-1 blue, которые затем высевали на питательную среду 2xYT-агар, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина. Полученные клоны анализировали ПЦР, после чего из них выделяли плазмидную ДНК. 59 2.2.8. Ферментативный гидролиз ДНК Гидролиз проводили в 10 – 20 мкл смеси, содержащей 0,2 – 1 мкг ДНК и 1 – 2 ед. акт. эндонуклеазы рестрикции в буфере, рекомендованном производителем. Реакцию осуществляли при рекомендованной температуре в течение 1 ч, после чего ДНК разделяли электрофоретически и выделяли набором “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN). 2.2.9. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК Трансформацию проводили по ранее описанному методу (Sambrook J. et al., 2001) с модификациями. Суспензию клеток объемом 0,5 мл с оптической плотностью OD600 около 0,4 центрифугировали 1 мин при 4000 g, пробирки помещали в лед. Осадок ресуспендировали в 1 мл буфера № 1 для трансформации. Суспензию центрифугировали 1 мин при 4000 g. Осадок ресуспендировали в буфере № 2 для трансформации и оставляли во льду на 15 мин. После центрифугирования в течение 1 мин при 4000 g тщательно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 0,2 мл буфера № 2 для трансформации и добавляли ~ 20 нг плазмидной ДНК. Смесь выдерживали при 0 °C в течение 30 мин, затем прогревали 1 мин при 42 °C, добавляли 1 мл среды 2×YT и выдерживали 60 мин при 37 °C. После этого бактерии высевали на чашки со средой 2×YT-агар, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и растили в течение ночи при 37 °C. 2.2.10. Выделение плазмидной ДНК Суперскрученную плазмидную ДНК выделяли коммерческим набором “Zyppy Plasmid Miniprep Kit” (Zymo Research) согласно инструкции производителя. После измерения концентрации раствор ДНК хранили при -20 °C. 2.2.11. Определение концентрации нуклеиновых кислот Концентрацию нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм на спектрофотометре “SmartSpec Plus” (Bio-Rad). В расчетах полагали, что оптическая плотность равна 1,0 для раствора РНК с концентрацией 40 мкг/мл и раствора ДНК с концентрацией 50 мкг/мл (Sambrook J. et al., 2001). 60 2.2.12. Электрофоретическое фракционирование ДНК Фракционирование фрагментов ДНК электрофорезом проводили согласно стандартной методике (Sambrook J. et al., 2001). Использовали 6% ПААГ с соотношением «акриламид : N,N'-метиленбисакриламид» = 29 : 1 либо 1% агарозу в ТАЕ-буфере. Для визуализации ДНК гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и документировали на системе “Gel Doc XR+” (Bio-Rad) . 2.2.13. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК Нуклеотидные последовательности определяли с использованием набора реагентов “BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems) согласно инструкции производителя. Продукты реакции Сэнгера обессоливали на сорбенте “Sephadex G-50 super fine” (GE Healthcare). Образцы высушивали на вакуумном испарителе “Concentrator Plus” (Eppendorf) и передавали в центр коллективного пользования “Геномика” СО РАН для анализа. Полученные нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности анализировали с помощью баз данных BLAST, IgBLAST (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/) и IMGT (URL: http://www.imgt.org). 2.2.14. Конструирование векторных плазмид pCH2 и pCL2 Плазмиды конструировали в соответствии с тем, как описано в гл. 3.4. Ферментативный гидролиз и лигирование ДНК проводили, как описано выше. Достройка 5’-выступающих концов ДНК до “тупых” с помощью Pfu ДНКполимеразы. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 0,5 ед. акт. Pfu ДНКполимеразы (Fermentas), 2 мкл 10х буфера, 2 нмоль каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата и около 1 мкг ДНК, содержащей 5’-выступающие концы. Реакционную смесь инкубировали при 72 °C в течение 10 мин, затем охлаждали до комнатной температуры и переосаждали ДНК этанолом. Введение делеции методом перекрывающейся ПЦР. Делецию в ген, кодирующий лёгкую цепь антитела, вводили методом перекрывающейся ПЦР (Heckman K. L. et al., 2007). Для этого сначала были получены перекрывающиеся ДНК-фрагменты sigVL_delta и CL_delta, содержащие делецию. Фрагмент sigVL_delta был получен в результате ПЦР с использованием олигонуклеотидов T7mod_dir и ON2 при температуре 61 отжига 50 °C. ДНК-фрагмент CL_delta получали аналогично с использованием олигонуклеотидов ON1 и BGH_rev. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, вырезали необходимые участки геля и экстрагировали ДНК с помощью набора “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN) по инструкции производителя. ДНК-фрагмент light_delta получали в результате ПЦР, реакционная смесь объемом 50 мкл содержала по 10 пмоль праймерных олигонуклеотидов T7mod_dir и BGH_rev, 5 нмоль каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 0,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы, 1 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas), 5 мкл 10х буфера для Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и по 50 нг ДНК-фрагментов sigVL_delta и CL_delta. Проводили 30 циклов по схеме: денатурация – 95 °C/1 мин; отжиг – 50°C/1 мин и элонгация – 72 °C/1 мин. Финализация – 72 °C, 5 мин. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, вырезали необходимые участки геля и экстрагировали ДНК с помощью набора “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN) по инструкции производителя. Сайт-направленный мутагенез методом мегапраймера (Kammann M. et al., 1989; Ke S. H. et al., 1997). На первой стадии проводили ПЦР с использованием праймера M, содержащего мутацию, и фланкирующего праймера A. В качестве матрицы использовали исходный ДНК-фрагмент A-B, не содержащий мутаций. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, вырезали участок геля, содержащий ДНК-фрагмент A-M и экстрагировали ДНК с помощью набора “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN) по инструкции производителя. На второй стадии ДНК-фрагмент A-M, содержащий мутацию, использовали в качестве «мегапраймера». Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 300 нг ДНКфрагмента A-M, 5 нмоль каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 0,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы, 1 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas), 5 мкл 10х буфера для Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и 200 пг исходного ДНК-фрагмента A-B в качестве матрицы. Проводили 5 циклов по схеме: денатурация – 95 °C/1 мин; отжиг и элонгация – 72 °C/2 мин. Затем добавляли 10 пмоль фланкирующего праймера B и проводили еще 25 циклов по схеме: денатурация – 95 °C/1 мин; отжиг – 50 °C/1 мин и элонгация – 72 °C/1 мин.. После этого проводили окончательную элонгацию 72 °C, 5 мин. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле и экстрагировали 62 ДНК с помощью набора “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN) по инструкции производителя. 5’-фосфорилирование олигонуклеотидов и получение олигонуклеотидных коннекторов. При получении ДНК-коннектора для плазмиды pCL2 реакционная смесь объемом 50 мкл содержала по 500 пг олигонуклеотидов Lconn_dir и Lconn_rev, 5 мкл 10мМ раствора аденозинтрифосфата, 10 ед. акт. полинуклеотидкиназы бактериофага T4 (New England Biolabs) и 5 мкл 10x буфера для полинуклеотидкиназы (New England Biolabs). Олигонуклеотиды фосфорилировали 30 мин при 37 °C, инкубировали 5 мин при 95 °C для инактивации фермента и затем выдерживали 20 мин при комнатной температуре для образования двуцепочечных ДНК-фрагментов. Полученную смесь использовали для лигирования ДНК в молярном соотношении «вектор : коннектор» = 1 : 10. Аналогично на основе нуклеотидов олигонуклеотидов Hconn_dir и Hconn_rev получали ДНК-коннектор для плазмиды pCH2. 2.2.15. Встраивание VH- и VL-фрагментов в векторные плазмиды pCH2 и pCL2 Плазмидную ДНК pCH2, а также VH-фрагмент ДНК были гидролизованы эндонуклеазами рестрикции XhoI и Acc65I (Fermentas). Гидролизованные продукты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле. Фрагменты, соответствующие по размеру ожидаемым продуктам, вырезали и проводили экстракцию ДНК из геля с помощью набора для выделения ДНК “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN) по инструкции производителя. Аналогично проводили гидролиз плазмидной ДНК pCL2 и VL-фрагмента эндонуклеазами рестрикции EcoRV и HindIII (Fermentas). 2.2.16. Выделение плазмидной ДНК, не содержащей эндотоксинов Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукариотические клетки осуществляли с использованием набора “PureYield plasmid midiprep system” (Promega). Для этого клоны E.coli XL1-blue, трансформированные необходимой плазмидой, выращивали в 100 мл среды LB при 37 °C и непрерывном качании в течение ночи. После этого осуществляли выделение ДНК согласно инструкции производителя с использованием вакуумного насоса (Millipore). Элюированные с колонок растворы плазмид центрифугировали 5 мин при 14000 g для удаления взвеси диоксида кремния. 63 Плазмидную ДНК переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде, не содержащей нуклеаз. После определения концентрации растворы ДНК хранили при -20 °C. 2.2.17. Электрофоретический анализ белков Электрофоретическое разделение белков проводили по Лэммли (Laemmli U. K., 1970) в трис-глициновом буфере. Использовали 5% концентрирующий и 12% либо 15% разделяющий гели. Для денатурации белка образцы предварительно смешивали с равным объемом буфера для внесения проб и прогревали 5 мин при 95 °C. При проведении электрофореза в редуцирующих условиях использовали буфер для внесения проб, содержащий 0,1 М дитиотреитол. Электрофорез проводили в режиме 5 – 8 В/см, после чего гель окрашивали подогретым до 50 – 60 °C спиртовым раствором красителя “Coomassie Brilliant Blue R-250” в течение 10 мин и отмывали краситель 10% водным раствором уксусной кислоты, подогретым до 50 – 60 °C. Окрашенный гель сканировали или фотографировали. 2.2.18. Масс-спектрометрический анализ антител Для масс-спектрометрического анализа нативных молекул образец антитела в количестве около 5 мкг обессоливали с помощью наконечников ZipTipC18 (Millipore) согласно рекомендациям производителя. Обессоленные образцы передавали в Центр масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН, где их кристаллизовали с синапиновой кислотой и анализировали на времяпролётном МАЛДИ-масс-спектрометре “Autoflex speed” (Bruker) в диапазоне m/z = 30000 – 210000 в линейном положительном режиме. Для анализа масс триптических фрагментов образец антитела разделяли электрофорезом в восстанавливающих условиях, окрашивали красителем “Coomassie Brilliant Blue R-250” и вырезали необходимый фрагмент геля, содержащий лёгкую или тяжёлую цепь. Фрагмент геля измельчали, удаляли краситель попеременной инкубацией то в 50% водном растворе ацетонитрила, содержащем 50 мМ NH4HCO3, то в 100% ацетонитриле. В каждом растворе гель выдерживали по 10 мин с интенсивным встряхиванием, отмывку повторяли три раза. Белок гидролизовали в геле модифицированным трипсином для масс-спетрометрии (Promega) согласно инструкции производителя в течение ночи. Пептиды экстрагировали из геля 50 мкл 25 мМ 64 NH4HCO3, высушивали на вакуумном испарителе “Concentrator Plus” (Eppendorf) и обессоливали с помощью наконечников ZipTipC18 (Millipore) согласно рекомендациям производителя. Обессоленные образцы передавали в Центр масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН, где их кристаллизовали с 2,5-дигидроксибензойной кислотой и анализировали на времяпролётном МАЛДИ-масс-спектрометре “Autoflex speed” (Bruker) в диапазоне m/z = 500 – 4000 в отражательном положительном режиме. Спектры анализировали с помощью программного обеспечения mMass v. 5.5.0 (by Martin Strohalm, PhD.). Для моделирования продуктов триптического гидролиза использовали программу PeptideMass (URL: http://web.expasy.org/peptide_mass/ (дата обращения: 31.07.2015)). 2.2.19. Дегликозилирование антител Антитела дегликозилировали N-гликозидазой F (peptide-N4-(N-acetyl-beta- glucosaminyl)asparagine amidase, PNGase F, PNGase A, EC 3.5.1.52) (New England Biolabs). Реакционную смесь объемом 10 мкл, содержащую 10 мкг антитела и 1 мкл буфера “10x Glycoprotein Denaturing buffer” из комплекта, инкубировали 5 мин при 95 °C. Смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 2 мкл буфера “10x GlycoBuffer 2”, 2 мкл 10% NP40, 1 мкл N-гликозидазы F (New England Biolabs, 500 ед. акт./мкл) и 6 мкл воды. Инкубировали 1 ч при 37 °C. 2.2.20. Трансфекция и культивирование клеток Трансфекцию использованием клеток линии поликатионного CHO-K1 (Life липофильного Technologies) реагента проводили “Lipofectamine с 2000” (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Трансфекцию и культивирование клеток осуществлял А.Л. Матвеев. Клетки выращивали до достижения 90% конфлюентности в 6ти-луночных культуральных планшетах с использованием культуральной среды “DMEM F12 advanced” (Life technologies) без антибиотиков. При получении антитела ch14D5a (ch14D5b) смешивали по 35 мкг плазмид pCH2-14D5 и pCL2-14D5a (pCL2-14D5b) в одинаковом мольном соотношении и добавляли необходимое количество бессывороточной среды. После этого добавляли “Lipofectamine 2000” из расчёта 3 мкл на 1 мкг плазмидной ДНК, инкубировали суспензию в течение 20 мин и добавляли её в лунки с клетками. Клетки растили с добавлением 2% фетальной 65 сыворотка быка с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Life technologies) и без добавления антибиотиков при 37 °C и 4% содержании CO2. Первый отбор и замену культуральной среды осуществляли приблизительно через 24 ч после трансфекции. В дальнейшем среду отбирали и заменяли один раз в сутки в течение одной недели. К собранной культуральной жидкости, содержащей антитело, добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,02% и хранили при 4 °C до хроматографического выделения антител. 2.2.21. Хроматографическое выделение рекомбинантных антител Рекомбинантные и моноклональные антитела выделяли хроматографически с использованием сорбента “Protein A sepharose CL-4B” (GE Healthcare). Перед хроматографией культуральную жидкость осветляли центрифугированием 10 мин при 15000 g и фильтровали через полиэфирсульфоновый фильтр со средним размером пор 0,45 мкм. Антитела наносили на колонку с 5 мл сорбента “Protein A sepharose CL-4B” со скоростью 1 мл/мин с использованием хроматографа “BioLogic LP System” (Bio-Rad), проскок собирали для анализа. Колонку промывали 20 мл ФСБР, содержащего 0,05% азида натрия в качестве консерванта, после чего отмывали сорбент от антител быка 25 мл 0,1 М цитратного буфера с pH 5,0. Элюцию рекомбинантного антитела осуществляли 0,1 М цитратным буфером с pH 3,0. Для нейтрализации кислого элюирующего буфера и предотвращения деградации антител доводили pH элюата до 6,8 добавлением 1,5 М буфера трис-HCl pH 8,8. Анионообменную хроматографию проводили в проточном режиме со скоростью 0,2 мл/мин на колонке “HiScreen DEAE FF” (GE healthcare), упакованной 4,7 мл сорбента “DEAE Sepharose Fast Flow” (GE healthcare) и предварительно уравновешенной 0,2 М буфером трис-HCl с pH 6,8. Антитело элюировали тем же буфером. Раствор антитела концентрировали до 150 – 250 мкл ультрафильтрацией с использованием фильтров “Amicon ultra-4” (Millipore) с порогом отсечения 50 кДа. С использованием этих же фильтров производили замену буфера (диафильтрацию) на ФСБР с 0,05% азидом натрия. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм на спектрофотометре “SmartSpec Plus” (Bio-Rad). В расчетах полагали, что оптическая плотность раствора иммуноглобулинов IgG c концентрацией 1 66 мг/мл составляет около 1,41 (Hale G., 2000). Полученные образцы антител хранили при 4 °C. 2.2.22. Анализ олигомерных форм антител с использованием высокоэффективной гель-фильтрации Наличие мономерной, димерной и тримерной форм, а также фрагментов антител исследовали с помощью высокоэффективной гель-фильтрации на колонке “TSKgel G3000SWxl” (Tosoh Bioscience) с использованием хроматографа Breeze (Waters), работающего под управлением программного обеспечения Breeze 2. Колонку уравновешивали ФСБР с добавлением 0,02% азида натрия со скоростью 1 мл/мин. Образец антитела с концентрацией ~1 мг/мл вносили в петлю объемом 10 мкл и элюировали изократически тем же буфером. Оптическую плотность раствора анализировали на 280 и 320 нм. Калибровку колонки проводили с использованием набора белковых стандартов “Gel Filtration HMW Calibration Kit” (GE Healthcare). 2.2.23. Вестерн-блот анализ Вестерн-блот анализ использовали для подтверждения того, что полученные химерные антитела содержат константные части иммуноглобулинов человека класса IgG1. Образцы химерных антител ch14D5a и ch14D5b, а также МКА 14D5 электрофоретически разделяли в полиакриламидном геле, после чего при помощи электропереноса белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали в 5% эмульсии сухого молока в ФСБР 1 ч при 37 °C, затем трижды промывали, инкубируя 5 мин в ФСБР-tween. Далее добавляли иммуноконъюгат моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 человека (Sigma #A2064) либо иммуноконъюгат поликлональных антител козы против антител IgG человека (Sigma #A1543) в разведении 1 : 10000 в ФСБР-tween и инкубировали 1 ч при 37 °C. После этого мембрану отмывали трижды в ФСБР-tween, затем трижды в APбуфере. Добавляли растворы красителей “Nitro blue tetrazolium” (NBT) и 5-бром-4-хлор3-индолилфосфат (BCIP), растворённые в AP-буфере и инкубировали мембрану в темноте при 37 °C до появления окрашивания. Мембрану дистиллированную воду, отмывали, высушивали и сканировали. 67 переносили в 2.2.24. Твердофазный иммуноферментный анализ Способность антител связываться с антигеном определяли твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА). В 96-луночные стрипованные полистирольные планшеты с плоским дном (Росмедполимер) сорбировали около 200 нг рекомбинантного белка Е, растворенного в 100 мкл ФСБР. Сорбцию проводили в течение ночи при температуре 4 °C. После удаления раствора антигена лунки промывали три раза буфером ФСБР-tween. Далее поверхность лунок блокировали 3 % раствором БСА в буфере ФСБР-tween при 37 °C в течение часа. Исследуемые антитела разводили в ФСБР с шагом 1,5, начиная с концентраций 1 мкг/мл, 100 мкг/мл и 5 мкг/мл для антител ch14D5a, ch14D5b и МКА 14D5, соответственно. Лунки планшета трижды промывали буфером ФСБР-tween и инкубировали 1 ч при 37 °C с последовательно разведёнными растворами антител. После трёхкратной промывки буфером ФСБР-tween образовавшиеся комплексы выявляли иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 человека (Sigma #A2064), использованным в разведении 1 : 10000 в ФСБРtween в течение часа при 37 °C. После трехкратной промывки сначала буфером ФСБРtween, затем AP-буфером в лунки добавляли по 100 мкл 2 мг/мл раствора паранитрофенилфосфата в AP-буфере. Через 5 – 30 мин после добавления хромогена измеряли оптическую плотность при длине волны 405 нм на планшетном спектрофотометре “Bio-Rad Model 680” (Bio-Rad). 2.2.25. Исследование сродства антител к рекомбинантному белку Е с использованием оптического биосенсора ProteOn XPR 36 Константы аффинности химерных антител ch14D5a и ch14D5b, а также МКА 14D5 по отношению к белку Е ВКЭ были определены на оптическом биосенсоре ProteOn XPR 36 (Bio-Rad). Для иммобилизации рекомбинантного белка Е поверхность сенсорного чипа GLC (Bio-Rad) была активирована смесью 125 мкл 40 мМ 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC) и 125 мкл 10 мМ N- гидроксисульфосукцинимида (Sulfo-NHS) в течение 1 мин со скоростью 150 мкл/мин. Рекомбинантный белок Е, разведённый в 10 мМ растворе ацетата натрия c pH 4,5 до концентрации 15 мкг/мл, иммобилизовали на активированную поверхность со скоростью 25 мкл/мин до уровня 2700 RU. Референсная дорожка чипа была 68 активирована аналогично, а при иммобилизации вместо раствора белка использовали 10 мМ растворе ацетата натрия c pH 4,5. Дорожки чипа блокировали 1 М этаноламин-HCl в течение 1 мин со скоростью 150 мкл/мин. Эксперименты по связыванию проводили в буфере ФСБР с добавлением 0,005% tween-20. В качестве аналита использовали последовательные двухкратные разведения антитела в этом буфере, начиная с концентрации 50 нМ. На стадии ассоциации растворы антител пропускали со скоростью 25 мкл/мин в течение 10 мин. На стадии диссоциации буфер пропускали с той же скоростью в течение 120 мин. Каждую концентрацию антитела анализировали трижды, поверхность чипа между анализами регенерировали буфером 10 мМ глицин-HCl pH 2,5 со скоростью 100 мкл/мин в течение 40 сек. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ProteOn Manager v. 3.1.0 (Bio-Rad). Данные корректировали вычитанием сигнала, полученного с interspot-областей чипа, не содержащих иммобилизованного лиганда. Кривые связывания-диссоциации для разных концентраций антитела анализировали в совокупности (т.н. глобальный анализ) с использованием модели односайтового связывания для антител ch14D5a и ch14D5b, либо с использованием модели гетерогенного аналита для МКА 14D5. 2.2.26. Изучение нейтрализующей активности антител in vitro в реакции ингибирования фокусообразования Эксперименты по изучению вируснейтрализующей активности антител in vitro проводили совместно с сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор». Серию последовательных двухкратных разведений антитела в культуральной жидкости объемом 100 мкл смешивали с равным объёмом суспензии ВКЭ, штамм 205, содержащей около 500 фокусообразущих единиц (ф.о.е.) и инкубировали 1 ч при 37 °C. Затем 150 мкл смеси переносили в лунки 96-тилуночного культурального планшета с монослоем клеток Vero E6 и инкубировали в CO2-инкубаторе в течение 42 ч при 37 °C. Далее культуральную жидкость удаляли, а клетки фиксировали холодным ацетоном и высушивали. Лунки инкубировали со 100 мкл раствора моноклонального антитела 4F6 в ФСБР в течение 30 мин при 37 °C, затем промывали трехкратно ФСБР и инкубировали с раствором пероксидазного иммуноконъюгата антител козы против антител мыши (Sigma) в течение 1 ч при 37 °C. Лунки промывали трехкратно ФСБР и окрашивали раствором 369 амино-9-этилкарбазола (Sigma) согласно инструкции производителя. Окрашенные фокусы детектировали с помощью микроскопа Olympus CK40 (Olympus). Индекс нейтрализации IC50 при 50% ингибировании инфекционности вируса был вычислен c 95% доверительными интервалами методом пробит-анализа. 70 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Оценка протективной активности мышиных моноклональных антител против ВКЭ in vivo с целью выбора прототипного антитела При создании химерного антитела против ВКЭ было необходимо выбрать в качестве источника вариабельных доменов антитело, обладающее наибольшей противовирусной активностью из ранее охарактеризованной коллекции мышиных МКА (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). Протективную активность трёх высокоаффинных вируснейтрализующих антител 14D5, 13D6 и 1B1 исследовали на периферической мышиной модели ВКЭ (Тимофеев А. В. и др., 2001). Животных инфицировали приблизительно 500 ЛД50 вируса, препараты антител в дозировке 150 мкг/мышь вводили внутривенно через 24 ч после инфицирования. В результате эксперимента было установлено, что выживаемость мышей в случае введения антитела 14D5 выше по сравнению с антителами 1B1 и 13D6 (Рисунок 11). На основании этого МКА 14D5 было выбрано в качестве прототипа для создания химерного антитела против ВКЭ. Рисунок 11. Протективная активность МКА против ВКЭ in vivo. Мышам вводили по 150 мкг указанных МКА внутривенно через 24 ч после инфицирования 500 ЛД50 ВКЭ. * p<0,05; ** p<0,005 (логранговый критерий). 71 3.2. Получение ДНК-фрагментов, кодирующих вариабельные домены МКА 14D5, 1B1 и 13D6, и определение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов Из гибридомных клеток линии 14D5, продуцирующих МКА 14D5, была выделена РНК, которую использовали для синтеза фрагментов кДНК, кодирующих вариабельные домены антитела. Поскольку ранее было установлено, что МКА 14D5 относится к IgG1/каппа изотипу (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993), для синтеза кДНК-фрагментов, кодирующих VH-домен, использовали праймеры MH1_dir, соответствующий началу каркасных областей VH-последовательности, и mouse_IgHG1_const_rev, комплементарный началу домена CH1 IgG1-цепей антител мыши. Для синтеза кДНКфрагментов, кодирующих соответствующий началу VL-домен, каркасных использовали областей праймеры mouse_kappa_dir, Vkappa-последовательности, и mouse_kappa_const_rev, комплементарный началу Ckappa домена антител мыши. Последовательности праймеров были заимствованы из (Wang Z. et al., 2000) либо разработаны самостоятельно на основе последовательностей генов иммуноглобулинов мыши, опубликованных в базе GenBank. Для тяжёлой цепи в результате ПЦР образовался один ДНК-фрагмент, обозначенный VH14D5, тогда как для лёгкой цепи в результате ПЦР образовалось три фрагмента с различной электрофоретической подвижностью (Рисунок обозначенные VL14D5a, VL14D5b и VL14D5c. Рисунок 12. Электрофореграмма в 6% ПААГ ПЦР-фрагментов, полученных с кДНК гибридомных клеток линии 14D5. М – плазмидная ДНК pQpE, гидролизованная эндонуклеазой HaeIII. 72 12), Дополнительно мРНК клеток линии 14D5 была проверена на наличие последовательностей, кодирующих лёгкие цепи лямбда типа. Для этого на основе известных нуклеотидных последовательностей вариабельных и константных генов, кодирующих лёгкие цепи лямбда типа мышиных иммуноглобулинов, были разработаны праймеры mouse_lambda_dir и mouse_lambda_const_rev. В результате ПЦР, сопряжённой с обратной транскрипцией, ДНК-фрагментов не образовалось. Каждый из полученных ПЦР-фрагментов встроили в плазмиду pUC19 по сайтам эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII; плазмиды обозначили pUC19-VH-14D5, pUC19-VL-14D5a, pUC19-VL-14D5b и pUC19-VL-14D5c. После этого с использованием праймеров m13/pUC_dir(-46) и m13/pUC_rev(-46) были определены нуклеотидные последовательности встроенных участков для нескольких клонов каждой из полученных плазмид (рисунки 13, 14). Анализ последовательностей с помощью базы данных IMGT/V-QUEST (URL: http://www.imgt.org (дата обращения: 31.07.2015)) выявил, что последовательность фрагмента VH14D5 относится к семейству IGHV1 антител мыши, VL14D5a – к семейству IGKV10, а VL14D5b – к семейству IGKV6, согласно классификации IMGT. Последовательность фрагмента VL14D5c содержит V-участок (нуклеотиды 1 – 296), идентичный зародышевому гену IGKV3-5, однако вместо Jсегмента присутствует вставка участка генома (нуклеотиды 297 – 360), которая приводит к сдвигу рамки трансляции, что препятствует образованию легких цепей с константным доменом (Рисунок 14). Аналогичным образом были определены нуклеотидные последовательности фрагментов, кодирующих антитела 1B1 и 13D6 (рисунки 15, 16). Как и в случае гибридомы 14D5, для тяжёлых цепей антител 1B1 и 13D6 было получено по одному ДНК-фрагменту, тогда как для лёгких цепей в результате ПЦР образовалось несколько фрагментов с различной электрофоретической подвижностью. В результате секвенирования было установлено, что последовательности фрагментов VH1B1 и VH13D6 относятся к семейству IGHV1 антител мыши, VL1B1a и VL13D6a – к семейству IGKV10. Нуклеотидные последовательности ДНК-фрагментов VL1B1b и VL13D6b оказались идентичны нуклеотидной последовательности фрагмента VL14D5b. 73 VH14D5: 1 Q V Q L Q Q S G A E L A K P G A S V K M CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG 61 <------ CDR1 -----> S C K A S G Y I F T N Y W M H W V K Q R TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAT ATT TTT ACT AAC TAT TGG ATG CAC TGG GTA AAA CAG AGG 121 <-------------------- CDR2 ---------------P G Q G L E W I G Y I N P S T G Y T E Y CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT AGC ACT GGT TAT ACT GAA TAC 181 ----------------------> N Q R F I D K A T L T A D K S S S T A D AAT CAG AGA TTC ATA GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC GAC 241 <-----M Q L N S L T S E D S A V Y Y C V R E G ATG CAA CTG AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GTA AGA GAG GGA 301 --- CDR3 ---------> |<-------------F A L D Y W G Q G T T L T V S S A K T T TTC GCC CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA 361 ---- IgG1 constant ---------... P P S V Y R S S CCC CCA TCT GTC TAT AGA TCT TCC VL14D5a: 1 D I V M T Q S P S S L S A S L G D R V T GAT ATT GTG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC 61 <----------------- CDR1 ------------------> I S C R A S Q D I R N Y L N W Y Q Q K P ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC ATT AGA AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA 121 <---------- CDR2 ---------> D G S V K L L I Y Y T S R L Q S G V P S GAT GGA AGT GTT AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAG TCA GGA GTC CCA TCA 181 R F S G S G S G T D Y S L T I S N L E Q AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGC AAC CTG GAA CAA 241 <-------------- CDR3 -------------> E D I A T Y F C Q E G G T L P R T F G G GAA GAT ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA GAG GGT GGT ACG CTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA 301 |<---------- kappa constant --------... G T K L E I K R A D A A P T V S S GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCA AGC TT Рисунок 13. Нуклеотидные последовательности, а также выведенные последовательности аминокислотных остатков ДНК-фрагментов VH14D5 и VL14D5a, полученных на основе гибридомных клеток линии 14D5. Жирным шрифтом отмечены области, кодирующие гипервариабельные участки. Серым фоном выделены области, соответствующие участкам гибридизации праймеров MH1_dir и mouse_IgHG1_const_rev, а также праймеров mouse_kappa_dir и mouse_kappa_const_rev. 74 VL14D5b: 1 D I V I T Q S H K F M S T S V G D R V S GAC ATT GTG ATC ACA CAG TCT CAC AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC 61 <----------------- CDR1 ------------------> I T C K A S Q D V S T T V A W Y Q Q K P ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT GTG AGT ACT ACT GTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 121 <---------- CDR2 ---------> G Q S P K L L I Y S A S Y R Y T G V P D GGG CAA TCT CCT AAA CTA CTG ATT TAT TCG GCA TCC TAC CGG TAC ACT GGA GTC CCT GAT 181 R F T G S G S G T D F T F T I S S V Q A CGC TTC ACT GGC AGT GGA TCT GGG ACG GAT TTC ACT TTC ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT 241 <-------------- CDR3 -------------> E D L A V Y Y C Q Q H Y S T P P T F G G GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAA CAT TAT AGT ACT CCT CCC ACG TTC GGA GGG 301 |<---------- kappa constant --------... G T K L E I K R A D A A P T V T S GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA ACA AGC VL14D5c: 1 D I V M T Q S P A S L A V S L G Q R A T GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC 61 <--------------------------- CDR1 ------------------------> I S C R A S E S V D S Y G N S F M H W Y ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC 121 <---------- CDR2 ---------> Q Q K P G Q P P K L L I Y R A S N L E S CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 181 G I P A R F S G S G S R T D F T L T I N GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATT AAT 241 <----------- CDR3 -------| P V E A D D V A T Y Y C Q Q S N E D P H CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCG CAC 301 S D R N R A T N L K R T E M * Q T T L M AGT GAT AGG AAC AGA GCC ACT AAT CTG AAG AGA ACA GAG ATG TGA CAG ACT ACA CTA ATG 361 |<------ kappa constant -----... A D A A P T V S G * C C T N C I GGC TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC A - ОРТ2 - ОРТ1 Рисунок 14. Нуклеотидные последовательности, а также выведенные последовательности аминокислотных остатков ДНК-фрагментов VL14D5b и VL14D5c, полученных на основе гибридомных клеток линии 14D5. Жирным шрифтом отмечены области, кодирующие гипервариабельные участки. Серым фоном выделены области, соответствующие участкам гибридизации праймеров mouse_kappa_dir и mouse_kappa_const_rev. В последовательности VL14D5c нуклеотиды 1 – 296 идентичны зародышевому гену IGKV3-5, кодирующему аминокислотные остатки вариабельного домена открытой рамкой трансляции 1 (ОРТ1). Вместо J-сегмента следует вставка (нуклеотиды 297 – 360, подчёркнуты), которая во всех трех прямых рамках трансляции содержит терминирующие кодоны. Нуклеотиды 361 – 385 кодируют начало константного домена во второй открытой рамке трансляции (ОРТ2). 75 VH13D6: 1 E V K L E E S G A E L A K P G A S V K M GAG GTA AAG CTG GAG GAG TCT GGG GCT GAA CTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG 61 <------ CDR1 -----> S C K A S G Y T F I D Y W I H W V K Q R TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ATT GAC TAC TGG ATA CAC TGG GTG AAA CAG AGG 121 <-------------------- CDR2 ---------------P G Q G L E W I G Y I N P T T D Y T Y Y CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT ACC ACT GAT TAT ACT TAT TAC 181 ----------------------> N Q T F K D K A T L T A D K S S S T A Y AAT CAG ACG TTC AAG GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAG TCC TCC AGC ACA GCC TAC 241 <-----M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A R E G ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAA GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GAG GGA 301 --- CDR3 ---------> |<-------------F A L D Y W G Q G T T L T V S S A K T T TTC GCC CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA 361 ---- IgG1 constant ---------... P P S V Y R S S CCC CCA TCT GTC TAT AGA TCT TCC VL13D6a: 1 D I V M T Q S P S S L S A S L G D R V T GAT ATT GTG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC 61 <----------------- CDR1 ------------------> I S C R A S Q D I S N Y L N W Y Q Q K P ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC ATT AGC AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 121 <---------- CDR2 ---------> D G T V K L L I F Y T S K L H S G V P S GAT GGA ACT GTT AAA CTC CTG ATC TTC TAC ACA TCA AAA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 181 R F S G S G S G T D Y S L T I W N L E Q AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT TGG AAC CTG GAG CAA 241 <-------------- CDR3 -------------> E D L A T Y F C Q H G N T L P R T F G G GAA GAT CTT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAT GGT AAT ACG CTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA 301 |<---------- kappa constant ------------... G T K L E V K R A D A A P T V S S F GGC ACC AAG CTG GAA GTC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCA AGC TTC C Рисунок 15. Нуклеотидные последовательности, а также выведенные последовательности аминокислотных остатков ДНК-фрагментов VH13D6 и VL13D6a, полученных на основе гибридомных клеток линии 13D6. Жирным шрифтом отмечены области, кодирующие гипервариабельные участки. Серым фоном выделены области, соответствующие участкам гибридизации праймеров MH1_dir и mouse_IgHG1_const_rev, а также праймеров mouse_kappa_dir и mouse_kappa_const_rev. 76 VH1B1: 1 E V K L Q Q S G A E L A K P G A S V K M GAG GTA AAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG 61 <------ CDR1 -----> S C K A S G Y T F T S Y W M H W V K Q R TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTA AAA CAG AGG 121 <-------------------- CDR2 ---------------P G Q G L E W M G Y I N P S T G Y T E Y CCT GGA CAG GGC CTG GAA TGG ATG GGA TAC ATT AAT CCT AGC ACT GGT TAT ACT GAA TAT 181 ----------------------> N Q R F I D K A T L T A D K S S N T A N AAT CAG AGG TTC ATA GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC AAC 241 <-----M Q L N S L T S E D S A V Y Y C V R E G ATG CAA CTG AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GTG AGA GAG GGA 301 --- CDR3 ---------> |<-------------F A L D F W G Q G T T L T V S S A K T T TTC GCC CTT GAC TTC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA 361 ---- IgG1 constant ---------... P P S V Y R S S CCC CCA TCT GTC TAT AGA TCT TCC VL1B1a: 1 D I V M T Q S P S S L S A S L G D R V T GAT ATT GTG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC 61 <----------------- CDR1 ------------------> I S C R A S Q D I K N Y L N W Y Q Q K P ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC ATT AAA AAT TAT TTG AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA 121 <---------- CDR2 ---------> D G S I K L L I Y Y T S T L Q S G V P S GAT GGA AGT ATT AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA ACA TTA CAG TCA GGA GTC CCA TCA 181 R F S G T G S G T D Y S L T I R N L E Q AGG TTC AGT GGC ACT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT CGC AAC CTG GAA CAA 241 <-------------- CDR3 -------------> E D I A T Y F C Q E G S A L P R T F G G GAA GAT ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA GAG GGT AGT GCG CTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA 301 |<---------- kappa constant ------------... G T K L E I K R A D A A P T V S S F GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCA AGC TTC CC Рисунок 16. Нуклеотидные последовательности, а также выведенные последовательности аминокислотных остатков ДНК-фрагментов VH1B1 и VL1B1a, полученных на основе гибридомных клеток линии 1B1. Жирным шрифтом отмечены области, кодирующие гипервариабельные участки. Серым фоном выделены области, соответствующие участкам гибридизации праймеров MH1_dir и mouse_IgHG1_const_rev, а также праймеров mouse_kappa_dir и mouse_kappa_const_rev. 77 На рисунках 17 и 18 приведено сравнение последовательностей а.к.о. вариабельных доменов мышиных антител 14D5, 1B1 и 13D6, а также некоторых других антител против ВКЭ (Байков И. К. и др., 2012). Для вариабельного домена лёгкой цепи антитела 13D6 приведены две последовательности: VL13D6, опубликованная в GenBank ADA82602.1, на основе которой ранее получено антитело ch13D6 (Levanov L. N. et al., 2010), а также VL13D6a, полученная впервые. Согласно выравниванию (Рисунок 17), VH-последовательности антител 14D5, 1B1 и 13D6 выделяются в одну группу, а VH-последовательности антител 10С2 и 14D2 образуют другую группу. Это хорошо согласуется с данными эпитопного картирования, проведённого для этих антител, а также с их противовирусными свойствами (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). VL-последовательности VL14D5a, VL1B1, VL13D6a и VL14D2 образуют одну группу, VL-последовательности VL14D5b и VL13D6 образуют другую группу (Рисунок 18). Отдельно от них отстоит последовательность VL10C2. Сравнение с последовательностями антител E6B и 4.2 (Jiang W. et al., 1994; Тикунова НВ и др., 1999) не выявило значительной гомологии. VH14D5 VH1B1 VH13D6 VH14D2 VH10C2 VH4.2 VHE6B HCDR1 HCDR2 QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYIFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINP--STGYT [ 60] E.K........................T..S................M.....--..... E.K.EE.....................T.ID..I...................--T.D.. E.K.EE..P..V.......L...S...T..ENTI.....SH.KS..Y..G...--DN.G. E.......P..VE......L...S...T..ENTI.....SH.KS..Y..G...--DN.G. ........P..V...............T..D.VIG.....T........E.Y.--GS.T. ..E.LE..GG.VQ..E.M.L..V...FT.SDA..D..L.S.EK....VAE.RSKSNNHA. VH14D5 VH1B1 VH13D6 VH14D2 VH10C2 VH4.2 VHE6B HCDR2 HCDR3 EYNQRFIDK-ATLTADKSSSTADMQLNSLTSEDSAVYYCVREG----FALDYWGQGTTLT [120] .........-.........N..N....................----....F........ Y...T.K..-............Y...S............A...----............. S...K.KG.GP...V.......Y.E.R............A.WE--ITAT.A......LV. S...K.KG.-....V.......Y.E.R............A.WE--ITAT.A......LV. Y..EK.K..-.........N..Y...S..........F.A.GEDGYYI..........V. S.AESVEGR-F.ISR.D.K.SVYL.M.N.RA..TGI...T.YYGYLYWYF.VL.....V. VH14D5 VH1B1 VH13D6 VH14D2 VH10C2 VH4.2 VHE6B VSS [123] ... ... ... ... ... ... Рисунок 17. Последовательности аминокислотных остатков, составляющих вариабельные домены тяжёлых цепей антител против гликопротеина Е ВКЭ. Жирным шрифтом и рамками выделены гипервариабельные участки. Серым фоном выделены области, соответствующие участкам гибридизации праймеров. 78 VL14D5a VL1B1 VL13D6a VL14D5b VL13D6 VL14D2 VL10C2 VL4.2 VLE6B LCDR1 LCDR2 DIVMTQSPSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNY----LNWYQQKPDGSVKLLIYYTSRLQS [ 60] .............................K..----...........I........T... .............................S..----..........T.....F...K.H. ...I...HKFM.T.V....S.T.K....VSTT----VA......GQ.P.....SA.YRYT ..EL....N...T.V.EG.S.T.K....VSTT----VA......GQ.P.....SA.YRYT .............................S..----..........T.....F...K.H. ..EL....ALM...P.EK..MT.S..SSVSY-----MF......RS.P.SW..L..N.A. ..EL....A.....V.ET...T....GN.H..----.A.....QGK.PQ..V.KAQT.AD ..EL....P..AV...Q.A.......KSLDS.GNSF.H......GQPP.....LA.N.E. VL14D5a VL1B1 VL13D6a VL14D5b VL13D6 VL14D2 VL10C2 VL4.2 VLE6B LCDR3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQEGGTLPR-TFGGGTKLEIKR [113] ........T..........R...............SA...-............ ...................W......L......H.N....-.........V.. ...D..T.......FTF...SVQA..L.V.Y..QHYST.P-............ ...D..T.......FTF..RSVQA..FGS.Y..QHYST.P-............ ...................W......L......H.N....-.........V.. ...A.........S......SM.A..A...Y..Q-WSS.L-...A........ .............Q...K.NS.QP..FGS.Y..HFWST.PW............ .L.A.......R..FT...DPV.AD.A...Y..QNNDD.--...S........ Рисунок 18. Последовательности аминокислотных остатков, составляющих вариабельные домены лёгких цепей антител против гликопротеина Е ВКЭ. Жирным шрифтом и рамками выделены гипервариабельные участки. Серым фоном выделены области, соответствующие участкам гибридизации праймеров. 3.3. Электрофоретический и масс-спектрометрический анализ образца МКА 14D5 Чтобы определить, какие именно лёгкие цепи содержатся в молекулах антитела, секретируемого гибридомой 14D5, провели электрофоретическое разделение образца МКА 14D5 (Рисунок 19) с последующим масс-спектрометрическим анализом легких и тяжёлых цепей отдельно. В результате этого было установлено, что препарат МКА 14D5 содержит молекулы IgG c лёгкими цепями двух типов: light_14D5a и light_14D5b, соответствующими последовательностям VL14D5a и VL14D5b (Рисунок 20). Пиков, соответствующих неполной лёгкой цепи light_14D5c, не было обнаружено в спектре. В приложениях 1, 2 и 3 приведены расчётные массы триптических фрагментов всех трёх цепей. 79 116 кДа 66 кДа тяжелые цепи антитела 45 кДа 35 кДа легкие цепи антитела 25 кДа 18 кДа 1 2 M Рисунок 19. Электрофореграмма МКА 14D5 в 12% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. 1 – МКА 14D5 3 мкг на дорожку; 2 – МКА 14D5 1.5 мкг на дорожку; M – маркер молекулярных масс. Исходя из соотношения высот пиков, отвечающих пептиду LLIYYTSR ([M+H+]=1028,6) цепи light_14D5a и пептиду LLIYSASYR ([M+H+]=1085,6) цепи light_14D5b, можно приблизительно оценить соотношение лёгких цепей light_14D5a и light_14D5b в препарате МКА 14D5 как 1:3. Рисунок 20. MALDI-TOF масс-спектр триптических фрагментов лёгких цепей антитела 14D5, снятый в рефлективном положительном режиме с использованием матрицы DHB. Пики, отмеченные ▲, соответствуют цепи light_14D5a, тогда как пики, отмеченные , соответствуют цепи light_14D5b. Пики, отмеченные соответствуют константному домену каппа-цепей мышиных антител. 80 3.4. Конструирование полноразмерных кассетных рекомбинантных плазмидных антител с ДНК для экспрессии константной частью иммуноглобулинов человека IgG1/каппа Для транзиентной экспрессии полноразмерных антител в клетках млекопитающих в нашей лаборатории ранее использовали плазмиды pCH и pCL, содержащие гены тяжёлой цепи с константной частью IgG1 человека и лёгкой цепи с константной частью каппа-цепей антител человека, соответственно. В частности, с их помощью было получено полноразмерное антитело человека против вируса Эбола (Шингарова Л. Н. и др., 2007). Эти плазмиды сконструированы на основе коммерческого вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen), гены тяжёлой и лёгкой цепей находятся в них под контролем цитомегаловирусного промотора и содержат последовательность сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Обе плазмиды содержат в качестве селективного маркера ген аминогликозид 3’-фосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к генетицину. В данной работе на основе плазмид pCH1 и pCL1 были получены кассетные плазмидные ДНК pCH2 и pCL2, в которых можно заменять V-гены, получая при этом новые антитела с различной специфичностью. Кроме того в плазмиде, кодирующей лёгкую цепь, был заменён ген устойчивости к антибиотику. Это позволяет осуществлять независимый селективный отбор клонов по каждой из плазмид, что необходимо при получении клеточного клона, стабильно секретирующего антитело. На первой стадии в плазмиде pCL1 ген Neo, обеспечивающий устойчивость к генетицину, заменили на ген hygroB, кодирующий гигромицин обеспечивающий устойчивость к гигромицину Б. Для этого Б-киназу и плазмиду pCL1 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NheI и ApaI, после чего фрагмент light1_NA, содержащий ген лёгкой цепи, встроили в гидролизованную теми же эндонуклеазами рестрикции плазмиду pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen), содержащую ген устойчивости к гигромицину Б. В результате была получена плазмида pCL1/hygro, несущая ген устойчивости к гигромицину Б и обеспечивающая продукцию лёгкой цепи полноразмерного антитела человеческого антитела против вируса Эбола (Рисунок 21). Далее в плазмиды pCH1 и pCL1/hygro были введены дополнительные уникальные сайты гидролиза эндонуклеазами рестрикции в 5'- и 3'-концевые области VH- и VLучастков. Сайты были подобраны таким образом, чтобы они редко встречались в VH- и 81 VL-последовательностях антител человека и мыши, а также чтобы их введение минимально изменяло консервативную аминокислотную последовательность N- и Сконцов вариабельных доменов антител. В результате анализа последовательностей вариабельных доменов мышиных и человеческих антител с помощью базы данных Abysis (www.bioinf.org.uk/abysis/) были выбраны сайты эндонуклеаз XhoI и Acc65I (KpnI) для плазмиды pCH1 и сайты эндонуклеаз EcoRV и HindIII для плазмиды pCL1/hygro. Согласно базе данных V-base (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) эти сайты редко встречаются в нуклеотидных последовательностях зародышевых генов вариабельных доменов антител (приложение 4), поэтому их можно использовать в качестве фланкирующих сайтов при встраивании VH- и VL-фрагментов ДНК в экспрессионные плазмиды. Для конструирования кассетного вектора pCL2 на основе плазмиды pCL1/hygro из этой плазмиды предварительно удалили некодирующий участок полилинкера с 1640 п.н. по 1681 п.н., содержащий сайт HindIII, с образованием промежуточной плазмиды pCLm1 (Рисунок 21) (здесь и далее указаны координаты плазмиды pcDNA3.1(+), используемые производителем). Затем удалили участок с 1301 п.н. по 1312 п.н. длиной 12 п.н., кодирующий неестественную для иммуноглобулинов вставку Ala-Leu-Gly-Arg между VL- и CL-доменами, с образованием ДНК-фрагмента light_delta (Рисунок 22). Далее методом мегапраймера (Giebel L. B. et al., 1990; Ke S. H. et al., 1997) последовательно вводили сайты эндонуклеаз рестрикции EcoRV и HindIII, в результате чего получили плазмиду pCLm2, содержащую сайты EcoRV и HindIII в положениях 977 п.н. и 1283 п.н. (Рисунок 22). Полученную плазмиду pCLm2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRV и HindIII и объединяли в реакции лигирования с двуцепочечным олигонуклеотидным коннектором, образованном олигонуклеотидами Lconn_dir и Lconn_rev. В результате получили плазмиду pCL2, обеспечивающую удобное клонирование генов, кодирующих VL-домены различных антител (Рисунок 23). 82 pCMV R Amp pCMV T7mod_dir primer NheI signal sequence R Amp VL human kappa constant NheI BamHI HindIII ApaI BGH_rev primer pCL1 pcDNA3.1/Hygro(+) BamHI MCS ApaI NeoR HygroBR NheI, ApaI sig NheI VL NheI, ApaI CL light1_NA ApaI NheI pcDNA3.1_hygro_NA ApaI T4 ДНК-лигаза NheI BamHI HindIII ApaI pCL1/hygro BamHI, HindIII HindIII pCL1_hygro_BH BamHI HygroBR Pfu ДНК-полимераза NheI pCLm1 BamHI ApaI T4 ДНК-лигаза pCL1_hygro_blunt Рисунок 21. Схема последовательного конструирования плазмид pCL1/hygro и pCLm1. Использованы следующие обозначения: pCMV – цитомегаловирусный промотор; VL – участок гена, кодирующий вариабельный домен лёгкой цепи антитела; human kappa constant -- участок, кодирующий константный домен каппа-цепей антител человека; NeoR, HygroBR и AmpR – гены, обусловливающие устойчивость к неомицину, гигромицину Б и ампициллину, соответственно; signal sequence – участок, кодирующий сигнальный пептид цепей иммуноглобулинов. Курсивом указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. 83 ПЦР, праймеры ON1 и BGH_rev NheI CL* ApaI pCLm1 sig BamHI ApaI ПЦР, праймеры T7mod_dir и ON2 VL* NheI Перекрывающаяся ПЦР, праймеры T7mod_dir и BGH_rev ПЦР, праймеры VL_EcoRV_dir и VL_HindIII_rev VL sig EcoRV HindIII NheI VLmod VL CL light_delta ApaI 1. Достраивание 2. ПЦР, праймеры T7mod_dir VL_HindIII_rev sig VL sigVLmod NheI EcoRV HindIII 1. Достраивание 2. ПЦР, праймеры T7mod_dir и BGH_rev NheI, ApaI sig VL CL NheI EcoRV HindIII ApaI light_mod NheI, ApaI sig NheI pCLm1_NA_vector ApaI VL CL NheI EcoRV HindIII ApaI light_mod_NA T4 ДНК-лигаза NheI EcoRV HindIII BamHI ApaI pCLm2 Рисунок 22. Схема конструирования плазмиды pCLm2. Использованы следующие обозначения: VL и CL – участки гена, кодирующие вариабельный и константный домены лёгкой цепи антитела; sig – участок, кодирующий сигнальный пептид цепей иммуноглобулинов. Курсивом указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. 84 NheI EcoRV HindIII BamHI ApaI pCLm2 5’ ATCGTCGACAGCGGCCGCA 3’ Lconn_dir + 5’ AGCTTGCGGCCGCTGTCGACGAT 3’ Lconn_rev 1. Полинуклеотидкиназа T4 + АТФ 2. 95°C, 5 мин 3. Ткомн, 20 мин EcoRV, HindIII EcoRV pCLm2_EH_vector 5’ pATCGTCGACAGCGGCCGCA 3’ 3’ TAGCAGCTGTCGCCGGCGTTCGAp 5’ HindIII Lconn T4 ДНК-лигаза NheI VL-adapter 5’...GGGGATATCGTCGACAGCGGCCGCAAGCTTGAG...3’ 3’...CCCCTATAGCAGCTGTCGCCGGCGTTCGAACTC...5’ EcoRV human kappaAcc65I constant ApaI HindIII XhoI pCL2 Рисунок 23. Схема конструирования плазмиды pCL2. Для конструирования кассетного вектора pCH2 на основе плазмиды pCH1 из этой плазмиды предварительно удалили некодирующий участок с 2346 п.н. по 2497 п.н., содержащий сайт XhoI, с образованием промежуточной плазмиды pCHm1 (Рисунок 24). Затем методом мегапраймера (Giebel L. B. et al., 1990; Ke S. H. et al., 1997) последовательно вводили сайты эндонуклеаз рестрикции XhoI и Acc65I, в результате чего получили промежуточную плазмиду pCHm2, содержащую сайты XhoI и Acc65I в положениях 999 п.н. и 1311 п.н., соответственно. Плазмиду pCHm2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XhoI и Acc65I и объединяли в реакции лигирования с двуцепочечным олигонуклеотидным коннектором Hconn, образованном олигонуклеотидами Hconn_dir и Hconn_rev (Рисунок 24). В результате получили плазмиду pCH2, обеспечивающую удобное клонирование генов, кодирующих VHдомены различных антител (Рисунок 24). 85 pCMV R Amp T7mod_dir primer NheI signal sequence VH IGHG1_dir primer IGHG1_rev primer pCH1 pCH1-lin XhoI human IgG1 constant XhoI XhoI XbaI NeoR XhoI Pfu ДНК-полимераза BGH_rev primer pCH1-lin2 T4 ДНК-лигаза NheI ПЦР, праймеры T7mod_dir и IgHG1_CH3_rev pCHm1 sig VH CH1 CH2 CH3 XbaI NheI h-pA XbaI ПЦР, праймеры VH_dir_XhoI и VH_rev_Acc65I VH XhoI Acc65I VHmod ПЦР, праймеры T7mod_dir и IgHG1_rev sig NheI VH CH1 sigVHCH1 1. Достраивание sig VH 2. ПЦР, праймеры NheI XhoI Acc65I T7mod_dir и sigVHmod VH_rev_Acc65I sig NheI VH XhoI CH1 CH2 Acc65I CH3 XbaI 1. Достраивание 2. ПЦР, праймеры T7mod_dir и IgHG1_CH3_rev hm2a Продолжение схемы Рисунок 24. Схема конструирования плазмиды pCH2. Использованы следующие обозначения: pCMV – цитомегаловирусный промотор; VH – участок гена, кодирующий вариабельный домен тяжёлой цепи антитела; human IgG1 constant – участок, кодирующий константные домены тяжёлых цепей антител человека изотипа IgG1; NeoR и AmpR – гены, обусловливающие устойчивость к неомицину и ампициллину, соответственно; signal sequence – участок, кодирующий сигнальный пептид цепей иммуноглобулинов. Курсивом указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. 86 NheI sig NheI VH CH1 XhoI CH2 pCHm1 CH3 Acc65I XbaI hm2a XbaI NheI, XbaI NheI, XbaI sig VH NheI XhoI CH1 Acc65I CH2 CH3 hm2a_NX XbaI NheI pCHm1_NX_vector XbaI T4 ДНК-лигаза NheI XhoI Acc65I 5’ TCGAGGTCGACAGCGGCCGCG 3’ Hconn_dir pCHm2 + 5’ GTACCGCGGCCGCTGTCGACC 3’ Hconn_rev XbaI 1. Полинуклеотидкиназа T4 + АТФ 2. 95°C, 5 мин 3. Ткомн, 20 мин XhoI, Acc65I 5’ pTCGAGGTCGACAGCGGCCGCG 3’ 3’ CCAGCTGTCGCCGGCGCCATGp 5’ XhoI pCHm2_XA_vector Acc65I Hconn T4 ДНК-лигаза NheI VH-adaptor 5’...CTGCTCGAGGTCGACAGCGGCCGCGGTACCCTG...3’ 3’...GACGAGCTCCAGCTGTCGCCGGCGCCATGGGAC...5’ XhoI pCH2 XbaI Рисунок 24 (продолжение). Схема конструирования плазмиды pCH2 . 87 Acc65I 3.5. Конструирование плазмидных ДНК для экспрессии химерных антител на основе МКА 14D5 Кассетные векторные плазмиды pCH2 и pCL2 были использованы при конструировании плазмид для экспрессии химерных антител против ВКЭ на основе фрагментов ДНК VH14D5, VL14D5a и VL14D5b, которые были получены ранее (п. 3.2.) ДНК-фрагмент VH14D5, кодирующий VH-домен мышиного МКА 14D5, был получен в результате ПЦР с плазмиды pUC19-VH-14D5 с использованием праймеров VH_dir_XhoI и VH_rev_Acc65I. Фрагмент VH14D5 и плазмидная ДНК pCH2 были гидролизованы эндонуклеазами XhoI и Acc65I, и после электрофоретического разделения векторный фрагмент плазмиды был объединен ДНК-лигазой фага Т4 с VH-фрагментом. В результате была получена плазмидная ДНК pCH2-14D5 (Рисунок 25). NheI VH-adaptor NheI VL-adapter human kappa constant ApaI pCH2 pCL2 VH XbaI XhoI VL Acc65I EcoRV HindIII VH14D5 VL14D5a EcoRV, HindIII EcoRV, HindIII XhoI, Acc65I XhoI, Acc65I VL VH XhoI pCH2_XA_vector Acc65I XhoI Acc65I VH14D5_XA EcoRV I EcoRV HindIII pCL2_EH_vector HindIII VL14D5a_EH T4 ДНК-лигаза T4 ДНК-лигаза pCMV pCMV R signal sequence Amp signal sequence AmpR VH14D5 VL14D5a human kappa constant pCH2-14D5 NeoR pCL2-14D5a human IgG1 constant HygroBR Рисунок 25. Схема конструирования плазмид pCH2-14D5 и pCL2-14D5a. Схема получения плазмиды pCL2-14D5b аналогична схеме получения плазмиды pCL2-14D5a 88 ДНК-фрагменты VL14D5a и VL14D5b, кодирующие VL-домены мышиного МКА 14D5, были получены в результате ПЦР с плазмид pUC19-VL-14D5a и pUC19-VL-14D5b с использованием праймеров VL_dir_EcoRV и VL_rev_HindIII. Эти ДНК-фрагменты и плазмидная ДНК pCL2 были гидролизованы эндонуклеазами EcoRV и HindIII, и после электрофоретического разделения векторный фрагмент плазмиды был объединен ДНКлигазой бактериофага Т4 с каждым VL-фрагментом отдельно. В результате были получены плазмидные ДНК pCL2-14D5a и pCL2-14D5b (Рисунок 25). 3.6. Наработка и очистка химерных антител ch14D5a и ch14D5b Антитела ch14D5a и ch14D5b получали в результате транзиентной экспрессии генов лёгкой и тяжёлой цепей антитела в линии эукариотических клеток CHO-K1. Клетки ко-трансфицировали соответственно плазмидами pCH2-14D5 + pCL2-14D5a, а также pCH2-14D5 + pCL2-14D5b с использованием реагента “Lipofectamine 2000” (Life Technologies) согласно методике, рекомендованной производителем. Клетки растили без добавления антибиотиков в 100 мл культуральной среды DMEM F12 advanced (Gibco) с 2% фетальной сыворотка быка с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Life technologies). Через 24 ч после трансфекции культуральную жидкость отобрали и заменили свежей средой, процедуру повторяли через 48, 72, 96, 120 и 144 ч после трансфекции. К собранной культуральной жидкости объемом около 600 мл добавляли раствор азида натрия в качестве консерванта до конечной концентрации 0,02%. На первой стадии культуральную жидкость осветляли центрифугированием и фильтрацией, после чего выделяли антитело хроматографией на белок А-сефарозе по стандартной методике (Antibody purification handbook, 2001) (Рисунок 26). 89 Оптическая плотность, mAU pH 5,0 pH 3,0 Элюция химерного антитела Элюция антител быка Время, мин Рисунок 26. Очистка антитела ch14D5a аффинной хроматографией на белок А-сефарозе CL-4B. Поскольку кроме целевого химерного антитела культуральная жидкость также содержала иммуноглобулины из фетальной сыворотки быка, стандартная методика была модифицирована. При отработке методики хроматографического выделения антитела элюировали ступенчатым градиентом буферных растворов с pH от 6,0 до 3,0, после чего элюаты концентрировали и анализировали электрофоретически и вестерн-блот анализом (данные не приводятся). Было установлено, что иммуноглобулины быка полностью элюируются 0,1М цитратным буфером с pH 5,0, а целевое антитело смывается аналогичным буфером с pH 3,0. Поэтому к стандартной методике была добавлена стадия элюции иммуноглобулинов быка 0,1М цитратным буфером с pH 5,0. После аффинной хроматографии раствор химерного антитела нейтрализовали и осуществляли дополнительную очистку от клеточных белков и ДНК анионообменной хроматографией в проточном режиме (Рисунок 27). Химерное антитело ch14D5b было очищено аналогично. Выход обоих антител составил 0,4 – 0,6 мг с литра полученной культуральной жидкости. Электрофорезом в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях было показано, что исследованные образцы антител ch14D5a и ch14D5b содержат белки с высокой молекулярной массой и не содержат отдельно лёгких или тяжёлых цепей (Рисунок 28). 90 Оптическая плотность, mAU Элюция химерного антитела Время, мин Рисунок 27. Хроматограмма, иллюстрирующая очистку антитела ch14D5a ионообменной хроматографией в проточном режиме на ДЭАЭ-сефарозе. В восстанавливающих условиях антитела разделяются на лёгкие и тяжёлые цепи с молекулярной массой Электрофоретическая 25 кДа подвижность соответствует подвижности более и 50 кДа, антител, не соответственно обработанных (Рисунок 28). дитиотреитолом, 250 кДа. Этот результат был получен с использованием 10% и 12% разделяющих полиакриламидных гелей и двух наборов маркеров молекулярных масс: “PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250kDa” (Thermo scientific #26619) и “Precision Plus Protein Dual Color Standards ” (Bio-Rad #1610374) (данные не представлены). нативные химерные антитела 250 кДа 150 кДа 50 кДа тяжелые цепи антител 25 кДа легкие цепи антител M 1 2 3 4 Рисунок 28. Электрофореграмма очищенного антитела ch14D5a в 12% ДСН-ПААГ в восстанавливающих (дорожка 1) и невосстанавливающих (дорожка 3) условиях, а также очищенного антитела ch14D5b в восстанавливающих (дорожка 2) и невосстанавливающих (дорожка 4) условиях. M – белковый маркер молекулярных масс. 91 Поскольку моноклональные антитела склонны к агрегации, в том числе с образованием ковалентных ди- и олигомеров (Remmele R. L. et al., 2006; Deperalta G. et al., 2013), мы предположили, что антитела ch14D5a и ch14D5b образуются преимущественно в форме ковалентных димеров с молекулярной массой около 300 кДа. Для препаратов терапевтических антител наличие незначительного количества агрегатов, не более 2%, считается нормальным, однако наличие существенного количества агрегатов в препарате терапевтических антител нежелательно, поскольку они потенциально иммуногенны, и их эффективность может быть ниже по сравнению с мономером (Hermeling S. et al., 2004; Deperalta G. et al., 2013). Поэтому предположение о димеризации антител ch14D5a и ch14D5b было дополнительно проверено высокоэффективной гель-фильтрацией (Рисунок 29). Было установлено, что время выхода основного пика антител соответствует приблизительно 100 кДа, согласно калибровочной хроматограмме, что хорошо согласуется с опубликованными хроматографическими профилями препаратов моноклональных антител (Remmele R. L. et al., 2006; Deperalta G. et al., 2013). Кроме того, на хроматограмме есть два дополнительных небольших пика слева от основного (объём элюции Ve = 5,2 и 6,1 мл), которые, по-видимому, соответствуют тримерной и димерной форм антитела (Рисунок 29 Б). Таким образом, полученные препараты химерных антител преимущественно содержат мономерную форму с молекулярной массой около 150 кДа. Для подтверждения того, что полученные химерные антитела содержат константные части иммуноглобулинов человека класса IgG1, был проведён вестерн-блот анализ образцов антител ch14D5a и ch14D5b с использованием моноклонального иммуноконъюгата против Fc-фрагмента антител IgG1 человека и поликлонального иммуноконъюгата против антител человека. В качестве отрицательного контроля использовали мышиное МКА 14D5. Анализ подтвердил принадлежность константных участков химерных антител к человеческим иммуноглобулинам (Рисунок 30). 92 A) ch14D5a (образец 1) ch14D5a (образец 2) ch14D5b (образец 1) ch14D5b (образец 2) Б) ch14D5a (образец 1) ch14D5a (образец 2) ch14D5b (образец 1) ch14D5b (образец 2) В) Кональбумин, 75кДа Альдолаза, 158 кДа Овальбумин, 44кДа Ферритин, 440 кДа Тиреоглобулин, 669 кДа ch14D5a (образец 2) Рисунок 29. Хроматографический анализ образцов антител ch14D5a и ch14D5b высокоэффективной гель-фильтрацией. А) и Б) хроматограммы образцов в двух масштабах; В) хроматограмма антитела ch14D5a вместе с хроматограммой калибровочных белков. 93 150 кДа тяжелые цепи антител 55 кДа 25 кДа легкие цепи антител M 1 2 3 4 Рисунок 30. Вестерн-блот анализ антител ch14D5a и ch14D5b, разделённых электрофорезом в восстанавливающих условиях. Химерные антитела ch14D5a (дорожка 1) и ch14D5b (дорожка 3), проявленные иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 человека (Sigma #A2064); химерные антитела ch14D5a (дорожка 2) и ch14D5b (дорожка 4), проявленные иммуноконъюгатом поликлональных антител козы против антител IgG человека (Sigma #A1543). 3.7. Масс-спектрометрический анализ химерных антител ch14D5a и ch14D5b. Проверка наличия гликозилирования у полученных антител. Молекулярная масса антитела ch14D5a, оцененная электрофоретически и высокоэффективной гель-фильтрацией, была определена также масс-спектрометрически (Рисунок 31). Полученное значение 148097,2 хорошо согласуется с расчётным (Таблица 4), вычисленным для молекул антител с отщеплёнными лидерными пептидами и не подвергнутых каким-либо модификациям кроме гликозилирования. Структуру антител ch14D5a и ch14D5b дополнительно подтверждали массспектрометрическим анализом продуктов гидролиза антител трипсином (Рисунок 32, 33). Расчетные массы фрагментов приведены в приложениях 5, 6 и 7. Спектр лёгкой цепи антитела ch14D5a содержит пик 1028,6, соответствующий пептиду LLIYYTSR, а спектр лёгкой цепи антитела ch14D5b содержит пик 1085,6, соответствующий пептиду LLIYSASYR. Покрытие составило около 80% для антитела ch14D5a и около 60% для антитела ch14D5b. 94 Таблица 4. Расчётные средние молекулярные массы антител ch14D5a и ch14D5b, а также значения изоэлектрической точки pI ch14D5a ch14D5b Не гликозилированы обе H- 144952,8 145003,0 цепи (N+N) pI = 7,30 pI = 7,67 Гликозилирование G0F+N 146398,2 146448,4 Гликозилирование G1F+N 146560,3 146610,5 Гликозилирование G2F+N 146722,4 146772,6 Гликозилирование G0F+G0F 147843,6 147893,8 Гликозилирование G1F+G1F 148167,8 148218,0 Гликозилирование G2F+G2F 148492,0 148542,2 Примечание: значения вычислены на основе аминокислотных последовательностей антител с помощью программы “Compute pI/Mw tool” центра ExPASy (URL: http://web.expasy.org/compute_pi/ (дата обращения: 31.07.2015)). Рисунок 31. MALDI-TOF масс-спектр антитела ch14D5a в линейной положительном режиме с использованием синапиновой кислоты в качестве матрицы. Базовая линия скорректирована. Мажорные пики соответствуют однозарядному и двузарядному ионам. 95 А) ▲ Б) ▲ ▲ ▲ ▲▲ Рисунок 32. MALDI-TOF масс-спектр триптических гидролизатов тяжёлой цепи антитела ch14D5a (А) и лёгкой цепи антитела ch14D5a (Б) в положительном режиме с использованием DHB-матрицы. Пики, отмеченные ▲ соответствуют вариабельному домену VL14D5a. Пики, отмеченные соответствуют константному домену легких цепей каппа-типа антител человека. Отмеченные пики соответствуют вариабельному домену VH14D5, отмеченные пики соответствуют константному домену антител IgG1 человека. 96 А) Relative intensity (%) Б) Рисунок 33. MALDI-TOF масс-спектр триптических гидролизатов тяжёлой цепи антитела ch14D5b (А) и лёгкой цепи антитела ch14D5b (Б) в положительном режиме с использованием DHB-матрицы. Отмеченные пики соответствуют вариабельному домену VL14D5b, отмеченные пики соответствуют константному домену легких цепей каппа-типа антител человека. Отмеченные пики соответствуют вариабельному домену VH14D5, отмеченные пики соответствуют константному домену антител IgG1 человека. Кроме того было показано, что N-концы тяжёлых и легких цепей антител ch14D5a и ch14D5b не содержат лидерных пептидов, что подтверждается наличием в спектрах пиков 1926,05, 1863,91 и 1058,53 (Рисунок 34). Отсутствие лидерных пептидов на Nконцах цепей свидетельствует о правильном процессинге полученных антител. Также показано, что дезаминирование N-концевых остатков глутамата тяжёлых цепей, одна из распространённых модификаций иммуноглобулинов, хранения, отсутствует. 97 возникающая в процессе А) MAWVWTLLFLMAAAQSAQAEVQLLESGAELAKPGASVK… 1926,05 4016,10 Б) MKSQTQVFVFLLLCVSGAHGDIVMTQSPSSLSASLGDR… 1863,91 3750,88 В) MKSQTQVFVFLLLCVSGAHGDIVMTQSHK… 1058,53 2945,50 Рисунок 34. Пептиды, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином N-концевого участка А) тяжёлой цепи антител ch14D5a и ch14D5b; Б) лёгкой цепи антитела ch14D5a; В) лёгкой цепи антитела ch14D5b. Серым цветом обозначен соответствующий лидерный пептид. Приведены моноизотопные массы. Поскольку терапевтические свойства антител существенно зависят от типа и степени гликозилирования (Jefferis R. et al., 2009; Abès R. et al., 2010), для антител ch14D5a и ch14D5b был изучен профиль гликозилирования. Для этого антитела дегликозилировали N-гликозидазой F, после чего электрофоретически разделяли на тяжёлые и легкие цепи (Рисунок 35). Подвижность лёгких цепей при этом оставалась на уровне контроля, а подвижность тяжёлых цепей увеличивалась по сравнению с контролем. Этот результат свидетельствует о том, что обе тяжёлых цепи антитела Nгликозилированы. Легкие и тяжёлые цепи дегликозилированного антитела гидролизовали поотдельности трипсином с последующим масс-спектрометрическим анализом, полученные спектры сравнили со спектрами лёгкой и тяжёлой цепей интактного антитела ch14D5a. В спектрах лёгких цепей не было выявлено сдвигов и других существенных отличий, поэтому можно считать, что N-гликозилирование лёгких цепей отсутствует, что нормально для подавляющего большинства антител. 98 116 кДа 66 кДа тяжелые цепи антитела 45 кДа 35 кДа N-гликозидаза F легкие цепи антитела 25 кДа 18 кДа 14 кДа 1 2 3 M Рисунок 35. 12% полиакриламидный гель-электрофорез в восстанавливающих условиях дегликозилированного антитела ch14D5a (дорожка 2), антитела ch14D5a, выдержанного в реакционном буфере, но без добавления фермента (дорожка 1) и интактного антитела ch14D5a (дорожка 3). M – белковый маркер молекулярных масс. В спектрах тяжёлых цепей было обнаружено несколько пиков, для которых отношение массы к заряду m/z изменилось при дегликозилировании (Рисунок 36, Таблица 5). В частности, масс-спектр триптических фрагментов тяжёлой цепи не дегликозилированного антитела ch14D5a не содержал пика 1189,51, соответствующего пептиду EEQYNSTYR, а также пиков 1671,81 и 2978,50, соответствующих пептидам TKPREEQYNSTYR и EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK, которые могли образоваться при неполном гидролизе белка трипсином (Рисунок 37). В аналогичном спектре дегликозилированного антитела присутствовал пик 1190,50, который соответствует пептиду EEQYDSTYR (при дегликозилировании остаток аспарагина превращается в остаток аспартата Asn → Asp (Plummer T. H. et al., 1984)). Это наблюдение подтверждает то, что обе тяжёлых цепи антитела гликозилированы. Чтобы установить тип гликозилирования, были проанализированы значения сдвигов в спектрах, которые составили 1216,42, 1444,56, 1606,64 и 1768,72. Значения сдвига массы не несут полной информации о структуре гликозидных остатков, однако полученные данные полностью согласуются с установленными ранее значениями для 99 гликозилированных антител, полученных в культурах клеток CHO (Routier F. H., 1997; van Berkel P. H. et al., 2009). При исследовании профиля гликозилирования антитела ch14D5b были получены аналогичные результаты (данные не приводятся). Полученные результаты подтверждают, что антитела ch14D5a и ch14D5b гликозилированы по обеим тяжёлым цепям, при этом гликозилированный а.к.о. расположен в пептиде EEQYNSTYR и с высокой долей вероятности соответствует остатку Asn297, который консервативно гликозилирован в иммуноглобулинах IgG1 человека (Raju T. S., 2003; Shade K. C. et al., 2013). Установлено, что препарат антитела ch14D5a содержит несколько вариантов, отличающихся размером углеводных остатков, которые, по-видимому, соответствуют углеводным остаткам антител, секретируемых клетками CHO (Routier F. H., 1997; Raju T. S., 2003; Jefferis R., 2009). Таблица 5. Экспериментально установленные значения m/z в спектрах триптических фрагментов тяжёлых цепей, полученных из интактного антитела ch14D5a, а также инкубированных в реакционном буфере с добавлением N-гликозидазы F и без неё. Пептид Моноизотопная масса [M+H]+ (m/z при z=1) ch14D5a интактный ch14D5a инкубирова н в буфере ch14D5a обработан Nгликозидазой F EEQYNSTYR 1189,51 – – – EEQYDSTYR 1190,52 – – + TKPREEQYNSTYR 1671,81 – – – TKPREEQYDSTYR 1672,79 – – + EEQYN(G0F)STYR 2634,07 + + – EEQYN(G1F)STYR 2796,15 + + – EEQYN(G2F)STYR 2958,23 + + – EEQYN(MAN5)STYR 2405,93 + + – TKPREEQYN(G0F)STYR 3116,44 + + – TKPREEQYN(G1F)STYR 3278,52 + + – 100 1190.52• 1672.79 • 2405.93 • • 2634.07 2796.15 • 2958.23 • 3116.44 • 3278.52 • Рисунок 36. Сравнение масс-спектров триптических фрагментов тяжёлой цепи антитела ch14D5a до и после дегликозилирования. Верхние половины каждого фрагмента содержат спектры, соответствующие интактному антителу (оранжевый) и антителу, инкубированному в буфере без добавления N-гликозидазы (синий). Нижние половины – дегликозилированному антителу (зелёный). Спектры получены в положительном линейном режиме. 101 Asn297 …TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK… 1189,51 1671,81 2978,50 Рисунок 37. Пептиды, образующиеся при полном и неполном гидролизе трипсином негликозилированной тяжёлой цепи антител ch14D5a и ch14D5b, а также их моноизотопные массы. 3.8. Определение иммунохимических свойств антител ch14D5a и ch14D5b Сродство антител ch14D5a и ch14D5b к белку Е ВКЭ оценили методом твёрдофазного ИФА. Комплексы антител с белком Е выявляли иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 человека (Sigma). Предварительно было проверено и показано, что конъюгат проявляет одинаковую чувствительность к антителам ch14D5a и ch14D5b (Рисунок 38). Анализ связывания антител ch14D5a и ch14D5b с белком Е ВКЭ показал, что сродство антитела ch14D5a к белку Е ВКЭ (около 10-10 М) значительно выше, чем сродство антитела ch14D5b к этому же белку (около 10-7 М). Кроме того, сродство антитела ch14D5a к белку Е ВКЭ Оптическая плотность оказалось выше, чем сродство исходного МКА 14D5 (около 10-9 М) (Рисунок 39). Рисунок 38. Изучение чувствительности иммуноконъюгата моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 человека (Sigma #A2064) к антителам ch14D5a и ch14D5b в ИФА. 102 Оптическая плотность ch14D5a Оптическая плотность Концентрация антитела, М ch14D5b Оптическая плотность Концентрация антитела, М МКА 14D5 Концентрация антитела, М Рисунок 39. Оценка связывания химерных антител ch14D5a и ch14D5b, а также МКА 14D5 с белком Е ВКЭ методом ИФА. Константы аффинности химерных антител ch14D5a и ch14D5b, а также МКА 14D5 по отношению к белку Е ВКЭ были определены на оптическом биосенсоре ProteOn XPR 36 (Bio-Rad), основанном на явлении поверхностного плазмонного резонанса (Рисунок 40). Для химерных антител ch14D5a и ch14D5b значения констант скорости ассоциации и диссоциации, а также равновесной константы аффинности были вычислены с использованием модели односайтового связывания (Таблица 6). Сродство антитела ch14D5a к белку Е ВКЭ (2,6 × 1010 M-1) оказалось на три порядка выше по 103 сравнению со сродством антитела ch14D5b к тому же белку (1,0 × 107 М-1), что вызвано разницей в легких цепях. С помощью простой модели односайтового связывания не удалось аппроксимировать данные связывания МКА 14D5, содержащего различные лёгкие цепи, с белком Е. Однако использование модели гетерогенного аналита позволило определить параметры взаимодействия (Таблица 6). МКА 14D5 показало промежуточную аффинность, что может объясняться присутствием в образце высоко- средне- и низкоаффинных молекул антитела, имеющих соответственно две цепи light_14D5a либо по одной цепи light_14D5a и light_14D5b либо две цепи light_14D5b. Сигнал, RU A) Время, сек Сигнал, RU Б) Время, сек Рисунок 40. Связывание антител ch14D5a (А) и МКА 14D5 (Б) в концентрациях 3,12, 6,25, 12,5, 25 и 50 нМ с рекомбинантным белком Е, иммобилизованным на поверхность чипа GLC (Bio-Rad). Пунктиром показаны результаты общего кинетического анализа данных с использованием модели односайтового связывания (А) и модели односайтового связывания с гетерогенным аналитом (Б). 104 Поскольку антитело ch14D5a проявило значительно большее сродство к рекомбинантному белку Е по сравнению с антителом ch14D5b, дальнейшие эксперименты по изучению противовирусных свойств проводили только с антителом ch14D5a. Таблица 6. Кинетические параметры и константы аффинности для взаимодействия антител с рекомбинантным белком Е ВКЭ. Антитело Константа скорости диссоциации kd, (s–1) Константа скорости ассоциации ka, (M–1 s–1) Равновесная константа ассоциации KA, (M–1) ch14D5a 4,99±0,55* × 10–6 1,30±0,01 × 105 2,6±0,6 × 1010 ch14D5b 2,11±0,03 × 10–3 2,10±0,01 × 104 1,0±0,1 × 107 МКА 14D5** 1,24±0,05 × 10–4 3,21±0,06 × 10–3 1,05±0,01 × 104 1,57±0,01 × 104 8,5±0,1 × 107 4,9±0,1 × 106 * Среднее ± стандартная ошибка среднего; ** Представлены данные для высоко- и низкоаффинных антигенсвязывающих сайтов МКА 14D5. 3.9. Нейтрализация инфекционности ВКЭ антителом ch14D5а и МКА 14D5 in vitro Нейтрализующая активность последовательных разведений антитела ch14D5a и МКА 14D5 по отношению к ВКЭ, штамм 205, была определена в реакции ингибирования фокусообразования на культуре клеток Vero E6 (Рисунок 41). Оба антитела оказались способны нейтрализовать ВКЭ, при этом индекс нейтрализации IC50 при 50% ингибировании инфекционности вируса для антитела ch14D5a и МКА 14D5 составил 0,043±0,028 мкг/мл и 0,50±0,14 мкг/мл соответственно. 105 IC50 (ch14D5a) IC50 (МКА 14D5) Рисунок 41. Пробит-анализ результатов экспериментов по изучению нейтрализующей активности антител ch14D5a и МКА 14D5 in vitro. Указаны границы 95% доверительных интервалов. 3.10. Протективная активность антитела ch14D5a против ВКЭ in vivo Для определения протективных свойств химерного антитела ch14D5 были использованы мыши линии BALB/c массой 10 грамм. Животным вводили 240 ЛД50 вируса клещевого энцефалита штамм «Абсеттаров», а препараты антител вводили через 24 ч после заражения. Параллельно с антителом ch14D5a были протестированы МКА 14D5 и иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита с титром 1:160 (НПО «Микроген»). Согласно результатам эксперимента (Рисунок 42), химерное антитело ch14D5 продемонстрировало более высокую протективную активность по сравнению с другими препаратами антител. Оно обеспечило 100% уровень протекции в дозировках 80 мкг/мышь и 10 мкг/мышь, в то время как МКА 14D5 обеспечило 70% уровень протекции лишь в дозировке 80 мкг/мышь и не обеспечило защиту мышей будучи использованным в дозировке 10 мкг/мышь. Кроме того, протективная активность антитела ch14D5a оказалась выше по сравнению с активностью иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита, который используется для профилактики и лечения ВКЭ. 106 ch14D5a 10 мкг и 80 мкг МКА 14D5 80 мкг МКА 14D5 10 мкг Рисунок 42. Протективная активность антитела ch14D5a и МКА 14D5, а также сывороточного иммуноглобулина человека против ВКЭ in vivo. Мышам вводили указанные количества антител внутривенно через 24 ч после инфицирования 240 ЛД50 ВКЭ. * p=0,067 (логранговый критерий). Введение мышам антитела ch14D5a в дозировке 0,5 мкг/мышь не защищало животных от летальных доз ВКЭ, но и не уменьшало среднюю продолжительность жизни мышей. Средняя продолжительность жизни при введении антитела ch14D5a в дозировке 0,5 мкг/мышь составила 8,3±1,0 дней по сравнению с 7,7±0,7 дней для нелеченых животных, достоверного различия не обнаружено (p = 0,095 согласно логранговому критерию) (Рисунок 42). Это свидетельствует об отсутствии антителозависимого усиления инфекции при введении субнейтрализующих доз антитела ch14D5a. 107 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В настоящее время создан ряд рекомбинантных антител для специфической терапии и профилактики различных вирусных инфекций (Reichert J. M., 2007; Berry J. D. et al., 2011). Разрабатываются такие антитела и для применения при флавивирусных инфекциях, вызванных вирусом западного Нила (Oliphant T. et al., 2005; Morrey J. D. et al., 2007; Beigel J. H. et al., 2010), вируса лихорадки Денге, тип 2 (Sukupolvi-Petty S. et al., 2010), вируса желтой лихорадки (Thibodeaux B. A. et al., 2012) и вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (Hunt A. R. et al., 2011). Коммерчески доступные рекомбинантные антитела для экстренной профилактики и лечения клещевого энцефалита пока отсутствуют, и разработка таких антител, получаемых в культурах клеток в стандартных условиях, является актуальной задачей. Ранее в ИХБФМ СО РАН (НИБХ СО АН) была получена панель мышиных МКА, специфичных к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ (Матвеев Л. Э. и др., 1989). Было показано, что некоторые из этих антител способны ингибировать инфекционность ВКЭ in vitro (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). Мы оценили протективную активность нескольких наиболее перспективных МКА в экспериментах in vivo с использованием мышиной модели ВКЭ. МКА 14D5 продемонстрировало наиболее высокую способность защищать мышей от летальной инфекции ВКЭ, поэтому его вариабельные домены мы использовали для конструирования химерного антитела. При клонировании и секвенировании VH- и VL-генов МКА 14D5 оказалось, что гибридома 14D5 продуцирует две разные легкие цепи light_14D5a и light_14D5b с вариабельными доменами VL14D5a и VL14D5b, принадлежащими к семействам IGKV10 и IGKV6 соответственно. Соотношение этих цепей в очищенном препарате МКА 14D5, оцененное по масс-спектрам, составило приблизительно 1 : 3. Для мышиных гибридомных линий клеток описаны случаи секреции двух различных лёгких цепей одновременно (Köhler G. et al., 1976; Zack D. J. et al., 1995). Например установлено, что мышиная миелома NS-1 синтезирует внутриклеточно лёгкую цепь каппа-типа, которая после получения гибридомы секретируется в составе молекул антитела вместе с лёгкой цепью, происходящей от исходного спленоцита (Köhler G. et al., 1976). Поиск гомологичных последовательностей показал, что последовательность а.к.о. вариабельного домена последовательностью, цепи light_14D5а образующейся при 108 имеет гомологию трансляции около 94 зародышевого % с гена IGKV10-96*02, а также с вариабельными доменами лёгких цепей антител, основанных на этом гене. Однако не было выявлено значительной гомологии ни с лёгкими цепями других антител против ВКЭ, ни с легкими цепями, синтезируемыми мышиными миеломами. Для последовательности а.к.о. вариабельного домена цепи light_14D5b было обнаружено, что она практически идентична вариабельному домену лёгкой цепи мышиной миеломной линией клеток MPC 11 (Smith G. P., 1978; Zakut R. et al., 1980). (Рисунок 43). LCDR1 MPC_11 DIVMTQFAGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTTVAWYQQKPGQSPKLLI [ 60] VL14D5b ------------...I............................................ VL13D6 ------------..EL...PNSL.....EG.............................. LCDR2 LCDR3 MPC_11 YSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPPTFGGGTKLEIKR [120] VL14D5b ............................................................ VL13D6 ...........................R......FGS....................... Рисунок 43. Выравнивание последовательности а.к.о. VL-участков легкой цепи миеломы MPC 11 и легкой цепи light_14D5b, а также последовательности VL13D6 (GenBank: ADA82602.1). Серым отмечена нетипичная для антител последовательность, расположенная между лидерной областью и последовательностью вариабельного домена (Smith G. P., 1978). Легкие цепи, высоко гомологичные или идентичные секретируемой лёгкой цепи миеломы MPC 11, были обнаружены также в антителах против А-антигена группы крови (Chen H. T. et al., 1987), против ракового Tn-антигена (Yuasa N. et al., 2012), против комплекса CD4-gp120 ВИЧ-1 (GenBank: CAQ16368.1), а также в МКА 13D6 против ВКЭ (Levanov L. N. et al., 2010; GenBank: ADA82602.1). Анализ мРНК гибридом 1B1, 13D6, 10C2 и 14D2, секретирующих антитела против ВКЭ (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993), а также масс-спектрометрический анализ образцов секретируемых ими антител показали, что все эти клетки синтезируют несколько типов мРНК и секретируют два типа лёгких цепей в составе антител. При этом для каждой гибридомы один из кДНК-фрагментов был идентичен VL14D5b (данные не опубликованы). Таким образом, на основании результатов сравнения полученных последовательностей VL14D5a и VL14D5b с известными последовательностями мышиных антител и антител, секретируемых миеломами, не удалось определить, какая из цепей light_14D5a или light_14D5b вносит больший вклад в сродство МКА 14D5 к гликопротеину Е ВКЭ. 109 С использованием генов, кодирующих VH14D5, VL14D5a и VL14D5b доменов мышиного МКА 14D5, и CH- и CL-генов иммуноглобулина человека класса IgG1/kappa, мы сконструировали плазмидные ДНК для получения двух химерных антитела – ch14D5a и ch14D5b. Полагают, что основной вклад в сродство антител вносит тяжёлая цепь, особенно её третий гипервариабельный участок CDR3, однако в случае антител ch14D5a и ch14D5b вклад легкой цепи в их аффинность оказался существенным, поскольку константы аффинности этих антител отличались более, чем на три порядка – 2,6 • 1010 М-1 и 1,0 • 107 М-1, соответственно. Одним из результатов работы стало создание кассетных векторных плазмид pCH2 и pCL2 для удобного клонирования последовательностей вариабельных доменов с целью получения полноразмерных рекомбинантных антител. С помощью этих кассетных плазмид наряду с антителами против ВКЭ в лаборатории получены полноразмерные человеческие антитела против ортопоксвирусов (Байков И. К. и др., 2013; Khlusevich Y. A. et al., 2014), ДНК-гидролизующие полноразмерные антитела (Morozova V. V. et al., 2013), а также антитела против интерлейкина-18 (данные не опубликованы). Антитело ch14D5a обладало большей активностью по сравнению с химерным антителом ch13D6, сконструированным ранее (Levanov L. N. et al., 2010). Сродство к белку Е ВКЭ для ch14D5a было на два порядка выше, чем для ch13D6. В экспериментах in vitro ch14D5a также ингибировало инфекционность ВКЭ значительно эффективнее, чем ch13D6 (IC50 для ch14D5a – 0,04 мкг/мл, а для ch13D6 – 4,5 мкг/мл). Кроме того, антитело ch14D5а в дозировке 80 мкг/мышь и 10 мкг/мышь обеспечивало 100% выживаемость мышей, инфицированных 240 ЛД50 ВКЭ, тогда как протективная активность для ch13D6 не была обнаружена. Следует отметить, что антитело ch14D5a продемонстрировало более высокие протективные свойства, чем исходное МКА 14D5. Антитело ch14D5a ингибировало инфекционность ВКЭ более чем в 10 раз эффективнее, чем МКА 14D5 в реакции ингибирования фокусообразования. Вероятно, более высокая эффективность ch14D5a по сравнению с МКА 14D5 объясняется тем, что гибридомная линия клеток 14D5 синтезирует два вида лёгких цепей – light_14D5a и light_14D5b (La и Lb). Предполагая, что характер объединения лёгких цепей с тяжелыми является случайным, можно ожидать наличие иммуноглобулиновых молекул вида LaHHLa (6,25%), LaHHLb (37,5%) и 110 LbHHLb (56,25%) в препарате МКА 14D5, в то время как препарат ch14D5a содержит только высокоаффинное антитело. Сравнение последовательностей а.к.о. вариабельных доменов антител против ВКЭ показало (рисунки 17, 18), что вариабельный домен VL13D6a, кодирующая последовательность которого была получена при ре-секвенировании иммуноглобулиновых мРНК гибридомы 13D6, гомологичен вариабельному домену VL14D5a. В то же время, последовательность а.к.о. вариабельного домена VL13D6 (Levanov L. N. et al., 2010б GenBank ADA82602.1) гомологична последовательности а.к.о. вариабельного домена VL14D5b. Поскольку последовательности VH-доменов антител 14D5 и 13D6 сходны, и комбинация VH14D5+VL14D5a обладает большим сродством к гликопротеину Е ВКЭ по сравнению с VH14D5+VL14D5b, то можно ожидать, что комбинация VH13D6+VL13D6a оказалась бы более активной по сравнению с VH13D6+VL13D6, полученной в работе Levanov L. N. et al., 2010. Сравнение аминокислотных последовательностей вариабельных доменов антител против ВКЭ (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993) с последовательностями антител E6B и 4.2 (Jiang W. et al., 1994; Тикунова Н. В. и др., 1999) не выявило значительной гомологии. При разработке рекомбинантных терапевтических средств важна степень гуманизации белковых молекул. Для антитела ch14D5a степень гуманизации оценивали следующим образом. Для каждого а.к.о. вариабельных доменов лёгкой и тяжёлой цепей антитела ch14D5 определяли частоту встречаемости данного а.к.о. в данной позиции с помощью базы данных Abysis (URL: http://www.bioinf.org.uk/abysis/ (дата обращения: 31.07.2015)), ограничивая область поиска антителами человека. Если встречаемость составляла менее 3%, то считали, что в этой позиции в антителе ch14D5a расположен а.к.о., нехарактерный для антител человека. Для легкой цепи было обнаружено три таких остатка: VL44 (позиция L44 согласно нумерации Kabat), YL50 и QL80. Для тяжёлой цепи обнаружено 9 нехарактерных остатков: AH12, MH20, KH38, RH40, IH64, KH66, AH67, DH79 и SH87. При длине легкой цепи в 214 а.к.о. и тяжёлой цепи в 446 а.к.о. суммарная длина антитела составит 1320 а.к.о., 24 из которых нехарактерны для данных позиций. Оцененная таким образом степень гуманизации составляет (1320 - 24) / 1320 = 0,982 или 98,2 %. Данная оценка является приблизительной, поскольку не все нехарактерные для антител человека а.к.о. расположены на поверхности белка и могут быть распознаны в 111 качестве антигенных детерминант. Однако преимуществом этого метода является его простота и возможность последовательностей обнаружить серьёзные человеческих антител. отличия от канонических Поскольку экстренная иммунопрофилактика ВКЭ предполагает однократное введение, а лечение ВКЭ – непродолжительный курс введения препарата специфических антител, мы полагаем, что степень гуманизации антитела ch14D5a является достаточной для дальнейшей разработки на его основе препарата для возможного применения на людях. Поскольку биологические функции сильно зависят от структуры и посттрансляционных модификаций антител, антитела ch14D5a и ch14D5b были охарактеризованы с использованием различных методов. В частности было подтверждено, что антитела представляют собой мономеры с молекулярной массой около 150 кДа, которые прошли правильное процессирование, а профиль их Nгликозилирования соответствует профилю гликозилирования антител, полученных в клетках хомячка CHO. Аппарат N-гликозилирования клеток человека и хомячка содержит некоторые различия, что может вызывать вопросы о применимости антител, полученных в клетках CHO, для профилактики и лечения людей. Однако различия эти незначительны и в целом профиль гликозилирования антител, полученных в клетках CHO, очень близок профилю гликозилирования человеческих антител (Routier F. H. et al., 1997; Raju T. S., 2003; Jefferis R., 2005). Например, в клетках хомячка нет N- ацетилглюкозаминилтрансферазы-III, фермента, который способствует присоединению биссекторного остатка N-ацетилглюкозамина к гликозидной части белка, однако биссекторный остаток N-ацетилглюкозамина содержат не более 10% человеческих иммуноглобулинов IgG (Raju T. S. et al., 2000). Кроме того, в иммуноглобулинах IgG человека остатки сиаловой кислоты присоединены к гликозидной части через α2,6связь, тогда как в белках хомячка они присоединены через α2,3-связь (Shah P. et al., 1998). Однако и у человека, и у хомячка сиализированы не более 5% всех иммуноглобулинов IgG (Hamako J. et al., 1993; Raju T. S. et al., 2000). Кроме того установлено, что отсутствие «коровых» (англ. core – ядро) остатков фукозы в гликозидной части антител повышает АЗКЦ таких антител в 50-100 раз (Yamane-Ohnuki N. et al., 2009), однако и у человека, и у хомячка более 95% антител IgG содержат остатки фукозы в этом положении. 112 В настоящее время самый эффективный способ предотвращения инфекции ВКЭ – это вакцинация (Heinz F. X. et al., 2012). Против ВКЭ разработаны достаточно эффективные вакцины, однако степень вакцинации населения России пока что низкая, что приводит к тысячам случаев ВКЭ в год, включая тяжёлые случаи (Mansfield K. L. et al., 2009). Даже в европейских странах с высоким уровнем вакцинации по-прежнему встречаются тяжёлые случаи ВКЭ (Dobler G. et al., 2012). Для лечения таких случаев необходима разработка новых противовирусных лекарственных средств, а также схем лечения. В частности, обсуждаются перспективы использования внутривенных иммуноглобулинов человека (Růžek D. et al., 2013). Применение высоких доз внутривенных иммуноглобулинов в некоторых случаях оказывает положительное воздействие, однако в ряде случаев вызывает побочные эффекты, включая асептический менингит, почечную недостаточность и др. (Růžek D. et al., 2013). С этой точки зрения, высоко протективное антитело против ВКЭ либо коктейль таких антител были бы более предпочтительны для лечения инфекции ВКЭ. Существуют опасения, что введение терапевтических антител, обеспечивающее пассивную иммунизацию, способно вызвать антителозависимое усиление инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE) (Aebi C. et al., 1994; Kluger G. et al., 1995). Полагают, что ADE связан с суб-нейтрализующей концентрацией протективных либо наличием непротективных антител в препарате (Bröker M. et al., 2008; Huisman W. et al., 2009). Ранее ADE был обнаружен при заболеваниях, вызванных вирусом лихорадки Денге (Halstead S. B. et al., 1977). В экспериментах in vitro ADE также наблюдали для вируса японского энцефалита, вируса энцефалита долины Муррея (Bröker M. et al., 2008), ВЗН (Nelson S. et al., 2008) и ВКЭ (Kreil T. R. et al., 1997). Однако в экспериментах in vivo обнаружить усиление инфекции ВКЭ не удалось (Kreil T. R. et al., 1997). В наших экспериментах in vivo ADE также не был обнаружен при введении мышам низких доз ch14D5a, которые не защищали мышей от введения летальных доз ВКЭ, но и не уменьшали среднюю продолжительность жизни мышей (Рисунок 42). Таким образом, созданное и исследованное в данной работе антитело ch14D5a является перспективным кандидатом для создания профилактических и терапевтических препаратов против ВКЭ: оно обладает высоким сродством к антигену, а также высокой противовирусной активностью в экспериментах in vitro и in vivo. В настоящее время идут доклинические испытания антитела ch14D5a, в ходе которых предполагается 113 выяснить эффективность антитела при профилактической и терапевтической схемах введения, фармакокинетические и фармакодинамические параметры, а также выявить наличие либо отсутствие острой и хронической токсичности. Если эти характеристики будут соответствовать требованиям для лекарственных средств, то можно ожидать появления новых препаратов против ВКЭ на основе антитела ch14D5a и его производных. 114 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что гибридома 14D5 продуцирует антитела против ВКЭ с VHдоменами, принадлежащими к семейству IGHV1 антител мыши, и с двумя типами VL-доменов, принадлежащих к семействам IGKV10 и IGKV6. 2. Сконструированы кассетные векторные плазмиды pCH2 и pCL2, позволяющие осуществлять экспрессию генов полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках; на основе этих плазмид сконструированы плазмиды pCH2-14D5, pCL2-14D5a и pCL214D5b, которые несут гены, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи химерных антител ch14D5a и ch14D5b. 3. Получены образцы очищенных химерных антител ch14D5a и ch14D5b, и показано, что их молекулярная масса, число лёгких и тяжёлых цепей, а также степень и тип гликозилирования соответствуют характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках CHO. 4. Определены значения констант аффинности химерных антител ch14D5a и ch14D5b к белку Е ВКЭ, которые составили 2,6•1010 М-1 и 1,0•107 М-1, соответственно, и показано, что химерное антитело ch14D5a в дозировке 1 мг/кг веса мыши обеспечило 100% защиту мышей, предварительно инфицированных 240 ЛД50 ВКЭ. 115 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Baykov I. K., Matveev A. L., Stronin O. V., Ryzhikov A. B., Matveev L. E., Kasakin M. F., Richter V. A., Tikunova N. V. A protective chimeric antibody to tick-borne encephalitis virus // Vaccine. – 2014. – V. 32. – Issue 29. – P. 3589–3594. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.05.012. 2. Байков И. К., Хлусевич Я. А., Матвеев А. Л., Бабкина И. Н., Тикунова Н. В. Конструирование кассетных векторных плазмид для получения полноразмерных рекомбинантных антител // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2013. – Т. 11. – № 3. – С. 56–64. 3. Байков И. К., Матвеев Л. Э., Матвеев А. Л., Тикунова Н. В. Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита // Сибирский медицинский журнал. – 2012. – Т. 111. – № 4. – С. 30–33. 4. Levanov L. N., Matveev L. E., Goncharova E. P., Lebedev L. R., Ryzhikov A. B., Yun T. E., Batanova T. A., Shvalov A. N., Baykov I. K., Shingarova L. N., Kirpichnikov M. P., Tikunova N. V. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. – 2010. – V. 28. – Issue 32. – P. 5265–5271. 5. Патент РФ № 2550252 C1 от 15.11.2013. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLm4/hygro-14D5, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита, и рекомбинантная плазмидная ДНК pCHm2-14D5, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита, химерное антитело, обеспечивающее экстренную профилактику клещевого энцефалита у мышей. Тикунова Н. В., Байков И. К., Матвеев Л. Э., Бабкина И. Н., Матвеев Л. Э., Рихтер В. А. 116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а. к. о. – аминокислотный остаток БСА – бычий сывороточный альбумин ВКЭ – вирус клещевого энцефалита ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН – додецилсульфат натрия ед. акт. – единица активности ИФА – иммуноферментный анализ кДа – килодальтон кДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота, комплементарная матричной РНК МКА – моноклональное антитело мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота ОРТ – открытая рамка трансляции оцАТ, scFv – одноцепочечное антитело ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией ПААГ – полиакриламидный гель п.н. – пара нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота Трис – трис(гидроксиметил)аминометан ФСБР – фосфатно-солевой буферный раствор ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота CDR – гипервариабельный фрагмент антитела FR – каркасный фрагмент вариабельного домена антитела Ig – иммуноглобулин MOPS – 3-[N-морфолино]пропансульфоновая кислота OD – оптическая плотность при длине волны PBS – фосфатно-солевой буферный раствор VH – вариабельный домен тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина VL – вариабельный домен легкой цепи молекулы иммуноглобулина 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Альтшулер Е. П., Серебряная Д. В., Катруха А. Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности // Успехи биологической химии. – 2010. – Т. 50. – С. 203–258. 2. Байков И. К., Хлусевич Я. А., Матвеев А. Л., Бабкина И. Н., Тикунова Н. В. Конструирование кассетных векторных плазмид для получения полноразмерных рекомбинантных антител. // Вестник НГУ. Сер. Биология, клиническая медицина. – 2013. – Т. 11. – Вып. 3. – С. 56–64. 3. Байков И. К., Матвеев Л. Э., Матвеев А. Л., Тикунова Н. В. Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита // Сиб. мед. журнал. – 2012. – Т. 111. – № 4. – С. 30–33. 4. Богачек М. В., Зайцев Б. Н., Секацкий С. К., Протопопова Е. В., Терновой В. А., Иванова А. В., Качко А. В., Иванисенко В. А., Дитлер Г., Локтев В. Б. Xарактеризация С–концевой части гликопротеина E вируса Западного Нила и оценка силы его взаимодействия с αvβ3 интегрином как с предполагаемым клеточным рецептором // Биохимия . – 2010 . – Т. 75 . – № 4 . – С. 571–581. 5. Леванов Л. Н., Матвеев Л. Э., Юн Т. Э., Гончарова Е. П., Лебедев Л. Р., Швалов А. Н., Рыжиков А. Б., Байков И. К., Матвеева В. А., Рихтер В. А., Тикунова Н. В. Нейтрализующее одноцепочечное антитело против вируса клещевого энцефалита // Биоорганическая химия. – 2009. – Т. 35. – С. 524–532. 6. Матвеев Л. Э., Годовиков А. А., Караванов А. С., Плетнев А. Г., Рубин С. Г., Семашко И. Г., Цехановская Н. А., Чумаков М. П., Прессман Е. К. Моноклональные антитела к гликопротеиду вируса клещевого энцефалита: предварительная характеристика // Вопр. вирусол. – 1989. – Т. 34. – № 6. – С. 694– 698. 7. Матвеева B. A., Добрикова Е. Ю., Цехановская H. A., Попова Р. В., Прессман Е. К., Караванов А. С., Матвеев Л. Э. Получение и свойства моноклональных антител к неструктурным белкам вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. – 1998. – Т. 50. – № 3. – С. 134–137. 8. Нетёсова Н. А., Белавин П. А., Малыгин Э. Г., Рукавишников М.Ю. Рекомбинантная плазмидная днк pGSDEI, кодирующая белок E вируса клещевого 118 энцефалита и штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка E вируса клещевого энцефалита. Патент РФ № RU 2136754. Дата публикации: 10.09.1999 9. Пеньевская Н. А., Рудаков Н. В. Эффективность применения препаратов иммсуноглобулина для постэкспозиционной профилактики клещевого энцефалита в России (обзор полувекового опыта) // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. – 2010. – № 1. – С. 53–60. 10. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. Приложение 14. Производство лекарственных средств из крови или плазмы человека. ГОСТ Р 52249 – 2009 . – Введ. 2009–05–10. 11. Протопопова Е. В., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител // Вопр. вирусол. – 1997. – Т. 42. – № 6. – С. 264–268. 12. Протопопова Е. В., Хусаинова А. Д., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. Получение и характеризация антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. – 1996. – № 2. – С. 50–53. 13. Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител //Аcta Naturae. – 2009. – № 3. – С. 6–15. 14. Тикунова Н. В., Николенко Г. Н., Протопопова Е. В. и др. Получение одноцепочечных антител против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. – 1999. – № 1. – C. 12–15. 15. Тимофеев А. В., Кондратьева Я. Ю., Карганова Г. Г., Стефенсон Дж. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. – 2001. – № 1. – С. 22– 24. 16. Шингарова Л. Н., Тикунова Н. В., Юн Т. Э., Чепурнов А. А., Алиев Т. К., Батанова Т. А., Болдырева Е. Ф., Некрасова О. В., Топорова В. А., Панина А. А., Кирпичников М. П., Сандахчиев Л. С. Рекомбинантное полноразмерное антитело человека против вируса Эбола // Биоорг. химия. – 2007. – Т. 33. – № 6. – С. 598– 605. 119 17. Abès R., Teillaud J-L. Impact of Glycosylation on Effector Functions of Therapeutic IgG // Pharmaceuticals. – 2010. – V. 3. – P. 146–157. doi: 10.3390/ph3010146. 18. Acosta E. G., Castilla V., Damonte E. B. Alternative infectious entry pathways for dengue virus serotypes into mammalian cells // Cell Microbiol. – 2009. – V. 11. – Issue 10. – P. 1533–1549. 19. Acosta E. G., Castilla V., Damonte E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin-mediated endocytosis // J Gen Virol. – 2008. – V. 89. – N. 2. – P. 474–484. 20. Acosta E. G., Kumar A., Bartenschlager R. Revisiting dengue virus-host cell interaction: new insights into molecular and cellular virology // Adv Virus Res. – 2014. – V. 88. – P. 1-109. doi: 10.1016/B978-0-12-800098-4.00001-5. 21. Aebi C., Schaad U. B. TBE-immunoglobulins – a critical assessment of efficacy // Schweiz Med Wochenschr. – 1994. – V. 124. – N 42. – P. 1837–40. 22. Allison S. L., Schalich J., Stiasny K., Mandl C. W., Heinz F. X. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E // J Virol. – 2001. – V. 75. – N. 9. – P. 4268–4275. 23. Allison S. L., Schalish J., Stiasny K., Mandl C. W., Kunz C., Heinz F. X. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH // J Virol. – 1995. – V. 69. – N 2. – P. 695–700. 24. Allison S. L., Stiasny K., Stadler K., Mandl C. W., Heinz F. X. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E // J Virol. – 1999. – V. 73. – N. 7. – P. 5605–5612. 25. Almagro J. C., Strohl W. R. Chapter 13. Antibody engineering: humanization, affinity maturation, and selection techniques // Therapeutic monoclonal antibodies. From bench to clinic / By Willey, 2009. – 912 pages. – ISBN: 978-0-470-11791-0. 26. Alvarez D. E., de Lella Ezcurra, A. L., Fucito, S., Gamarnik, A. V. Role of RNA structures present at the 3'UTR of dengue virus on translation, RNA synthesis, and viral replication // Virology. – 2005. – V. 339. – Issue 2. – P. 200–212. 27. Anthony R. M., Wermeling F., Ravetch J. V. Novel roles for the IgG Fc glycan // Ann N Y Acad Sci. – 2012. – V. 1253. – P. 170–80. doi: 10.1111/j.1749-6632.2011.06305.x. 28. Antibody purification handbook / Uppsala:Amersham Pharmacia Biotech; 2001. 120 29. Arnold J. N., Wormald M. R., Sim R. B., Rudd P. M., Dwek R. A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins // Annu Rev Immunol. – 2007. – V. 25. – P. 21–50. 30. Austin S. K., Dowd K. A. B cell response and mechanisms of antibody protection to West Nile virus // Viruses. – 2014. – V. 6. – N 3. – P. 1015–1036. 31. Balsitis S. J., Williams K. L., Lachica R., Flores D., Kyle J. L., Mehlhop E., Johnson S., Diamond M. S., Beatty P. R., Harris E. Lethal antibody enhancement of dengue disease in mice is prevented by Fc modification // PLoS Pathog. – 2010. – V. 6. – N 2:e1000790. doi: 10.1371/journal.ppat.1000790. 32. Beasley D. W., Barrett A. D. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein // J Virol. – 2002. – V. 76. – N. 24. – P. 13097–130100. 33. Beigel J. H., Nordstrom J. L., Pillemer S. R., Roncal C., Goldwater D. R., Li H., Holland P. C., Johnson S., Stein K., Koenig S. Safety and pharmacokinetics of single intravenous dose of MGAWN1, a novel monoclonal antibody to West Nile virus // Antimicrob Agents Chemother. – 2010. – V. 54. – N 6. – P. 2431–6. 34. Beltramello M., Williams K. L., Simmons C. P., Macagno A., Simonelli L., Quyen N. T., Sukupolvi-Petty S., Navarro-Sanchez E., Young P. R., de Silva A. M., Rey F. A., Varani L., Whitehead S. S., Diamond M. S., Harris E., Lanzavecchia A., Sallusto F. The human immune response to Dengue virus is dominated by highly cross-reactive antibodies endowed with neutralizing and enhancing activity // Cell Host Microbe. – 2010. – V. 8. – Issue 3. – P. 271–83. doi: 10.1016/j.chom.2010.08.007. 35. Berry J. D., Gaudet R. G. Antibodies in infectious diseases: polyclonals, monoclonals and niche biotechnology // N Biotechnol. – 2011. – V. 28. – Issue 5. – P. 489–501. doi: 10.1016/j.nbt.2011.03.018. 36. Bhardwaj S., Holbrook M., Shope R. E., Barrett A. D., Watowich S. J. Biophysical characterization and vector-specific antagonist activity of domain III of the tick-borne flavivirus envelope protein // J Virol. – 2001. – V. 75. – P. 4002–4007. 37. Bogachek M. V., Protopopova E. V., Loktev V. B., Zaitsev B. N., Favre M., Sekatskii S. K., Dietler G. Immunochemical and single molecule force spectroscopy studies of specific interaction between the laminin binding protein and the West Nile virus surface glycoprotein E domain II // J Mol Recognit. – 2008. – V. 21. – Issue 1. – P. 55–62. 121 38. Boulianne G. L., Hozumi N., Shulman M. J. Production of functional chimaeric mouse/human antibody // Nature. – 1984. – V. 312. – N 5995. – P. 643–646. 39. Brandriss M. W., Schlesinger J. J., Walsh E. E., Briselli M. Lethal 17D yellow fever encephalitis in mice. I. Passive protection by monoclonal antibodies to the envelope proteins of 17D yellow fever and dengue 2 viruses // J Gen Virol. – 1986. – V. 67. – P. 229–234. 40. Brien J. D., Austin S. K., Sukupolvi-Petty S., O’Brien K. M., Johnson S., Fremont D. H., Diamond M. S. Genotype Specific Neutralization and Protection by Antibodies against Dengue Virus Type 3 // J Virol. – 2010. – V. 84. – N 20. – P. 10630–10643. 41. Brinton M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus // Viruses. – 2014. – V. 6. – N 1. – P. 13–53. doi: 10.3390/v6010013. 42. Bröker M., Kollaritsch H. After a tick bite in a tick-borne encephalitis virus endemic area: current positions about post-exposure treatment // Vaccine. – 2008. – V. 26. – Issue 7. – P. 863–868. 43. Bumbaca D., Boswell C. A., Fielder P. J., Khawli L. A. Physiochemical and biochemical factors influencing the pharmacokinetics of antibody therapeutic // AAPS J. – 2012. – V. 14. – Issue 3. – P. 554–558. doi: 10.1208/s12248-012-9369-y. 44. Butrapet S., Kimura-Kuroda J., Zhou D. S., Yasui K. Neutralizing mechanism of a monoclonal antibody against Japanese encephalitis virus glycoprotein E // Am J Trop Med Hyg. – 1998. – V. 58. – N 4. – P. 389–398. 45. Calvert A. E., Kalantarov G. F., Chang G. J., Trakht I., Blair C. D., Roehrig J. T. Human monoclonal antibodies to West Nile virus identify epitopes on the prM protein // Virology. – 2011. – V. 410. – Issue 1. – P. 30–37. 46. Chabierski S., Makert G. R., Kerzhner A., Barzon L., Fiebig P., Liebert U. G., Papa A., Richner J. M., Niedrig M., Diamond M. S., Palù G., Ulbert S. Antibody responses in humans infected with newly emerging strains of West Nile Virus in Europe // PLoS One. – 2013. – V. 8 . – N 6. – P. e66507. 47. Chadd H. E., Chamow S. M. Therapeutic antibody expression technology // Curr Opin Biotechnol. – 2001. – V. 12. – Issue 2. – P. 188–194. 48. Chambers T. J., Hahn C. S., Galler R., Rice C. M. Flavivirus genome organization, expression, and replication // Annu Rev Microbiol. – 1990. – V. 44. – P. 649–688. 122 49. Chambers T. J., Halevy M., Nestorowicz A., Rice C. M., Lustig S. West Nile virus envelope proteins: Nucleotide sequence analysis of strains differing in mouse neuroinvasiveness // J. Gen. Virol. – 1998. – V. 79. – P. 2375–2380. 50. Chames P., Van Regenmortel M., Weiss E., Baty D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future // Br J Pharmacol. – 2009. – V. 157. – Issue 2. – P. 220–233. doi: 10.1111/j.1476-5381.2009.00190.x. 51. Charrel R. N., Attoui H., Butenko A. M., Clegg J. C., Deubel V., Frolova T. V., Gould E. A., Gritsun T. S., Heinz F. X., Labuda M., Lashkevich V. A., Loktev V., Lundkvist A., Lvov D. V., Mandl C. W., Niedrig M., Papa A., Petrov V. S., Plyusnin A., Randolph S., Süss J., Zlobin V. I., de Lamballerie X. Tick-borne virus diseases of human interest in Europe // Clin Microbiol Infect. – 2004. – V. 10. – Issue 12. – P. 1040–1055. 52. Chen H. T., Kabat E. A., Lundblad A, Ratcliffe R. M. Nucleotide and translated amino acid sequences of cDNA coding for the variable regions of the light and heavy chains of mouse hybridoma antibodies to blood group A and B substances // J Biol Chem. – 1987. – V. 262. – N 28. – P. 13579–13583. 53. Chen Y., Maguire T., Hileman R. E., Fromm J. R., Esko J. D., Linhardt R. J., Marks R. M. Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate // Nat Med. – 1997. – V. 3. – N 8. – P. 866–871. 54. Cheng G., Cox J., Wang P., Krishnan M. N., Dai J., Qian F., Anderson J. F., Fikrig E. A C-type lectin collaborates with a CD45 phosphatase homolog to facilitate West Nile virus infection of mosquitoes // Cell. – 2010. – V. 142. – Issue 5. – P. 714–725. doi: 10.1016/j.cell.2010.07.038. 55. Chu J. J. H., Ng M. L. Infectious entry of West Nile Virus occurs through clathrinmediated endocytic pathway // J Virol. – 2004a. – V. 78. – N 19. – P. 10543– 10555. 56. Chu J. J. H., Ng M. L. Interaction of West Nile Virus with αvβ3 integrin mediates virus entry into cells // J. Biol. Chem. – 2004b. – 279. – N. 52. – P. 54533–54541. 57. Chu P. W., Westaway E. G. Characterization of Kunjin virus RNA-dependent RNA polymerase: Reinitiation of synthesis in vitro // Virology. – 1987. – V. 157. – Issue 2. – P. 330–337. 58. Chung K. M., Nybakken G. E., Thompson B. S., Engle M. J., Marri A., Fremont D. H., Diamond M. S. Antibodies against West Nile Virus Nonstructural Protein NS1 Prevent 123 Lethal Infection through Fc γ Receptor-Dependent and -Independent Mechanisms // J Virol. – 2006. – 80. – N 3. – P. 1340–1351. 59. Cohn E., Strong L., Hughes W., Mulford D., Ashworth J., Melin M., Taylor H: Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids // J Am Chem Soc. – 1946. – Vol. 68. – P. 459–475. 60. Corver J., Lenches E., Smith K., Robison R. A., Sando T., Strauss E. G., Strauss J. H. Fine mapping of a cis-acting sequence element in yellow fever virus RNA that is required for RNA replication and cyclization // J Virol. – 2003. – V. 77. – N 3. – P. 2265–2270. 61. Cosset F. L., Lavillette D. Cell entry of enveloped viruses // Adv Gen – 2011. – V. 73. – P. 121-183. doi: 10.1016/B978-0-12-380860-8.00004-5. 62. Costin J. M., Zaitseva E., Kahle K. M., Nicholson C. O., Rowe D. K., Graham A. S., Bazzone L. E., Hogancamp G., Figueroa Sierra M., Fong R. H., Yang S. T., Lin L, Robinson J. E., Doranz B. J., Chernomordik L. V., Michael S. F., Schieffelin J. S., Isern S. Mechanistic study of broadly neutralizing human monoclonal antibodies against dengue virus that target the fusion loop // J Virol. – 2013. – V. 87. – N 1. – P. 52–66. doi: 10.1128/JVI.02273-12. 63. Crill W. D., Chang G. J. Localization and characterization of flavivirus envelope glycoprotein cross-reactive epitopes // J Virol. – 2004. – V. 78. – N 24. – P. 13975– 13986. 64. Crill W. D., Roehrig J. T. Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells // J Virol. – 2001. – V. 75. – N 16. – P. 7769–7773. 65. Daffis S, Kontermann R. E., Korimbocus J., Zeller H., Klenk H. D., Ter Meulen J. Antibody responses against wildtype yellow fever virus and the 17D vaccine strain: characterization with human monoclonal antibody fragments and neutralization escape variants // Virology. – 2005. – V. 337. – N 2. – P. 262–272. 66. Davis C. W., Nguyen H. Y., Hanna S. L., Sanchez M. D., Doms R. W., Pierson T. C. West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGNR for cellular attachment and infection // J Virol. – 2006. – V. 80. – N 3. – P. 1290–1301. 124 67. de Alwis R., Smith S. A., Olivarez N. P., Messer W. B., Huynh J. P., Wahala W. M., White L. J., Diamond M. S., Baric R. S., Crowe J. E. Jr, de Silva A. M. Identification of human neutralizing antibodies that bind to complex epitopes on dengue virions // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2012. – V. 109. – N 19. – P. 7439–7444. doi: 10.1073/pnas.1200566109. 68. Dejnirattisai W., Jumnainsong A., Onsirisakul N., Fitton P., Vasanawathana S., Limpitikul W., Puttikhunt C., Edwards C., Duangchinda T., Supasa S., Chawansuntati K., Malasit P., Mongkolsapaya J., Screaton G. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans // Science. – 2010. – V. 328. – N 5979. – P. 745–748. doi: 10.1126/science.1185181. 69. Deng Y. Q., Dai J. X., Ji G. H., Jiang T., Wang H. J., Yang H. O., Tan W. L., Liu R., Yu M., Ge B. X., Zhu Q. Y., Qin E. D., Guo Y. J., Qin C. F. A broadly flavivirus crossneutralizing monoclonal antibody that recognizes a novel epitope within the fusion loop of E protein // PLoS One. – 2011. – V. 6. – N 1. – P. e16059. doi: 10.1371/journal.pone.0016059. 70. Deperalta G., Alvarez M., Bechtel C., Dong K., McDonald R., Ling V. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting // MAbs. – 2013. – V. 5. – Issue 1. – P. 86–101. 71. Dobler G., Gniel D., Petermann R., Pfeffer M. Epidemiology and distribution of tickborne encephalitis // Wien Med Wochenschr. – 2012. – V. 162. – Issue 11–12. – P. 230–238. doi: 10.1007/s10354-012-0100-5. 72. Dokland T., Walsh M., Mackenzie J. M., Khromykh A. A., Ee K. H., Wang S. West Nile virus core protein; tetramer structure and ribbon formation // Structure. – 2004. – V. 12. – Issue 7. – P. 1157–1163. 73. Dowd K. A., Pierson T. C. Antibody-mediated neutralization of flaviviruses: A reductionist view // Virology. – 2011. – V. 411. – Issue 2. – P. 306–315. doi: 10.1016/j.virol.2010.12.020. 74. Edeling M. A., Austin S. K., Shrestha B., Dowd K. A., Mukherjee S., Nelson C. A., Johnson S., Mabila M. N., Christian E. A., Rucker J., Pierson T. C., Diamond M. S., Fremont D. H. Potent dengue virus neutralization by a therapeutic antibody with low monovalent affinity requires bivalent engagement // PLoS Pathog. – 2014. – V. 10. – N 4. – P. e1004072. doi: 10.1371/journal.ppat.1004072. 125 75. Eliasson M., Olsson A., Palmcrantz E., Wiberg K., Inganas M., Guss B., Lindberg M., Uhlen M. Chimeric IgG-binding receptors engineered from staphylococcal protein A and streptococcal protein G // J Biol Chem. – 1988. – V. 263. – N 9. – P. 4323–4327. 76. Emami M., Shamsipur M., Saber R., Irajirad R. An electrochemical immunosensor for detection of a breast cancer biomarker based on antiHER2-iron oxide nanoparticle bioconjugates // Analyst. – 2014. – V. 139. – N 11. – P. 2858–2866. doi: 10.1039/c4an00183d. 77. Erbel P., Schiering N., D’Arcy A., Renatus M., Kroemer M., Lim S. P., Yin Z., Keller T. H., Vasudevan S. G., Hommel U. Structural basis for the activation of flaviviral NS3 proteases from dengue and West Nile virus // Nat. Struct. Mol. Biol. – 2006. – V. 13. – P. 372–373. 78. Faggioni G., Pomponi A., De Santis R., Masuelli L., Ciammaruconi A., Monaco F., Di Gennaro A., Marzocchella L., Sambri V., Lelli R., Rezza G., Bei R., Lista F. West Nile alternative open reading frame (N-NS4B/WARF4) is produced in infected West Nile Virus (WNV) cells and induces humoral response in WNV infected individuals // Virol. J. – 2012. – V. 9. – P. e283. doi: 10.1186/1743-422X-9-283. 79. Falconar A. K., Young P. R. Production of dimer-specific and dengue virus group cross-reactive mouse monoclonal antibodies to the dengue 2 virus non-structural glycoprotein NS1 // J Gen Virol. – 1991. – V. 72. – P. 961–965. 80. Feige M. J., Nath S., Catharino S. R., Weinfurtner D., Steinbacher S., Buchner J. Structure of the murine unglycosylated IgG1 Fc fragment // J Mol Biol. – 2009. – V. 391. – Issue 3. – P. 599–608. doi: 10.1016/j.jmb.2009.06.048. 81. Fibriansah G., Tan J. L., Smith S. A., de Alwis A. R., Ng T. S., Kostyuchenko V. A., Ibarra K. D., Wang J., Harris E., de Silva A., Crowe J. E. Jr, Lok S. M. A potent antidengue human antibody preferentially recognizes the conformation of E protein monomers assembled on the virus surface // EMBO Mol Med. – 2014. – V. 6. – Issue 3. – P. 358–371. doi: 10.1002/emmm.201303404. 82. Flamand A., Raux H., Gaudin Y., Ruigrok R. W. Mechanisms of rabies virus neutralization // Virology. – 1993. – V. 194. – Issue 1. – P. 302–313. 83. Gangwar R. S., Shil P., Cherian S. S., Gore M. M. Delineation of an epitope on domain I of Japanese encephalitis virus Envelope glycoprotein using monoclonal antibodies // Virus Res. – 2011. – V. 158. – Issue 1–2. – P. 179–187. 126 84. Geyer C. R., McCafferty J., Dübel S., Bradbury A. R. M., Sidhu S. S. Chapter 2. Recombinant Antibodies and In Vitro Selection Technologies // Antibody methods and protocols, Methods in Molecular Biology / Springer, 2012. – V. 901. – ISBN: 978-161779-930-3 (Print). – ISBN: 978-1-61779-931-0 (Online). 85. Ghai R., Waters P., Roumenina L. T., Gadjeva M., Kojouharova M. S., Reid K. B., Sim R. B., Kishore U. C1q and its growing family // Immunobiology. – 2007. – V. 212. – Issue 4–5. – P. 253–266. 86. Ghosh R. Protein separation using membrane chromatography: opportunities and challenges // J Chromatogr A. – 2002. – V. 952. – Issue 1–2. – P. 13–27. 87. Giebel L. B., Spritz R. A. Site-directed mutagenesis using a double-stranded DNA fragment as a PCR primer // Nucleic Acids Res. – 1990. – V. 18. – N 16. – P. 4947. 88. Gillespie L. K., Hoenen A., Morgan G., Mackenzie J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex // J Virol. – 2010. – V. 84. – N 20. – P. 10438–10447. 89. Gollins S. W., Porterfield J. S. Flavivirus infection enhancement in macrophages: an electron microscopic study of viral cellular entry // J Gen Virol. – 1985. – V. 66. – P. 1969–1982. 90. Gollins S. W., Porterfield J. S. A new mechanism for the neutralization of enveloped viruses by antiviral antibody // Nature. – 1986. – V. 321. – N 6067. – P. 244–246. 91. Goto A., Hayasaka D., Yoshii K., Mizutani T., Kariwa H., Takashima I. A BHK-21 cell culture-adapted tick-borne encephalitis virus mutant is attenuated for neuroinvasiveness // Vaccine. – 2003. – V. 21. – Issue 25–26. – P. 4043–4051. 92. Gould L. H., Sui J., Foellmer H., Oliphant T., Wang T., Ledizet M., Murakami A., Noonan K., Lambeth C., Kar K., Anderson J. F., de Silva A. M., Diamond M. S., Koski R. A., Marasco W. A., Fikrig E. Protective and therapeutic capacity of human singlechain Fv-Fc fusion proteins against West Nile virus // J Virol. – 2005. – V. 79. – N 23. – P. 14606–14613. 93. Gromowski G. D., Barrett N. D., Barrett A. D. Characterization of dengue virus complex-specific neutralizing epitopes on envelope protein domain III of dengue 2 virus // J Virol. – 2008. – V. 82. – N 17. – P. 8828–8837. 94. Guirakhoo F., Bolin R. A., Roehrig J. T. The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes 127 within the R2 domain of E glycoprotein // Virology. – 1992. – V. 191. – Issue 2. – P. 921–931. 95. Guirakhoo F., Heinz F. X., Kunz C. Epitope model of tick-borne encephalitis virus envelope glycoprotein E: analysis of structural properties, role of carbohydrate side chain, and conformational changes occurring at acidic pH // Virology. – 1989. – 169. – Issue 1. – P. 90–99. 96. Hahn R., Schlegel R., Jungbauer A. Comparison of protein A affinity sorbents // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2003. – V. 790. – Issue 1–2. – P. 35– 51. 97. Hale G. Chapter 7. Isolation and purification of monoclonal antibodies from tissue culture supernatant // Monoclonal antibodies: a practical approach, edited by Philip S. Shepherd, Christopher J. Dean / Oxford University Press, 2000. – 479 pages. – ISBN13: 978-0199637225 . – ISBN-10: 0199637229 98. Hale G., Drumm A., Harrison P., Phillips J. Repeated cleaning of protein A affinity column with sodium hydroxide // J Immunol Methods. – 1994. – V. 171. – N 1. – P. 15–21. 99. Halstead S. B., O’Rourke E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody // J Exp Med. – 1977. – V. 146. – N 1. – P. 201–217. 100. Halstead S. B. Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses // Adv. Virus Res. – 2003. – V. 60. – P. 421–467. 101. Hamako J., Matsui T., Ozeki Y., Mizuochi T., Titani K. Comparative Studies of Asparagine-Linked Sugar Chains of Immunoglobulin G from Eleven Mammalian Species // Comp Biochem Physiol B. – 1993. – V. 106. – Issue 4. – P. 949–954. 102. Hammerschmidt N., Hintersteiner B., Lingg N., Jungbauer A. Continuous precipitation of IgG from CHO cell culture supernatant in a tubular reactor // Biotechnol J. – 2015 epub. doi: 10.1002/biot.201400608. 103. Harmsen M. M., De Haard H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments // Appl Microbiol Biotechnol. – 2007. – V. 77. – Issue 1. – P. 13–22. 104. Harrison S. C. Viral membrane fusion // Nat Struct Mol Biol. – 2008. – V. 15. – N 7. – P. 690–698. doi: 10.1038/nsmb.1456. 128 105. He J., Lai H., Engle M., Gorlatov S., Gruber C., Steinkellner H., Diamond M. S., Chen Q. Generation and analysis of novel plant-derived antibody-based therapeutic molecules against West Nile virus // PLoS One. – 2014. – V. 9. – Issue 3. – P. e93541. doi: 10.1371/journal.pone.0093541. 106. He R. T., Innis B. L., Nisalak A., Usawattanakul W., Wang S., Kalayanarooj S., Anderson R. Antibodies that block virus attachment to Vero cells are a major component of the human neutralizing antibody response against dengue virus type 2 // J. Med. Virol. – 1995. – V. 45. – Issue 4. – P. 451–461. 107. Heckman K. L., Pease L. R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension // Nat Protoc. – 2007. – V. 2. – N 4. – P. 924–932. 108. Heinz F. X., Mandl C. W., Holzmann H., Kunz C., Harris B. A., Rey F., Harrison S. C. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization // J Virol. – 1991. – V. 65. – N 10. – P. 5579– 5583. 109. Heinz F. X., Stiasny K. Flaviviruses and flavivirus vaccines // Vaccine. – 2012. – V. 30. – Issue 29. – P. 4301–4306. 110. Heinz F. X., Stiasny K., Puschner-Auer G., Holzmann H., Allison S. L., Mandl C. W., Kunz C. Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM // Virology. – 1994. – V. 198. – Issue 1. – P. 109–117. 111. Heinz F. X., Stiasny K., Allison S. L. The entry machinery of flaviviruses // Arch. Virol. Suppl. – 2004. – V. 18. – P. 133–137. 112. Hermeling S., Crommelin D. J., Schellekens H., Jiskoot W. Structure-immunogenicity relationships of therapeutic proteins // Pharm Res. – 2004. – V. 21. – Issue 6. – P. 897– 903. 113. Hershkovitz O., Rosental B., Rosenberg L. A., Navarro-Sanchez M. E., Jivov S., Zilka A., Gershoni-Yahalom O., Brient-Litzler E., Bedouelle H., Ho J. W., Campbell K. S., Rager-Zisman B., Despres P., Porgador A. NKp44 receptor mediates interaction of the envelope glycoproteins from the West Nile and dengue viruses with NK cells // J Immunol. – 2009. – V. 183. – N 4. – P. 2610–2621. 129 114. Hirota J., Shimizu S. A new competitive ELISA detects West Nile virus infection using monoclonal antibodies against the precursor-membrane protein of West Nile virus // J Virol Methods. – 2013. – V. 188. – Issue 1–2. – P. 132–138. 115. Holliger P, Hudson P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains // Nat Biotechnol. – 2005. – V. 23. – N 9. – P. 1126–1136. 116. Holt L. J., Herring C., Jespers L. S., Woolven B. P., Tomlinson I. M. Domain antibodies: proteins for therapy // Trends Biotechnol. – 2003. – V. 21. – Issue 11. – P. 484–490. 117. Holzmann H., Stiasny K., York H., Dorner F., Kunz C., Heinz F. X. Tick-borne encephalitis virus envelope protein E-specific monoclonal antibodies for the study of low pH-induced conformational changes and immature virions // Arch Virol. – 1995. – V. 140. – P. 213–221. 118. Huisman W., Martina B. E., Rimmelzwaan G. F., Gruters R. A., Osterhaus A. D. Vaccine-induced enhancement of viral infections // Vaccine. – 2009. – V. 27. – Issue 4. – P. 505–512. 119. Hunt A. R, Bowen R. A, Frederickson S., Maruyama T., Roehrig J. T., Blair C. D. Treatment of mice with human monoclonal antibody 24h after lethal aerosol challenge with virulent Venezuelan equine encephalitis virus prevents disease but not infection // Virology. – 2011. – V. 414. – Issue 2. – P. 146–152. 120. Huse K., Böhme H. J., Scholz G. H. Purification of antibodies by affinity chromatography // J Biochem Biophys Methods. – 2002. – V. 51. – Issue 3. – P. 217– 231. 121. Issur M., Geiss B. J., Bougie I., Picard-Jean F., Despins S., Mayette J., Hobdey S. E., Bisaillon M. The flavivirus NS5 protein is a true RNA guanylyltransferase that catalyzes a two-step reaction to form the RNA cap structure // RNA. – 2009. – V. 15. – P. 2340–2350. 122. Jakobovits A. Production of fully human antibodies by transgenic mice // Curr Opin Biotechnol. – 1995. – V. 6. – Issue 5. – P. 561–566. 123. Jefferis R., Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models // Immunol Lett. – 2002. – V. 82. – Issues 1–2. – P. 57–65. 124. Jefferis R. Glycosylation of recombinant antibody therapeutics // Biotechnol Prog. – 2005. – V. 21. – Issue 1. – P. 11–16. 130 125. Jefferis R. Isotype and glycoform selection for antibody therapeutics // Arch Biochem Biophys. – 2012. – V. 526. – Issue 2. – P. 159–166. 126. Jefferis R. Recombinant antibody therapeutics: the impact of glycosylation on mechanisms of action // Trends Pharmacol Sci. – 2009. – V. 30. – N 7. – P. 356–362. doi: 10.1016/j.tips.2009.04.007. 127. Jefferis R. The glycosylation of antibody molecules: functional significance // Glycoconj J. – 1993. – V. 10. – Issue 5. – P. 358–361. 128. Jiang W., Bonnert T. P., Venugopal K., Gould E. A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses // Virology. – 1994. – V. 200. – Issue 1. – P. 21–28. 129. Julander J. G., Thibodeaux B. A., Morrey J. D., Roehrig J. T., Blair C. D. Humanized monoclonal antibody 2C9-cIgG has enhanced efficacy for yellow fever prophylaxis and therapy in an immunocompetent animal model // Antiviral Res. – 2014. – V. 103. – P. 32–38. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.12.011. 130. Jung D., Giallourakis C., Mostoslavsky R., Alt F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination at the immunoglobulin heavy chain locus // Annu Rev Immunol. – 2006. – V. 24. – P. 541–570. 131. Junjhon J., Edwards T. J., Utaipat U., Bowman V. D., Holdaway H. A., Zhang W., Keelapang P., Puttikhunt C., Perera R., Chipman P. R., Kasinrerk W., Malasit P., Kuhn R. J., Sittisombut N. Influence of pr-M cleavage on the heterogeneity of extracellular dengue virus particles // J Virol. – 2010. – V. 84. – N 16. – P. 8353–8358. 132. Kaiser R. Tick-borne Encephalitis―still a serious disease? // Wien Med Wochenschr. – 2012. – V. 162. – Issue 11–12. – P. 229. 133. Kammann M., Laufs J., Schell J., Gronenborn B. Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR) // Nucleic Acids Res. – 1989. – V. 17. – N 13. – P. 5404. 134. Kaufmann B., Chipman P. R., Holdaway H. A., Johnson S., Fremont D. H., Kuhn R. J., Diamond M. S., Rossmann M. G. Capturing a flavivirus pre-fusion intermediate // PLoS Pathog. – 2009. – V. 5. – P. e1000672. 135. Kaufmann B., Nybakken G. E., Chipman P. R., Zhang W., Diamond M. S., Fremont D. H., Kuhn R. J., Rossmann M. G. West Nile virus in complex with the Fab fragment 131 of a neutralizing monoclonal antibody // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. – V. 103. – N 33. – P. 12400–12404. 136. Kaufmann B., Rossmann M. G. Molecular mechanisms involved in the early steps of flavivirus cell entry // Microbes Infect. – 2011. – V. 13. – Issue 1. – P. 1–9. doi: 10.1016/j.micinf.2010.09.005. 137. Ke S. H., Madison E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method // Nucleic Acids Res. – 1997. – V. 25. – N 16. – P. 3371– 3372. 138. Kearney J. F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewsky K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibodysecreting hybrid cell lines // J Immunol. – 1979. – V. 123. – N 4. – P. 1548–1550. 139. Keller B. C., Fredericksen B. L., Samuel M. A., Mock R. E., Mason P. W., Diamond M. S., Gale M. Jr. Resistance to alpha/beta interferon is a determinant of West Nile virus replication fitness and virulence // J Virol. – 2006. – V. 80. – N 19. – P. 9424– 9434. 140. Khlusevich Y. A., Matveev A. L., Baykov I. K., Tikunova N. V. Developing of fully human monoclonal antibodies against pathogenic Orthopoxviruses // Materials of 17th Annual Meeting of ESCV. – 2014. – Prague. 141. Khromykh A. A., Meka H., Guyatt K. J., Westaway E. G. Essential role of cyclization sequences in flavivirus RNA replication // J Virol. – 2001. – V. 75. – N 14. – P. 6719– 6728. 142. Kiermayr S., Stiasny K., Heinz F. X. Impact of quaternary organization on the antigenic structure of the tick-borne encephalitis virus envelope glycoprotein E // J Virol. – 2009. – V. 83. – N 17. – P. 8482–8491. doi: 10.1128/JVI.00660-09. 143. Kishore U., Reid K. B. C1q: structure, function, and receptors // Immunopharmacology. – 2000. – V. 49. – Issues 1–2. – P. 159–170. 144. Klasse P. J., Sattentau Q. J. Occupancy and mechanism in antibody-mediated neutralization of animal viruses // J Gen Virol. – 2002. – V. 83. – Pt. 9. – P. 2091–2108. 145. Klasse P. J., Sattentau Q. J. Mechanisms of virus neutralization by antibody // Curr Top Microbiol Immunol. – 2001. – V. 260. – P. 87–108. 132 146. Kluger G., Schöttler A., Waldvogel K., Nadal D., Hinrichs W., Wündisch G. F., Laub M. C. Tickborne encephalitis despite specific immunoglobulin prophylaxis // Lancet. – 1995. – V. 346. – Issue 8988. – P. 1502. 147. Köhler G., Howe S. C., Milstein C. Fusion between immunoglobulin-secreting and nonsecreting myeloma cell lines // Eur J Immunol. – 1976. – V. 6. – Issue 4. – P. 292– 295. 148. Kramer L. D., Li J., Shi P. Y. West Nile virus // Lancet Neurol. – 2007. – V. 6. – Issue 2. – P. 171–181. 149. Kreil T. R., Eibl M. M. Pre- and postexposure protection by passive immunoglobulin but no enhancement of infection with a flavivirus in a mouse model // J Virol. – 1997. – V. 71. – Issue 4. – P. 2921–2927. 150. Krishnan M. N., Sukumaran B., Pal U., Agaisse H., Murray J. L., Hodge T. W., Fikrig E. Rab 5 is required for the cellular entry of dengue and West Nile viruses // J Virol. – 2007. – V. 81. – N 9. – P. 4881–4885. 151. Kroschewski H., Allison S. L., Heinz F. X., Mandl C. W. Role of heparan sulfate for attachment and entry of tick-borne encephalitis virus // Virology. – 2003. – V. 308. – Issue 1. – P. 92–100. 152. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – V. 227. – N 5259. – P. 680–685. 153. Lai H., Engle M., Fuchs A., Keller T., Johnson S., Gorlatov S., Diamond M. S., Chen Q. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2010. – V. 107. – N 6. – P. 2419–2424. doi: 10.1073/pnas.0914503107. 154. Lai H., He J., Engle M., Diamond M. S., Chen Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce // Plant Biotechnol J. – 2012. – V. 10. – Issue 1. – P. 95–104. 155. Lai H., He J., Hurtado J., Stahnke J., Fuchs A., Mehlhop E., Gorlatov S., Loos A., Diamond M. S., Chen Q. Structural and functional characterization of an anti-West Nile virus monoclonal antibody and its single-chain variant produced in glycoengineered plants // Plant Biotechnol J. – 2014. – V. 12. – Issue 8. – P. 1098–1107. 10.1111/pbi.12217. 133 doi: 156. Laurent-Rolle M., Boer E. F., Lubick K. J., Wolfinbarger J. B., Carmody A. B., Rockx B., Liu W., Ashour J., Shupert W. L., Holbrook M. R., Barrett A. D., Mason P. W., Bloom M. E., García-Sastre A., Khromykh A. A., Best S. M. The NS5 protein of the virulent West Nile virus NY99 strain is a potent antagonist of type I interferon-mediated JAK-STAT signaling // J Virol. – 2010. – V. 84. – N 7. – P. 3503–3515. 157. Lee E., Lobigs M. Substitutions at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry // J Virol. – 2000. – V. 74. – P. 8867–8875. 158. Lee T. H., Song B. H., Yun S. I., Woo H. R., Lee Y. M., Diamond M. S., Chung K. M. A cross-protective mAb recognizes a novel epitope within the flavivirus NS1 protein // J Gen Virol. – 2012. – V. 93. – Pt. 1. – P. 20–26. doi: 10.1099/vir.0.036640-0. 159. Lee J. W., Chu J. J., Ng M. L. Quantifying the specific binding between West Nile virus envelope domain III protein and the cellular receptor alphaVbeta3 integrin // J Biol Chem. – 2006. – V. 281. – P. 1352–1360. 160. Lehrer A. T., Holbrook M. R. Tick-borne Encephalitis Vaccines // J Bioterror Biodef. – 2011. – Suppl 1. – P. 3. 161. Lelli D., Moreno A., Brocchi E., Sozzi E., Capucci L., Canelli E., Barbieri I., Zeller H., Cordioli P. West Nile virus: characterization and diagnostic applications of monoclonal antibodies // Virol J. – 2012. – V. 9. – P. 81. doi: 10.1186/1743-422X-9-81. 162. Levanov L. N., Matveev L. E., Goncharova E. P., Lebedev L. R., Ryzhikov A. B., Yun T. E., Batanova T. A., Shvalov A. N., Baykov I. K., Shingarova L. N., Kirpichnikov M. P., Tikunova N. V. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. – 2010. – V. 28. – P. 5265–5271. 163. Li L., Lok S. M., Yu I. M., Zhang Y., Kuhn R. J., Chen J., Rossmann M. G. The flavivirus precursor membrane-envelope protein complex: structure and maturation // Science. – 2008. – V. 319. – N 5871. – P. 1830–1834. 164. Li P. C., Liao M. Y., Cheng P. C., Liang J. J., Liu I. J., Chiu C. Y., Lin Y. L., Chang G. J., Wu H. C. Development of a humanized antibody with high therapeutic potential against dengue virus type 2 // PLoS Negl Trop Dis. – 2012. – V. 6. – N 5. – P. e1636. doi: 10.1371/journal.pntd.0001636. 165. Lim S. P., Shi P. Y. West Nile virus drug discovery // Viruses. – 2013. – V. 5. – N 12. – P. 2977–3006. doi: 10.3390/v5122977. 134 166. Lin M. H., Hsu H. J., Bartenschlager R., Fischer W. B. Membrane undulation induced by NS4A of Dengue virus: A molecular dynamics simulation study // J Biomol Struct Dyn. – 2014. – V. 32. – Issue 10. – P. 1552–1562. doi:10.1080/07391102.2013.826599. 167. Lindebach B. D., Thiel H.-J., Rice C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication // In: Knippe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), 4th ed. Fields Virology, Vol.1. / Lippincott Williams and Wilkins and Wolters Kluwer Business Publishers,Philadelphia, USA, 2001 . – pp. 1101–1152. 168. Lindquist L., Vapalahti O. Tick-borne encephalitis // Lancet. – 2008. – V. 371. – Issue 9627. – P. 1861. – 1871. doi: 10.1016/S0140-6736(08)60800-4. 169. Liu H. F., Ma J., Winter C., Bayer R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production // MAbs. – 2010. – V. 2. – Issue 5. – P. 480–499. 170. Liu W. J., Wang X. J., Mokhonov V. V., Shi P. Y., Randall R., Khromykh A. A. Inhibition of interferon signaling by the New York 99 strain and Kunjin subtype of West Nile virus involves blockage of STAT1 and STAT2 activation by nonstructural proteins // J Virol. – 2005. – V. 79. – P. 1934–1942. 171. Lo M. K., Tilgner M., Bernard K. A., Shi P. Y. Functional analysis of mosquito-borne flavivirus conserved sequence elements within 3' untranslated region of West Nile virus by use of a reporting replicon that differentiates between viral translation and RNA replication // J Virol. – 2003. – V. 77. – P. 10004–10014. 172. Lobigs M., Dalgarno L., Schlesinger J. J., Weir R.C. Location of a neutralization determinant in the E protein of yellow fever virus (17D vaccine strain) // Virology. – 1987. – V. 161. – P. 474–478. 173. Lok S. M., Kostyuchenko V., Nybakken G. E., Holdaway H. A., Battisti A. J., Sukupolvi-Petty S., Sedlak D., Fremont D. H., Chipman P. R., Roehrig J. T., Diamond M. S., Kuhn R. J., Rossmann M. G. Binding of a neutralizing antibody to dengue virus alters the arrangement of surface glycoproteins // Nat Struct Mol Biol. – 2008. – V. 15. – N 3. – P. 312–317. doi: 10.1038/nsmb.1382. 174. Ma L., Jones C. T., Groesch T. D., Kuhn R. J., Post C. B. Solution structure of dengue virus capsid protein reveals another fold // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2004. – V. 101. – P. 3414–3419. 135 175. Mackenzie J. M., Khromykh A. A., Jones M. K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A // Virology. – 1998. – V. 245. – P. 203–215. 176. Maldov D. G., Karganova G. G., Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells // Arch Virol. – 1992. – V. 127. – Issue 1–4. – P. 321– 325. 177. Mandl C. W. Steps of the tick-borne encephalitis virus replication cycle that affect neuropathogenesis // Virus Res. – 2005. – V. 111. – Issue 2. – P. 161–174. 178. Mandl C. W., Guirakhoo F., Holzmann H., Heinz F. X., Kunz C. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model // J Virol. – 1989. – V. 63. – N 2. – P. 564–571. 179. Mandl C. W., Kroschewski H., Allison S. L., Kofler R., Holzmann H., Meixner T., Heinz F. X. Adaptation of tick-borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo // J Virol. – 2001. – V. 75. – N 1. – P. 5627–5637. 180. Mansfield K. L., Johnson N., Phipps L. P., Stephenson J. R., Fooks A. R., Solomon T. Tick-borne encephalitis virus – a review of an emerging zoonosis // J Gen Virol. – 2009. – V. 90. – Pt 8. – P. 1781–1794. 181. Marasco W. A., Sui J. The growth and potential of human antiviral monoclonal antibody therapeutics // Nat Biotechnol. – 2007. – V. 25. – N 12. – P. 1421–1434. 182. Marichal-Gallardo P. A., Alvarez M. M. State-of-the-art in downstream processing of monoclonal antibodies: process trends in design and validation // Biotechnol Prog. – 2012. – V. 28. – Issue 4. – P. 899–916. doi: 10.1002/btpr.1567. 183. Martínez-Barragán J. J., del Angel R. M. Identification of a putative coreceptor on Vero cells that participates in dengue 4 virus infection // J Virol. – 2001. – V. 75. – N 17. – P. 7818–7827. 184. Matveeva V. A., Popova R. V., Kvetkov Е. А., Chernicina L. O., Zlobin V. I., Puchovskaya N. M., Morozova O. V. Antibodies against tick-borne encephalitis virus (TBEV) non-structural and structural proteins in human sera and spinal fluid // Immunol Lett. – 1995. – V. 46. – Issue 1–2. – P. 1–4. 185. Mazor R., Eberle J. A., Hu X., Vassall A. N., Onda M., Beers R., Lee E. C., Kreitman R. J., Lee B., Baker D., King C., Hassan R., Benhar I., Pastan I. Recombinant 136 immunotoxin for cancer treatment with low immunogenicity by identification and silencing of human T-cell epitopes // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2014. – V. 111. – N 23. – P. 8571–8576. doi: 10.1073/pnas.1405153111. 186. Mehlhop E., Nelson S., Jost C. A., Gorlatov S., Johnson S., Fremont D. H., Diamond M. S., Pierson T. C. Complement protein C1q reduces the stoichiometric threshold for antibody-mediated neutralization of West Nile virus // Cell Host Microbe. – 2009. – V. 6. – Issue 4. – P. 381–391. 187. Midgley C. M., Flanagan A., Tran H. B., Dejnirattisai W., Chawansuntati K., Jumnainsong A., Wongwiwat W., Duangchinda T., Mongkolsapaya J., Grimes J. M., Screaton G. R. Structural analysis of a dengue cross-reactive antibody complexed with envelope domain III reveals the molecular basis of cross-reactivity // J Immunol. – 2012. – V. 188. – N 10. – P. 4971–4979. doi: 10.4049/jimmunol.1200227. 188. Miller J. L., de Wet B. J., Martinez-Pomares L., Radcliffe C. M., Dwek R. A., Rudd P. M., Gordon S. The mannose receptor mediates dengue virus infection of macrophages // PLoS Pathog. – 2008. – V. 4. – P. e17. 189. Miller S., Kastner S., Krijnse-Locker J., Buhler S., Bartenschlager R. The nonstructural protein 4A of dengue virus is an integral membrane protein inducing membrane alterations in a 2K-regulated manner // J Biol Chem. – 2007. – V. 282. – P. 8873–8882. 190. Miller S., Sparacio S., Bartenschlager R. Subcellular localization and membrane topology of the Dengue virus type 2 Non-structural protein 4B // J Biol Chem. – 2006. – V. 281. – P. 8854–8863. 191. Miorin L., Romero-Brey I., Maiuri P., Hoppe S., Krijnse-Locker J., Bartenschlager R., Marcello A. Three-dimensional architecture of tick-borne encephalitis virus replication sites and trafficking of the replicated RNA // J Virol. – 2013. – V. 87. – P. 6469–6481. 192. Moesker B., Rodenhuis-Zybert I. A., Meijerhof T., Wilschut J., Smit J. M. Characterization of the functional requirements of West Nile virus membrane fusion // J Gen Virol. – 2010. – V. 91. – P. 389–393. 193. Moreland N. J., Susanto P., Lim E., Tay M. Y., Rajamanonmani R., Hanson B. J., Vasudevan S. G. Phage display approaches for the isolation of monoclonal antibodies against dengue virus envelope domain III from human and mouse derived libraries // Int J Mol Sci. – 2012. – V. 13. – N 3. – P. 2618–2635. 137 194. Morozova V. V., Grigorieva A. S., Baykov I. K., Matveev A. L., Dubrovskaya V. V., Tikunova N. V., Gabibov A. G. DNA-abzymes selected from the phage display library of antibodies of multiple sclerosis patients // FEBS Journal. – 2013. – V. 280. – Supp. 1. – P. 432. 195. Morrey J. D., Siddharthan V., Olsen A. L., Wang H., Julander J. G., Hall J. O., Li H., Nordstrom J. L., Koenig S., Johnson S., Diamond M. S. Defining limits of treatment with humanized neutralizing monoclonal antibody for West Nile virus neurological infection in a hamster model // Antimicrob Agents Chemother. – 2007. – V. 51. – N 7. – P. 2396–2402. 196. Morrison S. L., Johnson M. J., Herzenberg L. A., Oi V. T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1984. – V. 81. – N 21. – P. 6851–6855. 197. Mukhopadhyay S., Kuhn R. J., Rossmann M. G. A structural perspective of the flavivirus life cycle // Nat Rev Microbiol. – 2005. – V. 3. – P. 13–22. 198. Mukhopadhyay S., Kim B. S., Chipman P. R., Rossmann M. G., Kuhn R. J. Structure of West Nile virus // Science. – 2003. – V. 302. – N 5643. – P. 248. 199. Muyldermans S. Nanobodies: natural Biochem. – 2013. – V. 82. – P. 775–797. single-domain antibodies // Annu Rev doi: 10.1146/annurev-biochem-063011- 092449. 200. Navarro-Sanchez E., Altmeyer R., Amara A., Schwartz O., Fieschi F., Virelizier J. L., Arenzana-Seisdedos F., Després P. Dendritic-cell-specific ICAM 3-grabbing nonintegrin is essential for the productive infection of human dendritic cells bymosquitocell-derived dengue virus // EMBO Rep. – 2003. – V. 4. – N 7. – P. 723–728. 201. Nawa M., Takasaki T., Yamada K. -I., Kurane I., Akatsuka T. Interference in Japanese encephalitis virus infection of vero cells by a cationic amphiphilic drug, chlorpromazine // J Gen Virol. – 2003. – V. 84. – Pt. 7. – P. 1737–1741. 202. Nelson A. L., Dhimolea E., Reichert J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics // Nat Rev Drug Discov. – 2010. – V. 9. – N 10. – P. 767–774. doi: 10.1038/nrd3229. 203. Nelson S., Jost C. A., Xu Q., Ess J., Martin J. E., Oliphant T., Whitehead S. S., Durbin A. P., Graham B. S., Diamond M. S., Pierson T. C. Maturation of West Nile virus 138 modulates sensitivity to antibody-mediated neutralization // PLoS Pathog. – 2008. – V. 4. – N 5. – P. e1000060. 204. Noda M., Masrinoul P., Punkum C., Pipattanaboon C., Ramasoota P., Setthapramote C., Sasaki T., Sasayama M., Yamashita A., Kurosu T., Ikuta K., Okabayashi T. Limited cross-reactivity of mouse monoclonal antibodies against Dengue virus capsid protein among four serotypes // Biologics. – 2012. – V. 6. – P. 409–416. doi: 10.2147/BTT.S37792. 205. Nybakken G. E., Oliphant T., Johnson S., Burke S., Diamond M. S., Fremont D. H. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody // Nature. – 2005. – V. 437. – N 7059. – P. 764–769. 206. Oliphant T., Engle M., Nybakken G. E., Doane C., Johnson S., Huang L., Gorlatov S., Mehlhop E., Marri A., Chung K. M., Ebel G. D., Kramer L. D., Fremont D. H., Diamond M. S. Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus // Nat Med. – 2005. – V. 11. – N 5. – P. 522–530. 207. Oliphant T., Nybakken G. E., Engle M., Xu Q., Nelson C. A., Sukupolvi-Petty S., Marri A., Lachmi B. E., Olshevsky U., Fremont D. H., Pierson T. C., Diamond M. S. Antibody recognition and neutralization determinants on domains I and II of West Nile Virus envelope protein // J Virol. – 2006. – V. 80. – N 24. – P. 12149–12159. 208. Oliphant T., Nybakken G. E., Austin S. K., Xu Q., Bramson J., Loeb M., Throsby M., Fremont D. H., Pierson T. C., Diamond M. S. Induction of epitope-specific neutralizing antibodies against West Nile virus // J Virol. – 2007. – V. 81. – P. 11828–11839. 209. Pacis E., Yu M., Autsen J., Bayer R., Li F.. Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation--what affects high mannose 5 glycoform // Biotechnol Bioeng. – 2011. – V. 108. – Issue 10. – P. 2348–2358. doi: 10.1002/bit.23200. 210. Parren P. W., Burton D. R. The antiviral activity of antibodies in vitro and in vivo // Adv Immunol. – 2001. – V. 77. – P. 195–262. 211. Pastan I., Hassan R., FitzGerald D. J., Kreitman R. J. Immunotoxin treatment of cancer // Annu Rev Med. – 2007. – V. 58. – P. 221–237. 212. Pereboev A., Borisevich V., Tsuladze G., Shakhmatov M., Hudman D., Kazachinskaia E., Razumov I., Svyatchenko V., Loktev V., Yamshchikov V. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus // Antiviral Res. – 2008. – V. 77. – Issue 1. – P. 6–13. 139 213. Perera R., Kuhn R. J. Structural proteomics of dengue virus // Curr Opin Microbiol. – 2008. – V. 11. – Issue 4. – P. 369–377. 214. Perera-Lecoin M., Meertens L., Carnec X., Amara A. Flavivirus entry receptors: an update // Viruses. – 2013. – V. 6. – N 1. – P. 69–88. doi: 10.3390/v6010069. 215. Pierson T. C., Diamond M. S. Degrees of maturity: the complex structure and biology of flaviviruses // Curr Opin Virol. – 2012. – V. 2. – P. 168–175. 216. Pierson T. C., Kielian M. Flaviviruses: braking the entering // Curr Opin Virol. – 2013. – V. 3. – Issue 1. – P. 3–12. doi: 10.1016/j.coviro.2012.12.001. 217. Pierson T. C., Xu Q., Nelson S., Oliphant T., Nybakken G. E., Fremont D. H., Diamond M. S. The stoichiometry of antibody-mediated neutralization and enhancement of West Nile virus infection // Cell Host Microbe. – 2007. – V. 1. – Issue 2. – P. 135–145. 218. Pierson T. C., Diamond, M.S. Flaviviruses // In Fields Virology, 6th ed.; Knipe, D.M., Howley, P.M., Eds.; Wolters Kluwer / Lippencott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, USA, 2013. – pp. 747–794. 219. Plemper R. K. Cell entry of enveloped viruses // Curr Opin Virol. – 2011. – V. 1. – Issue 2. – P. 92–100. doi: 10.1016/j.coviro.2011.06.002. 220. Plevka P., Battisti A. J., Junjhon J., Winkler D. C., Holdaway H. A., Keelapang P., Sittisombut N., Kuhn R. J., Steven A. C., Rossmann M. G. Maturation of flaviviruses starts from one or more icosahedrally independent nucleation centres // EMBO Rep. – 2011. – V. 12. – P. 602–606. 221. Plummer T. H. Jr, Elder J. H., Alexander S., Phelan A. W., Tarentino A. L. Demonstration of peptide:N-glycosidase F activity in endo-beta-N- acetylglucosaminidase F preparations // J Biol Chem. – 1984. – V. 259. – N 17. – P. 10700–10704. 222. Presta L. G. Molecular engineering and design of therapeutic antibodies // Curr Opin Immunol. – 2008. – V. 20. – Issue 4. – P. 460–70. 223. Protopopova E., Sorokin A., Konovalova S., Kachko A., Netesov S, Loktev V. Human laminin binding protein as a cell receptor for tick-borne encephalitis virus // Zentralblatt fur Bacteriologie. – 1999. – V. 289. – Issues 5–7. – P. 632–638. doi: 10.1016/s09348840(99)80021-8 140 224. Pytela R., Pierschbacher M. D., Argraves S., Suzuki S., Ruoslahti E. Arginine– glycine–aspartic acid adhesion receptors // Methods Enzymol. – 1987. – V. 144. – P. 475–489. 225. Radosevich M., Burnouf T. Intravenous immunoglobulin G: trends in production methods, quality control and quality assurance // Vox Sang. – 2010. – V. 98. – Issue 1. – P. 12–28. doi: 10.1111/j.1423-0410.2009.01226.x. 226. Rajamanonmani R., Nkenfou C., Clancy P., Yau Y. H., Shochat S. G., SukupolviPetty S., Schul W., Diamond M. S., Vasudevan S. G., Lescar J. On a mouse monoclonal antibody that neutralizes all four dengue virus serotypes // J Gen Virol. – 2009. – V. 90. – Pt 4. – P. 799–809. doi: 10.1099/vir.0.006874-0. 227. Raju T. S., Briggs J. B., Borge S. M., Jones A. J. Species-specific variation in glycosylation of IgG: evidence for the species-specific sialylation and branch-specific galactosylation and importance for engineering recombinant glycoprotein therapeutics // Glycobiology. – 2000. – V. 10. – N 5. – P. 477–486. 228. Raju T. S. Glycosylation variations with expression systems and their impact on biological activity of therapeutic immunoglobulins // Bioprocess Int. – 2003. – V. 1. – P. 44–54. 229. Ray D., Shah A., Tilgner M., Guo Y., Zhao Y., Dong H., Deas T. S., Zhou Y., Li H., Shi P. Y. West Nile virus 5'-cap structure is formed by sequential guanine N-7 and ribose 2'-O methylations by nonstructural protein 5 // J Virol. – 2006. – V. 80. – P. 8362–8370. 230. Razumov I. A., Kazachinskaia E. I., Ternovoi V. A., Protopopova E. V., Galkina I. V., Gromashevskii V. L., Prilipov A. G., Kachko A. V., Ivanova A. V., L'vov D. K., Loktev V. B. Neutralizing monoclonal antibodies against Russian strain of the West Nile virus // Viral Immunol. – 2005. – V. 18. – Issue 3. – P. 558–368. 231. Reed L. J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Am J Hyg. – 1938. – V. 27. – P. 493–497. 232. Reichert J. M. Trends in the development and approval of monoclonal antibodies for viral infections // BioDrugs. – 2007. – V. 21. – Issue 1. – P. 1–7. 233. Remmele R. L. Jr, Callahan W. J., Krishnan S., Zhou L., Bondarenko P. V., Nichols A. C., Kleemann G. R., Pipes G. D., Park S., Fodor S., Kras E., Brems D. N. Active 141 dimer of Epratuzumab provides insight into the complex nature of an antibody aggregate // J Pharm Sci. – 2006. – V. 95. – Issue 1. – P. 126–145. 234. Rodenhuis-Zybert I. A., van der Schaar H. M., da Silva Voorham J. M., van der EndeMetselaar H., Lei H. Y., Wilschut J., Smit J. M. Immature dengue virus: a veiled pathogen? // PLoS Pathog. – 2010. – V. 6. – N 1. – P. e1000718. 235. Roehrig J. T., Bolin R. A., Kelly R. G. Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica // Virology. – 1998. – V. 246. – N 2. – P. 317–328. 236. Routier F. H., Davies M. J, Bergemann K., Hounsell E. F. The glycosylation pattern of humanized IgGI antibody (D1.3) expressed in CHO cells // Glycoconj J. – 1997. – V. 14. – Issue 2. – P. 201–207. 237. Růžek D., Dobler G., Niller H. H. May early intervention with high dose intravenous immunoglobulin pose a potentially successful treatment for severecases of tick-borne encephalitis? // BMC Infect Dis. – 2013. – V. 13. – P. 306. 238. Sambrook J., Russell D. W., Molecular cloning - a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001 239. Sánchez M. D., Pierson T. C., McAllister D., Hanna S. L., Puffer B. A., Valentine L. E., Murtadha M. M., Hoxie J. A., Doms R. W. Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus // Virology. – 2005. – V. 336. – Issue 1. – P. 70–82. 240. Sanchez-San Martin C., Liu C. Y., Kielian M. Dealing with low pH: entry and exit of alphaviruses and flaviviruses // Trends Microbiol. – 2009. – V. 17. – Issue 11. – P. 514– 521. 241. Sautto G., Mancini N., Gorini G., Clementi M., Burioni R. Possible future monoclonal antibody (mAb)-based therapy against arbovirus infections // Biomed Res Int. – 2013. – V. 2013. – P. 838491. doi: 10.1155/2013/838491. 242. Saylor C., Dadachova E., Casadevall A. Monoclonal antibody-based therapies for microbial diseases // Vaccine. – 2009. – V. 27. – Suppl. 6. – P. G38–46. 243. Shade K. C., Anthony R. M. Antibody glycosylation and inflammation // Antibodies. – 2013. – V. 2. – P. 392–414. 244. Shah P., Reece-Ford M., Dong S., Goodall M., Pidaparthi S., Jefferis R., Jenkins N. Physiological Influences on Recombinant IgG Glycosylation // Biochem Soc Trans. – 1998. – V. 26. – P. S114. 142 245. Shapira A., Benhar I. Toxin-based therapeutic approaches // Toxins (Basel). – 2010. – V. 2. – N 11. – P. 2519–2583. doi: 10.3390/toxins2112519. 246. Sharkey R. M., Goldenberg D. M. Use of antibodies and immunoconjugates for the therapy of more accessible cancers // Adv Drug Deliv Rev. – 2008. – V. 60. – Issue 12. – P. 1407–1420. doi: 10.1016/j.addr.2008.04.011. 247. Shrestha B., Brien J. D., Sukupolvi-Petty S., Austin S. K., Edeling M. A., Kim T., O'Brien K. M., Nelson C. A., Johnson S., Fremont D. H., Diamond M. S. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1 // PLoS Pathog. – 2010. – V. 6. – N 4. – P. e1000823. doi: 10.1371/journal.ppat.1000823. 248. Shukra A. M., Sridevi N. V., Dev Chandran, Kapil Maithal. Production of recombinant antibodies using bacteriophages // Eur J Microbiol Immunol (Bp). – 2014. – V. 4. – N 2. – P. 91–98. doi: 10.1556/EuJMI.4.2014.2.1. 249. Shulman M., Wilde C. D., Köhler G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies // Nature. – 1978. – V. 276. – N 5685. – P. 269–270. 250. Simmons M., Murphy G. S., Hayes C. G. Short report: Antibody responses of mice immunized with a tetravalent dengue recombinant protein subunit vaccine // Am J Trop Med Hyg. – 2001a. – V. 65. – N 2. – P. 159–161. 251. Simmons M., Murphy G. S., Kochel T., Raviprakash K., Hayes C. G. Characterization of antibody responses to combinations of a dengue-2 DNA and dengue-2 recombinant subunit vaccine // Am J Trop Med Hyg. – 2001b. – V. 65. – P. 420–426. 252. Simmons M., Nelson W. M., Wu S. J., Hayes C. G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice // Am J Trop Med Hyg. – 1998a. – V. 58. – P. 655–662. 253. Simmons M., Porter K. R., Escamilla J., Graham R., Watts D. M., Eckels K. H., Hayes C. G. Evaluation of recombinant dengue viral envelope B domain protein antigens for the detection of dengue complex-specific antibodies // Am J Trop Med Hyg. – 1998b. – V. 58. – P. 144–151. 254. Siontorou C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy // Int J Nanomedicine. – 2013. – V. 8. – P. 4215–4227. 255. Sjobring U., Bjorck L., Kastern W. Streptococcal protein G. Gene structure and protein binding properties // J Biol Chem. – 1991. – V. 266. – N 1. – P. 399–405. 143 256. Smith G. P. Sequence of the full-length immunoglobulin kappa-chain of mouse myeloma MPC 11 // Biochem J. – 1978. – V. 171. – N 2. – P. 337–347. 257. Smith S. A., de Alwis A. R., Kose N., Harris E., Ibarra K. D., Kahle K. M., Pfaff J. M., Xiang X., Doranz B. J., de Silva A. M., Austin S. K., Sukupolvi-Petty S., Diamond M. S., Crowe J. E. Jr. The potent and broadly neutralizing human dengue virus-specific monoclonal antibody 1C19 reveals a unique cross-reactive epitope on the bc loop of domain II of the envelope protein // MBio. – 2013. – V. 4. – N 6. – P. e00873–13. doi: 10.1128/mBio.00873-13. 258. Stadlmann J., Weber A., Pabst M., Anderle H., Kunert R., Ehrlich H. J., Peter Schwarz H., Altmann F. A close look at human IgG sialylation and subclass distribution after lectin fractionation // Proteomics. – 2009. – V. 9. – Issue 17. – P. 4143–4153. doi: 10.1002/pmic.200800931. 259. Stiasny K., Kiermayr S., Bernhart A., Heinz F. X. The membrane-proximal "stem" region increases the stability of the flavivirus E protein postfusion trimer and modulates its structure // J Virol. – 2013. – V. 87. – N 17. – P. 9933–9938. 260. Stiasny K., Brandler S., Kossl C., Heinz F. X. Probing the flavivirus membrane fusion mechanism by using monoclonal antibodies // J Virol. – 2007. – V. 81. – N 20. – P. 11526–11531. 261. Suksanpaisan L., Susantad T., Smith D. R. Characterization of dengue virus entry into HepG2 cells // J Biomed Sci. – 2009. – V. 16. – P. 17. 262. Sukupolvi-Petty S., Austin S. K., Engle M., Brien J. D., Dowd K. A., Williams K. L., Johnson S., Rico-Hesse R., Harris E., Pierson T. C., Fremont D. H., Diamond M. S. Structure and function analysis of therapeutic monoclonal antibodies against dengue virus type 2 // J Virol. – 2010. – V. 84. – P. 9227–9239. 263. Sukupolvi-Petty S., Austin S. K., Purtha W. E., Oliphant T., Nybakken G. E., Schlesinger J. J., Roehrig J. T., Gromowski G. D., Barrett A. D., Fremont D. H., Diamond M. S. Type- and subcomplex-specific neutralizing antibodies against domain III of dengue virus type 2 envelope protein recognize adjacent epitopes // J Virol. – 2007. – V. 81. – P. 12816–12826. 264. Sukupolvi-Petty S., Brien J. D., Austin S. K., Shrestha B., Swayne S., Kahle K., Doranz B. J., Johnson S., Pierson T. C., Fremont D. H., Diamond M. S.. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope 144 exposure that impacts neutralization and protection // J Virol. – 2013. – V. 87. – N 16. – P. 8826–8842. doi: 10.1128/JVI.01314-13. 265. Suss J. Tick-borne encephalitis 2010: epidemiology, risk areas, and virus strains in Europe and Asia—an overview // Ticks Tick Borne Dis. – 2011. – V. 2. – N. 1. – P. 2– 15. 266. Suzuki T., Ishii-Watabe A., Tada M., Kobayashi T., Kanayasu-Toyoda T., Kawanishi T., Yamaguchi T. Importance of neonatal FcR in regulating the serum half-life of therapeutic proteins containing the Fc domain of human IgG1: a comparative study of the affinity of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins to human neonatal FcR // J Immunol. – 2010. – V. 184. – N 4. – P. 1968–1976. 267. Svasti J., Milstein C. The complete amino acid sequence of a mouse kappa light chain // Biochem J. – 1972. – V. 128. – N 2. – P. 427–444. 268. Taggart R. T., Samloff I. M. Stable antibody-producing murine hybridomas // Science. – 1983. – V. 219. – N 4589. – P. 1228–1230. 269. Tassaneetrithep B., Burgess T. H., Granelli-Piperno A., Trumpfheller C., Finke J., Sun W., Eller M. A., Pattanapanyasat K., Sarasombath S., Birx D. L., Steinman R. M., Schlesinger S., Marovich M. A. DC-SIGN (CD209) mediates dengue virus infection of human dendritic cells // J Exp Med. – 2003. – V. 197. – P. 823–829. 270. Thakur M. S., Ragavan K. V. Biosensors in food processing // J Food Sci Technol. – 2013. – V. 50. – N 4. – P. 625–641. doi: 10.1007/s13197-012-0783-z. 271. Thepparit C., Smith D. R. Serotype-specific entry of dengue virus into liver cells: identification of the 37-kilodalton/67 kilodalton high-affinity laminin receptor as dengue virus serotype 1 receptor // J Virol. – 2004. – V. 78. – N 22. – P. 12647–12656. 272. Thibodeaux B. A., Garbino N. C., Liss N. M., Piper J., Schlesinger J. J., Blair C. D., Roehrig J. T. A humanized IgG but not IgM antibody is effective in prophylaxis and therapy of yellow fever infection in an AG129/17D-204 peripheral challenge mouse model // Antiviral Res. – 2012. – V. 94. – Issue 1. – P. 1–8. 273. Thompson B. S., Moesker B., Smit J. M., Wilschut J., Diamond M. S., Fremont D. H. A therapeutic antibody against West Nile virus neutralizes infection by blocking fusion within endosomes // PLoS Pathog. – 2009. – V. 5. – N 5. – P. e1000453. 274. Throsby M., Geuijen C., Goudsmit J., Bakker A. Q., Korimbocus J., Kramer R. A., Clijsters-van der Horst M., de Jong M., Jongeneelen M., Thijsse S., Smit R., Visser 145 T. J., Bijl N., Marissen W. E., Loeb M., Kelvin D. J., Preiser W., ter Meulen J., de Kruif J. Isolation and characterization of human monoclonal antibodies from individuals infected with West Nile Virus // J Virol. – 2006. – V. 80. – N 14. – P. 6982–6992. 275. Thurber G. M., Schmidt M. M., Wittrup K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance // Adv Drug Deliv Rev. – 2008. – V. 60. – Issue 12. – P. 1421–1434. 276. Tohidkia M. R., Barar J., Asadi F., Omidi Y. Molecular considerations for development of phage antibody libraries // J Drug Target. – 2012. – V. 20. – N 3. – P. 195–208. doi: 10.3109/1061186X.2011.611517. 277. Tscheliessnig A., Satzer P., Hammerschmidt N., Schulz H., Helk B., Jungbauer A. Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies //J Biotechnol. – 2014. – V. 188. – P. 17–28. doi: 10.1016/j.jbiotec.2014.07.436. 278. Tsekhanovskaya N. A., Matveev L. E., Rubin S. G., Karavanov A. S., Pressman E. K. Epitope analysis of tick-borne encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype) // Virus Res. – 1993. – V. 30. – Issue 1. – P. 1–16. 279. van Berkel P. H., Gerritsen J., Perdok G., Valbjørn J., Vink T., van de Winkel J. G., Parren P. W. N-linked glycosylation is an important parameter for optimal selection of cell lines producing biopharmaceutical human IgG // Biotechnol Prog. – 2009. – V. 25. – Issue 1. – P. 244–251. doi: 10.1002/btpr.92. 280. van der Most R. G., Corver J., Strauss J. H. Mutagenesis of the RGD motif in the yellow fever virus 17D envelope protein // Virology. – 1999. – V. 265. – Issue 1. – P. 83–95. 281. van der Schaar H. M., Rust M. J., Chen C., van der Ende-Metselaar H., Wilschut J., Zhuang X., Smit J. M. Dissecting the cell entry pathway of dengue virus by singleparticle tracking in living cells // PLoS Pathog. – 2008. – V. 4. – P. e1000244. 282. Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions // Front Immunol. – 2014. – V. 5. – P. 520. 283. Vogt M. R., Dowd K. A., Engle M., Tesh R. B., Johnson S., Pierson T. C., Diamond M. S. Poorly neutralizing cross-reactive antibodies against the fusion loop of West Nile virus envelope protein protect in vivo via Fcgamma receptor and complement- 146 dependent effector mechanisms // J Virol. – 2011. – V. 85. – N 22. – P. 11567–11580. doi: 10.1128/JVI.05859-11 284. Vogt M. R., Moesker B., Goudsmit J., Jongeneelen M., Austin S. K., Oliphant T., Nelson S., Pierson T. C., Wilschut J., Throsby M., Diamond M. S. Human monoclonal antibodies induced by natural infection against West Nile virus neutralize at a postattachment step // J Virol. – 2009. – V. 83. – N 13. – P. 6494–6507. 285. Volk D. E., Beasley D. W., Kallick D. A., Holbrook M. R., Barrett A. D., Gorenstein D. G. Solution structure and antibody binding studies of the envelope protein domain III from the New York strain of West Nile virus // J Biol Chem. – 2004. – V. 279. – P. 38755–38761. 286. Wahala W. M., Donaldson E. F., de Alwis R., Accavitti-Loper M. A., Baric R. S., de Silva A. M. Natural strain variation and antibody neutralization of dengue serotype 3 viruses // PLoS Pathog. – 2010. – V. 6. – P. e1000821. 287. Wahala W. M., Kraus A. A., Haymore L. B., Accavitti-Loper M. A., de Silva A. M. Dengue virus neutralization by human immune sera: role of envelope protein domain III-reactive antibody // Virology. – 2009. – V. 392. – Issue 1. – P. 103–113. doi: 10.1016/j.virol.2009.06.037. 288. Wang W., Singh S., Zeng D. L., King K., Nema S. Antibody structure, instability, and formulation // J Pharm Sci. – 2007. – V. 96. – Issue 1. – P. 1–26. 289. Wang Z., Raifu M., Howard M., Smith L., Hansen D., Goldsby R., Ratner D. Universal PCR amplification of mouse immunoglobulin gene variable regions: the design of degenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase 3' to 5' exonuclease activity // J Immunol Methods. – 2000. – V. 233. – N 1–2. – P. 167–177. 290. Welsch S., Miller S., Romero-Brey I., Merz A., Bleck C. K., Walther P., Fuller S. D., Antony C., Krijnse-Locker J., Bartenschlager R. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites // Cell Host Microbe. – 2009. – V. 5. – Issue 4. – P. 365–375. 291. Westaway E. G., Mackenzie J. M., Khromykh A. A. Replication and gene function in Kunjin virus // Curr Top Microbiol Immunol. – 2002. – V. 267. – P. 323–351. 292. Wong S. J., Boyle R. H., Demarest V. L., Woodmansee A. N., Kramer L. D., Li H., Drebot M., Koski R. A., Fikrig E., Martin D. A., Shi P. Y. Immunoassay targeting nonstructural protein 5 to differentiate West Nile virus infection from dengue and St. 147 Louis encephalitis virus infections and from flavivirus vaccination // J Clin Microbiol. – 2003. – V. 41. – P. 4217–4223. 293. Xie X., Gayen S., Kang C., Yuan Z., Shi P.Y. Membrane topology and function of dengue virus NS2A protein // J Virol. – 2013. – V. 87. – P. 4609–4622. 294. Yamane-Ohnuki N., Satoh M. Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation // MAbs. – 2009. – V. 1. – Issue 3. – P. 230–236. 295. Yu I. M., Zhang W., Holdaway H. A., Li L., Kostyuchenko V. A., Chipman P. R., Kuhn R. J., Rossmann M. G., Chen J. Structure of the immature dengue virus at low pH primes proteolytic maturation // Science. – 2008. – V. 319. – N 5871. – P. 1834–1837. 296. Yuasa N., Ogawa H., Koizumi T., Tsukamoto K., Matsumoto-Takasaki A., Asanuma H., Nakada H., Fujita-Yamaguchi Y. Construction and expression of anti-Tn-antigenspecific single-chain antibody genes from hybridoma producing MLS128 monoclonal antibody // J Biochem. – 2012. – V. 151. – Issue 4. – P. 371–381. doi: 10.1093/jb/mvs007. 297. Zack D. J., Wong A. L., Stempniak M., Weisbart R. H. Two kappa immunoglobulin light chains are secreted by an anti-DNA hybridoma: implications for isotypic exclusion // Mol Immunol. – 1995. – V. 32. – Issue 17–18. – P. 1345–1353. 298. Zakut R., Cohen J., Givol D. Cloning and sequence of the cDNA corresponding to the variable region of immunoglobulin heavy chain MPC11 // Nucleic Acids Res. – 1980. – V. 8. – N 16. – P. 3591–3601. 299. Zauner G., Selman M. H., Bondt A., Rombouts Y., Blank D., Deelder A. M., Wuhrer M. Glycoproteomic analysis of antibodies // Mol Cell Proteomics. – 2013. – V. 12. – N 4. – P. 856–865. doi: 10.1074/mcp.R112.026005. 300. Zhang W., Chipman P. R., Corver J., Johnson P. R., Zhang Y., Mukhopadhyay S., Baker T. S., Strauss J. H., Rossmann M. G., Kuhn R. Visualization of membrane protein domains by cryo-electron microscopy of dengue virus // Nat Struct Biol. – 2003. – V. 10. – P. 907–912. 301. Zhang W., Kaufmann B., Chipman P. R., Kuhn R. J., Rossmann M. G. Membrane curvature in flaviviruses // J Struct Biol. – 2013. – V. 183. – P. 86–94. 302. Zhang X., Ge P., Yu X., Brannan J. M., Bi G., Zhang Q., Schein S., Zhou Z. H. CryoEM structure of the mature dengue virus at 3.5-Å resolution // Nat Struct Mol Biol. – 2013. – V. 20. – N 1. – P. 105–110. doi: 10.1038/nsmb.2463. 148 303. Zhang Y., Corver J., Chipman P. R., Zhang W., Pletnev S. V., Sedlak D., Baker T. S., Strauss J. H., Kuhn R. J., Rossmann M. G. Structures of immature flavivirus particles // EMBO J. – 2003. – V. 22. – P. 2604–2613. 304. Zhang Y., Kaufmann B., Chipman P. R., Kuhn R. J., Rossmann M. G. Structure of immature West Nile virus // J Virol. – 2007. – V. 81. – P. 6141–6145. 305. Zhou Y., Ray D., Zhao Y., Dong H., Ren S., Li Z., Guo Y., Bernard K. A., Shi P. Y., Li H. Structure and function of flavivirus NS5 methyltransferase // J Virol. – 2007. – V. 81. – P. 3891–3903. 149 ПРИЛОЖЕНИЕ Приложение 1. Предполагаемые триптические фрагменты лёгкой цепи light_14D5a МКА 14D5. значение m/z для [M+H]+ 1881.92 Пептид DIVMTQTTSSLSASLGDR Положе ние 1-18 VTISCR 678.36 19-24 ASQDIR 689.36 25-30 NYLNWYQQKPDGSVK 1839.90 31-45 LLIYYTSR LQSGVPSR FSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQEGGTL PR TFGGGTK LEIK ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFY PK DINVK 1028.58 843.47 46-53 54-61 3743.70 62-96 667.34 502.32 97-103 104-107 3514.72 109-142 588.33 143-147 IDGSER QNGVLNSWTDQDSK 676.32 1591.73 150-155 156-169 DSTYSMSSTLTLTK DEYER 1534.73 711.29 170-183 184-188 HNSYTCEATHK 1290.55 189-199 832.48 523.26 200-207 208-211 TSTSPIVK SFNR Возможные модификации MSO: 1897.92 Cys_PAM: 749.40 Cys_PAM: 3814.74 Cys_PAM: 3585.76 MSO: 1550.75 Cys_PAM: 1361.59 Примечание: указаны моноизотопные массы ионов [M+H]+, фрагменты массой менее 500 дальтон не указаны. Серым цветом обозначены пептиды константных доменов антитела. Cys_PAM – пропионамид цистеина, MSO – окисленный остаток метионина (метионин сульфоксид). 150 Приложение 2. Предполагаемые триптические фрагменты лёгкой цепи light_14D5b МКА 14D5. DIVMTQSHK значение m/z для [M+H]+ 1058.53 FMSTSVGDR VSITCK Пептид Положе ние Возможные модификации 1-9 MSO: 1074.53 999.46 10-18 650.35 19-24 MSO: 1015.45 Cys_PAM: 721.39 ASQDVSTTVAWYQQKPGQSPK 2306.14 25-45 LLIYSASYR 1085.60 46-54 807.40 55-61 4453.02 62-103 502.32 104-107 3514.72 109-142 588.33 143-147 IDGSER QNGVLNSWTDQDSK 676.32 1591.73 150-155 156-169 DSTYSMSSTLTLTK 1534.73 170-183 711.29 184-188 1290.55 189-199 832.48 523.26 200-207 208-211 YTGVPDR FTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYS TPPTFGGGTK LEIK ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFY PK DINVK DEYER HNSYTCEATHK TSTSPIVK SFNR Cys_PAM: 4524.06 Cys_PAM: 3585.76 MSO: 1550.75 Cys_PAM: 1361.59 Примечание: указаны моноизотопные массы ионов [M+H]+, фрагменты массой менее 500 дальтон не указаны. Серым цветом обозначены пептиды константных доменов антитела. Cys_PAM – пропионамид цистеина, MSO – окисленный остаток метионина (метионин сульфоксид). 151 Приложение 3. Предполагаемые триптические фрагменты VL-домена VL14D5c антитела 14D5. значение m/z для [M+H]+ 1887.00 Пептид EIVMTQSPASLAVSLGQR ATISCR Положе ние 1-18 650.33 19-24 ASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPK LLIYR 2868.31 677.43 25-49 50-54 ASNLESGIPAR 1114.59 55-65 697.33 66-72 3544.55 73-103 546.33 106-110 FSGSGSR TDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPHSDR ATNLK Возможные модификации MSO: 1903.00 Cys_PAM: 721.37 MSO: 2884.30 Cys_PAM: 3615.58 Примечание: указаны моноизотопные массы ионов [M+H]+, фрагменты массой менее 500 дальтон не указаны. Cys_PAM – пропионамид цистеина, MSO – окисленный остаток метионина (метионин сульфоксид). 152 Приложение 4. Встречаемость сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции в функциональных участках зародышевых генов антител человека Эндонуклеаза ApaLI AscI BamHI BglII BssHII BstEII ClaI EagI EcoRI EcoRV HaeIII HindIII KpnI NcoI NdeI NheI NotI PstI PvuI SacI SacII SalI SmaI SpeI SphI SfiI XbaI XhoI Узнаваемая VH VK VL D (25) JH (6) JK (5) JL (4) последовательность (51)* (40) (31) GTGCAC 2 0 2 0 0 0 0 GGCGCGCC 0 0 0 0 0 0 0 GGATCC 14 0 15 0 0 0 0 AGATCT 12 0 0 0 0 0 0 GCGCGC 0 0 0 0 0 0 0 GGTNACC 4 0 8 0 5 0 1 ATCGAT 0 0 0 0 0 0 0 CGGCCG 23 0 0 0 0 0 0 GAATTC 0 4 0 0 0 0 0 GATATC 1 0 0 0 1 1 0 (AG)GCGC(CT) 3 4 3 0 0 0 0 AAGCTT 1 0 2 0 0 0 0 GGTACC 0 18 23 0 0 0 0 CCATGG 0 0 1 0 0 0 0 CATATG 4 0 3 0 0 0 0 GCTAGC 0 0 0 0 0 0 0 GCGGCCGC 0 0 0 0 0 0 0 CTGCAG 14 33 4 0 0 0 0 CGATCG 0 0 1 0 0 0 0 GAGCTC 11 1 1 0 0 0 0 CCGCGG 8 0 0 0 0 0 0 GTCGAC 0 0 0 0 0 0 0 CCCGGG 2 1 4 0 0 0 0 ACTAGT 2 0 1 0 0 0 0 GCATGC 3 9 1 0 0 0 0 GGCCNNNNNGGCC 0 0 0 0 0 0 0 TCTAGA 0 0 0 0 0 0 0 CTCGAG 0 3 0 0 0 0 0 * В скобках указано общее число участков этого типа в геноме человека. Переведено с сайта URL: http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/restriction2.php (дата обращения: 31.07.2015) 153 Приложение 5. Предполагаемые триптические фрагменты тяжёлых цепей антител ch14D5a и ch14D5b. значение m/z для [M+H]+ 1926.05 Пептид EVQLLESGAELAKPGASVK ASGYIFTNYWMHWVK QRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNQR Положе ние 1-19 1902.90 2927.41 24-38 39-63 522.29 719.39 64-67 68-74 SSSTADMQLNSLTSEDSAVYYCVR 2627.16 75-98 EGFALDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSK 2317.13 1186.65 99-120 121-132 STSGGTAALGCLVK 1264.66 133-146 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK 6656.29 147-209 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 2730.41 222-247 835.43 248-254 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK 2082.01 255-273 FNWYVDGVEVHNAK 1677.80 274-287 TKPR EEQYNSTYR (не гликозилирован) 501.31 1189.51 288-291 292-300 VVSVLTVLHQDWLNGK ALPAPIEK 1808.01 838.50 301-316 326-333 EPQVYTLPPSR EEMTK 1286.67 637.29 344-354 355-359 NQVSLTCLVK 1104.61 360-369 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDK 2544.13 1873.92 575.34 370-391 392-408 409-413 FIDK ATLTADK DTLMISR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK Возможные модификации 2744.25 416-438 788.45 439-446 MSO: 1918.89 Cys_PAM: 2698.20 MSO: 2643.16 Cys_PAM: 1335.69 Cys_PAM: 6727.33 Cys_PAM: 2872.49 MSO: 851.43 Cys_PAM: 2153.04 MSO: 653.28 Cys_PAM: 1175.65 Cys_PAM: 2815.28 MSO: 2760.24 Примечание: указаны моноизотопные массы ионов [M+H]+, фрагменты массой менее 500 дальтон не указаны. Серым цветом обозначены пептиды константных доменов антитела. Cys_PAM – пропионамид цистеина, MSO – окисленный остаток метионина (метионин сульфоксид). 154 Приложение 6. Предполагаемые триптические фрагменты лёгкой цепи антитела ch14D5a. значение m/z для [M+H]+ 1863.91 Пептид DIVMTQSPSSLSASLGDR VTISCR Положе ние 1-18 678.36 19-24 ASQDIR NYLNWYQQKPDGSVK 689.36 1839.90 25-30 31-45 LLIYYTSR LQSGVPSR FSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQEGGTL PR TFGGGTK 1028.58 843.47 46-53 54-61 3743.70 62-96 667.34 97-103 LEIK TVAAPSVFIFPPSDEQLK 502.32 1946.03 104-107 109-126 SGTASVVCLLNNFYPR 1740.87 127-142 560.32 146-149 VDNALQSGNSQESVTEQDSK 2135.97 150-169 DSTYSLSSTLTLSK ADYEK 1502.76 625.28 170-183 184-188 VYACEVTHQGLSSPVTK 1818.90 191-207 523.26 208-211 VQWK SFNR Возможные модификации MSO: 1879.91 Cys_PAM: 749.40 Cys_PAM: 3814.74 Cys_PAM: 1811.91 Cys_PAM: 1889.94 Примечание: указаны моноизотопные массы ионов [M+H]+, фрагменты массой менее 500 дальтон не указаны. Серым цветом обозначены пептиды константных доменов антитела. Cys_PAM – пропионамид цистеина, MSO – окисленный остаток метионина (метионин сульфоксид). 155 Приложение 7. Предполагаемые триптические фрагменты лёгкой цепи антитела ch14D5b. DIVMTQSHK значение m/z для [M+H]+ 1058.53 FMSTSVGDR VSITCK Пептид Положе ние Возможные модификации 1-9 MSO: 1074.53 999.46 10-18 650.35 19-24 MSO: 1015.45 Cys_PAM: 721.39 ASQDVSTTVAWYQQKPGQSPK 2306.14 25-45 LLIYSASYR 1085.60 46-54 807.40 55-61 4453.02 62-103 502.32 1946.03 104-107 109-126 SGTASVVCLLNNFYPR 1740.87 127-142 VQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSK 560.32 2135.97 146-149 150-169 DSTYSLSSTLTLSK 1502.76 170-183 625.28 184-188 1818.90 191-207 523.26 208-211 YTGVPDR FTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYS TPPTFGGGTK LEIK TVAAPSVFIFPPSDEQLK ADYEK VYACEVTHQGLSSPVTK SFNR Cys_PAM: 4524.06 Cys_PAM: 1811.91 Cys_PAM: 1889.94 Примечание: указаны моноизотопные массы ионов [M+H]+, фрагменты массой менее 500 дальтон не указаны. Серым цветом обозначены пептиды константных доменов антитела. Cys_PAM – пропионамид цистеина, MSO – окисленный остаток метионина (метионин сульфоксид). 156 БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю свою искреннюю благодарность научному руководителю Нине Викторовне Тикуновой за терпение, помощь при подготовке диссертации и доброжелательно-критический анализ работы. Спасибо сотрудникам института и коллегам из нашей большой лаборатории за поддержку, ценные советы и дружную атмосферу. Спасибо всем, кто научил, объяснил и не пожалел времени – вас много, и я вам всем очень благодарен. Отдельно выражаю благодарность любимой жене Маше и детям Саше и Соне за терпение, поддержку и участие. Спасибо вам =) 157
