Диагностика диарогенных эшерихиозов

Диагностика диарогенных
эшерихиозов
Коновалова Татьяна Александровна
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
г. Москва
Краткое содержание
- Диарогенные эшерихиозы
- Классические подходы к диагностике
- Альтернативные подходы к диагностике
- Результаты их сравнения
Клинико-эпидемиологическая классификация
E.coli
Диарогенные E. coli
Группа диарогенных E. coli
Источники изоляции
Энтеропатогенные
(Enteropathogenic E.coli – EPEC)
Причина диареи у людей,
собак, кроликов, кошек,
лошадей
Причина диареи у людей,
свиней, овец, коз, КРС,
собак, лошадей
Человек, КРС
Энтеротоксигенные
(Enterotoxigenic E.coli – ETEC)
Энтерогеморрагические
(Enterohemorragic E.coli – EHEC)
Энтероинвазивные
(Enteroinvasive E.coli – EIEC)
Энтероаггрегативные
(Enteroaggregative E.coli – EAgEC)
Диффузно-адгерентные
(Diffusely Adherent E.coli - DAEC)
Только человек
Только человек
Только человек ?
Эпидемиологические особенности
диарогенных эшерихиозов
EHEC – зооноз, естественный резервуар – крупный рогатый скот, реже –
мелкий рогатый скот, свиньи, собаки, куры. Низкая инфицирующая доза.
Пищевой, реже водный путь передачи.
ETEC – антропоноз. Максимальная заболеваемость у детей после
прекращения грудного вскармливания. Высокая инфицирующая доза.
Контактной передачи не описано.
EPEC – антропоноз. Максимальная заболеваемость у детей до 2 лет.
Клиническая значимость обнаружения в фекалиях максимальна у детей до 6
мес, в старшем возрасте высока частота бессимптомного носительства.
Наиболее распространенный бактериальный возбудитель ОКИ среди детей в
возрасте до 5 лет в развитых странах.
EIEC
–
антропоноз.
Эпидемиология
инфицирующая доза выше.
сходна
с
шигеллезами,
но
EAgEC – антропоноз. В основном – спорадическая заболеваемость. У части
пациентов в форме длительного (~14 дней) энтерита без фебриллитета.
DAEC – антропоноз? Эпидемиология изучена недостаточно.
Классические подходы к
диагностике
Алгоритм микробиологических исследований
на энтеробактериевые (Приказ №535 22.04.85)
1 день – посев на среды с лактозой (Эндо, среда Левина, SS агар,
ЭМС агар и др.) При исследовании фекалий (дополнительно) –
кровяной агар, висмут-сульфит агар или Плоскирева.
«намеченные для дальнейшего изучения колонии снимают
бактериологической петлей»
2 день – родовая
биохимическая идентификация
3 день – видовая биохимическая
идентификация
Серологическая
идентификация
Как «намечают» колонии для дальнейшего
изучения
Утилизация лактозы
Lac+
Среда Эндо
Гемолитическая активность
Lac-
Кровяной агар
Антигенные свойства E. coli
Серогрупповая принадлежность:
соматический О-антиген – 173 типа
капсульный К-антиген – 80 типов (различаются по терморезистентности)
Серотиповая принадлежность:
жгутиковый Н-антиген – 56 типов
Серологическая характеристика
ОКА-сыворотка
Поливалентная
Содержит Ат к 22 Аг серогрупп Е.coli
«-»
Моно-сыворотки
«+»
ОКВ
ОКС
ОКД
ОКЕ
Поливалентные сыворотки более узкого спектра
Определение ОК- или О-типа
«+»
«+»
«+»
Моно-сыворотки
Определение ОК- или О-типа
Н-сыворотка 15 наименований. Используют редко (сложная методика)
«+»
Корреляция между серологическими свойствами
штаммов и патогенетической группой
ETEC
EPEC
EIEC
EHEC
EAgEC
DAEC
06; 08; 015; 020; 025; 027;
063; 078; 080; 085; 092;
0115; 0128; 0139; 0148;
0153; 0159; 0167
018; 044; 055; 086; 0111;
0112; 0114; 0119; 0125;
0126; 0127; 0128; 0142
028; 029; 0112; 0124; 0136;
0143; 0144; 0152; 0164; 0167
026; 055; 0111; 0113; 0117
0145; 0157
O3; O15; O44;O77; O86;
O111; O127
-
Основные проблемы бактериологической
диагностики
1. Широкое распространение невирулентных E.coli в
клиническом материале.
Необходимость широкого использования
дорогостоящих и малоэффективных методов
характеристики выделенных штаммов.
2. Отсутствие четкой корреляции между наличием у
штаммов определенных факторов вирулентности и их
биохимическими / серологическими свойствами.
Альтернативные подходы к
диагностике
Цель исследования:
Разработка эффективного подхода к мониторингу диарогенных
эшерихиозов как первому этапу эпидемиологического надзора
за данной группой заболеваний.
Задачи исследования:
1. Разработка инструмента для лабораторной диагностики
диарогенных эшерихиозов
2. Проведение его лабораторных и клинических испытаний
3. Сопоставление с результатами применения культуральных
тестов
4. Определение оптимальных схем применения
Генетические детерминанты
дифференцировки диарогенных E. coli
LT
термолаб
ильный
токсин
Энтеротоксигенные ETEC
+
Энтеропатогенные EPEC
Энтерогеморрагические EHEC
Энтероаггрегативные EAgEC
Энтероинвазивные EIEC
Гены ключевых факторов
вирулентности
STX1/
aggR STX2
activator of
Интимин шигопод aggregative
обные adherence
eae inv intimin токсины fimbriae
инвазин
+
±
+
+
+
Тест-система «Эшерихиозы-FL»
Дизайн теста
Канал
ПЦР-смесь-1детекции FEP/FRTEIEC/EHEC/STI
FAM
STI (ВКО)
HEX
STX1/2 (EHEC)
ROX
ipaH (EIEC)
ПЦР-смесь-1FEP/FRTEPEC/ETEC/EAgEC
aggR (EAgEC)
EAE (EPEC, EHEC)
LT (ETEC)
Интерпретация результатов
FAM
HEX
ROX
ПЦР-смесь-1- ПЦР-смесь-1- ПЦР-смесь-1- ПЦР-смесь-1- ПЦР-смесь-1- ПЦР-смесь-1FEP/FRTFEP/FRTFEP/FRTFEP/FRTFEP/FRTИнтерпретация результатов FEP/FRTEIEC/EHEC/ EPEC/ETEC/ EIEC/EHEC/ EPEC/ETEC/ EIEC/EHEC/ EPEC/ETEC/
STI
EAgEC
STI
EAgEC
STI
EAgEC
Энтеротоксигенны е ETEC
Энтеропатогенны е EPEC
Энтерогеморрагические EHEC
Энтероаггрегативны е EAgEC
Энтероинвазивны е EIEC
+
-
+
-
+
±
-
+
+
-
Положительные контроли, штаммы
контроль
штамм
источник
EAgEC
№ 4513
Клинический изолят
EPEC
137А
ГИСК
ETEC
О126 №611
ГИСК
EHEC
О157:Н7
ГИСК
EIEC
Shigella sonnei
ГИСК
Схема выделения изолятов для коллекции
1. Скрининг ДНК, выделенной из фекалий больных ОКИ, методом ПЦР с
праймерами из комплекта «Эшерихиозы-FL»
2. Посев на питательные среды отобранных после скрининга фекалий
3. Выделение чистой культуры Escherichia coli
4. Выделение ДНК из чистой культуры
5. Повторное тестирование ДНК методом ПЦР
Тестирование на специфичность
Панель штаммов для оценки
специфичности.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Enterobacter
Enterobacter
Enterococcus
Escherichia
Escherichia
Klebsiella
Pantoea
Proteus
Pseudomonas
Salmonella
Salmonella
Shigella
Shigella
Staphylococcus
Staphylococcus
Yersinia
Yersinia
Listeria
aerogenes
cloacae
faecalis
coli
coli
pneumoniae
agglomerans
mirabilis
aeruginosa
enteritidis
typhi
flexneri 2a
sonne
aureus
saprophyticus
enterocolitica
pseudotuberculosis I
monocytogenes
ГИСК 29212
NCTC 9001
ATСС25922
Выборочное подтверждение
специфичности прямым
секвенированием клинических
находок
ЕТЕС – 2 изолята
ЕНЕС – 7 изолятов
ATCC 27853
ГИСК 1137
5715
ГИСК 1270
ГИСК 9090
ATCC 25923
ATCC 15305
ЕРЕС – 9 изолятов
EAgEC – 9 изолятов
Аналитическая чувствительность
Энтероинвазивные Escherichia coli (EIEC)
30 бак. клеток/мл
Энтеротоксигенные Escherichia coli (ETEC)
300 бак. клеток/мл
Энтеропатогенные Escherichia coli (EPEC)
30 бак. клеток/мл
Энтерогеморрагические Escherichia coli (EHEC)
30 бак. клеток/мл
Энтероаггрегативные Escherichia coli (EAgEC)
300 бак. клеток/мл
Распространенность E. coli среди детей с ОКИ
Обследовались дети в возрасте до 5 лет, госпитализированные в 5 ДИБ с
ОКИ. Исследование проводилось по мере поступления материала и
ретроспективно.
Группа исследования
человек
%
Контрольная группа
человек
%
всего
1026
EPEC
98
9.55
0
0
ETEC
9
0.88
0
0
EAgEC
53
5.17
0
0
EHEC
13
1.27
0
0
57
Контрольная группа – образцы от детей без признаков острых диарейных
заболеваний в течение двух недель до обследования.
Спектр исследований –
чем больше тем лучше?
Дети в возрасте до 5 лет (n=1026)*.
%
расшифровки
% моноинфекций
% сочетанного
выявления
Shigella, Salmonella
6,92
6,82
0,1
Shigella, Salmonella, RotavirusA
43,37
42,2
1,17
Shigella, Salmonella, Rotavirus
A, Norovirus II, Astrovirus,
Campylobacter, Adenovirus
65,5
51,27
14,23
Shigella, Salmonella, Rotavirus
A, Norovirus II, Astrovirus,
Campylobacter, Adenovirus +
эшерихиозы
70,37
46,98
23,39
*Собственные данные.
Оценка валидности
Исследование лактозонегативных
изолятов E. coli
Оценка информативности отбора лактозонегативных
штаммов E.coli для детальных исследований в отношении
диарогенных изолятов E.coli.*
"Обычные" E.
coli
n
75
EHEC
1
ETEC
1
EPEC
8
EIEC
5
EAgEC
11
Лактозонегативные
E. coli
21
0
0
1
3
2
*Исследование выполняется совместно с лабораторией клинической микробиологии и
микробной экологии человека (Юдицкая Наталья Михеевна)
Исследование изолятов E. coli,
имеющих гемолитическую активность
Оценка информативности отбора штаммов E.coli, имеющих
гемолитическую активность, для детальных исследований в
отношении диарогенных изолятов E.coli.*
"Обычные" E coli E coli, имеюшие
гемолитическую
активность
n
75
27
EHEC
1
0
ETEC
1
0
EPEC
8
1
EIEC
5
1
EAgEC
11
0
*Исследование выполняется совместно с лабораторией клинической микробиологии и
микробной экологии человека (Юдицкая Наталья Михеевна).
Области применения
Клинический
материал
«-»
Тестирование
культур
«+»
При
необходимости
Бактериология
При
необходимости
Дополнительные методы
исследования
(типирование,
биохимическая характеристика,
антибиотикочувствительность)
Заключение:
1. В результате проделанной работы был разработан комплект
реагентов
для
лабораторной
диагностики
диарогенных
эшерихиозов «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» (№ ФСР 2010/070977
от 11 июня 2010 г).
2. Лабораторные и клинические испытания комплекта доказали его
высокую специфичность и достаточную для клинического
применения
аналитическую
чувствительность
30-300
бактериальных клеток/мл.
3. Широко используемые в микробиологической практике критерии
селекции изолятов E. coli для диагностики диарогенных
эшерихиозов - невалидны
4. В результате проведенных исследований можно рекомендовать
применение комплекта как для исследований клинического
материала, так и изолятов микроорганизмов.