Оптимальный метОд выделения нуклеинОвых кислОт вирусОв в

УДК 618.33 - 022.6 : 616 - 091
Н.М. Ивахнишина, Е.П. Когут, О.В. Островская
Оптимальный метод выделения нуклеиновых кислот
вирусов в секционном материале
Институт охраны материнства и детства СО РАМН, г. Хабаровск
При постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР)
ключевую роль играет этап подготовки проб. Патологоанатомический материал содержит в большом количестве
продукты некроза и аутолиза тканей и клеток, нарушенного обмена белков и липидов, ферментов, которые являются ингибиторами ПЦР [2, 4]. К началу нашей работы
не было коммерческих диагностических наборов для выделения нуклеиновых кислот внутриутробных инфекций
из секционного материала.
Цель исследования — подбор условий для получения
препаратов нуклеиновых кислот из патолого-анатомического материала, пригодных для ПЦР.
Материалы и методы
Для выбора оптимального метода выделения нуклеиновых кислот ДНК-содержащих вирусов (HSV и CMV)
из секционного материала сравнивали эффективность
пробоподготовки с помощью трех вариантов диагностических наборов, разработанных разными фирмами:
1. Фенольно-хлороформная экстракция с применением наборов «ВектоДНК-экстракция», ЗАО «Вектор-Бест»
(пос. Кольцово Новосибирской обл.) для выделения
ДНК из сывороток крови, форменных элементов крови,
мочи, слюны, слезной жидкости, ликвора, соскобов со
слизистой, культур клеток. Метод был модифицирован:
фрагменты органов предварительно измельчались и обрабатывались лизирующим раствором [3].
2. Фенольно-хлороформная обработка («ДНК/РНК
экстракция», НПФ «Литех», г. Москва, для выделения
ДНК/РНК из сыворотки и плазмы крови).
Таблица 1
Ключевые слова: вирусы, подготовка проб, фенольнохлороформная экстракция, сорбционный метод, полимеразная цепная реакция.
Key words: viruses, preparation of tests, fast culturing
method, reaction of immunofluorescence, polymerase chain
reaction.
3. Сорбционный метод выделения ДНК («Gene Pak™
DNA PCR test», OOO «Изоген», г. Москва) из мокроты,
экссудатов, плевральной и спинномозговой жидкости, из
мазков со слизистой урогенитального тракта. Для выбора оптимального метода выделения нуклеиновых кислот
РНК-вирусов — вируса краснухи (Rub) и энтеровирусов
(E/v) сравнивали методы:
1. Предварительный лизис и фенольно-хлороформная
обработка («ВектоДНК-экстракция», ЗАО «Вектор-Бест»
для выделения ДНК из крови, сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слюны, ликвора, соскобов со
слизистой, культур клеток).
2. Фенольно-хлороформная обработка («ДНК/РНК
экстракция», НПФ «Литех» для выделения ДНК/РНК из
сыворотки и плазмы крови).
3. Сорбционный метод («Gene Pak™ RNA PCR test»,
OOO «Лаборатория Изоген») для обнаружения РНК в мокроте, различных экссудатах, плевральной и спинномозговой
жидкости, в мазках со слизистой урогенитального тракта).
В дальнейшем сотрудниками ЦНИИ эпидемиологии
Роспотребнадзора (г. Москва) были разработаны наборы
«ДНК-сорб-В» для выделения ДНК из цельной крови,
биоптатов, фекальных экстрактов. Было проведено сравнительное исследование по выделению ДНК HSV и CMV
Эффективность различных способов выделения
ДНК из секционного материала
Предварительный лизис
+ фенольная
экстракция
«ВектоДНКэкстракция»
Органы /
кол-во проб
Фенольная
экстракция
«ДНК/РНКэкстракция»
Таблица 2
Эффективность различных способов выделения
РНК из секционного материала
Сорбционный
метод «Gene
Pak™ DNA
PCR test»
1
2
3
4
5
6
Органы /
кол-во проб
Предварительный лизис
+фенольная
экстракция
«ВектоДНКэкстракция»
Фенольная
экстракция
«ДНК/РНКэкстракция»
Сорбционный
метод «Gene
Pak™ RNA
PCR test»
HSV
CMV
HSV
CMV
HSV
CMV
Тимус
2
2
1
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
Мозг
9
4
2
4
0
2
0
E/v
Rub.
E/v
Rub.
E/v
Rub.
Сердце
9
1
0
0
0
0
0
Мозг
10
1
1
1
1
0
0
Легкое
9
3
3
0
1
1
0
Сердце
10
3
0
0
0
0
0
Почка
9
4
2
2
1
0
0
Легкое
10
3
0
1
0
0
0
10
4
1
2
1
1
0
Печень
9
4
2
2
2
1
1
Почка
Селезенка
8
2
1
0
1
0
0
Печень
10
2
0
0
0
0
0
Плацента
4
1
0
0
0
0
0
Селезенка
10
4
1
0
0
0
1
60
17
28,3
±5,8*
3
5,03
±2,8
3
5,0
±2,8
2
3,3
±2,3
1
1,7
±1,7
1
1,7
±1,7
Всего
(абс./%±m)
59
21
35,6
±6,2*
11
18,6
±5,1
10
16,9
±4,9
6
10,2
±3,9
4
6,8
±3,3
1
1,7
±1,6
Всего
(абс./%±m)
Примечание. * — 1 и 3; 1 и 5 — p<0,01.
Примечание. * — 1 и 3 — p<0,05; 1 и 5 — p<0,01.
104
Таблица 3
Значение ранней обработки секционного
материала для выявления РНК
Выделение РНК через
4 ч методом предварительного лизиса +
«ДНК-экстракция»
Органы /
кол-во проб
Выделение РНК через
3-5 сут методом предварительного лизиса +
«ДНК-экстракция»
Таблица 4
Выявление ДНК-вирусов при обработке секционного
материала модифицированным методом пробоподготовки
и с помощью тест-системы «ДНК-сорб-В»
Предварительный лизис
+ фенольная экстракция
«ВектоДНК-экстракция»
Органы /
кол-во проб
E/v
Rub.
E/v
Rub.
Мозг
5
0
1
0
0
Мозг
Сердце
5
2
0
0
0
Сердце
Легкое
5
0
0
0
0
Почка
5
1
1
1
Печень
5
0
0
Селезенка
5
2
Всего
(абс./%±m)
30
5
16,7±6,8
Сорбционный метод
«ДНК-сорб-В»
HSV
CMV
HSV
CMV
5
4
0
3
1
5
0
0
0
0
Легкое
5
2
2
2
2
0
Почка
5
0
1
0
1
0
0
Печень
5
0
0
0
1
0
0
0
Селезенка
5
3
2
3
2
2
6,7±4,6
1
3,3 ±3,3
0
0±11,8
Всего
(абс./%±m)
30
9
30,0±8,4
5
16,7±6,8
8
26,7±8,1
7
23,3±7,7
двумя методами: модифицированным методом фенольно-хлороформной экстракции («ВектоДНК-экстракция»,
ЗАО «Вектор -Бест») с предварительным измельчением и
лизисом секционного материала и сорбционным методом
(наборы «Амплисенс» «ДНК-сорб-В»).
Амплификацию проводили, используя тест-системы
«Амплисенс» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва). Результаты ПЦР учитывали методом
электрофореза в агарозном геле.
Результаты и обсуждение
Результаты выделения ДНК вирусов с использованием трех способов подготовки проб показаны в табл.
1. Установлено, что с помощью модифицированного нами метода ДНК HSV выявляли в 2,1-3,5 раза чаще, чем
с помощью второго и третьего методов (р<0,05; р<0,01).
ДНК CMV также выявляли в 1,8-10,9 раза чаще с помощью первого метода, чем при использовании второго и
третьего.
При сравнении методов выявления РНК-содержащих
вирусов установлено, что РНК E/v обнаруживали с помощью первого метода в 5,7-16,6 раза чаще, чем остальными
методами (р<0,01). Ампликоны РНК Rub также выявляли
в 1,5-3 раза чаще первым методом (табл. 2).
Известно, что РНК является неустойчивой структурой [1]. Для установления оптимального срока обработки
секционного материала было проведено выявление РНК
из фрагментов органов через 4 ч без замораживания и через 3 и 5 сут после хранения при t = -20С°. При обработке
материала в самые ранние сроки через 4 ч РНК E/v выявляли в 5 раз чаще. РНК Rub обнаруживали только при
раннем способе обработки (табл. 3). Для хранения очищенного препарата РНК необходимо сразу производить
реакцию обратной транскрипции (ОТ), комплиментарная ДНК при t = -20 С° хранится длительно, до 1 г. (срок
наблюдения). Аналогичное исследование в отношении
ДНК-содержащих вирусов показало, что результаты ПЦР
не зависят от срока хранения (t° хранения -20°С) очищенной нуклеиновой кислоты.
Таким образом, сравнение различных способов выявления ДНК и РНК-вирусов показало, что наиболее эффек-
тивен модифицированный нами способ с применением
дополнительного лизиса и фенольно-хлороформной экстракции с использованием наборов «ВектоДНК-экстракция». Для выявления РНК вирусов необходимо проводить
пробоподготовку не позже 4-6 ч после взятия пробы.
Сравнительное исследование двух методов выделения ДНК вирусов HSV и CMV из секционного материала:
с использованием предварительного лизиса и фенольнохлороформной экстракции («ВектоДНК-экстракция») и с
применением тест-системы «Амплисенс» «ДНК-сорб-В»
— показало, что при использовании обоих методов ДНК
вирусов выявляли практически с одинаковой частотой и
в одних и тех же образцах (табл. 4).
Таким образом, в сравнительных опытах было установлено преимущество обработки секционного материала с помощью фенольно-хлороформной экстракции
и денатурации этанолом наборами «ВектоДНК-экстракция» с предварительным размельчением и удалением
примесей лизирующим раствором. Способ был использован нами для изучения этиологической структуры фетоинфантильных потерь. Этот метод по эффективности
сопоставим с разработанным позже ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, биоптатов
и фекальных экстрактов «ДНК-сорб-В».
Ли т е р а т у р а
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.
М., 1990. 544 с.
2. Мавзютов А.Р., Бондаренко В.М., Латкин А.Т. //
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.
2003. №3. С. 93-98.
3. Пат. №2292551, Российская Федерация. МПК 51
G01№33/53 G01№1/28 (2006.01). Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных
/ О.В.Островская, Н.М. Ивахнишина, Е.Б.Наговицына и
соавт.; заявитель и патентообладатель ГУ ДНЦ ФПД СО
РАМН
4. Wilson I.G. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 10,
Р. 3741-3751.