Сергеев О.В.
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение Научноисследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Сергеев Олег Витальевич РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ (ВАКЦИНА ВЕРРЕС-ЭДС) В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор Алипер Тарас Иванович Москва 2014 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ДИАРЕЯ СВИНЕЙ 1.1. Общая характеристика и распространённость……………………………5 1.2. Этиология……………………………………………………………………7 1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней…………………………………...7 1.2.2. Систематика вируса ЭДС …………………………………………...10 1.2.3. Структура вириона…………………………………………………...10 1.2.4. Физико-химические свойства……………………………………….10 1.2.5. Структурные белки…………………………………………………..10 1.2.6. Неструктурный белок ORF3…………………………………………13 1.2.7. Структура генома…………………………………………………….13 1.2.8. Антигенное родство…………………………………………………14 1. 3. Культивирование………………………………………………………….16 1.4. Эпизоотологические данные……………………………………………...17 1.5. Патогенез…………………………………………………………………...18 1.6. Клинические признаки…………………………………………………….21 1.7. Диагностика………………………………………………………………..22 1.8. Предупреждение и контроль……………………………………………...25 1.8.1. Общие меры………………………………………………………….25 1.8.2. Специфическая иммунопрофилактика……………………………..25 1.9. Заключение по обзору литературы……………………………………….29 1.10. Цель и задачи исследования……………………………………………..33 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы……………………………………………………….34 2.2. Результаты исследований 2.2.1. Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма……………...49 2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации……………..…………………..……49 2 2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса …………………..............52 2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero……………………………...54 2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса...……..56 2.2.2.1. Состояние культуры клеток…………………………………….56 2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения……….…58 2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях……………………………………..…59 2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero………………………………….....59 2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой сухой вакцины в экспериментальных условиях ………….……..62 2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины……….…………………….........63 2.2.3.2. Контроль вакцины на безопасность и реактогенность……….70 2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС..….71 2.2.4.1. Способ введения вакцины….………………………………….. 71 2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от прививочной дозы…………………………………………. 74 2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости от кратности введения и дозы вакцины……………………...75 2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве……………………….78 2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ИС-ЭДС в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС..………………..…….…81 2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины в производственных условиях…………………………………81 2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих хозяйствах России.…………………………………………..…82 2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях….83 2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов живой вакцины против ЭДС……..………….……….……..….90 3 2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней против ЭДС и ТГС………………………………………….…...92 2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин……………..….94 2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС)…… 94 2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1…………... 95 2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС……………………………………………. 96 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ………. 98 4. ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ………… 118 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………...121 6. ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………….……………..138 4 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ДИАРЕЯ СВИНЕЙ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30 - 100%. ЭДС по клиническим признакам очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также более медленное распространение. ЭДС впервые была обнаружена в Англии в 1971 г. среди свиней в период откорма [116]. Заболевание проявлялось спорадическими вспышками энтерита в зимнее время. Основной характеристикой болезни была водянистая диарея. Данное заболевание было названо «эпизоотическая диарея типа 1». В 1976 г. наблюдали острую диарею среди свиней всех возрастов, включая подсосных поросят. Это заболевание по клиническим проявлениям напоминало ТГС и было названо «эпизоотическая диарея типа 2» [178, 179]. Этиологическим агентом обоих типов диареи являлся коронавирус, впервые выделенный и названный «вирус эпизоотической диареи свиней» в 1978 г. [106]. В течение 1980-х и 1990-х гг. ЭДС была широко распространена в странах Европы: Англии, Бельгии, Германии, Франции, Нидерландах, и Швейцарии, была зарегистрирована в Японии. В период 1995 – 2011 гг. ЭДС была зарегистрирована в Южной Корее, Китае и Таиланде. В 2013 г. заболевание было выявлено в США [39, 158]. 5 Таблица 1. Первичные вспышки ЭДС в различных странах согласно публикациям Год публикации 1978 Страна Англия Описание Источник Диарея свиней типа 2, экспериментально воспроизведена на свиньях разного возраста. В фекалиях и кишечном эпителии инфицированных животных наблюдали коронавирусные частицы Диарея свиней типа 2, экспериментально воспроизведена на свиньях. Выделен новый коронавирус, обозначенный CV777, который отличался от коронавирусов ТГС и энцефаломиелита свиней. 35 1978 Бельгия 1983 Япония Вспышка острой диареи у почти 2500 свиней одной фермы. Смертность поросят 20%. 164 1993 Чехия ЭДС выявлена в двух хозяйствах. Вирус ЭДС идентифицирован с помощью электронной микроскопии 133 1994 Бельгия Свиньи с тяжёлой диареей серопозитивными к вирусу ЭДС оказались 172 1996 Венгрия На 19 фермах обнаружена диарея у поросят подсосного возраста, выделен вирус ЭДС 111 2000 Южная Корея Китай В 304 из 639 свиноводческих хозяйств (47,6%) обнаружен вирус ЭДС 33 Выделен вирус ЭДС от поросят с тяжёлой диареей 79 2005 124 Италия Вспышка острой диареи среди свиней всех возрастов. В 63 хозяйствах установлена ЭДС на основании данных иммунной ЭМ, серологических исследований и ПЦР Китай Повторные вспышки ЭДС среди свиней, ранее иммунизированных против данного заболевания Таиланд Несколько вспышек ЭДС в период 2007-2010 гг. Диагноз поставлен на основе клинических наблюдений, гистологии и ПЦР 115, 128 2011 Китай Показано, что ЭДС в Китае впервые обнаружена в 1986 г. Использовали прямую ИФ (срезы кишечника), иммунную ЭМ и сероконверсию (РН) 38 2013 США 2008 2010 2010 679 свиней разных возрастных и технологических групп в 17 штатах 104 37 39, 158 6 Данные об основных первичных вспышках ЭДС в различных странах приведены в таблице 1. В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г. (НПО НАРВАК). В Европе вспышки ЭДС регистрировали реже, чем в Азии. В странах Азии массовые вспышки ЭДС сопровождаются высокой смертностью новорождённых поросят, которая в среднем составляет 50%, но в отдельных случаях достигает 100%. По массовости, остроте и тяжести их нельзя клинически отличить от острых вспышек ТГС. Различные особенности возникновения и течения ЭДС отмечали в разных странах. Например, в Нидерландах заболевание остро протекало у откормочных свиней и супоросных свиноматок, хотя проявлялось в лёгкой форме или даже при отсутствии клинических признаков у подсосных поросят и поросят вскоре после отъёма. В Англии ЭДС клинически проявлялась у свиней в возрасте 815 недель [178, 179]. В Венгрии наиболее существенный ущерб заболевание причиняло в послеотъёмный период [111]. В Японии вспышки ЭДС сопровождались высокой смертностью поросят-сосунов (30-100%), тогда как взрослые животные имели лишь незначительные признаки болезни [160, 164]. В Южной Корее заболеваемость поросят до 10-дневного возраста достигала 90% [33]. В Азии в целом ситуация по ЭДС характеризуется выраженной стационарностью, связанной с персистенцией вируса ЭДС в популяциях частично иммунных свиноматок. 1.2. ЭТИОЛОГИЯ 1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней Патологию желудочно-кишечного тракта свиней вызывают вирусы пяти семейств: Coronaviridae, Reoviridae, Caliciviridae, Astroviridae и Adenoviridae. Однако, несмотря на это многообразие, ведущая роль в этиологии массовых острых гастроэнтеритов свиней и особенно поросят в 7 неонатальный период развития принадлежит коронавирусам. По экономическому ущербу, причиняемому промышленному свиноводству, особое значение имеют коронавирусные гастроэнтериты: трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) и эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) [3, 10, 11, 19]. ТГС и ЭДС – два массовых вирусных диарейных заболевания свиней, очень сходные по характеру течения, клиническим проявлениям, патологоанатомической картине и патоморфологическим изменениям. Много общего имеет их эпизоотология. Фактически ТГС и ЭДС – заболеваниядвойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорожденных поросят. Поскольку поросята заболевают и гибнут в первые дни жизни, возможность их активной иммунизации исключается. Вирус ТГС является более патогенным по сравнению с вирусом ЭДС. Он вызывает гибель 80-100% поросят до 10-дневного возраста. Более выраженная патогенность вируса ТГС обусловлена более масштабным разрушением энтероцитов от основания до вершины ворсинок тонкого кишечника (рис. 1А). Инфицированные энтероциты разрушаются и слущиваются в просвет кишечника, ворсинки быстро атрофируются. В первые сутки после заражения резко нарушается пищеварение и всасывание и развивается диарея, следствием которой является тяжелая дегидратация. Потеря воды с фекалиями у поросят в первые дни после рождения достигает 150 мл в сутки. У поросят 3-недельного возраста энтероциты поражаются только в отдельных участках тощей и подвздошной кишок [10]. Вирус ЭДС размножается в энтероцитах нижней части ворсинок и крипт (рис. 1 Б). По-видимому, по этой причине вирус ЭДС вызывает менее интенсивную диарею и меньшую смертность по сравнению с вирусом ТГС, но по той же причине может длительно персистировать в кишечнике животных [122, 126]. 8 9 1.2.2. Систематика вируса ЭДС Возбудителем ЭДС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Соronaviridае (порядок Nidovirales). На основе антигенных и генетических критериев вирус ЭДС вместе с коронавирусами человека NL63 и 229 Е и несколькими коронавирусами летучих мышей принадлежат роду Alphacоronavirus (до недавнего времени антигенная группа 1) [67, 142]. В данный род также входит недавно установленный вид альфакоронавирус 1, который включает вирусы, недавно считавшиеся самостоятельными видами: вирус ТГС, коронавирус собак, коронавирусы кошек типов I, II и вирус инфекционного перитонита кошек [49]. 1.2.3. Структура вириона Вирионы вируса ЭДС обладают всеми характеристиками семейства Соronaviridае [35, 124]. Они представляют собой плеоморфные частицы диаметром 95-190 (в среднем 130) нм (Рис. 2 А). Они состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются характерные радиальные булавовидные пепломеры (выступы) длиной 18-23 нм, формирующие «корону» [55, 160]. 1.2.4. Физико-химические свойства Плавучая плотность вирионов вируса ЭДС в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см3. Адаптированный к культуре клеток вирус ЭДС теряет инфекционность при >600С в течение 30 мин, но сохраняет стабильность при 500С. При 40С вирус стабилен при рН 4,0 - 9,0, при 370С он стабилен при рН 6,5-7,5 [28, 98]. Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру, хлороформу и другим жирорастворителям, детергентам и ультрафиолетовым лучам, быстро инактивируется формалином (0,03%). 10 1.2.5. Структурные белки В вирионах вируса ЭДС обнаружено 4 белка. В состав липопротеидной оболочки вирионов входят поверхностный (пепломерный) гликопротеин S, формирующий выступы, большой мембранный гликопротеин М и негликозилированный белок оболочки Е. С вирусной РНК ассоциирован негликозилированный белок N, вместе они формируют спиральный нуклеокапсид (рис. 2 Б) [110, 131]. Белок S является гликопротеином типа I. Он состоит из 1 383 аминокислотных остатков (штамм CV777) и имеет молекулярную массу 150220 кД (различных штаммах вируса). Гликопротеин S отвечает за адсорбцию вирионов на энтероцитах кишечника посредством связывания вириона с клеточными рецепторами и за слияние липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки [51, 135, 162]. Для вируса ЭДС выявлена связь между белком S, адаптацией вируса к размножению в культуре клеток и вирулентностью [118, 144]. Гликопротеин S также обусловливает гемагглютинирующую активность вируса ТГС, однако вирус ЭДС гемагглютинирующей активностью не обладает [28]. Гликопротеин S индуцирует синтез вируснейтрализующих антител (ВНА), в его составе идентифицированы четыре вируснейтрализующих эпитопа [34, 42, 65, 78, 161]. Белок М (20-30 кД) является наиболее многокопийным компонентом вирионной оболочки. Он представляет собой структурный мембранный гликопротеин, трижды пронизывающий мембрану, с коротким N-концевым доменом на поверхности вириона и долгим С-концевым доменом внутри [79, 168]. Показано, что гликопротеин М играет важную роль в процессе сборки вирионов [113, 134], в чём не исключено также участие белка Е (7 кД) [22]. Гликопротеин М индуцирует синтез антител, способных нейтрализовать вирус в присутствии комплемента [135], и, возможно, альфа интерферона [97]. 11 12 Белок N (57-58 кД) представляет собой щелочной фосфопротеин, ассоциированный с вирусным геномом [23, 43, 58, 110]. Предполагается его роль в индукции клеточно-опосредованного иммунитета [135]. 1.2.6. Неструктурный белок ORF3 Для многих коронавирусов характерны неструктурные вспомогательные белки, функции которых известны мало [43, 145, 183, 184]. Единственным вспомогательным белком (и геном) вируса ЭДС является ORF3, который, как показано, формирует ионные каналы в мембранах инфицированных клеток-хозяев [173], что может быть одним из механизмов регуляции продукции вируса. В ходе адаптации и размножения вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток ген ORF3 мутирует, что коррелирует с аттенуацией вируса для новорождённых поросят [40, 119, 152]. Аналогичным образом в ходе адаптации к культуре клеток изменяются последовательности гомологичного гена вируса ТГС [108, 111, 168] и других коронавирусов [50, 52, 70, 71, 102]. Помимо изменений в гене ORF3 в основе тканевого тропизма и вирулентности вируса ЭДС (a также других коронавирусов) лежат изменения в генах гликопротеинов S и М [36, 118, 135, 140, 141, 144]. 1.2.7. Структура генома Геном вируса ЭДС представлен единой односпиральной линейной инфекционной (позитивной) РНК длиной 28033 нуклеотидов (штамм CV777) [26, 67, 89, 169]. На 5’- конце РНК имеются лидирующая последовательность (около 90 нуклеотидов) и нетранслируемый участок (5’-UTR, примерно 200 нуклеотидов). На 3’-конце имеются нетранслируемый участок (3’-UTR, примерно 200 нуклеотидов) и поли (А)- последовательность. В геномной РНК идентифицированы 7 открытых рамок считывания, которые кодируют структурные и неструктурные белки. Гены, 13 кодирующие структурные белки (S, Е, М и N) расположены в 3’-концевой части РНК и составляют примерно 30% генома. Гены, кодирующие неструктурные белки, находятся в 5’-концевой половине РНК (гены полимеразы (репликазы) 1a и 1b), а также между структурными генами S и E (ген ORF3); они составляют около 70% генома (рис. 3) [23, 26, 27, 54, 58, 89, 112, 157]. В клетках, инфицированных вирусом ЭДС, обнаружены шесть видов вирусспецифических РНК различного размера. Один вид соответствует по длине вирионной РНК, а остальные виды являются субгеномными РНК. последовательность нуклеотидов на на Все виды 5’-конце 3’-конце. и РНК содержат идентичные Каждая лидирующую последовательности субгеномная РНК является информационной РНК (иРНК) и обеспечивает синтез одного белка, размер которого соответствует кодирующему потенциалу 5'-концевой последовательности, отсутствующей в более короткой субгеномной иРНК. Субгеномные иРНК 2, 4, 5 и 6 кодируют соответственно структурные белки S, Е, М и N, иРНК 3 кодирует белок ORF3, полноразмерная иРНК 1 кодирует вирусную полимеразу (Рис. 3) [89, 110, 112]. 1.2.8. Антигенное родство Все штаммы вируса ЭДС, выделенные в различных странах мира, практически идентичны по антигенной структуре и представляют один серотип вируса. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов N и S и аминокислотных последовательностей их продуктов у прототипного штамма CV777 и корейского штамма Chinju99, а также нескольких корейских и японских изолятов обнаружило высокую (96,7%) гомологию [91, 93, 99, 182]. 14 15 1. 3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В начале вирус ЭДС рaзмножали пероральной инокуляцией новорожденных поросят кишечным материалом от больных поросят [46]. Адаптация вируса к размножению в культуре клеток оказалась трудной задачей. Многие типы клеток были безуспешно использованы для культивирования вируса ЭДС. Невозможность накопления вируса ЭДС в культуре клеток затрудняла разработку средств диагностики и специфической профилактики заболевания. Впоследствии было найдено, что культура клеток Vero (почка зелёной мартышки) поддерживает серийное размножение вируса ЭДС. В культуре клеток Vero вирус был выделен из тонкого кишечника как естественно больных, так и экспериментально инфицированных поросят. Полевые изоляты вируса проходили свыше 100 серийных пассажей в клетках Vero. Поддерживающая среда в период размножения вируса содержала трипсин в концентрации 1-2 мкг/мл. Размножение эффектом вируса (ЦПЭ), сопровождается который выражается выраженным в цитопатическим вакуолизации клеток и формировании синцития (симпласты), содержащие до 100 ядер (Рис. 6). Титр вируса достигал пика (около 105,5 БОЕ / мл) через 15 часов после инокуляции [72, 73, 98]. При выделении вируса из фекалий больных поросят требовалось провести несколько «слепых» пассажей перед появлением ЦПЭ в клетках Vero [92, 94, 98, 148, 152]. При серийном пассировании вирус (105,0 ТЦД50/мл) вносили в культуру клеток через 48 часов после посева клеток, когда монослой ещё полностью не сформировался. После развития выраженного ЦПЭ, вирус выделяли из клеток путём повторного замораживания-оттаивания [72, 81]. Инфекционная активность изолята KPEDV-9 на 90 пассаже достигла титра 106,5 ТЦД50/мл [94], a изолят DR13 на 55 пассаже достиг уровня активности 106,0 ТЦД50/мл и до 100 пассажа накапливался в пределах 106,5 – 107,0 ТЦД50/мл [152]. 16 Важным достижением в области культивирования вируса ЭДС явилось то, что некоторые штаммы вируса ЭДС, адаптированные к клетакм Vero, успешно размножались в культурах клеток как свиного, так и несвиного происхождения: МА 104, CPK и ESK [92]. В линиях клеток свиньи KSEK-6 и IB-RS2 штамм P-5V серийно размножался даже без добавления трипсина [81], хотя роль трипсина в повышении уровня репродукции вируса ЭДС была показана экспериментально [41]. Имеются сведения о выделении вируса ЭДС в культурах клеток мочевого пузыря и почки свиньи, выращенных в плашках, покрытых коллагеном. Присутствие трипсина в поддерживающей среде было необходимо [148]. Один штамм вируса ЭДС, МК, адаптированный к росту в культуре клеток Vero [92], оказался способным реплицироваться в нейронах новорождённых мышей после интрацеребрального заражения [150] и после 10 пассажей (МК-р10) проявлял высокую нейровирулентность. Продуктивность МК-р10 по сравнению с таковой исходного штамма МК возросла [90]. Установлено, что серийное пассирование полевых вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток приводит к потере вирулентности и получению антигенно активных аттенуированных штаммов (глава 1.2.6). Случаи реверсии патогенности при пассировании аттенуированных штаммов на поросятах неизвестны. 1.4. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ ЭДС в хозяйствах протекает в эпизоотической (острой) и энзоотической (хронической) формах. Эпизоотическая форма ЭДС наблюдается при заносе вируса в хозяйство, где все или большинство животных чувствительны к нему. Заболевание характеризуется внезапно появляющейся диареей у животных 17 всех возрастов и гибелью 30 - 100% поросят до 2-недельного возраста. Обычно вспышка болезни в хозяйстве затем продолжается 3-4 недели и прекращается после формирования иммунитета примерно у 80% животных. Эпизоотическую форму ТГС чаще регистрируют в холодное время года. Эта форма болезни нередко переходит в энзоотическую форму [10, 139]. Энзоотическая форма ЭДС обычно встречается в крупных свиноводческих хозяйствах, и она связана с персистенцией вируса и наличием чувствительных к вирусу поросят при непрерывных опоросах. Латентное инфицирование свиней вирусом ЭДС регистрируют чаще, чем вирусом ТГС. Персистенция вируса ЭДС в организме свиней обусловлена, по-видимому, тем, что он поражает энтероциты крипт тонкого кишечника. Это явление также обусловливает более частый переход острой инфекции в хроническую при ЭДС по сравнению с ТГС (глава 1.2.1). При хроническом течении ЭДС аналогично ТГС условия содержания, кормления и различные стрессовые воздействия оказывают значительное влияние на тяжесть болезни. При пониженной температуре внешней среды заболевание протекает тяжелее и более длительно [10, 106]. 1.5. ПАТОГЕНЕЗ Патогенез при ЭДС изучали на безмолозивных поросятах. 3-дневные поросята, заражённые орально изолятом СV777, заболевали через 22-36 часов после инокуляции [48]. Вирус размножается в цитоплазме эпителиальных клеток ворсинок всего тонкого кишечника (тощей и подвздошной кишок), а также ободочной кишки, что было показано иммунофлуоресценцией и электронной микроскопией. Признаки инфицирования эпителиальных клеток обнаруживают уже через 12-18 часов после заражения поросят, максимум развития цитопатологии наступает через 24-36 часов. Репликация вируса в тонком кишечнике приводит к разрушению 18 энтероцитов и укорочению ворсинок. Отношение высоты ворсинок к глубине крипт уменьшается до 3:1 по сравнению с нормой 7:1. Дегенерацию инфицированных эпителиальных клеток ободочной кишки не наблюдали. Патогенетические изменения в тонком кишечнике поросят при ЭДС подобны таковым при ТГС. Однако, так как репликация вируса и развитие инфекционного процесса при ЭДС протекают медленнее, инкубационный период при ЭДС длится дольше [125]. Репликация вируса ЭДС у поросят обнаружена только в клетках кишечного тракта. Shibata et al. [148] показали, что безмикрофлорные свиньи-гнотобиоты, инокулированные полевым вирусом ЭДС в возрасте от 2 дней до 12 недель, вырабатывали иммунитет, напряжённость которого зависела от возраста, а погибали только 2-7-дневные поросята. Патогенез ЭДС у взрослых свиней детально не изучен, но с помощью иммунофлуоресценции в эпителиальных клетках ворсинок тощей, подвздошной и ободочной кишок у откормочных свиней выявляли вирусный антиген как после экспериментальной, так и после естественной инфекции [46]. Неясно, насколько инфекция ободочной кишки усиливает клинические признаки болезни. Неясно также, какой патогенный механизм обусловливает внезапную смерть с острым некрозом мышц спины, наблюдаемую иногда у взрослых свиней и свиней в период доращивания [125]. Особенности патогенеза ЭДС, описанные в Корее и Японии, идентичны тем, которые наблюдали в Европе, за исключением того, что репликация азиатских штаммов вируса в ободочной кишке не обнаружена и не было случаев внезапной смерти откормочных животных [76, 87, 160]. Как у экспериментально, так и у естественно инфицированных поросят наблюдаются сходные патологоанатомические изменения [56, 57, 76, 126, 160] (рис. 4). Повреждается только тонкий кишечник, стенки которого обволакиваются жидкостью жёлтого цвета. Вакуолизация и 19 20 слущивание энтероцитов ворсинок тонкого кишечника начинаются через 24 часа после инокуляции и совпадает с началом диареи. Начиная с этого момента, ворсинки быстро укорачиваются и энзиматическая активность кишечника резко снижается. Данные наблюдения были подтверждены сканирующей электронной микроскопией [55]. Эта патология очень сходная с патологией при ТГС. Гистопатологические изменения в ободочной кишке не наблюдают. Ультраструктурные изменения наблюдают сначала в цитоплазме энтероцитов, в которых органеллы уменьшаются, образуя электроннопрозрачные пятна. Позже микроворсинки и терминальная мембрана исчезают, а цитоплазма частично вытекает в просвет кишечника. Клетки становятся плоскими, теряют тесное соединение друг с другом и высвобождаются в просвет кишечника. Видно формирование вируса внутри клеток путём почкования через мембраны эндоплазматического ретикулума [55, 75, 126]. В ободочной кишке наблюдают незначительные изменения в энтероцитах, содержащих вирусные частицы, но не подвергающиеся слущиванию. 1.6. КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ Инкубационный период ЭДС составляет приблизительно 48 часов, клинические признаки заболевания проявляются в течение 7-14 дней. Главным и часто единственным видимым клиническим признаком ЭДС является водянистая диарея. Вспышки в восприимчивых репродукторных стадах могут значительно варьировать по заболеваемости, длительности и летальности. На некоторых фермах заболевают свиньи всех возрастов, а заболеваемость приближается к 100%. ЭДС очень сходна с ТГС за исключением более медленного распространения и несколько более низкой смертности новорождённых поросят. Поросята в возрасте до 1 недели могут погибнуть от дегидратации после 3-4-дневной диареи. Смертность поросят в 21 среднем составляет 50%, но может достигать 100%. Более старшие поросята выздоравливают примерно через 1 неделю. После острой вспышки диарея у них может наблюдаться 2-3 недели после отъёма [125]. В последние два десятилетия типичные острые вспышки с высокой смертностью новорождённых поросят в Европе наблюдают редко, но они часто происходят в Японии [160], Корее [33], Китае [37, 38, 40, 101] и других странах Азии [115, 128]. В 2013 г. ЭДС, характеризующаяся острыми вспышками, охватила 27 штатов США [39, 158]. При острой вспышке ЭДС в хозяйстве все откормочные свиньи заболевают с развивитием диареи в течение недели. Животные аноректичны, угнетены, и их фекалии водянистые. К концу периода откорма клинические признаки ЭДС могут быть суровее, чем при ТГС. В частности, животные проявляют большую болезненность в области живота. Как правило, животные выздоравливают через 7-10 дней. Смертность среди откормочных свиней составляет 1 - 3%, гибель наступает на ранней стадии диареи или даже до её появления. При некропсии у таких животных обнаруживают острый некроз спинной мускулы. Наиболее высокая смертность наблюдается среди пород, чувствительных к стрессу. По сравнению с ТГС ЭДС распространяется медленнее. Распространение вируса из одного свинарника в другой может занять 4-6 недель, некоторые свинарники могут оставаться свободными от инфекции [125]. 1.7. ДИАГНОСТИКА Диагноз на ЭДС нельзя поставить только по клиническим признакам. Клинически острые вспышки диареи у свиней всех возрастов нельзя отличить от проявления ТГС. В ряде случаев вспышки ЭДС могут проявляться в виде быстро распространяющейся водянистой диареи у послеотъёмных поросят и более взрослых животных на репродукторных фермах, но без клинических признаков у новорождённых поросят. 22 Этиологический диагноз можно установить прямым обнаружением вируса ЭДС и / или его антигена, или специфических антител. Наиболее демонстративными методами являются электронная микроскопия (ЭМ), иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ), прямая иммунофлуоресценция (ИФ) и иммуногистохимия ультратонких срезов тонкого кишечника новорождённых поросят. Частицы вируса ЭДС можно видеть в фекалиях в прямой ЭМ, хотя их нелегко обнаружить, если шипы вириона потеряны или неясно видны. Наивысший результат обнаружения вируса в фекальных образцах составил 73% и получен при исследовании экспериментально зараженных поросят в первый день после начала диареи. Следует отметить, что для дифференциации вирусов ЭДС и ТГС, требуется ИЭМ, так как оба вируса имеют одинаковую морфологию [125]. ИФ и особенно иммуногистохимию можно применять в основном при исследовании образцов кишечника поросят, убитых во время острой фазы диареи, предпочтительно в течение 2 дней после её начала. Данные методы часто ненадёжны при исследовании патологического материала от естественно погибших животных из-за элиминации энтероцитов в период болезни [23, 47, 68, 160]. Использование ИФ позволяет быстро обнаружить вирус ЭДС, выделенный из фекалий в культуре клеток Vero или других линий клеток [72, 148]. В настоящее время создан ряд наборов иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антигенов вируса ЭДС в фекалиях, а также для демонстрации специфических антител в сыворотке крови. Они чувствительны и надёжны, особенно для группового диагноза. Для антигенных версий ИФА использовали поли- и моноклональные антитела к антигенам вируса, размноженного в поросятах антительного ИФA антигеном является [29, 31, 171]. Для полуочищенный вирус, размноженный в поросятах или в культуре клеток [29, 32, 94], а также 23 вирусные белки S и N, выделенные из инфицированных клеток Vero [88]. Антительный ИФА также используют для обнаружения иммуноглобулина в молозиве и молоке свиноматок [45]. Для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и молозиве как инфицированных, так и вакцинированных свиней используют ИФA, блокирующий ИФA, непрямую ИФ, блокирующую ИФ и реакцию нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero [29, 73, 74, 127, 148, 177]. Повторные (парные) образцы сыворотки следует брать для исследования не раньше 2 недель после начала диареи [32]. Для оценки протективного иммунитета большее значение имеют концентрация антител класса IgA в молозиве и вируснейтрализующая активность молозива по сравнению с аналогичными показателями сыворотки крови [69]. Для дифференциальной диагностики вирусов ЭДС и ТГС весьма успешно используют иммунохроматографический метод на нитроцеллюлозных мембранах с иммобилизованными моноклональными антителами против структурных белков обоих вирусов [83]. Данный метод особенно подходит для массового обследования проб от свиней в случаях, когда высока вероятность одновременной инфекции обоими вирусами. Наиболее чувствительным и специфичным тестом на вирус ЭДС является обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (RT-PCR). Тест-система RT-PCR, использующая праймеры к лидирующей последовательности вирусного генома (5’ UTR) успешно применяется для выявления как лабораторных штаммов, так и полевых изолятов вируса ЭДС [77, 91, 84]. Также разработана дуплексная RT-PCR для дифференциальной диагностики вирусов ЭДС и ТГС [85]. Однако в случаях, когда доступны лишь образцы тканей, фиксированные формалином, иммуногистохимия и гибридизация in situ являются лучшими методами диагностики по сравнению с RT-PCR [86]. 24 1.8. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ И КОНТРОЛЬ 1.8.1. Общие меры В Европе специфическую профилактику ЭДС считают экономически невыгодным мероприятием вследствие редкого возникновения и небольших потерь от заболевания. Поэтому в странах Европы борьба против ЭДС основана на общих превентивных мерах. Подсосные поросята, страдающие ЭДС, должны иметь свободный доступ к воде, чтобы уменьшить дегидратацию. Откорм свиней рекомендуется приостановить. Так как ЭДС не распространяется очень быстро, можно применять общесанитарные превентивные меры и на время задержать проникновение вируса в репродукторные свинарники с опоросами и новорождёнными поросятами. Задержка естественного заражения поросят до достижения более старшего возраста может значительно уменьшить заболеваемость и гибель свиней. Если вирус циркулирует в последовательных помётах подсосных поросят, можно попытаться прекратить его перманентную передачу путём перемещения свиней сразу после окончания подсосного периода в другое место не менее, чем на 4 недели. Одновременно с этим прибытие новых животных в хозяйство должно быть временно прекращено. 1.8.2. Специфичесая профилактика 1.8.2.1. Лактогенный иммунитет Как и при ТГС, целенаправленное скармливание свиноматкам фекалий супоросным больных ЭДС свиней или суспензии кишечника погибших от ЭДС поросят стимулирует лактогенный иммунитет и сокращает продолжительность вспышки заболевания в хозяйстве. Однако при данном подходе напряжённость иммунитета сильно варьирует в связи с неопределённым содержанием вируса ЭДС в фекалиях или суспензии кишечника. Данный распространения других подход имеет инфекционных потенциальную заболеваний, опасность связанную с 25 возможной контаминацией фекалий другими патогенами (вирус РРСС, цирковирус и др.). До 13-дневного возраста поросята получают защиту против ЭДС в виде специфических антител, в основном класса IgG, из молозива и молока иммунных свиноматок [138], продолжительность колострального иммунитета зависит от титра антител. После сенсибилизации кишечника свиноматок вирусным антигеном иммуноциты, продуцирующие антитела, мигрируют в молочную железу, где секретируют антитела в молозиво и молоко. Иммунологическая связь кишечник-молочная железа является важным фактором, который следует учитывать при разработке вакцины, обеспечивающей лактогенный иммунитет [6, 12, 13, 14, 138, 174]. Антитела класса IgG составляют более 60% суммарного иммуноглобулина в молозиве, но антитела класса IgA эффективнее нейтрализуют патогены, проникающие оральным путём, чем IgG и IgM [16, 24, 30, 149, 170]. Это объясняется более высокой способностью IgA к нейтрализации вируса и его большей устойчивостью к протеолитической деградации в кишечном тракте [114, 159]. Таким образом, только пассивный перенос IgA от иммунизированной матери создаёт эффективный пассивный иммунитет у новорождённых поросят [2, 7, 20, 25, 107, 136]. Разработку и испытание вакцин против ЭДС проводили в основном в странах Азии, где, в отличие от Европы, происходят суровые вспышки заболевания с высокой смертностью новорождённых поросят. Наиболее эффективным путём создания вакцины против ЭДС является аттенуация вируса длительным пассированием в культуре клеток. Cерийное пассирование приводит к снижению и утрате патогенности вируса для свиней, особенно для новорожденных поросят, но сохраняет его способность вызывать протективный иммунный ответ у привитых свиней [95, 153]. Аттенуированный штамм KPEDV-9 на 93 пассаже в культуре клеток 26 Vero был использован для орального и внутримышечного введения безмолозивным поросятам в возрасте 1-4 дня. Из 8 поросят, получивших орально 10 мл суспензии вируса в концентрации 108 ТЦД50/мл, только 3 развили мягкую диарею. Все поросята, привитые вирусом в дозах 106 и 107 ТЦД50/мл, не показали каких-либо признаков инфекции [95]. Штамм DR13 на 100 пассаже в клетках Vero не вызвал диарею, анорексию и виремию у новорождённых поросят и супоросных свиноматок. Только 1 из 14 поросят проявлял слабую диарею [152]. Эти данные были подтверждены в последующих экспериментах [153, 154]. Супоросные свиноматки, привитые внутримышечно аттенуированным штаммом KPEDV-9 в дозе 107 ТЦД50, развили высокие титры противовирусных антител в крови и молозиве, которые легко выявляли в ИФА. Новорождённых поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, заражали орально полевым вирулентным вирусом ЭДС в дозе 10 и 5 ЛД50 и наблюдали в течение 2 недель. При 10 ЛД50 смертность поросят с лактогенным иммунитетом составила 20% по сравнению со 100% гибелью аналогичных поросят в контрольной группе; при 5 ЛД50 все иммунные поросята выжили по сравнению с гибелью 60% поросят в контрольной группе [95]. Аналогичные результаты были получены в опытах с культуральным штаммом DR13, аттенуированным подобным способом [152]. Было также показано, что оральное введение аттенуированного DR13 приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [155]. Этот штамм не проявил вирулентность в течение трёх серийных пассажей в безмолозивных поросятах. В Корее его используют для вакцинации свиней с 2004, в Филиппинах – с 2011. Однако после вакцинации выделение вируса с фекалиями у экспериментально зараженных поросят существенно не уменьшается по сравнению с контрольной группой, что может свидетельствовать о недостаточной иммунной защите вакцинированных 27 животных. С другой стороны, выделение вируса ЭДС с фекалиями количественно трудно измерить, много зависит от штамма вируса и метода исследования [156]. В Японии с 1997 для профилактики свиноматок применяют коммерческую живую вакцину из штамма Р-5V, аттенуированного в культуре клеток. Вакцина считается эффективной, хотя не все свиноматки развивают выраженный лактогенный иммунитет [167]. Представляет также интерес альтернативное получение безопасного антигена вируса ЭДС для использования в качестве вакцины. Синтез рекомбинантного гликопротеина S вируса в трансгенном табаке составил 2,1% от общего растворимого белка, что делает это растение потенциальной «съедобной вакциной» [82]. Трансгенные морковь и салат тестировали на мышиной модели скармливанием. Антитела, индуцированные в организме мышей, обладали вируснейтрализующей активностью in vitro [20]. Для оценки перспективности данного направления вакцины необходимы дальнейшие исследования с определением протективного эффекта на свиньях. 1.8.2.2. Пассивная профилактика и терапия Кроме исследований по вакцинопрофилактике ЭДС известны опыты пассивной защиты поросят специфическими иммуноглобулинами естественно нечувствительных к ЭДС иммунизированных животных. Оральное введение новорождённым поросятам желтка куриных яиц или молозива коров, содержащих иммуноглобулины к вирусу ЭДС, предотвращало заболевание или снижало смертность [96, 147]. Есть предложение использовать рекомбинатные бактерии E. coli, синтезирующие вариабельные фрагменты мышиных моноклональных антител к антигенам вируса ЭДС [129]. В качестве терапевтического средства предложено применять фактор 28 эпидермального роста (EGF), который стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток в криптах кишечника и тем самым способствует восстановлению ворсинок после атрофии [80]. 1.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ Анализ заболевание материалов изучения представляет собой ЭДС показывает, проблему для что данное промышленного свиноводства. Причиной тому являются существенные экономические потери или высокая вероятность таковых в крупных свиноводческих хозяйствах при возникновении ЭДС. Возникновение ЭДС носит внезапный характер, после одной или нескольких вспышек она часто приобретает стационарный (энзоотический) характер. При ЭДС отчётливо выражена возрастная чувствительность. Наиболее чувствительны к вирусу поросята до двухнедельного возраста, летальность среди которых составляет 30 - 100%. Летальность среди свиней начиная с послеотъёмного возраста составляет обычно 1 - 3 %. В полевых условиях разные штаммы вируса ЭДС обладают различной вирулентностью. Штаммы вируса, циркулирующие в странах Азии, в целом характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению со штаммами, циркулирующими в странах Европы. Механизмы данной географической корреляции неясны. Однако существенные экономические потери, причиняемые ЭДС в азиатском регионе, явились основанием для интенсивного изучения заболевания и его возбудителя. Можно выделить три направления исследований, в которых достигнут наибольший прогресс: этиология, культивирование вируса и лабораторная диагностика. Результаты исследований в данных направлениях являются научной основой для разработки эффективных мер борьбы против ЭДС. Достаточно изучены иммунобиологические свойства вируса ЭДС, особенности его репродукции, строение вириона и вирусного генома. Важным шагом в научном и практическом плане явилась разработка 29 методов массового культивирования вируса ЭДС вне организма хозяина, что позволило получать достаточное количество вируса для его изучения и изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Адаптация вируса ЭДС к культуре клеток позволила также давать оценку его биологической и антигенной активности, что имело важное научное и практическое значение. Хотя эффективность выделения полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero относительно высокая и после проведения нескольких слепых пассажей репликация вируса сопровождается выраженным ЦПЭ, вирус накапливается в относительно невысоком титре (не выше 6,5 – 7,0 lg ТЦД50 / мл), даже после продолжительной адаптации к культуре клеток Vero или последующей адаптации к другой культуре клеток. Серийное пассирование вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток относительно быстро приводит к снижению и потере вирулентности и получению аттенуированных вакцинных штаммов. Молекулярной основой аттенуации вируса ЭДС и её необратимости при серийном размножении в культуре клеток считается делеция в последовательности вспомогательного гена ORF3. Возможность реверсии некоторых аттенуированных штаммов в организме свиней теоретически не исключена. Однако реверсию патогенности вакцинных штаммов вируса ЭДС ни в практических условиях, ни в процессе ограниченного пассирования на новрождённых серонегативных поросятах никто не наблюдал. Остаются невыясненными многие вопросы эпизоотологии ЭДС, в частности, носительство вируса ЭДС различными технологическими и возрастными группами свиней. Известно, что при ЭДС острая инфекция в хозяйствах чаще переходит в хроническую форму, чем при ТГС. В качестве возможного объяснения считается предпочтительное инфицирование вирусом ЭДС энтероцитов крипт тонкого кишечника. Предварительный диагноз ТГС / ЭДС ставят на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и 30 эпизоотологических данных. Окончательный (этиологический) диагноз устанавливают на основании результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика включает обнаружение вирусного антигена или вирусной нуклеиновой кислоты и специфических антител. Серологические методы, помимо диагностического значения, представляют ценность для оценки иммунитета в практических условиях. Наиболее чувствительным и специфическим методом дифференциальной диагностики ТГС / ЭДС является ПЦР. Для дифференцирования этих вирусов используют гнездовую (дуплексную) версию ПЦР. Специфическая профилактика ЭДС представляет собой актуальную проблему для ряда стран с развитым свиноводством. Как и в случае ТГС, основу стратегии специфической профилактики ЭДС составляет пассивный лактогенный иммунитет, то есть иммунизация супоросных свиноматок и защита потомства антителами молозива и молока. Медиатором лактогенного иммунитета служит секреторный иммуноглобулин IgA, который нейтрализует вирус на поверхности слизистой оболочки и предупреждает развитие инфекции. Роль клеточного иммунитета в защите свиней от ЭДС не изучена. Для специфической профилактики ЭДС в разных странах применяются различные живые вакцины из культуральных аттенуированных штаммов вируса ЭДС. Создание инактивированной вакцины против ЭДС не представляется реальным вследствие низкого накопления вируса как в культуре клеток, так и в организме. Живые препараты вводят супоросным свиноматкам, как правило, орально или внутримышечно. Одна группа авторов показала, что оральное введение вакцины приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением. Однако оральное введение неприменимо для массовой вакцинации в условиях крупных хозяйств. Существуют опасения некоторых исследователей, что 31 напряжённость иммунитета, индуцированного некоторыми коммерческими живыми вакцинами, часто недостаточна, так как после вакцинации свиноматок вирус ЭДС выделяется с фекалиями у экспериментально зараженных поросят примерно так же, как у серонегативных поросят контрольной группы. Однако главным критерием иммуногенности живых вакцин против ЭДС является их эпизоотическая эффективность, которая тесно коррелирует с уровнем лактогенного иммунитета (титр ВНА в молозиве и молоке) вакцинированных свиноматок. 32 1.10. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Основываясь на анализе данных литературы, характеризующих современный уровень исследований и разработок по проблеме ЭДС, а также учитывая актуальность специфической профилактики заболевания для промышленного свиноводства России, мы провели работу научного и прикладного значения, результаты которой обобщены в данном труде. Цель работы. Разработка сухой живой вакцины против ЭДС и условий её применения в ветеринарной практике. В задачи исследования входило: Получение авирулентного культурального штамма вируса ЭДС; Изучение генетических основ аттенуации вируса ЭДС; Оптимизация условий культивирования аттенуированного вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток; Разработка метода изготовления и контроля сухой живой вакцины и режима её хранения; Изготовление экспериментальных серий вакцины и испытание их эффективности в лабораторных и производственных условиях; Изготовление производственных серий вакцины и испытание их в неблагополучных по ЭДС хозяйствах; Изучение возможности одновременной вакцинации свиней против ЭДС и ТГС. Работа выполнена в 2008 – 2012 гг. в ОАО НИИ ДПБ и ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России 33 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1.1. Вирус Вирус первоначально был выделен от больных поросят в культуре клеток Vero и размножался слабо в течение первых пассажей. Расплодка 20 пассажа в культуре клеток Vero имела титр 2,5 lg ТЦД50/мл. Исходный вирулентный вирус ЭДС, использованный для экспериментального заражения поросят, представлял собой суспензию кишечного материала, взятого от естественно инфицированных поросят. 2.1.2. Однослойные культуры клеток Клетки Vero размножали в среде DMEM с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота (FetaClone) с антибиотиками (гентамицин 20 мкг / мл или ципрофлоксацин 25 мкг / мл). Из флакона с выросшим клеточным монослоем удаляли ростовую среду, монослой промывали 1-2 раза раствором Версена (0,02%) и 1 раз смесью растворов Версена (0,02%) и трипсина (0,025%) в соотношении 4:1, затем выдерживали при 370С 5-10 мин. После отделения клеток от стенки флакона их разводили средой DMEM с сывороткой. Клеточную суспензию, содержащую 1-2 х 105 клеток/мл, вносили по 150 мл в 1,5 мл флаконы. Клетки выращивали при 37 0С. Срок формирования монослоя: 48-72 часа. Клетки СПЭВ выращивали на среде 199, остальные клетки выращивали на среде DMEM с антибиотиком (2 мкг/мл гентамицина или 2,5 мкг/мл ципрофлоксацина). Клетки всех линий пересевали каждые 3-4 дня с коэффициэнтом 1:4 – 1:5. 34 2.1.3. Выращивание вируса в культуре клеток Для выращивания вируса использовали клетки Vero, покрывающие ростовую поверхность флакона на 95-100%. Клетки отмывали раствором Хэнкса и заражали вирусом с множественностью 0,1 ТЦД50 на клетку. Вирус вносили одновременно с поддерживающей средой (DMEM с антибиотиками без сыворотки), содержащей трипсин в концентрации 5 мкг / мл. Выраженный ЦПЭ развивался через 18-20 часов после заражения. В этот период (разрушение не менее 70% клеток монослоя) культивирование вируса прекращали, и сосуды с инфицированной культурой клеток интенсивно встряхивали. В случаях, когда на стенках культуральных сосудов оставалась значительная часть клеток, сосуды кратковременно замораживали. Вируссодержащую культуральную суспензию сливали в пластиковые бутыли и хранили при -200- -700С. Вирус ЭДС, адаптированный к культуре клеток Vero (титр 103,5 – 106,0 ТЦД50/мл), использовали для изготовления экспериментальных серий вакцины. 2.1.4. Титрование вируса в культуре клеток Инфекционность вируса в жидких и лиофилизованных препаратах определяли методом титрования в культуре клеток Vero в 96-луночных плашках. Клетки Vero в 96-луночных плашках выращивали стандартным способом в атмосфере 4% СО2. Концентрация клеток при посеве: 2-4 х 105 клеток / мл, в лунку вносили 100 мкл клеточной суспензии, срок формирования монослоя: 24-48 ч. Перед внесением разведений вируса монослой в лунках промывают 1-2 раза раствором Хэнкса. Серийные 10кратные разведения вируса готовили в среде DMEM, содержащей трипсин (5 мкг / мл) и гентамицин (20 мкг / мл). Разведения от 10-1 до 10-5 вносили в отмытые от ростовой среды лунки по 100 мкл, каждое разведение в 4 лунки. Плашки инкубировали при 370С, 4% СО2. Результаты титрования вируса 35 учитывали через 48-72 ч. Титр вируса определяли по методу Рида-Менча и выражали в единицах ТЦД50 /мл. Инфекционную активность определяют (1) в исходном культуральном вирусе, (2) культурального вируса, смешанного со стабилизатором и замороженного (до сушки), (3) свежевысушенного вируса и (4) высушенного вируса после ускоренного старения (инкубация при 370С в течение 7 дней) и (5) в процессе хранения при 20-80С. 2.1.5. Экспериментальные животные Оценку антигенной и иммуногенной активности вакцинных препаратов проводили на лабораторных животных, супоросных свиноматках, откормочных свиньях и новорожденных поросятах. Новорождённых поросят содержали под своими свиноматками. Поросят в возрасте 30-35 дней содержали отдельно от свиноматок и их потомства. Содержание и кормление свиноматок и откормочных свиней, находящихся в опытах, проводили согласно технологическим нормам. Поросята-гнотобиоты получены путем кесарева сечения свиноматок. Поросят извлекали из матки и переносили в стерильные камеры с подачей стерильного воздуха. Кормили поросят каждые 3 часа автоклавированной молочной смесью. Аналогичным образом содержали и безмолозивных поросят. Орально и назально вирусные препараты вводили с помощью шприца-полуавтомата с силиконовой насадкой вместо иглы. В качестве лабораторных животных использовали морских свинок массой 350-450г и кроликов массой 2,5-4,0 кг. Для испытания схемы вакцинации использовали серонегативных в отношении ЭДС свиней из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям. Три глубоко супоросные свиноматки крупной белой породы в возрасте 3,5-4 года содержали в отдельном помещении для опороса. Животных содержали в соответствии с общепринятыми нормами. 36 2.1.6. Сбор и приготовление образцов для исследований Пробы сыворотки крови, молозива и молока, а также легочные смывы свиней исследовали серологическими методами до и после вакцинации. Кровь брали из наружной ушной вены в стерильные флаконы и выдерживали 2 часа в термостате при 37°С, затем выдерживали в течение ночи при 4°С. Сыворотку отделяли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. Молозиво и молоко брали в стерильные флаконы. Для получения молока свиноматкам внутривенно вводили 50 ед окситоцина. Каждую пробу получали не менее чем из трех долей вымени. Полученные пробы подвергали центрифугированию в режиме 19000 об/мин в течение 2 часов, после чего собирали среднюю фракцию, содержащую сыворотку. Легочные смывы получали из легких вакцинированных свиней в условиях убойных пунктов или мясокомбината. С этой целью в просвет трахеи вводили 500-700 мл фосфатно-буферного раствора (рН 7,4) и после тщательного массирования долей легких собирали смывы в стерильные флаконы. Полученные смывы осветляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. В ИФА и РН использовали также гипериммунные сыворотки кроликов, иммунизированных вакцинным штаммом вируса ТГС. Все пробы до исследования хранили при -20°С. Другие материалы брали и обрабатывали перед исследованием в соответствии с принятыми нормами. 2.1.7. Живая вакцина изготовлена из вируса ЭДС, прошедшего не меньше 40 пассажей в культуре клеток Vero и представляла культуральную жидкость с титром вируса 5,0 lg ТЦД50 / мл. Вирус-содержащую культуральную жидкость с момента получения до испытания на свиньях хранили при -200С. 37 2.1.8. Инактивированная вакцина изготовлена из того же вируса. К инактивированному формалином (0,2%, 24 часа, 370С) вирусу добавляли мертиолат натрия 1:10 000 и 25% гидроокиси алюминия (ГОА). Вакцину хранили при 4 – 60С. 2.1.9. Вакцинация Свиноматок вакцинировали по разным схемам. 1) Живой вакциной орально двукратно: за 4-5 недель и за 2-3 недели до опороса. Каждый раз 5 мл живой вакцины смешивали с 5 мл пастеризованного коровьего молока непосредственно перед оральным введением. Разовая доза вакцинного вируса составляла 5,7 lg ТЦД50. 2) Живой, а затем инактивированной вакциной. Живую вакцину вводили однократно орально за 4-5 недель до опороса в объёме и дозе, указанных выше. Инактивированную вакцину вводили однократно внутримышечно в дозе 5 мл за 2-3 недели до опороса. 30-35-дневных поросят разделили на три равные группы, которых иммунизировали по трём схемам: 1) живой вакциной орально однократно, 2) живой вакциной внутримышечно однократно и 3) живой вакциной орально однократно и через 2 недели инактивированной вакциной внутримышечно однократно. Доза живой вакцины составляла 5,0 lg ТЦД50 (в объёме 3 мл), инактивированную вакцину вводили в дозе 2 мл. За вакцинированными животными ежедневно проводили клиническое наблюдение, фиксируя отклонения от физиологической нормы, в течение всего срока эксперимента. 2.1.10. Заражение новорождённых поросят Трёх поросят под каждой вакцинированной свиноматкой заражали в возрасте 3 дня. Вирулентный штамм вируса ЭДС вводили орально в дозе 3,0 lg ЛД100 в объёме 2 мл. После заражения за поросятами каждого помёта наблюдали 10 дней. 38 2.1.11. Реакция нейтрализации вируса Реакцию нейтрализации использовали для оценки антигенной активности вакцинного вируса по уровню вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотке крови свиней до и после вакцинации и в молозиве (молоке) свиноматок, взятом в день опороса и в последующие дни. Для реакции нейтрализации вируса использовали: 1) культуру клеток Vero со сплошным монослоем в 96-луночных пластиковых планшетах, предварительно отмытые от ростовой среды средой ДМЕМ, 2) вирус ЭДС с известным титром инфекционности в виде культуральной суспензии. Пробы иммунной сыворотки крови свиней предварительно инактивировали при 560С 30 мин. Пробы молозива / молока замораживали, оттаивали и обезжиривали центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин. Затем готовили серийные 2- или 10-кратные разведения на среде ДMEM с антибиотиком. Для активации вируса ЭДС в суспензию, содержащую вирус, добавляли трипсин до концентрации 20 – 30 мкг / мл и инкубировали 30 мин при 370С. Активированный вирус разводили средой ДMEM до концентрации 2-4 х 103 ТЦД50 / мл и смешивали с равным объёмом серийного разведения сыворотки или молозива. После инкубации 1 ч при 37 0С смесь вируссыворотка вносили в отмытые от ростовой среды лунки с монослоем по 100 мкл. Доза вируса в каждой лунке составляла 100-200 ТЦД50. Смесь каждого разведения сыворотки вносили в 4 лунки. Клетки со смесью вирус-сыворотка инкубировали 1 ч при 370С в атмосфере 4% СО2, после чего смесь удаляли, монослой отмывали от сыворотки и вносили поддерживающую среду ДMEM с трипсином (5-10 мкг / мл) по 100 мкл в лунку. Планшеты инкубировали при 370С, 4% СО2. Результаты реакции учитывали через 2 - 4 суток при наличии ЦПЭ в культуре, заражённой вирусом в рабочем разведении без сыворотки (контроль +) и отсутствии ЦПЭ в лунках с незаражённой культурой клеток 39 (контроль –). Вируснейтрализующий титр выражали как предельное разведение сыворотки (молозива), ингибирующее развитие ЦПЭ в 50% заражённых культур клеток. 2.1.12. Стабилизирующие среды С целью уменьшения потери активности в результате сушки вирусную суспензию смешивали с одной из трёх стабилизирующих (защитных) сред, использованных в работе: декстраново-желатиновой, пептонно-желатозной и молоком. Декстраново-желатиновую среду готовили следующим образом. В 2/3 конечного объёма бидистилированной воды вносили компоненты в следующем порядке (в граммах на 1 л воды): гидрофосфата калия 1,25, дигидрофосфата калия 0,5, желатина 30, декстрана 50, сорбита 50, сахарозы 30, гидролизата казеина 20. Каждый следующий компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После доведения рН до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия добавляли бидистиллят до конечного объёма и автоклавировали при 121-1250С в течение 30 мин. Пептонно-желатозную среду готовили смешиванием равных объёмов двух растворов. Первый раствор содержит (в порядке растворения) дигидрофосфат калия 0,27%, лактозу 10% и пептон 10%. Второй раствор содержит дигидрофосфат калия 0,27% и желатозу 4%. Для растворения компонентов смеси нагревают или оставляют на ночь. рН обоих растворов доводят до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия. После автоклавирования при 1211250С 30 мин растворы смешивали. Молоко готовили альтернативно двумя способами. 1) Сухое обезжиренное молоко стерилизовали гамма-облучением интенсивностью 2 млн рад. Растворяли в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,3-7,4) в весовой пропорции 1:6, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. 2) 40 Коммерческое пастеризованное молоко 2,5 или 3,2 % жирности стерильно разливали в 50-мл центрифужные пробирки, однократно замораживалиоттаивали, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. После проверки рН (7,2-7,4) супернатант сливали и смешивали с вирусной суспензией или хранили в замороженном виде. Вирусную суспензию смешивали с декстраново-желатиновой средой в отношении 0,7 : 0,3, с пептонно-желатозной средой или молоком - в отношении 1 : 1. 2.1.13. Сублимационная сушка вакцины ВЕРРЕС-ЭДС Смесь культурального вируса со стабилизирующей средой расфасовывали вручную (малые объёмы) или на автоматической линии по 1 мл во флаконы объёмом 3 см3, устанавливали на каждый флакон резиновую пробку с пазами для удаления влаги. Для сушки в лабораторной установке Christ Alpha расфасованную вакцину предварительно замораживали в холодильнике при –600 - -70 0С в течение 16 ч, затем помещали в сушильную установку. При производственной сушке расфасованную вакцину замораживали в установке Christ Epsilon перед началом сублимации. Сразу после расфасовки в один или два флакона с вакциной помещали датчики температуры. Замораживание проводили в течение 6-8 ч до достижения в материале температуры полного замораживания, - 500С или ниже. Сублимацию проводили при значениях вакуума в камере около 0,16 мБар в течение не менее 50 ч. После удаления из препарата около 90% влаги проводили досушивание при температуре 30-350С в течение 15 ч. График изменения температуры в препарате в процессе сублимации показан на рисунке 5. 41 42 По окончании сублимационной сушки флаконы герметично укупоривали непосредственно в камере сублиматора с помощью прижимных плит, после чего камеру заполняли атмосферным воздухом. После определения вакуума и остаточной влажности флаконы с сухой вакциной закатывали алюминиевыми колпачками. 2.1.14. Определение вакуума в сухой вакцине Вакцина считается пригодной для практического применения только при наличии вакуума во флаконах. Поэтому все флаконы сухой вакцины проверяли на наличие вакуума с помощью аппарата Д’Арсонваля. Наличие светящегося разряда во флаконах свидетельствует о наличии вакуума. 2.1.15. Определение массовой доли влаги в сухой вакцине Определяли уменьшение массы сухой вакцины после досушивания её по ГОСТ № 24061 – 89 (СТ СЭВ 6279 – 89). Массовая доля влаги в сухой вакцине должна быть в пределах 1-4%. 2.1.16. «Ускоренное старение» вакцины 6 флаконов с сухой вакциной, содержащих вакуум, выдерживали в течение 7 суток при 370С. По истечении этого срока определяли активность вируса в усреднённой пробе титрованием вируса в культуре клеток. 2.1.17. Иммунохроматография на нитроцеллюлозных стрипах Дифференцирование антигена вирусов ЭДС и ТГС в полевых и культуральных образцах проводили с использованием коммерческих наборов Antigen Rapid TGE\PED Ag Kit и ZETECT TGE/PED компании BIONOTE (Южная Корея) в соответствии с инструкцией производителя. 43 2.1.18. Наборы и ферменты для ПЦР и секвенирования Маркеры молекулярной массы от 100 до 3000 н. п. (GeneRulertm 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas, Литва). Набор для выделения ДНК из геля (Рrоmеgа, DNА Рurificatrion System, Wizard®, США) Набор для выделения ДНК из геля QIАЕХ II Gеl Ехtraction Kit (Qiagen, Германия). Набор для очистки ПЦР-продуктов (Рrоmеgа, Wizard™ РСR Рrерs DNА Purification System for Rapid Purification of DNA Fragments, США). Hабор для выделения плазмидной ДНК (Рrоmеgа, DNА Purification System, Wizard®Рlus, SV Minipreps, США). Набор для секвенирования ДНК Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, (Applied Biosystems, США). Обратная транскриптаза (ревертаза): Из вируса лейкемии мышей Молони (ММLV) (Рromegа, США), Из вируса миелобластоза птиц (АМV) (Рromegа, США); Taq-полимераза (Рromegа, США); Ингибитор РНКаз (RNAzin, 40 ед/мкл) (Рromegа, США). 2.1.19. Оборудование для ПЦР и секвенирования Автоматический секвенатор АВI РRISМ 3130 Genetic Analyzer (Аррlied Biosystems; США), монитор и компьютер (DELL,). Вортекс "Fisons" (UК), твердотельный термостат "Гном" (ДНК-Технология, Россия), источник питания "Эльф" (ДНК-Технология, Россия), настольные микро центр и фуги Eppendorf, центрифуга с охлаждением RС2-В (Sorvall), прибор для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле (Хеликон, Россия), вакуумный насос (Gast), енегодслательная машина AF100 (Scotsman), низкотемпературный холодильник (Nuare), водный термостат 44 Bromma (LКВ), амплификаторы «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Нуbaid, термостат воздушный ТС 1/20 (СНУ), трансиллюминатор, холодный шкаф Bromma (LKB), пипетки переменного объёма Gilson, Eppendorf, автоклав настольный Sanyo, дистиллятор СПУ, холодильник Stinol, система для очистки воды Milli Q (Millipore, США), электронные настольные весы 1219 МР (Sartorius), магнитная мешалка ММ-5 (СССР), рН-метр 420А+ (Thermo Orion, США), спектрофотометр Biophotometr (Eppendorf, Германия), фотокамера для фотографирования гелей (Olympus C5060 Wide Zoom). 2.1.20. Химические реагенты и расходные материалы Tризол (Gibco ВRL, Life Technologies, США), трис основной, дeзоксинуклеотид – трифосфаты, ЭДТА (Promegа, США), хлорид калия, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид натрия, гидроксид натрия, легкоплавкая агароза, диэтилпирокарбонат, силика (Sigma, США), уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изопропиловый спирт - ректификат, ацетон (Химмeд, Россия), глицерин (Меrck, Германия), тритон Х-100 (IСN, США), масло минеральное (ЕSSО, Германия), метиловый оранжевый (Рeахим, Россия), бромистый этидий (Servа, Германия), гуанидинтиоцианат (РеqLаb, Германия). Пробирки объемом 0,6 мл тонкостенные для ПЦР (QSР, США), 1,6 мл и 2 мл микроцентрифужные пробирки с градуировкой (Ерреndorf, Германия), микронаконечники на 0,5 – 1,0 мкл, микронаконечники на 0,1 - 2,5 мкл, микронаконечники на 1 - 200 мкл желтые (Greiner, Австрия), желтые с фаской (Тreff), наконечники на 100 - 1000 мкл голубые (Greiner, Австрия), микронаконечники с фильтром на 1 - 20, 1 - 200 и 100 - 1000 мкл (QSР, США), пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой на 15 и 50 мл, центрифужные пробирки (Nаlgеnе, Италия), стеклянная лабораторная посуда с градуировкой и пластиковыми завинчивающимися крышками (Scott Duran), пробирки оптические на 200 мкл MicroAmp, 96-луночные оптические плашки 45 96-well Optical Reaction Plate, кюветы для спектрофотометра 50 - 2000 мкл, свободные от ДНКаз, РНКаз, протеаз. 2.1.21. Выделение вирусной РНК Для выделения РНК из монослоя и суспензии культуры клеток использовали методику выделения с тризолом (Gibco ВRL, Life Technologies). Для жидких образцов: к 500 мкл образца добавляли 500 мкл тризола и инкубировати при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4° С. Отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при -20° С в течение 20 минут. Центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Образовавшийся осадок РНК промывали дважды 75% этанолом, подсушивали при 37°С в течение 20-30 минут и растворяли в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC). Для монослоя и тканевых образцов: на монослой клеток наносили тризол из расчета 37,5 мкл на 1 см2 культуралыюй поверхности, дожидались отделения монослоя от поверхности чашки, переносили суспензию клеток в тризоле в микроцентрифужную пробирку (1,5 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Затем отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при -20°С в течение 20 минут, центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Образовавшийся осадок РНК промывали и растворяли, как указано выше. 46 2.1.22. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТПЦР) для детекции геномов вирусов ЭДС и ТГС В работе использовали метод множественной ОТ-ПЦР, позволяющий обнаружение и различение геномов вирусов ТГС и ЭДС в одной пробе. Две пары праймеров, последовательности которых приведены ниже, подобраны на основе геномных последовательностей штамма CV777 вируса ЭДС и штамма Purdue вируса ТГС. Специфические праймеры были подобраны таким образом, чтобы исключить перекрёстные реакции вирусов и неспецифические реакции. Условия для этих двух проведения реакции отрабатывали на матрице двух референтных штаммов вируса ТГС, ТМК и Miller, и референтного штамма CV777 вируса ЭДС. Последовательности праймеров соответствуют консервативным участкам гена мембранного белка (М) вируса ЭДС и гена нуклеокапсида (N) вируса ТГС. Размеры специфических фрагментов соответствуют 412 п.н. и 612 п.н. для вирусов ЭДС и ТГС. Последовательности праймеров приведены ниже. М, прямой праймер: 5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’ М, обратный праймер: 5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’ N, прямой праймер: 5’-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3’ N, обратный праймер: 5’-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3’ Состав реакционной смеси: 1 мM MgSO4, 50 мM Tрис-HCl (pH 8,3), 1,5 мM MgCl2, 0,01% желатина, 0,1% тритона Х-100, 0,25 мМ смеси четырёх дезокси-нуклеотид-трифосфатов (dNTPs), 2,5 ед. Taq-полимеразы, 2,5 ед. обратной транскриптазы (AMV-ревертазы), по 0,25 мкМ каждого праймера и 2 – 5 мкл РНК-содержащего препарата. Вода – до 25 мкл. Режим проведения реакции. 1 цикл обратной транскрипции: 420С – 45 мин, 940С – 2 мин; 40 циклов амплификации: 940С – 30 сек, 550С – 30 сек, 720С – 30 сек; 1 цикл общей элонгации: 950С – 30 сек, 600С – 30 сек, 720С – 10 мин; охлаждение до 00С. ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). 47 2.1.23. Электрофорез ДНК в агарозном геле Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле. В 1% гель вносили по 25 мкл продуктов ПЦР при длине фрагмента более 1000 пар нуклеотидов, в 2% - при длине фрагмента менее 1000 пар нуклеотидов. Электрофорез проводили с использованием трис-ацетатного буфера (рН 8.5), содержащего бромистый этидий в концентрации 0,4 - 0,5 мкг/мл, при напряженности электрического поля 10 - 15 В/см в течение 30 минут. Гели просматривали в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм. Наработанные фрагменты вырезали из геля и выделяли с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Fermentas, Литва) по методике производителя. 2.1.24. Определение нуклеотидной последовательности гена ORF3 вируса ЭДС Для секвенирования гена ORF3 по двум цепям использовали праймеры, разработанные Song последовательность определяли с соавторами [2003]. Нуклеотидную по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР-продукта с использованием набора Big Dye Terminator Сусlе Sequencing Kit (Аррlied Biosystems) согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе АВI РRISМ 3130 Genetic Analyzer (Аррlied Biosystems, США). 2.1.25. Компьютерный анализ полученных последовательностей Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright© 1997-2004) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006). 48 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И ATTEНУАЦИЯ ПОЛЕВОГО ИЗОЛЯТА ВИРУСА ЭДС С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИННОГО ШТАММА Полевой вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) был передан в ЗАО НПО НАРВАК в виде культуральной жидкости. Данный вирус был выделен в культуре клеток Vero из кишечника больного поросёнка и к моменту передачи прошёл шесть серийных пассажей в культуре клеток Vero. 2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации Прежде всего, предстояло выяснить культуральные и вирулентные свойства полученного вируса. Выявление спектра чувствительных линий клеток естественного хозяина представляло интерес с целью выбора наиболее пригодного клеточного субстрата для исследовательских и производственных целей. На первом этапе исследовали чувствительность линий клеток СПЭВ и ППК, используемых в работе с вирусом ТГС. В отличие от линии клеток Vero, обе линии клеток оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. Поэтому для дальнейших исследований и прежде всего для аттенуации вируса ЭДС использовали линию клеток Vero. В процессе решения различных задач вирус ЭДС прошёл более 100 серийных пассажей в культуре клеток Vero. Размножение вируса постоянно сопровождалось характерным ЦПЭ, который выражался в интенсивном формировании вакуолизированных синцитиев, сливающихся в симпласты (рис. 6). По мере пассирования период наступления выраженного ЦПЭ постепенно сокращался, а накопление вируса постепенно повышалось. Так, в течение первых 20 пассажей вирус накапливался в титре 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл, а после 40 пассажей титр вируса был в пределах 4,0-5,0 lg ТЦД50/мл. 49 50 Выраженный ЦПЭ наступал через 18 ч, а разрушение монослоя – через 24-26 ч после заражения (таблица 1). Таблица 1. Инфекционность и цитопатическая активность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero Фактическая Время Накопление множественность наступления Характер ЦПЭ Номер вируса, ЦПЭ, часы заражения, пассажа lg ТЦД50/мл ТЦД50/клетка Единичные небольшие 10 - 20 0,001 40 – 48 3,00 – 3,50 синцитии 21 – 40 0,001 36 – 42 Отдельные 3,50 – 4,50 синцитии 41 – 60 0,01 18 - 24 Множественные 4,00 – 5,33 синцитии Множественные синцитии или 61 – 80 0,01 18 - 20 4,66 – 5,66 симпласт 81 - 115 0,1 16 - 18 Симпласт 5,50 – 6,50 Результаты проведенных исследований (таблица 1) показали, что время наступления цитопатического эффекта и накопления вируса зависели от длительности пассирования и множественности заражения культуры клеток Vero. После 80 пассажей вирус накапливался максимально в титре 5,50 – 6,50 lg ТЦД50/мл. Начиная с 40 пассажа, вирус периодически использовали для изготовления экспериментальных образцов живой вакцины. С целью аттенуации полевой вирус серийно пассировали в культуре клеток Vero. Вирулентность культурального вируса ЭДС на уровне 15, 26 и 30 пассажей в культуре клеток Vero изучали в опытах на 2-3-дневных безмолозивных поросятах, полученных от свиноматок, серонегативных к вирусам ЭДС и ТГС. Культуральную вируссодержащую жидкость поросятам 51 вводили орально в объёме 2 мл. Доза вируса составляла 3,33 lg ТЦД50 (15 пассаж) и 3,66 lg ТЦД50 (26 и 30 пассажи). Каждый вариант вируса вводили двум поросятам. В течение опыта (7 дней) поросят содержали при температуре 25-270С и в течение первых суток после заражения кормили стерилизованным коровьим молоком через соску каждые 4-6 часов. Вирус 15 пассажа вызвал слабовыраженную диарею через 16 часов после введения, которая прекратилась через 48 часов. У поросят, которым ввели вирус 26 пассажа, отклонений от нормального состояния не отмечали в течение всего периода наблюдения. Безмолозивные поросята, которым ввели вирус 30 пассажа, оставались нормальными в течение всего периода наблюдения (7 дней). Из результатов этого опыта следует, что после 25-30 серийных пассажей в культуре клеток Vero вирус ЭДС полностью утратил вирулентность для новорождённых поросят. Авирулентный штамм вируса ЭДС получил название ИС (по названию страны первичного выделения вирулентного вируса - Испания). Штамм ИС депонировали в коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (удостоверение ГКВ 2467 от 08.10.2009). В дальнейшем его использовали в исследовательских целях и разработке живой вакцины. 2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса Антигенные свойства штамма ИС, аттенуированного в культуре клеток Vero, определяли послеотъёмного на серонегативных возраста (35-40 дней). к вирусу Поросят ЭДС поросятах иммунизировали внутримышечно, однократно. Через 21 день после введения вируса определяли титр ВНА в сыворотке крови. В первом опыте вирус, прошедший 40 пассажей в культуре клеток Vero, вводили в дозе 4,0 и 5,0 lg ТЦД50. Введение вируса вызывало образование ВНА в титре 1:32 – 1:40 и 1:60 – 1:80 соответственно дозе 52 инокуляции. Данные этого опыта показали антигенность вакцинного штамма вируса ЭДС для свиней, степень которой зависит от дозы вакцины. В следующем опыте с целью определения возможного диапазона пассирования вакцинного штамма ИС без снижения его антигенной активности исследовали вирус 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero. Вирусом одного уровня пассажа прививали группу 35-40-дневных поросят, которых в соответствии с технологией в период доращивания содержали в одном секторе (53-71 голов). Доза иммунизации составляла 4,0 lg ТЦД50. Титр ВНА в сыворотке крови определяли у 5 поросят из каждого сектора. Результаты исследования показали, что штамм ИС, прошедший 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero, не различается по антигенной активности для свиней. Поросята, иммунизированные вирусом всех трёх уровней пассажа, развили антительный ответ сходной интенсивности. Титр ВНА составлял 1:30 – 1:40 (таблица 2). Таблица 2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero Доза Число Титр ВНА Пассаж прививочного привитых До После вируса вируса, поросят иммунизации иммунизации ТЦД50 (контроль) 40-45 104 60 60-65 104 53 80-85 104 71 1:30, 1:40, 1:30, 1:15, 1:20, 1:15, 1:30, 1:30 (1:32) 1:10, 1:20 (1:16) 1:60, 1:40, 1:30, 1:40, 1:30 (1:40) 1:30, 1:40, 1:30, 1:30, 1:20 (1:30) Примечание. В скобках указан уровень ВНА в среднем по группам поросят Таким образом, вследствие аттенуации вируса ЭДС получен авирулентный штамм, обладающий выраженной антигенностью. 53 2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero Адаптация и размножение вируса ЭДС в культуре клеток Vero сопровождается мутациями в гене ORF3 (см. Обзор литературы, глава 1.2.6). Целью настоящего исследования являлось изучение изменений, произошедших в гене ORF3 штамма ИС в ходе его адаптации к размножению в культуре клеток Vero. Для этого сравнивали первичную структуру гена ORF3 трёх вариантов вируса: штамма ИС, прошедшего 70 и 110 пассажей в культуре клеток (соответственно ИС70 и ИС110), и полевого изолята. В качестве референс-последовательности была взята последовательность гена ORF3 прототипного штамма CV777 вируса ЭДС (GenBank, NCBI, номер доступа Z24733). Сравнительный анализ последовательностей ORF3 полевого изолята и эталонного штамма CV777 вируса ЭДС показал их идентичность на 97,5%. В 675 нуклеотидах ORF3 полевого изолята вируса обнаружены 17 нуклеотидных замен в позициях: 54 G -> A, 62 T -> C, 160 G -> A, 162 T -> C, 235 G -> A, 238 T -> G, 241, 243, 264, 274 C -> T, 301 G -> A, 450 C -> T, 481 G -> A, 497 A -> G, 579 G -> A, 586 A -> T и 588 T -> C (Рис. 7). Сравнение последовательностей ORF3 ИС70, ИС110 и CV777 выявило делеции размером 29 и 38 нуклеотидов в 5’-концевом участке гена соответственно ИС70 и ИС110. Остальная часть последовательности всех трёх исследованных вариантов вируса имеет абсолютное сходство за исключением одной нуклеотидной замены в случае ИС70 и ИС110 (586 A -> T, Рис. 7). 54 55 2.2.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ МАССОВОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА Для изготовления вакцинных препаратов большой интерес представляет повышение выхода культурального вируса. С целью получения максимально возможного выхода штамма ИС вируса ЭДС изучали зависимость накопления вируса в культуре клеток Vero от различных факторов: 1) состояния культуры клеток, 2) наличия следов сыворотки в среде, 3) дозы заражения и 4) способа культивирования (роллерная или статическая культура). Серию опытов проводили с длительно адаптированным вирусом (50-60 пассажей), обладающим выраженной репродукцией (значения инфекционной активности 4,50 – 5,50 lg ТЦД50/мл). Клетки Vero выращивали в 1,5 л матрасах или в роллерных сосудах ёмкостью 3 л. В культуру клеток, выращенную в 1,5 л матрасах или в 3 л роллерных сосудах, вносили соответственно по 150 или 250 мл поддерживающей среды DMEM c антибиотиком и трипсином (5 мкг / мл). Культуру клеток, выращенную различным способом, заражали вирусом одновременно и инкубировали при 370С до выраженного цитопатогенного эффекта (поражение не менее 80% клеток монослоя). Образцы вирусной культуральной жидкости перед титрованием для определения инфекционной активности вируса хранили при температуре не выше -200С. Инфекционную активность всех образцов вируса, полученных в одном опыте, определяли одновременно, используя культуру клеток одного посева. 2.2.2.1. Состояние культуры клеток Сравнивали накопление вируса ЭДС в культуре клеток Vero в зависимости от интенсивности клеточного роста (формирование монослоя на 85-90 и на 95-100%). После удаления ростовой среды и однократного промывания монослоя клеток раствором Хэнкса в культуральные сосуды вносили поддерживающую среду ДМЕМ, содержащую трипсин (5 мкг / мл) и 56 вирус 75-85 пассажа (0,1 ТЦД50 / клетка). Накопление вируса определяли через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в культуре клеток Vero. Из результатов, представленных в таблице 3, видно, что в культуре клеток с более развитым монослоем вирус накапливается в большем титре. Наблюдения также показали, что возраст заражаемого монослоя Vero в пределах 48 - 96 ч имеет меньшее значение для накопления вируса ЭДС, чем численность (плотность) клеток в монослое. Таблица 3. Накопление вируса в зависимости от интенсивности формирования клеточного монослоя Номер Пассаж Титр вируса, lg ТЦД50/мл опыта вируса Монослой 85-90% Монослой 95-100% 1 75 5,33 - 5,50 5,50 - 6,00 2 80 5,00 - 5,33 5,33 - 5,76 3 85 5,17 - 5,33 5,66 - 6,00 Так как перед заражением при смене ростовой среды на поддерживающую в ней могут остаться следы сыворотки крови, которая угнетает репродукцию вируса ЭДС, представлялось целесообразным изучить значение такой возможности. вирусом остатки ростовой Перед заражением однослойной культуры среды, содержащей сыворотку, удаляли однократным промыванием раствором Хэнкса (20-25% объёма ростовой среды). В качестве контроля использовали культуру клеток без промывания раствором Хэнкса перед заражением. Вирус (0,1 ТЦД50/клетка) вносили вместе с поддерживающей средой. Накопление вируса в культуре определяли через 18 ч после инкубирования. В культуре клеток, отмытой от ростовой среды, титр вируса был выше в 30-50 раз по сравнению с титром вируса в неотмытой культуре (таблица 4). Это, вероятно, связано с частичной нейтрализацией трипсина остатками 57 сыворотки ростовой среды. Таблица 4. Влияние удаления следов ростовой среды перед заражением на размножение вируса ЭДС Номер опыта Титр вируса, lg ТЦД50/мл Без удаления С удалением 1 3,76 - 4,23 5,33 - 5,66 2 3,33 - 3,66 5,00 - 5,50 3 4,00 - 4,50 5,50 - 5,83 2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения Использовали культуру клеток с полностью сформированным монослоем (48 - 72 ч) и вирус 50 и 80 пассажа с исходным титром соответственно 5,00 и 5,50 lg ТЦД50/мл. После удаления ростовой среды и однократного промывания раствором Хэнкса культуру клеток заражали вирусом с множественностью 0,1; 0,01; 0,001 и 0,0001 ТЦД50/клетка. Через 18 ч во всех заражённых культурах развился ЦПЭ, характерный для вируса ЭДС. Интенсивность ЦПЭ коррелировала с заражающей дозой вируса. Все культуры клеток инкубировали до развития выраженного ЦПЭ, т.е. культуры, заражённые вирусом в дозе 0,1 и 0,01, инкубировали 18 часов, а в дозе 0,001 и 0,0001 – 42 часа. Результаты этого исследования (таблица 5) показали прямую зависимость накопления вируса от дозы заражения неависимо от уровня пассажа. Накопление вируса было максимальным (5,33 - 6,23 lg ТЦД50/мл) в культуре клеток, инфицированной с множественностью заражения 0,01 и 0,1 ТЦД50/клетка. 58 Таблица 5. Накопление вируса ЭДС при различной дозе заражения Заражающая доза вируса, ТЦД50 /клетка Пассаж 0,0001 0,001 0,01 0,1 Накопление вируса, lg ТЦД50/мл вируса 50 4,33 - 4,76 4,83 - 5,23 5,33 - 5,50 5,50 - 5,83 80 4,23 - 4,50 5,00 - 5,33 5,50 - 5,66 5.66 - 6,23 2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях Культуру клеток Vero, сформировавшую монослой на 95-100% в статических матрасах объёмом 1,5 л и в роллерных бутылях объёмом 3 л, после удаления ростовой среды использовали для выращивания вируса ЭДС. Вирус 82-86 пассажей с исходным титром 5,50 - 6,00 lg ТЦД50 / мл вносили в дозе 0,1 ТЦД50 / клетка вместе с поддерживающей средой (содержащей трипсин в концентрации 5 мкг/мл) после удаления следов ростовой среды. В каждом опыте заражали по 3-5 сосудов со статической или роллерной культурой. Урожай вируса собирали через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ. Результаты исследования представлены в таблице 6. По накоплению вируса ЭДС оба способа культивирования практически не различались между собой и поэтому являются альтернативными. 2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero Данное исследование было проведено с целью возможного выявления высокопродуктивной линии клеток для производственного размножения штамма ИС вируса ЭДС. Изучали способность указанного штамма к размножению в культуре клеток перевиваемых линий различного происхождения (PK15, SK6, IB-RS2, MARC-145 и HRT). Прежде всего, 59 Таблица 6. Накопление вируса в зависимости от способа культивирования Номер опыта Число заражённых культур Статических Роллерных 1 2 3 5 6 6 5 5 3 Накопление вируса, lg ТЦД50/мл В статической культуре В роллерной культуре 4,76 - 5,23 5,00 - 5,50 5,33 - 5,66 5,00 - 5,50 5,00 - 5,66 5,33 - 5,66 интересовала возможность накопления вакцинного штамма в большем титре по сравнению с его накоплением в культуре клеток Vero. Исходным материалом являлся штамм ИС 90 - 100 пассажа в культуре клеток Vero (5,50 – 6,00 lg ТЦД50 / мл). Размножение вируса в клеточных культурах различного происхождения определяли в течение нескольких серийных пассажей. Культуры клеток выращивали в пластиковых матрасах ёмкостью 50 см3. Для заражения брали культуры клеток, сформировавшие монослой на 90-100% (24 - 48 ч после пересева). Перед заражением монослой дважды промывали от ростовой среды. В сосуды с отмытым монослоем вносили 10 мл соответствующей ростовой среды без сыворотки, содержащей вирус в дозе 0,1-1,0 ТЦД50 на клетку и трипсин в концентрации 5 мкг/мл. За развитием ЦПЭ наблюдали в течение 96 часов. В качестве контроля использовали те же культуры клеток, не заражённые вирусом, а также заражённую и незаражённую культуру клеток Vero. Культуры замораживали в период развития ЦПЭ, а при его отсутствии – через 96 часов после заражения. После размораживания культуральную жидкость использовали для очередного пассажа в гомологичной линии клеток (серийные пассажи). Результаты адаптации вируса к новым линиям клеток учитывали по развитию ЦПЭ, биопробе в культуре Vero и с помощью ПЦР анализа. Из данных, приведенных в таблице 7, видно, что из 6 исследованных 60 линий клеток чувствительными к размножению штамма ИС после 100 пассажей в культуре клеток Vero оказались две линии: IB-RS2 и MARC-145. Таблица 7. Чувствительность различных линий клеток к размножению вакцинного штамма ИС вируса ЭДС Размножение и Результат цитопатические выявления изменения вируса ЭДС Пассаж Культура Происхождение вируса клеток В Методом Номер пассажа 1 2 3 4 5 клетках Vero ПЦР 90 СПЭВ Почка свиньи + + + НИ НИ - - 90 PK-15 То же - - - - НИ - - 100 SK6 То же + + + + + - - 100 IB-RS2 То же - + + + + + + 100 MARC145 Почка зелёной мартышки + + + + + + + 90 HRT Кишечник человека - - НИ НИ НИ - - Примечание. + наличие ЦПЭ, + сомнительный результат, - отсутствие ЦПЭ, НИ – не исследовали В культуре клеток МАRC-145 штамм ЭДС прошёл пять серийных пассажей, максимальная активность вируса (4,23 lg/мл) была в первых двух пассажах. В ходе дальнейшего пассирования в данной культуре активность вируса снижалась и в пятом пассаже составила около 3,00 lg/мл. В культуре клеток IB-RS2 вирус прошёл восемь серийных пассажей, максимальная активность была отмечена в шестом пассаже (4,76 lg/мл). Результаты данного исследования показали, что из всех использованных культур клеток только Vero поддерживает репликацию штамма ИС на относительно высоком уровне, удовлетворяющем 61 требованиям изготовления живой вакцины. Только культуру клеток Vero использовали в дальнейшем для производственного культивирования вируса. Так как предыдущее исследование показало, что для массового культивирования штамма ИС пригодна только культура клеток Vero, было целесообразно сравнить его накопление в культуре различных доступных сублиний клеток Vero. Культуру клеток Vero трёх сублиний: испанской, английской и российской (Vero B) выращивали и заражали в одинаковых оптимальных условиях. В таблице 8 приведены значения инфекционной активности в расплодках вакцинного вируса ЭДС, выращенного в различных сублиниях клеток Vero. Из представленных в таблице 8 данных видно, что накопление вируса было сходным во всех использованных сублиниях клеток Vero. Любая из этих трёх сублиний клеток пригодна для производственного культивирования штамма ИС вируса ЭДС. Таблица 8. Накопление штамма ИС в сублиниях клеток Vero Сублиния Vero Пассаж вируса ЭДС для заражения Накопление вируса в сублинии, lg ТЦД50 / мл Испанская Английская Vero В (Россия) 85 87 90 85 88 90 87 88 90 5,66 6,17 6,00 5,76 5,66 6,00 6,00 5,66 6,00 2.2.3. РАЗРАБОТКА ТЕХОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ Предыдущие исследования позволили получить два важных результата, определивших дальнейшую стратегию разработки средств специфической профилактики ЭДС. Титр культурального вируса ЭДС повысился в ходе серийного пассирования в культуре клеток Vero, однако не 62 достиг уровня, пригодного для изготовления инактивированной вакцины (> 107,0 ТЦД50/мл). Серийное пассирование полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero относительно быстро (25-30 пассажей) привело к потере вирулентности, что было установлено в опыте на новорождённых поросятах. После потери вирулентности аттенуированный штамм вируса ЭДС ещё в течение длительного серийного пассирования в культуре клеток Vero сохранял выраженные антигенные и иммуногенные свойства. Эти данные определили возможность и целесообразность разработки живой вакцины на основе аттенуированного штамма ИС вируса ЭДС. Были изготовлены экспериментальные серии живой вакцины против ЭДС: восемь серий сухой и три серии замороженной вакцины для проведения испытаний на безвредность (реактогенность) и сохранность в сухом и замороженном состояниях. Живая вакцина против ЭДС получила название вакцина ВЕРРЕС -ЭДС. 2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины Предстояло изучить влияние различных условий лиофилизации вакцины, допустимый срок хранения сухой вакцины и сохранность жидкой вакцины в замороженном состоянии. Сохранность вируса ЭДС в процессе изготовления сухой вакцины При производстве и использовании живых вакцин важное значение уделяется так называемой «холодовой цепи». Целью данного раздела работы являлась разработка способа производственного изготовления сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС и условий её хранения, обеспечивающих максимальную биологическую активность вакцинного вируса. Максимальное сохранение биологической активности вакцинного вируса в сухом препарате является особенно важным, если учесть, что в культуре клеток он накапливается в относительно низком титре (5,50 – 6,50 ТЦД50/мл). Для достижения этой цели 63 необходимо было выбрать: наиболее эффективную для данного вируса стабилизирующую среду, оптимальный режим лиофилизации и метод ускоренной оценки стабильности сухой вакцины. В процессе изготовления сухой вакцины определяли титр вируса до смешивания со стабилизатором, после смешивания со стабилизатором, после замораживания (перед сушкой), сразу после сушки и после испытания сухой вакцины методом ускоренного старения. В качестве исходного материала для приготовления сухой вакцины использовали вирус 45 - 114 пассажей в культуре клеток Vero c титром 5,50 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. Среда высушивания. Сравнивали протективную эффективность трёх защитных сред при лиофилизации вируса. Состав и способ приготовления сред №1, №2 и №3 и смешивание их с вирусной суспензией описан в главе 2.1.12 раздела «Материалы и Методы». Лиофилизацию вируса со всеми вариантами защитной среды проводили одновременно в аппарате Christ Alpha. Протективный эффект трёх защитных сред по биологической активности вакцинного штамма оценивали сразу после лиофилизации. Из представленных данных (таблица 9) видно, что активность вируса ЭДС снижалась стабилизирующей ещё на среды начальной и стадии последующего - после добавления замораживания. Потеря активности вируса на этой стадии со средой №1, №2 и №3 соответственно составляла 0,00 – 0,24, 0,33 – 0,50 и 0,00 – 0,34 lg ТЦД50 / мл. В процессе высушивания с защитной средой №1 или №2 вирус терял 0,50 - 0,84 lg ТЦД50 / мл, а с защитной средой №3 - 0,66 – 0,84 lg ТЦД50 / мл. Таким образом, суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составило 0,66 - 0,84; 1,00 – 1,24 и 0,84 – 1,00 lg ТЦД50 / мл при использовании соответственно защитной среды №1, №2 и №3. 64 Таблица 9. Активность вируса ЭДС при высушивании с тремя защитными средами Активность вируса ЭДС, lg ТЦД50 / мл Защитная среда Исходная суспензия Декстрановожелатиновая (№1) Пептонножелатозная (№2) Молоко обезжиренное (№3) Смесь После вируса с замораживания защитной средой После сушки После ускоренного старения 6,00 5,76 6,00 5,33 4,33 5,66 5,50 5,50 5,00 4,00 5,50 5,50 5,50 4,66 3,66 6,00 5,66 5,66 4,76 3,23 5,66 5,50 5,33 4,66 3,23 5,50 5,33 5,00 4,50 3,00 6,00 5,66 5,66 5,00 3,50 5,66 5,50 5,50 4,66 3,33 5,50 5,33 5,33 4,66 3,00 Для оценки стабильности вакцинного препарата в будущем при длительном хранении проводили испытание методом «ускоренного старения» (370С, 7 суток). В ходе ускоренного старения активность вируса снижалась на 1,00; 1,43 – 1,53 и на 1,33 – 1,66 lg ТЦД50 / мл соответственно в препаратах с защитной средой №1, №2 и №3. Дополнительно была проведена сушка вирусной культуральной суспензии с консервированным концентрированным молоком (без предварительного обезжиривания), рН 7,2-7,4. Использовали культуральную суспензию с активностью вируса ЭДС 5,5 lg ТЦД50/мл. Вирусную суспензию смешивали с концентрированным молоком в отношениях 1:1, 2:1 и 4:1. Образцы сушили в сублиматоре Christ alpha. В качестве контроля одновременно сушили смеси вируса с декстраново-желатинным и пептонно65 желатозным стабилизаторами в соответствующих пропорциях. Из результатов этих исследований, представленных в Таблице 10, видно, что концентрированное молоко (обезжиренное и необезжиренное) в качестве защитной среды менее пригодно по сравнению с другими защитными средами. Увеличение концентрации молока в смеси не приводило к улучшению сохранности вируса в сухом препарате. Однако молоко хорошо защищало вирус при замораживании. Таблица 10. Активность вируса при сушке с концентрированным молоком Содержание молока в вирусной суспензии, % Активность вируса, lg ТЦД50 / мл Смесь вируса с защитной средой После замораживан ия После сушки После ускоренного старения 50 5,24 5,33 3,50 2,00 33 5,33 5,33 3,50 20 5,50 5,50 4,00 < 2,00 2,33 Результаты проведённых исследований показывают, что наиболее эффективной из испытанных защитных сред является декстраново- желатиновая (среда №1, таблица 9). Изготовление экспериментальных серий сухой вакцины. С целью оценки воспроизводимости результатов изготовления сухой вакцины и дальнейшего изучения её свойств при хранении изготовили восемь экспериментальных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Серии вакцины готовили из вируса, прошедшего 45-114 пассажей в культуре клеток Vero. Титр вируса в исходной культуральной суспензии был 4,33 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. В качестве защитной среды использовали декстраново-желатиновый стабилизатор. Лиофилизацию экспериментальных серий вакцины проводили в аппарате Christ Alpha, каждая серия насчитывала 80 – 100 флаконов. 66 Данные по изменению активности вируса в процессе изготовления восьми серий сухой вакцины представлены в Таблице 11. Определение инфекционной активности вируса на различных этапах изготовления вакцины показало, что после смешивания с защитной средой активность вируса снижалась не больше, чем на 0,16 lg ТЦД50 / мл, а в результате высушивания – на 0,50 – 0,84 lg ТЦД50 / мл. Суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составляло 0,50 1,00 lg ТЦД50 / мл. В результате ускоренного старения инфекционная активность вируса в сухой вакцине снижалась на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл. Эти данные согласуются с результатами, приведёнными в таблице 9 и свидетельствуют о воспроизводимости выбранного режима изготовления сухой вакцины. Выбранный режим использовали в дальнейших исследованиях, а также при изготовлении производственных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Сохранность вакцинного штамма в сухой вакцине Для определения срока годности вакцины образцы всех восьми экспериментальных серий помещали на хранение при +2 - +80С (согласно инструкции по применению вакцины ВЕРРЕС-ЭДС). Через различный срок хранения (3, 6, 9 и 12 месяцев) определяли биологическую активность вакцины. Все серии вакцины, как указано выше, также были испытаны в режиме «ускоренного старения» (Материалы и Методы, глава 2.1.16). Результаты этого исследования приведены в Таблице 12. Через каждые три месяца хранения активность вируса в сухой вакцине снижалась на 0,00 0,33 lg ТЦД50 / мл, за 12 мес хранения активность вируса снижалась на 0,50 – 0,83 lg ТЦД50 / мл. При испытании в режиме ускоренного старения активность вируса в вакцине снижалась на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл (в большинстве случаев на 1,00 lg ТЦД50 / мл). 67 Таблица 11. Изменение активности вируса в процессе изготовления экспериментальных сериях сухой вакцины Активность вируса, lg ТЦД50 / мл Серия Пассаж вируса Исходная суспензия 1 45 4,33 2 58 3 Вакцина после сушки Сухая вакцина после ускоренного старения 4,17 (0,16) 3,66 (0,51) 2,66 (1,00) 5,00 5,00 (0,00) 4,23 (0,77) 3,00 (1,23) 91 5,66 5,50 (0,16) 4,83 (0,67) 3,66 (1,17) 4 102 5,50 5,50 (0,00) 4,66 (0,84) 3,66 (1,00) 5 103 6,33 6,24 (0,09) 5,66 (0,58) 4,66 (1,00) 6 111 5,66 5,66 (0,00) 5,00 (0,66) 4,00 (1,00) 7 113 6,33 6,33 (0,00) 5,66 (0,67) 4,66 (1,00) 8 114 6,00 6,00 (0,00) 5,33 (0,67) 4,33 (1,00) вакцины Смесь вируса со стабилизатором до сушки В скобках указано снижение инфекционной активности вируса по сравнению с предыдущим этапом изготовления вакцины Изучение стабильности сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС при испытании в режиме ускоренного старения в сравнении с её сохранностью при +2-+80С в течение 12 месяцев показало ценность данного метода для предварительной оценки будущей стабильности вакцины при длительном хранении. Так, испытание 8 серий сухой вакцины методом ускоренного старения показало снижение титра инфекционности на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 1,00 lg), тогда как те же серии вакцины через 12 месяцев хранения при +2+80С снижали активность на 0,50-0,83 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 0,70 lg). Из результатов этого исследования можно сделать следующее заключение: если при ускоренном старении сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС биологическая активность вакцинного штамма вируса снижается на 1,00 lg ТЦД50 / мл, можно с большой долей вероятности утверждать, что при хранении в течение 68 Таблица 12. Активность вируса в экспериментальных сериях сухой вакцины в процессе хранения при +2 +80С Активность вируса, lg ТЦД50 / мл Серия Сразу После После хранения после сушки ускоренного старения Через 3 мес. Через 6 мес. Через 9 мес. Через 12 мес. 1 3,66 2,66 3,66 3,50 3,33 3,00 2 4,23 3,00 4,00 4,00 3,66 3,50 3 4,83 3,66 4,66 4,50 4,33 4,00 4 4,66 3,66 4,50 4,33 4,23 4,00 5 5,66 4,66 5,50 5,33 5,00 5,00 6 5,00 4,00 5,00 4,76 4,66 4,33 7 5,66 4,66 5,50 5,33 5,33 5,00 8 5,33 4,33 5,00 4,83 4,66 4,50 12 месяцев при +2-+80С его активность снизится не больше, чем на 0,83 lg ТЦД50 / мл. Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки, новых стабилизаторов, режимов сублимации и в целом качества сухих вакцин. Сохранность вакцинного штамма в замороженном состоянии При изготовлении и использовании живой вакцины против ЭДС часто возникает необходимость хранения культурального вируса при умеренно низкой температуре. В этой связи изучали сохранность вакцинного вируса при температуре -18 - -200С. С этой целью были изготовлены три экспериментальные расплодки вакцинного вируса 50 – 70 пассажей. Вирусную суспензию смешивали с декстрановым стабилизатором в 69 отношении 7:3 (как при изготовлении сухой вакцины), разливали по 10 мл в 10 мл стеклянные флаконы и хранили при -18 - -200С. Инфекционную активность вируса определяли перед замораживанием и через 1, 2, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения в замороженном состоянии. Таблица 13. Сохранность вируса в процессе хранения в замороженном состоянии (-18 - -200С) Длительность хранения, месяцы Номер 0 серии 1 2 3 1 2 3 6 9 12 3,66 3,50 4,50 4,33 5,00 5,00 Титр инфекционности, lg ТЦД50/мл 4,50 5,00 5,66 НИ 4,66 5,50 НИ 4,66 5,50 4,00 4,50 5,50 4,00 4,66 5,33 Примечание. НИ - не исследовали Результаты, представленные в таблице 13, показали, что при выбранных условиях хранения культуральный вирус снижал инфекционную активность не более чем на 1,0 lg в течение 12 месяцев (срок наблюдения), что сравнимо с потерей его активности в сухом препарате при +2 – +80С. Следовательно, сублимационная сушка и замораживание являются альтернативными способами хранения живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Хранение расплодки вакцинного штамма ИС в замороженном состоянии может быть полезным при экстренной необходимости иммунизации свиней против ЭДС в практических условиях. 2.2.3.2. Контроль вакцины на безвредность и реактогенность Безвредность аттенуированного штамма ИС и сухой вакцины проверяли на морских свинках массой 350-400 г. Испытуемые препараты вводили однократно внутримышечно в область бедра. Вакцинный вирус и сухую 70 вакцину вводили трём морским свинкам в дозе 4,0 lg ТЦД50 в объёме 2 см3. За морскими свинками наблюдали в течение 10 дней. Все испытуемые препараты: вакцинный вирус 36 - 40 пассажей и 2 сухая вакцина серий 1 и 2, оказались безвредными при контроле на морских свинках. 2.2.4. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРИМЕНЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭДС Предыдущие исследования показали безвредность и эффективность живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС в экспериментальных условиях. Для иммунизации свиней против ЭДС в производственных условиях необходимо было определить схему введения вакцины. В связи с этим на данном этапе работы изучали антигенность (иммуногенность) вакцинного штамма в зависимости от способа введения, прививочной дозы вируса и кратности вакцинации. 2.2.4.1. Способ введения вакцины В качестве предварительного этапа провели оценку применения живой вакцины против ЭДС на серонегативных свиньях двух технологических групп: супоросных свиноматках (возраст 3,5 – 4 года) и поросятах послеотъёмного возраста (35-40 дней), с использованием различных способов введения живой вакцины, а также последовательности применения живой и инактивированной «кишечной» вакцин (Материалы и методы, глава 2.1.9). Для иммунизации свиней применяли вакцинный вирус в виде культуральной жидкости (активность 5,0 – 6,0 lg ТЦД50/мл) и инактивированную «кишечную» вакцину против ЭДС (таблица 14). Наличие и выраженность иммунитета определяли по титру ВНА в сыворотке крови свиней через 21 день после вакцинации и через 15 дней после ревакцинации. ВНА в высоком титре обнаружены в сыворотке крови и молозиве вакцинированных свиноматок, а также в сыворотке крови их потомства. Титр 71 Таблица 14. Схема применения двух вакцинных препаратов Супоросные свиноматки Схема вакцинации 1 2 3 4 5 Послеотъёмные поросята Вакцинация Орально Орально Ревакцинация Орально В/М инакт. Вакцинация Ревакцинация __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Орально В/М жив. В/М жив. __ В/М инакт. Примечания. Орально: вакцинный вирус в дозе 5,66 lg ТЦД50 свиноматкам (№1 и №2) или 5,0 lg ТЦД50 поросятам В/М жив.: живой вакцинный вирус внутримышечно в дозе 5,0 lg ТЦД50 В/М инакт.: инактивированная вакцина внутримышечно в объёме 5 мл свиноматкам или 2 мл поросятам ВНА в молозиве при вакцинации по схеме 1 был выше, чем по схеме 2 (таблица 15). Высокий титр ВНА в крови новорождённых поросят указывает на эффективную передачу колостральных антител потомству. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии преимущества ревакцинации супоросных свиноматок инактивированной вакциной против ЭДС. Таблица 15. Сероконверсия у вакцинированных свиноматок и колостральный иммунитет у их потомства Титр ВНА у свиноматок Колостральный иммунитет у Схема новорождённых поросят вакциСыворотка крови Наличие нации Молози Титр ВНА иммунитета при До После свино- вакцина- ревакцинаво в крови контрольном маток заражении & ции ции 1 <1:10 1:320 1:320* 2 <1:10 1:240 1:240* Примечания. * - пробы молозива в день опороса, & 1:240 1:160 1:320 + + + 1:320 1:160 1:80 + + + - на основании данных ПЦР В сыворотке крови поросят послеотъёмного возраста, полученной 72 через 21 и 36 дней после вакцинации (независимо от ревакцинации), обнаружены ВНА в значительном титре (1:80 - 1:320). Наиболее высокий титр ВНА обнаружен у поросят, привитых двукратно внутримышечно. Титр ВНА у поросят повысился между 21 и 36 днями независимо от ревакцинации (таблица 16). Таблица 16. Вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови 35-40-дневных поросят Титр ВНА в сыворотке крови Схема Номер Через 21 день Через 36 дней вакцинации поросят До после после вакцинации вакцинации вакцинации 1 <1:10 1:160 1:240 3 2 То же 1:160 1:160 3 То же 1:80 1:160 4 <1:10 1:120 1:240 4 5 То же 1:160 1:160 6 То же 1:160 1:240 7 <1:10 1:120 1:320 5 8 То же 1:80 1:160 9 То же 1:160 1:320 Принципиального различия в титре ВНА в крови вакцинированных свиноматок, новорождённых поросят и вакцинированных поросят послеотъёмного возраста не выявлено. Это свидетельствует о возможности использования поросят послеотъёмного возраста вместо супоросных свиноматок при оценке иммуногенности живой вакцины против ЭДС на стадиях её разработки, оптимизации способа применения, а также при выборочном контроле иммуногенности производственных серий вакцины на основе сероконверсии. Для вакцинации свиней в производственных условиях выбрано внутримышечное введение, так как его эффективность была показана в предыдущем исследовании (схема 4, таблица 14) и оно значительно проще по сравнению с оральным, особенно при массовой вакцинации. Колостральный иммунитет у поросят. Экспериментальное заражение 73 трёхдневных поросят вирулентным вирусом (по три поросёнка под каждой вакцинированной свиноматкой) не вызвало диарейного синдрома ЭДС или каких-либо отклонений от физиологической нормы за весь период наблюдения (7 дней). Незаражённые поросята также оставались клинически здоровыми. Исследование фекалий как экспериментально заражённых, так и незаражённых новорождённых поросят на наличие вируса ЭДС методом ПЦР в течение всего периода наблюдения дало отрицательные результаты. Данные экспериментального заражения поросят, а также выраженный титр колостральных антител свидетельствуют о надёжном пассивном иммунитете у поросят, полученных от вакцинированных свиноматок (таблица 15). 2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от прививочной дозы Минимальную дозу вируса ЭДС, обеспечивающую создание выраженного антительного ответа, определяли на свиньях. Использовали штамм ИС, прошедший 80 - 85 пассажей в культуре клеток Vero. Исследования проводили в ранее неблагополучном по ЭДС хозяйстве, в котором супоросных свиноматок прививали инактивированной «кишечной» вакциной против ЭДС. Антигенность вакцинного штамма ИС вируса ЭДС изучали на ранее невакцинированных 65-70-дневных поросятах, у которых в данный период индивидуальная и групповая серопозитивность к вирусу ЭДС была на низком уровне (таблица 17). Четыре группы поросят иммунизировали с использованием следующих прививных доз вируса: 5,0; 4,0; 3,0 и 2,0 lg ТЦД50 в объёме 2 мл. Антигенность вакцинного вируса оценивали по титру ВНА в сыворотке крови поросят в день вакцинации и через 21 день после вакцинации. Сыворотку крови поросят всех групп исследовали одновременно. В качестве контроля служила сыворотка крови поросят, взятая в день иммунизации. 74 Таблица 17. Антигенность вакцинного вируса в зависимости от прививочной дозы Доза Число Титр ВНА Пассаж прививочного привитых До иммунизации После вируса вируса, поросят иммунизации lg ТЦД50 80-85 5,0 66 1:60, 1:80, 1:80, 1:120, 1:60 (1:80) 1:15, 1:20, 1:15, 1:60, 1:40, 1:40, 80-85 4,0 68 1:10, 1:20 (1:16) 1:40, 1:30 (1:42) 80-85 3,0 64 1:20, 1:20, 1:30, 1:30, 1:20 (1:24) 80-85 2,0 68 1:10, 1:10, 1:15, 1:10, 1:20 (1:13) Каждой дозой вируса прививали всех поросят в одном секторе (64-68 голов). Титр ВНА определяли у 5 поросят из каждого сектора. Установлена прямая зависимость титра ВНА от прививочной дозы вируса. Увеличение дозы вируса в 10 раз сопровождалось повышением титра ВНА приблизительно в 2 раза: при дозе 2,0 lg ТЦД 50 1:13; при дозе 3,0 lg ТЦД50 1:24; при дозах 4,0 и 5,0 lg ТЦД50 соответственно 1:42 и 1:80 (таблица 17). Данные по зависимости антигенности штамма ИС вируса ЭДС от длительности аттенуации (раздел 2.2.1.2) и от прививочной дозы суммированы в таблице 18. Установлено, что антигенность штамма ИС зависит от прививочной дозы, а не от продолжительности аттенуации в исследованном диапазоне - 40-85 пассажей. 2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости от кратности и дозы введения Для сравнения антигенности штамма ИС при однократной и двукратной вакцинации использовали вирус, прошедший 80 - 85 пассажей в культуре клеток Vero. Антигенность изучали на свиньях в возрасте 65-70 дней. 75 Таблица 18. Суммарные данные о влиянии длительности аттенуации и прививочной дозы на антигенность вакцинного штамма ИС Число свиней Пассаж вируса 40-45 Доза вируса, lg ТЦД50 4,0 60-65 Привито Исследовано 60 5 4,0 53 5 5,0 66 5 4,0 71 5 3,0 64 5 2,0 68 5 80-85 Титр ВНА Индивидуальные сыворотки Среднее значение п по группе свиней 1:30, 1:40, 1:30, 1:30, 1:30 1:60, 1:40, 1:30, 1:40, 1:30 1:60, 1:80, 1:80, 1:120, 1:60 1:60, 1:40, 1:40, 1:40, 1:30 1:20, 1:20, 1:30, 1:30, 1:20 1:10, 1:10, 1:15, 1:10, 1:20 1:32 1:40 1:80 1:42 1:24 1:13 Пять групп свиней иммунизировали внутримышечно одно- и двукратно с использованием разных прививочных доз вируса. Три группы свиней иммунизировали однократно в дозе 5,0; 4,0 и 3,0 lg ТЦД50 и две группы свиней иммунизировали двукратно в дозе 4,0 и 3,0 lg ТЦД50 в объёме 2 мл. Двукратную вакцинацию проводили с интервалом 15 дней. Антигенность вакцинного вируса оценивали по титру ВНА в сыворотке крови животных через 21 и 36 дней после прививки в случае однократной вакцинации и через 30 дней после второй прививки в случае двукратной вакцинации. Сыворотку крови всех групп свиней (по 10 голов в каждой) исследовали одновременно. В качестве контроля служила сыворотка крови, взятая в день иммунизации. Титр ВНА у свиней в день вакцинации в среднем по группе из 10 животных был равен 1:12. 76 Таблица 19. Антигенность штамма ИС для свиней в зависимости от дозы и кратности вакцинации Доза вакцинации, lg ТЦД50 5,0 4,0 3,0 Кратность вакцинации Титр ВНА после вакцинации Через 21 день Через 36 дней Однократно 1:60;1:40;1:30;1:40; 1:40;1:60;1:120; 1:60; 1:30;1:60;1:40;1:30; 1:60;1:60;1:40;1:60; 1:40;1:30 (1:40) 1:80; 1:80 (1:80) Однократно 1:30;1:40; 1:40;1:30; 1:60;1:80; 1:60; 1:40; 1:20; 1:20; 1:30;1:20; 1:60; 1:40;1:60; 1:80; 1:40; 1:40 (1:32) 140; 1:80 (1:60) Однократно 1:20,1:20,1:20,1:30, 1:30,1:40,1:30,1:30, 1:20 (1:20) 1:20 (1:30) Через 30 дней после вакцинации 4,0 Двукратно 3,0 Двукратно 1:80; 1:120; 1:60;1:60;1:80; 1:80;1:80;1:120; 1:80; 140 (1:80) 1:30;1:40;1:30;1:40;1:30;1:20;1:30;1:30; 1:40;1:30 (1:34) В скобках указан уровень ВНА в среднем по группам Результаты данного исследования (таблица 19) показали, что: 1) Антигенность вакцинного штамма ИС находится в прямой зависимости от дозы вируса и кратности вакцинации, 2) двукратная вакцинация в дозе 4,0 lg ТЦД50 вызывала сходный антительный эффект с однократной вакцинацией в дозе 5,0 lg ТЦД50 (титр ВНА 1:80), 3) двукратная вакцинация в дозе 3,0 lg ТЦД50 вызывала образование ВНА в значительно более низком титре (1:34), чем одно- и двукратная вакцинация с использованием более высоких доз вакцины. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что двукратная внутримышечная вакцинация более эффективна для формирования антительного ответа против вируса ЭДС у свиней по сравнению с однократной вакцинацией. Двукратная вакцинация в дозе 4,0 lg ТЦД50 представляется оптимальной для практического применения. 77 2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хояйстве Первую пробную серию сухой вакцины, изготовленную в конце 2008 г., применили в начале 2009 г. с целью испытания в неблагополучном по ЭДС хозяйстве СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодской области. Результаты применения данной серии вакцины имели прототипное значение для дальнейшего массового изготовления и применения вакцины в неблагополучных по ЭДС хозяйствах. Экспериментальная серия сухой вакцины, приготовленная из вируса 40-45 пассажа в культуре клеток Vero, имела активность 4,0 lg ТЦД50 /мл. Свиней прививали двукратно с интервалом 15 дней в объёме 2 мл. Супоросных свиноматок и ремонтных свинок прививали на 75-80 и 90-95 дни супоросности (примерно за 40 и 25 дней до опороса). Кроме того, прививали двукратно поросят в возрасте 30-35 дней. Специфическую сероконверсию, обусловленную вакцинацией, оценивали по титру ВНА в сыворотке крови привитых животных (таблица 20) и в молозиве свиноматок через сутки после опороса (таблица 21), а также в крови поросят через 2, 4, 7 и 15 дней после рождения (таблица 22). Результаты исследования, приведённые в таблице 20, показали, что сухая вакцина в дозе 4,0 lg ТЦД50 /мл вызывала выраженную сероконверсию у всех трёх групп свиней, особенно после двукратного применения. Кроме того, вакцинация поросят в послеотъёмный период показала возможность их использования при оценке вакцины в зависимости от дозы и схемы вакцинации. В данном неблагополучном по ЭДС хозяйстве специфическая серопозитивность перед вакцинацией была наиболее выраженной у основных свиноматок, по-видимому, за счёт предшествовавшего латентного инфицирования полевым вирусом (одна из характерных особенностей течения ЭДС в полевых условиях). Исследование колострального иммунитета у двукратно вакцинированных свиней показало наличие в молозиве в день опороса специфических ВНА в 78 79 80 высоком титре. У основных свиноматок – 1:120 –1:320, у ремонтных свинок – 1:120 – 1:240 (таблица 21). Анализ динамики колостральных антител в сыворотке крови поросят в течение первых 15 дней жизни (таблица 22) показал постепенное снижение концентрации ВНА более чем в 3 раза (с 1:190 до 1:60). Исходя из этих данных можно заключить, что период полужизни колостральных антител против вируса ЭДС составляет около 7 дней. 2.2.5. ИЗГОТОВЛЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ВЕРРЕС-ЭДС В ХОЗЯЙСТВАХ, НЕБЛАГОПОЛУЧНЫХ ПО ЭДС В неблагополучных по ЭДС хозяйствах применяли три разработанные в НПО НАРВАК варианта вакцины против ЭДС: инактивированную «кишечную», живую замороженную и живую сухую. 2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины в производственных условиях При изготовлении производственных серий сухой вакцины использовали технологию, разработанную для изготовления экспериментальных серий сухой вакцины (раздел 2.2.3.1). В 2010-2011 гг изготовлено восемь серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Лиофилизацию вакцины проводили в аппарате Christ Epsilon. Использовали вирус, прошедший 60 - 100 пассажей в культуре клеток Vero, с титром инфекционной активности 5,50 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. Перед лиофилизацией смесь вируссодержащей жидкости с защитной средой расфасовывали по 1 мл в 3 см3 флаконы, как описано в разделе Материалы и методы. Количество флаконов с вакциной в одной серии значительно различалось, от 1500 до 30 000. После определения активности вируса в сухой вакцине рассчитывали число прививочных доз вакцины в единице фасовки (1 мл во флаконе), исходя из значения 4,00 lg ТЦД50 для одной 81 Таблица 23. Основные сведения, характеризующие изготовление производственных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС Активность вируса в вакцине, lg ТЦД50 / мл № серии Объём вируссодержа щей КЖ, л Объём смеси вируссодержащей КЖ и защитной среды, л Перед сушкой Сразу после сушки После ускоренного старения Число прививочных доз В 1 мл В серии 1 1,6 2,3 5,66 5,00 4,00 6 13 800 2 0,84 1,2 6,00 5,33 4,50 10 12 000 3 1,4 2,0 5,66 5,00 4,33 6 12 000 4 15,0 21,5 5,66 4,66 3,66 3 64 500 5 7,4 12,0 5,50 4,50 3,50 3 36 000 6 11,9 17,0 5,66 4,83 3,66 5 85 000 7 14,0 20,0 5,66 4,66 3,50 3 60 000 8 10,8 15,5 5,50 4,50 3,50 3 46 500 прививочной дозы вакцины (разделы 2.2.4.2 и 2.2.4.3). Из данных, представленных в таблице 23, видна прямая зависимость снижения титра инфекционной активности вируса с увеличением объёма серии сухой вакцины. Так, например, при лиофилизации вакцины объёмом 1,2 – 2,3 л (серии 1-3) потеря инфекционности вируса составила 0,66 lg ТЦД50 / мл, тогда как при лиофилизации вакцины объёмом 12 – 21,5 л (серии 4-8) потеря инфекционности составила 0,83 – 1,00 lg ТЦД50 / мл. Однако следует отметить, что указанное различие не выявлялось при испытании серий вакцины методом ускоренного старения. 2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих хозяйствах России С целью проведения эффективной вакцинопрофилактики ЭДС в промышленном свиноводстве России была изучена распространённость 82 заболевания в 26 крупных свиноводческих хозяйствах (2007-2013 гг.). Так как по клинической картине ЭДС неотличима от трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), диагностику проводили двумя лабораторными методами: обратной транскрипцией – полимеразной цепной реакцией (ОТПЦР) и иммунохроматографией. Оба данных метода широко применяются для дифференцирования ЭДС и ТГС. Результаты исследования приведены в таблице 24. Методом ОТ-ПЦР на наличие РНК вирусов ЭДС и ТГС исследовали 310 проб кишечного материала, взятого от больных, погибших или вынужденно убитых свиней разного возраста. 136 проб содержали вирус ЭДС, 18 – вирус ТГС, 6 проб содержали одновременно оба вируса. Методом иммунохроматографии на наличие антигенов вирусов ТГС и ЭДС исследовали 110 проб кишечного материала, взятого в основном от больных поросят. Вирус ЭДС обнаружили в 46 пробах, вирус ТГС – в 22 пробах. Ни одной пробы, положительной на оба вируса, не выявлено. Проведённое исследование показало значительно более широкое распространение ЭДС в промышленном свиноводстве России в настоящее время по сравнению с ТГС (таблица 24), что указывает на особую актуальность вакцинопрофилактики ЭДС в промышленном свиноводстве РФ с использованием опыта борьбы против ТГС. 2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях Как указано выше, в неблагополучных по ЭДС хозяйствах применяли три варианта вакцины против ЭДС. Однако основную роль в профилактике данного заболевания играла живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС. Эпизоотологическая эффективность данной вакцины была изучена в ходе её применяли в пяти неблагополучных по ЭДС хозяйствах: СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодской области (~20 000 свиней), МП «Совхоз Шелонский» Псковской области (~25 000 свиней), ЗАО «Им. Фрунзе» 83 Таблица 24. Распространённость трансмиссивного гастроэнтерита свиней и эпизоотической диареи свиней в промышленном свиноводстве России Регион 1. Вологодская обл. 2. Московская обл. 3. Белгородская обл. 4. Краснодарский край 5. Самарская обл. 6. Новгородская обл. 7. Псковская обл. 8. Ярославская обл. 9. Пензенская обл. 10. Смоленская обл. 11. Тюменская обл. 12. Томская обл. 13. Свердловская обл. 14. Удмуртия Итого № хозяйства Число повторных исследований 1 2 Результаты исследований ОТ ПЦР Иммунохроматография ТГС ЭДС ТГС ЭДС 3 1 19/4 1/0 19/11 1/0 5/3 НИ 5/3 НИ 1 1 1/0 1/1 НИ НИ 2 3 1 3 1 2 26/0 13/1 9/0 26/13 13/11 9/2 18/9 10/0 5/0 18/6 10/10 5/1 2 1 7/0 7/6 НИ НИ 3 4 5 4 1 3 27/1 17/1 24/3 27/9 17/14 24/19 4/4 5/1 НИ 4/0 5/1 НИ 6 7 8 1 2 3 1 1 1 1 12/0 1/0 1/1 10/0 2/0 12/3 1/0 1/0 10/7 2/0 НИ НИ НИ НИ 3/0 НИ НИ НИ НИ 3/0 1 2 1 3 1 2 7/1 4/0 24/0 7/5 4/2 24/7 НИ НИ 23/0 НИ НИ 23/5 1 1 5/0 5/3 НИ НИ 1 1 1 7 2 2 18/3 2/0 6/0 18/8 2/2 6/0 11/5 НИ 6/0 11/10 НИ 6/0 1 1 1 3 2 2 24/1 8/0 22/2 24/6 8/0 22/7 3/0 4/0 9/0 3/3 6/1 9/5 1 1 20/0 20/0 4/0 4/1 310/18 310/36 110/22 110/46 26 Примечание. Числитель – количество проб, исследованных данным методом, знаменатель – количество положительных проб от общего числа исследованных. НИ – не исследовали 84 Белгородской области (~40 000 свиней), ЗАО «Тропарёво» Московской области (~13 000 свиноматок) и ЗАО «Алексеевский Бекон» Белгородской области (~14 000 свиноматок). Первые два хозяйства до 2009 года были неблагополучными по трансмиссивному гастроэнтериту свиней (ТГС), а с 2009 г. заболевание свиней ТГС прекратилось благодаря применению инактивированной культуральной вакцины ТР-1 (НПО НАРВАК). ЭДС в СПК «Агрофирма Красная Звезда» впервые зарегистрировали в январе 2008 г., а в остальных хозяйствах - в начале 2010 г. Наличие вируса ЭДС в данных хозяйствах было установлено неоднократными лабораторными исследованиями в ООО «НПО НАРВАК» и ВНИИЗЖ с применением ПЦР, РН, иммунохроматографии и ИФА. Результаты вакцинации оценивали по прекращению заболевания в хозяйстве, общему состоянию иммунизированных свиней, рождаемости, сохранности и приросту массы тела поросят, а также по уровню ВНА в сыворотке крови и молозиве свиней. СПК «Агрофирма Красная Звезда» ЭДС в хозяйстве проявилась массовой диареей и гибелью 80-90% новорождённых поросят. У свиноматок диарея возникала редко, протекала легко, без повышения температуры тела и каких-либо осложнений. У свиней в период доращивания и откорма диарейный синдром не наблюдали. Для снижения экономического ущерба и при отсутствии других средств специфической профилактики в хозяйстве в марте 2008 г. стали применять инактивированную вакцину против ЭДС, приготовленную из кишечного вируса больных поросят. Её применяли аналогично вакцине ТР-1 против ТГС. Применение инактивированной вакцины сократило заболеваемость и гибель поросят с 80-90% до 40-50%, но не сопровождалось ликвидацией болезни. Поэтому в январе 2009 г. в соответствии с решением Россельхознадзора хозяйство начало испытание живой вакцины против ЭДС 85 в производственных условиях. Экспериментальную живую вакцину против ЭДС применяли согласно временной инструкции ООО «НПО НАРВАК». Супоросных свиноматок прививали внутримышечно в дозе 4,0 lg ТЦД50 (2 мл) двукратно на 75-80 и 90-95 дни супоросности. Заболевание ЭДС в хозяйстве прекратилось через 3-4 недели после начала вакцинации. Всего в 2009 г. иммунизировали 6185 основных свиноматок и ремонтных свинок. От вакцинированных свиноматок получено 48 360 поросят (9,3 поросёнка на 1 свиноматку). Сохранность поросят, полученных от вакцинированных свиноматок на участке опороса (возраст поросят 30 дней), достигала 97%. Суточный привес массы тела поросят в группе 0-2 составил 270 граммов. При передаче на доращивание в возрасте 2 месяца масса тела поросят в среднем была 18,2 кг. При изучении влияния дозы вакцины и кратности её применения на создание иммунитета у вакцинированных свиноматок (170 голов) установлено, что однократная вакцинация в дозе 3,5 lg ТЦД50 оказалась недостаточной для защиты их потомства, тогда как двукратная прививка основных свиноматок и ремонтных свинок в дозе 3,5 - 4,0 lg ТЦД50 надёжно защищала практически всех новорождённых поросят от ЭДС. Кроме супоросных свиноматок живой вакциной против ЭДС были привиты 508 поросят 60-70-дневного возраста. Вакцинация супоросных свиноматок и поросят в период доращивания не сопровождалось какимилибо отклонениями от физиологической нормы. Заболевание и гибель новорождённого молодняка с признаками диареи, характерной для ЭДС, прекратились при опоросе вакцинированных основных и ремонтных свиноматок. Лабораторные исследования фекальных масс новорожденных поросят методом ПЦР подтвердили отсутствие ЭДС в хозяйстве. Благополучие хозяйства по ЭДС сохранялась до конца периода наблюдения (декабрь 2011 г.). Вакцинация против ЭДС в хозяйстве не проводится с конца 2009 г. 86 Экономическая эффективность применения живой вакцины против ЭДС в хозяйстве согласно его данным составила 2382000 руб. Результаты испытания живой вакцины против ЭДС в СПК «Агрофирма Красная Звезда» позволили хозяйству сделать следующее заключение: «Живая вакцина против ЭДС, разработанная ООО «НПО НАРВАК», является безопасным и высоко эффективным средством специфической профилактики ЭДС». МП «Совхоз Шелонский» Эпизоотическую диарею в хозяйстве впервые обнаружили в январе 2010 у свиней в период откорма и доращивания. Заболевание сопровождалось диареей (фекальные массы серо-бурого цвета), угнетением, отказом от корма и истощением. Температура тела была в пределах нормы. На участке доращивания из 7 564 свиней заболели 4500 голов (69%), погибли 46, вынужденно убиты 150 голов. На участке откорма из 9 619 свиней заболели 9 500 голов (~ 99%), погибли 32. На участке опороса из 5325 поросят заболели только 994 поросёнка (~20%), что, по-видимому, связано с естественной иммунизацией свиноматок к периоду опороса. Вспышка диареи также охватила холостых и супоросных свиноматок с клиническими признаками – угнетение, отказ от корма, фекальные массы серо-бурого цвета. В феврале 2010 г. всех хряков и свиноматок независимо от стадии супоросности привили двукратно вакциной ВЕРРЕС-ЭДС. Всего было иммунизировано 1193 свиноматки, в том числе 170 ремонтных свинок. После вакцинации отклонений от нормы у матерей и их потомства не наблюдали. Заболевание ЭДС в хозяйстве прекратилось через 7 дней после вакцинации ВЕРРЕС-ЭДС. Сохранность поросят, полученных от вакцинированных основных свиноматок и ремонтных свинок, к периоду отъёма соответственно составила 96 и 94%. ЗАО «Тропарёво» ЭДС в хозяйстве зарегиситрировали в январе 2010 г. на одной из двух 87 племенных ферм (~600 свиноматок), трёх репродукторах из пяти (по ~2500 свиноматок в каждом) и двух площадках откорма из трёх. В феврале - апреле 2010 г. в хозяйстве провели специфическую профилактику ЭДС с использованием живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС и инактивированной вакцины против ЭДС, изготовленной из кишечного вируса от заболевших в хозяйстве поросят. Обе вакцины были изготовлены в ООО «Ветбиохим» и применялись согласно временных инструкций, разработанных и утверждённых ООО «Ветбиохим». На племенной ферме №1 (~600 свиноматок) и репродукторе №3 (~2500 свиноматок), где ЭДС наблюдали в конце февраля - начале марта, применили живую вакцину. Отход новорождённых поросят составил 8-11% при технологической норме 8%, а масса тела поросят при отъёме снизилась в среднем на 500 г по сравнению с нормой. На репродукторе №4 (~2500 свиноматок) при использовании инактивированной «кишечной» вакцины гибель поросят Таблица 25. Основные результаты вакцинации против ЭДС в ЗАО «Тропарёво» Наименование вакцины Живая вакцина Число свиноматок Отход подсосных на репродукторе поросят, % 600 11 Вес поросят при отъёме, кг 5,5 ВЕРРЕС-ЭДС 2500 8 6,0 Инактивированная кишечная вакцина 2500 49 4,5 Невакцинированная 600 48 4,7 2500 47 4,7 2500 46 4,7 2500 28 4,5 ферма Невакцинированная ферма Невакцинированная ферма Невакцинированная ферма 88 составила 49%, а масса тела к периоду отъёма снизилась в среднем на 2 кг по сравнению с нормой. На четырёх репродукторных фермах (~8000 свиноматок), где вакцинацию против ЭДС не проводили, гибель поросят составила 28-48%, а масса тела к периоду отъёма была в среднем на 2 кг меньше по сравнению с нормой (таблица 25). Данные, представленные в таблице 25, позволили сделать вывод, что инактивированная «кишечная» вакцина, содержащая полевой вирус ЭДС, в отличие от живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС не создаёт иммунной защиты. ЗАО «Алексеевский Бекон» Испытание живой вакцины против ЭДС, изготовленной ООО «Ветбиохим», проводили с 20.02 по 06.03.2010 г. Хозяйство представляет собой пять изолированных друг от друга участков. В каждом из них имеются помещения павильонной застройки для воспроизводства (2 930 свиноматок), доращивания и откорма. Вспышка ЭДС возникла на двух свинокомплексах среди завезённых из-за рубежа ремонтных свинок. Однако гибели свинок после возникновения ЭДС не наблюдали. Так как свинокомплекс находился на начальной стадии формирования в период завоза маточного поголовья, воздействию возбудителя подверглись только супоросные свиноматки. В феврале – марте 2010 в данном хозяйстве применили живую вакцину против ЭДС. В благополучном профилактической целью по ЭДС отделении иммунизировали «СК 2771 Пирогово свиноматку. 1» с После вакцинации у свиноматок и родившихся поросят каких-либо отклонений в физиологическом состоянии не отмечали. Число поросят в период отъёма оставалось в пределах технологической нормы, клинических проявлений, характерных для инфекционных болезней с диарейным синдромом, не наблюдали. Результаты исследования сыворотки крови (таблица 26) ещё раз показали, что двукратная вакцинация супоросных свиноматок значительно 89 эффективнее однократного применения вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Таблица 26. Уровень гуморального иммунитета у супоросных свиноматок в зависимости от кратности вакцинации Наименование хозяйства ЗАО «Тропарёво» ЗАО «Алексеевский Бекон» Кратность вакцинации В день вакцинации Двукратная <1:4; 1:4; <1:4; <1:4; <1:4 Однократная <1:4; <1:4; <1:4; <1:4 Титр ВНА у свиноматок Через 15 дней после Через 15 дней после ревакцинации вакцинации Сыворотка Молозиво Сыворотка крови Молозиво крови 1:20;1:40; 1:60;1:120; 1:80;1:120; 1:40;1:60; Н.И. 1:120;1:80; 1:80;1:120; 1:120 1:40 (1:40) 1:80 (1:92) (1:104) 1:40; 1:30; 1:40; 1:40; 1:30 (1:36) 1:40;1:60; 1:60;1:40; 1:40 (1:48) НИ НИ Примечания. В скобках указаны средние значения по группе. НИ - не исследовали ЗАО «Им. Фрунзе» Вакциной ВЕРРЕС-ЭДС с марта по май 2010 г. вакцинировали 258 основных свиноматок и 102 ремонтных свинок, от которых при опоросе получили по 1828 и 755 поросят. Из числа новорождённого потомства признаки диареи обнаружены соответственно у 198 и 50 поросят. Сохранность молодняка к периоду отъёма в группе основных свиноматок была 89,1% , а в группе ремонтных свинок – 93,4%. Сохранность поросят в целом по сравнению с периодом, предшествовавшим вакцинации, возросла на 40%. При иммунизации свиноматок отклонений от нормы у матерей и у потомства не отмечали. Заболевание ЭДС в хозяйстве прекратилось через 14 дней после вакцинации свиноматок. 2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов живой вакцины против ЭДС Живую вакцину против ЭДС первоначально готовили в жидком виде со стабилизатором и хранили в замороженном состоянии при температуре не выше -200С. С разработкой живой сухой вакцины ЭДС появилась возможность сравнить эффективность их применения. Сравнительное 90 испытание эффективности двух вариантов одной и той же вакцины было проведено в МП «Совхоз Шелонский» Псковской области в марте-апреле 2010 г. ЭДС в данном хозяйстве характеризовалась массовыми диареями у свиней разного возраста и высокой смертностью подсосных поросят, особенно в первые дни после рождения. Основных и ремонтных супоросных свиноматок прививали одним из двух вариантов вакцины ВЕРРЕС-ЭДС: одну часть (410 свиноматок) – «жидкой» вакциной, другую (416 свиноматок) – сухой вакциной. «Жидкую» вакцину доставляли в хозяйство и хранили в замороженном виде при -200С. Обе вакцины применяли согласно инструкции. Свиноматок прививали в дозе 4,0 lg ТЦД50, двукратно, внутримышечно. Таблица 27. Эффективность вакцинации супоросных свиноматок двумя вариантами вакцины против ЭДС Число поросят Вариант живой вакцины «Жидкая вакцина» Сухая вакцина Число привитых свиноматок Родилось Отнято Титр ВНА в сыворотке Сохранность крови (%) свиноматок при опоросе* 97,2 1:80 Основных 276 голов Ремонтных 140 голов Основных 240 голов 3057 2966 1411 1369 97,0 1:68 2631 2558 97,3 1:66 Ремонтных 170 голов 1758 1685 95,8 1:87 Примечание. * - Титр ВНА в среднем по группе из 5 свиноматок Оба варианта живой вакцины обладали равной эффективностью при применении в неблагополучном по ЭДС хозяйстве. На фоне острой вспышки болезни оба варианта вакцины показали полную безопасность и практически абсолютную эффективность применения. Сохранность поросят от момента рождения до периода отъёма в возрасте 28-30 дней составила 95-97% 91 (таблица 27). При массовой вакцинации супоросных свиноматок в целом по хозяйству сохранность поросят на участке опороса составила 95,8-97,3%. 2.2.6. ОДНОВРЕМЕННАЯ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНАЯ ВАКЦИНАЦИЯ СВИНЕЙ ПРОТИВ ЭДС И ТГС Вирусные гастроэнтериты свиней имеют широкое распространение и причиняют значительный экономический ущерб промышленному свиноводству развитых стран. К этой группе клинически сходных заболеваний относят трансмиссивный гастроэнтерит свиней эпизоотическую диарею свиней (ЭДС) и ротавирусную (ТГС), диарею свиней (РВДС). В практических условиях часто имеет место одновременное течение двух заболеваний. Это прежде всего относится к ТГС и РВДС. Отмечены также случаи последовательной смены ТГС на ЭДС в одних и тех же хозяйствах без представляется заметного временного целесообразным интервала. изучить В связи возможность с этим одновременной иммунизации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС. В работе использовали основных свиноматок на второй и третьей супоросности. Все свиноматки перед вакцинацией были серонегативными в отношении вирусов ТГС и ЭДС. Для иммунизации свиноматок использовали живые сухие моновалентные вакцины. Вакцина против ТГС изготовлена из природно аттенуированного мутанта вируса ТГС (респираторный коронавирус свиней (РКВС), штамм Holland). Вакцина против ЭДС изготовлена из аттенуированного штамма ИС вируса ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС). Кроме живой вакцины против ТГС использовали инактивированную ГОА-вакцину ТР-1, изготовленную из культурального вакцинного штамма ТМК вируса ТГС [1]. Все указанные вакцины произведены в ООО «НПО НАРВАК» по соответствующим технологиям. Свиноматок иммунизировали живыми моно- и бивалентными 92 вакцинами внутримышечно в область шеи, двукратно, на 75-80 и 90-95 дни супоросности. При одновременном применении живой вакцины против ЭДС и инактивированной вакцины против ТГС (ТР-1) их вводили свиноматкам одновременно внутримышечно с разных сторон шеи в указанные сроки супоросности. Живые вакцины вводили в следующих дозах: ТГС (РКВС) – 5,0 lg ТЦД50, и ВЕРРЕС-ЭДС – 4,0 lg ТЦД50. Инактивированную вакцину ТР-1 вводили в объёме 2 мл. При одновременном применении двух сухих живых вакцин их после растворения смешивали таким образом, чтобы в прививочном объёме содержалась одна прививочная доза каждой вакцины. Свиноматок прививали моновалентными вакцинами раздельно против ЭДС и ТГС или одновременно против двух заболеваний. Каждой моновалентной или бивалентной вакциной прививали по 5 свиноматок. Эффективность иммунизации свиноматок оценивали по уровню ВНА против каждого исследуемого вируса в сыворотке крови до и после иммунизации. Кровь у свиноматок брали в день первой иммунизации и через 1-2 дня после опороса. Титр ВНА к вирусу ЭДС определяли в культуре клеток Vero, а к вирусу ТГС – в культуре клеток СПЭВ. В этих опытах сравнивали пять схем вакцинации: 1. Раздельное введение двух живых сухих вакцин: ВЕРРЕС-ЭДС и РКВС; 2. Введение бивалентной живой вакцины против ЭДС и ТГС; 3. Одновременное введение живой вакцины против ЭДС и инактивированной вакцины против ТГС; 4. Последовательное введение живой вакцины против ЭДС и инактивированной вакцины против ТГС; 5. Последовательное введение инактивированной вакцины против ТГС и живой вакцины против ЭДС. Выраженность иммунного ответа супоросных свиноматок на введение различных моно- и бивалентных вакцин оценивали по уровню 93 специфических ВНА. 2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин Сравнительное испытание живых вакцин против ЭДС и ТГС выявило их различную антигенную активность для супоросных свиноматок. Живая вакцина против ЭДС обладала более выраженной антигенной активностью, чем живая вакцина против ТГС. Титр ВНА в среднем по группе свиноматок соответственно составлял 1:64 и 1:51 (таблица 28). Таблица 28. Антигенность моновалентных живых вакцин против ЭДС и ТГС Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС РКВС (против ТГС) Титр ВНА к гомологичным вирусам 1:32, 1:32, 1:64, 1:64, 1: 128 (1:64) 1:64, 1:32, 1:32, 1:64, 1: 64 (1:51) Примечание. В скобках указано среднее значение титра ВНА по группе супоросных свиноматок 2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС) Антигенную активность живой бивалентной вакцины против ЭДС + ТГС сравнивали по титру ВНА к вирусам, входящим в её состав. Результаты этого опыта показали снижение антигенной активности обоих вирусов в бивалентной вакцине по сравнению с моновалентными аналогами (таблица 29). Следовательно, вакцинацию против ЭДС и ТГС с применением живых Таблица 29. Антигенность бивалентной живой вакцины Титр ВНА к вирусу ЭДС На бивалентную вакцину ЭДС+ТГС 1:16, 1:32, 1:16, 1:32, 1: 64 (1:32) На моновакцину против ЭДС 1:32, 1:32, 1:64, 1:64, 1: 128 (1:64) Титр ВНА к вирусу ТГС На бивалентную вакцину ЭДС+ТГС 1:8, 1:8, 1:16, 1:16, 1: 16 (1: 13) На моновакцину против ТГС 1:64, 1:32, 1:32, 1:64, 1: 64 (1:51) Примечание. В скобках указано среднее значение титра ВНА по группе супоросных свиноматок. 94 вакцин целесообразно проводить раздельно. 2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ВЕРРЕС-ЭДС и ТР-1 Учитывая особую актуальность защиты свиней от ТГС и наличие высокоэффективной инактивированной вакцины ТР-1 в качестве основного средства специфической защиты от ТГС в производственных условиях, а также снижение представлялось эффективности важным изучить бивалентной возможность живой её вакцины, одновременного применения с живой вакциной против ЭДС. В хозяйстве СПК «Агрофирма Красная Звезда» серонегативных свиноматок прививали одновременно против ЭДС и ТГС. В хозяйствах МП «Совхоз Шелонский» и ЗАО «Залесье» Ярославской обл. свиноматок вакцинировали против ТГС, а затем спустя 30-45 дней против ЭДС. Вакцинацию против ТГС в обоих хозяйствах проводили с профилактической целью, тогда как вакцинацию против ЭДС в тех же хозяйствах проводили в экстренном порядке в связи с внезапным возникновением данного заболевания. Результаты исследования (таблица 30) показали, что инактивированная вакцина ТР-1 против ТГС обладает значительно более выраженной антигенной активностью по сравнению с живой вакциной на основе РКВС (таблицы 28 и 29). При одновременном применении вакцин ТР-1 и ВЕРРЕСЭДС снижалась антигенная активность обеих вакцин примерно в 1,5 раза по сравнению с их раздельным применением. Вместе с тем введение вакцины ТР-1, а через 30-45 дней вакцины ВЕРРЕС-ЭДС приводило к такому же антительному ответу к обоим вирусам, как и после их раздельного применения. Эти данные свидетельствуют о значительном подавлении развития иммунитета к обоим вирусам при одновременном применении двух вакцин и указывают на целесообразность их последовательного применения. 95 Таблица 30. Антигенная активность комбинированной супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС Титр ВНА К вирусу ТГС К вирусу ЭДС вакцинации Вакцины Хозяйство ТР-1 ВЕРРЕС-ЭДС ТР-1 + ВЕРРЕСЭДС Красная Звезда 1:240 __ 1:140 Шелонский 1:80 __ __ Залесье 1:128 __ 1:80 Красная Звезда __ 1:60 1:42 Шелонский __ 1:60 __ Залесье __ 1:80 1:60 2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС Приведённые выше данные показали, что при одновременном применении вакцины против ТГС (инактивированная вакцина ТР-1) и ЭДС (живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) защитный эффект вакцинации против ТГС может быть значительно снижен. Кроме того, возникают технические неудобства (введение вакцин с двух сторон шеи), Поэтому представлялось целесообразным изучить эффективность последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС. В опыте использовали две группы по 7 супоросных свиноматок. Одну группу супоросных свиноматок (группа 1) вакцинировали вначале против ТГС (вакцина ТР-1), а спустя 21-30 дней – против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС). Другую группу супоросных свиноматок (группа 2) вакцинировали вначале против ЭДС, а спустя 21-30 дней – против ТГС. В каждой группе вакцинировали по 7 серонегативных свиноматок. Кровь для определения титра ВНА у свиноматок обеих групп брали дважды через 21 день после введения первой вакцины и через 21 день после введения второй вакцины. 96 Результаты этого опыта (таблица 31) показали, что при последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС (вакцина ТР-1), а затем против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и наоборот с интервалом между вакцинациями 21 день антигенность указанных вакцин не снижается. Для гуморального иммунитета не имеет существенного значения, какую из двух вакцин применяли сначала, а какую - потом. Такая схема вакцинации удобна для практического применения против обоих заболеваний и может быть использована в случае необходимости. Таблица 31. Эффективность двух схем последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС Группа вакцинированных свиноматок 1 2 Титр ВНА к вирусу ТГС, Титр ВНА к вирусу ЭДС, срок после первой вакцинации срок после первой вакцинации 21 день 42 дня 1:80, 1:160, 1:120, 1:240, 1:80, 1:120, 1:180 1:240, 1:80, 1:60, 1:180, 1:200, 1:160, 1:160 1:240, 1:80, 1:60, 1:180, 1:200, 1:160, 1:160 21 день 42 дня 1:50, 1:80, 1:30, 1:40, 1:60, 1:30, 1:40 1:30, 1:60, 1:40, 1:40, 1:30, 1:60, 1:30 1:30, 1:60, 1:40, 1:40, 1:30, 1:60, 1:30 Примечание. В скобках указано среднее значение титра ВНА по группе свиноматок. 97 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Вакцинопрофилактика по праву считается одним из выдающихся достижений биологической науки, характерной чертой развития которой является быстрое использование достижений в других областях науки. Благодаря этому достигнуты большие успехи в борьбе со многими опасными инфекционными заболеваниями человека и животных. Например, с помощью глобальной вакцинопрофилактики в мире искоренена натуральная оспа человека (1979 г.), создан эффективный контроль других опасных заболеваний человека, таких как полиомиелит, грипп, корь, бешенство и другие. Значительный успех достигнут в ликвидации и профилактике многих глобальных вирусных болезней животных (ящур, классическая чума свиней, чума жвачных, ньюкаслская болезнь птиц и др.). Специфическая профилактика сельскохозяйственных животных многих достигла инфекционных болезней исключительно широких масштабов и стала неотъемлемой частью технологии промышленного животноводства развитых стран. Изготовление некоторых вакцин исчисляется миллионами и миллиардами доз. Центральным звеном разработки и производства современных вирусных вакцин является размножение вирусов в культуре клеток. Размножение вирусов млекопитающих и птиц in vitro стало основным методом вирусологии, особенно при изготовлении средств специфической профилактики. За небольшим исключением (калицивирусы, торовирусы, вирусы папилломы человека, геморрагической болезни кроликов, гепатита Е), вирусы человека и животных успешно выращивают in vitro. Оказалось, что разные вирусы значительно различаются по спектру чувствительности культур клеток, способных поддерживать их репликацию. Одни вирусы размножаются в клетках многих типов первичных культур и линий, другие – только в клетках некоторых линий. Например, представители семейств 98 пикорнавирусов и парвовирусов как правило реплицируются в культурах клеток натуральных хозяев, тогда как рабдовирусы обладают широким хозяинным спектром in vitro. Представители семейства парамиксовирусоув значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра in Вообще спектр чувствительных культур клеток к данному вирусу vitro. предсказать невозможно. Наиболее чувствительный клеточный субстрат устанавливают экспериментальным путём или на основе данных литературы. Выбор наиболее продуктивной культуры клеток для данного вируса часто является непростой задачей. Даже при размножении в наиболее чувствительной культуре разные вирусы существенно различаются по уровню накопления, особенно инфекционного вируса. Например, полиовирус и вирус ящура в элективных культурах клеток накапливаются в высоком титре (107 – 109 ТЦД50/мл). Вирус везикулярного стоматита обладает широким хозяинным спектром in vitro и высоким накоплением [9]. Оказалось, что клетки естественно восприимчивого вида, не являясь клетками-мишенями in vivo, могут приобрести высокую чувствительность к вирусу после размножения в культуре клеток. Например, размножение нейротропного вируса полиомиелита в культуре клеток почки приматов стало открытием, положившим начало новому направлению в вирусологии. Другим примером является эпителиотропный вирус ящура, который прекрасно размножался в культуре клеток почки телят. Можно привести множество подобных примеров, которые свидетельствуют об изменении рецепторного аппарата клеток в результате их эксплантации и размножения in vitro. Уровень накопления вируса в культуре клеток позволяет сделать важный выбор в пользу изготовления живой или инактивированной вакцины. При низком накоплении вируса остаётся возможность изготовления только живой вакцины. Возможность крупномасштабного изготовления культуральных инактивированных вакцин против полиомиелита и ящура 99 является счастливым исключением и венцом биотехнологии 20-го века. Вирус для первой вакцины размножают в первичной культуре (субкультуре) клеток почки обезьян, для второй – в культуре клеток почки сирийского хомяка (в реакторах большой ёмкости > 1000 л). Особенно важная роль культурам клеток принадлежит в разработке и производстве средств специфической профилактики вирусных заболеваний человека и животных. За небольшим исключением, вирусы человека и животных размножают in vitro. Однако они значительно различаются между собой по спектру чувствительных культур клеток и интенсивности репликации. Одни вирусы обладают широким спектром чувствительных культур клеток, другие – узким. Например, представители семейств пикорнавирусов и парвовирусов, как правило, реплицируются в культурах клеток естественных хозяев, тогда как рабдовирусы обладают более широким спектром чувствительных клеток независимо от их происхождения. Представители одного и того же семейства вирусов могут значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра клеточных культур. Как правило, чувствительными к каждому конкретному вирусу оказываются культуры клеток (первичные, субкультуры, перевиваемые линии), происходящие от естественно восприимчивого вида. Смена культуры клеток одного вида на культуру клеток другого вида в процессе серийного пассирования вируса может привести к увеличению его накопления без заметного изменения других свойств. Как первичные культуры, так и постоянные линии клеток обладают различной чувствительностью к вирусам. Одни линии являются хорошим субстратом для репродукции лишь отдельных вирусов, другие обладают высокой чувствительностью к широкому спектру вирусов. К линиям клеток с широким спектром вирусной чувствительности относятся Vero, BHK-21, МА-104, HeLa. Линия клеток МА-104 почки эмбриона макака резуса явилась весьма продуктивной для ротавирусов. Линия клеток карциномы человека 100 HeLa – для аденовирусов. Линия клеток почки новорожденного хомячка BHK-21 высоко чувствительна к таким возбудителям, как вирусы ящура, бешенства, катаральной лихорадки овец, болезни Ауески и др. Широкое применение для производственного культивирования вирусов получили также постоянные линии клеток свиней (СПЭВ, ППС, РК-15, IB-RS-2), крупного рогатого скота (MDBK) и других видов животных. Из перевиваемых (диплоидных) культур клеток широкое применение получили культуры фибробластоподобных клеток WI-38 и MRC-5, из первичных культур клеток - фибробластов эмбрионов птиц, прежде всего кур [9, 18]. Некоторые постоянные линии клеток оказались эффективными культуральными системами для репродукции кишечных вирусов, клеткамимишенями для которых in vivo являются в основном эпителиальные клетки ворсинок тонкого кишечника (корона-, рота- и астровирусы человека и животных [163, 175]). Постоянные линии клеток, полученные из одних и тех же тканей одного вида животных, так же как их сублинии (клеточные клоны), могут значительно различаться между собой по спектру чувствительности и интенсивности вирусной репродукции. Однако в наших опытах использование двух сублиний клеток Vero с целью выхода вакцинного вируса ЭДС не дало позитивного результата. По спектру чувствительных культур клеток близкородственные вирусы возбудители ТГС и ЭДС существенно отличаются между собой. Вирус ТГС легко адаптируется и успешно размножается в клетках многих линий свиного происхождения, тогда как вирус ЭДС пока удалось выделить и серийно размножить только в культуре клеток почки зелёной мартышки Vero. В наших опытах вирус ЭДС, прошедший 100 пассажей в культуре клеток Vero, приобрёл умеренно выраженную способность размножаться (103,0 -104,7 ТЦД50/мл) и вызывать цитопатические изменения в линии клеток свиньи IBRS-2 и линии клеток макак МARC-145. Однако линии клеток свиньи РК-15 и СПЭВ по-прежнему оставались нечувствительными к вирусу ЭДС, 101 адаптированному к культуре клеток Vero. Таким образом, по способности размножаться in vitro вирус ЭДС оказался исключением из общего правила, согласно которому чувствительными к природному вирусу прежде всего являются культуры клеток естественно восприимчивого хозяина. Кроме отмеченной выше особенности, вирус ЭДС по мере серийного пассирования в культуре клеток Vero с большим трудом повышал уровень накопления. Даже после 60 пассажей его максимальная инфекционная активность оставалась на уровне 106,0 – 106,5 ТЦД50/мл. Этот факт ещё раз подтверждает биологическое различие между вирусами-представителями одного рода и указывает на необходимость изыскания другой возможности повышения урожайности вакцинного вируса ЭДС. Низкая урожайность вакцинного штамма вируса ЭДС в культуре клеток Vero, возможно, обусловлена тем, что в продуктивной инфекции участвуют лишь 10-20% инфицированных клеток. Подобное явление было показано в опытах с вирусом Ньюкаслской болезни и вирусом бешенства [9]. Даже при оптимальном выборе чувствительной клеточной системы урожай вируса может зависеть от условий культивирования. Это обстоятельство имеет важное значение для вирусов с относительно низким природным уровнем репликации (например, флавивирусы). Кроме выбора наиболее продуктивной культуры клеток важное значение может иметь оптимизация условий культивирования. Накопление вируса прямо зависит от физиологического состояния культуры клеток, которое в свою очередь зависит от ряда факторов: состава питательной среды, температурного режима, плотности посева, способа культивирования (монослойный – стационарный и роллерный или суспензионный), а для некоторых вирусов ещё и от присутствия в среде дополнительных активирующих агентов: фитогемагглютинина, диметилсульфоксида [166] или трипсина [64]. 102 Однако даже при оптимальном режиме культивирования урожай различных вирусов достигает разного значения. Например, полиовирус, вирус ящура накапливаются в титре 107 – 109 ТЦД50/мл, тогда как другие представители семейства пикорнавирусов накапливаются в титре 10 4 – 106 ТЦД50/мл. Например, представитель рода альфакоронавирусы вирус ТГС при оптимальном режиме культивирования накапливается в титре 107,5 – 109,0 ТЦД50/мл, что примерно в 100 раз превышает накопление другого представителя данного рода, вируса ЭДС. Специфическая профилактика вирусных болезней основывается главным образом на применении живых культуральных вакцин. Однако против некоторых заболеваний созданы и успешно применяютя культуральные инактивированные вакцины. К таким заболеваниям помимо полиомиелита и ящура относится трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС). Против последних двух не удалось создать безопасную и эффективную живую вакцину. С давних пор известно, что инактивированные вакцины можно приготовить из природного вируса, если он не размножается in vitro. При отсутствии эффективной живой культуральной вакцины против ЭДС изначально готовили инактивированную вакцину из вируса, содержащегося в кишечнике больных новорождённых поросят. Однако такая вакцина не обладала выраженной эффективностью, вероятно, из-за недостаточно высокого содержания вирусного антигена в кишечном материале больных поросят. Для профилактики полиомиелита в начале была разработана инактивированная культуральная вакцина, затем живая культуральная вакцина. Обе вакцины оказались весьма эффективными и применяются раздельно или сочетано в зависимости от эпидемиологической обстановки по полиомиелиту. Следует отметить, что инактивированные культуральные вакцины могут быть эффективными только при условии высокого 103 накопления вирулентного штамма вируса (> 107 ТЦД50/мл) после непродолжительного пассирования в чувствительной культуре клеток и максимального сохранения антигенности вируса перед его инактивацией. Таким требованиям удовлетворяют инактивирванные культуральные вакцины против полиомиелита, ящура и трансмиссивного гастроэнтерита свиней [9]. При сравнительном испытании эффективности инактивированной «кишечной» и живой культуральной вакцин против ЭДС в наших исследованиях было показано, что живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС является существенно более инактивированной эффективным «кишечной» препаратом вакциной. по При сравнению с использовании инактивированной «кишечной» вакцины гибель поросят составила 49%, а масса тела к периоду отъёма снизилась в среднем на 2 кг по сравнению с нормой. На фермах, где вакцинацию против ЭДС не проводили, гибель поросят составила 28-48%, а масса тела к периоду отъёма была в среднем на 2 кг меньше по сравнению с нормой. Современная вакцинопрофилактика основывается преимущественно на применении живых вакцин, создание которых прежде всего зависит от получения вакцинного штамма. Живые вакцины, применяемые в медицине и ветеринарии, различаются между собой во многих отношениях, начиная от способа аттенуации вируса до условий применения и выраженности вакцинального иммунитета. С целью аттенуации и получения вакцинных штаммов вирусы, как правило, размножают в культуре клеток. Размножение вирусов in vitro вне естественно восприимчивого организма сопровождается изменениями вирусного генома и селекцией мутантов в соответствиями с новыми условиями репликации. Указанные изменения нарастают по мере пассирования вируса и всё отчётливее проявляются изменением его фенотипических свойств, в том числе ослаблением, а затем и потерей вирулентности. Данный механизм популяционной изменчивости является 104 общебиологической закономерностью [59, 60]. Наиболее распространённым способом аттенуации вирусов является серийное пассирование в чувствительной культуре клеток. Данный способ аттенуации вирусов давно используют при получении вакцинных штаммов против различных заболеваний, в том числе против полиомиелита, кори, бешенства, жёлтой лихорадки, чумы свиней и жвачных и др. Этот метод основан на селекции мутантов, образующихся в результате пассирования. Получаемые таким способом аттенуированные штаммы аккумулируют в себе множество спонтанных мутаций, что гарантирует им генетическое и фенотипическое отличие от полевого вируса и стабильность аттенуации. Однако несмотря на успешное применение многих живых вакцин, разработанных на основе вакцинных штаммов, полученных таким способом, генетическая природа аттенуации в большинстве случаев остаётся неизвестной. Опыт аттенуации вирусов с целью получения вакцинных штаммов показал, что сочетание надёжного уровня аттенуации и сохранения антигенности (иммуногенности) при последующем размножении часто является трудной задачей и во многом является делом случая [109]. Сложность решения этой задачи можно продемонстрировать на примере получения вакцинного штамма вируса гепатита утят. При серийном пассировании вируса на утиных эмбрионах выраженная аттенуация наступала через 50-55 пассажей, но при этом ослаблялась иммуногенность штамма [44, 181]. Наши исследования по получению и изучению вакцинного штамма вируса ЭДС оказались счастливым исключением. Вирус утратил вирулентность после 25 - 30 серийных пассажей в культуре клеток Vero. Период выраженной иммуногенности после аттенуации вируса составлял не менее 60 пассажей в культуре клеток Vero. Безопасные и высокоэффективные вакцинные штаммы быстрее и чаще удавалось получить у оболочечных, чем у безоболочечных вирусов. Тип 105 геномной нуклеиновой кислоты не имел значения. Продолжительность аттенуации колеблется в широких пределах и зависит от вируса и условий размножения in vitro. Одни вирусы быстро теряли вирулентность, другие нуждались в длительном серийном размножении. Короткий период аттенуации наблюдали в опытах с двумя вирусами птиц. Аттенуация вируса чумы уток наступала примерно через 20 пассажей в культуре клеток эмбриона кур, а аттенуация вируса ринотрахеита индеек происходила через 17 пассажей в культуре клеток Vero [176]. Для аттенуации вирусов кори и полиомиелита методом серийного пассирования требовался более продолжительный период [61, 63]. В последнее время уделяется большое внимание изучению молекулярных основ аттенуации вирусов. Идентификация вирусных генов, определяющих иммунобиологические свойства, представляет огромный практический интерес для получения, поддержания и контроля вакцинных штаммов. Молекулярными основами для аттенуации являются изменения в вирусном геноме, которые делятся на замены отдельных нуклеотидов (точечные мутации), делеции и инсерции. Вирусы, геном которых представлен РНК, больше подвержены мутациям по сравнению с ДНКсодержащими вирусами, так как при репликации РНК ошибки генерируются примерно в 10 тысяч раз чаще по сравнению с репликацией ДНК [53, 108]. Изменения в геноме приводят к изменению последовательности аминокислот, а также к изменению конформации и гликозилирования вирионных белков. Например, адаптация вируса гепатита А к культуре клеток сопровождается нуклеотидными делециями в гене, кодирующем VP1 (белок, который играет важную роль в начальной стадии инфекции). После 60 пассажей в культуре клеток было обнаружено 18 нуклеотидных делеций, обусловливающих замещение минимум 6 аминокислот в VP1 [132]. В опытах с вирусом бешенства установлено, что замена двух аминокислот сопровождалась потерей нейровирулентности [165]. 106 Аттенуация вируса и приобретение им способности размножаться в клетках новых биологических линий являются вариантов результатом (субпопуляций) селекции вируса, различных отличающихся от исходной популяции [59, 60]. Субпопуляции одного и того же вируса, полученные серийным размножением в различных линиях клеток, отличаются антигенными свойствами от вируса дикого типа и между собой [17, 62, 103]. Аттенуация вирусов, как правило, связана с изменением их клеточного тропизма в привитом организме. В тех случаях, когда клетки-мишени являются первичным и единственным местом репликации вакцинного вируса, создание эффективной и безопасной живой вакцины затруднено, так как репликация вакцинного вируса вызывает те же повреждения клеток, что и репликация полевого вируса. В идеале, аттенуированный вирус должен практически утрачивать способность поражать клетки-мишени, но сохранить или приобрести способность размножаться в других клетках, обеспечивая создание выраженного иммунитета и иммунологической памяти при минимальной реактогенности и полной безопасности [100]. Альтернативно можно допустить ситуацию, при которой размножение вакцинного вируса происходит лишь в небольшой части клеток-мишеней и сопровождается массовым образованием ДИЧ, ограничивающих численность клеток- мишеней для размножения вакцинного вируса в результате гомологичной интерференции. Также можно допустить, что репродукция вакцинного штамма вируса в клетках-мишенях блокируется на разных стадиях репликативного цикла. Многие вирусы в результате серийного пассирования в культуре клеток одного вида приобретают способность реплицироваться и в других клеточных культурах, то есть расширяют спектр чувствительных клеток in vitro. Например, штамм Edmonston вируса кори был сначала выделен в первичной культуре почки человека. После 26 серийных пассажей в той же 107 культуре при пониженной температуре и 28 пассажей в первичной культуре амниона человека штамм приобрёл способность к репликации в куриных эмбрионах, а затем в культуре куриных фибробластов [61], т.е. в клетках организма, не являющегося натуральным хозяином вируса кори. Подобные примеры быстрой смены клеточного тропизма известны с другими вирусами. В наших опытах вакцинный штамм вируса ЭДС после 100 пассажей в культуре клеток Vero обнаружил лишь умеренно выраженную способность размножаться (103,00 – 104,76 ТЦД50/мл) и вызывать ЦПЭ в одной из трёх исследованных линий клеток свиньи (IB-RS-2), что свидетельствует о его генетическом консерватизме. Данные различных авторов свидетельствуют, что в основе аттенуации вируса ЭДС в процессе серийного пассирования в культуре клеток лежат изменения в генах M, S [118, 135, 144] и особенно в гене ORF3. Ген ORF3 вируса ЭДС кодирует неструктурный протеин, который, по данным одной группы исследователей [173], участвует в регуляции продукции вируса посредством формирования ионных каналов в мембранах инфицированных клеток-хозяев. Адаптация вируса ЭДС к культуре клеток Vero сопровождается одновременно аттенуацией вируса и мутациями в гене ORF3, из которых наибольшее значение отводится делеции размером 51 нуклеотидов. Такой делецией обладает ген ORF3 аттенуированных вакцинных штаммов DR13, KPED-9 и P-5V, тогда как ни у одного штамма вируса ЭДС дикого типа она не выявлена [119]. Поэтому в последнее время ген ORF3 рассматривается как маркёр адаптации к культуре клеток и аттенуации вируса ЭДС [40]. В нашем исследовании вакцинный штамм ИС отличался от прототипного штамма CV777 делецией в последовательности ORF3 размером 29 (пассаж 70) и 38 (пассаж 110) нуклеотидов. Данная делеция рассматриватся нами как генетическая основа аттенуации вакцинного штамма ИС вируса ЭДС. Аналогичное явление лежит в основе потери вирулентности вирусом 108 ТГС в результате делеций в генах 3а, 3b и особенно S. Делеция 5’- концевой последовательности гена S привела к возникновению природного авирулентного варианта вируса, называемого респираторным коронавирусом свиней (РКВС), который широко используется в качестве вакцины [8, 121, 123, 130, 139]. Существование природно-аттенуированных штаммов известно и у других вирусов. Например, штаммы полиовируса, выделенные от здоровых людей, обладают пониженной нейровирулентностью, а часть из них (~20%) являются авирулентными. Вакцинный штамм против полиовируса типа 2 является природно аттенуированным [109]. Природно аттенуированные штаммы вируса ньюкаслской болезни также широко распространены и используются в качестве живых вакцин [9]. Изготовление живых вакцин неизбежно связано с пассированием вакцинного штамма. Если оно происходит в той же культуре клеток, в которой произошла его аттенуация, то это не угрожает реверсии его вирулентности, но угрожает снижением иммуногенности живой вакцины со временем по мере пассирования. Следовательно, при характеристике вакцинного штамма должна быть установлена потенциальная стабильность его иммуногенных свойств при последующем пассировании в культуре клеток, используемой при производстве живой вакцины. Для многих вакцинных штаммов определено число пассажей, в пределе которых они сохраняют антигенные свойства и могут быть использованы для изготовлении вакцины. Антигенные свойства аттенуированного штамма ИС вируса ЭДС практически не изменились на протяжении не менее 60 серийных пассажей после аттенуации (срок наблюдения). Вирус ЭДС, прошедший в культуре клеток Vero с начала адаптации 40, 50, 60, 70, 80 и 90 пассажей, вызывал выраженный антительный ответ одинакового уровня при иммунизации свиней, который обеспечивал защиту новорождённых поросят от заражения инфекционным вирусом ЭДС в экспериментальных и полевых условиях. Это 109 свидетельствует о сохранении антигенной структуры вируса ЭДС как в ходе аттенуации в культуре клеток Vero, так и в ходе его дальнейшего серийного размножения в данной культуре клеток в исследованном диапазоне. Данное свойство вакцинного штамма ИС обеспечило возможность его длительного использования при серийном крупномасштабном производстве живой вакцины против ЭДС. Использование для этой цели вакцинного штамма более высокого уровня пассажа в культуре клеток Vero, чем 90-й требует соответствующего изучения. Стабильность иммуногенных свойств аттенуированного штамма вируса ЭДС на протяжении длительного серийного пассирования в культуре клеток Vero согласуется с консерватизмом его репликативных свойств. Штамм ИС после 100 пассажей в культуре клеток Vero остался неспособным размножаться в двух линиях клеток свиньи, РК-15 и СПЭВ. Несмотря на морфологическое и молекулярно-биологическое сходство вирусов-возбудителей «заболеваний-близнецов» ЭДС и ТГС, данные заболевания имеют ряд существенных различий. ТГС характеризуется более высокой летальностью новорождённых поросят, передачей вируса ТГС с молозивом, преимущественно острым течением болезни. ЭДС чаще, чем ТГС переходит в хроническую форму и характеризуется большим разнообразием течения в полевых условиях и различных географических регионах [122]. Массовая серопозитивность у различных групп свиней в неблагополучных хозяйствах при отсутствии признаков болезни свидетельствует о широком латентном инфицировании при ЭДС. Возможно, этим объясняется меньшая заболеваемость и смертность новорождённых поросят при ЭДС, чем при ТГС в полевых условиях. Международный опыт борьбы против ТГС показал низкую эффективность различных живых вакцин. Например, для положительного эффекта живой вакцины ТО-193 требовалось её введение в большой дозе (109,3 ТЦД50). Даже несмотря на широкое распространение природного 110 авирулентного мутанта, респираторного коронавируса свиней (РКВС), ТГС во многих регионах долгое время оставался проблемой [8, 137]. На территории России в настоящее время многие промышленные свиноводческие хозяйства неблагополучны по коронавирусным гастроэнтеритам: одни хозяйства неблагополучны по ТГС, другие – по ЭДС, третьи – по ЭДС и ТГС и лишь небольшая часть из числа обследованных хозяйств свободна от этих болезней. В целом в России ареал распространения ТГС сокращается, а ЭДС - расширяется. Значительное сокращение заболеваемости свиней ТГС в стране, по-видимому, обусловлено прежде всего своевременной диагностикой и эффективной вакцинопрофилактикой свиней с использованием инактивированных вакцин в предыдущий период (конец 20 – начало 21 столетия). Первичное появление ЭДС в России приходится на конец 2006 – начало 2007 гг. и, вероятно, связано с интенсивным импортом племенных свиней, латентно инфицированных вирусом ЭДС. В связи с этим вакцинопрофилактика ЭДС в промышленном свиноводстве России имеет особую актуальность. Оптимизация условий производственного размножения вакцинного штамма вируса имеет важное значение, особенно при недостаточно высоком накоплении вакцинного штамма при изготовлении живой вакцины. Исследования в данном направлении проведены нами при выращивании вакцинного штамма ИС вируса ЭДС в культуре клеток Vero. Известно, что роллерное выращивание различных культур клеток (как первичных, так и перевиваемых) позволяет увеличивать урожай клеток в 2 3,5 раза по сравнению со стационарным культивированием при прочих равных условиях [21]. При роллерном культивировании вирусов ящура, бешенства, кори и других вирусов урожай вируса возрастал по сравнению со стационарным культивированием [143]. Однако это имело значение в основном для увеличения выхода вирусного антигена при изготовлении инактивированной вакцины и практически не влияло на выход 111 инфекционного вируса, что важно при изготовлении живой вакцины. Накопление вируса в культуре зависит от множественности заражения, которая главным образом влияет на продолжительность накопления вируса, а не на его урожай. Для заражения однослойных культур с целью накопления вируса обычно применяют 0,001—0,1 ТЦД50 на одну клетку (М = 0,001—0,1). При этом накопление вируса в культуре является суммарным результатом многоцикловой репродукции. В случаях, когда имеют дело с культурами клеток, жизнеспособность которых снижается быстро, а вирусы не обладают коротким циклом репродукции, множественность заражения имеет более важное значение. Эти культуры заражают таким образом, чтобы как можно больше клеток включить в первичный инфекционный процесс. Повышение урожая некоторых вирусов наблюдали при использовании высокой множественности заражения (М=10—100). Кроме того, использование высокой множественности заражения способствовало получению «раннего» вируса везикулярного стоматита (спустя 4,5 ч после заражения), с повышенным содержанием вирионного белка, ответственного за иммуногенную активность. Однако высокая множественность заражения особенно в процессе серийного пассирования может привести к изменению соотношения инфекционных и дефектных (неинфекционных) интерферирующих частиц (ДИЧ) и тем самым снизить выход инфекционного вируса и изменить фенотипические свойства вирусной популяции [105]. Согласно результатам наших исследований, наиболее существенное влияние на выход инфекционного вируса оказали множественность заражения культуры клеток и удаление следов сыворотки (липид содержащих ингибиторов репликации вируса) при смене ростовой среды на поддерживающую среду без сыворотки. Оптимальные условия производственного выращивания вакцинного штамма ИС вируса ЭДС были следующими: сформированный монослой, отсутствие следов сыворотки, наличие трипсина 5-10 мкг/мл, множественность заражения 0,1 ТЦД50/клетка, 112 культивирование в течение 18 - 24 ч при 370С. С получением вакцинного штамма и положительной оценкой его иммуногенных свойств возникла практическая возможность создания сухой вакцины против ЭДС. Учитывая огромный опыт изготовления сухих вакцинных препаратов, накопленный в биологической промышленности, с помощью лиофильного высушивания, этот опыт был использован нами. Под термином лиофилизация понимают высушивание биологических объектов (препаратов) в замороженном состоянии под вакуумом. При этом вода удаляется из замороженных объектов путём сублимации льда, то есть путём превращения его в пар, минуя жидкую фазу. Метод лиофилизации позволяет получать сухие препараты (вещества) без потери их структурной целостности и умеренном снижении биологической активности. В процессе лиофилизации большинство белков не подвергаются денатурации и могут длительно сохраняться в сухом препарате при умеренном охлаждении (~00C). Лиофилизированные препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства. Лиофилизацию применяют при необходимости продолжительного хранения различных продуктов биологического происхождения, в том числе сухих вакцин [4, 15]. Целью данного этапа работы являлась разработка оптимальных условий изготовления и хранения сухой вакцины. Обеспечение максимальной инфекционной активности вакцинного вируса в процессе высушивания и хранения в сухой вакцине было главной задачей, решению которой в основном зависело от защитной среды и режима высушивания. При изготовлении живых сухих вакцин в качественной стабилизирующей (защитной) среды используют изотонический фосфатно-буферный раствор с различными добавками: желатин, сахароза, глютамат калия, сорбитол и др. [66]. При изготовлении сухой вакцины против ЭДС сравнивали четыре защитных среды. Лучшие результаты получены при использовании декстраново-желатиновой среды. В присутствии этой среды инфекционность 113 вируса была наиболее высокой по четырём последовательным измерениям: после смешивания с вирусом, после замораживания, после сушки и после «ускоренного старения» сухой вакцины. Эти результаты в дальнейшем были подтверждены в опытах изготовления восьми экспериментальных серий сухой вакцины, что позволило использовать выбранные условия при изготовлении производственных серий вакцины против ЭДС. Для определения срока годности вакцины образцы восьми экспериментальных серий сухой вакцины хранили при 2 – 80С в течение 12 месяцев. Инфекционную активность вакцины проверяли через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения. Через указанные промежутки хранения инфекционная активность вируса снижалась на 0,00 – 0,33 lg ТЦД50 / мл. За 12 месяцев хранения активность вируса снижалась на 0,50 – 0,83 lg ТЦД50 /мл. Установлена прямая корреляция между снижением инфекционной активности в сухой вакцине при испытании методом ускоренного старения сразу после высушивания и через 12 месяцев хранения при 2 – 80С. В последнем случае вирус теряет активность не более 1,0 lg ТЦД50 / мл в течение всего периода хранения. Учитывая необходимость экстренной иммунизации свиней против ЭДС при отсутствии сертифицированной сухой вакцины исследовали возможность хранения и транспортировки вакцинного вируса в замороженном состоянии. Оказалось, что культуральный вакцинный вирус хорошо хранится при -18 - -200С. Следует отметить, что некоторые вакцины против ветряной оспы и опоясывающего герпеса человека также хранят в замороженном состоянии не выше -150С [18]. Многие принципы вакцинопрофилактики универсальны и с успехом используются в разных странах. Например, сухие вирусные вакцины, применяемые в медицине и ветеринарии, как правило, хранят при 2-80С защищёнными от дневного света [66]. При разработке схемы применения живой сухой вакцины против ЭДС в производственных условиях следовало определить контингент 114 вакцинируемых животных, способ введения вакцины, дозу вакцины и кратность вакцинации. Свиней, подлежащих вакцинации против ЭДС, определяли по аналогии с рекомендацией по специфической защите против ТГС. Исходя из того, что колостральная защита потомства с первого дня рождения является основой специфической профилактики вирусных энтеритов свиней, признали целесообразным вакцинировать против ЭДС только свиноматок [5]. Различные схемы применения живой и инактивированной «клеточной» вакцины против ЭДС сравнивали по уровню специфической сероконверсии у матерей и потомства. Выявлено существенное преимущество внутримышечного введения живой вакцины. Возможность оценки вакцинального иммунитета на поросятах в период доращивания значительно облегчило оптимизацию режима применения вакцины в практических условиях. Внутримышечная вакцинация свиноматок признана наиболее эффективным и практичным способом профилактики ЭДС. Установлена прямая зависимость иммунного ответа свиней от прививочной дозы вакцинного вируса (2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 lg ТЦД50). Увеличение дозы вируса в 10 раз сопровождалось повышением титра ВНА приблизительно в 2 раза. Антигенность вакцинного штамма не зависела от продолжительности его аттенуации (40 – 85 пассажей в культуре клеток Vero). Двукратная внутримышечная вакцинация оказалась более эффективной для формирования иммунного ответа у привитых свиней, чем однократное введение вакцины. Двукратная вакцинация в дозе 10 4 ТЦД50 с интервалом 15 дней рекомендована для практического применения. Испытание экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве показало выраженную сероконверсию у всех трёх групп свиней, вакцинированных по рекомендованной схеме: основных свиноматок, ремонтных свинок и поросят в период доращивания. ВНА в высоком титре обнаружены в молозиве свиноматок в день опороса и в сыворотке крови поросят на 2-15 дни после рождения. Эти данные 115 подтверждают целесообразность выбранной нами схемы вакцинации в практических условиях. Эффективность повторного введения вакцины через 15 дней подтверждена лабораторными исследованиями и применением вакцины в полевых условиях. Нам известна рекомендация по ревакцинации не раньше чем через 3 недели после первичного введения вакцины, основанная на оценке вакцинального ответа по титру IgG [151]. Однако при возникновении массового (летучего) заболевания в условиях высокой концентрации и большой численности животных необходимо в как можно более короткие сроки обеспечить специфическую защиту всего поголовья. С целью вакцинопрофилактики ЭДС в производственных условиях изготовлено 8 производственных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС, которые различались между собой по объёму (12 000 – 85 000 доз) и инфекционной активности (4,5 – 5,0 lg ТЦД50/мл). Эффективность вакцинации оценивали в пяти свиноводческих хозяйствах промышленного типа (> 20 000 свиней). Установлено: живая сухая вакцина против ЭДС является безопасным и высокоэффективным препаратом; двукратная вакцинация в дозе 3,5 – 4,0 lg ТЦД50 более эффективна, чем однократная вакцинация в той же дозе; заболевание в хозяйстве прекращается через 7 дней после двукратного применения живой вакцины; инактивированная «кишечная» вакцина не обладает защитными свойствами. Эффективность двух вариантов живой вакцины (сухой и замороженной) была одинаковой и свидетельствует о возможной целесообразности длительного хранения сертифицированного пула вакцинного вируса при температуре не выше 700С. Эпизоотологические наблюдения показали разнообразное клиническое течение ЭДС в разных хозяйствах. Согласно общепринятым правилам, две или более инактивированные вакцины можно вводить одновременно или с различным интервалом между ними. Инактивированную и живую вакцины можно вводить одновременно или через различные интервалы между ними. Две или более живые вакцины 116 можно вводить с интервалом не менее 4 недель [18]. Различные живые вакцины рекомендуется вводить с указанным интервалом из-за возможной гетерологичной интерференции. При изучении возможности одновременной и последовательной вакцинации свиноматок против ЭДС и ТГС установлено, что живая вакцина против ЭДС обладает значительно более выраженной антигенностью, чем живая вакцина против ТГС. При одновременном введении живых вакцин против ЭДС и ТГС наблюдали частичное подавление иммунного ответа против обоих вирусов. При последовательном введении этих вакцин подавления иммунного ответа не наблюдали. Из данных литературы известно, что одновременное введение множества антигенов или различных инактивированных вакцин не влияет на иммунный ответ против каждого из введённых препаратов. Другое дело, когда одновременно вводят живые вакцины, размножение которых в привитом организме может подавляться на основе интерференции вирусов. Поэтому различные живые вакцины рекомендуют вводить с интервалом не менее 4 недели [18]. Наш опыт последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС, а затем против ЭДС и наоборот с интервалом между вакцинациями 21 день, практически не влияло на их антигенность. Такая схема вакцинации, по нашему мнению, удобна для практического применения. В заключении следует отметить, что в результате проведённых исследований решены все цели и задачи, сформулированные в диссертации. 117 4. ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) по способности размножаться in vitro представляет редкое исключение. Он не размножается в линиях клеток естественного хозяина – свиньи (линии СПЭВ, ППК, РК-15), но размножается в линии клеток нечувствительного вида – обезьяны (линия Vero). 2. Cерийное пассирование вируса ЭДС в культуре клеток Vero сопровождалось выраженным ЦПД с образованием синцития и симпластов, умеренным накоплением инфекционного вируса и быстрой аттенуацией. 3. Вирус ЭДС после 26-30 пассажей в культуре клеток Vero утратил вирулентность и не вызывал заболевание суточных безмолозивных поросят при оральном введении. Авирулентный вирус, получивший название штамм ИС, явился основой для создания живой сухой вакцины против ЭДС. 4. Штамм ИС отличается от вирулентного вируса ЭДС делецией в гене ORF3 (не менее 30 нуклеотидов), размер которой увеличивался по мере пассирования в культуре клеток Vего. 5. При массовом размножении штамма ИС в культуре клеток Vero в оптимальном режиме (сформированный монослой, отсутствие следов сыворотки, наличие трипсина 5-10 мкг/мл, М=0,1 ТЦД50/клетка, 1824 ч, 370С) вирус накапливался в титре 105,0-106,3 ТЦД50/мл. Роллерное культивирвание не повышало накопление вируса. 6. Вакцинный штамм ИС сохранял выраженные антигенные (иммуногенные) свойства в процессе серийного пассирования в культуре клеток Vего в течение не менее 90 пассажей (срок наблюдения). 7. Уровень гуморального иммунитета у свиней зависел от дозы и кратности введения вакцинного вируса. Двукратная вакцинация существенно повышала иммунный ответ. При однократном введении увеличение дозы 118 вируса в десять раз (102, 103, 104 и 105 ТЦД50) повышало титр вируснейтрализующих антител (ВНА) примерно в 2 раза. Двукратное введение вируса в дозе 104 ТЦД50 вызывало такой же иммунный ответ, как однократное введение в дозе 105 ТЦД50. 8. Двукратная внутримышечная иммунизация свиноматок штаммом ИС в дозе 104,0 ТЦД50 с интервалом 2 недели сопровождалась образованием ВНА в титре 1:80 – 1:320, что указывало на наличие протективного иммунитета. 9. Вакцинированные свиноматки с титром ВНА в молозиве в день опороса не менее чем 1:120 способны защищать поросят от ЭДС колостральными антителами не менее чем в течение первых двух недель. Период «полураспада» колостральных ВНА при ЭДС соответствует 7 дням. 10. Активность вируса в сухой живой вакцине ВЕРРЕС-ЭДС, изготовленной в оптимизированном режиме, снижалась в процессе лиофилизации на 0,6 – 0,8 lg ТЦД50 /мл и в процессе хранения сухой вакцины (2 - 80С) в течение 3, 6 и 12 месяцев соответственно на 0,3, 0,6 и 0,8 lg ТЦД50/мл. Инфекционная активность вируса в процессе изготовления и хранения сухой вакцины в течение 12 месяцев снижалась не более чем на 1,5 lg ТЦД50 /мл. 11. Живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС по эффективности значительно превосходит инактивированную вакцину из кишечного вируса ЭДС больных поросят. 12. При необходимости эпизоотической диареи создания и иммунитета трансмиссивного одновременно против гастроэнтерита свиней вакцинацию следует проводить последовательно соответствующими вакцинами с интервалом 21 день независимо от очерёдности их введения. 119 На основании проведённых исследований разработаны и предложены для практического использования: Живая сухая вакцина против ЭДС o Вакцинный штамм ИС вируса ЭДС. Депонирован в коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Удостоверение ГКВ 2467 от 08.10.2009. Стандарт ООО Ветбиохим 2010 г., № 42418073-0019-2010 o Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС против ЭДС, живая, сухая. Стандарт ООО Ветбиохим 2010 г., № 76418883-0003-2010 Инструкция по применению утверждена 4 октября 2010 г. Производственный регламент 120 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алипер, Т. И. Инактивированная вакцина при ТГС / Т. И. Алипер, В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов // Ветеринария. - 2002. – т.8. – С.18-21 2. Беляков, И.М. Иммунная система слизистых / И.М. Беляков // Иммунология. – 1997. – т.4. - С.7-13 3. Вишняков, И.Ф. Результаты исследований по изучению особо опасных болезней животных и разработке мер борьбы с ними / И.Ф. Вишняков // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. М., 1999, С. 67-74 4. Лозина-Лозинский, Л.К. //Криобиология и криомедицина. – 1980. - №7. – С. 3-6 5. Орлянкин, Б.Г. Особенности функционирования иммунной системы слизистых оболочек и стратегия специфической профилактики вирусных гастроэнтеритов поросят / Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер // Сельхоз. Биология. – 2001. - №2. – С. 10-19 6. Орлянкин, Б.Г. Основы противовирусного иммунитета / Б.Г. Орлянкин, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // Орбис Пиктус, Москва, 2011. 231с. 7. Сергеев, В.А. Иммунная система слизистых: концепция общности и механизм функционирования / В.А. Сергеев, Т.И. Алипер, Г.Г. Рухадзе, В.И. Бахуташвили // Вопр. Вирусол. - 1988. - №4. – С. 393-402 8. Сергеев, В.А. Респираторный коронавирус свиней / В.А. Сергеев, Г.Г. Рухадзе, Т.И. Алипер // Вест. с.-х. науки. - 1989. - №8. – С. 96-100 9. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // Библионика, Москва, 2007. 523с. 10. Собко, А.И. Вирусные диареи свиней / А.И. Собко, Е.В. Краснобаев // ВНИИТЭИ Агропром, Москва, 1987. 56с. 11. Сюрин, В.Н. Инфекционный гастроэнтерит свиней / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // В кн.: Вирусные болезни животных. М., 1998, С. 165-183 12. Федоров, Ю.Н. Иммунопрофилактика болезней новорожденных животных 121 / Ю.Н. Федоров // С.-х. биология. - 1988. - №2. – С. 133-136 13. Федоров, Ю.Н. Лактогенный иммунитет у поросят против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза свиней / Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, М. Аноятбеков, Б.Г. Орлянкин, Н.А. Соколова, Э.А. Шегидевич // Ветеринария. - 1997. №12. - 20-23 14. Хаитов, Р.М. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и патологии / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. - 1997. - №5. – С.4-7 15. Харрис, Р. Применение замораживания-высушивания в биологии / Р. Харрис // В кн. Консервирование вирусов, под ред. Р. Харриса. М., ИЛ., 1956. С. 273-291 16. Холод, В.М. Иммуноглобулины молозива и пассивный иммунитет новорожденных животных / В.М. Холод // С.-х. биология. 1983. - №6. – С.127-132 17. Al-Ahdal, M.N. Variation in herpes simplex virus type 1 glycoproteins produced in kidney cells from different species / M.N. Al-Ahdal, F.A. Al-Khodairy, T.J. McGarry // Microbios. – 1989. – v.58. – P.7-15 18. Atkinson, W.L.General immunization practices / W.L. Atkinson, A.L. Kruger, L.K. Pickering // In: Vaccines, Eds S.Plotkin et al., 2008; P. 83-109 19. Bachmann, P.A. Comparative aspects of pathogenesis and immunity of viral diarrhoeas in animals / P.A. Bachmann, R.G. Hess // In: Virus infections of gastrointestinal tract, New York, 1982; P.361-397 20. Bae, J.L. Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen / J.L. Bae, J.G. Lee, T.J. Kang, H.S. Jang, Y.S. Jang, M.S. Yang // Vaccine. - 2003. – v.21. – P.40524058 21. Bachrach, H.L. Large-scale cultivation of animal cells in roller bottles for production of decigram amounts of pure foot-and-mouth disease virus / H.L. Bachrach // Natl. Cancer Inst. Monogr. - 1968. – v.29. – P.73-79 22. Baudoux, P. Coronavirus pseudoparticles formed with recombinant M and E proteins induce alpha interferon synthesis by leukocytes / P. Baudoux, C. Carrat, L. Besnardeau, B. Charley, H. Laude // J. Virol. - 1998. – v.72. – P.8636-8643 122 23. Bernasconi, C. Experimental infection of gnotobiotic piglets with a cell culture adapted porcine epidemic diarrhoea virus: Clinical histopathological and immunohistochemical findings / C. Bernasconi, F. Guscetti, A. Utiger, K. Van Reeth, M. Ackermann, A. Pospischil // Proc. 3rd Congr. ESVV, 1995. P.542-546 24. Bohl, E.H. Secretory antibodies in milk of swine against transmissible gastroenteritis virus / E.H. Bohl, L.J. Saif, R.K. Gupta, G.T. Frederick //Adv. Exp. Med. Biol. - 1974. - - v.45. – P.337-342 25. Bohl, E.H. Antibody responses in serum, colostrum, and milk of swine after infection or vaccination with transmissible gastroenteritis virus / E.H. Bohl, R.K. Gupta, M.V. Olquin, L.J. Saif // Infect. Immun. - 1972.- v.6. – P.289-301 26. Bridgen, A. Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus / A. Bridgen, M. Duarte, K. Tobler, H. Laude, M. Ackermann // J.Gen.Virol. - 1993. – v.74. – P.1795-1804 27. Bridgen, A. Further analysis of the genome of porcine epidemic diarrhoea virus / A. Bridgen, R. Kocherhans, K. Tobler, A. Carvajal, M. Ackermann // Adv. Exp. Med. Biol. - 1998. – v.440. – P.781-786 28. Callebaut, P. Some characteristics of a new porcine coronavirus and detection of antigen and antibody by ELISA / P. Callebaut, P. DeBouck // In Proc. 5th Int. Congr. Virol., Strasbourg, 1981, P.420 29. Callebaut, P. Enzyme-linked im-munosorbent assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea / Callebaut P, DeBouck P, Pensaert M. // Vet. Microbiol. - 1982. – v.7. – P.295306 30. Callebaut, P. Induction of milk IgA antibodies by porcine respiratory coronavirus infection / P. Callebaut, E. Cox, M. Pensaert, K. Van Deun // Adv. Exp. Med. Biol. - 1990. – v. 276. - P.421-428 31. Carvajal, A. Evaluation of an ELISA for the detection of porcine epi¬demic diarrhea virus (PEDV) in feces of naturally infected pigs / A. Carvajal, R. Diego, I. Lanza, P. Rubio, P. Carmenes, M. Schwyzer // Proc. 3rd Congr. ESW; 1995a. P. 516-519 32. Carvajal, A. Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies / A. Carvajal, I. Lanza, R. Diego, P. Rubio, P. Carmenes // J. Vet. Diagn. Invest. - 1995b. – v.7. 123 – P.60-64 33. Chae, C. Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs / Chae C, Kim O, Choi C, Min K, Cho WS, Kim J, Tai JH. // Vet Rec. 2000. 147:606-608. 34. Chang, S.H. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus / Chang S.H., Bae J.L., Kang T.J., Kim J., Chung G.H., Lim C.W., Laude H., Yang M.S., Jang Y.S. // Mol. Cells. - 2002. – v.14. – P.295-299 35. Chasey, D. Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhoea / Chasey D., Cartwright S.F. // Res. Vet. Sci. - 1978. – v.25. – P.255-256 36. Chen, J.F. Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China / Chen J.F., Sun D.B., Wang C.B., Shi H.Y., Cui X.C., Liu S.W., Qiu H.J., Feng L. // Virus Genes. - 2008. – v.36. - P.355-364 37. Chen, J. Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China / Chen J., Wang C., Shi H., Qiu H., Liu S., Chen X., Zhang Z., Feng L. // Arch. Virol. - 2010. – v.15. – P.1471-1476 38. Chen, J. Complete genome sequence of a chinese virulent porcine epidemic diarrhea virus strain / Chen J., Wang C., Shi H, Qiu H, Liu S, Shi D., X., Feng L. // J. Virol. - 2011. – v.85. – P.11538–11539 39. Chen, Q. Isolation and Characterization of Porcine Epidemic Diarrhea Viruses Associated with the 2013 Disease Outbreak among Swine in the United States / Chen Q., Li G., Stasko J., Thomas J.T., Stensland W.R., Pillatzki A.E., Gauger P.C., Schwartz K.J., Madson D., Yoon K.-J., Stevenson G. W., Burrough E.R., Harmon K.M., Main R.G., Zhang J. // J. Clin. Microbiol. – 2014. – v.52. – P.234243 40. Chen, X. Sequence heterogeneity of the ORF3 gene of porcine epidemic diarrhea viruses field samples in Fujian, China, 2010-2012 / Chen X., Zeng L., Yang J., Yu F., Ge J., Guo Q., Gao X., Song T. // Viruses. - 2013. – v.5. – P.2375-2383 41. Chen, X. Trypsin-dependent cleavage of the spike protein increases infectivity of porcine epidemic diarrhea virus in Vero cells / Cruz M. D. J., Shin H. J. // Proceedings, 88 Ann. Meet., Chicago, 2007. 42. Cruz, D.J. The GPRLQPY motif located at the carboxy-terminal of the spike protein induces antibodies that neutralize porcine epidemic diarrhea virus / Cruz 124 D.J., Kim C.J., Shin H.J. // Virus Res. - 2008. – v.132. – P.192-196 43. Curtis, K.M. Heterologous gene expression from transmissible gastroenteritis virus replicon particles / Curtis K.M., Yount B., Baric R.S. // J. Virol. - 2002. – v.76. – P.1422-34 44. Davis, D. Triple plaque purified strains of duck hepatitis virus and their potential as vaccines / Davis D. // Res. Vet. Sci. – 1987. – v.43. – P.44-48 45. De Arriba, M.L. Development of an ELISA for the detection of antibody isotypes against porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) in sow's milk / De Arriba ML, Carvajal A, Lanza I, Rubio P, Carmenes P. // Proc 3rd Congr. ESVV, 1995, P.222-225 46. DeBouck, P. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus CV777 / DeBouck P., Pensaert M. // Am. J. Vet. Res. - 1980. – v.41. – P.219-223 47. DeBouck, P. The diagnosis of coronavirus-like agent (CVLA) diarrhea in suckling pigs / DeBouck P, Callebaut P, Pensaert M. // Curr. Top. Vet. Med. Anim. Sci. - 1981a. – v.13. – P.59-61 48. DeBouck, P. The pathogenesis of an enteric infection in pigs experimentally induced by the coronavirus-like agent CV777 / DeBouck P., Pensaert M., Coussement W. // Vet. Microbiol. - 1981b. – v.6. – P.157-165 49. De Groot, R.J. Coronaviridae / De Groot R.J., Baker S.C., Baric R., Enjuanes L., Gorbalenya A.E., Holmes K.V., Perlman S., Poon L., Rottier P.J.M., Talbot P.J., Woo P.C.Y., Ziebuhr J. // In King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J. (ed), Virus taxonomy: 9th report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press, Inc, San Diego, CA. 2012. P.774 –796 50. De Haan, C.A. The group-specific murine coronavirus genes are not essential, but their deletion, by reverse genetics, is attenuating in the natural host / De Haan C.A., Masters P.S., Shen X., Weiss S., Rottier P.J. // Virology. - 2002. – v.296. P.177-189 51. Delmas, B. Assembly of coronavirus spike protein into trimers and its role in epitope expression / Delmas B., Laude H. // J.Virol. - 1990. – v.64. – P.53675375 52. Dijkman, R. Human coronavirus 229E encodes a single ORF4 protein between the spike and the envelope genes / Dijkman R., Jebbink M.F., Wilbrink B., Pyrc 125 K., Zaaijer H.L., Minor P.D., Franklin S., Berkhout B., Thiel V., van der Hoek L. // Virol J. - 2006. – v.3. – P.106. 53. Domingo, E. RNA virus mutations and fitness for survival / Review. Domingo E., Holland J.J. // Annu. Rev. Microbiol. – 1997. – v.51. – P.151-178 54. Duarte, M. Sequence of the spike protein of the por¬cine epidemic diarrhoea virus Duarte M., Laude H. // J. Gen. Virol. - 1994. - v.75. – P.1195-1200 55. Ducatelle, R. Three-dimensional sequential study of the intestinal surface in experimental porcine CV777 coronavirus enteritis / Ducatelle R., Coussement W., Charlier G., DeBouck P., Hoorens J. // Zentralbl. Veterinarmed. B. - 1981. – v.28. – P.483-493 56. Ducatelle, R. Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis in piglets. II. Electron microscopic study / Ducatelle R. // Vet. Pathol. - 1982a. – v.19. – P.57-66 57. Ducatelle, R. Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis in pig¬lets. I. Histological and histochemical study / Ducatelle R., Coussement W., DeBouck P., Hoorens J. // Vet. Pathol. - 1982b. – v.19. – P.46-56 58. Egberink, H.F. Characterization of the structural proteins of porcine epizootic diarrhea virus, strain CV777 / Egberink H.F., Ederveen J., Callebaut P., Horzinek M.C. // Am. J. Vet. Res. - 1988. – v.49. – P.1320-1324 59. Eigen, M. The fifth Paul Ehrlich Lecture, Virus strains as models of molecular evolution / Eigen M. // Med. Res. Rev. - 1993а. – v.13. – P.385-398 60. Eigen, M. Viral quasispecies / Eigen M. // Sci. Am. - 1993b. – v.269. – P.42-49 61. Enders, J.F. Development of attenuated measles-virus vaccines. A summary of recent investigation / Enders J.F., Katz S.L., Holloway A. // Am. J. Dis. Child. 1962. – v.103. – P.335-340 62. Epstein, A.L. In vitro divergence of HSV-1 populations propagated in different cell lines / Epstein A.L., Lyon M., Michal Y., Jacquemont B. // Arch. Virol. – 1990. – v.111. – P.133-140 63. Flint, S.J. Principles of virology. 2nd ed., 2004. 64. Gifford, G.E. Effect of proteolytic enzymes on vaccinia virus replication / Gifford G.E., Klapper D.G. // Arch. Gesamte Virusforsch. – 1969. – v.26. – P.321-333 126 65. Godet, M. Major receptor-binding and neutralization determinants are located within the same domain of the transmissible gastroenteritis virus (coronavirus) spike protein / Godet M., Grosclaude J., Delmas B., Laude H. // J. Virol. - 1994. – v.68. – P.8008-8016 66. Gomez, P.L. Vaccine manufacturing / Gomez P.L., Robinson J.M., Rogalewicz J.A. // In: Vaccines, Eds S.Plotkin et al., 2008, P.45-58 67. Gonzales, J.M. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae / Gonzales J.M., Gomez-Puertas P., Cavanagh D., Gorbalenya A.E., Enjuanes L. // Arch. Virol. - 2003. – v.148. – P.2207-2235 68. Guscetti, F. Immunohistochemical detection of porcine epidemic diarrhea virus compared to other methods / Guscetti F, Bernasconi C, Tobler K, Van Reeth K, Pospischil A, Ackermann M. //Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. 5:412-414. 69. Ha, G.W. Colostrum IgA concentration as a marker of protection from porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection / Ha G.W., Kang B.K., Park S.J., Lee C.S., Oh J.S., Chai Y.G., Park B.K., Moon H.J. // Korean J. Vet. Public Health. 2010. – v.34. –P.53-56 70. Haijema, B.J. Live, attenuated coronavirus vaccines through the directed deletion of group-specific genes provide protection against feline infectious peritonitis / Haijema B.J., Volders H., Rottier P.J. // J. Virol. - 2004. – v.78. – P.3863-3871 71. Herrewegh, A.A. The molecular genetics of feline coronaviruses: comparative sequence analysis of the ORF7a/7b transcription unit of different biotypes / Herrewegh A.A., Vennema H., Horzinek M.C., Rottier P.J., de Groot R.J. // Virology. - 1995. – v.212. – P.622-631 72. Hoffman, M. Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture / Hoffman M., Wyler R. // J. Clin. Microbiol. - 1988. – v.26. –P.22352239 73. Hoffman, M. Quantitation, biological and physiocemical properties of cell culture-adapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV) / Hoffman M., Wyler R. // Vet. Microbiol. - 1989. – v.20. –P.131-142 74. Hoffman, M. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of porcine epidemic diarrhea coronavirus antibodies in swine sera / Hofmann M, Wyler R. // Vet. Microbiol. - 1990. – v.212. – P.63-73 127 75. Horvath, I. Ultrastructural changes in the small intestinal epithelium of suckling pigs affected with a trans¬missible gastroenteritis (TGE)-like disease / Horvath I., Moscari E. // Arch. Virol. - 1981. – v.68 – P.103-113 76. Hwang, E.K. Current occurrence of porcine epidemic diarrhea in Korea / Hwang E.K., Kim J.H., Jean Y.H., Bae Y.C., Yoon S.S., Park C.K., Kweon C.H., Yoon Y.D., Ackermann M. // RDA J. Agri. Sci. - 1994. – v.36. – P.587-596 77. Ishikawa, K. Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR / Ishikawa K., Sekiguchi H., Ogino T., Suzuki S. // J. Virol. Methods. 1997. – v.69. – P.191-195 78. Jackwood, M.W. Spike glycoprotein cleavage recognition site analysis of infectious bronchitis virus / Jackwood M.W., Hilt D.A., Callison S.A., Lee C.W., Plaza H., Wade E. // Avian Dis. - 2001. – v.45. – P.366-372 79. Jinghui, F. Cloning and sequence analysis of the M gene of porcine epidemic diarrhea virus LJB/03 / Jinghui F., Yijing L. // Virus Genes. - 2005. – v.30. – P.69-73 80. Jung, K. Effects of epidermal growth factor on atrophic enteritis in piglets induced by experimental porcine epidemic diarrhoea virus / Jung K., Kang B.K., Kim J.Y., Shin K.S., Lee C.S., Song D.S. // Vet. J. – 2008. – v.177. – P.231-235 81. Kadoi, K. The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines / Kadoi K., Sugioka H., Satoh T., Kadoi B.K. // New Microbiol. – 2002. v.25. – P.285-290 82. Kang, T. J. Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of porcine epidemic diarrhea virus in tobacco plants without nicotine / Kang T. J., Kim Y. S., Jang Y. S., Jang M.S. // Vaccine. - 2005. – v.23. – P.2294-2297 83. Kang, J.H. Development of a simple and rapid immunochromatographic strip test for diarrhea-causative porcine rotavirus in swine stool / Kang J.H., Kwon DH, Chung TW, Kim YD, Lee HG, Kim JW, Choe IS, Kim KW, Lim JS, Song EY, Kim CH. // J. Virol. Methods. – 2007. – v.146. – P.74-79 84. Kim, O. In situ hybridization for the detection and localization of porcine epidemic diarrhea virus in the intestinal tissues from naturally infected piglets / Kim O., Chae C. // Vet. Pathol. - 2000. – v.37. – P.62-67 85. Kim, S.Y. Differential detection of transmis¬sible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR / Kim S.Y., Song D.S., Park B.K. // J. Vet. Diagn. Invest. - 2001. – v.13. – P.516-520 128 86. Kim, O. Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs / Kim O., Chae C. // Can. J. Vet. Res. - 2002. – v.66. – P.112-116 87. Kim, O. Experimental infection of piglets with a Korean strain of porcine epidemic diarrhoea virus / Kim O., Chae C. // J. Comp. Path. - 2003. – v.129. – P.55-60 88. Knuchel, M. An ELISA for detection of antibodies against porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) based on the specific solubility of the viral surface glycoprotein / Knuchel M, Ackermann M, Miiller HK, Kihm U. // Vet. Microbiol. - 1992. – v.32. – P.117-134 89. Kocherhans, R. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence / Kocherhans R, Bridgen A, Ackermann M, Tobler K. // Virus Genes. - 2001. – v.23. – P.137-144 90. Kotani, O. Neuropathogenesis of a mouse-adapted porcine epidemic diarrhea virus infection in suckling mice / Kotani O., Shirato K., Nagata N., Ikeda H., Takahashi K., Taguchi F. // J. Gen. Virol. - 2013. – v.94. –P.831–836 91. Kubota, S. Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the virus / Kubota S., Sasaki O., Animoto K., Okada N., Kitazima T., Yasuhara H. // J. Vet. Med. Sci. - 1999. – v.61. – P.827-830 92. Kusanagi, K. Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate / Kusanagi K., Kuwahara H., Katoh T., Nunoya T., Ishikawa Y., Samejima T., Tajima M. // J. Vet. Med. Sci. - 1992. – v.54. – P.313–318 93. Kweon, C.H. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Korea / Kweon C.H., Kwon B.J., Jung T.S., Kee Y. J., Hur D.H., Hwang E.K., Rhee J.C., An S.H. // Korean J. Vet. Res. - 1993. – v.33 – P.249-254 94. Kweon, C.H. Cell adaptation of KPEDV-9 and serological survey on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Korea / Kweon C.H., Kwon B.J., Kang Y.B., An S.H. // Korean J. Vet. Res. - 1994. – v.34 – P.321-326 95. Kweon, C.H. Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) as vaccine candidate / Kweon C. H., Kwon B. J., Lee J. G., Kwon G.O., Kang Y.B. // Vaccine. - 1999. – v.17. – P.2546-2553 129 96. Kweon, C.H. Immunoprophylactic effect of chicken egg yolk immunoglobulin (IgY) against porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in piglets / Kweon C.H., Kwon B.J., Woo S.R., Kim J.M., Woo G.H., Son D.H., Hur W., Lee Y.S. // J. Vet. Med. Sci. - 2000. – v.62. – P.961-964 97. Laude, H. Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis virus / Laude H., Gelfi J., Lavenant L., Charley B. // J. Virol. - 1992. – v.66. – P.743-749 98. Lee, H.K. Biological and physiochemical properties of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99 strain isolated in Korea / Lee H.K., Yeo S.G. // J. Vet. Clin. - 2003a. – v.20. – P.150-154 99. Lee, H.K. Cloning and sequencing analysis of the nucleocapsid gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99 / Lee H.K., Yeo S.G. // Virus Genes. - 2003b. – v.26. – P.207-212 100. Li, X. In vivo interference by Newcastle disease virus in chickens, the natural host of the virus / Li X., Hanson R.P. // Arch. Virol. – 1989. – v.108. – P.229-245 101. Li, W. New Variants of Porcine Epidemic Diarrhea Virus, China, 2011 / Li W., Li H., Liu Y., Pan Y., Deng F., Song Y., Tang X., He Q. // Emerg. Inf. Dis. 2012. – v.18. – P.1350-1353 102. Lissenberg, A. Luxury at a cost? Recombinant mouse hepatitis viruses expressing the accessory hemagglutinin esterase protein display reduced fitness in vitro / Lissenberg A., Vrolijk M.M., van Vliet A.L., Langereis M.A., de GrootMijnes J.D., Rottier P.J., de Groot R.J. // J. Virol. - 2005. – v.79. – P.1505415063 103. Lundström, M. Host cell-induced differences in O-glycosylation of herpes simplex virus gC-1. I. Structures of nonsialylated HPA- and PNA-binding carbohydrates / Lundström M, Olofsson S, Jeansson S, Lycke E, Datema R, Månsson JE. // Virology. - 1987. – v.161. – P.385-394 104. Martelli, P. Epidemic of diarrhoea caused by porcine epidemic diarrhoea virus in Italy / Martelli P., Lavazza A., Nigrelli A.D., Merialdi G., Alborali L.G., Pensaert M.B. // Vet. Rec. - 2008. – v.162. – P.307-310 105. McMillan, B.C. The effects of the multiplicity of infection on viral subpopulations during passage of Newcastle disease viruses / McMillan B.C., Fellenz S.C., Hanson R.P. // Avian Dis. - 1986. – v.30. – P.122-125 130 106. Morin, M. Neonatal diarrhea of pigs in Quebec: Infectious causes of significant outbreaks / Morin M., Turgeon D., Jolette J., Robinson Y., Phaneuf J.B., Sauvageau R., Beauregard M., Teuscher E., Higgins R., Larivere S. // Can. J. Comp. Med. - 1983. – v.47. – P.11-17 107. Moxley, R.A. Clinical evaluation of transmissible gastroenteritis virus vaccination procedures for inducing lactogenic immunity in sows / Moxley R.A., Olson L.D. // Am. J. Vet. Res. - 1989. – v.50. – P.111-118 108. Moya, A. The evolution of RNA viruses: A population genetics view / Moya A., Elena S.F., Bracho A., Miralles R., Barrio E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. – v.97. – P.6967-6973 109. Murphy, B.R. Immunization against viral diseases / Murphy B.R., Channock R.M. // In Fields Virology, eds D.M. Knipe et al., 4th ed., 2001. P.435-467 110. Murphy, F.A. / Murphy F.A., Gibbs E.P., Horzinek M.C., Studdert M.J. // In: Veterinary Virology, 3rd edn, (Academic Press, San Diego, 1999): P. 496-501 111. Nagy, B. Enterotoxigenic Escherichia coli, rotavirus, porcine epidemic diarrhoea virus, adenovirus and calici-like virus in porcine postweaning diarrhoea in Hungary / Nagy B, Nagy G, Meder M, Mocsári E. // Acta Vet. Hung. – 1996. v.44. – P.9-19 112. Narayanan, K. / Narayanan K., Makino S. // In Nidoviruses, by Perlman S., Snijder E.J.(eds) (ASM Press, Washington, DC, 2008), P.235-244 113. Nguyen, V.P. Protein interactions during coronavirus assembly / Nguyen V.P., Hogue B.G. // J. Virol. - 1997. – v.71. – P. 9278-9284 114. Offit, P.A. Protection against rotavirus-induced gastroenteritis in a murine model by passively acquired gastrointestinal but not circulating antibodies / Offit P.A., Clark H.F. // J. Virol. - 1985. – v.54. – P.58-64 115. Olanratmanee, E.O. Impact of porcine epidemic diarrhea virus infection at different periods of pregnancy on subsequent reproductive performance in gilts and sows / Olanratmanee EO, Kunavongkrit A, Tummaruk P. // Anim. Reprod. Sci. - 2010. – v.122. – P.42-51 116. Oldham, J. Letter to the editor. //Pig Farming. - 1972. - October suppl. – P.72– 73 117. Ortego, J. Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo virus replication and virulence / Ortego J., Sola I., Almazán F., 131 Ceriani J.E., Riquelme C., Balasch M., Plana J., Enjuanes L. // Virology. - 2003. – v.308. – P.13-22 118. Park, S.J. Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea / Park S.J., Moon H.J., Yang J.S., Lee C.S., Song D.S., Kang B.K., Park B.K. // Virus Genes. - 2007. – v.35. – P.321332 119. Park, S.J. Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses / Park S.J., Moon H.J., Luo Y., Kim H.K., Kim E.M., Yang J.S., Song D.S., Kang B.K., Lee C.S., Park B.K. // Virus Genes. - 2008. – v.36. – P.95–104 120. Paul, P.S. Pathogenicity and sequence analysis studies suggest potential role of gene 3 in virulence of swine enteric and respiratory coronaviruses / Paul P.S, Vaughn E.M., Halbur P.G. // In: Paul P.S., Francis D.H., Benfield D.A. (eds). Mechanisms in the pathogenesis of enteric diseases. Plenum Press., New York, 1997. P.317-321 121. Pensaert, M.B. Transmissible gastroenteritis virus (respiratory variant) / Pensaert M.B. // In: M. B. Pensaert (Ed.) Virus Infections of Porcines. Amsterdam: Elsevier Science, 1989. P.154-165 122. Pensaert, M. Porcine epidemic diarrhea / Pensaert M. //In: B.E. Straw et al. (eds) Diseases of Swine, (8th Ed., Blackwell, Ames, 1999), P.179 -185 123. Pensaert, M.B. Porcine respiratory coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus / Pensaert M.B., Cox E. // Agri-Pract. - 1989. – v.10. – P.17-21 124. Pensaert, M. A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine / Pensaert M., DeBouck P. // Arch. Virol. - 1978. – v.58. – P.243-247 125. Pensaert, M. Porcine epidemic diarrhea / Pensaert M. //In: B.E. Straw et al. (eds) Diseases of Swine, (9th Ed., Blackwell, Ames, 2006), P.367-372 126. Pospischil, A. Light microscopy and ultrahistology of intestinal changes in pigs infected with enzootic diarrhoea virus (EVD): Comparison with transmissible gastroenteritis (TGE) virus and porcine rotavirus infections / Pospischil A., Hess R.G., Bachmann P.A. //Zentralbl. Veterinarmed. B. - 1981. – v.28. – P.564-577 127. Prager, D. Die serologische Diagnose der Epizootischen Virusdiarrhoe (EVD) des Schweines mit Hilfe der indirekten Immunofluoreszenztechnik (IIFT). II. Antikorper-Antwort nach experimenteller Infektion / Prager D, Witte K. // 132 Tierarztl. Umsch. - 1981. – v.36. – P.477-480 128. Puranaveja, S. Chinese-like Strain of Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Thailand / Puranaveja S., Poolperm P., Lertwatcharasarakul P., Kesdaengsakonwut S., Boonsoongnern A., Urairong K., Kitikoon P., Choojai P., Kedkovid R., Teankum K., Thanawongnuwech R. // Emerg. Infect. Dis. - 2009. – v.15. – P.1112–1115 129. Pyo, H.M. Escherichia coli expressing single-chain Fv on the cell surface as a potential prophylactic of porcine epidemic diarrhea virus / Pyo H.M., Kim I.J., Kim S.H., Kim H.S., Cho S.D., Cho I.S., Hyun B.H. // Vaccine. - 2009. – v.27. – P.2030-2036 130. Rasschaert, D. Porcine respiratory coronavirius differs from transmissible gastroenteritis virus by a few genomic deletions / Rasschaert D., Duarte M., Laude H. // J. Gen. Virol. - 1990. – v.71. – P.2599-2607 131. Risco, C. The transmissible gastroenteritis coronavirus contains a spherical core shell consisting of M and N proteins / Risco C., Anton I.M., Enjuanes L., Carrascosa J.L. //J.Virol. - 1996. – v.70. – P.4773-4777 132. Robertson, B.H. Altered hepatitis A VP1 protein resulting from cell culture propagation of virus / Robertson BH, Brown VK, Khanna B. // Virus Res. – 1989. – v.13. – P.207-212 133. Rodak, L. Elisa detection of group A rotavirus, transmissible gastroenteri¬tis virus and porcine epidemic diarrhoea virus in faeces of piglets / Rodak L, Smid B, Valicek L, Smitalova R, Nevorankova Z. // Proc. Congr. Int. Pig Vet. Soc. 2004. – v.1. –P.271-280. 134. Rottier, P.J.M. // In: Siddel S.G. (ed.) The Coronaviridae. Plenum Press, New York, 1995, P.115-139 135. Saif, L.J. Coronavirus immunogens / Saif L.J. //Vet. Microbiol. - 1993. – v.37. – P.285-297 136. Saif, L.J. Enteric viral infection of pigs and strategies for induction of mucosal immunity / Saif L.J. //In: Advances in veterinary medicine, 1999, 41, P.429-446 137. Saif, L.J. Animal coronavirus vaccines: lessons for SARS / Saif L.J. // Dev. Biol. (Basel). - 2004. – v.119. – P.129-140 138. Saif, L.J. Isolation of porcine immunoglobulins and determination of the immunoglobulin classes of transmissible gastroenteritis viral antibodies / Saif L.J., Bohl E.H., Gupta R.K. // Infect. Immun. - 1972. – v.6. – P.600-609 133 139. Saif, L.J. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory coronavirus / Saif L.J., Wesley R.D. // In: B.E. Straw et al. (eds) Diseases of Swine, Iowa State University Press, Ames, 1999, P.295-325 140. Sanchez, C.M. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses / Sanchez C.M., Gebauer F., Sune C., Mendez A., Dopazo J., Enjuanes L. // Virology. - 1992. – v.190. - P.92-105 141. Sanchez, C.M. Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence / Sánchez C.M., Izeta A., Sánchez-Morgado J.M., Alonso S., Sola I., Balasch M., Plana-Durán J., Enjuanes L. // J. Virol. - 1999. – v.73. – P.76077618 142. Sanchez, C.M. Antigenic homology among coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus / Sanchez C.M., Jimenez G., Laviada M.D., Correa I., Sune C., Bullido M. J., Gebauer F., Srnerdou C., Callebaut P., Escribano J.M., Enjuanes L. //Virology. - 1990. – v.174. – P.410-417 143. Santero, G.G. The "rotary column" method for growth of large-scale quantities of cell monolayers // Biotechnol. Bioeng. - 1972. – v.14. – P.753-775 144. Sato, T. Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptation in vitro and attenuation of virulence in vivo / Sato T., Takeyama N., Katsumata A., Tuchiya K., Kodama T., Kusanagi K. // Virus Genes. - 2011. – v.43. – P.72-78 145. Schwarz, B. Murine coronavirus nonstructural protein ns2 is not essential for virus replication in transformed cells / Schwarz B., Routledge E., Siddell S.G. // J. Virol. - 1990. – v.64. – P.4784-4791 146. Sestak, K. Porcine coronaviruses / Sestak K., Saif L.J. //In: A. Morilla et al. (Eds) Trends In Emerging Viral Infections Of Swine, Iowa State Press, 2002. P.321330 147. Shibata, I. Passive protection against porcine epidemic diarrhea (FED) virus in piglets by colostrum from immunized cows / Shibata I., Ono M, Mori M. // J. Vet. Med. Sci. - 2001. – v.63. – P.655-658 148. Shibata, I. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cul¬tures and experimental infection of pigs of different ages / Shibata I., Tsuda T., Mori M., Ono M., Sueyoshi M., Uruno K. // Vet. Microbiol. - 2000. – v.72. – P.173182 134 149. Shirai, J. Lactogenic immunity to transmissible gastroenteritis of swine induced by attenuated Nouzilly strain of TGE virus: Neutralizing antibody classes and protection / Shirai J., Lantier I., Bottreau E., Aynaud J.M., Bernard S. // Ann. Rech. Vet. - 1988. – v.19. – P.267-272 150. Shirato, K. Enhanced cell fusion activity in porcine epidemic diarrhea virus adapted to suckling mice / Shirato K., Maejima M., Hirai A., Ami Y., Takeyama N., Tsuchiya K., Kusanagi, K., Nunoya, T. & Taguchi, F. // Arch. Virol. - 2010. – v.155. – P.1989–1995 151. Siegrist, C.A. Vaccine immunology / Siegrist C.A., Robinson J.M., Rogalewicz J.A. // In: S. Plotkin et al. (Eds) Vaccines, 2008, P.17-36 152. Song, D.S. Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3 / Song D.S., Yang J.S., Oh J.S., Han J.H., Park B.K. // Vaccine. - 2003. – v.21. – P.1833-1842 153. Song, D.S. Fecal shedding of a highly cell adapted porcine epidemic diarrhea virus after oral inoculation of pigs / Song D.S., Oh J.S., Kang B.K. Yang J.S., Song J.Y., Moon H.J., Kim T.Y., Yoo H.S., Jang Y.S., Park B.K. // J. Swine Health Prod. - 2005. – v.13. – P.269 - 272 154. Song, D.S. Use of an internal control in a quantitative RT - PCR asssay for quantitation of porcine epidemic diarrhea shedding in pigs / Song D.S., Kang B.K., Lee S.S., Yang J.S., Moon H.J., Oh J.S., Ha G.W., Jang Y.S., Park B.K. // J. Virol. Meth. - 2006. – v.133. – P. 27-33 155. Song, D.S. Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain / Song D.S., Oh J.S., Kang B.K., Yang J.S., Moon H.J., Yoo H.S., Jang Y.S., Park B.K. // Res. Vet. Sci. - 2007. – v.82. – P.134—140 156. Song, D.S. Porcine epidemic diarrhea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis and vaccines / Song D.S., Park B.K. // Virus Genes. - 2012. – v.44. – P.167-175 157. Spaan, W. Coronaviruses: structure and genome expression / Spaan W., Cavanagh D., Horzinek M.C. // J. Gen. Virol. 1988. 69: 2939-2952. 158. Stevenson, G.W. Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences / Stevenson G.W., Hoang H., Schwartz K.J., Burrough E.R., Sun D., Madson D., Cooper V.L., Pillatzki A., Gauger P., Schmitt B.J., Koster L.G., Killian M.L., Yoon K.J. // J. 135 Vet. Diagn. Invest. - 2013. – v.25. – P.649–654 159. Stokes, C. Mucosal defence along the gastrointestinal tract of cats and dogs / Stokes C., Waly N. // Vet. Res. - 2006. – v.37. – P.281-293 160. Sueyoshi, M. An immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhea / Sueyoshi M., Tsuda T., Yamazaki K., Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, Minami T, Iwashita K, Watanabe M, Suzuki Y. // J. Clin. Pathol. - 1995. – v.113. – P.59-67 161. Sun, D. Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein / Sun D., Feng L., Shi H., Chen J., Cui X., Chen H., Liu S., Tong Y., Wang Y., Tong G. // Vet. Microbiol. - 2008. – v.131. – P.73-81 162. Sune, C. Mechanisms of transmissible gastroenteritis coronavirus neutralization / Sune C., Jimenez G., Correa I., Bullido M.J., Gebauer F., Smerdou C., Enjuanes L. // Virology. - 1990. – v.177. – P.559-569 163. Superti, F. HT-29 cells: a new substrate for rotavirus growth / Superti F., Tinari A., Baldassarri L., Donelli G. // Arch Virol. – 1991. – v.116. – P.159-173 164. Takahashi, K. An outbreak of swine diarrhea of a new-type associated with coronavirus-like particles in Japan / Takahashi K., Okada K., Ohshima K. // Jpn. J. Vet. Sci. - 1983. – v.45. – P.829–832 165. Tidke, R. Characterization of a double avirulent mutant of rabies virus and its potency as a vaccine, live or inactivated / Tidke R., Préhaud C., Coulon P., Blancou J., Flamand A. // Vaccine. – 1987. – v.5. – P.229-233 166. Truitt, R.L. The replication of bovine viral diarrhea-mucosal disease virus in bovine leukocytes in vitro / Truitt R.L., Schechmeister I.L. // Arch. Gesamte Virusforsch. – 1973. – v.42. – P.78-87 167. Usami, Y. Antibody response of pregnant sows to porcine epidemic diar¬rhea virus live vaccine and maternally derived antibodies of the piglets / Usami Y., Yamaguchi O., Kumanomido K., Matsumura Y. // J. Jpn. Vet. Med. Assoc. 1998. – v.51. – P.652-655 168. Utiger, A. Identification of the membrane protein of porcine epidemic diarrhea virus / Utiger A., Tobler K., Brigen A., Ackermann M. // Virus Genes. - 1995a. – v.10. – P.137-148 169. Utiger, A. Identification of proteins specified by porcine epidemic diarrhoea virus / Utiger A., Tobler K., Bridgen A., Suter M., Singh M., Ackermann M. // 136 Adv. Exp. Med. Biol. - 1995b. – v.380. – P.287-290 170. Van Cott, J.L. Contribution of antibody secreting cells induced in mucosal lymphoid tissues of pigs inoculated with respiratory or enteric strains of coronavirus to immunity against enteric coronavirus challenge / Van Cott J.L., Brim T.A., Lunney J.K., Saif L.J. // J. Immunol. - 1994. – v.152. – P.3980-3990 171. Van Nieuwstadt, A.P. Use of two enzyme-linked im-munosorbent assays to monitor antibody responses in swine with experimentally induced infection with porcine epidemic diarrhea virus / Van Nieuwstadt A.P., Zetstra T. // Am. J. Vet. Res. – 1991. – v.52. – P.1044-1050 172. VanReeth, K. Prevalence of infections with enzootic respiratory and enteric viruses in feeder pigs entering fattening herds / VanReeth K., Pensaert M. // Vet. Rec. – 1994. - v.135. – P.594-597 173. Wang, K., PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production / Wang K., Lu W., Chen J., Xie S., Shi H., Hsu H., Yu W., Xu K., Bian C., Fischer W.B., Schwarz W., Feng L., Sun B. // FEBS Lett. – 2012. – v.586. – P.384–391 174. Wege, H. Immunological aspects of coronavirus infections // Springer Semin. Immunopathol. - 1995. – v.17. – P.133-148 175. Willcocks, M.M. Growth and characterisation of human faecal astrovirus in a continuous cell line / Willcocks M.M., Carter M.J., Laidler F.R., Madeley C.R. // Arch. Virol. – 1990. – v.113. – P.73-81 176. Williams, R.A. Further studies on the development of a live attenuated vaccine against turkey rhinotracheitis / Williams R.A., Savage C.E., Worthington K.J., Jones R.C. // Avian Pathol. – 1991. – v.20. – P.585-596 177. Witte, K.H. Der Nachweis von Antikorpern gegen das Virus der Epizootischen Virusdiarrhoe (EVD) des Schweines mit dem Immunofluoreszenz-blockadetest (IFBT) / Witte K.H., Prager D. // Tierarztl. Umsch. - 1987. – v.42. – P.817-820 178. Wood, E.N. An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea // Vet. Rec. - 1977. – v.100. – P.243-244 179. Wood, E.N. Transmissible gastroenteritis and epidemic diarrhoea of pigs // Br. Vet. J. - 1979. – v.135. – P.305-314 180. Woods, R.D. Efficacy of a transmissible gastroenteritis coronavirus with an altered ORF-3 gene // Can. J. Vet. Res. - 2001. – v.65. – P.28-32 137 181. Woolcock, P.R. Duck virus hepatitis: serial passage of attenuated virus in ducklings / Woolcock P.R., Crighton GW. // Vet. Rec. – 1979. – v.105. - P.30-32 182. Yeo, S.G. Cloning and sequencing analysis of the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99 //Virus Genes. - 2003. – v.26. – P.239-246 183. Youn, S. In vitro assembled, recombinant infectious bronchitis viruses demonstrate that the 5a open reading frame is not essential for replication / Youn S., Leibowitz J.L., Collisson E.W. // Virology. - 2005. – v.332. – P.206-215 184. Yount, B. Severe acute respiratory syndrome coronavirus group-specific open reading frames encode nonessential functions for replication in cell cultures and mice / Yount B., Roberts R.S., Sims A.C., Deming D., Frieman M.B., Sparks J., Denison M.R., Davis N., Baric R.S. // J.Virol. – 2005. – v.79. – P.14909-14922 138 ПРИЛОЖЕНИЯ 139 140
