А.П. Пономарев, доктор биологических наук,
advertisement
А.П. Пономарев, доктор биологических наук, Е.В. Белик, А.А. Молева, кандидаты ветеринарных наук ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ) УДК 636.028:616.157:57.086.3 Выявление нанобактерий в крови лабораторных животных – кроликов методом электронной микроскопии При выполнении настоящей работы преследовалась цель прижизненного контроля животных для получения информации о наличии в их крови возможных контаминирующих агентов, исходя из следующих предпосылок. Литературные данные свидетельствуют об открытии нового вида карликовых микроорганизмов – нанобактерий, для которых наиболее благоприятной средой для роста и размножения является кровь и сыворотки крови, в частности фетальная сыворотка телят. Установлено, что нанобактерии как сапрофиты могут присутствовать в организме, как человека, так и животных. По мнению многих исследователей, эти микроорганизмы принимают участие в развитии многих заболеваний, в том числе и тех, возбудителями которых ранее считались вирусы и бактерии [9, 11, 13, 14, 15]. Кроме того, известно, что распространение инфекционных заболеваний наиболее часто происходит на фоне снижения резистентности организма животных. Среди многих причин следует выделить наличие в организме животных различных ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов относящихся к потенциальным иммунотоксикантам, присутствие которых ведет к развитию иммунодефицитного состояния [10]. Выбор кроликов для исследований обусловлен не только их доступностью и относительной невысокой стоимостью, но и тем, что они наиболее часто используются при проведении экспериментальных научных исследований. На ушах у кроликов имеются легко доступные вены, что упрощает введение антигена и взятие крови. При иммунизации кроликов различными антигенами можно получить довольно большое количество крови, антисыворотка которой обладает высокими титрами [3]. Совершенно очевидно, что качество сывороток будет зависеть от дополнительных антигенов, изначально присутствующих в крови животных. Учитывая многообразие функциональных свойств крови и доступность её получения нами были выполнены исследования образцов крови кроликов с использованием метода электронной микроскопии на предмет выявления в её составе возможных контаминирующих агентов с характеристикой их морфологии и оценкой количественных показателей. Материалы и методы В опытах было использовано порядка 200 конвенциональных кроликов массой 2,02,5 кг – это обычно разводимые в питомниках по открытой системе на хорошем зоогигиеническом уровне. Считается, что такие животные имеют полный набор микроорганизмов, свойственных нормальной микрофлоре, хотя не исключаются и некоторые условно-патогенные и даже патогенные для животных микроорганизмы [1]. Материалом для исследований служила периферическая кровь, которую забирали из краевой ушной вены. Операционное поле выстригали и обрабатывали ксилолом. В пробирки типа Эппендорф с 1 мл буфера STE рН 7,4 из иглы вносили четыре-пять капель крови. Для сохранения достоверности получаемых электронно-микроскопических изображений образцы крови, разведенные в буферном растворе, после отбора сразу же замораживали в термосе с жидким азотом (-196ºС). Пробы крови от группы животных, оттаивали и проводили первое центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 мин на настольной центрифуге ОПн8УХЛ4.2. После этого из каждой пробирки отбирали надосадочную жидкость и переносили в стерильные пробирки для повторного центрифугирования. Осадки при этом отбрасывали. Осветленные жидкости центрифугировали при 7000 об/мин в течение 30 мин. После этого надосадочные жидкости удаляли, а к полученным осадкам добавляли 3050 мкл буферного раствора рН 7,4, ресуспендировали активным перемешиванием и использовали при подготовке препаратов для электронной микроскопии. Препараты для электронной микроскопии готовили методом негативного контрастирования по общепринятой методике с использованием 4% раствора фосфорновольфрамовой кислоты рН 6,8. Исследования проводили в электронном микроскопе JEM100B (Япония) [6]. Результаты и обсуждение В ходе электронно-микроскопических исследований образцов крови кроликов установлено, что в крови данного вида животных могут присутствовать в различных концентрациях и соотношениях три основных морфологически различимых вида контаминирующих агентов. К наиболее часто выявляемому виду следует отнести микроорганизмы по морфологическим признакам предварительно идентифицированные нами ранее как микоплазмоподобные клетки. Концентрации последних у разных особей колебалась в пределах от 106 до 1010 клеток/мл и они могут быть представлены в крови как моноконтаминация, так и в ассоциации с бактериальными клетками. На рис. 1 приведена наиболее показательная электронная микрофотография 2 микоплазмоподобных клеток, выявленных в крови кролика. Из снимка видно, что клетки характеризуются сильно выраженным полиморфизмом. В популяции можно выделить клетки грушевидной формы, находящиеся в стадии бинарного деления (1). При этом параметры дочерних клеток следующие: длина от области перетяжки до вершины 167 и 193 нм при диаметре в области максимального утолщения соответственно – 90 и 97 нм. Для нитевидных материнских клеток отмечается как равновеликое, так и неравновеликое бинарное деление. 3 5 2 5 1 4 Рис. 1. Клетки микроорганизма неизвестного вида из крови кролика. По внешним морфологическим признакам они соответствуют известному определению «нитевидная плазма», что предварительно позволяет отнести их к микоплазмам Следующая разновидность клеток - это тонкие нитевидные структуры с равномерной толщиной по всей длине: при диаметре 25-30 нм они имеют длину от 0,5 до 2 мкм (2). На окончаниях клеток видны сферические утолщения с обозначением концентрации цитоплазматического вещества. Ряд клеток нитевидной формы разрастаются до гигантских размеров и изменяющейся толщиной по длине от 30 до 200 нм. На снимке у наиболее протяженной клетки тонкая часть диаметром 30-40 нм составляет 1,5 мкм, а её утолщенная часть, диаметром 170 нм, имеет длину 1,2 мкм и заканчивается тонким отростком длиной 350 нм (3). Общая длина данной клетки 3 мкм. Кроме того, на микрофотографии видны изображения и других клеток, тела которых имеют не только изменяющиеся по длине 3 параметры, но и утолщенные ответвления до 200 нм (4). Многообразие форм и очертаний клеток, отражающих их характерную морфологическую черту, свидетельствует об отсутствии у них ригидной клеточной стенки. Наряду с нитевидными структурами в популяции присутствуют также клетки по форме близкой к сферической диаметром 200-250 нм (5). Отдельные клетки имеют форму ракетки: сфера с одним нитевидным отростком. По-видимому, образованию подобных клеток предшествует образование на их поверхности бугорков, которые или отпочковываются в виде «мини-тел», или прорастают в виде нитевидных отростков. Клетки тороидальной формы имеют внешний диаметр 150 нм при толщине стенки тора 30-35 нм. Следует указать также на наличие на общем фоне нитевидных структур мелких сферических частиц или наносфер диаметром от 5 до 50 нм. Наряду с нитевидными и другими формами клеток нанобактерий в крови кроликов были выявлены сферические структуры нанометровых размеров или наносферы диаметром от 5-10 до 100-300 нм (рис.2). Размеры подобных микроорганизмов удобнее выражать в нанометрах, а не в микрометрах и обозначать их как «нанобактерии». В крови отдельных особей их содержание достигало высочайшей концентрации - 1011-1012 наносфер/мл. Их расположение характеризовалось как в виде цепочечных образований из а) б) Рис. 3. Морфология наносфер из содержимого образцов крови клинически здорового кролика, х 100 000 4 мельчайших сфер диаметром 5-20 нм (рис. 2а), рассредоточенное на поверхности пленкиподложки, а также в составе биопленок, в форме колоний (рис. 2б). Происхождение наносфер размером 50-100 нм возможно объяснить их образованием при почковании материнских клеток. Наносферы меньшего размера - 20-50 нм возможно образуются при фрагментации тонких нитевидных клеток. Происхождение же цепочечных образований из наносфер диаметром 5-20, в отдельных случаях напоминающих монослой на поверхности пленки-подложки, пока объяснить затруднительно. К следующему виду контаминирующих агентов следует отнести бактериальные клетки, идентичные по морфологии и по размерам энтеробактериям (рис. 3). Часть клеток на грани лизиса просматриваются вследствие во поражения внутренней их полости. наносферами, Концентрация которые отчетливо бактериальных клеток находилась в пределах 105-107 клеток/мл. Присутствие бинарно делящихся материнских клеток на две равновеликие дочерние клетки свидетельствовало об их активном размножении в крови. Рис. 3. Электронная микрофотография бактериальных клеток из образца крови кролика. х 16 000 При электронно-микроскопической оценке общей контаминации крови следует 5 указать, например, что в крупной партии из 60 кроликов у 8 особей микроорганизмы не были выявлены. У остальных животных в различных соотношениях выявляли как моно-, так и в ассоциации бактериальные клетки и микоплазмоподобные клетки в форме нитей различной длины, гантелевидные, сферические, тороидальные, а также наносферы и другие менее определенные формы. Данными морфологическими признаками обладают представители класса Mollicutes – микоплазмы. Общая характеристика микоплазм описана в фундаментальной работе коллектива авторов [4]. Полиморфизм клеток выражается наличием сферических форм, диаметром 0,3-2 мкм, овоидных, спиралевидных, коккобациллярных нитей, клетками с перетяжками, удлиненных нитей протяженностью от 2,5 до 10-30 мкм, почкующихся клеток. Представленные нами электронные микрофотографии достаточно убедительно демонстрируют наиболее типичные для прокариот признаки бесполого размножения: бинарное деление и почкование. При бинарном делении отмечается равновеликое и неравновеликое деление материнских клеток с образованием перетяжки и тонкостенной капсулы между дочерними клетками, которые часто имеют грушевидную форму. В процессе почкование на поверхности сферической клетки образуются бугорки от одного до восьми, из которых затем формируются «мини-тела». В некоторых случаях отчетливо просматривались нитевидные формы клеток с явно выраженными признаками фрагментации. Из вышесказанного следует, что между выявленными нами в образцах крови микроорганизмами и клетками микоплазм имеется, за исключением размеров клеток, определенное морфологическое сходство. Наиболее наглядно это подтверждается спецификой развития микоплазм, растущих на жидкой и плотной питательных средах, схематические изображения которых приведены в монографии В.Д. Тимакова и Г.Л.Каган (1967). Фактически эти сведения и послужили нам ранее основанием для идентификации выявленных микроорганизмов как микоплазмы. Но последующие опыты поставили под сомнение правильность выдвинутой данной интерпретации [7] . Для получения дополнительных сведений были выполнены опыты по проверке устойчивости выявленных микроорганизмов к физико-химическим воздействиям. Для этих целей образцы крови готовили совершенно идентично, как и для электронной микроскопии. Для проверки термоустойчивости выявленных микроорганизмов, образцы, в виде конечных ресуспендированных осадков, прогревали при температуре 70°С в течение 10 мин. Результаты электронно-микроскопического контроля показали, что в процесс прогревания сопровождается конформационным переходом или трансформацией 6 нитевидных клеток до более мелких сферических наносфер и других менее определенных форм. На поверхности отдельных наносфер просматривается капсулярная оболочка или фрагмент в виде короткой палочки (рис. 4). Рис. 4. Морфология клеток из образца крови до и после прогревания при 70°С в течение 10 мин. Трансформированные клетки в форме наносфер имеют диаметр 120-150 нм. Из литературы известно, что микоплазмы чувствительны к температуре выше +39°С, а при температуре +70°С лизис клеток происходит в течение 30 сек [5]. Следовательно, установленный нами факт термоустойчивости микроорганизмов, выявленных в крови животных, не позволяет отнести их к микоплазмам. Явление нанотрансформации при температурном воздействии свидетельствует о бактериальной природе данных микроорганизмов. Феномен нанотрансформации обнаружен у ряда бактерий, в том числе и у микоплазм, что установлено на примере Acholeplasma laidlawii как ответная реакция на стрессовые воздействия ультрамикроформы in vitro. сопровождается Установлено, потерей что трансформация цитоплазматического клеток в материала, конценсацией нуклеоида, изменением профиля полипептидного спектра и ампликонов генов рРНК. При этом наноклетки A. laidlawii могут восстанавливать пролиферативную активность и обладают способностью реверсии в исходную вегетативную форму [11]. При проверке воздействия на выявленные микроорганизмы органического 7 растворителя использовали хлороформ, 5-10% которого добавляли к ресуспендированным осадкам образцов крови и интенсивно перемешивали на вибровстряхивателе в течение 10 мин. Полученную эмульсию осветляли на центрифуге при 500 g в течение 10 мин. Затем из надосадочной водной фазы готовили препараты для электронной микроскопии. Результаты контроля показали, что вследствие воздействия хлороформа клетки нитевидной формы трансформировались с образованием структур сферической формы диаметром 5-40 нм или наносфер. Концентрация их зависела от исходного содержания интактных клеток и находилась в пределах от 107 до 1010 наносфер/мл. Подобной обработки микоплазмы выдержать не могут, так как их клеточные мембраны содержат все липиды микоплазмы и до 50% белков [2]. Кроме того, известно, что микоплазмы отличаются неустойчивостью (быстрым лизисом) в дистиллированной воде [2]. Для проверки влияния воды на морфологию нитевидных и других форм клеток конечные осадки после центрифугирования образцов крови ресуспендировали в дистиллированной воде. По второму варианту кровь разводили в дистиллированной воде, дважды центрифугировали, осадки также ресуспендировали в воде и использовали для приготовления препаратов для электронной микроскопии. Результаты контроля показали сохранение в водных растворах при некоторых нарушениях морфологии нитевидных и палочковидных форм клеток, а в отдельных случаях отмечалась их трансформация до наносфер. Этот факт является дополнительным свидетельством, что выявленные в крови микроорганизмы не относятся к семейству микоплазм. Подтверждением данной гипотезы послужили данные по идентификации выявленных микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). По результатам контроля концентрированных образцов микроорганизмов методом ПЦР были получены отрицательные данные. Постановку ПЦР в разное время проводили кандидаты биологических наук С.А.Чупин и А.В.Щербаков и авторы выражают им глубокую признательность за проделанную работу. Известно, что повышенной устойчивостью к стрессовым факторам: тепловой обработке, антибиотикам, ультрафиолетовым лучам, действию химических веществ и другим физико-химическим факторам обладают недавно открытый вид микроорганизмов - нанобактерии. Кроме того, известно о способности нанобактерий расти на искусственной питательной среде, что и было испытано в наших опытах. Для высева на питательные среды образцы крови готовили в соответствии с описанным выше способом и в соотношениях 1:250-1:1000 добавляли к питательной среде Игла. Инкубация среды при температуре +37°С сопровождалась ростом и размножением 8 микроорганизмов с образованием осадка начиная с 4-5 суток при отсутствии бактериального пророста. При периодическом электронно-микроскопическом контроле содержимого осадков в течение 2 месяцев было установлено присутствие в высоких концентрациях наносфер диаметром от 10 до 200 нм, которые располагались как в свободном состоянии, так и в составе биопленок. При пассировании на среде Игла также отмечается активный рост и размножение наносфер с образованием не только сферических структур, но других неопределенных форм клеток. Эти обстоятельства и известные литературные данные по структуре и свойствам нанобактерий позволяют нам отнести выявленные нами микроорганизмы к нанобактериям. Результаты исследований по их росту и размножению на питательных средах будут изложены в отдельной работе. В наших исследованиях также установлены факты взаимодействия и проникновения нитевидных форм нанобактерий внутрь лимфоцитов. На электронной микрофотографии (рис. 5а) представлены клетки лимфоцитов из крови кролика, одна из которых поражена нитевидными формами и почти лизирована, а вторая, расположенная рядом, остается свободной. На снимке нитевидные формы клеток расположены как в свободном состоянии, так и на поверхности лимфоцитов с внедрением внутрь. Диаметр лимфоцитов равен 5,0-5,2 мкм. На следующем снимке (рис. 5б) представлена клетка лимфоцита из крови кролика той же партии. Нанобактерии нитевидной, сферической и других форм просматриваются в вакуолях лимфоцита. На поверхности лимфоцита отмечается присутствие мелких наносфер диаметром 20-30 нм. Следует отметить, что в некоторых партиях животных кровь всех кроликов была контаминирована нанобактериями, что, возможно, свидетельствует об общем источнике их заражения. При клиническом осмотре подобной партии кроликов из 28 особей было сделано заключении о том, что животные находились в неудовлетворительном физиологическом состоянии. Подтверждением этому, послужило то, что до использования их для целей иммунологических исследований два кролика пало. Следствием активного размножения нанобактерий в лимфоцитах является лизис последних с образованием скоплений из нитевидных и других форм микоплазм с фрагментами собственно лимфоцита (рис. 6). По внешним размерам данные колонии соответствуют размерам лимфоцитов. Возможно предположить, что остатки лизированных лимфоцитов, сохраняющих свою компактность, могут способствовать формированию тромбов и вызывать нарушение микроциркуляции. 9 а) б) Рис. 5. Клетки лимфоцитов из крови кролика, одна из которых поражена нанобактериями, а вторая, расположенная рядом, остается свободной от них (а), х 17 500; нанобактерии различных размеров и формы в вакуолях лимфоцита (б), х 38 000 10 Рис.6. Колония клеток нанобактерий в смеси с фрагментами разрушенного лимфоцита. Усредненный внешний диаметр колонии равен 5 мкм, х 23 000 Таким образом, метод электронной микроскопии позволяет контролировать наличие контаминирующих агентов в крови животных и дает возможность проводить оценку нарушений нормального состава крови. Совершенно очевидно, что присутствие в крови животных чужеродных микроорганизмов вызывает дополнительную нагрузку на иммунную систему живого организма. Выявление частично или полностью лизированных лимфоцитов с образованием их скоплений, при поражении последних нанобактериями, свидетельствует о нарушении микроциркуляции крови, что может быть причиной различных заболеваний. Присутствие же в крови клинически здоровых животных нанобактерий, в различном морфологическом состоянии, и бактериальных клеток является фоном, на котором совершенно очевидно происходит развитие ассоциированных инфекций, вызываемых возбудителями вирусной и бактериальной природы. Это затрудняет диагностику и принятие адекватных мер лечения. Поэтому метод электронной микроскопии целесообразно использовать для предварительной оценки возможной контаминации крови животных, используемых в ответственных опытах. 11 Литература 1. Балтрашевич А.К., Подопригора Г.И., Комаровская Т.П. Категоризация лабораторных животных по микробному фактору / Акт. вопр. стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований. Ч.II. – М., 1988. – С. 36. 2. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вонский М.С. Микоплазмы / СПб.Наука. -2002. -317 с. 3. Горвиц М., Шарфф М. Получение антисывороток к вирусным антигенам / Методы вирусологии и молекулярной биологии. - М., Мир. – 1972. – С. 200-207. 4. Инфекционная патология животных. В 2т. / Под ред. А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронина. – М.: ИКЦ «Академкнига». – 2006, Т.2. – 807 с. 5. Коромыслов Г.Ф., Мессарош Я., Штипкович Л. И и др. Микоплазмы в патологии животных. – М.: Агропромиздат. – 1987. – 256 с. 6. Пономарев А.П., Мищенко В.А. Электронная микроскопия вирусов животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов. – Владимир: Фолиант, 2005. -158 с. 7. Пономарев А.П., Груздев К.Н., Мищенко В.А., Белик Е.В. Электронная микроскопия крови животных, больных лейкозом / Вестник РАСХН. – 2007. - №5. – С.6171. 8. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Семейство Mycoplasmataceae и L-формы бактерий / М.: Медицина, 1967. – 336 с. 9. Урбано П., Урбано Ф. Нанобактерии: реальность или фантазия? / Российский ветеринарный журнал. – 2007. - №3. – С. 9-11. 10. Ушкалов В.А. Энтеротоксигенность условно-патогенных бактерий как фактор их патогенности / Мат. междунар. науч. конф. «Общая эпизоотология: иммунологические и методологические проблемы».- 20-22 сентября 1995, Харьков. – С. 200-207. 11. Чернов В.М., Мухаметшина Н.Е., Гоголев Ю.В. и др. Адаптивные реакции микоплазм in vitro: “жизнеспособные, но некультивируемые формы” и наноклетки Acholeplasma laidlawii / Микробиология. – 2005. -Т. 74, №4. – С. 498-503. 12. Barr S.C., LinkeR.A., Janssen D. Detection of biofilm formation and nanobacteria under long-term cell culture conditions in serum samples of cattle, goats, cats and dogs / Am. J. Vet. Res. – 2003. – Vol. 64. – P. 176-182. 13. Ciftciogly N. Association between nanobacteriae and periodontal disease / Circulation. – 2003. –Vol. 108. – 8 p. 14. Kajander E.O., Kuronen I., Ciftciogly N. Faral (fetal) bovine serum: discovery pf 12 nanobacteria / Molecular Biolology of the cell, Suppl. -1996. –Vol. 7. – P.517. 15. Kajander E.O., Kurpnen J., Akerman K. Nanobacteria from blood the smallest cubturable automously replicating agent on Earth; Sciece / Nature. – 1997. –Vol. 3111. – P. 420428. Резюме К статье А.П.Пономарева, Е.В.Белика, А.А.Молевой Выявление нанобактерий в крови лабораторных животных – кроликов методом электронной микроскопии Проведены исследования по выявлению контаминирующих агентов в образцах крови кроликов, наиболее часто используемых в иммунологических исследованиях. Показано, что в крови клинически здоровых животных могут присутствовать как моно, так и различные ассоциации клеток бактерий и нанобактерий в различном морфологическом состоянии. При этом клетки нанобактерий могут находиться в свободном состоянии и в составе лимфоцитов, вызывая лизис последних. Присутствие в крови животных клеток нанобактерий и бактериальных клеток может служить фоном, который способствует развитию ассоциированных инфекций, вызываемых возбудителями вирусной и бактериальной природы. 13
