Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном

На правах рукописи
КОМАРОВА Татьяна Валерьевна
Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и
вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической
платформы продукции фармацевтических белков
03.01.03 –Молекулярная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва – 2013
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Произрастая в агробиоценозах, растения постоянно испытывают давление внешних
факторов окружающей среды, как биотической, так и абиотической природы. Повреждающее
воздействие ветра, осадков или фитофагов нарушают целостность покровных тканей растения,
открывая путь для проникновения внутрь различных патогенов. Растения в ответ на вторжение
вирусов и бактерий синтезируют макромолекулы (РНК и белки), транспортируемые в различные
ткани и органы. Существует три уровня движения макромолекул по растению: (а) ядерноцитоплазматический транспорт, включающий перемещение РНК из ядра в цитоплазму и
движение белков, синтезированных в цитоплазме, в ядро; (б) межклеточное перемещение РНК и
белка (ближний транспорт); (в) дальний транспорт по сосудистой системе растения белков и
РНК, в том числе вирусных нуклеопротеидов. Вирусы и бактерии различаются между собой в
способности эксплуатировать эти три уровня транспорта. Вирусы растений, большая часть из
которых цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, активно используют ближний и дальний
транспорт для переноса генетического материала по растению. Бактерии, как внеклеточные
патогены, не нуждаются в транспорте генетического материала по растению, однако при
колонизации используют ядерно-цитоплазматический транспорт, вводя белковые факторы
вирулентности в хозяйское ядро для его «переформатирования». Современное представление о
вирусном и бактериальном патогенезе предполагает возможность конкурентных
взаимоотношений между макромолекулами хозяина и патогена на уровне транспорта. Однако
экспериментальных данных на этот счет недостаточно, что определяет актуальность
исследования роли транспорта макромолекул в иммунитете растений.
При рассмотрении ядерно-цитоплазматического транспорта макромолекул в растении
следует иметь в виду, что растения в ответ на внешнее воздействие и атаку патогена проявляют
серию защитных реакций, включающих повышенную транскрипцию некодирующих и
кодирующих участков генома, вовлеченных в адаптивные реакции растений. Ядро растительной
клетки структурно и функционально отделено от цитоплазмы, поэтому ядерноцитоплазматический экспорт РНК через ядерную пору играет фундаментальную роль в
регуляции генома. В последние годы установлена важная роль коротких некодирующих РНК
(кнРНК) в иммунитете растений и в проявлении защитных реакций в ответ на вирусную и/или
бактериальную инфекцию. В частности показана связь между вирулентностью вирусов и
уровнем накопления в цитоплазме кнРНК (Bazzini et al., 2007, 2011). Более того, установлено,
что суперэкспрессия кнРНК и увеличение их содержания в цитоплазме стимулирует
репродукцию вируса табачной мозаики (ВТМ) (Dorokhov et al., 2006). Молекулярные механизмы
этих явлений неясны и требуют дополнительных экспериментов для выяснения роли ядерного
экспорта РНК в реакциях растений на бактериальную и вирусную атаку. Этим определяется
необходимость создания экспериментальной модели экспорта мРНК, а также коротких
1
некодирующих РНК из ядра растительной клетки. На подобной модели можно охарактеризовать
молекулярные механизмы конкуренции РНК за экспорт из ядра в цитоплазму и изучить участие
ядерного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.
На втором уровне транспорта клеточных макромолекул, когда через плазмодесмы
происходит перенос клеточных белков, например, транскрипционных факторов хозяина и
кодирующих их мРНК, также может происходить конкуренция с вирулентными факторами
патогенов, а именно, с вирусными транспортными белками (ТБ) и эффекторными молекулами
бактерий. Вероятность такой конкуренции до сих пор не исследовалась, прежде всего, из-за
отсутствия адекватной экспериментальной модели, позволяющей изучать роль межклеточного
транспорта в бактериальном и вирусном патогенезе в условиях, максимально приближенных к
природным. В интактном растении табака только молодые (0,5-3,0 см) верхние быстрорастущие
листья, являющиеся акцепторами (sink) фотоассимилятов, характеризуются наличием
«открытых» плазмодесм и интенсивным межклеточным транспортом. Эти листья, однако, не
представляют собой природных «ворот» инфекции и малопригодны для экспериментального
заражения. С другой стороны, зрелые крупные (10-20 см) листья табака, являющиеся донорами
(source) фотоассимилята и обычно использующиеся для экспериментального заражения ВТМ и
бактериями, такими как Ralstonia solanacearum и Agrobacterium tumefaciens, содержат
плазмодесмы, которые «закрыты» для крупных макромолекул. Пропускная способность
плазмодесм «source»-листьев увеличивается при вирусной инфекции, например, с помощью
транспортного белка вируса. Оптимальной экспериментальной системой могли бы быть
растения, у которых плазмодесмы «source»-листьев «открываются» при воздействии
газообразного вещества, не повреждающего листья и не вносящего в систему фактор травмы.
Вообще, летучие органические вещества, которые могут играть роль сигналов коммуникации
между растениями, известны достаточно давно. Среди них идентифицирован метанол, который
образуются в реакции деметилирования пектина ферментом клеточной стенки табака,
пектинметилэстеразой (ПМЭ). В нашей лаборатории этот фермент впервые был
идентифицирован в качестве рецептора транспортного белка ВТМ (Dorokhov et al., 1999).
Использование
разработанной
экспериментальной
системы
контролируемого
межклеточного транспорта позволит проверить выдвинутую ранее гипотезу относительно
участия ПМЭ и метанола в регуляции межклеточного транспорта и патогенезе растений
(Дорохов, 2007). Кроме того, именно в условиях данной системы появляется возможность
исследования роли ПМЭ и метанола как факторов мобилизации растительного сообщества в
ответ на травму и проникновение вирусного или бактериального патогена.
В последние годы биотехнология рассматривает растения в первую очередь в качестве
некоего «ферментера» рекомбинантных фармацевтических молекул, включая ферменты,
вакцины и антитела. Поэтому другим направлением нашего исследования является выявление
молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растения и вируса в
искусственных условиях растения-биофабрики. Наиболее эффективными оказались системы
2
продукции, основанные на введении вирусного вектора, кодирующего целевой белок, с
помощью бактерии Agrobacterium tumefaciens в клетки растения Nicotiana benthamiana. Этот
подход позволяет получить временную экспрессию гена целевого белка с высоким выходом
конечного продукта и в короткие сроки (до 7 дней). Таким образом, мы рассматриваем
возможность практического применения выявленных закономерностей переноса макромолекул
хозяина и патогена в клетке и между клетками. Выяснение молекулярных механизмов, лежащих
в основе таких систем экспрессии, также представляется актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является расшифровка
молекулярных механизмов участия ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта
макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений, а также создание на их основе
биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков.
Для достижения вышеописанной цели поставлены следующие задачи:
1.
Создать экспериментальную модель экспорта РНК из ядра растительной клетки.
2.
Изучить молекулярные механизмы и создать концепцию участия ядерного
транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.
3.
Разработать экспериментальную модель модификации межклеточного транспорта
макромолекул в листьях растений с использованием газообразного метанола.
4.
Исследовать молекулярные механизмы и роль транспорта макромолекул в
иммунитете растений и создать концепцию конкуренции макромолекул хозяина и патогена на
уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы или
белки переносчики.
5.
Разработать биотехнологические основы эффективной продукции вакцин и
антител в растении.
Научная новизна и практическая значимость работы
В результате проделанной работы нами создана модельная система для изучения
способности кнРНК и коротких мРНК, индуцируемых стрессовыми воздействиями, подавлять
ядерный экспорт хозяйской мРНК и мРНК зеленого флуоресцирующего белка, GFP. Создан
набор генетических конструкций для синтеза РНК, направляемых ДНК-зависимой-РНКполимеразой (Pol) I, II и III в растительной клетке. При ко-агроинфильтрации листьев
N.benthamiana генетическими конструкциями, обеспечивающими синтез кнРНК клеточной Pol
II, совместно с конструкций, кодирующей GFP, наблюдалось значительное снижение уровня
экспрессии последнего, в то время как кнРНК, синтез которых направляется в клетке Pol I или
III, не оказывали влияние на экспрессию гена GFP. Степень ингибирования экспрессии гена
GFP, а также клеточного гена BiP напрямую зависела от длины некодирующего транскрипта и
«силы» промотора. Показано также, что короткие транслируемые транскрипты, или короткие
мРНК (кмРНК), также способны конкурировать за ядерный экспорт с другими более длинными
мРНК. Гипотеза о том, что кнРНК и кмРНК могут блокировать ядерно-цитоплазматический
3
транспорт мРНК, участвующих в антивирусной защите клетки, подтверждена
экспериментально. Показано, что при доставке в клетки растения плазмид, кодирующих
короткие РНК, совместно с векторами, направляющими синтез РНК ВТМ или Х-вируса
картофеля (ХВК), наблюдается значительное повышение эффективности репродукции вируса.
Предложены две схемы, «песочные часы» и «генные ворота», отражающие механизмы
конкуренции между молекулами кнРНК/кмРНК и мРНК при прохождении ими ядерной поры.
Для исследования роли второго уровня транспорта в растении, движения макромолекул
из клетки в клетку, разработана экспериментальная модель регулируемого межклеточного
транспорта в листьях табака, когда после воздействия газообразного метанола на интактное
растение, плазмодесмы его листьев «открываются». Эта модель позволяет изучать участие
межклеточного транспорта в реакции растений на травму, вторжение вируса и бактериальных
патогенов. Показано, что механическое повреждение листьев растения приводит к активному
синтезу ПМЭ de novo, сопровождаемого повышением уровня образования и выделения в
атмосферу метанола. Газообразный метанол или пары, испускаемые поврежденным растением,
вызывают у соседних интактных растений устойчивость к бактериальным патогенам, R.
solanacearum и A. tumefaciens. Были выявлены гены, индуцируемые метанолом (methanolinducible genes, МИГ), большинство из которых связано с защитой растения и межклеточным
транспортом. Среди них ген β-1,3-глюканазы (BG), ген NCAPP (non-cell-autonomous pathway
protein) и ранее не идентифицированный ген, MIG-21. Эксперименты с ВТМ и вектором,
кодирующим две тандемные копии GFP и используемым в качестве индикатора межклеточного
транспорта, показали, что BG, MIG-21 и NCAPP вызывают увеличение пропускной способности
плазмодесм, приводящее к повышению эффективности перемещения вирусной РНК из клетки в
клетку. Показано, что газообразный метанол или пары, испускаемые травмированным
растением, повышают эффективность репродукции ВТМ в соседних растениях. Был сделан
вывод, что метанол, выделяемый поврежденными тканями, индуцирует повышение экспрессии
генов межклеточной коммуникации (BG, MIG-21 и NCAPP) в соседних растениях и приводит к
более активному транспорту в нем РНК ВТМ. Выявлено участие ПМЭ и метанола в блокаде
ядерно-цитоплазматического транспорта. Создана модель, согласно которой бактериальные
белки, содержащие сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), конкурируют с
ТБ ВТМ за NCAPP, играющий роль рецептора и переносчика хозяйских и вирусных
транспортных белков.
Выявленные закономерности ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта в
растении позволили разработать биотехнологическую платформу продукции вакцин и антител.
Создан новый вирусный вектор на основе генома Х вируса картофеля, а также впервые создана
эффективная система транзиентной экспрессии в растительной клетке на основе
транскрипционной кассеты РНК-полимеразы I. Разработан метод продукции в растении
гуманизированного моноклонального антитела трастузумаб, применяемого в лечении рака
молочной железы; определены параметры конструирования вакцинных наночастиц на основе
4
вирионов ВТМ. Кроме того доказана биологическая безопасность Agrobacterium tumefaciens для
млекопитающих: эта бактерия при экспериментальной бактериемии не вызывает
трансформацию клеток органов мыши.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании ученого совета НИИ
физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ 18 июня 2012 года. Материалы
работы докладывались на международных конференциях: на конференциях Plant-based Vaccines
and Antibodies (проводятся раз в два года) 2007-2011 гг., на всех конгрессах FEBS с 2008 по 2012
гг, на конгрессах FESPB 2008 и 2010 гг.
Публикации. По результатам работы подготовлено 22 публикации в рецензируемых
научных изданиях, в том числе 2 главы в монографиях, 1 обзорная статья в международном
периодическом издании Expert Review of Vaccines. Авторские права в биотехнологических
разработках Т.В.Комаровой защищены 5 патентами. Основные результаты и теоретические
обобщения опубликованы в ведущих российских и международных журналах [Acta Naturae,
Биохимия (Москва), FEBS Journal, Plant Molecular Biology, PLoS One, PLoS Pathogens,
Tuberculosis,Virology].
Структура работы и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы:
введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список
литературы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Имеющиеся данные относительно роли транспорта макромолекул в бактериальном и
вирусном патогенезе оставляют неизученными целый ряд вопросов. Приступая к работе, мы
придерживались следующей гипотезы: в ответ на стрессовые воздействия в растительной клетке
повышается уровень транскрипционной активности, в результате чего возможно возникновение
конкуренции между кнРНК и клеточными мРНК за экспорт из ядра в цитоплазму. Мы
предположили, что поскольку короткие РНК могут синтезироваться в ядре с более высокой
эффективностью, а, следовательно, в бóльшем количестве, чем относительно длинные
интронированные пре-мРНК, то произойдет вытеснение мРНК из экспорта, и какая-то доля
мРНК останется в ядре, не достигнув цитоплазмы. При такой конкуренции в проигрыше
окажутся, прежде всего, длинные мРНК, например мРНК белков, участвующих в защитной
реакции умолкания генов, дайсер (англ. Dicer) и аргонавт (англ. Argonaute), длина которых
превышает 6 тысяч оснований. Снижение эффективности экспорта таких мРНК в цитоплазму
вызовет дефицит белков, участвующих в сайленсинге, т.е. в специфической деградации РНК
патогена. Недостаток в клетке молекул дайсера или аргонавта послужит причиной повышения
стабильности и уровня накопления вируса. Если применить эти соображения к бактериальной
инфекции, то избыточный синтез кнРНК на раннем этапе заражения может блокировать экспорт
5
в цитоплазму молекул мРНК, кодирующих факторы, обеспечивающие питание патогена и
способствующие успеху бактериальной колонизации растения.
1.
Экспериментальная модель экспорта кнРНК из ядра растительной клетки.
Все вышесказанное определяет необходимость создания экспериментальной модели
экспорта из ядра растительной клетки кнРНК, синтез которых в ядре направляется ДНКзависимой РНК полимеразой (Pol) I, II или III. На такой модели можно выяснить, существует ли
(а) взаимосвязь между экспортом кнРНК и экспрессией мРНК и (б) конкуренция между
молекулами РНК, синтезированными различными РНК-полимеразами, за экспорт из ядра в
цитоплазму. Разработанная нами система основана на временной трансформации с помощью
A.tumefaciens растения N. benthamiana плазмидами, направляющими синтез кнРНК под
контролем промоторов Pol I, II и III.
Рис. 1. Схематическое изображение генетических конструкций. А. Конструкция 35S-GNC. В составе
транскрипционной кассеты (35S промотор и 35S терминатор вируса мозаики цветной капусты) химерный
ген, кодирующий GFP, сигнал ядерной локализации (NLS) SV40 и белок оболочки бактериофага MS2
(CPMS2). Б-Г. Последовательность, соответствующая 4-кратно повторенной «шпильке», узнаваемой
CPMS2, в составе транскрипционных кассет РНК-полимераз I (Pol IrRNA), II (Pol II35S) и III (Pol IIItRNA),
соответственно.
Для создания модели мы применили ранее описанный прием (Zhang and Simon, 2003),
основанный на способности белка оболочки бактериофага MS2 (CPMS2) узнавать и связываться с
РНК, содержащей специфическую 19-нт-последовательность ACAAGAGGAUCACCCAUGU,
образующую шпилечную структуру (MS2 шпилька). Для визуализации используется
генетическая конструкция, кодирующая химерный слитый белок GNC, содержащий CPMS2,
зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и сигнал ядерной локализации (NLS) SV40 (Рис. 1А).
Проверка эффективности выбранного методического приема была проведена с помощью
агроинфильтрации листьев N.benthamiana 35S-GNC. Белок GNC, синтезированный в цитоплазме
в отсутствие РНК, содержащей MS2 шпильку, всегда направляется в ядро системами импорта
ядерных белков при участии сигнала ядерной локализации GNC (Рис. 2А). Появление в
цитоплазме РНК, содержащей MS2 шпильки, препятствует переносу GNC в ядро (Рис. 2В). РНК
MS2 шпильки, по-видимому, экранирует NLS GNC, делая его недоступным для системы
6
переноса ядерных белков, поэтому часть молекул GNC не попадает в ядро и остается
цитоплазме.
На следующем этапе мы создали генетические конструкции, кодирующие тетрамер MS2шпильки (MS2-H)4 в составе транскриционных кассет рибосомной РНК (Pol IrRNA), тРНК (Pol
IIItRNA) и мРНК (Pol II35) (Рис. 1 Б-Г). Промоторы направляли в клетке синтез соответствующих
молекул РНК, причем Pol IrRNA обеспечивала синтез бóльшего количества РНК (MS2-H)4 в
клетке (Табл. 1, последняя колонка). Агроинъекция листьев этими конструкциями совместно с
GNC приводила к частичной цитоплазматической локализации GNC (Рис. 2 Б-Г).
Рис. 2. Визуализация экспрессии GFP в клетках эпидермиса. Листья агроинфильтрированы (А) 35SGNC или 35S-GNC совместно с (Б) Pol IrRNA-(MS2-H)4, (В) Pol II35S-(MS2-H)4, (Г) Pol IIItRNA-(MS2-H)4.
Фотографии получены при помощи конфокального микроскопа, представлены проекции нескольких
конфокальных "срезов". Масштабная линейка соответствует 20 мкм.
Таблица 1. кнРНК, синтезированные
экспортируются в цитоплазму.
Конструкция,
ко-инъецированная с 35S-GNC
Pol IrRNA-(MS2-H)4
Pol II35S-(MS2-H)4
Pol IIItRNA-(MS2-H)4
РНК-полимеразами
Количество клеток с ядерноцитоплазматической
локализацией GNC (%)
27±1.3
30±3.7
21±2.7
I-III,
эффективно
Относительное количество
РНК (MS2-H)4
1.42±0.34
1.00±0.13
0.49 ±0.07
Подсчет количества клеток, экспрессирующих GNC, и оценка локализации последнего
показывает, что при ко-агроинфильтрации 35S-GNC с кодирующими (MS2-H)4 конструкциями
происходит перераспределение GNC в клетке. Доля клеток с ядерно-цитоплазматической
локализацией более 20% для всех вариантов (Табл. 1, вторая колонка), т.е. РНК,
соответствующие (MS2-H)4 эффективно синтезируются и экспортируются из ядра в цитоплазму.
Мы заключили, что разработанная экспериментальная модель позволяет исследовать
экспорт в цитоплазму молекул кнРНК, синтезированных в ядре клетки с помощью Pol I, Pol II
или Pol III.
На следующем этапе мы изучали вопрос, может ли клетка экспортировать молекулы
кнРНК из ядра в цитоплазму тем же путем, что и мРНК, т.е. использует ли клетка одни и те же
7
механизмы ядерного созревания РНК и ядерные поры. Существует ли конкуренция между
мРНК, синтез которых, как известно, направляет Pol II, и молекулами кнРНК, синтезируемых
Pol I, Pol II и Pol III? Чтобы ответить на эти вопросы, мы создали следующие генетические
конструкции в составе транскрипционной кассеты Pol II: Pol II35S-Lnc-(MS2-H)4, кодирующая
длинную (>1,800 нуклеотидов) РНК с последовательностью (MS2-H)4 на 3’-конце, и 35S(GAAA)16, обеспечивающая синтез в клетке искусственной РНК, состоящей из 16 повторов
тетрануклеотида GAAA [(GAAA)16] (Рис. 3, слева).
Рис. 3. Ядерно-цитоплазматическое распределение GNC в клетке. Ко-инфильтрация 35S-GNC с 35SLnc-(MS2-H)4 и 35S-(GAAA)16. Lnc, длинная (>1800 нт) некодирующая последовательность; (GAAA)16,
короткая искусственная некодирующая последовательность. Фотографии получены при помощи
конфокального микроскопа, представлены проекции нескольких конфокальных «срезов», наложенных на
изображение в видимом свете. Внизу указан процент клеток, в которых наблюдается цитоплазматическая
локализация GNC, от общего количества экспрессирующих GNC клеток.
Агроинъекция листьев конструкцией Pol II35S-GNC совместно с Pol II35S-Lnc-(MS2-H)4
приводила к изменению локализации GNC с ядерной на цитоплазматическую (Рис. 3, справа
внизу). Внесение Pol II35S-(GAAA)16 в агроинъекционную смесь восстанавливало ядерную
локализацию, что позволяет предположить возможность блокады экспорта из ядра в цитоплазму
РНК Lnc-(MS2-H)4 многочисленными молекулами (GAAA)16, т.е. короткие РНК (GAAA)16
успешно конкурируют с длинными мРНК на этапе выхода из ядра в цитоплазму.
8
Рис. 4. Синтезируемые Pol II кнРНК снижают уровень экспрессии 35S-GFP. А. Экспрессия GFP на 3
день после агроинфильтрации 35S-GFP и конструкций, кодирующих (GAAA)16 в составе
транскрипционных кассет Pol I, Pol II и Pol III. Контроль: ко-инфильтрация 35S-GFP с pBin19.
Визуализация зон экспрессии GFP при помощи УФ-света. Б. Флуориметрический анализ количества GFP
в зонах листа, представленных на панели А. Контроль принят за 100 относительных единиц
флуоресценции1. Данные получены в 5-8 независимых экспериментах2.
На следующем этапе мы исследовали вопрос, существует ли конкуренция между мРНК и
молекулами кнРНК, синтез которых направляется Pol IrRNA-, Pol II35S- и Pol IIItRNA. Для этого мы
использовали транскрипт гена GFP в качестве индикатора экспорта мРНК и набор генетических
конструкций, содержащих последовательность (GAAA)16 в составе транскрипционных кассет
Pol I, Pol II и Pol III. Мы показали, что в отличие от Pol IrRNA-(GAAA)16 и Pol IIItRNA-(GAAA)16,
ко-агроинъекция листьев 35S-GFP и Pol II35S-(GAAA)16 приводила к подавлению экспрессии
GFP (Рис. 4А). Как видно из гистограммы (Рис. 4Б), эффективность накопления GFP падает в 210 раз (в зависимости от количества GAAA-повторов) по сравнению с контролем, что указывает
на возможную конкуренцию РНК GFP и (GAAA)n, синтезированных Pol II, за экспорт из ядра. В
пользу этого предположения свидетельствовуют наши результаты, указывающие на то, что
экспрессия GFP и экспорт мРНК GFP не подавлялись в случае синтеза (GAAA)16
непосредственно в цитоплазме с субгеномного промотора вирусного вектора на основе ХВК
(данные не представлены). Наблюдаемый нами феномен не связан с конкуренцией промоторов
Pol II35S за полимеразу Pol II. В пользу этого заключения свидетельствуют две группы данных.
Во-первых, введение интрона в ген GFP (GFPi) повышает уровень экспрессии этого гена,
несмотря на присутствие в клетке Pol II35S-(GAAA)16 или Pol II35S-(MS2-H)4 (данные не
представлены). Эти результаты указывают на важную роль сплайсинга, но не на конкуренцию
промоторов.
1
2
Здесь и далее интенсивность флуоресценции представлена в относительных единицах.
Здесь и далее планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
9
Рис. 5. Сравнительный анализ
эффективности
накопления
кнРНК, мРНК GFP и РНК Lnc(MS2-H)4.
Индивидуальная
(слева) или совместная (справа)
агроинъекция листа. Оценка
количества РНК3 по результатам
количественной ПЦР в реальном
времени с предварительным
получением кДНК (ОТ-ПЦР РВ).
Во-вторых, в пользу конкуренции именно за экспорт свидетельствуют данные по
количественному анализу содержания в клетке мРНК GFP и кнРНК (GAAA)16 , направляемых
Pol II. Оказалось, что молекулы мРНК GFP накапливаются в клетке в одинаковом количестве
как при индивидуальной, так и при совместной с Pol II35S-(GAAA)16 агроинъекции (Рис. 5).
Кроме того, наблюдается более эффективное по сравнению с мРНК GFP или Lnc-(MS2-H)4
накопление (GAAA)16 кнРНК, следовательно, короткая РНК синтезируется в бóльшем
количестве, чем длинная.
Рис. 6. Обратная зависимость уровня накопления кнРНК и уровня экспрессии 35S-GFP.
А.Относительное количество РНК (GAAA)16, направляемой полным и укороченным вариантами 35Sпромотора. Б. Флуориметрический анализ количества GFP на 3 день после ко-агроинфильтрации 35SGFP и 35S-(GAAA)16 или 35S(min)-(GAAA)16. Контроль: ко-инфильтрация 35S-GFP с pBin19.
Таким, образом, эффективность накопления кнРНК и уровень экспрессии 35S-GFP могут
быть связаны обратной зависимостью. В соответствии с этим предположением укорочение
промотора 35S [35S(min)], снижающее его транскрипционную активность (Рис. 6А), приводило
к почти полной потере конкурентоспособности кнРНК (Рис. 6Б). Мы заключили, что
3
Здесь и далее количество РНК представлено в относительных единицах по результатам ОТ-ПЦР РВ.
10
ингибирующее действие кнРНК на экспорт мРНК GFP зависит от длины кнРНК и,
следовательно, от количества синтезированных в ядре молекул кнРНК.
Рис. 7. U6 короткая некодирующая РНК, синтезируемая Pol II, подавляет экспрессию GFP и BiP. А.
Относительное количество РНК U6 при использование транскрипционных кассет Pol I, Pol II и Pol III по
результатам ОТ-ПЦР РВ. Количество РНК представлено в относительных единицах, указана стандартная
ошибка (по 5 независимым экспериментам). Б-В. Визуализация в УФ-свете (Б) и флуориметрический
анализ (В) экспрессии GFP на 3 день после ко-агроинфильтрации 35S-GFP и Pol I-, Pol II- или Pol III-U6.
Контроль: ко-инфильтрация 35S-GFP с pBin19. Результаты измерения флуоресценции приведены в
относительных единицах, контроль принят за 100 единиц. Данные получены в 5 независимых
экспериментах, указана стандартная ошибка. Г. Иммуноблот и денситометрический анализ количества
клеточного белка BiP в листьях, агроинфильтрированных 35S-U6 или 35S-U6i. Контроль: интактное
растение. Верхняя панель – BiP, нижняя панель – контроль нанесения (RuBisCO). Цифры обозначают
относительное количество BiP по результатам денситометрии. Контроль принят за 1.
Далее, для того, чтобы продемонстрировать универсальность феномена ингибирования
экспрессии мРНК, мы использовали природную малую ядерную РНК U6 (103 нуклеотида),
синтез которой в ядре клетки направляли с помощью транскрипционных промоторов Pol IrRNA-,
Pol II35S- или Pol IIItRNA (Рис. 7А). В соответствии с нашими ожиданиями, только в случае Pol
II35S-U6 кнРНК наблюдалось подавление экспрессии 35S-GFP (Fig. 7 Б, В) и клеточного гена BiP
(Рис. 7Г). Более того, введение интрона в U6 кнРНК существенно повышало ингибирующее
действие этой РНК на экспрессию клеточной мРНК BiP (Рис. 7Г). Таким образом,
11
подтверждается наше представление о тесной связи аппарата сплайсинга и ядерного экспорта
мРНК.
В целом, мы заключили, что кнРНК, синтезируемые Pol II, и мРНК используют один и
тот же путь экспорта из ядра, что позволяет молекулам кнРНК, накапливающимся в ядре клетки
в бóльшем количестве по сравнению с клеточными мРНК, эффективно с ними конкурировать за
выход из ядра в цитоплазму.
2. Эффект, оказываемый кнРНК на репродукцию фитовирусов.
В число молекул мРНК, вытесняемых из ядерного экспорта, могут входить мРНК белков,
участвующие в антивирусных клеточных реакциях, например, дайсер или аргонавт. Дефицит в
клетке молекул дайсера или аргонавта приведет к снижению эффективности специфического
разрушения вирусной РНК, т.е. повышению стабильности и уровня накопления вируса. Для
проверки этой гипотезы мы использовали вирусные векторы на основе генома крестоцветного
штамма ВТМ (крВТМ) (Рис. 8А) (Dorokhov et al., 2006) и Х-вируса картофеля (ХВК) (Рис. 9А)
(Комарова и др., 2006). Оба эти вектора кодировали репортерный ген GFP, детекция которого
упрощает количественный анализ репродукции вирусов.
Рис. 8. кнРНК, синтезируемые Pol II, стимулируют репродукцию вирусного вектора крВТМ:GFP.
А. Схема вектора крВТМ:GFP. Act, промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana; Т – nos терминатор
транскрипции; РЕП, ген репликазы крВТМ; ТБ, ген транспортного белка крВТМ; шпилечная структура,
3'-НТО крВТМ. Б-В. Визуализация в УФ-свете (Б) и флуориметрический анализ (В) экспрессии GFP на 5
день после ко-агроинфильтрации крВТМ:GFP и Pol I-, Pol II- или Pol III-U6. Контроль: ко-инфильтрация
крВТМ:GFP с pBin19.
Мы установили, что кнРНК U6, направляемая Pol II, а не Pol I или Pol III, значительно
увеличивали уровень накопления GFP (Рис. 8 Б,В). Аналогичный эффект наблюдался при
использовании других кнРНК, таких как тандемный повтор (GAAA)16 (Рис. 9Б), химерная
микроРНК, miRNA171/159, наконец, тРНК. Мы установили, что стимулирующее воздействие
12
кнРНК на репродукцию вирусного вектора определяется длиной кнРНК (Рис. 10), но не зависит
от нуклеотидного состава или вторичной структуры кнРНК. Введение интронов в
последовательность вирусной геномной РНК (Рис. 11А), которое, как известно, повышает
эффективность вирусного вектора (Marillonnet et al. 2005), снижала стимулирующий эффект
кнРНК (Рис. 11Б).
Рис. 9. кнРНК, синтезируемые Pol II, стимулируют репродукцию вирусного вектора PVXdt:GFP. А.
Схема вектора PVXdt:GFP. РЕП, ген репликазы ХВК. Б. Визуализация в УФ-свете экспрессии GFP на 3
день после ко-агроинфильтрации PVXdt:GFP и 35S-(GAAA)16. Контроль: ко-инфильтрация PVXdt:GFP с
pBin19. Использованы три разведения ночной культуры агробактерии, содержащей плазмиду 35SPVXdt:GFP, в 104, 105 и 106 раз.
Таким образом, конкуренция между молекулами кнРНК, синтез которых направлялся Pol
II, и мРНК, приводит к повышенной репродукции в цитоплазме вирусных РНК. Феномен, повидимому, связан с подавлением экспорта мРНК, участвующих в антивирусных клеточных
реакциях, включая сайленсинг.
Рис. 10. Эффект, оказываемый Pol IIсинтезируемыми
кнРНК,
на
репродукцию
вирусного
вектора
зависит от длины транскрипта.
Флуориметрический анализ экспрессии
GFP
на
5
день
после
коагроинфильтрации листьев крВТМ:GFP
и кнРНК различной длины под
контролем
Pol
II35S-промотора.
Последовательность
(GAAA)
использована в качестве модуля для
получения транскриптов длиной 6, 18,
32, 64, 128, 256 и 512 нт. 75 нт кнРНК
соответствует конструкции Pol II35SтРНКTyr. Контроль – ко-инфильтрация
крВТМ:GFP с pBin19, принят за 1.
13
Рис. 11. Введение интронов в вирусный вектор крВТМ(и):GFP приводит к снижению
стимулирующего эффекта кнРНК, синтезируемых Pol II. А. Схема вектора крВТМ:GFP. Act,
промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana; Т – nos терминатор транскрипции; РЕП, ген репликазы
крВТМ; ТБ, ген транспортного белка крВТМ; шпилечная структура, 3'-НТО крВТМ; белыми
прямоугольниками обозначены интроны. Б. Флуориметрический анализ экспрессии GFP на 5 день после
ко-агроинфильтрации листьев крВТМ:GFP и 35S-U6 или 35S-U6(i). Контроль – ко-инфильтрация
крВТМ:GFP с pBin19, принят за 100.
3. Влияние кмРНК на репродукцию геномной РНК вируса растений.
Наша модель конкурентных взаимоотношений молекул РНК в процессе их ядерноцитоплазматического экспорта допускает, что способностью ингибировать экспорт мРНК из
ядра обладают и короткие мРНК (кмРНК). Таковыми, например, являются мРНК белков,
связанных с патогенезом (pathogenesis related, PR): ингибиторы протеаз (семейство PR-6),
дефензины (семейство PR-12), тионины (семейство PR-13), переносчики липидов (семейство PR14) (Sels et al. 2008) и др.
Рис.
12.
Схематическое
изображение
конструкций, соответствующих коротким мРНК.
35S-тионин(инт)
и
35S-тионин
–
последовательность гена и кДНК тионина под
контролем 35S-промотора. 35S-ELF – искусственная
последовательность,
кодирующая
эластиноподобный пептид, слитый с FLAG Аминокислотный
состав ELF: M AVGVPG VAVPG LGVPG AGVPG
VAVPG LGVP DYKDDDDK, где подчеркнута
последовательность FLAG.
В качестве коротких мРНК мы использовали 318 нт мРНК тионина N.benthamiana и
искусственную транслируемую последовательность ELF, содержащую 117 нт и кодирующую
эластино-подобный пептидный повтор, слитый с FLAG-элементом (Рис. 12). Кроме того, была
создана конструкция, где последовательность, кодирующая тионин, содержала природный
интрон из этого гена. Для оценки влияния кмРНК на экспрессию GFP была проведена
агроинъекция листьев N.benthamiana 35S-GFP совместно с вышеописанными конструкциями.
14
Наши эксперименты показали, что, подобно Pol II35S-(GAAA)16, Pol II35S-ELF вызывает
значительное подавление накопления в листе GFP (Рис. 13). При использовании обоих
вариантов тионина, 35S-тионин или 35S-тионин(инт), также наблюдается негативный эффект,
однако менее выраженный.
Более слабое влияние кмРНК тионина на экспрессию GFP объясняется тем, что длина
данных матриц более чем в 2 раза превышает длину мРНК ELF. Это находится в соответствии с
нашими данными относительно обратной связи степени ингибирования экспрессии GFP и длины
короткой РНК (Рис. 4).
Рис. 13. Короткие мРНК оказывают негативный
эффект на экспрессию GFP под контролем Pol II35S
промотора. Флуориметрический анализ количества
GFP на 3 день после агроинфильтрации 35S-GFP и
35S-тионин(инт), 35S-тионин, 35S-ELF. Контроль:
ко-инфильтрация 35S-GFP с pBin19.
В соответствии с вышеописанными результатами (Рис. 8,9), показывающими, что
конкуренция между кнРНК и мРНК, направляемыми Pol II, приводит к повышенной
репродукции в цитоплазме вирусных РНК, мы ожидали, что кмРНК также вызовут стимуляцию
вирусной репродукции. Действительно, как следует из рисунка 14, оба типа кмРНК (ELF и
тионин) увеличивали эффективность репродукции вирусного вектора крВТМ:GFP в той же
степени, что и кнРНК (например, 35S-(GAAA)16).
Рис. 14. Короткие транслируемые
мРНК стимулируют репродукцию
вирусного вектора крВТМ:GFP.
Флуориметрический
анализ
экспрессии GFP на 5 день после коагроинфильтрации крВТМ:GFP и 35Sтионин(инт), 35S-тионин, 35S-ELF.
Контроль
–
ко-инфильтрация
крВТМ:GFP с pBin19, принят за 100
единиц.
15
Мы заключили, что суперпродукция кнРНК и кмРНК, направляемых Pol II в ядре,
приводит к подавлению экспорта хозяйских мРНК и повышению уровня репродукции вирусного
вектора в цитоплазме.
4. Модель экспорта мРНК из ядра цитоплазму.
Считается, что у эукариот пространственное разобщение между Pol I, II и Pol III является
важным эволюционным приобретением, усиливающим продуктивность транскрипционных
реакций и повышающим, например, эффективность созревание рибосом в ядрышках и мРНК на
хроматиновых территориях (Cremer and Cremer, 2010) или в «транскрипционных фабриках»
(Geyer et al., 2011). Наши результаты (Рис. 4Б) согласуются с таким представлением и
показывают независимость экспорта из ядра в цитоплазму молекул РНК, синтезированных в
ядре РНК-полимеразами I, II и III. Наша модель экспорта РНК предполагает пространственное
разобщение «транскрипционных фабрик» Pol I, II и III в ядре (Рис. 15).
Рис. 15. Модель, отражающая пространственное разобщение «транскрипционных фабрик» РНКполимераз I-III типов (по Geyer et al., 2011, с изменениями). Ядерная оболочка (ЯО) пронизана
ядерными порами (ЯП). В ядре хромосомы (обозначены цветными линиями) занимают определенные
участки – хромосомные территории. С ядрышком (серый овал) ассоциированы "транскрипционные
фабрики" РНК-полимеразы I и III (правая врезка). Транскрипционная активность РНК-полимеразы II
сопряжена с экспортом мРНК из ядра
16
Мы полагаем, что пространственное разобщение между полимеразами диктуется
специализацией полимераз и нахождением в одном и том же месте специфического фермента и
его субстрата. Однако, главным в пространственном разобщении полимераз и, соответственно,
«транскрипционных фабрик», является необходимость избежать конкуренции в процессе
экспорта из ядра в цитоплазму молекул РНК, синтезируемых РНК-полимеразами I, II и Pol III.
Ключевой момент – разделение этих потоков в пространстве, чтобы молекулы мРНК, тРНК и
рРНК не интерферировали между собой в процессе выхода из ядра в цитоплазму.
Пространственная разобщенность трех классов РНК позволяет этим молекулам
транспортироваться в цитоплазму через различные ядерные поры, т.е. «транскрипционные
фабрики» располагаются в ядре таким образом, что смешивания потоков экспорта мРНК и рРНК
не происходит. По-видимому, вирусы животных и растений, тем или иным образом
взаимодействующие с ядром клетки-хозяина в процессе репродукции, используют этот принцип
разделения информационных в свою пользу. Например, чтобы избежать конкуренции с
клеточными мРНК, вирусы растений и животных для синтеза своей РНК эксплуатируют
ядрышко, место биогенеза рибосом (Hiscox, 2007; Show and Brown, 2012; Taliansky et al., 2011).
Наша модель согласуется с данными о взаимодействии транскриционно-активных генов c
белками ядерной поры (Capelson et al., 2010). Более того, допускается существование некой
«транскрипционной памяти», когда после повторного воздействия на клетку каких-либо
стимулов происходит быстрое восстановление связи между транскриционно-активными генами
и белками ядерной поры (Light et al., 2010).
Однако, концентрирование синтезируемых РНК-полимеразой II молекул мРНК в
«транскрипционных фабриках» и использование одних тех же ядерных пор для выхода в
цитоплазму создает возможность конкуренции между молекулами экспортируемых мРНК.
Стресс и атака патогенов – это благоприятные факторы для такой конкуренции, поскольку в
подобных условиях резко повышается транскрипционная активность стрессовых генов, а также
синтез коротких РНК (Yao & Sun, 2012; Sun, 2012). Стрессовые гены или гены, связанные с
патогенезом, как правило, кодируют небольшие белки (10-20 кДа), трансляция которых
осуществляется с достаточно коротких молекул мРНК. Более короткие мРНК неизбежно
вытеснят из экспорта более длинные мРНК, например, мРНК «домашнего хозяйства». Наши
эксперименты подтверждают это. Преимущество в экспорте из ядра имеют более короткие
молекулы РНК (кодирующие и некодирующие). Мы показали, что молекулы кнРНК успешно
конкурируют за экспорт с более длинными мРНК (GFP и BiP) (Рис. 7). Поскольку результаты
наших экспериментов указывают на отсутствие конкуренции между промоторами за РНКполимеразу II (Рис. 5,6), то закономерным является предположение, что в «транскрипционной
фабрике» содержится избыточное количество молекул РНК-полимеразы. Известно, что скорость
элонгации молекул РНК полимеразой II постоянна и составляет более 50 000 оснований в
минуту на один ген эукариот (Marcello, 2012). Следовательно, чем более короткий путь
проходит полимераза по РНК-матрице, тем меньше времени тратится на синтез РНК, и тем
17
больше синтезируется молекул РНК в единицу времени. Именно этим фактом объясняется
корреляция между длиной кнРНК и скоростью их накопления в клетке.
Итак, в основе конкурентоспособности коротких РНК лежит высокая скорость их
синтеза, т.е. РНК-полимераза II в единицу времени синтезирует больше молекул кнРНК, чем,
например, мРНК GFP. С другой стороны, обнаруженная нами конкуренция молекул РНК на
стадии ядерного экспорта сама по себе свидетельствует об общем пути их транспорта, т.е.
молекулы РНК, синтезированные РНК-полимеразой II, попадают в цитоплазму через одни те же
«ворота», или аппарат ядерной поры.
Полученные нами результаты согласуются со следующими литературными данными:
1. Более короткие РНК, микро РНК и аденовирусная РНК VA1, «вытитровывают»
компоненты аппарата ядерной поры и, тем самым, препятствуют экспорту огромной
мРНК, кодирующей дайсер, белок длиной около 2000 а.к. (Bennasser et al., 2010).
2. Показано наличие конкуренции за белковые факторы аппарата ядерной поры между
малыми ядерными РНК (U РНК длиной 200-300 нт) и длинными пре-мРНК (McCloskey et
al., 2012).
3. Наблюдение за экспортом одиночных нативных мРНК из ядра клеток слюнных желез
Chironomus tentans показало, что из всех мРНП, достигших аппарата ядерной поры,
только 25% осуществляют переход в цитоплазму (Siebrasse et al., 2012), что напрямую
свидетельствует о конкуренции между мРНК за ядерный экспорт.
Для объяснения явления конкуренции между молекулами мРНК в процессе их экспорта
из ядра в цитоплазму возможны две модели: (а) модель, условно обозначенная как «песочные
часы», согласно которой с большей вероятностью через ядерную пору проходят РНК,
обладающие численным преимуществом в ядре (Рис.16) и (б) модель «генные ворота» (gene
gating), которая развивает теорию Гюнтера Блобела (Рис. 17).
Рис. 16. Модель конкуренции
мРНК за выход из ядра в
цитоплазму
«песочные
часы»,
согласно
которой
с
большей
вероятностью через ядерную пору
проходят
РНК,
обладающие
численным преимуществом. Пр,
транскрипционный
промотор,
узнаваемый РНК-полимеразой II;
двойная зеленая линия, хромосома;
фиолетовые овалы, РНК-полимераза
II;
кмРНК,
кнРНК,
короткие
кодирующие и некодирующие РНК,
обозначены голубыми короткими
линиями;
бирюзовыми
кругами
обозначен кэп; синие длинные линии
– мРНК; ЯО, ядерная оболочка; ЯП,
ядерная пора.
18
Первая модель предполагает свободную конкуренцию между молекулами на этапе
прохождения ядерной поры. Чем больше молекул данного типа, тем больше их окажется в
цитоплазме согласно теории вероятности (рис. 16). Как следует из наших результатов, чем
больше в ядре синтезируется молекул коротких РНК (кодирующих и некодирующих), тем
меньше молекул мРНК GFP или BiP достигнет цитоплазму.
Рис. 17. Модель конкуренции мРНК за
выход из ядра в цитоплазму «генные
ворота». Пр, промотор; двойная зеленая
линия, хромосома; фиолетовые овалы, РНКполимераза II; бирюзовыми кругами
обозначен кэп; синие линии – мРНК; ЯО,
ядерная оболочка; ЯП, ядерная пора;СВР80,
кэп-связывающий белок. Транскрипция
сопряжена с экспортом мРНК из ядра, при
этом ядерная пора оказывается занятой
мРНК
до
момента
терминации
транскрипции, таким образом, другие мРНК
в это время не могут экспортироваться через
ту же пору (обозначено перечеркнутой
стрелкой).
Вторая модель основывается на гипотезе Гюнтера Блобела «генные ворота» (gene gating)
(Blobel, 1985), которую в последующем развили Мур и Праудфут (Moore and Proudfoot, 2009).
Модель предполагает тесную взаимосвязь между транскрипцией, процессингом пре-мРНК и
экспортом мРНК через аппарат ядерной поры (Hocine et al., 2011). Эта модель полностью
исключает свободную конкуренцию между молекулами. Рисунок 17 показывает, что транскрипт,
синтезированный на ДНК-матрице РНК-полимеразой II, вступает во взаимодействие с
аппаратом ядерной поры и занимает его полностью, блокируя экспорт других молекул РНК на
время синтеза первой молекулы. После окончания транскрипции происходит выход мРНК через
ядерную пору в цитоплазму, а освободившаяся пора готова к взаимодействию со следующей
молекулой. Чем больше молекул одного типа, тем больше у них вероятность «занять» ядерную
пору для своего экспорта.
Очевидно, что будущие эксперименты должны определить выбор одной из этих моделей.
5. Экспериментальная функциональная модель межклеточного транспорта
макромолекул в листьях и его роли в иммунитете растений.
Современные методы исследования межклеточного транспорта в растении – это
инвазивные методы, базирующиеся на: (а) физическом повреждении поверхности листа при
введении плазмид (агроинъекция, бомбардирование листа, микроинъекция в клетку трассерных
молекул красителя или GFP) и (б) суперпродукции в клетке исследуемого белка при стабильной
трансформации растения или транзиентной экспрессии. Все это часто приводит к артефактным
результатам, неадекватно отражающим функцию транспорта молекул и часто являющимся
19
реакциями клетки на микроповреждение и суперпродукцию клеточного или чужеродного белка.
Для максимального приближения к природной ситуации желательно наличие модельной
системы, в которой изменение (активизация) межклеточного транспорта, а именно, расширение
плазмодесм, может вызываться при воздействии некоего газообразного вещества, не
повреждающего листья и не вносящего в систему фактор травмы.
Ранее в нашей лаборатории было показано участие ПМЭ в контроле межклеточного
транспорта вирусной РНК (Dorokhov et al., 2006) и высказана гипотеза об участии в этом
процессе газообразного продукта реакции, осуществляемой ПМЭ, метанола (Дорохов, 2007).
Здесь мы описываем создание системы, в которой газообразный метанол, испускаемый
травмированным растением, воздействует на соседнее интактное растение, вызывая в нем
изменение межклеточного транспорта. Работа по созданию системы была проведена в два этапа.
Первый этап - разработка метода количественного измерения газообразного метанола,
испускаемого травмированным растением. На втором этапе мы определили состав газов и
количественные параметры эмиссии метанола интактным и травмированным растением.
5.1. Разработка метода количественного измерения газообразного метанола,
испускаемого травмированным растением. Определение количества газообразного метанола
представляется технически сложной задачей. Метанол – полярная молекула, хорошо
растворимая в воде, и это свойство создает проблемы при измерении концентрации метанола в
газовой фазе существующими приборами. Во-первых, метанол сорбируется в водном конденсате
в трубках на пути к детектору. Во-вторых, удаляется вместе с водой в случае наличия ловушки
для дегидратации перед газовой хроматографией (GC). Кроме того применение GC-MS
осложняется тем, что молекулярная масса метанола 32, как и для О2, следовые количества
которого всегда присутствуют в газовой смеси. Использование электронной ионизации (EI) для
MS не является оптимальным для анализа метанола, т.к. требуется предварительное
концентрирование, подразумевающее использование сорбентов и элюцию органическими
растворителями (например, диэтиловым эфиром). В случае дорогостоящей химической
(протонной) ионизации (PTR-MS) в предварительном концентрировании нет необходимости,
однако проблема сорбции метанола в конденсате не снимается. Мы разработали собственный
менее затратный способ оценки количества газообразного метанола, выделяемого листьями
растений. Перепробовав несколько агентов-ловушек (декан, октан, гексан, ацетонитрил), мы
остановились на воде, отличающейся высокой эффективностью сорбции газообразного
метанола, а также безвредностью для растений. Таким образом, была решена проблема оценки
малых количеств метанола в газовой фазе, т.к. при адсорбции в воде проходило естественное
концентрирование, кроме того, измерение концентрации метанола в растворе не вызывает в
настоящее время технических затруднений. Мы измеряли метанол, выделяемый растением, в
двух системах: закрытой (Рис. 18А) и проточной (Рис. 18Б).
20
Рис. 18. Система для оценки количества
газообразного метанола в среде. А. Закрытая
система представляет собой герметичный сосуд с
внесенной каплей воды, в которой после инкубации
в течение заданного времени определяется
концентрация метанола. Б. Проточная система
состоит из сосуда с образцом, через который
постоянно проходит воздух с определенной
скоростью, и водяной ловушки, в которой
сорбируется метанол из проточного воздуха. После
инкубации в течение заданного времени жидкость
из водяной ловушки анализируется с помощью
газовой хроматографии (GC) на наличие метанола,
определяется его концентрация.
В первом случае лист растения помещали в герметичный сосуд объемом 150 мл, куда
вносили каплю воды (300 мкл). Газообразный метанол, выделяемый листом, переходил в
водную фазу капли. Согласно закону Генри через некоторое время наступало равновесие между
газообразным и растворенным в воде метанолом. По содержанию метанола в воде можно было
уверенно судить о его содержании в воздухе. Во втором варианте, проточной системе,
инкубация листа проводилась в сосуде, через который с постоянной скоростью проходил воздух,
после камеры с листом пропускаемый через водяную ловушку, где и сорбировался газообразный
метанол. Затем в содержимом водяной ловушки определялась концентрация метанола.
Рис.
19.
Измерение
количества
газообразного метанола, выделяемого
поврежденным листом, в закрытой
системе. Листья N. benthamiana (0,5-0,7 г)
были повреждены при помощи обработки
целлитом и помещены в герметично
закрытый сосуд. Через 30-, 60- и 180 мин
измерялось содержание метанола в капле
воды.
Для проведения точных измерений, во-первых, учитывалась температура окружающей
среды, а во-вторых, были построены калибровочные кривые, которые получали в
соответствующих реконструкционных модельных экспериментах, как для закрытой емкости, так
и проточной системы. Для этого в систему на дно сосуда вносили известное количество
21
метанола, который быстро испарялся и растворялся в капле воды в соответствии с законом
Генри. Измерения содержания метанола с помощью газового хроматографа служили основой
для построения калибровочных кривых.
5.2. Определение количественных параметров эмиссии метанола и состава газов,
испускаемых травмированным растением. Нами показано, что в изолированном сосуде с
помещенным в него листом при температуре 24°C метанол уже можно уверенно детектировать в
капле воды через 30 мин. Через 3 часа его содержание составляет 80% от точки насыщения (рис.
19).
Результаты, представленные на рисунке 20А, показывают, что механическое повреждение
листа приводит к резкому выбросу в воздух метанола. Обе системы измерения, как закрытый
сосуд, так и проточная камера, показали, что через 3 часа после повреждения листа эмиссия
метанола была в 20 раз выше по сравнению с эмиссией интактным листом. Для того чтобы
выяснить, не происходит ли реадсорбция травмированным листом метанола, мы измерили его
содержание в соке. Оказалось, что содержание метанола в соке не меняется после травмы (Рис.
20Б). Это свидетельствует о том, что, во-первых, не происходит реадсорбция метанола. Вовторых, весь метанол, синтез которого вызвало повреждение, выделяется в атмосферу, т.е.
травмированное растение можно рассматривать как генератор газообразного метанола, который
может быть использован для воздействия на другое, неповрежденное растение.
Рис. 20. Генерируемый поврежденным растением метанол выбрасывается в атмосферу. А.
Повреждение листьев вызывает повышение количества газообразного метанола, выделяемого растением.
Б. Концентрация метанола в соке растения не изменяется при повреждении.
Для характеристики нашей системы важно было выяснить, является ли метанол
единственным газообразным веществом, испускаемым листом после механической травмы, или
это смесь летучих органических соединений (ЛОС). Мы исследовали этот вопрос и показали,
что помимо метанола (Рис. 21А) в воздух после травмы выбрасывается еще и цис-3-гексен-1-ол,
имеющий характерный запах свежескошенной травы (D'Auria et al., 2007) (Рис. 21Б). Кроме
того, показано, что травма не приводит к увеличению эмиссии этилена, а такие ЛОС, как
22
метилсалицилат и метилжасмонат, не детектируются. Присутствие цис-3-гексен-1-ола в смеси с
метанолом осложняет интерпретацию результатов, особенно в связи с обнаружением
способности цис-3-гексен-1-ола индуцировать в растении эмиссию метанола (Рис. 22).
Используя проточную систему (Рис. 22А), мы определили количество метанола, который
выделяется растением, инкубируемым в присутствии паров цис-3-гексен-1-ола (Рис. 22Б).
Рис. 21. Количество выделяемого растением метанола и цис-3-гексен-1-ола. Измерения проводились
в закрытой системе для интактного, поврежденного и трансгенного по ПМЭ листьев N. tabacum после
инкубации в течение 3 часов. Н.д. – не детектируется.
Рис. 22. Цис-3-гексен-1-ол индуцирует эмиссию метанола листьями. А. Проточная система, в которой
входящий воздух пропускается через камеру с различными количествами цис-3-гексен-1-ола. GC, газовая
хроматография. Б. Количество метанола, выделяемое листьями в ответ на обработку цис-3-гексен-1олом.
Следовательно, необходимо было создать условия, при которых цис-3-гексен-1-ол
удаляется из газовой смеси, выделяемой поврежденными тканями, либо метанол является
единственным ЛОС. В качестве модельной системы в этом случае мы использовали растение
Nicotiana tabacum, трансгенное по ПМЭ. Оно характеризуется тем, что выделяет в атмосферу
повышенное количество метанола по сравнению с интактным растением, однако, в отличие от
23
поврежденного, не эмитирует цис-3-гексен-1-ол (Рис. 21). Мы использовали табак, трансгенный
по ПМЭ, наряду с поврежденными растениями для дальнейших исследований.
Таким образом, нами определены параметры и дизайн системы, позволяющей
исследовать иммунитет интактного неповрежденного растения, обработанного газообразным
метанолом.
5.3 . Идентификация в растении генов чувствительных к метанолу. Для того чтобы
более полно охарактеризовать систему, а также изучить механизмы воздействия метанола на
иммунитет растения, мы использовали библиотеку кДНК растений N. benthamiana, полученную
с помощью прямой и обратной супрессионной вычитающей гибридизацией (СВГ), до и после
обработки растений парами метанола. В результате мы выявили 359 дифференциальноэкспрессирующихся клонов кДНК, из которых 320 – это транскрипционно-активные гены
листьев, обработанных метанолом. Для дальнейшего анализа мы использовали только гены,
экспрессия которых усиливается при действии метанола. Большинство генов (167 генов),
чувствительных к метанолу, попадают в разряд стресс-индуцируемых. Активность выявленных
СВГ МИГов была подтверждена «псевдонозерном».
Для дальнейшего анализа мы отобрали 5 генов, наиболее чувствительных к воздействию
метанола (Табл. 2). Среди них ранее неидентифицированный ген, кодирующий белок с
молекулярной массой около 21 кДа. Мы назвали его метанол-индуцируемым геном-21 (MIG-21)
(EMBL GenBank GU128961) (Табл. 2, Рис. 23).
Таблица 2. Гены, индуцируемые метанолом, отобранные по результатам супрессионной
вычитающей гибридизации для дальнейшего анализа.
4
МИГи N.benthamiana
кол-во
клонов
β-1,3-глюканаза (BG)
51
Ингибитор протеазы II (PI-II)
24
Метанол-индуцируемый ген 21 (MIG-21)
22
Ингибитор ПМЭ (PMEi)
7
Non-cell autonomous pathway protein
(NCAPP)
3
Предположительно
24
Функция МИГа
Межклеточный транспорт, регуляция
пропускной способности плазмодесм
Противогрибная и антибактериальная
защита
Межклеточный транспорт, регуляция
пропускной способности плазмодесм4
Противогрибная и антибактериальная
защита
Межклеточный транспорт
M A S L Q C HK P A Q HA P S TL C Q K TTT V T C N K AN N E H HS F A DK M K D MTD K M Y H H -5 0
D S H N H Q SA C H G TK T Q QT A A C HGT K T Q Q S AA C H G TK T Q QS A A S HRT K T Q Q T -1 0 0
A C H G T S AN G T K TQ L S VA C H G TKT Q Q S A A SH G T K TQ Q T AC H G T SAT A T H A R -1 5 0
A C G K K K EG S F M HK M R DQ M R S RRN R N K D G SC S D G SD S S SS S S S DES D N E N C -2 0 0
G R T K N R GS C
-2 0 9
Рис. 23. Аминокислотная последовательность ранее неидентифицированного белка MIG-21 из
N.benthamiana. Подчеркнуты повторяющиеся аминокислотные участки.
С помощью количественного ПЦР в реальном времени мы подтвердили, что уровень
накопления мРНК отобранных нами генов зависит от концентрации (Табл. 3) и времени
воздействия метанола (Рис. 24).
Таблица 3. Изменение уровня накопления мРНК МИГов в ответ на метанол.5
Кол-во
внесенного
метанола
(мг)
Содержание
метанола6
(µг/г листа)
BG
NCAPP
MIG-21
PMEi
PME
PI-II
40
17,5
118.7±4.01
9.89±2.67
3.60±0.80
1.92±0.63
1.03±0.33
1.32±0.42
160
70,0
398.53±12.93
48.84±5.19
17.51±2.60
9.71±1.31
1.54±0.47
7.11±0.68
0
1.1±0.1
1.00±0.25
1.00±0.26
1.00±0.26
1.00±0.39
1.00±0.32
1.00±0.33
Относительное количество мРНК МИГов N.benthamiana
Рис. 24. Повышение уровня
накопления МИГов в ответ на
обработку
N.
benthamiana
метанолом.
Проводилась
инкубация целых растений в 20-л
эксикаторе, в который было
внесено 160 мг метанола, в течение
6, 12 или 24 часов. Контроль –
интактное растение, принят за 1.
По оси Y шкала логарифмическая.
Ген ПМЭ очевидно не чувствителен к метанолу, поскольку его активность при действии
метанола на лист изменялась незначительно (Табл. 3), в то время как уровень накопления мРНК
гена NCAPP увеличивался почти в 50 раз после 18-ч инкубации в атмосфере с повышенным
содержанием метанола.
5
Инкубация растения с метанолом проводилась в течение 18 часов в герметично закрытом 20-л эксикаторе. В
первой колонке указано количество метанола, вносимого в этот объем.
6
Содержание метанола в эксикаторе на момент окончания инкубации растения с метанолом (первая и вторая
строки) или интактного растения (третья строка).
25
Далее, мы выдерживали растения N. benthamiana в присутствии метанола в 20-л
герметичном эксикаторе в течение 3 часов, после чего растения извлекали из эксикатора и
отбирали пробы РНК для анализа МИГов с помощью ОТ-ПЦР РВ. Рисунок 25 показывает
«затухающую волну» активности МИГов после воздействия метанола. Уровень накопления
мРНК МИГов достигает максимума через 24 часа после воздействия метанола, а затем медленно
снижается. Более того, повышенная транскрипция генов BG и NCAPP наблюдается даже через 5
дней после воздействия метанола.
Рис. 25. «Волна» накопления мРНК МИГов после обработки растения метанолом. N. benthamiana
инкубировалась в течение 3 часов в герметично закрытом эксикаторе с повышенным содержанием (160
мг на 20 л объема) газообразного метанола. На диаграмме в логарифмической по оси Y шкале
представлено количество мРНК BG, NCAPP и MIG-21 по результатам ОТ-ПЦР РВ через 3, 24, 48, 72, 96
и 120 часов после обработки растения метанолом. Контроль – интактное растение, принят за 1. ***,
Р<0,001.7
Если наша гипотеза, подразумевающая участие метанола в передаче сигнала от растения
к растению и воздействии на иммунитет, верна, то резкое повышение продукции газообразного
метанола, вызванного повреждением листа, должно привести к индукции МИГов в соседнем
растении. Для проверки этого предположения мы использовали закрытую систему (эксикатор) и
исследовали транскрипционную активность МИГов в растениях-ресиверах, которые
выдерживали вместе с поврежденным растением или ПМЭ-трансгеном (Рис. 26).
7
Здесь и далее ***, Р<0,001; **, Р<0,01, двухвыборочный t-критерий Стьюдента, сравнение с контролем, если не
указано иное.
26
Рис. 26. Уровень накопления МИГов повышается в растении-ресивере (N. benthamiana),
инкубированном в замкнутом сосуде с эмиттерами метанола (схематическое изображение слева):
поврежденным растением N.tabacum (A) или трансгеным по ПМЭ растением (Б). wR, ресивер
поврежденного растения; pR, ресивер ПМЭ трансгена. На диаграммах (справа) приведено относительное
количество мРНК МИГов в логарифмической по оси Y шкале по результатам ОТ-ПЦР РВ, контроль –
интактное растение, принят за 1.
Диаграммы на рисунке 26 показывают, а статистический анализ подтверждает
существенные различия в экспрессии МИГов в растениях-ресиверах и контроле. Поврежденное
растение индуцирует накопление мРНК МИГов у соседнего (Рис. 26А). Постоянная экспрессия
ПМЭ и повышенная продукция метанола (Рис. 21) в трансгенном растении-эмиттере приводит к
увеличению экспрессии МИГов в растении-ресивере (Рис. 26Б). Анализ МИГов в самом ПМЭтрансгенном растении (Рис. 27) отличается от соответствующего растения-ресивера (сравн. с
Рис. 26Б). Помимо повышенной активности ПМЭ (в 18 раз по сравнению с контролем),
наблюдается почти 70-кратное увеличения активности гена PI-II, ингибитора протеиназы II, повидимому, из-за продолжительного воздействия повышенного уровня ПМЭ.
27
Рис.
27.
Уровень
накопления мРНК МИГов
в N.tabacum, трансгенному
по
ПМЭ.
Контроль
–
N.tabacum дикого типа. На
диаграмме
приведено
относительное
количество
мРНК
МИГов
в
логарифмической по оси Y
шкале по результатам ОТПЦР РВ, контроль принят за
1.
Рис. 28. Уровень накопления мРНК генов LOX, PR-3, PR-4, FPS и PAL в растении N.benthamiana,
инкубированном в атмосфере с повышенным содержанием этилена, метил жасмоната, метил салицилата
или метанола. Контроль – интактное растение, принят за 1.
Растение в ответ на атаку насекомого-фитофага выделяет в воздух различные ЛОС,
включая упоминавшийся выше этилен, метилсалицилат, метилжасмонат и, так называемые,
ЛОСы зеленого листа, главный из которых цис-3-гексен-1-ол (Arimura et al., 2000). В растении28
ресивере эти вещества индуцируют экспрессию генов таких белков, как хитиназа, тауматинподобный белок (PR-4), липоксигеназа (LOX), фенилаланин-аммоний-лиаза (PAL) и
фарнезилпирофосфат синтаза (FPS). Мы исследовали изменение экспрессии перечисленных
генов в ответ на воздействие метанола и показали (Рис. 28), что уровень накопления мРНК LOX,
PR-3, PR-4, FPS и PAL в растении, обработанном метанолом, увеличивается незначительно.
Обработка цис-3-гексен-1-олом стимулировала транскрипцию FPS гена, в то время как этилен,
метилсалицилат и метилжасмонат повышали активность, главным образом, генов PAL и PR-4.
Мы заключили, что МИГи являются специфическими генами, индукция которых
осуществляется только под воздействием газообразного метанола.
6. Исследование участия метанола в межклеточном транспорте растений.
Повышение транскрипционной активности МИГов, вовлеченных в межклеточный
транспорт (BG, NCAPP), позволяет предполагать, что в растении, находившемся под
воздействием газообразного метанола, повышена пропускная способность плазмодесм и
активизирован межклеточный транспорт макромолекул. Для характеристики состояния
межклеточного транспорта в листьях растений, обработанных метанолом, мы использовали
репортерные макромолекулы, с помощью которых оценивали пропускную способность
плазмодесм. Мы выбрали белковую молекулу, тандем GFP (2xGFP) (мол.масса 27х2=54кДа),
которая в норме не может переходить из одной клетки в другую через плазмодесмы зрелого
листа, поскольку их пропускная способность ограничивается белковыми молекулами до 47 кДа
(Crawford and Zambryski, 2000). Переход 2xGFP из одной клетки в другую свидетельствует об
«открытом» состоянии плазмодесм, когда их пропускная способность повышается. Итак, для
мониторинга межклеточного транспорта мы выбрали наблюдение за 2хGFP. Плазмида,
кодирующая 2xGFP, вводилась в клетки при помощи агроинъекции (Stonebloom et al., 2009).
Чтобы наблюдать одиночные сайты агроинфекции, мы вводили в лист разведенные (OD600~0.01)
бактериальные суспензии. Растения подвергали воздействию паров метанола, а затем через 30
часов после агроинъекции подсчитывали кластеры светящихся клеток с помощью
флуоресцентного светового микроскопа.
Число светящихся эпидермальных клеток, окружающих клетку, в которую была введена
ДНК 2xGFP, обеспечивает количественную характеристику межклеточного транспорта. Когда
плазмодесмы «закрыты», видны одиночные светящиеся клетки (Рис. 29А, верх). Когда
плазмодесмы «открыты», флуоресцентный сигнал распределен между двух- или трехклеточными кластерами (Рис. 29А, низ). В контрольном растении около 6% сигналов
распределено между 2-3-клеточными кластерами (Рис. 29Б). Эти наблюдения согласуются с
имеющимися данными по перемещению 2xGFP в растительной ткани (Crawford and Zambryski,
2000). Когда исследовали растения, обработанные метанолом, то отмечали усиление
межклеточного транспорта, т.е. более чем 20% флуоресцентных сигналов было распределено
между 2-3-клеточными кластерами. Важно, что в контрольных листьях только 1% сигналов
обнаруживался в 3-клеточных кластерах, а после обработки метанолом их доля поднималась до
29
7%. Оценка достоверности с помощью двухвыборочного критерия Стьюдента подтвердила
статистическую значимость различий активности межклеточного транспорта 2xGFP в листьях,
обработанных метанолом, по сравнению с контрольными (Рис. 29Б).
Рис. 29. Метанол и МИГи, кодирующие BG, NCAPP и MIG-21, активизируют межклеточный
транспорт в растении. А. Одиночная клетка (сверху) и группа клеток (снизу) эпидермиса N.benthamiana,
экспрессирующие 2xGFP. Б-В. Оценка эффективности межклеточного транспорта 2xGFP после
обработки растения газообразным метанолом (Б) или ко-агрофинфильтрации с конструкциями,
кодирующими МИГи (В). Значение двухвыборочного критерия Стьюдента для выборок,
соответствующих контрольному и обработанному метанолом растению, во всех случаях Р<0,001.
30
Мы заключили, что метанол – это вещество, воздействие которого стимулирует
межклеточный транспорт 2xGFP. На следующем этапе, для исследования роли МИГов в
межклеточном транспорте, мы проводили мониторинг распространения 2xGFP в эпидермальных
клетках N. benthamiana, агроинъецированных плазмидами, кодирующими BG, NCAPP или MIG21. Рисунок 29В показывает, что в листьях контрольного растения, агроинъецированных пустым
вектором рBin19, около 7% сигналов распределено между 2- и 3-клеточными кластерами. Когда
проводили ко-агроинъекцию листьев 2хGFP с NCAPP, MIG-21 или BG, межклеточный
транспорт 2xGFP активизировался. Более чем 23, 26 или 22%, соответственно, флуоресцентных
сигналов обнаруживались в клеточных кластерах (Рис. 29В).
Мы заключили, что метанол может запускать процесс «открытия» плазмодесм и
активизацию межклеточного транспорта посредством повышения синтеза МИГов, таких как
NCAPP, MIG-21 или BG.
7. Метанол вызывает повышение репродукции ВТМ в растении.
Если в растении, находившемся под воздействием газообразного метанола, повышена
пропускная способность плазмодесм и активизирован межклеточный транспорт макромолекул,
то это должно привести к более эффективному распространению и репродукции вируса. Для
проверки этого предположения, мы агроинъецировали листья растения по схеме, приведенной
на рисунке 30, вирусным вектором, крВТМ:GFP (Рис. 8А). Об уровне репродукции вирусной
РНК мы судили по экспрессии GFP.
Рис.
30.
Схематическое
изображение
постановки
эксперимента для оценки
межклеточного
транспорта
крВТМ:GFP
в
листьях
растения, инкубированного в
атмосфере с повышенным
содержанием
газообразного
метанола.
Размер фокусов вирусной инфекции свидетельствовал об активности межклеточного
транспорта соответствующей РНК. Рисунок 31 показывает типичные вирусные фокусы (локусы)
через 3 дня после агроинъекции (dpi). Видно, что метанол вызывает стимуляцию роста и
распространения фокусов GFP. В то время как фокусы становятся видимым во всех растениях
приблизительно в одно тоже время, размер их увеличивается быстрее в растениях,
обработанных метанолом (Рис. 32). На следующем этапе исследования мы проверили
способность BG, NCAPP и MIG-21 усиливать межклеточный транспорт и/или репродукцию
вирусного вектора.
31
а
Рис. 31. Динамика роста фокусов вследствие
активизации межклеточного транспорта
вирусного вектора крВТМ:GFP в листьях
растения, инкубированного в атмосфере с
повышенным содержанием газообразного
метанола. dpi, дней после инокуляции.
Флуоресцентная микроскопия.
Рис. 32. Оценка количества фокусов
крВТМ:GFP разного размера в листьях
растения, инкубированного в атмосфере с
повышенным
содержанием
газообразного
метанола, по сравнению с интактным растением
на 3 день после инокуляции.
Поскольку продукты этих генов улучшают межклеточную коммуникацию, то они,
вероятно, способны стимулировать экспрессию GFP с вирусного вектора крВТМ:GFP
вследствие повышения эффективности распространения последнего. Для проверки этого
предположения мы использовали ко-инъекцию листьев N. benthamiana крВТМ:GFP и
конструкциями, кодирующими BG, NCAPP и MIG-21.
Рис. 33. МИГи, кодирующие BG, NCAPP и MIG-21,
стимулируют репродукцию вирусного вектора
крВТМ:GFP в растении. Результаты измерения
флуоресценции GFP на 5 день после агроинъекции
приведены в относительных единицах, контроль
принят за 1.
32
Через пять дней после инъекции накопление GFP в листьях повышалось в 13-23 раз (Рис. 33),
что подтверждает нашу гипотезу о способности BG, NCAPP и MIG-21 усиливать
репродукцию/транспорт вирусного вектора крВТМ:GFP
Для максимального приближения к природной ситуации вирусной инфекции мы
использовали инокуляцию листьев растения N.benthamiana ВТМ. Т.к. это цитоплазматический
вирус, то его РНК не адаптирована к ядерной фазе заражения, которая неизбежна при
агроинъекции листьев вирусным вектором крВТМ:GFP. Дело в том, что при агроинъекции
вирусный транскрипт синтезируется в ядре и затем экспортируется в цитоплазму, в то время как
в природе вирусная РНК после «раздевания» вирусной частицы сразу оказывается в цитоплазме,
минуя клеточное ядро. Поэтому для подтверждения, сделанных выше выводов, мы использовали
метод инокуляции листьев суспензией вирусных частиц, как это происходит в природе при
контакте поврежденного листа с соком инфицированного растения. Результаты, представленные
на рисунке 34, показывают, что в сравнении с контролем растение, предварительно
инкубированное с поврежденным растением в эксикаторе, проявляет повышенную
чувствительность к ВТМ, о чем свидетельствует уровень накопления вирусной РНК.
Рис. 34. Метанол повышает
чувствительность растения к
ВТМ.
Схематическое
изображение
эксперимента:
растение-ресивер в течение 18
часов
инкубировалось
в
эксикаторе с поврежденным
растением или с метанолом,
затем заражалось ВТМ (сверху).
Оценка количества РНК ВТМ в
ресивере
поврежденного
растения или в растении,
обработанном
газообразным
метанолом, через час, 48 ч и 72
ч после заражения (снизу).
33
Аналогичный результат получен и при инкубации растения-ресивера в атмосфере с
повышенным содержанием паров метанола.
Рис. 35. Метанол повышает
чувствительность растения к
ВТМ. Схематическое изображение
эксперимента: растение-ресивер в
течение 18 часов инкубировалось в
проточной системе, воздух к
ресиверу непрерывно поступал из
эксикатора
с
поврежденным
растением, после чего растениересивер заражалось ВТМ (сверху).
Оценка уровня накопления РНК
ВТМ в ресивере (N.benthamiana)
через 48 ч и 72 ч после заражения.
Количество
РНК
ВТМ,
детектируемое через час, принято
за 1. 120# – относительно
количество РНК ВТМ в системнозараженном верхнем листе через 5
суток после инфекции (снизу).
На следующем этапе мы использовали проточную систему (Рис. 35, верх). Результаты,
представленные на диаграмме рисунка 35 (низ) после статистического анализа, подтверждают
вывод, сделанный выше: растение, предварительно инкубированное с поврежденным растением
или химически чистым метанолом, приобретает повышенную чувствительность к ВТМ.
Мы заключили, что метанол, выделяемый поврежденным растением, способен вызвать в
соседнем растении синтез МИГов, «раскрытие» плазмодесм, и, как следствие, увеличение
репродукции ВТМ.
8. Активизация межклеточного транспорта в растении связана с развитием
антибактериальной устойчивости.
8.1. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях, обработанных газообразным
метанолом и цис-3-гексен-1-олом в закрытой системе. Современные представления о
молекулярных механизмах бактериального патогенеза отмечают важную роль транспорта
бактериальных факторов вирулентности из цитоплазмы клетки в ее ядро для обеспечения
бактериальной колонизации (Deslandes and Rivas, 2012). Исходя из нашей гипотезы о связи
ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта, мы предположили, что метанол,
34
вызывая повышение пропускной способности плазмодесм и усиленный межклеточный
транспорт макромолекул должен индуцировать устойчивость растения к бактериям.
Рис. 36. Влияние эмиттеров метанола на устойчивость ресивера N.benthamiana к R.solanacearum. А.
Схематическое изображение эксперимента: растение-ресивер в течение 18 часов инкубировалось в
замкнутой системе с эмиттером, в качестве которого использовались растения или химические вещества,
метанол (№4) и цис-3-гесен-1-ол (№5). После инкубации в ресивер вводилась суспензия R.solanacearum
(106 КОЭ/мл). Далее проводилась оценка выживаемости бактерии в листьях растения-ресивера через 72 ч
после заражения (Б).
Для проверки этой гипотезы мы использовали разработанный нами метод (Рис. 36А):
поврежденное растение-эмиттер помещали в герметично закрытый 20л-эксикатор рядом с
интактным растением (ресивером). Через определенное время растение-ресивер удаляли из
эксикатора и в его листья вводили суспензию Ralstonia solanacearum. Эта бактерия способна
инфицировать широкий спектр растений, включая представителей семейства Solanaceae. В
качестве контроля использовали растение, инкубируемое с интактным эмиттером. Результаты,
представленные на рисунке 36Б, показывают, что, как мы ожидали, предварительная инкубация
с поврежденным растением-эмиттером приводила к снижению роста бактерий в ресивере
(столбик №3) по сравнению с контролем (столбик №1). В контрольных экспериментах метанол
также вызывал подавление размножения бактерий в растении-ресивере (столбик №4).
35
Далее, мы исследовали влияние цис-3-гексен-1-ола, эмиссия которого увеличивается
после повреждения листа (Рис. 21), на размножение бактерий в растении-ресивере. Подавление
роста R. solanacearum в ресивере поврежденного растения (Рис. 36, столбик № 3) могло быть
вызвано как эмиссией метанола, так и цис-3-гексен-1-ола. Действительно, инкубация в
атмосфере с повышенным содержанием цис-3-гексен-1-ола, также приводила к возникновению
антибактериальной устойчивости растения-ресивера (Риг. 36Б, столбик № 5). Однако, как
показано на рисунке 22, цис-3-гексен-1-ол, сам по себе может вызывать эмиссию листом
метанола, т.е. эффекты цис-3-гексен-1-ола могут быть не прямыми, а опосредованными. Мы
заключили, что прямая эмиссия метанола, а также эмиссия метанола, индуцированная цис-3гексен-1-олом, могут быть ответственны за подавление роста R. solanacearum в растенииресивере.
8.2. Исследование роли метанола в развитии системной устойчивости растения к
бактерии R. solanacearum на модели табака, трансгенного по ПМЭ. Чтобы убедиться в
решающей роли метанола в развитии антибактериальной устойчивости, необходимо было
исключить цис-3-гексен-1-ол, эмитируемый поврежденным листом, что и заставило нас
обратиться к ПМЭ-трансгенному табаку, полученному в нашей лаборатории (Гасанова и др.,
2008). Повышенная экспрессия ПМЭ привела к более высокому содержанию метанола в соке
растений (Рис. 37). Трансгенные растения были более устойчивы к R. solanacearum: бактерии не
вызывали некроза листьев (Рис. 38), а рост самих бактерий в листьях трансгенного растения был
существенно снижен (Табл. 4).
Здесь следует отметить, что растения, трансгенные по ПМЭ, морфологически отличались
от нормального табака. Размер их клеток и хлоропластов был увеличен по сравнению с
контролем. Но что важно, у ПМЭ-трансгена толщина клеточной стенки была 198±23,2 нм, а это
в 1,38 раза больше, чем у контрольных растений (143±12,5 нм).
Рис. 38. Формирование некрозов в листьях
N.tabacum дикого типа (WT) и трансгенных по
ПМЭ (PME-трансген) через 4 дня после
инъекции R. solanacearum (108 КОЭ/мл).
Стрелками обозначены места инъекции.
Рис. 37. Содержание метанола в соке
листьев N.tabacum дикого типа (WT) и
трансгенного по ПМЭ (PME-трансген).
36
Таблица 4. Рост R. solanacearum в листьях ПМЭ-трансгенного растения.
Тип растения
WT
PME-трансген
0h
1.09±0.02
1.05±0.01
Количество R. solanacearum (КОЕ/см2)x106
Соотношение
Относительный
72h
72h/0h
рост, %
3.07±0.02
2.82±0.01
182
1.19±0.07
1.13±0.02
13
Для того, чтобы исключить влияние структурной модификации клеточной стенки
трансгена, мы использовали систему эмиттер-ресивер в эксикаторе (Рис. 36А). В соответствии с
нашими ожиданиями, повышенная экспрессия гена ПМЭ приводила к увеличенной эмиссии
метанола, в то время как эмиссия цис-3-гексен-1-ола не была выявлена (Рис. 21).
Рис. 39. Влияние эмиттеров метанола на устойчивость растения-ресивера N.benthamiana к
R.solanacearum. А. Схематическое изображение эксперимента: растение-ресивер в течение 18 часов
инкубировалось в проточной системе, воздух к ресиверу непрерывно поступал из эксикатора с
эмиттером, в качестве которого использовались растения или химические вещества цис-3-гесен-1-ол и
метанол. После инкубации ресивер инфильтрировался суспензией R.solanacearum (106 КОЭ/мл). Далее
проводилась оценка выживаемости бактерии в листьях растения-ресивера через 72 ч после заражения (Б).
Инкубация с ПМЭ-трансгенным эмиттером приводила к снижению выживаемости бактерий в
листьях растения-ресивера (Рис. 36Б, столбик №2) по сравнению с контрольным растением
37
(столбик №1). Хотя ПМЭ-трансген оказывал менее выраженное действие на размножении R.
solanacearum в ресивере, однако оно представляется статистически значимым, и степень
ингибирования коррелирует с уровнем эмиссии метанола (Рис. 21).
8.3. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях растений, обработанных
газообразным метанолом в проточной системе. Для окончательного доказательства роли
метанола, как передаваемого по воздуху сигнала, мы воспользовались проточной системой (Рис.
39А), которая подразумевает постоянное поступление воздуха от ПМЭ-трансгена или
поврежденного растения в эксикатор с интактным растением-ресивером. После подобной
обработки растение-ресивер удаляли из эксикатора и вводили в него суспензию R. solanacearum.
Результаты, представленные на диаграмме рисунка 39Б, показывают, что растение-ресивер,
получавшее воздух из эксикатора с растением-эмиттером, ПМЭ-трансгеном или поврежденным
растением, приобретало антибактериальную устойчивость. Статистический анализ
подтверждает этот вывод. Интересно, что в соответствии с нашими ожиданиями, поврежденный
ПМЭ-трансген (по сравнению с интактным ПМЭ-трансгеном) в качестве эмиттера вызывал
более выраженную устойчивость растения-ресивера (столбик №4).
8.4. Влияние метанола на число фокусов экспрессии GFP в листьях, агроинъецированных
вирусным вектором крВТМ:GFP. Антибактериальный эффект метанола проявляется также на
растениях, инфицированных A. tumefaciens. Это отчетливо было видно в опытах, описанных
выше, когда растения агроинъецировали вирусным вектором крВТМ:GFP (Рис. 30). Показано,
что число светящихся локусов в листьях, падает в листьях растений, обработанных метанолом
(Рис. 40). Таким образом, метанол вызывает устойчивость как к бактерии R. solanacearum, так и
A. tumefaciens.
Рис. 40. Оценка количества фокусов экспрессии GFP
в
листьях
N.benthamiana,
инкубированных
с
газообразным метанолом перед агроинфильтрацией
крВТМ:GFP
по
сравнению
с
растением,
не
подвергавшимся воздействию метанола.
В целом, мы заключаем, что метанол является тем передаваемым по воздуху сигналом, который
вызывает в растениях (а) устойчивость к бактериям и (б) повышение пропускной способности
плазмодесм, а также (в) активизацию межклеточного транспорта макромолекул.
9. Концепция участия межклеточного транспорта макромолекул в бактериальном и
вирусном патогенезе растений (см. рис. 41).
38
Результаты, описанных выше экспериментов показали, что повреждение листа вызывает
дополнительную эмиссию метанола. Следует отметить несколько аспектов данного процесса:
• существует прямая корреляция между синтезом ПМЭ de novo и эмиссией метанола;
• метанол, выделяемый растением после повреждения, не накапливается в листовой ткани,
а выбрасывается в атмосферу;
• метанол, попав в окружающий воздух, способен изменять транскрипционную активность
МИГов, таких как BG, NCAPP и MIG-21, в листьях соседнего интактного растения, что, в
свою очередь, приводит к (а) увеличению пропускной способности плазмодесм sourceлистьев; (б) усилению репродукции ВТМ; (в) антибактериальной устойчивости.
Следует иметь в виду, что вызванная повреждением повышенная транскрипционная
активность ПМЭ (Рис. 41, этап 1 и 2) приводит к трем событиям. Во-первых, ПМЭ активирует
защитные реакции как против вирусов (Дорохов, 2007; Гасанова и др, 2008), так и бактерий (Рис.
38). Последнее заключение подтверждается данными, полученными на табаке, трансгенном по
ПМЭ. Эти трансгенные растения являются хорошей экспериментальной моделью исследования
взаимосвязи между повышенным уровнем мРНК ПМЭ и устойчивостью к бактериям (Табл. 4). В
целом, ПМЭ-трансген характеризуется повышенной эмиссией метанола (Рис. 21),
устойчивостью к ВТМ (Гасанова и др., 2008) и бактериям (Рис.38; Табл.4). Уровень и профиль
экспрессии МИГов у растений, трансгенных по ПМЭ, заметно отличается от растений,
обработанных метанолом. Здесь можно провести аналогию с хроническим (ПМЭ-трансгены) и
острым (обработка метанолом) воздействием метанола на растение.
Во-вторых, повреждение листа приводит к повышению ферментативной активности
ПМЭ. Мы показали, что через три часа после повреждения активность ПМЭ в клеточной стенке
N. benthamiana увеличивается со 139±9,2 до 360±0,068 нанокаталей на 1 мг сырого листа, т.е. в
2,5 раза.
Наконец, резко повышается уровень эмиссии метанола (Рис. 41, этап 3), который с одной
стороны изменяет активность МИГов в интактных листьях собственного и соседнего растения
(этап 4). С другой стороны, метанол по принципу обратной связи может вызывать подавление
транскрипции гена ПМЭ и последующую эмиссию метанола. Это, в конечном итоге, возвращает
лист в исходное состояние. Ингибитор ПМЭ (PMEi) (Табл. 3) также являются одним из факторов
возвращения эмиссии метанола в исходное состояние.
Нами показано, что индукция МИГов в соседних листьях приводит к активизации
межклеточного транспорта. Если участие BG и NCAPP в межклеточном транспорте было
известно в литературе (Lee et al., 2003; Bucher et al., 2001) и подтверждено в этой работе, то
участие MIG-21 в этом процессе обнаружено нами впервые (Рис. 29).
39
Рис. 41. Модель, отражающая эффекты метанола, выделяемого растением при повреждении.
Механические повреждения листьев растения (1) приводят к повышению уровня экспрессии ПМЭ (2) и
индукции выделения газообразного метанола (3). Испускаемый растением метанол вызывает индукцию
ряда генов (МИГов) в листьях того же и соседних растений (4). Повышение экспрессии МИГов приводит
к возникновению антибактериальной устойчивости (5).
Для решения обсуждаемых проблем важно, что усиление межклеточного транспорта
вызывает устойчивость растения к R. solanacearum и чувствительность к ВТМ. Последний факт
является достаточно неожиданным. Мы рассматриваем его как неизбежную расплату за
антибактериальную устойчивость (Рис. 41, этап 5). В пользу такого взгляда говорят
исследования вирусологов (Gibbs et al., 2010), обнаруживших совпадение во времени
активизации эволюции вирусов растений и возникновения культурных растений, т.е. начала
сельского хозяйства. Дело в том, что по окончании оледенения в начале голоцена (примерно 12
тысяч лет назад) человек перешел от собирательства к возделыванию растений, т.е. к их
окультуриванию и переносу растений из мест дикого существования в поля ближе к жилищу.
Данный процесс стимулировал распространение вирусов, т.к. постоянное микро и макроповреждение растений неизбежно при их культивировании. Более того, человек создал
благоприятные условия для насекомых-переносчиков вирусов. Известно, что первичнозараженное растение тыквы (Cucurbita pepo), например вирусом огуречной мозаики (ВОМ),
становились более предпочтительны для тлей, Myzus persicae и Aphis gossypii, чем здоровые.
Тля, в свою очередь, являясь переносчиками ВОМ, способствовала интенсивному
40
инфицированию растений тыквы (Mauk et al., 2010). Таким образом, человек на полях,
засеянных монокультурой, возделывал ее, повреждая растения, т.е. создавал благоприятные
условия для распространения вирусных инфекций в условиях сниженного давления
экологических факторов сдерживания популяции переносчиков.
В большинстве случаев, вирус, как внутриклеточный паразит, не вызывает гибели
растения-хозяина, а бактериальная инфекция зачастую приводит к отмиранию тканей и смерти
растения. Кроме того, факторы вирулентности бактерий могут имитировать какие-либо
клеточные белки, «обманывая» защитные системы растения. Таким образом, наибольшую
потенциальную опасность для растения представляют именно бактериальные патогены,
вероятно поэтому в первую очередь необходимо создание условий, максимально
препятствующих именно бактериальной колонизации растения.
С другой стороны, растения могли получить эволюционное преимущество благодаря
бактериальной и вирусной инфекции, однако в этом случае патоген не должен приводить к
гибели растения. И действительно, подтвержден факт горизонтального переноса генов (ГПГ) в
случае бактерии Agrobacterium rhizogenes, вызывающей разрастание тканей хозяина, но не
гибель. Однако, наибольшее количество обнаруженных случаев ГПГ связано с вирусами
(Talianova et al., 2011). Т.е. благодаря патогенам и в значительной степени вирусам, происходило
повышение генетического разнообразия растений (Murad et al., 2004), в том числе приводящее к
приобретению устойчивости (Bertsch et al., 2009).
10. Исследование роли метанола и NCAPP в модификации ядерноцитоплазматического транспорта клетки.
Приступая к исследованию вопроса, как активизация межклеточного транспорта в листе
может препятствовать бактериальной колонизации растения, мы учитывали три обстоятельства.
Первое, имеется тесная связь между ядерно-цитоплазматическим и межклеточным транспортом
транскрипционных факторов, например таких как KNOTTED1 (KN1) и SHORT-ROOT (SHR)
(Gallagher and Benfey, 2009). Второе, для успешной колонизации листа бактерии необходимо
ввести в ядро клетки хозяина белки, выполняющие функцию транскрипционных факторов, в том
числе белки III и IV типа секреции, например, PopP2 R.solanacearum и Vir-белки A.tumefaciens
(Deslandes et al., 2003). Третье, ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ способна
блокировать ядерно-цитоплазматический транспорт белков, таких как фактор умолкания генов
дайсер DCL1 (Dorokhov et al., 2006).
На первом этапе исследования мы изучили способность газообразного метанола,
являющегося продуктом реакции деметилирования пектина ПМЭ, вызывать блокаду ядерного
импорта белков. Для этой цели мы создали генноинженерные конструкции, кодирующие GFP,
слитый с сигналом ядерной локализации. Первый вариант, GFP:NLSpTα моделировал клеточный
ядерный белок и представлял собой GFP, слитый с сигналом ядерной локализации (NLS)
протимозина альфа. Второй вариант, GFP:NLSPopP2, служил моделью бактериального
вирулентного фактора и представлял собой GFP, слитый с NLS белка PopP2 R. solanacearum III
41
типа секреции. Обе конструкции доставлялись в клетки растения с помощью агроинъекции. На
рисунке 42 показана схема эксперимента, включающая введение в листья суспензий
агробактерии и последующую обработку листьев газообразным метанолом. Микроскопия
листовой пластинки позволила нам убедиться, что оба варианта NLS эффективно направляют
GFP в ядро. Две химерные молекулы GFP различались между собой по тому, с какой
вероятностью они оставались в цитоплазме. GFP:NLSpTα давал цитоплазматическую
флуоресценцию примерно трети подсчитанных клеток (Табл. 5), в то время как для GFP:NLSPopP2
только шестая часть клеток была с цитоплазматической флуоресценцией GFP. Столь высокая
доля клеток с цитоплазматической флуоресценцией в контроле объясняется тем, что
контрольный лист в закрытой системе также выделяет небольшое количество газообразного
метанола, который своим воздействием вызывает повышение фонового уровня.
Рис. 42. Газообразный метанол
вызывает
изменения
ядерноцитоплазматического транспорта
в
растении.
Схематическое
изображение
эксперимента:
агроинъекция листьев N.benthamiana
35S-GFP:NLS
с
последующей
инкубацией в закрытой системе в
течение 3 ч. Через 24 ч после
инъекции
проводится
оценка
распределения GFP между ядром и
цитоплазмой. Фотографии, получены
при
помощи
конфокального
микроскопа. Масштабная линейка
соответствует 20 мкм.
Вестерн-блот анализ состояния химерных молекул GFP в клетке подтвердил высокую
стабильность GFP:NLSpTα (Рис. 43). GFP:NLSPopP2 оказался менее стабильным, хотя бóльшая
часть молекул GFP:NLSPopP2 присутствовала в зоне целого белка. Таблица 5 показывает, что
после обработки листьев метанолом число клеток с цитоплазматической локализацией GFP
резко увеличилось. Это позволило нам сделать вывод о способности метанола вызывать блокаду
ядерного импорта ядерных белков.
Рис. 43. Вестерн-блот анализ растительных экстрактов (суммарный растворимый белок) из листьев,
ко-агроинфильтрированных 35S-GFP:NLSpTα или 35S-GFP:NLSPopP2 с pBin19 (контроль), 35S-proPME или
35S-NCAPP. Использовались антитела к GFP, конъюгированные с щелочной пероксидазой хрена.
42
На следующем этапе мы исследовали способность NCAPP в качестве одного из МИГов
взаимодействовать с GFP:NLSpTα или GFP:NLSPopP2 и блокировать их доставку ядро. Мы
ожидали, что в соответствии с данными лаборатории Лукаса (Lee et al., 2003), первооткрывателя
NCAPP, этот белок может взаимодействовать с NLS транскрипционных факторов и блокировать
их доставку ядро.
Таблица 5. Газообразный метанол вызывает нарушение импорта ядерных белков.
Конструкция
GFP:NLSpTα
GFP:NLSPopP2
Инкубация с метанолом
% клеток с цитоплазматической локализацией GFP
нет
32,14±7,34
да
83,6±12,40
нет
16,25±2,53
да
57,50±5,92
Таблица 6 показывает, что в соответствии с нашими данными (Dorokhov et al., 2006),
введение в клетку конструкции, кодирующей предшественник ПМЭ (proPME), вызывает
подавление импорта в ядро GFP:NLSpTα и GFP:NLSPopP2. NCAPP также эффективно препятствует
ядерному импорту модельных белков: число клеток с цитоплазматической флуоресценцией
возрастает более, чем в два раза. Важно отметить, что стабильность химерных GFP в клетке в
присутствии NCAPP или proPME не изменяется (Рис. 43).
Таблица 6. ПМЭ и NCAPP вызывают нарушение импорта ядерных белков.
Конструкция
pTα
GFP:NLS
PopP2
GFP:NLS
Ко-инъекция
% клеток с цитоплазматической локализацией GFP
нет
15,50±1,34
NCAPP
41,30±1,31
proPME
93,80±0,60
нет
16,25±2,53
NCAPP
57,50±5,92
proPME
43,20±1,40
Результаты в пользу гипотетической функции NCAPP как рецептора клеточных
транспортных белков (Lee et al., 2003), позволили нам предположить участие NCAPP в качестве
их переносчика. Следует ожидать, что GFP:NLSpTα в присутствии NCAPP может перемещаться в
соседние клетки, т.е. NCAPP может переносить GFP:NLSpTα из клетки синтеза в соседние, в
результате чего число светящихся клеток увеличивается. Действительно, мы обнаружили в
листьях N. benthamiana, агроинъецированных GFP:NLSpTα, что количество клеток, содержащих
GFP-NLS, увеличивается в два раза в присутствии NCAPP (Рис. 44).
43
Рис. 44. Оценка количества светящихся в УФ свете
клеток, содержащих GFP, в листьях N.benthamiana, коагроинфильтрированных 35S-GFP с pBin19 (контроль) или
35S-NCAPP на см2.
Возможно NLS, присутствующий в хозяйских транспортных белках и бактериальных
факторах вирулентности, как участок, обогащенный положительно заряженными
аминокислотами, выполняет функцию сайта узнавания NCAPP, а также необходим для
взаимодействия между NCAPP и соответствующими факторами вирулентности. Мы
предположили, что NCAPP, выполняя функцию «ковра-самолета», может переносить через
плазмодесмы в соседние клетки бактериальные факторы вирулентности, при этом способствуя
их инактивации. На рисунке 45 представлена гипотетическая модель, отражающая
взаимодействие NCAPP с транспортными белками и бактериальными факторами вирулентности.
В пользу нашей модели говорит тот факт, что введение мутации в NLS, исключающей ядерную
локализацию белка SHR, отменяет его способность перемещаться из клетки в клетку (Gallagher
and Benfey, 2009). Что касается транспортного белка ВТМ, он локализуется в клеточной стенке,
а функциональная структура NLS в его составе не выявлена. Однако исследование
аминокислотной последовательности позволяет найти участки богатые положительно
заряженными аминоксилотами. Так в С-концевом фрагменте ТБ крВТМ присутствует
последовательность VDNFKRRKKKVE, богатая остатками лизина (К) и аргинина (R), которая
может отвечать за взаимодействие ТБ с NCAPP. Наша модель (Рис. 45) предполагает перенос
транспортного белка и бактериальных факторов вирулентности в соседние клетки через
плазмодесмы, где происходит их модификация и последующая инактивация. Это
предположение базируется на известных фактах. Так, фосфорилирование ТБ ВТМ с помощью
протеинкиназы плазмодесм приводит к его инактивации (Waigmann et al., 2000; Karger et al.,
2003).
Другое следствие нашей модели – это конкуренция между транспортным белком и
бактериальным фактором вирулентности за NCAPP. Это означает, что введенный в клетку ТБ
ВТМ «занимает» эндогенный NCAPP, не позволяя ему взаимодействовать с бактериальным
фактором вирулентности, и, как следствие, делая клетку более чувствительной к бактериальной
инфекции. В поддержку нашего предположения появилось сообщение (Conti et al., 2012), что
44
трансгенный по ТБ ВТМ табак существенно чувствительнее к бактерии Pseudomonas syringae и
грибку Sclerotinia sclerotiorum, чем контрольные растения.
Рис. 45. Модель взаимодействия NCAPP с ТБ ВТМ и NLS-содержащими белками бактерий. NCAPP
переносит ТБ ВТМ и NLS-содержащие белки к плазмодесмам, где, по-видимому, происходит
инактивация этих факторов патогенеза.
Обобщая все вышесказанное, мы заключаем, что в основе бактериальной устойчивости
листьев с «открытыми» плазмодесмами может быть конкуренция между транспортными
белками хозяина и факторами вирулентности бактерий за общие рецепторы или белки
переносчики, подобные NCAPP.
11. Биотехнологические основы эффективной продукции вакцин и антител в
растении.
Решение фундаментальных задач диссертации позволило нам перейти к созданию новых
векторов и биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков в растении.
11.1. Вектор на основе транскрипционной кассеты РНК-полимераз I. Эффективные
растительные системы транзиентной экспрессии используют вирусные векторы, ДНК которых
переносится в клетки с помощью A.tumefaciens. РНК-полимераза II в ядре синтезирует вирусную
РНК, поступающую затем в цитоплазму и направляющую синтез целевого белка. Жизненный
цикл ВТМ в природных условиях проходит в цитоплазме, поэтому вирус не приспособлен к
45
процессам ядерного сплайсинга, через которые проходит соответствующая РНК при доставке
генетического материала агроинъекцией. В этом случае удаление присутствующих в РНК ВТМ
криптических интронов, узнаваемых системой сплайсинга, приводит к потере инфекционности
вирусной РНК. В нашей работе исследована возможность создания векторной системы,
эксплуатирующей транскрипцию РНК-полимеразой I и не требующей сплайсинга. Для этого
кДНК крВТМ была поставлена под контроль промотора рибосомной РНК (Pol IrRNA), ген белка
оболочки замещен геном, кодирующим GFP и, таким образом, получен вектор Pol IrRNA-крВТМGFP. Нами показано, что при агроинъекции листьев полученным вектором наблюдается
продукция GFP. Это происходит, по-видимому, при участии матрицы крВТМ-GFP, не
содержащей кэпа, поскольку в природе РНК-полимераза I участвует в синтезе некэпированной
рРНК. Уровень синтеза GFP низок, но возрастает в 100 раз при коинъекции векторами,
кодирующими метилтрансферазу крВТМ и супрессор сайленсинга вируса кустистой
карликовости томатов. Таким образом, создана транзиентная система экспрессии в растении на
основе вирусного вектора под контролем промотора генов рРНК.
11.1.2. Интрон-содержащий вектор на основе генома крВТМ. Другим способом
модификации вирусного генома для повышения эффективности выхода из ядра
соответствующей РНК является удаление последовательностей, узнаваемых системой
сплайсинга как криптические интроны, и введение природных интронов. Аналитическая работа
по выявлению криптических интронов в последовательности генома крВТМ, внесение
необходимых мутации, а также введение природных интронов из генов растений была
осуществлена в группе Ю.Глеба (Giritch et al., 2006). На основе ранее созданного в нашей
лаборатории вектора крВТМ:GFP (Dorokhov et al., 2006) и интрон-содержащего провектора
pICH17388 (5'-концевая часть которого включает в себя последовательность репликазы и ТБ
крВТМ) (Giritch et al., 2006) был сконструирован новый вирусный вектор, имеющий 8 интронов
в гене репликазы – крВТМ(и):GFP. В дальнейшем этот вектор использовался как в
экспериментах по изучению ядерно-цитоплазматического транспорта РНК, так и для продукции
терапевтических белков (антител и химерных вирусных частиц) в растении.
11.2. Технологическая платформа продукции фармацевтических препаратов в растении.
Растение, как фабрика рекомбинантных фармацевтических продуктов, помимо
отсутствия у него патогенных для человека вирусов, привлекает низкой себестоимостью
продуцируемого белка и способностью растений синтезировать ферменты, вакцины и антитела.
В данном разделе работы на примере продукции антираковых антител создана эффективная
система экспрессии фармацевтических белков в растении. Впервые разработана система
продукции в растении антитуберкулезных вакцинных белков. Созданы эффективные системы
повышения продукции белка, основанные на использовании кнРНК. А главное, созданы (а)
вирусные наночастицы с экспонированными на их поверхности вакцинными эпитопами
онкогена HER2/neu; (б) антитела против фактора роста эндотелия сосудов, позволяющее
блокировать рост опухоли за счет подавления ее васкуляризации; (в) антитела против онкогена
46
HER2/neu для лечения рака молочной железы и продемонстрирована их более высокая
противоопухолевая активность по сравнению с коммерческими препаратами. Использование
результатов данной работы должно привести к благоприятным микро- и макроэкономическим
эффектам, таким как, совершенствование технологий в фармацевтической индустрии;
потенциальное импортозамещение препаратов из наиболее дорогостоящего сегмента
лекарственных и диагностических средств; снижение себестоимости продукции. Доказана
биологическая безопасность A.tumefaciens для млекопитающих: при экспериментальной
бактериемии A. tumefaciens не вызывает трансформацию клеток органов мыши.
ВЫВОДЫ
1.
Разработана экспериментальная модель экспорта РНК из ядра растительной клетки,
позволяющая исследовать перемещение в цитоплазму молекул коротких некодирующих РНК,
синтезированных в ядре ДНК-зависимыми РНК-полимеразами I, II и III.
2.
С помощью разработанной системы, был открыт новый механизм конкуренции за
ядерный экспорт между кнРНК и кмРНК, с одной стороны, и другими более длинными мРНК, с
другой стороны, характеризующийся следующими свойствами:
а) экспорт из ядра в цитоплазму молекул РНК, синтезируемых в ядре РНК-полимеразой I, II или
III, самостоятелен и не зависит друг от друга;
б) конкуренция приводит к подавлению синтеза в цитоплазме репортерного белка GFP и
клеточного белка BiP;
в) ингибирование экспрессии мРНК не связано с конкуренцией промоторов Pol II35S за РНКполимеразу II, но напрямую зависит от длины транскрипта и «силы» транскрипционного
промотора;
г) молекулы кнРНК, синтез которых в ядре направляется РНК-полимеразами I или III, не
оказывают влияния на экспрессию мРНК;
д) синтез в ядре кнРНК или кмРНК создает благоприятные условия для репродукции в
цитоплазме вирусного вектора.
3.
Разработана концепция конкуренции макромолекул на этапе ядерного транспорта в
бактериальном и вирусном патогенезе растений.
4.
Создана новая экспериментальная функциональная модель межклеточного транспорта,
основанная на открытии важной роли метанола в жизни растений и его участии в:
а) контроле генов, регулирующих устойчивость растений к абиотическим и биотическим
факторам;
б) передаче сигнала от растения к растению, приводящего к мобилизации защитных реакций
растения;
в) межклеточном транспорте макромолекул;
г) создании условий, благоприятных для репродукции вирусов;
47
д) создании условий, препятствующих бактериальной колонизации.
5.
Изучены молекулярные механизмы и определена роль транспорта макромолекул в
иммунитете растений, создана концепция конкуренции макромолекул хозяина и патогена на
уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы и/или
белки переносчики.
6.
Разработана технологическая основа эффективной продукции вакцин и антител в
растении, основанная на выявленных закономерностях ядерно-цитоплазматического и
межклеточного транспорта макромолекул в растении.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Комарова Т.В., Шеваль Е.В., Поздышев Д.В., Колесникова В.С., Дорохов Ю.Л.
Интенсивный синтез зеленого флуоресцирующего белка ведет к формированию Y-тел
включения в растительной клетке. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 742-749.
2.
Комарова Т.В., Шварц А.М., Макаров А.А., Дорохов Ю.Л. (2012) Новый вирусный вектор,
эксплуатирующий транскрипцию РНК-полимеразой I. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 649-656.
3.
Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I.V., Frolova O.Y., Pozdyshev D.V. and Gleba Y.Y.
Airborne signals from a wounded leaf facilitate viral spreading and induce antibacterial resistance in
neighboring plants. // PLoS Pathogens. 2012. V. 8. e1002640.
4.
Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I.V., Kosorukov V.S., Zinovkin R.A., Shindyapina
A.V., Frolova O.Y., and Gleba Y.Y. Methanol may function as a cross-kingdom signal. // PLoS One.
2012. V. 7. e36122.
5.
Pozdyshev D.V., Komarova T.V., Petrunia I.V., Dorokhov Y.L. Plant wounding influences on
neighboring plant immunity. // FEBS Journal. 2012. V. 279 (Suppl 1). P. 73.
6.
Тюлькина Л.Г., Скурат Е.В., Фролова О.В., Комарова Т.В., Каргер Е.М., Атабеков И.Г..
Новый вирусный вектор для суперпродукции эпитопов вакцинных белков в растениях. // ACTA
NATURAE. 2011. T. 3. C. 32-42.
7.
Petrunia I.V., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Methanol emission by wounded plant enhances
mice attraction: behavioral and gene-expression analysis. // FEBS Journal. 2011. V. 278 (Suppl 1). P.
146.
8.
Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Skrypnik K.A., Gleba Y.Y.,
Dorokhov Y.L. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits her2/neu+ cell proliferation and retards
tumor growth. // PLoS One. 2011. V. 6. e17541.
9.
Makarov A., Komarova T., Shwartz A., Dorokhov Y. RNA polymerase I directed synthesis and
expression of polycistronic viral RNA. // FEBS Journal. 2010. V. 277 (Suppl 1). P. 229.
10.
Komarova T.V., Schwartz A.M., Frolova O.Y., Zvereva A.S., Gleba Y.Y., Cytovsky V.,
Dorokhov Y.L. Pol II-directed short RNAs suppress the nuclear export of mRNA. // Plant Mol Biol.
2010. V. 74. P. 591-603.
11.
Frolova O.Y., Petrunia I.V., Komarova T.V., Kosorukov V.S., Sheval E.V., Gleba Y.Y.,
Dorokhov Y.L. Trastuzumab-binding peptide display by Tobacco mosaic virus. //. Virology. 2010V.
407. P. 7-13.
12.
Komarova T.V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E., Dorokhov Y.L. Transient
expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. // Expert Rev Vaccines. 2010. V. 9. 859-876.
13.
Komarova T.V., Sheval E.V., Dorokhov Y.L. Uncontrolled protein overexpression leads to plant
cell autophagy. // FEBS Journal. 2009. V. 276 (Suppl 1). P. 206.
14.
Petrunia I.V., Frolova O.Y., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Plant as a factory for breast cancer
antigen production. // FEBS Journal. 2009. V. 276 (Suppl 1). P. 70.
48
15.
Зверева A.C., Петровская Л.Е., Родина А.В., Иванов П.И., Фролова О.Ю., Шингарова
Л.Н., Комарова Т.В., Дорохов Ю.Л., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Атабеков И.Г. Продукция
в растениях биологически активных миелоцитокинов человека. // Биохимия. 2009. T. 74. C. 14591468.
16.
Komarova T.V., Dorokhov Y.L. RNA-polymerase II-derived non-coding RNAs suppress
mRNA export and abolish antiviral protection in plants. // FEBS Journal. 2008. V. 275 (Suppl 1). P. 70.
17.
Shwartz A.M., Komarova T.V., Skulachev M.V. Destabilization of messenger RNA with long
3'UTR in plants. // FEBS Journal. 2008. V. 275 (Suppl 1). P. 464.
18.
Petrunia I.V., Frolova O.Y., Komarova T.V., Kiselev S.L., Citovsky V., and Dorokhov Y.L.
Agrobacterium tumefaciens caused bacteraemia does not lead to GFP gene expression in mouse organs.
// PLoS One. 2008. V. 3. e2352.
19.
Шварц А.М., Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г.
Стабильность мРНК в растениях зависит от длины 3'-нетранслируемой области. // Биохимия.
2007. T. 72. C. 260 – 269.
20.
Dorokhov Yu.L, Frolova O.Yu., Sheveleva A.A, Komarova T.V., Zvereva A.S., Ivanov P.A.,
Atabekov J.G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves. // Tuberculosis (Edinb.). 2007.
V. 87. P. 218-224.
Монографии и главы в книгах
1.
Komarova T.V., Petrunia I.V., Dorokhov Y.L. Vaccine peptide display on recombinant TMV
particles. // Plant-derived Vaccines: Technologies & Applications. Future Medicine Ltd. 2011. eBook
ISBN: 978-1-78084-092-5
2.
Komarova T.V., Citovsky V., Dorokhov Y.L. Pectin methylesterase enhances Tomato bushy
stunt virus P19 RNA silencing suppressor effects. // RNAi technology, eds: R.K. Gaur, Y. Gafni,
P.Sharma and V.K.Gupta. CRC Press, FL, USA. 2011. P. 125-137.
Патенты и патентные заявки
1. Дорохов Ю.Л., Комарова Т.В., Фролова О.Ю. Антитело против фактора роста эндотелия
сосудов и способ продукции антитела в растении. // 2011. Патент РФ № 2412251.
2. Дорохов Ю.Л., Комарова Т.В., Косоруков В.С. Антитело, специфически взаимодействующее
с онкобелком HER2/neu. // 2011. Патент РФ №2425840.
3. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Uryvaev L.V., Alkhovsky S.A.,
Samokhvalov E.I. Method of producing nucleoprotein nanoparticles. // 2010. WO2010039056
4. Dorokhov Y.L., Komarova T.V. Method for overproducing anti-HER2/Neu oncogene antibodies in
plant. // 2009. WO 2009048354.
5. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Atabekov J.G. Method of hyperproduction of target protein in a
plant. // 2008. WO2008063093.
49