Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на

версия от 14 ноября 2014
Sileks
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки крови на магнитных
частицах MP@SiO2
Cat. #: KIRPS0100
Назначение набора: выделение нуклеиновых кислот
Условия хранения: +4ºC
Условия транспортировки: особых условий не требуется
Состав набора
Набор содержит количество реагентов, достаточное для проведения 100 процедур выделения.
Компонент набора
• Буфер START
13 ml
• Буфер Lysis&Binding
40 ml
• Магнитные частицы MP@SiO2 (тип RNA Grade)
0.5 ml
• Буфер Wash 1
60 ml
• Буфер Wash 2
60 ml
• Буфер Wash 3
60 ml
• Буфер Final Wash
60 ml
• Буфер Elution
10 ml
Вы можете получить дополнительную информацию по данной серии
наборов, отсканировав расположенный рядом QR-код камерой
своего смартфона, планшета или веб-камерой компьютера, либо
посетив наш веб-сайт, воспользовавшись этой прямой ссылкой:
http://www.sileks.ru/shortlink/Kits_Isol_Plasma
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на магнитных частицах MP@SiO2
от 14 ноября 2014
ЗАО "Силекс" ● тел.: +7(495)7374224, +7(495)9984288 ● тел./факс: +7(495)7374224 ● эл. почта: info@sileks.com
Стр. 1 из 6
Содержание:
1. Меры предосторожности
2. Описание
3. Протокол выделения
4. Возможные проблемы и решения
5. Связанные продукты
1. Меры предосторожности
Некоторые компоненты набора могут нанести вред здоровью в случае
проглатывания, длительной ингаляции или попадания на кожу и в глаза.
Не смешивайте компоненты набора с кислотами, хлорными дезинфектантами и
отбеливателями. Это может привести к реакции с выделением токсичных паров.
Если для удаления промывочных буферов Вы используете аспиратор, проследите,
чтобы его колба-ловушка была пуста или по крайней мере не содержала кислот и
хлорных дезинфектантов. В наборе используются органические соединения, длительное
ингаляционное воздействие которых может вызывать головокружения и головные боли.
Избегайте попадания компонентов набора на одежду, кожу и в глаза.
При попадании в глаза немедленно промыть большим количеством воды, продолжая эту процедуру
не менее 15 минут, затем обратиться к врачу. Эффективность промывания возрастает, если
принудительно оттянуть веки пальцами. При сохранении неприятных симптомов (покраснения,
раздражённости, жжения) обязательно обратиться за медицинской помощью. В случае попадания
на кожу немедленно промойте место контакта с мылом и большим количеством воды.
2. Описание
Набор предназначен для эффективного и быстрого (~30 мин) выделения ДНК/РНК из
сыворотки или плазмы крови. Выделенные нуклеиновые кислоты могут использоваться как в
ПЦР, так и для любых других молекулярно-биологических применений (синтез кДНК путём
обратной транскрипции, мечение, клонирование, секвенирование и т.д.).
В набор входят все необходимые реактивы и буфера. Протокол выделения можно
модифицировать для масштабирования, в случае, когда требуется получение большего
количества ДНК/РНК. Для масштабирования необходимо пропорционально изменить
количества используемых реактивов. Принцип используемого в наборе метода основан на
обратимом связывании нуклеиновых кислот на поверхности магнитных частиц.
Терминология:
Плазма крови – это жидкий компонент цельной крови. В ней нет клеток, но содержатся все
белки (глобулины, альбумины, фибриногены и др.), электролиты, факторы свёртывания и
прочие неклеточные компоненты крови. Простейший способ отделить плазму от крови – это
центрифугирование цельной крови при 2000–3000×G в течение 5 минут.
В упрощённом виде это можно представить как: Плазма = Кровь – Клетки
Сыворотка крови – это плазма крови, лишённая факторов свёртывания и прочих белков,
вовлечённых в этот процесс. Обычно это жидкость, которая остаётся после свёртывания
крови (коагуляции).
В упрощённом виде это можно представить как: Сыворотка = Плазма – ФакторыСвёртывания
Бóльшаяя часть ДНК и РНК в организме содержится внутри клеток. Но небольшое количество
нуклеиновых кислот обнаруживается свободно циркулирующим в крови. Эти молекулы ДНК и
РНК образуются из мёртвых клеток, содержимое которых выбрасывается в кровоток. Наличие
таких свободно циркулирующих ДНК и РНК позволяет использовать малоинвазивные методы
диагностики для выявления ряда клинических заболеваний и нарушений. Обнаружение
специфических ДНК и/или РНК создаёт уникальный потенциал для ранней диагностики
различных патологий. Так можно обнаруживать рак на ранних стадиях, многие вирусные
инфекции, проводить неинвазивную пренатальную диагностику в период беременности,
выявлять некоторые формы диабета.
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на магнитных частицах MP@SiO2
от 14 ноября 2014
ЗАО "Силекс" ● тел.: +7(495)7374224, +7(495)9984288 ● тел./факс: +7(495)7374224 ● эл. почта: info@sileks.com
Стр. 2 из 6
Существуют различные источники свободно циркулирующей ДНК в крови:
• погибшие кровяные клетки
• патогенные микроорганизмы (бактерии, вирусы)
• молекулы ДНК на поверхности лейкоцитов
• процесс апоптоза
• некротические процессы
• спонтанный выброс новосинтезированной ДНК
• спонтанный выброс ДНК/РНК-липопротеиновых комплексов из здоровых клеток
Уровень в крови свободной ДНК, выделяемой мёртвыми клетками и микроорганизмами,
обычно низкий. Главным же источником свободной ДНК является апоптоз. Этот процесс, в
частности, специфичен для различных онкологических процессов.
Источники свободно циркулирующей РНК в крови обычно следующие:
• активные или погибшие вирусы, циркулирующие в кровотоке
• спонтанный выброс РНК в виде ДНК/РНК-липопротеиновых комплексов
• мРНК из клеток, погибших при процессах некроза или апоптоза
Принцип используемого в наборе метода основан на обратимом связывании ДНК на
поверхности магнитных частиц.
На Рисунке 1 схематически представлена процедура выделения. После лизирования образца,
содержащиеся в нём нуклеиновые кислоты связываются с магнитными частицами. Затем они
должны быть отмыты буферами из набора. После нескольких циклов отмывки осадок
магнитных частиц должен быть высушен, после чего можно элюировать нуклеиновые кислоты.
Рисунок 1. Схема процедуры выделения.
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на магнитных частицах MP@SiO2
от 14 ноября 2014
ЗАО "Силекс" ● тел.: +7(495)7374224, +7(495)9984288 ● тел./факс: +7(495)7374224 ● эл. почта: info@sileks.com
Стр. 3 из 6
3. Протокол выделения ДНК/РНК
Обязательно прочитайте перед началом работ!
Проверьте все буфера на предмет наличия осадка. Выпадение осадка не означает порчу буфера.
Если осадок образовался, подогрейте буфер до 50 °C до растворения осадка.
Буфера START, Lisys&Binding, Wash 1, Wash 2 должны тщательно встряхиваться перед внесением для образования суспензии.
Фраза "хорошо перемешанный буфер" далее по тексту означает, что буфер надо встряхнуть 5-10 раз.
Фраза "тщательно перемешать" далее по тексту означает, что раствор надо перемешать одним из следующих способов:
• ручным пипетированием (требуется не менее 20 пипетирований каждого образца для качественного суспендирования);
• используя компактный миксер LabMix Mini 201 (5 секунд на низкой или средней скорости).
Выделение ДНК/РНК из 100 μl плазмы или сыворотки
Лизис
1. Внесите 100 μl плазмы или сыворотки крови в пробирку на 1,5 ml.
2. Добавьте 130 μl хорошо перемешанного буфера START и тщательно перемешайте раствор.
3. Инкубируйте при комнатной температуре 5 минут.
Более длительная инкубация (до 15 минут) позволяет повысить выход ДНК/РНК.
4. В отдельной чистой пробирке смешайте следующие компоненты: 400 μl хорошо перемешанного буфера
Lysis&Binding и 5 μl хорошо перемешанных магнитных частиц MP@SiO2. Тщательно перемешайте эту смесь.
5. Добавьте приготовленную суспензию магнитных частиц в пробирку с лизированным образцом. Тщательно
перемешайте. Инкубируйте 5 минут при комн. темп. Дважды-трижды перемешайте во время инкубации.
6. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц (может потребоваться до 1 минуты).
Wash 1
7. Поместите пробирку в немагнитный штатив. Добавьте 600 μl хорошо перемешанного буфера Wash 1
Wash 2
Удалите супернатант. Будьте осторожны, чтобы не захватить магнитные частицы.
9. Поместите пробирку в немагнитный штатив. Добавьте 600 μl хорошо перемешанного буфера Wash 2
и тщательно перемешайте до получения гомогенной суспензии.
8. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц. Удалите супернатант.
и тщательно перемешайте до получения гомогенной суспензии.
10. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц. Удалите супернатант.
FinalWash
Wash 3
Если требуется получить экстрачистую ДНК/РНК, проведите дополнительную отмывку буфером Extra Wash
(не включён в набор, приобретается отдельно).
A. Добавьте 600 μl хорошо перемешанного буфера Extra Wash и тщательно перемешайте.
B. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц. Удалите супернатант.
11. Поместите пробирку в немагнитный штатив. Добавьте 600 μl буфера Wash 3 и тщательно
перемешайте до получения гомогенной суспензии.
12. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц. Удалите супернатант.
13. Поместите пробирку в немагнитный штатив. Добавьте 600 μl буфера FinalWash и тщательно
перемешайте до получения гомогенной суспензии.
Важно! На этой стадии (когда частицы находятся в буфере Final Wash) ДНК/РНК, связанная с
частицами, может храниться длительное время. Температура хранения может широко варьировать: от
комнатной (+20 °C) до +4 °C, -20 °C и -70 °C. Чем ниже температура, тем выше сохранность. По окончании
хранения протокол должен быть продолжен непосредственно со следующего шага.
14. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц. Удалите супернатант.
Элюция
15. Инкубируйте пробирку в термостате при 60 °C 10 минут, чтобы высушить осадок частиц.
16. Добавьте 50 μl буфера Elution. Тщательно ресуспендируйте частицы до получения гомогенной
суспензии. Если хотите получить бóльшую концентрацию ДНК/РНК, используйте 25 μl буфера
Elution вместо 50.
17. Инкубируйте в термостате при 60 °C 10-15 минут.
18. Поместите пробирку в магнитный штатив для сбора частиц. Перенесите ДНК/РНК-содержащий
супернатант в чистую пробирку.
Храните полученный раствор с выделенной нуклеиновой кистлотой при -20 °C.
Если Вашей целью было выделение РНК, рекомендуем добавить 1 μl РНазина сразу после завершения
выделения. Постановка обратной транскрипции должна быть проведена как можно скорее. РНК может
деградировать довольно быстро, снижая таким образом общую чувствительность метода.
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на магнитных частицах MP@SiO2
от 14 ноября 2014
ЗАО "Силекс" ● тел.: +7(495)7374224, +7(495)9984288 ● тел./факс: +7(495)7374224 ● эл. почта: info@sileks.com
Стр. 4 из 6
4. Возможные проблемы и их решение
Чистота выделенной нуклеиновой кислоты определяется спектрофотометрически соотношением оптических
плотностей при длине волны 260 и 280 нм. Соотношение OD260/OD280 должно быть в диапазоне 1,7 – 2,0.
Проблема
Низкий выход ДНК
Возможные причины
Решение
A. Состояние образца
1. В
образце
недостаточное
ДНК/РНК.
содержится 1. Возьмите больше исходного материала или
количество проводите элюцию в меньшее количество буфера
2. Образец долго хранился или 2. Проведите сбор материала повторно.
несколько
раз
подвергался
замораживанию-оттаиванию.
B. Неполное
высушивание Увеличьте время сушки после удаления буфера
частиц
перед
добавлением FinalWash.
элюирующего буфера
C. Неполный лизис
После внесения буфера START как можно тщательнее
суспендируйте образец.
D. Большой объем буфера Еlution
Подберите оптимальный объём буфера,
получить желаемую концентрацию ДНК/РНК.
Соотношение OD260/OD280 Примеси белка
слишком низкое
чтобы
1. В каждой процедуре, где используются частицы,
добивайтесь
максимально
тщательного
их
суспендирования.
2. Используйте меньшее количество
большее количество буфера Elution.
частиц
или
Нуклеиновая кислота на Старый образец, либо образец Проведите сбор материала повторно. Избегайте
электрофорезе выглядит подвергался
замораживания образца в процесс транспортировки и
деградировавшей
замораживанию-оттаиванию
хранения.
ВАЖНОЕ ПРИМЕЧАНИЕ
Качественное суспендирование частиц является ключевым моментом для
получения хорошего результата.
Для получения высоких выхода и чистоты ДНК/РНК необходимо тщательно
ресуспендировать частицы на каждом этапе отмывок.
Если требуется получить экстрачистую ДНК/РНК, проведите дополнительную отмывку
буфером Extra Wash (не включён в набор, приобретается отдельно). Отмывку им необходимо
провести после использования Wash 2 (см. протокол после шага №10).
Есть ещё вопросы?
Если у Вас есть вопросы или Вы нуждаетесь в консультации:
телефон:
+7 495 737 4224
+7 495 998 4288
эл. почта:
info@sileks.com
Не оставайтесь наедине со своими вопросами и сомнениями.
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на магнитных частицах MP@SiO2
от 14 ноября 2014
ЗАО "Силекс" ● тел.: +7(495)7374224, +7(495)9984288 ● тел./факс: +7(495)7374224 ● эл. почта: info@sileks.com
Стр. 5 из 6
5. Связанные продукты
Магнитные частицы с SiO2
1 мл, кат. номера K0171 и K0172
Ссылка на раздел на интернет-сайте:
http://www.sileks.ru/shortlink/MagBeads_SiO2
Малогабаритный лабораторный миксер LabMix Mini
Способен значительно ускорить процедуру выделения, полностью
заменяя ручное пипетирование в процессе перемешивания.
Существенно снижает расход пластика.
Ссылка на раздел на интернет-сайте:
http://www.sileks.ru/shortlink/LabMixMini
Магнитные штативы для работы с частицами
Магнитные штативы различных конструкций позволяют решать самые
разнообразные научные задачи с использованием магнитных частиц.
Ссылка на раздел на интернет-сайте:
http://www.sileks.ru/shortlink/MagRacks
Вы можете использовать эти QR-коды, чтобы напрямую попасть на соответствующий
раздел нашего сайта.
Выделение ДНК/РНК из плазмы и сыворотки на магнитных частицах MP@SiO2
от 14 ноября 2014
ЗАО "Силекс" ● тел.: +7(495)7374224, +7(495)9984288 ● тел./факс: +7(495)7374224 ● эл. почта: info@sileks.com
Стр. 6 из 6