Глава 4. Валидация методов обеспечения вирусной
advertisement
Глава 4. Валидация методов обеспечения вирусной безопасности: разработка, проведение и интерпретация результатов исследований по валидации методов инактивации и удаления вирусов СОДЕРЖАНИЕ 2 3 1. Введение 2 Источники контаминации вирусами 4 3. Процесс валидации 4 6 Выбор вирусов для валидации 8 5. Планирование валидационных исследований 9 6. Интерпретация данных 12 7. Ограничения валидационных исследований 15 8. Повторные исследования 18 Примечание 1: Статистическая оценка вирусных титров и коэффициентов снижения вирусной нагрузки и оценка их валидности 18 Примечание 2 Вычисление коэффициентов снижения 1 1. Введение 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 В настоящей Главе рассматривается необходимость и вклад валидационных исследований на вирусы по обеспечению вирусной безопасности биологических препаратов. Основная цель данной Главы заключается в представлении рекомендаций по планированию валидационного исследования, включая выбор используемых вирусов, и интерпретации полученных данных, особенно в отношении определения этапа процесса, который можно считать эффективным для инактивации и (или) элиминации вирусов. В данной Главе рассматривается валидация процедур инактивации и (или) элиминации вирусов из всех категорий биологических лекарственных препаратов для медицинского применения, за исключением живых вирусных вакцин (в том числе генно-инженерных живых векторов). Виды рассматриваемых препаратов: • препараты, получаемые при культивировании in vitro клеточных линий человеческого или животного происхождения, • препараты, получаемые при культивировании in vivo или из органов и тканей человека или животных, • препараты, полученные из крови или мочи, или других биологических жидкостей человека или животных. Риск вирусной контаминации характерен для всех биологических препаратов, производство которых предполагает использование материала животного или человеческого происхождения. Вирусная контаминация биологического препарата может быть обусловлена исходным материалом, например, банками клеток животного происхождения, кровью человека, тканями человека или животных; посторонние агенты могут быть привнесены в процесс производства, например, при использовании сыворотки животных при культивировании клеток. В прошлом ряд биологических препаратов, вводимых человеку, был контаминирован вирусами. В некоторых случаях вирус обнаруживался лишь спустя годы после ввода препарата в оборот, поскольку контаминация происходила до получения достаточных знаний о наличии инфекционных агентов. Основной причиной такой передачи вирусов была контаминация исходных материалов. Примерами служат: вакцина для профилактики желтой лихорадки, которая была контаминирована вирусом лейкоза птиц, который естественным образом инфицирует куриные яйца; вирус SV40 контаминировавший вакцины для профилактики полиомиелита и аденовирусной инфекции, производимые в 1950-е годы на первичных культурах клеток почек, взятых от макак-резусов, которые являются естественным резервуаром вируса SV40. Кроме того, вирусы, содержащиеся в плазме человека, например, ВИЧ и вирус гепатита C, контаминировали препараты крови; гормон роста человека, выделенный из гипофизов трупов, приводил к передаче приона, ответственного за развитие болезни Крейтцфельдта-Якоба. Контаминация биологического препарата может также происходить при использовании инфицированного материала в процессе производства или с вспомогательным веществом. Наиболее известным случаем является вакцина для профилактики желтой лихорадки, контаминированная вирусом гепатита B, содержавшегося в сыворотке человека, использованной в качестве стабилизатора в 1940-х годах. В целях контроля потенциальной вирусной контаминации биологических препаратов можно использовать три основных взаимодополняющих подхода: 2 отбор и испытание исходных материалов на предмет отсутствия обнаруживаемых вирусов, (ii) испытание способности производственных процессов элиминировать или инактивировать вирусы, (iii) испытание препарата на соответствующих этапах производства на предмет отсутствия обнаруживаемых вирусов. Ни один из подходов сам по себе не дает достаточной гарантии, поэтому в целях ее достижения необходимо использовать их комбинацию. Испытание исходных материалов является обязательным условием минимизации вирусной контаминации. Испытания могут обнаруживать один или более видов вирусов, однако ни одно отдельное испытание не способно подтвердить присутствие всех известных вирусов. Более того, в целях получения положительного результата любые аналитические системы требуют некоторой минимальной вирусной контаминации, испытания также ограничены статистическими погрешностями при отборе проб. Некоторые испытания, например, на антитела к вирусному гепатиту C в плазме человека, способны измерять маркеры инфекции, которые появляются спустя некоторое время после инфицирования. Аналогичные соображения справедливы и в отношении испытания лекарственного препарата. В связи с этим, подтверждение отсутствия в биологическом лекарственном препарате инфекционных вирусов во многих случаях происходит не только за счет прямого испытания на их наличие, но также путем подтверждения того, что процесс производства способен элиминировать или инактивировать их. Валидация процесса инактивации и (или) элиминации вирусов может играть ключевую роль в установлении безопасности биологических препаратов, особенно при высокой вероятности контаминации исходного материала и сырья патогенными для человека вирусами, например, препаратов, полученных из плазмы. Кроме того, поскольку во многих случаях в прошлом происходила контаминация агентами, о которой не было известно, и даже отсутствовали подозрения о такой возможности на момент производства, оценка процесса может дать определенную уверенность в том, что широкий спектр вирусов (включая неизвестные опасные вирусы) подвергается элиминации. Целью настоящей Главы является представление общих принципов проведения валидационных исследований и вирусологического подхода, который необходимо использовать при планировании валидационных исследований на вирусную нагрузку. Производители должны использовать правила, содержащиеся в настоящей Главе в отношении конкретного препарата, принимая во внимание свойства исходного материала и сырья, используемых при производстве и процедурах очистки, а также любые другие факторы, которые могут влиять на этот аспект безопасности. Производители должны объяснить и обосновать подход, использованный ими в исследованиях по оценке элиминации вирусов в регистрационном досье. (i) 1.6 1.7 1.8 2. Источники вирусной контаминации Вирусная контаминация биологических препаратов может быть обусловлена следующим: 2.1 Исходный материал и сырье могут быть контаминированы вирусами, инфицирующими вид животных, являющийся источником материала или сырья. Кровь может содержать различные вирусы, и применение препаратов, полученных из плазмы человека, приводило к инфицированию вирусами гепатитов B и C, ВИЧ, парвовирусом B19 и иногда вирусом гепатита A. Мышиные вирусы, некоторые из которых патогенны для человека, могут контаминировать мышиные гибридомы. 3 2.2 2.3 2.4 2.5 Клеточные линии, предназначенные для осуществления генетической манипуляции, могут быть контаминированы вирусами, в связи с чем необходимо внимательно подходить к их выбору и проводить испытания на предмет отсутствия обнаруживаемых посторонних агентов еще до генетической манипуляции, чтобы начать работу с должным образом охарактеризованной клеточной линией. Клетки могут быть источником латентной или персистирующей инфекции, например, вирусом герпеса или ретровирусом, которые могут передаваться вертикально от одного поколения клеток к следующему в виде вирусного генома, и который может периодически экспрессироваться в качестве инфекционного вируса. При создании производственной клеточной линии может быть привнесен контаминирующий вирус, характерный для других видов животных, например, трансформированная вирусом Эпштейна-Барр лимфобластоидная клеточная линия человека, секретирующая моноклональные антитела, может быть инфицирована мышиным ретровирусом после слияния с клетками миеломы мышей. Посторонние вирусы могут быть привнесены при использовании в процессе производства контаминированных животных продуктов, например, клеточные культуры могут быть контаминированы бычьими вирусами вследствие использования бычьей сыворотки, или мышиные моноклональные антитела, используемые в аффинной хроматографии, могут контаминировать препарат вирусами мышей. Возможны иные источники контаминации, например, производственный персонал или сырье небиологического происхождения. 3. Процесс валидации 3.1 3.2 3.3 Цель валидационных исследований по очистке от вирусов заключается в: (i) подтверждении того, что процесс производства эффективно инактивирует и (или) элиминирует вирусы, которые известны своей способностью контаминировать исходные материалы и сырье или вирусы, которые, предположительно, обладают такими свойствами, и (ii) непрямом подтверждении того, что процесс производства способен инактивировать и (или) элиминировать новые или непредвиденные вирусы. Это достигается за счет преднамеренного добавления (spiking) вируса к материалу, находящемуся на различных этапах производства, и измерения степени его элиминации или инактивации в ходе последующего этапа или этапов. Этот подход позволяет определить этапы производства, которые эффективны в обеспечении снижения содержания инфекционного вируса; он характеризует общую способность процесса элиминировать инфекционность контаминирующих вирусов. Валидационные исследования на вирусы, подобно прямому испытанию материалов на соответствующих этапах, вносят вклад в обеспечение вирусологической безопасности препарата. Вместе с тем, все валидационные исследования на вирусы следует рассматривать как некоторую приближенную оценку истинных возможностей процесса, поскольку проведение идеального валидационного исследования процесса может оказаться затруднительным в связи с вовлечением большого числа сложных переменных. Результаты свидетельствуют о том, что даже незначительные модификации в процедуре или определенном лабораторном штамме используемого вируса могут оказывать большое влияние на элиминацию и инактивацию вирусов. Если исходный материал или сырье недостаточно охарактеризованы, например, кровь, ткани и органы человека или животных, или если культивирование клеток осуществлялось в условиях in vivo, повышается вероятность вирусной контаминации, поэтому процесс производства, как правило, должен включать один 4 3.4 3.5 3.6 или несколько эффективных этапов инактивации и (или) элиминации вирусов. Препараты, полученные из плазмы, вызывают особые опасения в отношении вирусной безопасности; специальные рекомендации приведены в Главе ХХ настоящих Правил. Ранее полагали, что, если исходный материал (такой как полностью охарактеризованный банк клеток) представлял меньший вирусологический риск, процесс очистки, как правило, не включал специального этапа инактивации и (или) элиминации вирусов, и считали, что валидированный процесс очистки обеспечивал достаточную степень инактивации и (или) элиминации вирусов. Имеющийся клинический опыт не обнаружил какие-либо недостатки этого подхода. Однако некоторые производители моноклональных антител (mAbs) используют специальные этапы инактивации и (или) элиминации вирусов в процессе производства, поскольку клеточные линии-продуценты mAb мышиного происхождения выделяют различное количество потенциально инфекционных ретровирусов. Следует помнить, что системам культур клеток присуще поддержание репликации вирусов. В связи с этим, несмотря на то, что банк клеток хорошо охарактеризован, сохраняется риск вирусной контаминации культуры; имеются сообщения о единичных случаях контаминации посторонними вирусами. Обоснование проведения требуемых валидационных исследований и их объем зависят от процесса производства и типа препарата (например, вида животных, являющихся источником исходного материала, степени вариабельности исходного материала и сырья, стабильности активного продукта и т.д.). Достаточность исследований будет определяться в индивидуальном порядке. 4. Выбор вирусов для валидации 4.1 4.2 4.3 Вирусы для целей валидации должны, во-первых, как можно ближе по своей природе к вирусам, которые могут контаминировать препарат, а, во-вторых, обладать как можно более широким диапазоном физико-химических свойств, чтобы определить способность системы элиминировать вирусы в целом. В большинстве валидационных исследований используются штаммы вирусов, которые легко получить и количественно определить. Различные лабораторные штаммы вирусов могут обладать отличными друг от друга, а также от естественно встречающихся вирусов свойствами. Следовательно, любой вирус, использованный в валидационном исследовании, является, фактически, «модельным» вирусом. Производитель должен обосновать выбор вирусов в соответствии с целями валидационного исследованиями и принципами, изложенными в настоящей Главе. В случае, когда два сходных вируса можно использовать для валидационых исследований из-за их большого сходства с возможными контаминантами либо изза сходства их свойств, следует использовать более резистентный вирус, если не обосновано иное. Примеры выбора вирусов: (i) Концентраты факторов свертывания, полученные из плазмы человека, подвергались контаминации ВИЧ. В связи с этим процесс производства подобных материалов необходимо оценить на его способность инактивировать и (или) элиминировать инфекционный ВИЧ. (ii) Клеточные линии, полученные от грызунов, как правило, содержат эндогенные ретровирусные частицы, которые могут быть инфекционными (частицы C-типа) или неинфекционными (частицы A-типа). Если исходный материал или сырье получают из клеточных линий грызунов, процесс производства необходимо оценить на его способность инактивировать и 5 4.4 4.5 (или) элиминировать один из близкородственных лабораторных ретровирусов мышей. (iii) Примерами вирусов, обладающих широким диапазоном физико-химических свойств, использованных для оценки общей способности процесса элиминировать вирусную инфекционность, являются: a) SV40, полиовирус и парвовирус животных – в качестве небольших безоболочечных вирусов, b) парагрипп или мышиный ретровирус – в качестве крупных оболочечных РНК-вирусов, c) герпесвирус – в качестве крупного ДНК-вируса. Примеры вирусов, использованных в прошедших валидационных исследованиях, приведены в таблице 1. Однако поскольку эти вирусы и вирусы, описанные выше, являются исключительно примерами, их использование не является обязательным, поэтому производители могут использовать другие вирусы, особенно более подходящие для конкретных процессов. Более подробные рекомендации по выбору вирусов в целях валидации процессов производства препаратов из плазмы приведены в Главе ХХ (это глава по плазме!!!!) настоящих Правил. Необходимо располагать эффективным, чувствительным и надежным методом количественного определения инфекционности использованных вирусов. Предпочтительно использовать вирусы, которые можно получить в высоком титре, однако это не всегда достижимо. Препараты, получаемые из овечьих, козьих и бычьих тканей, могут быть контаминированы агентами трансмиссивной губчатой энцефалопатии, такими как скрейпи, которые накапливаются в центральной нервной системе и лимфоидной ткани. Эти агенты являются предметом соответствующей статьи (монографии) Фармакопеи Союза и отдельной главы настоящих правил. 5. Планирование валидационных исследований 5.1. Валидационные исследования включают преднамеренное внесение вируса на различных этапах производства и измерение полноты его удаления/инактивации в течение последующего этапа или этапов. Нет необходимости в валидации каждого отдельного этапа процесса производства. Валидационному исследованию следует подвергать только этапы, которые могут способствовать инактивации/удалению вируса. 5.2. Ограничения, накладываемые стандартами Надлежащей производственной практики (GMP), не допускают намеренного внесения вирусов в зону производства. Следовательно, валидацию следует проводить в отдельной лаборатории, оборудованной для вирусологических исследований при производстве в уменьшенном масштабе. Исследования должен выполнять персонал с вирусологическим опытом работы в сфере биоинженерии. Испытания следует проводить в соответствии с принципами Надлежащей лабораторной практики (GLP). 5.3. Сопоставимость модельного и полномасштабного процессов – обязательное условие, при выполнении которого могут быть приняты результаты оценки вирусной безопасности продукта, полученные при производстве в уменьшенном масштабе. Следовательно, необходимо продемонстрировать валидность уменьшения масштаба производства, сравнивая такие параметры процесса, как pH, температура, концентрация белка и других компонентов, время реакции, высота столба наполнителя в колонке для аффинной хроматографии, линейная скорость потока, отношение скорости потока к высоте столба наполнителя в колонке, профиль элюции и эффективность этапа (например, выход, 6 баланс, специфическая активность, состав). Следует обсудить возможное влияние на результаты оценки отклонений, которых не удалось избежать. 5.4. По возможности следует показать, чем обусловлено снижение инфекционности вируса – его инактивацией или удалением вирусных частиц. Это можно достичь, установив кинетику потери инфекционности и/или ее баланс, в соответствии с обстоятельствами. Процессы, снижающие инфекционность вирусов посредством инактивации, потенциально легче моделировать, чем процессы, в ходе которых происходит физическое удаление вирусных частиц. На этапе инактивации вирусов следует изучить кинетику инактивации, и полученные данные нужно включить в отчеты как в табличной, так и в графической форме. Если инактивация происходит слишком быстро, чтобы можно было определить ее кинетику, используя условия процесса, в дальнейших исследованиях нужно показать, что потеря инфекционности действительно вызвана инактивацией. Таким образом, следует ввести необходимые механизмы контроля для определения возможного влияния образца или матрицы, в которую вносится образец, на анализ и установить пределы обнаружения. 5.5. Следует исследовать производственные параметры, влияющие на эффективность этапа инактивации/удаления вирусов, и использовать полученные результаты при установлении соответствующих внутрипроизводственных пределов. В число критически важных параметров входят: • механические параметры, например, скорость потока, скорость перемешивания, размеры колонки, повторное использование колонки и т. д. • физико-химические параметры, например, содержание белка, pH, температура, влажность и т. д. 5.6. Антитела, присутствующие в исходном материале, могут влиять на поведение вируса на этапах разрушения или инактивации. Это следует учитывать при проведении валидационных исследований. 5.7. Валидность достигаемого логарифмического снижения устанавливается по результатам исследования воздействия изменчивости важных параметров процесса, используемых для установления внутрипроизводственных пределов. 5.8. Опубликованные работы, касающиеся способности сходных или общих процессов инактивировать/удалять вирусы, могут помочь в определении потенциально эффективных этапов. Тем не менее, изменения валидационных исследований, возникающие из необходимости моделировать процесс, выбирать используемые вирусы и применять в рамках лаборатории параметры полномасштабного производства, означает, что данные по валидации должны базироваться на экспериментальных исследованиях. 5.9. Количество вируса, добавляемого к исходному материалу для исследования этапа производства, должно быть как можно больше, чтобы определить возможность исследуемого этапа эффективно инактивировать/удалять вирусы. Тем не менее нужно внести такое количество вируса, чтобы состав материала существенно не изменился (обычно объем вносимого вируса не должен превышать 10%). По возможности, подсчитываемые критерии снижения должны быть основаны на особенностях вируса, который может быть обнаружен в исходном материале после внесения вируса, а не на количестве добавляемого вируса. 5.10. По возможности, вирус в образцах из модельных экспериментов должен быть раститрован без дальнейших манипуляций, таких как ультрацентрифугирование, диализ или хранение. Если требуются дальнейшие действия, например, чтобы удалить ингибиторы или токсичные вещества, или требуется хранение в течение некоторого времени, чтобы все образцы были раститрованы вместе, следует использовать соответствующие контроли, чтобы 7 определить, какое воздействие оказывают эти методики на результат исследования. Воздействие образца на систему детектирования, включая токсическое действие, следует фиксировать, поскольку это влияет на пределы обнаружения. 5.11. Количественный анализ инфекционности следует проводить согласно принципам Надлежащей лабораторной практики (GLP); он может включать метод образования стерильного пятна, выявление других цитопатических эффектов, таких как формирование синцития или клеточного агрегата, титрование до конечной точки (например, исследования по определению цитопатической дозы 50% (ЦПД)), выявление синтеза вирусного антигена или другие методы. Метод должен иметь необходимую чувствительность и воспроизводимость и должен проводиться с достаточным числом повторов и контролей для обеспечения статистической достоверности результата (см. Примечание 1). 5.12. Методы амплификации нуклеиновых кислот, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляют собой перспективный подход, обеспечивающий высокую чувствительность при выявлении вирусных геномов. Этот подход способен обнаруживать вирусы гепатитов B и C, которые нельзя вырастить на культурах клеток. Тем не менее, важное ограничение технологии состоит в невозможности полностью дифференцировать инактивированный вирус от интактного, что приведет к недооценке степени инактивации вируса, достигнутой в ходе потенциально эффективного этапа. С другой стороны, ПЦР может оказаться полезной при исследовании процессов, зависящих от удаления вирусов. Использование этой технологии связано с большими проблемами при количественном определении, стандартизации, контроле качества и интерпретации результатов. Валидация и стандартизация этих исследований должна быть ясно продемонстрирована прежде, чем они будут приняты. Особую осторожность следует проявлять при толковании как положительных, так и отрицательных результатов. 5.13. Следует предоставить гарантию, что любой вирус, потенциально накапливающийся в производственной системе, будет эффективно разрушен до следующего применения системы, например, путем санации колонок и т. д. 6. Интерпретация данных 6.1. При оценке эффективности этапа инактивации/удаления вирусов следует рассматривать комбинацию факторов. Оценка этапа, основанная исключительно на количестве инактивированного/удаленного вируса, может привести к заключению, что если процесс удовлетворит определенным уровням снижения количества вируса, безопасность препарата будет обеспечена. Однако это не всегда так. Перечисленные ниже факторы помогают определять эффективность этапа и в каждом случае данные следует тщательно оценивать: (i) Приемлемость вирусов, используемых в испытаниях (см. Раздел 4). (ii) Планирование валидационных исследований (см. Раздел 5). (iii) Достижение снижения на уровне log, логарифмическое снижение порядка 4 log10 или более говорят о явном влиянии на конкретный тестируемый вирус. Однако следует подчеркнуть, что логарифмическое снижение количества вируса нельзя использовать в качестве единственного абсолютного показателя эффективности этапа. (iv) Кинетика инактивации. Она указывает, является ли измеренное логарифмическое снижение консервативной оценкой. Инактивация вируса – обычно не просто реакция первого порядка и часто имеет начальную фазу, за которой следует более медленная фаза. Тем не менее резкое снижение скорости инактивации со временем может свидетельствовать о потере эффективности инактивирующего агента или о том, что оставшаяся часть вируса резистентна в 8 отношении инактивирующего агента. Это означает, что этап инактивации не является ни высоко эффективным, ни стабильным. (v) Способ инактивации/удаления и его селективность в отношении определенных классов вирусов. Этап процесса может быть высокоэффективным в отношении одних вирусов, но неэффективным в отношении других. Например, обработка сольвентом/детергентом эффективна в отношении вирусов, имеющих липидную оболочку, но не для вирусов, у которых эта оболочка отсутствует. (vi) Чувствительность инактивации/удаления вирусов к незначительным изменениям параметров процесса влияет на степень достоверности результатов, получаемых на данном этапе. (vii) Пределы чувствительности испытания. Решение о том, может ли процесс считаться эффективным, умеренно эффективным или неэффективным в отношении инактивации/удаления вирусов основывается на комбинированной оценке перечисленных выше факторов. 6.2. Следующие примеры иллюстрируют некоторые из этих принципов, при этом ни один из них не является определяющим и всеобъемлющим: (i) Если на этапе процесса происходит 6-кратное логарифмическое снижение количества вируса, а затем его 4-кратное логарифмическое восстановление, этап нельзя назвать эффективным, хотя он может внести вклад в общий процесс удаления вирусов. (ii) Если на этапе процесса происходит 6-кратное логарифмическое снижение количества вируса, но из-за цитотоксичности препарата предел чувствительности испытания в препарате составляет 4 log, будет продемонстрировано лишь 2-кратное логарифмическое снижение, и такой этап процесса нельзя будет назвать эффективным. Однако фактически в ходе этапа может быть удалено значительно больше вируса, что может быть выявлено при использовании другой схемы эксперимента. (iii) При 6-кратном логарифмическом снижении количества вируса на этапе процесса, а затем 2-кратном логарифмическом восстановлении удаляется значительное количество вируса. Препарат не является вирусологически стерильным. Тем не менее, если это снижение воспроизводимо и на него не влияют изменения параметров процесса, этап обладает некоторой эффективностью. Этот этап делает вклад в общее снижение вирусной нагрузки и может считаться частично эффективным. (iv) 6-кратное логарифмическое снижение количества вируса и отсутствие вирусов в препарате при выявлении их с пределом чувствительности порядка 2 log свидетельствует о 4-кратном логарифмическом снижении количества вируса. Это существенный показатель, а фактически в ходе этапа могло быть удалено значительно больше вируса, чем можно определить количественно. (v) Если вирус инактивирован, важно знать кинетику снижения его инфекционности. Если этап процесса предполагает длительную инкубацию, например подогрев в течение 10 часов, а инфекционность быстро достигает пределов обнаружения, процесс, вероятно, имеет более высокий вироцидный эффект, чем можно продемонстрировать посредством используемой методики. С другой стороны, если инфекционность снижается медленно и достигает пределов обнаружения к концу периода обработки, такой этап дает меньше уверенности в вирусной безопасности. 6.3. В целом процессы разделения не считаются эффективными этапами удаления вирусов, хотя признается, что они могут вносить вклад в удаление вирусов. Процессы разделения обычно имеют ряд переменных, которые трудно 9 контролировать и масштаб которых часто трудно уменьшить при проведении валидации. Кроме того, разделение зависит от чрезвычайно специфичных физикохимических свойств вируса, влияющих на его взаимодействие с гелевыми матрицами, и преципитационных свойств. Таким образом, для отделения модельного вируса могут потребоваться совершенно другие подходы, чем для отделения целевого вируса, что может быть обусловлено относительно малыми различиями поверхностных свойств этих вирусов, например, гликолизирования. Даже релевантный вирус, размножаемый в лаборатории, в этом отношении может действовать отлично от «дикого». Тем не менее, если разделение дает воспроизводимое снижение вирусной нагрузки, если производственные параметры, влияющие на разделение, можно должным образом определить и проконтролировать и если целевая фракция может быть надежно отделена от фракции, предположительно содержащей вирусы, тогда процесс может удовлетворить критериям эффективного этапа. 6.4. Цель валидации – выявить этапы, эффективные при инактивации/удалении вирусов, и оценить общую способность производственного процесса их инактивировать/удалять. Общий коэффициент снижения обычно выражается как сумма отдельных коэффициентов (см. Приложение II). Тем не менее простое суммирование отдельных низких коэффициентов снижения может ввести в заблуждение. Снижение титра вируса порядка 1 log и ниже считается ненадежным из-за ограничений исследований по валидации методов обеспечения вирусной безопасности и его не следует учитывать. Производителям следует отличать эффективные этапы снижения вирусной нагрузки от этапов процесса, которые могут внести вклад в удаление вирусов, но на которые можно полагаться с меньшей уверенностью. Также следует рассмотреть вопрос о том, окажется ли вирус, выживший на одном этапе, более устойчивым к следующему этапу обработки или, наоборот, станет более чувствительным. В большинстве случаев единственный высокоэффективный этап дает значительно большую уверенность в вирусной безопасности продукта, чем несколько этапов, имеющих такой же общий эффект. 6.5. Если в ходе процесса производства достигается небольшое снижение количества вирусов, а удаление вируса рассматривается как основной фактор для безопасности препарата, следует ввести особый дополнительный этап (этапы) инактивации/удаления вирусов. 6.6. Для всех вирусов производителям следует обосновать приемлемость полученных критериев снижения. Результаты следует рассматривать в каждом конкретном случае. 6.7. Нужно строго соблюдать принцип GMP, состоящий в том, что материал, прошедший эффективный этап инактивации/удаления вирусов, следует отделять от необработанного материала. 7. Ограничения валидационных исследований Валидационные исследования помогают подтвердить приемлемый уровень безопасности готового продукта, но сами по себе безопасность они не обеспечивают. Ряд факторов при планировании и выполнении валидационных исследований по вирусной безопасности могут привести к неточной оценке способности процесса удалять инфекционность вирусов природного происхождения. Эти факторы включают нижеперечисленные пункты. 7.1. Опыт показал, что чувствительность к одному и тому же воздействию разных лабораторных штаммов вируса может различаться. Именно поэтому определенный выбранный вирус может не соответствовать вирусу, для которого он был выбран в качестве модельного. Нативные вирусы могут иметь неизвестные свойства, например, могут иметь липидную оболочку, способную изменять их 10 свойства. Вирусные препараты, используемые для валидации производственного процесса, обычно производят в культуре тканей. Поведение вируса в культуре тканей на этапе производства может отличаться от поведения нативного вируса, например, если нативный и культивированный вирусы отличаются по чистоте или степени агрегации. Данные по штаммам вируса, их культивированию и исследованию, а также данные по отбору проб и по хранению должны быть документально оформлены. 7.2. В некоторых ситуациях невозможно применить логарифмические снижения. Например, если матрица способна адсорбировать только 104 инфекционных единиц вируса, а большие количества вируса со сравнимой аффинностью адсорбировать не может, она удалит все вирусы, если их содержание в образце не превышает 104 инфекционных единиц, но только 1% вируса при содержании в образце 106 инфекционных единиц. Именно поэтому измеренное удаление вируса может отличаться от рассматриваемого титра. 7.3. График инактивации вирусной инфективности часто выглядит как двухфазная кривая, на которой за быстрой начальной фазой следует более медленная фаза. Вирус, не инактивированный на первом этапе, может оказаться более резистентным к последующим этапам инактивации. Следовательно, общий коэффициент снижения необязательно представляет сумму коэффициентов снижения, подсчитанных для каждого отдельного этапа, на котором вносится новая порция вируса. Например, если резистентная фракция представлена вирусными агрегатами, их инфекционность может быть устойчива к ряду химических воздействий и нагреву. 7.4. Испытания в уменьшенном масштабе, скорее всего, отличаются от полномасштабного производства, несмотря на усилия, предпринимаемые при разработке процесса в уменьшенном масштабе. 7.5. Присутствие антител к нативному вирусу может негативно влиять на его отделение или его чувствительность к химической инактивации. Такие антитела могут затруднить планирование исследования за счет нейтрализации инфекционности вируса. Может быть сложно оценить пригодность схемы исследования. Уровень присутствующего антитела может считаться важной переменной процесса. 7.6. Небольшие различия в таких параметрах производства, как содержание белка или температура, могут привести к большим различиям в снижении инфекционности вируса с помощью какого бы то ни было механизма. 8. Повторные исследования 8.1. Изменения процесса производства могут потребовать нового валидационного исследования. 8.2. По мере накопления исследовательского опыта для сохранения приемлемого уровня процессов может потребоваться их повторное исследование. Примечание I СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВИРУСНЫХ ТИТРОВ И КОЭФФИЦИЕНТОВ СНИЖЕНИЯ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ И ОЦЕНКА ИХ ВАЛИДНОСТИ При титровании вирусов возникают проблемы вариабельности, общие для всех биопроб. Именно поэтому, чтобы определить надежность исследования, необходимо оценить точность титрования и коэффициентов снижения вирусной нагрузки, валидность анализов. Цель статистической оценки – установить, что исследование было выполнено на приемлемом уровне вирусологической компетентности. 1. Методы анализа могут быть либо квантильными (пробит-анализ), либо количественными. Квантильные методы включают оценку инфекционности при заражении животных или определение инфицирующей дозы для культуры тканей (TCID). При этом клетки животных или культивируемые клетки оценивают 11 как инфицированные или неинфицированные. Инфекционные титры при этом измеряют как долю инфицированных животных или культур. При использовании количественных методов измеряемая инфекционность при внесении вируса постоянно изменяется. К количественным методам относят метод образования бляшек (стерильных пятен), когда каждая подсчитанная бляшка соответствует одной инфекционной единице. Как квантильные, так и количественные анализы поддаются статистической оценке. 2. Вариабельность может возникнуть при проведении анализа как результат ошибок разведения, статистических эффектов и различий в системе анализа, которые либо неизвестны, либо их трудно контролировать. Представляется, что эти эффекты выражены сильнее при сравнении серии разных анализов (межаналитическая вариабельность), чем при сравнении результатов одного анализа (внутрианалитическая вариабельность). 3. 95% доверительный интервал для внутрианалитической вариабельности (в рамках одного анализа) и для межаналитической вариабельности обычно должен составлять ±0,5 log или лучше. Вариабельность между анализами можно отслеживать вводя внутрипроизводственный стандартный образец. Активность этого образца должна быть оценена в пределах примерно 0,5 log от среднего значения, установленного в лаборатории для анализа в качестве приемлемого. Внутрианалитическая вариабельность может быть оценена с помощью стандартных методов. В каждом отдельном эксперименте, если точность титрования меньше, чем эти целевые показатели, исследование все же можно считать приемлемым, если этому предоставлено обоснование. 4. Снижение вирусной нагрузки следует рассчитывать из экспериментально определенных титров вируса. По возможности следует стремиться достичь 95% доверительного интервала коэффициента снижения. Его можно приблизительно рассчитать по формуле: S 2 a 2 где ±s – 95% доверительный интервал для испытания на наличие вирусов исходного материала, а ±a – он же для анализа на вирусы материала после выполнения этапа. Если после этапа инактивирования/удаления вирусов выявить контаминацию в образцах не удается, коэффициент снижения не может быть оценен с помощью методов статистики. Чтобы оценить минимальный коэффициент снижения, за титр принимают значение ниже или равное одной инфекционной дозе в объеме при наибольшей испытываемой концентрации. После применения эффективных процессов инактивации можно ожидать, что никакие образцы не будут проявлять признаков инфекционности. Чтобы максимально повысить оцениваемый минимальный коэффициент снижения эффективного процесса инактивации, следует взять в образцы как можно больше обработанного неразбавленного материала. Примечание 2 ВЫЧИСЛЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТОВ СНИЖЕНИЯ Вычисление коэффициента снижения вирусной нагрузки R для отдельного этапа инактивации или удаления проводят по формуле: log V1×T1 R =-----------------V2×T2 где R – коэффициент снижения, V1 – объем исходного материала, T1 – концентрация вируса в исходном материале, V2 – объем материала после выполнения этапа, 12 T2 – концентрация вируса после выполнения этапа. Эта формула учитывает как титр, так и объем материала до и после этапа. Коэффициент снижения обычно выражают по логарифмической шкале. Это означает, что хотя остаточная вирусная инфекционность может быть сильно снижена, она никогда не снизится до нуля. В отношении методов стерилизации говорится о том, что надлежащими считаются процессы, обеспечивающие гарантированный уровень стерильности (SAL) в 10–6 или ниже для бактерий, плесеней и дрожжей. SAL=10–6 означает вероятность наличия не более одного жизнеспособного микроорганизма в 1×10–6 стерилизованных единицах готового препарата. 13
