АХМАТОВ Элвин Альтафович ДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕКСАСАХАРИДА, СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТУ ЦЕПИ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА
advertisement
На правах рукописи АХМАТОВ Элвин Альтафович ДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕКСАСАХАРИДА, СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТУ ЦЕПИ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА Streptococcus pneumoniae серотипа 14, НА АКТИВАЦИЮ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Курбатова Екатерина Алексеевна Официальные оппоненты: Калюжин Олег Витальевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии Института постдипломного образования Первого государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Пинегин Борис Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции Федерального государственного бюджетного учреждения «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Ведущая организация: Московский Федеральное научно-исследовательский бюджетное институт учреждение науки эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора Защита состоится «15» октября 2015 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, www.instmech.ru Автореферат разослан «_____» _______ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Яковлева Ирина Владимировна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Streptococcus pneumoniae является этиологическим фактором тяжелых бактериальных инфекций различной локализации у детей и взрослых [Харит С.М., 2011; Weinberger D.M. et al., 2010]. На основе химической структуры капсульного полисахарида (КП) идентифицировано более 90 серотипов пневмококка [Kamerling J.P., 2011], около 20 из которых вызывают до 90% заболеваний [Козлов Р.С. и др., 2011]. Показано, что в защите от пневмококковой инфекции основную роль играют антитела к КП и комплемент-опосредованный опсонофагоцитоз [Hyams C. et al., 2010]. Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции полисахаридными и конъюгированными вакцинами, защищающими от 80-90% клинически значимых серотипов пневмококка, привела к снижению заболеваемости во всех возрастных группах населения [Таточенко В.К., 2010; Белошицкий Г.В. и др., 2014; Hutchison B.G., et al., 1999; Leventer-Roberts M. et al., 2015]. Разработка пневмококковых вакцин третьего поколения на основе синтетических олигосахаридов, соответствующих фрагментам цепи S.pneumoniae, является приоритетным направлением КП современной вакцинологии [Vliegenthart J.F.G., 2006; Safari D., et al., 2012; Deng S., et al., 2014]. Известная структура углеводных лигандов позволяет точно определить олигосахаридные эпитопы, необходимые для индукции протективных антител [Anish C., et al., 2014]. Иммунный ответ на олигосахариды типоспецифичен, поэтому конъюгаты белков-носителей с некоторыми олигосахаридами рассматриваются в качестве потенциальных вакцин [Jansen W.T. et al., 2004]. В настоящем исследовании из трех впервые синтезированных в России (ФГБУ ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН) тетра-, гекса- и окта- олигосахаридов для углубленного иммунологического исследования выбран гексасахарид, соответствующий участку цепи КП S. pneumoniaе серотипа 14, клиническая __________________________________ Сокращения. КП - капсульный полисахарид, БСА – бычий сывороточный альбумин 1 значимость которого подтверждена в ряде эпидемиологических исследований [Jamal F., et al., 1987; McIntosh E.D., et al., 2007; Alexandre C., et al., 2010; Lin T.Y. et al., 2010; Jauneikaitea E. et al., 2013]. Гексасахарид является наиболее перспективным для исследования, так как содержит в своем составе помимо тетрасахаридного повторяющегося звена еще два дополнительных моносахарида и в большей степени соответствует химическому строению бактериального КП S. pneumoniae серотипа 14. Это позволило нам моделировать в эксперименте иммунный ответ, сходный с действием пневмококковых вакцин на основе КП, и исследовать его особенности. Показано, что синтетические аналоги фрагментов цепи КП S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированные с белком-носителем, вызывают Т-зависимый ответ, переключение синтеза антител с IgM на IgG, созревание аффинности антител, продукцию специфических IgG-антител к углеводной составляющей конъюгата и формирование иммунологической памяти [Safari D. et al., 2008]. В то же время остается неизученным действие синтетических олигосахаридов, в том числе гексасахарида, на активацию эффекторов системы врожденного иммунитета; отсутствуют данные о протективной активности конъюгированных олигосахаридов в опытах активной защиты животных от заражения и превентивных свойствах олигосахарид-специфических антител; не исследовано их влияние на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей. Всё это определило цель и задачи настоящего исследования. Цель. Изучение действия синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированного с белком-носителем, на активацию эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета. Задачи исследования 1. Дать оценку антигенной активности гексасахарида в сравнении с тетраи октасахаридом в ИФА. 2. Определить активность основных факторов системы врожденного иммунитета под влиянием конъюгированного с БСА гексасахарида (экспрессия 2 TLRs, созревание дендритных клеток, уровень продукции цитокинов in vitro и in vivo, бактерицидная активность сыворотки крови). 3. Оценить влияние конъюгированного гексасахарида на субпопуляционную структуру лимфоцитов селезенки мышей. 4. Определить особенности формирования гуморального иммунного ответа при иммунизации мышей конъюгированным гексасахаридом (продукция IgG-антител, опсонизирующие и превентивные свойства сыворотки крови). 5. Исследовать протективную активность конъюгированного гексасахарида при моделировании у мышей генерализованной инфекции, вызванной S. pneumoniae серотипа 14. Научная новизна Гексасахарид - синтетический аналог фрагмента цепи капсульного полисахарида ингибировал S. pneumoniae IgG-антитела в серотипа 14, конъюгированный антимикробной кроличьей с БСА, сыворотке и характеризовался равнозначной антигенной активностью с конъюгированными тетра-, октасахаридом и бактериальным капсульным полисахаридом (ингибирование ИФА 71-75%). Впервые на примере разветвленного гексасахарида β-D-Gal-(1→4)-β- D-Glc-(1→6)-[β-D-Gal-(1→4)]-β-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Glc продемонстрировано стимулирующее действие синтетических олигосахаридов на ряд показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа. Система врожденного иммунитета. Иммунизация мышей конъюгатом БСА с гексасахаридом увеличивала количество TLR2-экспрессирующих клеток в селезенке при отсутствии лиганд-рецепторного взаимодействия с клетками THP1-XBlue™-CD14; стимулировала in vitro появление в среде культивирования зрелых дендритных клеток с фенотипом CD11с+, СD80+, МНС II+ и цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNFα); обеспечивала повышение содержания в сыворотке крови мышей IL-1β, IL-10, IFN-γ и TNFα; приводила к усилению бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови животных. Гидроксид алюминия, выбранный 3 в качестве адъюванта для конъюгированного гексасахарида, способствовал повышению всех показателей функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета мышей, в том числе, TLR2-экспонирующих клеток в селезенке; зрелых дендритных клеток с фенотипом CD11с+, СD80+, CD83+, МНС II+, продуцирующих цитокины (особенно интенсивно IL-1β); сывороточных цитокинов (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, GM-CSF, IFN-γ, TNFα); бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови животных. Система адаптивного иммунитета. Впервые показано, что конъюгированный гексасахарид, сорбированный на гидроксиде алюминия, при двукратной иммунизации мышей оказывал стимулирующее влияние на образование преимущественно специфических IgG1-антител с формированием иммунологической памяти. Впервые установлено, что на фоне высокого уровня IgG-антител к гексасахариду в селезенке мышей сохранялся нормальный уровень CD4+ Тклеток при снижении числа CD8+ Т-лимфоцитов, что увеличивало иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) с 1,92 до 3,62. Количество Влимфоцитов (CD5+ экспрессирующих и CD19+), молекулы NK-клеток и класса II, MHC активированных достоверно клеток, превышало соответствующие показатели у интактных животных. Впервые продемонстрировано, что поствакцинальные антитела к гексасахариду обладали способностью связывать бактериальный капсульный полисахарид, а иммунная сыворотка мышей стимулировала фагоцитоз инактивированных бактерий S. pneumoniae серотипа 14 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных животных и защищала мышей от пневмококковой инфекции, вызванной серотипом 14. Впервые экспериментально доказано, что активная иммунизация мышей конъюгированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия, защищала животных от заражения S. pneumoniae серотипа 14. При этом степень защиты была сопоставима с протективной активностью конъюгированного бактериального капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14. 4 Практическая значимость Предложенный в работе дизайн иммунологического функциональной активности синтетического исследования гексасахарида может быть использован для оценки качества других синтетических олигосахаридов пневмококка и разрабатываемых синтетических вакцин. На основе синтетического гексасахарида может быть разработана высокоспецифичная ИФА тест-система, предназначенная для определения напряженности гуморального иммунного ответа к S. pneumoniae серотипа 14 у привитых пневмококковыми вакцинами, оценки формирования постинфекционного иммунного ответа, мониторинга уровня антител к капсульному полисахариду этого серотипа пневмококка в различных популяционных группах населения, а также оценки антигенной активности бактериальных капсульных полисахаридов S. pneumoniae серотипа 14 в лабораторных и производственных условиях. Сыворотки крови, полученные при иммунизации животных конъюгированным гексасахаридом, могут быть использованы в лабораторных условиях для типирования штаммов S. pneumoniae серотипа 14. Синтетический гексасахарид, конъюгированный с лицензированным белком-носителем, например, с CRM197, можно рассматривать в качестве кандидата для конструирования пневмококковой вакцины против S. pneumoniae серотипа 14, а также для получения лечебных сывороток, иммуноглобулинов и моноклональных антител к данному серотипу пневмококка. Реализация результатов исследования. Материалы диссертации используются в цикле лекций кафедры эпидемиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и кафедры эпидемиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 16 Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям, 2-5 апреля 2014 г. (г. Кейптаун, Южная Африка); 9 5 Международном симпозиуме по пневмококкам и пневмококковым заболеваниями, 9-13 марта 2014 г. (г. Хидерабад, Индия). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова «18» марта 2015 г. Протокол № 2. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №11-0401187-а «Исследование иммунобиологических свойств олигосахаридов, отвечающих фрагментам капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 14, для разработки подходов к синтезу гликоконъюгатной пневмококковой вакцины» (2011-2013 гг.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 2 – в материалах международных конференций, 1 – в электронном ресурсе. Структура и объём работы. Материал диссертации изложен на 135 страницах, проиллюстрирован 13 таблицами, 1 схемой и 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, алгоритма оценки иммунологической активности синтетических олигосахариидов и списка литературы, содержащего 189 источников (их них – 20 отечественных и 169 зарубежных авторов). Основные положения, выносимые на защиту: 1. Синтетический гексасахарид, конъюгированный с БСА, активирует ключевые эффекторы врожденного иммунитета: повышает уровень TLR2позитивных клеток селезенки, вызывает созревание дендритных клеток, стимулирует продукцию цитокинов, увеличивает бактерицидную активность сыворотки крови. 2. Гексасахарид, конъюгированный с БСА, после двукратной иммунизации мышей в присутствии гидроксида алюминия повышает количество Влимфоцитов и естественных клеток-киллеров в селезенке мышей, приводит к продукции опсонизирующих IgG-антител, формированию иммунологической памяти и защищает животных от заражения S. pneumoniae серотипа 14. 6 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Синтетические олигосахариды, соответствующие фрагментам цепи КП S. pneumoniae серотипа 14 (Рис. 1), синтезированы в лаборатории химии гликоконъюгатов ФГБУ «Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского» РАН под руководством члена-корреспондента РАН, д.х.н., профессора Н.Э.Нифантьева [Сухова Е.В. и др., 2014]. Полученные олигосахариды конъюгировали с БСА скваратным методом. В соответствии с данными MALDI-TOF анализа тетрасахарид содержал 11 олигосахаридных остатков, ковалентно связанных с белком; гексасахарид – 15; октасахарид – 9. Содержание углеводов в препаратах составляло 10, 19 и 16% соответственно. Все олигосахариды содержали галактозный заместитель в боковой цепи и галактозный остаток на невосстанавливаемом конце. Тетрасахарид Гексасахарид Октасахарид Рис. 1. Олигосахаридные синтетические аналоги фрагментов цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14. 7 Синтетический капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 получен методом поликонденсации [Нифантьев Н.Э. и др.,1987; Kochetkov N.K. et al., 1987]. Бактериальный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 получен в лаборатории иммунохимической диагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова под руководством д.м.н., профессора Н.Е. Ястребовой и к.м.н. Н.П. Ванеевой [Ванеева Н.П. и др., 2012]. Также в работе использовали пневмококковые вакцины, содержащие в своем составе КП S. pneumoniae серотипа 14: полисахаридную - Пневмо-23 (фирма “Sanofi-Pasteur”, Франция), не содержащую адъюванта, и конъюгированную - Превенар-13 (фирма “Pfizer”, США), сорбированную на фосфате алюминия, в качестве белка-носителя в которой использован рекомбинантный дифтерийный анатоксин (CRM197). Лабораторные животные. Мыши линий СВА самки и BALB/c самцы массой 14-16 г, полученные из питомника НЦ биомедицинских технологий, филиал «Андреевка». Антимикробные мышиные сыворотки к S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 14, 19А, 19F и 23F получали при иммунизации мышей возрастающими дозами живых микробных клеток [Курбатова Е.А. и др., 2013]. Сыворотку кроликов получали при многократном введении животным инактивированных микробных клеток S. pneumoniae серотипа 14 (лаборатория иммунохимической диагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова). Титры IgG-антител к олигосахаридам и КП S. pneumoniae типа 14 определяли с помощью твердофазного ИФА, в том числе с использованием биотинилированных конъюгатов исследуемых олигосахаридов, сорбированных на стрептавидиновых плашках “Pierce”, (фирма “Thermo Scientific”, США). Экспрессию TLRs определяли двумя методами. В первом случае оценивали лиганд-рецепторное взаимодействие гексасахарида с клетками моноцитарной клеточной линии THP1-XBlue™-CD14 (фирма “Invivogen”, США), экспрессирующей различные патоген-распознающие рецепторы (ФГБУ 8 «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, заведующий лабораторией микробиологии, д.б.н. Д.Ю. Логунов). Во втором случае уровни экспрессии TLR2 и TLR4 определяли на мононуклеарных лейкоцитах селезенки иммунизированных мышей методом проточной цитофлуорометрии. Фенотип дендритных клеток, мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей, продукцию цитокинов, опсонофагоцитарную и бактерицидную активность сыворотки мышей определяли методом проточной цитофлуорометрии. Протективная активность. Мышей иммунизировали конъюгированным гексасахаридом (с гидроксидом алюминия и без адъюванта) двукратно внутрибрюшинно в разовой дозе 10 мкг в расчете на углевод с интервалом 14 суток и заражали через две недели S. pneumoniae серотипа 14. В качестве контроля использовали интактных животных, которых заражали той же дозой микробной культуры. Учитывали количество выживших мышей в опыте и контроле. Превентивные свойства сыворотки. Мышам однократно внутрибрюшинно вводили иммунную сыворотку (25 мкл), полученную от мышей, иммунизированных конъюгатом БСА с гексасахаридом (разовая доза 10 мкг/мышь по углеводу), сорбированным на гидроксиде алюминия. В качестве группы сравнения использовали мышей, которым вводили нативную сыворотку от неиммунизированных мышей. Для контроля заражающей дозы использовали интактных животных, оценивая количество выживших мышей во всех группах. Методы статистической обработки. При нормальном распределении показателей использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для независимых выборок с апостериорным анализом Tukey. При отсутствии нормального распределения применяли метод Манна-Уитни для независимых выборок и метод χ2. Статистически достоверными считали различия при р≤0,05. Программное обеспечение STATISTICA 8. 9 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Сравнительная характеристика антигенной активности синтетических олигосахаридов Антигенную активность конъюгированных тетра-, гекса- и октасахарида оценивали методом ингибирования ИФА при сорбции на планшете конъюгата БСА с гексасахаридом. Специфическая активность гексасахарида подтверждена по отсутствию положительных реакций с антимикробными сыворотками к другим серотипам пневмококка ( 6В, 10А, 19F, 19A и 23F). Установлено отсутствие различий в антигенной активности между конъюгированными тетра-, гекса- и октасахаридом, а также КП (бактериальным и синтетическим). Все препараты связывали специфические IgG-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке (ингибирование ИФА 71-80%). Эти показатели существенно отличались от отрицательного (р<0,05) и положительного контролей (БСА) (р<0,05) (Рис. 2). Рис. 2. Антигенная активность конъюгированных олигосахаридов. Примечание. Реакция ингибирования ИФА с использованием антимикробной кроличьей сыворотки к S. pneumoniae серотипа 14. ОП – оптическая плотность исходной сыворотки; ФСБ – фосфатно-солевой буфер К(-); БСА – К(+); синтКП – синтетический КП; бакКП – бактериальный КП. Концентрация всех препаратов 10 мкг/лунка. На твердой фазе сорбирован конъюгат БСА с гексасахаридом, 0,2 мкг/лунка. Данные представлены как M±SD. * - достоверность различий с К(-) и К(+). Тест Манна-Уитни. 10 Тетра-, гекса- и октасахарид, сорбированные на твердой фазе в составе биотинилированных конъюгатов, одинаково хорошо выявляли IgG1-антитела (Log10 - 3,4; 3,4 и 3,7 соответственно) в сыворотке крови мышей, иммунизированных КП S. pneumoniae серотипа 14 в составе коммерческой вакцины (Рис. 3А). При этом титр IgG1-гексасахарид-специфических антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных исследуемым гликоконъюгатом, был в 9 раз выше, чем у мышей, иммунизированных конъюгированным КП. Поствакцинальные гексасахарид-специфические антитела способностью связывать бактериальный КП, что доказано обладали в тесте ингибирования ИФА по снижению оптической плотности (ОП) сыворотки иммунизированных мышей на 76,5; 81,2 и 83,6% при добавлении к ней 0,25; 0,5 и 1 мкг бактериального КП в расчете на лунку соответственно (Рис. 3Б). Рис. 3. Титр IgG1 антител к олигосахаридам в иммунных сыворотках мышей (А); ингибирование гексахарид-специфических антител (Б). Примечание. Иммунные сыворотки получены на 14 сутки после двукратной иммунизации мышей КП, сорбированным на фосфате алюминия (1/2 человеческой дозы вакцины Превенар-13) и конъюгированным с БСА гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия (разовая иммунизирующая доза 10 мкг по углеводу на мышь). Для ингибирования ИФА использовали бактериальный КП. Титр антител представлен в Log10±SD. Достоверность различий в сопряженных группах и с К(-), * - p<0,05. Тест Манна-Уитни. Полученные данные показали, что конъюгированный гексасахарид характеризуется антигенной активностью и специфичностью, что послужило основанием для проведения дальнейших исследований по оценке его действия на активацию эффекторов врожденного и адаптивного иммунного ответа. 11 2. Активация врожденного иммунитета Иммунный ответ начинается с активации рецепторного аппарата клеток системы врожденного иммунитета, что в последующем определяет направленность, интенсивность и длительность адаптивного иммунного ответа. 2.1. Активация экспрессии Толл-подобных рецепторов В первом случае оценку способности гексасахарида активировать Толлподобные рецепторы (Toll-like receptors – TLRs) проводили in vitro с использованием моноцитарной клеточной линии THP1-XBlue-CD14, экспрессирующей различные патоген-распознающие рецепторы, включая TLRs. Во втором - определяли содержание TLR2- и TLR4-позитивных клеток в селезенке иммунизированных мышей методом проточной цитофлуорометрии. Синтетический гексасахарид (лиганд) вызывал повышение уровня экспрессии TLRs на клетках THP1-XBlue-CD14 по сравнению с контролем (К-) (p=0,049535), но значительно слабее по сравнению с положительными контролями (К+) (Рис. 4). То есть, специфического лиганд-рецепторного взаимодействия выявлено не было. Рис. 4. Лиганд-рецепторное взаимодействие гексасахарида патогенраспознающими рецепторами клеточной линии THP1-XBlue-CD14. с Примечание. Конъюгированный гексасахарид и лиганд гексасахрида, а также БСА использовали в концентрации 100 мкг/мл. (К+) - в концентрации 1 мкг/мл. К (-) – ФСБ. Данные представлены как M±SD. Достоверность различий в сопряженных группах, * p<0,05. Тест Манна-Уитни. 12 На 7 сутки после однократной и двукратной внутрибрюшинной иммунизации мышей несорбированным конъюгатом гексасахарида с БСА (далее, гликоконъюгат) и сорбированным на гидроксиде алюминия (далее, гликоконъюгат+AL) отмечали повышение содержания TLR2-позитивных клеток в селезенке мышей по сравнению с контролем (p<0,05) (табл. 1). Количество TLR4-экспрессирующих клеток при этом не изменялось. Таблица 1. Содержание TLR-экспрессирующих клеток в селезенке мышей Препарат для Количество TLR-экспрессирующих клеток на 7 иммунизации сутки после иммунизации, % однократно двукратно TLR2 TLR4 TLR2 TLR4 Гликоконъюгат 20,6±2,2* 4,3±0,4 13,3±1,2* 3,8±0,2 ) Гликоконъюгат + AL 26,7±3,0* 4,1±0,5 25,9±2,2* ** 4,4±0,4 AL 20,2±2,1* 9,7±0,6 50±4,4*)** 8,1±0,5 Контроль (интактные) 3,6±0,3 4,7±0,3 4,9±0,4 7,3±0,5 Примечание. Данные представлены как M±SD. Достоверность различий: * - с контролем; ** - между однократным и двукратным введениями, p <0,05. Тест Манна-Уитни. 2.2. Созревание дендритных клеток и продукция цитокинов Известно, что зрелые дендритные клетки участвуют в представлении антигена Т-лимфоцитам. Прибавление гликоконъюгата в культуру незрелых ДК, генерированных из костного мозга мышей, снижало количество недифференцированных клеток (CD34+). При этом увеличивалось содержание клеток с молекулами адгезии CD11с+, костимуляции CD80+ и антигенного представления MHC класса II+ (p<0,05), однако их количество было ниже положительного контроля (TNFα) (p<0,05) (табл. 2). Добавление гликоконъюгата в среду культивирования ДК увеличивало в ней концентрации IL-1β, IL-6, TNFα по сравнению с контролем (среда с незрелыми ДК, без индуктора созревания). Гликоконъюгат+AL обладал сходными свойствами, однако, по сравнению с гликоконъюгатом без адъюванта, вызывал более значительное снижение уровня CD34+ и стимулировал повышение числа клеток с поверхностными молекулами CD11с+, CD80+ и СD83+ (p<0,05). В присутствии адъюванта 13 продукция цитокинов усиливалась, но была ниже положительного контроля (TNFα) за исключением IL-1β. Таблица 2. Иммунофенотип дендритных клеток и продукция цитокинов Поверхностные молекулы, % Цитокины, пг/мл Индуктор созреваCD34 CD11c CD80 CD83 MHC IL-1β IL-6 GMTNFα ния ДК II CSF Без 38,6± 4,8± 11,3± 3,1± 6,5± 23,2± 216± 159± 24,8± индук2,9 0,4 1,3 0,2 0,6 1,5 24,9 14,5 2,7 тора, (К-) Глико12,4± 41± 28,6± 4,7± 13,0± 33,5± 312± 57,2± 39,4± ) конъюгат 1,1* 3,1* ** 2,1* 0,5 0,5* 4,2* 28,8* 5,5# 3,3* Глико1,3± 32,0± 38,0± 8,4± 13,8± 84,7± 388± 152± 58,5± ) ) ) конъюгат 0,2* ** 2,7* 2,9* ** 0,8* ** 1,4* 6,4*)** 31,3** 11,2 5,8*)** + AL 41,1± 9,5± 54,8± 22,0± 20,3± 50,3± 226± 97,3± 24,6± AL 3,6 0,8 5,2* 1,8* 3,4* 4,1* 18,3 11,2 2,6 TNFα 10,7± 39,5± 75,2± 42,8± 52,3± 42,0± 345± 125± 132± (К+) 0,6* 2,9* 5,3* 3,3* 4,1* 4,2* 27* 9,5 9,7* Примечание. 9 сутки культивирования ДК. Данные представлены как M±SD. * - достоверность различий с незрелыми ДК (без индуктора созревания), (К-); ** - между гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+AL; # - снижение по сравнению с К (-), p<0,05. Тест Манна-Уитни. Таким образом, под действием гликоконъюгата, в том числе гликоконъюгата+AL, формировалась популяция зрелых ДК (CD11c+, CD80+, CD83+ и MHCII+), в среде культивирования которых присутствовали IL-1β, IL-6 и TNFα. 2.3. Для Продукция цитокинов in vivo оценки продукции цитокинов in vivo мышам однократно внутрибрюшинно вводили гликоконъюгат и гликоконъюгат+AL в дозе 10 мкг по углеводу в расчете на мышь и исследовали концентрацию цитокинов в сыворотке крови в течение 24 часов после введения препарата (Рис. 5). Гликоконъюгат вызывал повышение уровней IL-1β, IL-10, TNFα (p<0,05), кратковременно повышались концентрации IL-4, IL-5 и IL-17 (p<0,05), а через 4 ч после введения препарата увеличивалась продукция GM-CSF (p<0,05) и IFN-γ (p<0,05), при отсутствии изменения уровня IL-6. Гликоконъюгат+AL вызывал продукцию более широкого спектра цитокинов (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, 14 GM-CSF, IFN-γ, TNFα) и в большей концентрации, особенно IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, GM-CSF, TNFα. Выработка IFN-γ увеличивалась через 8 ч и резко возрастала через 24 ч наблюдения. Рис. 5. Концентрация цитокинов в сыворотке крови мышей. Примечание. Данные представлены как M±SD, * p<0,05; ** p<0,01. Тест Манна-Уитни. 2.4. Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови Гликоконъюгат периферической повышал крови бактерицидную иммунизированных 15 активность мышей в лейкоцитов отношении гетерологичного возбудителя (S. aureus), причем в большей степени в присутствии адъюванта (табл. 3). Таблица 3. Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови Препарат для % убитых микробных клеток S. aureus после первого иммунизации введения препарата на срок мышей 4ч 24 ч время инкубации время инкубации 1ч 3ч 1ч 3ч Гликоконъюгат 37,3±0,9 41,9±1,5 37,0±1,6 49,6±2,2* ) ) Гликоконъюгат+AL 42,9±2,6* 53,5±1,6* ** 64,3±1,9* ** 72,1±1,9*)** AL 33,3±2,6 40,7±3,1 32,1±1,6 41,0±2,0 Контроль 35,1±1,7 39,0±2,3 37,7±1,9 38,3±2,6 Примечание. Данные представлены как M±SD; * - достоверность различий с контролем; ** - между гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+AL, p<0,05. Тест Манна-Уитни. Таким образом, иммунизация гексасахаридом, конъюгированным с БСА, приводила к модификации иммунного процесса уже на первых этапах активации врожденного иммунитета, что проявлялось в повышении экспрессии TLR2; созревании дендритных клеток; продукции цитокинов, увеличении бактерицидной активности сыворотки крови. Сорбция гликоконъюгата на гидроксиде алюминия усиливала функциональную активность эффекторов врожденного иммунитета. 3. Активация адаптивного иммунитета 3.1. Иммунофенотип лимфоцитов На 7-е сутки после однократной иммунизации мышей гликоконъгатом увеличивалось количество T-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности молекулы СD3+, СD4+ и СD8+ (р<0,05 относительно контроля и гликоконъюгата+AL), и B-клеток с фенотипом CD19+ и CD5+ (р<0,05 относительно контроля) (табл. 4). Иммунизация гликоконъюгатом+AL не оказывала влияние на количество СD4+ и СD8+ T-клеток, но стимулировала повышение числа B-лимфоцитов (СD19+, СD5+) и Т-клеток, экспрессирующих рецептор к IL-2 (СD25+), а также активированных лимфоцитов, экспонирующих молекулы MHC класса II (р<0,05, относительно контроля и гликоконъюгата). На 7-е сутки после второй иммунизации мышей гликоконъюгатом наблюдалось снижение числа CD3+ и CD4+ T-лимфоцитов (р<0,05), тогда как 16 Таблица 4. Иммунофенотип лимфоцитов мышей Препарат для иммунизации СD45/ CD3 Гликоконъюгат Гликоконъюгат+AL AL 17 Контроль (неиммунизированные) Гликоконъюгат Гликоконъюгат+AL AL Контроль (неиммунизированные) 52,0± 4,5* 51,6± 4,4* 32± 3,7 40,6± 3,7 23,9± 2,2# 37,8± 3,5 22,9± 2,4# 32,4± 3,2 Количество клеток, экспрессирующих поверхностные молекулы, %±SD CD3/ CD3/ CD19 CD5 NK γδT CD4/ Treg CD4 CD8 CD25 7 суток после первой иммунизации 27,0± 25,3± 24,5± 16,7± 13,3± 2,0± 3,5± 1,2± ) ) 2,3* ** 2,6* ** 2,7* 1,7* 1,1 0,3# 0,3 0,2 20,8± 11,4± 33,0± 28,3± 13,4± 2,4± 9,4± 2,3± ) ) ) 1,8 0,3 4,1* ** 2,7 * ** 1,4 0,3# 0,5 * ** 0,4 10,9± 7,0± 25,2± 30,6± 13,1± 3,3± 1,2± 2,2± 1,3# 0,5# 2,6* 3,3* 1,7 0,4 0,2 0,3 21,3± 16,0± 10,7± 2,2± 13,8± 6,2± 1,6± 1,3± 2,7 1,5 0,7 0,2 0,4 5,0 0,3 0,2 7 суток после второй иммунизации 14,4± 7,5± 11,6± 10,8± 38,0± 2,5± 10,8± 3,2± 1,1# 0,4# 0,9* 1,0* 3,5* 0,2# 1,0* 0,3 24,2± 7,2± 14,2± 13,9± 41,7± 3,2± 13,9± 3,0± ) 2,5 0,5# 1,5* 1,2* ** 5,3* 0,3# 1,2* 0,2 18,3± 5,3± 5,4± 9,8± 52,0± 5,9± 9,8± 2,8± 1,4 0,3# 0,5 0,7* 4,2* 0,5 0,7* 0,2 20,6± 11,7±0, 6,8± 1,5± 13,9± 4,1± 1,5± 2,4± 2,0 7 0,2 0,3 1,1 0,3 0,3 0,3 СD45/ MHCII 28,4± 2,4 33,1± 3,0*)** 37,5± 2,9* 28,5± 3,1 47,9± 4,8* 58,9± 5,7*)** 50,7± 4,7* 35,2± 3,3 Примечание. Данные представлены как M±SD. Достоверность различий: * - по сравнению с контролем; ** - между гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+AL; # - снижение показателя по сравнению с контролем, p<0,05. Тест Манна-Уитни. иммунизация гликоконъюгатом+AL не оказывала влияния на количество Tклеток. Иммунизация мышей обоими гликоконъюгатами способствовала снижению численности Т-клеток с поверхностной молекулой СD8+ и γδTклеток (р<0,05). Прибавление к гликоконъюгату соли алюминия способствовало увеличению соотношения CD4/CD8 (для гликоконъюгата – 1,92; для гликоконъюгата + AL – 3,36) из-за уменьшения числа СD8+T-клеток. Повторное введение животным каждого из гликоконъюгатов приводило к сохранению на более высоком уровне числа B-клеток (СD19+, СD5+), способствовало увеличению количества NK-клеток и активированных клеток, экспонирующих MHC класса II (р<0,05). 3.2. Продукция антител Для определения продукции IgG-антител к гексасахариду мышей иммунизировали гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+AL (Рис. 6). На 7 и 14 сутки после однократной иммунизации не наблюдали образования специфических IgG-антител (Рис. 6А). Через 7 суток (день 21) после второй иммунизации гликоконъюгатом+AL уровень IgG-антител увеличивался (p=0,000177) и продолжал нарастать к 14 суткам (день 28 от начала вакцинации), тогда как гликоконъюгат без адъюванта не вызывал продукции антител. Это подтвердилось при определении IgG1-антител в индивидуальных сыворотках мышей (Рис. 6Б). Уровень IgG-антител после иммунизации гликоконъюгатом+AL оставался высоким до 61 суток (47 дней после второй иммунизации) по сравнению с исходным показателем (p=0,000205). К 92 суткам уровень IgG-антител снижался, но оставался выше первоначальных значений (p=0,011659). На фоне низкого уровня IgG-антител, на 92 день после иммунизации была проведена ревакцинация гликонъюгатом + AL в той же дозе (Рис. 6А). Через 24 часа (день 93) IgG-антитела оставались на исходном уровне, но к 4-м суткам (день 96) их титр увеличивался (p=0,012195) и продолжал нарастать до 7-х суток (день 99) (p=0,01148). Такое достаточно быстрое IgGантителообразование может свидетельствовать иммунологической памяти к гексасахариду. 18 о формировании Рис. 6. Титр IgG-антител к гексасахаридному участку цепи капсульного полисахарида. Примечание. Мышей иммунизировали двукратно внутрибрюшинно гликоконъюгатом в разовой дозе 10 мкг по углеводу на мышь в присутствии гидроксида алюминия или без адъюванта в дни 0 и 14 с проведением ревакцинации в день 92 той же дозой гликоконъюгата, сорбированного на гидроксиде алюминия. В качестве покрывающего лунки антигена в ИФА использовали КП S. pneumoniae серотипа 14. (А) IgG-антитела. Данные представлены как M±m. (Б). Индивидуальные титры IgG1-антител через 14 дней после второй иммунизации. Данные представлены индивидуальными титрами и Me±SD. ANOVA с апостериорным анализом Tukey, *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001. 19 Титр IgG-антител оставался выше, чем до ревакцинации (p=0,031494) в течение 97 дней (день 189). В сыворотке крови мышей преобладали антитела IgG1 субизотипа (1:11200). 3.3. Протективная активность Для исследования протективной активности гликоконъюгата и гликоконъюгата+AL мышей иммунизировали двукратно внутрибрюшинно и через две недели заражали летальной дозой S. pneumoniae серотипа 14 (табл. 5). В качестве референс-препаратов использовали пневмококковые вакцины: полисахаридную Пневмо-23 (без адъюванта) и конъюгированную - Превенар-13 (с фосфатом алюминия). Контроль заражающей дозы культуры S. pneumoniae серотипа 14 проводили на интактных мышах. Таблица 5. Протективная S.pneumoniae серотипа 14 активность Разовая иммунизируюПрепарат для иммунизации щая доза по углеводу, мкг Гликоконъюгат 10 10 101) Гликоконъюгат+AL 5 2,5 1,25 0,6 КП- CRM197 (Превенар-13) 1,0 КП (Пневмо-23) 5 Контроль (интактные) - гликоконъюгата Титр-1 IgGантител на 11-14 сутки после иммунизации в ИФА 150±28,7 4800±923* 800±0* 2400±461* 2400±461* 2400±461* 800±0* 1600±0* 400±0 150±28,7 при заражении Число выживших мышей из числа взятых в опыт на 10 сутки после заражения выжило/ %±m всего 0/10 8/8*** 7/8*** 7/8*** 6/7** 5/6* 6/7** 4/4** 2/10 0/8 0±8,5 100±0 87,5±11,7 87,5±11,7 87,5±11,7 83,3±15,2 85,7±13,2 100±0 20±12,6 0±0 Примечание. 1) - вторая иммунизация гликоконъюгатом, несорбированным на гидроксиде алюминия. В качестве покрывающего лунки антигена в ИФА использовали КП. Данные представленны как %±m. Достоверность различий по сравнению с контролем, * - р<0,05; ** р<0,01; *** - р<0,001. Различия в уровне антител определяли методом Манна-Уитни, а в выживаемости мышей - методом χ2 с поправкой Йейтса. Установлено, что гликоконъюгат, не вызывавший образования IgGантител, не обладал протективной активностью, тогда как гликоконъюгат+AL защищал от заражения 100% мышей (p=0,001). При проведении второй иммунизации той же дозой, но без адъюванта, уровень защиты снижался до 20 87,7%. Наименьшая из иммунизирующих доз (0,6 мкг) защищала 85,7% мышей. КП серотипа 14, входящий в состав вакцины Превенар-13, защищал от заражения 100% мышей, а неконъюгированный полисахарид, входящий в состав Пневмо-23, оказался неэффективным для защиты животных. 3.4.Превентивные свойства сыворотки крови иммунизированных мышей Для оценки превентивной активности иммунной сыворотки мышам за 2 часа до заражения S. pneumoniae серотипа 14 вводили иммунную сыворотку с титром антител к гексасахариду 1:6400. Для сравнения брали мышей, которым вводили сыворотку от интактных животных (табл. 6). Установлено, что только иммунная сыворотка, полученная от мышей после их двукратной иммунизации гликоконъюгатом+AL (разовая доза 10 мкг по углеводу), защищала 75% животных при заражении летальной дозой S.pneumoniae серотипа 14. Таблица 6. Превентивные свойства сывороток мышей при заражении S.pneumoniae серотипа 14 Сыворотка Заражаю Разовая Титр-1 IgGВыжило/ Выжило, после щая доза, доза антител к всего %±m иммунизации микр.кле- сывогексасахариду на 9 препаратом ток ротки, в тестируемой сутки мкл сыворотке Гликоконъюгат + AL Нативная сыворотка Контроль S.pneumoniae серотипа 14 0,5х109 12,5 6400±0 6/8* 75±15,3 0,5х109 12,5 <200 3/8 37,5±17,1 <200 <200 <200 0/8 6/8 8/8 0 75±15,3 100±8,5 0,5х109 9 0,25х10 9 0,125х10 - Примечание. Достоверность различий по сравнению с контролем, * - p<0,01. Различия в выживаемости мышей определяли методом χ2 с поправкой Йейтса. 3.5.Опсонизирующая активность иммунной сыворотки мышей Для изучения опсонофагоцитарной активности к образцам периферической крови интактных мышей прибавляли: убитые нагреванием бактериальные клетки S.pneumoniae серотипа 14; бактериальные клетки с добавлением нативной сыворотки мышей; бактериальные клетки с добавлением иммунной сыворотки к гексасахариду (табл. 7). 21 Таблица 7. Опсонизирующая активность сыворотки крови мышей Фагоцитирующие клетки % клеток интактных мышей, поглотивших убитые периферической крови нагреванием бактерии S. pneumoniae серотипа 14 интактных мышей без сыворотки нативная иммунная Нейтрофилы 65,6±1,4 77,6±2,6 83,5±1,9* Моноциты 72,5±2,2 78,0±2,3 89,8±2,6* Примечание. Иммунную сыворотку получали на 14 сутки после двукратной иммунизации гликоконъюгатом+AL (разовая доза 10 мкг по углеводу). Данные представлены как M±SD. Достоверность различий по сравнению с контролем (без сыворотки), * - р<0,05. Тест МаннаУитни. Нейтрофилы захватывали и больше моноциты бактерий, в присутствии иммунной взаимодействовавших с сыворотки антителами к гексасахариду (р=0,004), по сравнению с клетками, к которым не добавляли сыворотку или обрабатывали нативной сывороткой (p=0,006 и p=0,004 соответственно). Исследование показало, гексасахарид - синтетический аналог фрагмента цепи капсульного полисахарида S. pneumoniaе серотипа 14, конъюгированный с БСА, стимулирует активность ключевых эффекторов системы врожденного иммунитета, в присутствии адъюванта вызывает образование опсонизирующих IgG-антител и защищает мышей от заражения. ВЫВОДЫ 1. Показано, что гексасахарид обладает сопоставимой по величине антигенной активностью с тетра- и октасахаридом в составе конъюгатов с БСА, ингибируя специфические IgG-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке соответственно на 75, 71, 74%; в сыворотке к бактериальному КП поствакцинальные антитела к тетра-, гекса- и октасахариду выявляются в титрах 3,4; 3,4 и 3,7 (в Log10). 2. Установлено, что антитела к гексасахариду способны связывать бактериальный КП, ингибируя активность иммунной сыворотки соответственно на 76,5; 81,2 и 83,6%, при концентрациях КП 0,25; 0,5 и 1 мкг. 3. Продемонстрировано, что конъюгированный гексасахарид активирует экспрессию TLR2, вызывает созревание дендритных клеток (CD11с+, СD80+ и МНС II+), продуцирующих цитокины IL-1β, IL-6 и TNFα; повышает концентрацию в сыворотке крови мышей IL-1β, IL-10, IFN-γ и TNFα; 22 увеличивает бактерицидную активность лейкоцитов крови иммунизированных гликоконъюгатом мышей. 4. Показано, что добавление гидроксида алюминия к конъюгированному гексасахариду увеличивает численность TLR2-позитивных клеток селезенки мышей и зрелых дендритных клеток; повышает продукцию цитокинов дендритными клетками; расширяет спектр и увеличивает концентрацию сывороточных цитокинов (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, GM-CSF, IFN-γ, TNFα); усиливает бактерицидную активность лейкоцитов крови иммунизированных мышей. 5. Выявлено, что образование IgG-антител к гексасахариду происходит только после двукратного введения мышам гликоконъюгата (оптимальная доза 10 мкг по углеводу), сорбированного на гидроксиде алюминия; гликоконъюгат без адъюванта не вызывает специфического антителообразования. 6. Установлено, что ревакцинация, проведенная через 47 дней после второй иммунизации, вызывает быстрое (на 4 сутки) образование анамнестических IgG-антител к гексасахариду, которые сохраняются в сыворотке крови животных до 92 дней. 7. Показано, что введение животным конъюгированного гексасахарида, сорбированного на гидроксиде алюминия, увеличивает соотношение CD4/CD8 лимфоцитов, вследствие снижения числа СD8+T-клеток, стимулирует преимущественно B-лимфоциты, увеличивает пул естественных клетоккиллеров, а также экспрессию MHC класса II на лимфоцитах. 8. Установлено, что сыворотка крови мышей, иммунизированных гликоконъюгатом, сорбированным на гидроксиде алюминия, обладает превентивными свойствами и повышает фагоцитоз убитых нагреванием бактерий пневмококка S.pneumoniae серотипа 14 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных мышей. 9. Впервые продемонстрировано, что конъюгат БСА с гексасахаридом, сорбированный на гидроксиде алюминия, обладает выраженной протективной активностью и защищает мышей от заражения S.pneumoniae серотипа 14. 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Synthetic hexasaccaride – related to the fragment of the chain of capsular polysaccharide Streptococcus pneumoniae type 14 and dendritic cells maturation / E.A. Akhmatov, E.A. Kurbatova, D.S. Vorobiov, E.V. Sukhova, D.V. Yashunsky, Y.E. Tsvetkov and N.E. Nifantiev // Pneumonia. Special issue. 9th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases. - India. Hyderabad. 2014. -Vol. 3. - P. 102. 2. Immunogenic activity of a synthetic hexasaccharide fragment of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14 / E.A. Akhmatov, E.A. Kurbatova, D.S. Vorobiov, E.V. Sukhova, D.V. Yashunsky, Y.E. Tsvetkov and N.E. Nifantiev // Pneumonia. Special issue. 9th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases. - India. Hyderabad. - 2014. -Vol. 3. - P. 103. 3. Synthetic hexasaccharide of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae type 14 induces cytokines / E.A. Akhmatov E.A., E.A. Kurbatova, N.K. Akhmatova, E.V. Sukhova, D.V. Yashunsky, Y.E. Tsvetkov, N.E. Nifantiev // 16th International Congress on Infectious diseases. Cаpe Town. South Africa. – 2014. Abstract No 63.022. http://www.xcdsystem.com/icid2014/63.022.html. 4. Действие гидроксида алюминия на систему врожденного иммунитета и иммуногенность бактериальных и синтетических антигенов Streptoccoccus pneumoniae / Е.А. Курбатова, Э.А. Ахматов, Н.К. Ахматова, Д.С. Воробьев, Н.Б. Егорова, А.П. Батуро, Э.Е. Романенко, Е.В. Сухова, Д.В. Яшунский, Ю. Е. Цветков, Н.Э. Нифантьев // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2014. - № 6. – С. 59 - 66. 5. Протективная активность гликоконъюгата на основе синтетического гексасахарида - родственного фрагменту цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 14 / Е.А. Курбатова, Д.С. Воробьев, Э.А. Ахматов, Н.К. Ахматова, Н.Б. Егорова, Ю.Е. Цветков, Е.В. Сухова, Д.В. Яшунский, Н.Э. Нифантьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157. - № 5. – С. 630-633. 24