ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 23852
(51) A61K 39/395 (2010.01)
A61K 39/205 (2010.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
Сущность изобретения состоит в том, что способ
получения антирабической сыворотки, включает
интрацеребральное заражение животных вирусом
бешенства, их убой, взятие мозговой ткани,
приготовление суспензии, ее экстрагирование и
сбор надосадочной жидкости, иммунизацию
животных-продуцентов, взятие крови и отделение
сыворотки, причём в качестве животных - доноров
мозговой ткани используют новорожденных ослят,
мозговую суспензию дополнительно обрабатывают
дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 2530 минут, вирус бешенства отделяют в градиенте
сахарозы, в качестве животных-продуцентов
антирабической сыворотки используют ослов,
иммунизацию которых осуществляют тремя видами
антигена: НАФ -антиген, адъювантдепонированный
и
фенолизированный,
а
иммунизацию
осуществляют комбинированием внутрикожных,
подкожных
и
внутримышечных
введений
антигенов.
Способ позволяет снизить себестоимость
антирабической сыворотки, повысить её активность
и специфичность.
(19) KZ (13) A 4 (11) 23852
(21) 2010/0394.1
(22) 02.04.2010
(45) 15.04.2011, бюл.№ 4
(72)
Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович;
Хусаинов Дамир Микдатович; Батанова Жанат
Мухаметкалиевна; Икранбегийн Риза; Кожаев Аскар
Нурсултанович; Абдикадырова Айгерим Мадиевна
(73)
Товарищество
с
ограниченной
ответственностью
"Научно-производственное
предприятие "Антиген"
(56) Селимов М., Гордиенко Е. Производство
антирабического
иммуноглобулина
животного
происхождения.
Методы
лабораторных
исследований по бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с.
301-303
(54)
СПОСОБ
ПОЛУЧЕНИЯ
АНТИРАБИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
(57)
Изобретение относится к вирусологии,
иммунологии и биотехнологии, в частности к
способу получения антирабической сыворотки.
Технический
результат,
обеспечиваемый
изобретением, выражается в получении недорогой,
высокоактивной и специфической антирабической
сыворотки.
23852
Изобретение
относится
к
вирусологии,
иммунологии и биотехнологии, в частности к
способу получения антирабической сыворотки.
Известен, принятый за аналог, способ получения
антирабической
сыворотки
путем
интрацеребрального заражения животных вирусом
бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,
приготовления суспензии, ее экстрагированием и
сбором надосадочной жидкости, иммунизацией
животных-продуцентов,
взятием
крови
и
отделением сыворотки при этом в качестве
рабического
антигена
использован
экстракт
зараженного
пастеровским
штаммом
фиксированного вируса бешенства мозга кролика, а
в качестве продуцентов использованы лошади
(Lepine P., Atanasiu Р. Производство лечебной
антирабической сыворотки на животных // Методы
лабораторных исследований по бешенству / Женева:
ВОЗ, 1975, с. 295-300).
К недостаткам известного способа относится
дороговизна (дорогие продуценты) и низкая
активность
и
специфичность
получаемой
антирабической сыворотки.
Известен, принятый за прототип, способ
получения антирабической сыворотки путем
интрацеребрального заражения животных вирусом
бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,
приготовления суспензии, ее экстрагированием и
сбором надосадочной жидкости, иммунизацией
животных-продуцентов,
взятием
крови
и
отделением сыворотки при этом в качестве
рабического
антигена
использован
экстракт
зараженного вирусом бешенства V. Fexe (штамм
Москва) мозг овец, а в качестве продуцентов
использованы лошади (Селимов М., Гордиенко Е.
Производство антирабического иммуноглобулина
животного происхождения: Метод, используемый в
СССР // Методы лабораторных исследований по
бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с. 301-303).
К недостаткам известного способа также
относится дороговизна (дорогие продуценты) и
низкая активность и специфичность получаемой
антирабической сыворотки.
Задачей изобретения является разработка
способа получения недорогой, высокоактивной и
специфической антирабической сыворотки.
Технический
результат,
обеспечиваемый
изобретением, выражается в получении недорогой,
высокоактивной и специфической антирабической
сыворотки.
Указанный технический результат достигается
тем, что в способе получения антирабической
сыворотки,
включающем
интрацеребральное
заражение животных вирусом бешенства, их убой,
взятие мозговой ткани, приготовление суспензии, ее
экстрагирование и сбор надосадочной жидкости,
иммунизацию животных-продуцентов, взятие крови
и отделение сыворотки, в качестве животных доноров
мозговой
ткани
используют
новорожденных ослят, мозговую суспензию
дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком
при 15-20 КГц в течение 25-30 минут, вирус
бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в
качестве животных-продуцентов антирабической
сыворотки используют ослов, иммунизацию
которых осуществляют тремя видами антигена:
НАФ
-антиген,
адъювантдепонированный
и
фенолизированный, а иммунизацию осуществляют
комбинированием внутрикожных, подкожных и
внутримышечных введений антигенов.
Заявленный способ отличается от прототипа тем,
что антиген дополнительно содержит вирусную
массу, выделенную при озвучивании мозговой
суспензии, очищенную в градиенте сахарозы, а в
качестве продуцентов антигена используют ослят. В
качестве продуцентов используют ослов с
установлеными сроками иммунизации, дозами и
местом введения антигена. Таким образом,
заявляемый способ
соответствует
критерию
изобретения «новизна».
Известное техническое решение, в котором
применяется экстрагирование гомогената мозга не
обеспечивает достаточного выхода антигена, что
достигается в заявляемом техническом решении.
Кроме того, использование озвученного гомогената
мозговой ткани с выделением вируса в градиенте
сахарозы
усиливает
активность
антигена.
Использование мозговой ткани новорожденных
ослят позволяет снизить гетерогенность антигена.
Использование в качестве продуцентов ослов
позволяет снизить себестоимость и повысить
активность
и
специфичность
сыворотки.
Отработаны режимы иммунизации ослов, дозы и
место введения антигена. Это позволяет сделать
вывод о соответствии критерию «существенные
отличия».
В силу того, что предлагаемый способ
предполагает использование ослов, удобных в уходе
и содержании, с использованием гомологичного
антигена, специфическая активность получаемых
сывороток значительно повышается, что повышает
эффективность и результативность диагностических
тестов.
Пример получение антирабической сыворотки
Антирабическую
сыворотку
получают
следующим образом.
Для получения вируссодержащей мозговой
ткани используют ослят 1,5-2 -месячного возраста,
матери которых не были вакцинированы против
бешенства. Животных заражают интрацеребрально
в дозе 0,1-0,2 см2 1%-ной суспензией вируса
бешенства (штамм CVS). Суспензию готовят в
стерильных
условиях
из
вируссодержащего
головного мозга лабораторного животного, на
котором
пассируется
фиксированный
вирус
бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке
пестиком и готовят 10% суспензию на 0,85%
растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из
расчета по 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина
на 1 мл. Далее гомогенат подвергается обработке
ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут.
Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс.
оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200
мл дистиллированной воды, подвергается повторной
обработке ультразвуком до получения гомогенной
суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут).
2
23852
Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется).
Далее
вирус
бешенства
очищают
центрифугированием при небольшой скорости
(4000 g, 15 мин) для удаления крупных посторонних
частиц, а затем центрифугируют при высокой
скорости (40 000 g, 30 мин) для осаждения вирусных
частиц. Осажденный вирус ресуспендируют в
физиологическом растворе (добавляют объем,
равный 1/10 объема элюата), центрифугируют при
2000 g в течение 10 мин для удаления крупных
частиц, и надосадочную жидкость наслаивают на
сахарозный градиент. 1...2 мл концентрированной
суспензии вируса наслаивают на 28 мл линейного
градиента сахарозы (10...40%-ный раствор сахарозы,
приготовленный на физиологическом растворе,
забуференном 0,01 М Na -фосфатным буфером с рН
7,5) и центрифугируют при 15000 об/мин в
ультрацентрифуге Spinco, ротор SW 25, в течение 40
мин. Дно пробирки прокалывают и собирают
фракции (по 2 мл), вытекающие из отверстия. Зона,
содержащая вирус, располагается на границе
верхней трети градиента. Ее легко обнаружить по
опалесценции. В этой зоне должно содержаться
около 65% вируса, наслоенного на градиент.
(Концентрация вируса выражается в ГАЕ в 1 мл.)
Вирус содержится также в более низких частях
градиента, а кроме того, в осадке; однако эти две
фракции отбрасывают. Главную содержащую вирус
фракцию разбавляют физиологическим раствором и
центрифугируют при 40 000 g в течение 2 ч.
Осажденный вирус представляет собой более или
менее прозрачную, окрашенную в соломенный цвет
массу. Его ресуспендируют в физиологическом
растворе, содержащем 0,08% азида натрия.
Полученную белую сильно опалесцирующую
суспензию хранят при 4°С.
Рабический антиген для иммунизации ослов
применяют в 3-х вариантах.
Добавление к одной части суспензии 0,25%
фенола образует фенольный антиген. Другой адъювантдепонированный антиген содержит в
своем составе 0,05% сапонина, 20% гидрата окиси
алюминия и 0,1% формалина. Третий - НАФ
антиген - в пропорции 1:1с неполным адъювантом
Фрейнда.
Для получения антирабической сыворотки
отбирают клинически здоровых, упитанных ослов,
полученных из благополучных по инфекционным и
инвазионным заболеваниям хозяйств.
Как известно, активность антирабических
сывороток во многом определяется контактом
рабического антигена с обширной сетью нервных
окончаний, что определило использование трех
методов
введения
анетигена.
Иммунизацию
животных
осуществляют
чередованием
внутрикожных, подкожных и внутримышечных
инъекций рабических антигенов. Внутрикожные
инъекции осуществляют 6 точек: слева и справа
область шеи, спины, крупа; подкожные и
внутримышечные - в область шеи и крупа.
Первоначально осуществляют грундиммунизацию:
внутрикожно вводили НАФ-антиген по схеме 0,2×6
(в
6
точек
по
0,2
см3),
подкожно
адъювантдепонированный антиген по схеме 2,0×2 (в
2 точки в область шеи по 2,0 см3 ), и
внутримышечно фенольный антиген по схеме 1,5×2
(в 2 точки в область крупа по 1,5 см3). На 45-е сутки
после
грундиммунизации
приступают
к
гипериммунизации, животных иммунизируют 4-8
кратно с интервалом 10-20 дней в зависимости от
варианта антигена с соблюдением правил асептики
и антисептики. Вначале вводят НАФ-антиген и
адъювантдепонированный антиген соответственно в
дозах 0,2мл×10точек и 2мл×2точки, инъекцию
которого повторяют на 60-й (0,2мл×15точек и 3
мл×2 точки) и 75-й (0,2мл×20точек и 4мл×2 точки) и
90-й день (0,2мл×30точек и 5мл×2 точки).
Фенольный антиген вводят в область крупа, слева и
справа - на 52, 67, 82 и 97-й день в нарастающих
дозах: 2мл×2точки, 3мл×2точки, 4мл×2точки,
5мл×2точки. Нарастание титра антител проверяют в
пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от
каждого животного в процессе иммунизации по
тестам РДП и РН.
На 10 день после последней инъекции антигена
(107 день от начала иммунизации) у ослов
осуществляют пробное крововзятие по норме 400
см3 на 100 кг живой массы.
При достижении преципитационного титра 1:321:128 через 14 дней (118 день от начала
иммунизации)
производится
следующее
крововзятие по полной производственной норме
(1800
см3
на
100
кг
живой
массы).
Вируснейтрализующая активность такой сыворотки,
определяемая методом титрования на белых мышах,
соответствует 1000-2000 ЕР.
Сыворотка изготавливается стерильно, хранится
при температуре 4-6°С в течение года, и
используется для приготовления диагностических и
лечебных препаратов.
Достижение положительного эффекта при
применении
антирабической
сыворотки
в
диагностических целях подтверждено постановкой
более чем в 200 серологических реакций (РДП,
РИФ). При этом установлено, что полученная по
данному способу сыворотка обладала высокой
активностью (титр по РДП 1:128), специфичностью,
не давала перекрестных реакций с тканями
головного мозга различных сельскохозяйственных и
лабораторных животных.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения антирабической сыворотки,
включающий
интрацеребральное
заражение
животных вирусом бешенства, взятие мозговой
ткани, приготовление суспензии, ее экстрагирование
и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию
животных-продуцентов, взятие крови и отделение
сыворотки, отличающийся тем, что в качестве
животных - доноров мозговой ткани используют
новорожденных ослят, мозговую суспензию
дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком
при 15-20 КГц в течение 25-30 минут, вирус
бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в
3
23852
качестве животных-продуцентов антирабической
сыворотки используют ослов, иммунизацию
которых осуществляют тремя видами антигена:
НАФ - антиген, адьювантдепонированный и
фенолизированный, а иммунизацию осуществляют
комбинированием внутрикожных, подкожных и
внутримышечных введений антигенов.
Верстка Косалиева Б.
Корректор Мадеева П.А.
4