РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук На правах рукописи ЗЕРКАЛЕНКОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ВЛИЯНИЕ МАЛОЙ ГТФазы Rac1 НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИМЕНТИНОВЫХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ С МИТОХОНДРИЯМИ (03.01.03 – Молекулярная биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: канд. биол. наук А. А. Минин Москва, 2015 г. 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................... 9 1.1. Структура и функции митохондрий.................................................................... 9 1.1.1. Общее строение митохондрий ....................................................................... 9 1.1.2. Потенциал митохондрий и синтез АТФ ..................................................... 12 1.1.3. Митохондриальные красители .................................................................... 14 1.1.4. Регуляция концентрации ионов Са2+ митохондриями .............................. 16 1.1.5. Транспорт в митохондрию ........................................................................... 18 1.1.6. Генерация активных форм кислорода ........................................................ 21 1.1.7. Динамика и подвижность митохондрий ..................................................... 23 1.2. Промежуточные филаменты (ПФ) .................................................................... 26 1.2.1. Строение ПФ ................................................................................................. 27 1.2.2. Сборка ПФ ..................................................................................................... 30 1.2.2.1. Формирование димеров ......................................................................... 30 1.2.2.2. Формирование тетрамеров..................................................................... 31 1.2.2.3. Формирование протофиламентов единичной длины и дальнейшие этапы сборки......................................................................................................... 32 1.2.3. Динамика ПФ в клетке ................................................................................. 34 1.2.4. Фосфорилирование белков ПФ ................................................................... 35 1.2.4.1. Фосфорилирование ПФ in vitro ............................................................. 36 1.2.4.2. Фосфорилирование ПФ in vivo .............................................................. 36 1.2.5. Функции виментина. Болезни, связанные с ПФ ........................................ 38 1.3. Белок Rac1 и его эффектор протеинкиназа РАК1 ........................................... 40 1.3.1. Белок Rac1 ..................................................................................................... 42 1.3.1.1. Строение белка Rac1 .............................................................................. 42 1.3.1.2. Подходы к изучению функций белка Rac1 .......................................... 43 1.3.2. Функции белка Rac1 ..................................................................................... 45 1.3.2.1. Регуляция концентрации АФК белком Rac1 ....................................... 45 1.3.2.2. Регуляция динамики цитоскелета белком Rac1 .................................. 47 3 1.3.3. Эффектор белка Rac1 – протеинкиназа РАК1 ........................................... 48 1.3.3.1. Строение протеинкиназы РАК1 ............................................................ 48 1.3.3.2. Регуляция киназной активности РАК1 ................................................. 49 1.3.3.3. Функции протеинкиназы РАК1 ............................................................. 51 1.4. Перестройки цитоскелета как способ регуляции функционального состояния митохондрий............................................................................................. 52 1.4.1. Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий ............................................................................................................ 53 1.4.2. Роль функционального состояния митохондрий в физиологии клетки. Цитотоксические препараты .................................................................................. 55 1.4.3. Модель механизма регуляции взаимодействия митохондрий с цитоскелетом ........................................................................................................... 59 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................................ 61 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................... 62 2.1. Клеточные линии и культивирование клеток .................................................. 62 2.2. Трансфекция клеток ............................................................................................ 63 2.3. ДНК-конструкции ............................................................................................... 63 2.3.1. Конструкции, кодирующие различные формы белка Rac1 ...................... 63 2.3.2. Конструкции, кодирующие различные формы виментина ...................... 64 2.3.3. Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК1 ... 65 2.4. Окрашивание клеток митохондриальными потенциалзависимыми красителями ................................................................................................................ 66 2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание ............................................................. 66 2.5.1. Фиксация клеток ........................................................................................... 66 2.5.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание ....................................................... 67 2.5.3. Антитела к виментину и окраска актиновых микрофиламентов ............. 67 2.6. Микроскопия ....................................................................................................... 67 2.6.1. Методика проведения микроскопии живых и зафиксированных клеток 67 2.6.2. Анализ относительной подвижности митохондрий .................................. 68 2.6.3. Определение трансмембранного потенциала митохондрий .................... 70 4 2.7. Получение линий клеток, стабильно экспрессирующих различные типы виментина.................................................................................................................... 71 2.8. Определение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам ............. 72 2.8.1. МТТ-тест ........................................................................................................ 72 2.8.2. Тест с нейтральным красным ...................................................................... 73 2.8.3. Построение кривых выживаемости ............................................................ 73 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ................................................................................................ 75 3.1. Влияние Rac1 на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий ...................................................................................................................................... 75 3.1.1. Сравнение относительной подвижности митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин, в присутствии мутантных форм белка Rac1 ................................................................................................................ 75 3.1.2. Влияние мутантных форм белка Rac1 на относительную подвижность митохондрий в клетках с восстановленным виментином .................................. 76 3.1.3. Кинетика относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих Rac1-LOV2 .............................................................................. 78 3.1.4. Влияние Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин ............................................................. 80 3.2. Поиск эффектора белка Rac1 в регуляции подвижности митохондрий ....... 81 3.3. Проверка участия протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности и трансмембранного потенциала митохондрий ......................................................... 84 3.3.1. Влияние каталитического домена РАК1 на подвижность митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин .............................................. 84 3.3.2. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции подвижности митохондрий .................................................................................... 85 3.3.3. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий ...................................................... 86 3.4. Изучение роли остатка серина-55 виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с виментином ...................................................................................... 88 5 3.4.1. Сборка ПФ из точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование .................................................................................................. 88 3.4.2. Влияние точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование, на подвижность митохондрий ............................................ 90 3.4.3. Сборка ПФ из нефосфорилируемых аналогов виментина ....................... 90 3.4.4. Влияние нефосфорилируемых мутантов виментина на регуляцию подвижности митохондрий белком Rac1 ............................................................. 93 3.4.5. Влияние нефосфорилируемых аналогов виментина на эффект Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий ........................................................ 94 3.5. Влияние взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам............................................ 95 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................................... 100 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 111 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................................................................. 112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 115 6 ВВЕДЕНИЕ Митохондрии играют особую роль в жизнедеятельности клетки благодаря способности синтезировать АТФ, участвовать в регуляции внутриклеточной концентрации кальция и контролировать процесс регулируемой клеточной гибели – апоптоз. Функции митохондрий зависят от их внутриклеточного распределения. С одной стороны, во многих клетках митохондрии располагаются вблизи мест высокого потребления энергии. С другой стороны, известен ряд патологий, при которых неправильная локализация митохондрий приводит к нарушениям в их структуре. Регуляция распределения митохондрий может происходить на стадии их транспорта вдоль актиновых микрофиламентов и тубулиновых микротрубочек моторными белками. Вместе с тем появляется все больше данных о том, что наряду с изменением активности моторных белков и организации микротрубочек и актиновых филаментов в регуляции распределения митохондрий большое значение имеют промежуточные филаменты (ПФ). ПФ в клетках соединительной ткани состоят из белка виментина и являются наиболее прочной структурой цитоскелета (Fuchs et al., 1994). Во многих работах представлены данные о том, что митохондрии взаимодействуют с ПФ (Leterrier et al., 1994; Reipert et al., 1999). Известно, что при коллапсе ПФ к ядру под действием протеинкиназы С (ПКС1) подвижность митохондрий на периферии клетки возрастает (Некрасова et al., 2007). Это может говорить о роли ПФ как одного из элементов, удерживающих митохондрии в определенных местах клетки, то есть в стационарном состоянии. Они также могут являться адаптерами для взаимодействия митохондрий со специфическими структурами актинового цитоскелета (Кулик и др., 2006). Кроме того, ранее в нашей лаборатории был обнаружен участок в N-концевой области молекулы виментина, отвечающий за взаимодействие с митохондриями (Nekrasova et al., 2011). Дополнительные свидетельства в пользу важной роли ПФ в функционировании митохондрий филаментов были получены в опытах с 1 См. список принятых сокращений на с. 112 7 фибробластами из мышей, нокаутных по гену виментина (Tolstonog et al., 2005). В митохондриях таких клеток наблюдается прогрессирующее разрушение матрикса, снижение трансмембранного потенциала и способности синтезировать АТФ. Также фибробласты без виментина сильнее подвержены апоптозу и не способны к спонтанной иммортализации (Tolstonog et al., 2001). Оказалось, что взаимодействие митохондрий с ПФ влияет не только на подвижность митохондрий, но и на их трансмембранный потенциал. Восстановление виментиновых ПФ в клетках приводит к увеличению трансмембранного потенциала митохондрий, а удаление их с помощью РНК-интерференции – к его снижению (Chernoivanenko et al., 2015). Таким образом, взаимодействие с ПФ играет важную роль в распределении и функционировании митохондрий. Можно предположить, что это взаимодействие находиться под строгим регуляторным контролем внешних и внутренних факторов. Целью настоящей работы явилось изучение механизма регуляции взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ в клетках млекопитающих и влияния этого взаимодействия на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам. В данной работе показано, что главным регулятором переключения состояния митохондрий из стационарного в подвижное является малая ГТФаза Rac1. Когда Rac1 переходит в ГТФ-связанное состояние под действием внешних факторов, она активирует свой эффекторный белок – протеинкиназу РАК1. В результате активации РАК1 происходит фосфорилирование виментина по остатку серина-55. Это нарушает взаимодействие митохондрий с N-концевым участком виментина из-за появления в нем дополнительного отрицательного заряда, в результате чего увеличивается их подвижность. Важным следствием такого перехода в подвижное состояние является снижение трансмембранного потенциала митохондрий. Практически все функции митохондрий зависят от их трансмембранного потенциала. Поэтому выявленное в настоящей работе изменение взаимодействия митохондрий с виментином под действием малой 8 ГТФазы Rac1 является способом регуляции функционального состояния этих органелл внешними факторами. Также было предположено, что виментин, связываясь с митохондриями, может играть для клеток защитную роль, поскольку гибель клеток всегда сопровождается снижением трансмембранного потенциала митохондрий. Чтобы проверить эту гипотезу, на основе безвиментиновых клеток линии MFT-16 были получены линии, экспрессирующие различные формы виментина – виментин дикого типа, способный связываться с митохондриями, или его мутантные формы, которые утратили такую способность. Анализ жизнеспособности клеток в присутствии различных концентраций двух наиболее часто используемых противораковых препаратов винкристина и адрибластина показал, что виментин оказывает на клетки защитный эффект только в том случае, если он может взаимодействовать с митохондриями. 9 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структура и функции митохондрий Каждой живой клетке необходима энергия для поддержания упорядоченной внутренней структуры. Клетка получает энергию в результате превращения углеводов и других молекул и запасает ее в виде аденозинтрифосфата (АТФ) – универсальной энергетической валюты. АТФ может быть образован в цитоплазме с помощью гликолиза, однако такой путь дает сравнительно малый выход АТФ. Существует гораздо более эффективный способ – запасание энергии в виде градиента протонов на мембране, который впоследствии расходуется на синтез АТФ в ходе окислительного фосфорилирования. Такая мембрана получила название энергетической. В клетках прокариот в качестве энергетической мембраны выступает плазмалемма. В клетках эукариот функцию окислительного фосфорилирования выполняют специализированные органеллы – митохондрии и хлоропласты. Это полуавтономные органеллы, содержащие две мембраны – внешнюю и внутреннюю, причем внутренняя является энергетической. Митохондрии используют энергию химических связей для синтеза АТФ, а хлоропласты – энергию света. Именно благодаря высокой эффективности окислительного фосфорилирования оказался возможным переход к многоклеточности и началось интенсивное развитие многоклеточных эукариот. 1.1.1. Общее строение митохондрий Митохондрии представляют собой округлые или нитевидные органеллы, присутствующие, за небольшим исключением, в цитоплазме всех эукариотических клеток как аутотрофных, так и гетеротрофных организмов. Они впервые были описаны в 1890 году как «биобласты» – небольшие включения в цитоплазме эукариотических клеток, по форме и размерам напоминающие бактерии. Была отмечена их полуавтономность – способность к перемещению, 10 делению и слиянию, вследствие чего они были расценены как «элементарные организмы», живущие внутри клеток (Altmann, 1890). Размеры митохондрий сильно варьируют у разных видов: их толщина относительно постоянна и составляет около 0,5 – 1 мкм, а длина колеблется от 1 до 60 мкм. Количество митохондрий в клетке также может быть различно – от десятков в фибробластах до нескольких тысяч в гепатоцитах и кардиомиоцитах, где они занимают до одной трети объема клетки (Alberts et al., 2008; Bers, 2001). В различных клетках и тканях форма и локализация митохондрий может варьировать. Митохондрии чаще всего скапливаются вблизи тех участков цитоплазмы, где возникает наибольшая потребность в АТФ. Так, в скелетных мышцах митохондрии находятся вблизи миофибрилл, в нейронах – вблизи синапсов, а в сперматозоидах они образуют спиральный футляр вокруг оси жгутика. Округлые или нитевидные митохондрии характерны для большинства культивируемых клеток эукариот, причем обычно они скапливаются вокруг ядра клетки и на периферии расположены более редко (Ernster et al., 1981). Митохондрии независимо от их величины и формы имеют универсальное внутреннее строение. Они окружены гладкой внешней мембраной и содержат внутреннюю мембрану. Последняя непрерывна и образует складки – кристы. Межмембранным было названо пространство между внешней и внутренней мембранами, внутреннее пространство – матриксом (Palade, 1953) (см. рисунок 1). Наружная митохондриальная мембрана обычно имеет ровные контуры, еѐ толщина составляет разнообразных около белков. 7 Среди нм. них Она содержит ферменты большое липидного количество метаболизма, компоненты системы транслокации белков, многочисленные гидрофильные каналы (включая митохондриальный порин VDAC (voltage-dependent anion channel)), белки, контролирующие форму митохондрий, а также белки-регуляторы апоптоза. Благодаря гидрофильным каналам наружная мембрана проницаема для заряженных и незаряженных молекул массой до 5000 Да, в том числе небольших белков (Colombini, 1983). Наружная мембрана, в отличие от внутренней, богата холестеролом (Parsons et al., 1967). 11 Рисунок 1. Архитектура митохондрий (по (Alberts et al., 2008), с изменениями). Наружная мембрана отделена от внутренней межмембранным пространством шириной около 10-20 нм, хотя в некоторых местах они значительно сближены. Такое сближение наблюдается в местах расположения митохондриальной машины импорта белков, включающей белки TIM (translocase of inner membrane) и TOM (translocase of outer membrane). Также в местах сближения мембран может образоваться пора, изменяющая проницаемость мембраны – PTP (permeability transition pore). PTP включает в себя несколько белков: VDAC, ANT (adenine nucleotide translocator), циклофилин D и периферийный бензодиазепиновый рецептор. РТР образуется при различных нарушениях функционирования митохондрий. Проницаемость РТР регулируется белками семейства Bcl-2 (Bolter et al., 2001; Lemeshko, 2002). В межмембранном пространстве локализуется цитохром с и такие ферменты, как аденилаткиназа и нуклеозидмоно- и дифосфаткиназы (Ernster et al., 1969). 12 Внутренняя мембрана образует многочисленные кристы. Они позволяют значительно увеличить площадь внутренней мембраны. Внутренняя мембрана значительно отличается по составу от наружной. Так, она содержит фосфолипид кардиолипин, что придает ей особую непроницаемость для ионов. Она непроницаема также для незаряженных молекул массой больше 100-150 Да (Klingenberg et al., 1966). Соотношение белок:липид во внутренней мембране в два-три раза больше, чем в наружной (Parsons et al., 1966). В ней локализованы все компоненты дыхательной цепи (см. ниже), за исключением цитохрома с, находящегося в межмембранном пространстве. Также она содержит специальные переносчики малых молекул, метаболизирующихся в митохондрии. Матрикс содержит митохондриальную ДНК и рибосомы. Кроме этого, в нем содержатся более ста ферментов, участвующих в превращении пирувата в ацетилКоА, окислении жирных кислот, цикле Кребса и экспрессии митохондриального генома (Alberts et al., 2008). 1.1.2. Потенциал митохондрий и синтез АТФ Одной из важнейших вех в понимании природы клеточного дыхания явилось открытие Гансом Кребсом в 1937 году цикла трикарбоновых кислот – аэробного процесса, в ходе которого происходит превращение двух- и трѐхуглеродных соединений, образующихся как промежуточные продукты при распаде углеводов, жирных кислот и аминокислот, до углекислого газа (Krebs et al., 1937). Позже было показано, что именно матрикс митохондрий является местом локализации ферментов цикла Кребса. Митохондрии могут использовать в качестве источника энергии как пируват, получающийся в ходе расщепления углеводов гликолизом, а также расщепления аминокислот, так и жирные кислоты. Все эти источники энергии превращаются в митохондриях в ацетил-КоА. На первой стадии цикла Кребса ацетил-КоА соединяется с оксалоацетатом, в результате чего образуется шестиуглеродное соединение – цитрат. Далее в семи последовательных ферментативных реакциях происходит окисление цитрата до оксалоацетата. При этом выделяются две молекулы СО2. Освободившиеся 13 электроны восстанавливают молекулы коферментов (NAD+ и FAD) (Alberts et al., 2008). Восстановительные эквиваленты окисляются затем в электрон- транспортной цепи (ЭТЦ). ЭТЦ – это система переносчиков, которые осуществляют перенос атомов водорода или электронов с NADH на молекулу кислорода. В митохондриях перенос атомов водорода или электронов с NADH на кислород происходит в несколько стадий за счет участия дополнительных переносчиков электронов, у которых значения стандартных окислительновосстановительных потенциалов имеют промежуточное значение по сравнению с парами NAD+/NADH (Е0’ = - 0,32 B) и кислород/вода (Е0’ = + 0,82 B). Некоторые из этих переносчиков образуют пул (во внутренней митохондриальной мембране – пара убихинон/убихинол, в межмембранном пространстве – пара окисленный цитохром с/восстановленный цитохром с). Но большинство находятся в составе многокомпонентных белковых комплексов внутренней митохондриальной мембраны – так называемых комплексов дыхательной цепи (FMN, железосерные кластеры, гемы и другие) (Berry et al., 2000; Sazanov, 2007; Tsukihara et al., 1996; Wikstrom et al., 2006; Ленинджер, 1985). Энергия, высвобождающаяся при переносе электронов с одного переносчика на другой в составе комплексов I, III и IV дыхательной цепи, позволяет осуществлять также перенос протонов из матрикса митохондрии в межмембранное пространство (хемиосмотическое сопряжение). Этот перенос приводит к формированию электрохимического градиента протонов – ∆μН+. В обычной клетке электрохимический градиент протонов составляет 220 мВ (Виноградов, 1999; Скулачѐв, 1989). Существуют два разных способа генерации ∆μН+. Первый механизм носит название окислительно-восстановительной петли. Он основан на чередовании переноса через мембрану восстановительных эквивалентов в форме атомов водорода и в форме электронов (Mitchell, 1961). Примером генерации ∆μН+ по этому механизму является комплекс III. Второй возможный механизм генерации ΔμH+ получил название «протонной помпы». В данном случае энергия окислительно-восстановительных реакций 14 сопрягается с конформационными изменениями в белке и изменением значений рК различных протон-акцепторных групп. За счет этих событий происходит непосредственный трансмембранный перенос ионов Н+. По механизму протонной помпы происходит генерация потенциала комплексами I и IV. Создавшийся электрохимический градиент протонов (ΔμH+) идет на работу АТФ-синтетазы, которая синтезирует АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Этот процесс получил название окислительное фосфорилирование. АТФсинтетаза представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс с молекулярной массой более 500 кДа, работающий по роторному механизму. Каталитический центр, осуществляющий синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата, находится на β-субъединице F1. Синтез АТФ происходит благодаря циклически повторяющимся конформационным изменениям в β-субъединицах (Boyer, 1997; Meier et al., 2005; Stock et al., 2000; Weber, 2007). Кроме синтеза АТФ, ΔμH+ служит источником энергии для широкого ряда процессов. К ним относятся транспорт различных ионов и молекул (пирувата, АДФ, АТФ, фосфата и др.) через внутреннюю мембрану, энергозависимый обратный транспорт электронов, а также трансгидрогеназная реакция. Накопленная в виде ΔμH+ энергия может быть потрачена в тепло без сопряжения с каким-либо другим процессом. Такая диссипация происходит у млекопитающих в буром жире. Отличительной особенностью митохондрий бурого жира является наличие термогенина. Это белок, имеющий структурное сходство с АТФ-АДФ антипортером и являющийся природным разобщителем дыхательной цепи и синтеза АТФ (Brand, 2005; Nicholls, 2006). 1.1.3. Митохондриальные красители Для исследования митохондрий в живых клетках часто применяют флуоресцентные красители. Они представляют собой небольшие флуоресцентные липофильные катионы, способные проникать через мембраны. При энергизации внутренней мембраны митохондрии способны накапливать такие катионы, поскольку их внутренний объѐм заряжен отрицательно. Метод флуоресцентной 15 микроскопии позволяет наблюдать непосредственно в живой клетке тонкие нитчатые митохондрии, не видимые в световой микроскоп другими способами. К наиболее часто используемым митохондриальным флуоресцентным красителям относятся родамин 123 (метил-родамин), этиловый эфир тетраметилродамина (TMRE – tetramethylrhodamine-ethyl ester), JC-1 и красители группы MitoTracker компании Molecular Probes (США). JC-1 (5,5’,6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’-бензимидазолокарбоцианин йодид) представляет собой липофильный катион с делокализованным зарядом, который накапливается в митохондриях, обладающих потенциалом. Отличительной чертой этого красителя является способность формировать агрегаты при высоких концентрациях. При этом происходит сдвиг максимума флуоресценции из зеленой в красную область. TMRE также является липофильным катионом с делокализованным зарядом. Он способен проникать через липидные мембраны и накапливаться в митохондриях пропорционально уровню их мембранного потенциала. TMRE является наиболее часто используемым красителем. Он удобен тем, что имеет низкую токсичность. Его накопление в митохондриях очень динамично и меняется практически одновременно с мембранным потенциалом. Это позволяет следить за изменением мембранного потенциала в режиме реального времени (Koopman et al., 2008). Липофильные митохондриальные красители, включая TMRE, являются субстратами Р-гликопротеина, продукта гена множественной лекарственной устойчивости (Marques-Santos et al., 2003). Этот белок является АТФазой АВС типа и способен откачивать из клетки многие экзогенные вещества липофильной природы. В разных клетках активность P-гликопротеина может быть различной. Чтобы избежать непредсказуемого снижения флуоресценции за счет этого процесса и связанных с этим возможных ошибок, вместе с красителями в среду инкубации можно добавлять ингибитор Р-гликопротеина – верапамил. 16 1.1.4. Регуляция концентрации ионов Са2+ митохондриями Помимо энергетической функции, митохондрии способны также накапливать ионы кальция. Еще в 1960х годах было показано поглощение дышащими митохондриями Са2+ и других двухвалентных катионов (Vasington et al., 1962). В настоящее время известно, что кальций – это один из важнейших вторичных посредников в клетке. При этом концентрация Са2+ в цитозоле весьма низкая (10-7 М), он запасается в основном в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и митохондриях. Кальциевый сигналинг имеет вид «волн» повышения и понижения концентрации Са2+, причем митохондрии принимают важнейшее участие как в формировании этих «волн», так и их модулировании (Berridge et al., 2000; Rizzuto et al., 2000). Накопление кальция митохондриями (как и его выход) включает два этапа – перенос кальция через внешнюю мембрану и через внутреннюю мембрану (Hoppe, 2010). Как было сказано ранее, за проницаемость внешней митохондриальной мембраны для ионов и небольших молекул отвечает VDAC. Известно, что VDAC может находиться в двух состояниях – открытом (в норме) и закрытом (например, при взаимодействии с рутениевым красным или факторами семейства Bcl-2). В открытом состоянии он проницаем для метаболитов массой до 5 кДа и демонстрирует малую селективность в отношении пропускаемых молекул. Кроме того, опыты по реконструкции VDAC в липидном бислое показали, что VDAC проницаем не только для моновалентных катионов, но и для ионов Ca2+ (Gincel et al., 2001). Исходя из этого, считали, что кальций свободно диффундирует через открытый канал VDAC. Однако последние данные показали, что VDAC более проницаем для ионов кальция именно в закрытом состоянии (Tan et al., 2007), хотя размер поры при этом существенно меньше (1,8 нм в закрытом состоянии против 2,5 нм в открытом состоянии) (Song et al., 1998). Перенос кальция через внутреннюю митохондриальную мембрану в матрикс происходит с помощью ряда переносчиков – кальциевого унипортера, 17 митохондриального рианодинового рецептора и, по крайней мере, одного кальциевого канала (митохондриального кальциевого канала типа 2). Кальциевый унипортер осуществляет закачивание свободных ионов кальция из цитоплазмы в матрикс митохондрий за счѐт энергии электрохимического потенциала (Kirichok et al., 2004). Помимо этого, несколькими авторами было показано быстрое закачивание Са2+ в матрикс (так называемый RaM – rapid mode). Белковый комплекс, отвечающий за RaM, к настоящему моменту остается неизученным. Выдвигаются предположения, что RaM осуществляет тот же кальциевый унипортер, но в другом конформационном состоянии (Gunter et al., 2004). Кроме того, на внутренней митохондриальной мембране были обнаружены молекулы, по взаимодействию со специфическими антителами, молекулярной массе и связыванию [3H]рианодина похожие на рианодиновые рецепторы скелетных мышц (Salnikov et al., 2009). И хотя наличие собственных рианодиновых рецепторов в митохондриях еще обсуждается, полученные к настоящему времени данные о проводимости этих каналов указывают, что они ответственны за быстрое поглощение кальция митохондриями при сравнительно низких концентрациях (Altschafl et al., 2007). Предполагают, что именно рианодиновые рецепторы работают при физиологических условиях, в то время как кальциевый унипортер активируется при более высокой концентрации кальция, возможно, при патологических состояниях (Beutner et al., 2005). Третьим способом поступления Са2+ в митохондрию является митохондриальный кальциевый канал типа 2 (mCa2). Структура и функции этого канала остаются неизученными (Michels et al., 2009). Выход кальция из митохондрий через внутреннюю мембрану осуществляется также несколькими способами, в том числе с помощью Na+/Ca2+обменника и натрий-независимого выброса кальция. Na+/Ca2+-обменник считается основным способом выброса кальция в цитозоль в нервной и сердечной тканях (Hoppe, 2010). Для него была показана электрогенность – на три иона Na+ приходится один ион Са2+ (Jung et al., 1995). 18 Кроме того, для митохондриального саркоплазматического) показано Na+/Ca2+-обменника обращение функций при (как и для ингибировании метаболизма, что помогает предотвратить кальциевую перегрузку цитозоля. Это имеет большое значение при таких состояниях, как ишемия миокарда (Smets et al., 2004). Натрий-независимый выброс кальция из митохондрий является основным механизмом выхода кальция в клетках печени и почки (Crompton et al., 1977). Имеются данные об электронейтральности натрий-независимого выброса кальция (Gunter et al., 1983). Предполагают, что имеет место обмен Cа2+ на два иона Н+ (Gunter et al., 1990). Накопление митохондриями кальция Са2+ играет одну из центральных ролей в физиологии и патофизиологии клетки. В частности, поступление Са2+ из цитозоля в митохондрию регулирует скорость митохондриального синтеза АТФ (Jouaville et al., 1999). Ионы кальция, находящиеся в матриксе митохондрии, активируют дегидрогеназы цикла Кребса (Jouaville et al., 1999). Другие звенья митохондриального метаболизма, такие как ЭТЦ, АТФ-синтетаза и ANT, также регулируются ионами Са2+ (McCormack et al., 1990; Territo et al., 2000). От него зависит также подвижность митохондрий и их морфология (Yi et al., 2004). Более того, поглощение кальция митохондриями модулирует временное и пространственное распределение внутриклеточного Са2+. Так регулируются все сигнальные пути, связанные с этим катионом (Csordas et al., 1999; Rizzuto et al., 1998), включая клеточную смерть (Hajnoczky et al., 2006). 1.1.5. Транспорт в митохондрию Согласно данным масс-спектрометрии, при разрушении митохондрий можно выделить до 4000 различных белков у млекопитающих и около 1000 у дрожжей (Sickmann et al., 2003; Taylor et al., 2003). При этом собственный геном митохондрий содержит всего 37 генов, 13 из которых кодируют белки (прежде всего трансмембранные субъединицы комплексов дыхательной цепи и АТФсинтетазы), остальные – митохондриальные РНК (Holt et al., 2007). Таким 19 образом, большая часть белков как внешней мембраны, так и митохондриального матрикса кодируется ядерными генами и синтезируется в цитоплазме. Они попадают в митохондрии при помощи белковых систем транспорта, находящихся во внешней и внутренней мембранах. Митохондриальные белки всегда синтезируются в последовательности виде предшественников, митохондриального содержащих импорта. сигнальные Предшественники, как правило, остаются в развернутом состоянии до прохождения через мембрану. Для предотвращения агрегации и спонтанного фолдинга они взаимодействуют со вспомогательными белками – шаперонами Hsp70 и Hsp60. Часть белков, отправляющихся во внутреннюю мембрану и матрикс, содержит N-концевую сигнальную последовательность митохондриальной локализации, которая быстро отщепляется сигнальной пептидазой после транспорта белка. Другая часть белков внутренней мембраны и белки внешней мембраны содержат внутреннюю сигнальную последовательность, которая не удаляется после транспортировки. Лучше всего изучены сигнальные последовательности для белков, локализующихся в митохондриальном матриксе (Alberts et al., 2008). Сигнальная последовательность обычно имеет длину 18 аминокислотных остатков (16-20 аминокислотных остатков). Она содержит гидрофобные аминокислотные остатки, чередующиеся с гидрофильными (глицин, серин, метионин, тирозин) и ограничена с одной или двух сторон положительно заряженными аминокислотами. В результате сворачивания такой структуры образуется амфифильная α-спираль (Vogtle et al., 2009). Эта сигнальная последовательность узнаѐтся компонентами системы транслокации TOM (Rapaport, 2003). TOM транспортирует белки в межмембранное пространство. Центральным компонентом TOM является белок Tom40, который имеет структуру β-бочонка и формирует гидрофильную пору, через которую проникают предшественники митохондриальных белков (Hill et al., 1998). Дополнительные субъединицы комплекса выполняют рецепторые (Tom20, Tom 70/Tom71), а также модулирующие (Tom22, малые белки Tom5, Tom6, Tom7) функции. В качестве 20 первого шага импорта выступает взаимодействие сигнальной последовательности с рецепторной частью комплекса TOM (Brix et al., 1997). На втором этапе митохондриальный белок-предшественник проходит через канал ТОМ, начиная с N-конца. После прохождения через TOM предшественник белка внешней митохондриальной мембраны взаимодействует с шаперонами межмембранного пространства Tim9 и Tim10. После этого он встраивается в мембрану с помощью комплекса Mim1 (для белков с α-спиральным трансмембранным сегментом, например, Tom20 или Tom70 (Becker et al., 2008)) или комплекса SAM (для белков с трансмембранным сегментом в виде β-бочонка, например, VDAC или Tom40 (Wiedemann et al., 2003)). Если белок идет в межмембранное пространство, он, как правило, содержит множество цистеиновых остатков (например, малые шапероны Tim9 и Tim10). Благодаря этому предшественник такого белка быстро улавливается комплексом Mia40, который формирует временные межмолекулярные дисульфидные связи. Таким образом предотвращается взаимодействие белка с другими машинами импорта и его неправильная локализация. На следующем этапе Mia40 катализирует образование дисульфидных мостиков в белке, переводя его в нативную конформацию (Sideris et al., 2009). Встраивание белка во внутреннюю мембрану осуществляется с помощью комплекса TIM. После прохождения через TOM белок-предшественник также взаимодействует с шаперонами Tim9 и Tim10 межмембранного пространства для предотвращения агрегации. На первой стадии импорта шапероны, связанные с белком, взаимодействуют с рецепторной субъединицей Tim12. После этого белокпредшественник перемещается на основной комплекс машины импорта. TIM состоит из основной субъединицы Tim22, а также нескольких регуляторных субъединиц, включая Tim54. Tim54 содержит крупный домен в межмембранном пространстве, который является площадкой для связывания комплекса Tim9Tim10-Tim12. Tim22 формирует две поры большого диаметра, в каждую из которых способно пройти по крайней мере две α-спирали. Благодаря этому во 21 внутреннюю мембрану встраиваются белки, имеющие более одного трансмембранного домена. К ним относится большая часть переносчиков метаболитов, в частности ANT. Движущей силой этого транспорта является трансмембранный потенциал (Rehling et al., 2003). Наконец, белки, проникающие в митохондриальный матрикс, несут Nконцевую сигнальную последовательность, которая распознается белковым комплексом TIM23. Предшественники таких белков (а к ним относится большинство матриксных белков) поступают в матрикс при помощи энергии АТФ (Dudek et al., 2013). Как правило, оба комплекса митохондриального импорта, TIM и TOM, колокализуются и работают вместе. В местах их расположения наблюдается сближение внутренней и внешней мембран митохондрии (см. выше). Однако они могут функционировать и по отдельности. Так, белки внешней мембраны и межмембранного пространства проходят только через ТОМ. А при сильном нарушении внешней мембраны TIM сам по себе способен эффективно транспортировать белки в митохондриальный матрикс (Dudek et al., 2013). 1.1.6. Генерация активных форм кислорода Наряду с мембранными NADPH-оксидазами митохондрии являются одним из основных источников активных форм кислорода (АФК) – O2·-, H2O2, и OH· – в клетке. В ходе работы ЭТЦ митохондрий может происходить «утечка» электронов практически непосредственно на с любой стадии молекулярный и кислород. последующий В перенос результате их образуется супероксид-анион O2·-. Показано, что основными местами «утечки» электронов являются комплекс I, пул убихинона/убихинола, а также комплекс III. Супероксид-анион затем превращается в перекись водорода H2O2 под действием митохондриальной супероксиддисмутазы, содержащей ионы Mn2+. H2O2 в присутствии переходных металлов также может превращаться в высокореакционноспособный гидроксил-радикал OH· (Adam-Vizi et al., 2006). Другим важным источником АФК в митохондриях является α- 22 кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, причем производство АФК в нем тем больше, чем выше клеточный уровень NADH (Starkov et al., 2004; Tretter et al., 2004). Для комплекса I дыхательной цепи также показано увеличение продукции АФК с ростом уровня восстановленного NADH (Starkov et al., 2003). Значительное увеличение концентрации АФК может приводить к инактивации железосерных центров комплексов I, II и III дыхательной цепи и цис-аконитазы цикла Кребса. Это приводит к снижению продукции АТФ митохондриями (Wallace, 1999). Кроме того, АФК в больших концентрациях вызывают окислительные повреждения белков, липидов и ДНК. Показано, что агенты, ингибирующие работу комплекса I, повышают продукцию АФК на нем и, соответственно, вызывают его обширные окислительные повреждения (Chinopoulos et al., 2001). Окисление липидов приводит к развитию таких болезней, как атеросклероз и ишемия (Ott et al., 2007). Окислительные повреждения ДНК же представляют особую опасность для самих митохондрий, поскольку митохондриальная ДНК лишена гистонов (Duchen, 2004). С другой стороны, митохондрии имеют обширную защиту от АФК – в них содержатся супероксиддисмутаза, каталаза, тиоредоксины и глутатион-редуктаза (Jones et al., 2010). Последние исследования показывают, что АФК являются нормальными продуктами клеточного метаболизма и широко распространенными вторичными посредниками. Они вовлечены в регуляцию таких сигнальных путей, как каскад митоген-активируемых киназ (Behrend et al., 2003), каскады, связанные с транскрипционными факторами NF-κВ и AP1 (Klaunig et al., 2004), HIF-1сигналинг (Finkel, 2012). Все эти сигнальные пути имеют важнейшее значение в регуляции апоптоза, клеточной пролиферации и дифференцировки, а также в канцерогенезе. Это также означает, что продукция АФК в клетке должна строго регулироваться. 23 1.1.7. Динамика и подвижность митохондрий Митохондрии являются подвижными и пластичными органеллами. Митохондрии способны к изменениям формы и объема. Набухание митохондрий вызывается Са2+, неорганическим фосфатом и рядом других; АТФ же препятствует набуханию (Frederic et al., 1952). В настоящее время ясно, что набухание митохондрий является следствием формирования PTP и важным (хотя и не обязательным) шагом в развитии апоптоза – увеличение объема митохондриального матрикса приводит к расправлению крист и разрыву внешней мембраны. В результате цитохром с и некоторые другие факторы выходят в цитозоль и запускают апоптоз (Vianello et al., 2012). При помощи световой и флуоресцентной микроскопии живых клеток было показано, что митохондрии чрезвычайно динамичны. Они способны перемещаться внутри клетки, распадаться на более короткие фрагменты или, наоборот, объединяться, а также ветвиться. Митохондрии передвигаются по микротрубочкам и актиновым микрофиламентам (Ligon et al., 2000; Morris et al., 1995), причѐм в первом случае движение происходит с существенно большими скоростями (Hollenbeck, 1996). Центробежный транспорт митохондрий по микротрубочкам происходит с участием белков из семейства кинезинов (Nangaku et al., 1994; Tanaka et al., 1998). За перемещение митохондрий к минус-концу микротрубочек отвечает цитоплазматический динеин (Pilling et al., 2006). Нельзя исключить и участие кинезинов в этом процессе, таких как кинезин-14 (Hanlon et al., 1997; Yang et al., 2001). Локальные перемещения митохондрий, по-видимому, происходят в результате транспорта по актиновым микрофиламентам при участии миозинов, например, миозина-19 (Quintero et al., 2004). Была предложена модель «двойного транспорта», в которой за дальний транспорт органелл отвечают кинезины и динеин, ассоциированные с микротрубочками, а за локальные перемещения – миозины, ассоциированные с актиновыми филаментами (Langford, 2002). В клетках митохондрии, как правило, локализуются в местах наибольшего потребления энергии. Например, в скелетных мышцах они располагаются вблизи 24 миофибрилл (Appaix et al., 2003); в сперматозоидах они образуют спиральный футляр вокруг жгутика (Olson et al., 1986); в клетках, снабженных ресничками, они находятся у основания ресничек непосредственно под клеточной мембраной. В нервных клетках большинство митохондрий сосредоточено в синаптических окончаниях, растущих аксонах, перехватах Ранвье (Chada et al., 2003). В секреторных клетках они тесно связаны с зонами упорядоченно расположенных мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума. В то же время, при нарушении нормального распределения митохондрий в мышечных клетках наблюдается прогрессирующее разрушение матрикса, а сами они собираются в группы около сарколеммы (Balogh et al., 2005; Milner et al., 2000). Таким образом, для нормального функционирования митохондрий большое значение имеет их внутриклеточное распределение. В клетках позвоночных ПФ формируют обширную сеть, занимающую весь объем цитоплазмы (Goldman et al., 2008). Большая их часть сосредоточена в околоядерной области, а на периферии они располагаются более редко (Collins et al., 2002; Tanaka et al., 1998). Такое распределение зависит от системы микротрубочек (Ball et al., 1982). Большинство митохондрий на периферии неподвижна или движется с очень малыми скоростями. Лишь небольшая часть митохондрий перемещается с высокими скоростями (De Vos et al., 2003; Trinczek et al., 1999). Наличие в клетке митохондрий с разной подвижностью можно объяснить необходимостью их быстрой доставки в места наибольшего потребления энергии и их удерживания там. В лаборатории П. Холленбека было наглядно продемонстрировано подтверждение этой гипотезы. Оказалось, что транспорт и распределение митохондрий тесно связаны с конусом роста нейронов. Митохондрии активно перемещаются в подвижные конусы роста нервных окончаний, где необходимо наибольшее количество АТФ, в то время как их транспорта в неподвижные нервные окончания не происходит (Chada et al., 2003; Morris et al., 1993). Митохондрии активно удерживаются в подвижных нейритах (Chada et al., 2003). Таким образом, локализация митохондрий вблизи мест 25 наибольшего потребления энергии и их переключение между подвижным и неподвижным состояниями может достигаться двумя способами – как на уровне регуляции молекулярных моторов (De Vos et al., 2003; Morris et al., 1995), так и на уровне заякоривания митохондрии за элементы цитоскелета. На основании данных нескольких структурных и биохимических исследований предложено несколько механизмов заякоривания митохондрий с помощью микротрубочек, актиновых микрофиламентов и ПФ. В заякоривании на микротрубочках предположительно участвуют белки, ассоциированные с микротрубочками (microtubule-associated proteins – MAPs). МАРs представляют собой фибриллярные белки, которые обратимо связываются с микротрубочками и способствуют их полимеризации, придают им устойчивость против деполимеризующих агентов, а также вызывают образование пучков. MAPs способны специфически связываться с поверхностью митохондрий (Leterrier et al., 1994). Ингибирующее действие МАРs на транспорт митохондрий обратимо и зависит от фосфорилирования (Lopez et al., 1995). Появляется все больше работ, указывающих на то, что полимерный актин также участвует в заякоривании митохондрий. Так, разборка актиновых филаментов в клетке приводит к увеличению скорости движения митохондрий вдоль микротрубочек (Krendel et al., 1998). Участие актиновых филаментов в регулируемом заякоривании митохондрий также продемонстрировано при изучении быстрого аксонального транспорта митохондрий (Chada et al., 2003; Chada et al., 2004). Кроме того, было показано, что ингибирующее воздействие Fактина на транспорт митохондрий в культуре фибробластов оказывают только актиновые микрофиламенты, образованные при участии активированного белка из семейства форминов, mDia1, и представляющие собой пучки неразветвленных филаментов (Minin et al., 2006; Кулик et al., 2006). Кроме того, в ингибировании подвижности митохондрий принимают участие ПФ. Еще в ранних работах при помощи световой и электронной микроскопии были получены данные о колокализации митохондрий и ПФ в клетках (Eckert, 1986). Позже в опытах in vitro было показано, что мембранный 26 потенциал митохондрий играет роль в их взаимодействиях с белками нейрофиламентов (Leterrier et al., 1994). В нашей лаборатории было показано, что в фибробластах, лишенных гена виментина, подвижность митохондрий выше, чем в контрольных клетках (Некрасова et al., 2007). Зато, если в результате экспрессии экзогенного виментина восстановить сеть ПФ в этих клетках, то подвижность митохондрий снижается до контрольного уровня. Таким образом, роль цитоскелета в распределении митохондрий, которое, в свою очередь, оказывает влияние на их функции, не вызывает сомнения. Правильное распределение митохондрий достигается за счет не только транспорта по микротрубочкам и микрофиламентам, но и за счет заякоривания на различных цитоскелетных структурах. Поскольку в данной работе изучалось взаимодействие митохондрий с белком виментином, то в дальнейшем речь пойдет именно о ПФ. 1.2. Промежуточные филаменты (ПФ) ПФ имеют диаметр ~12 нм, что является промежуточным значением по сравнению с 8 нм для микрофиламентов и 20 нм для микротрубочек (Fuchs et al., 1994). Они являются важными структурными элементами как клеточного ядра, так и цитоплазмы (Herrmann et al., 2004). В разных типах клеток позвоночных и на разных стадиях дифференцировки экспрессируются гены разных белков цитоплазматических ПФ (Alberts et al., 2008; Toivola et al., 2005). В некоторых типах клеток может одновременно находиться несколько различных типов ПФ (Fuchs et al., 1994). Всего в геноме человека обнаружено около 70 генов, кодирующих различные белки ПФ, которые образуют одно из самых многочисленных белковых семейств (Herrmann et al., 2009). В отличие от актина и тубулина, которые обладают высококонсервативной структурой, гомология последовательностей белков ПФ составляет не более 20%. Основываясь на биохимическом, иммунологическом и структурном сходстве, выделяют ядерные и цитоплазматические ПФ. Ядерные ПФ (ламины) считаются 27 эволюционными представлены предшественниками четырьмя типами всех белков: ПФ. Цитоплазматические кератинами типа I и ПФ II, виментиноподобными, а также белками нейрофиламентов. Кератины экспрессируются в эпителиальных клетках и их производных. Кератиновые ПФ представлены только гетерополимерами, состоящими из равного количества кислых (тип I) и основных (тип II) субъединиц кератина (Toivola et al., 2005). К виментиноподобным относится виментин, который встречается во многих клетках мезенхимального происхождения; десмин, который экспрессируется во всех типах мышечных клеток; периферин, который в периферических нейронах участвует в сборке ПФ наряду с белками нейрофиламентов; кислый глиальный белок (glial filament acidic protein – GFAP), экспрессирующийся в клетках глии (Toivola et al., 2005). Виментиноподобные белки образуют, в зависимости от типа клеток, как гомополимеры, так и гетерополимеры с другими белками ПФ, например, с белками нейрофиламентов (Fuchs et al., 1994). Нейрофиламенты найдены в нейронах позвоночных, где они участвуют в радиальном росте аксонов. К ним относится α-интернексин (Pachter et al., 1985), а также легкие, средние и тяжелые белки нейрофиламентов (neurofilament light, medium, heavy – NF-L, NF-M, NF-H) (Angelides et al., 1989). Однако, несмотря на такое большое разнообразие типов ПФ, структура их молекул достаточно схожа (см. рисунок 2 А). 1.2.1. Строение ПФ Все белки цитоплазматических ПФ построены по одной схеме: центральная часть молекулы представляет собой α-спираль, разделенную тремя небольшими линкерными участками, а N- и C-концевые домены, различные по длине у разных белков, не имеют определенной вторичной структуры (Herrmann et al., 2004). 28 Рисунок 2. А – схема строения различных типов ПФ; Б – этапы сборки цитоплазматических ПФ (по (Alberts et al., 2008)). Строение центрального домена очень консервативно. Он содержит четыре спиральных сегмента 1А, 1В, 2А, 2В, которые отделяются друг от друга короткими неспиральными участками-линкерами L1, L1-2 и L2 (см. рисунок 2 А). Линкеры содержат остатки пролина и глицина. Α-спиральные сегменты центрального домена формируют параллельную левовращающую суперскрученную спираль с аналогичными участками другой молекулы (Steinert et al., 1993). Белки, способные к образованию суперскрученной спирали, содержат в аминокислотной последовательности повторы из 7 аминокислот – гептады вида (abcdefg)n. В гептадах положения а и d занимают небольшие гидрофобные остатки – лейцин, изолейцин, метионин и валин. Таким образом, суперскрученная спираль образована за счѐт гидрофобных контактов (Herrmann et al., 2007). 29 N-концевой домен играет важную роль в формировании и стабилизации структуры виментиновых и кератиновых ПФ, однако о трехмерной структуре этого домена в составе филамента известно достаточно мало. Молекулы виментина и кератинов, лишенные N-концевого домена, не собираются в филаменты. По-видимому, в процессе сборки положительно заряженная «голова» взаимодействует с кислым α-спиральным доменом (Traub et al., 1992). Было показано, что для полимеризации виментина важен нонапептид SSYRRIFGG на самом конце головного домена виментина. Он очень консервативен среди всех виментиноподобных ПФ (Herrmann et al., 1992). Удаление первых 24 аминокислотных остатков виментина, включающих в себя этот нонапептид, делает сборку филаментов полностью невозможной. Удаление аминокислотных остатков с 25 по 38 не влияет на способность белка к полимеризации как in vitro, так и in vivo. В то же время удаление остатков с 25 по 63 приводит к тому, что ПФ не собираются in vitro, хотя могут образовываться in vivo. При удалении аминокислотных остатков с 44 по 69, с 44 по 95 или с 40 по 95 виментин также может полимеризоваться in vivo. Кроме того, виментин с делецией аминокислотных остатков с 25 по 68 и с 44 по 103 полностью не способен к сборке в филаменты. Необходимость аминокислот с 95 по 103, а также первых 25 аминокислот виментина для сборки филаментов привела к предположению, что несколько остатков в С-концевой части головного домена играют решающую роль в сборке виментина в филаменты наряду с упомянутым выше нонапептидом (Shoeman et al., 2002). Полагают, что при образовании тетрамера виментина участок, расположенный на N-конце головного домена, приближается к центральному домену соседней белковой субъединицы и связывается с ним (Shoeman et al., 2002). При этом участок, расположенный в середине N-концевого домена, образует петлю. Она может выходить за пределы филамента и становиться доступной для взаимодействия с клеточными структурами. Например, на N-концевом домене найден участок связывания нуклеиновых кислот (Wang et al., 2000). Кроме того, именно в N-концевом домене виментина сосредоточено большое количество сайтов посттрансляционной модификации. 30 Это свидетельствует об огромной важности этого участка для регуляции сборки и динамики ПФ, а также взаимодействия с другими органеллами (см. ниже). С-концевой домен виментина, «хвост», не обязателен для сборки филаментов. Однако ПФ, состоящие из виментина без С-концевого домена, оказываются более толстыми и рыхлыми (Herrmann et al., 1996). 1.2.2. Сборка ПФ Пять типов белков ПФ, выделенных на основе гомологии последовательностей, разделяют на три группы, различающиеся принципами сборки. К первой группе сборки относят кератины, ко второй – виментиноподобные белки и нейрофиламенты, а третью группу сборки образуют ядерные ламины. Эти три группы могут сосуществовать как независимые системы ПФ внутри одной клетки (Herrmann et al., 2000). ПФ, в отличие от микротрубочек и микрофиламентов, обладают способностью к самосборке в отсутствие дополнительных белков и без затраты энергии ГТФ или АТР. Сборка ПФ проходит последовательно в несколько этапов: сначала образуются димеры, а затем из них – тетрамеры, октамеры, протофиламенты из 8 октамеров (Meng et al., 1994; Sokolova et al., 2006; Strelkov et al., 2004). 1.2.2.1. Формирование димеров Первой стадией самосборки ПФ является формирование димеров (см. рисунок 2 Б). Димеры образуются в результате гидрофобных взаимодействий между аминокислотными остатками в положениях а и d гептадных повторов центрального домена (Meng et al., 1994). Структура центральных доменов и их взаимодействие для образования димера на примере виментина были предсказаны на основании анализа первичной последовательности и впоследствии подтверждены и исследованы с помощью рентгеноструктурного анализа. Большой размер надмолекулярных структур ПФ затрудняет получение трехмерных кристаллов, поэтому были закристаллизованы лишь отдельные 31 небольшие фрагменты. Вопреки ожиданиям оказалось, что сегменты 1А виментина внутри димера расположены параллельно, то есть являются одиночными α-спиралями. Предполагается, что мономерные спирали сегмента 1А служат для соединения обращенной назад «головы» одной полипептидной цепи и сегментом 1А другой полипептидной цепи димера (Strelkov et al., 2004). Особую роль в сборке ПФ играют концевые участки центрального домена. Исследования формирования филаментов in vitro показали, что даже точечная замена аминокислоты на N-конце сегмента 1А или на С-конце сегмента 2В приводит к серьезным нарушениям их структуры (Letai et al., 1992). 1.2.2.2. Формирование тетрамеров Следующим этапом сборки ПФ является объединение димеров в более крупные комплексы – тетрамеры в случае цитоплазматических ПФ (см. рисунок 2 Б). Этим они отличаются от ламинов, которые при сборке соединяются по механизму «голова-к-хвосту» и образуют линейные полимеры (Fuchs et al., 1994). В образовании тетрамеров виментина участвуют электростатические взаимодействия чередующихся зон положительных зарядов, избыток которых имеется в N-концевом домене, и отрицательных, преобладающих в центральном домене (Meng et al., 1994). Существует несколько моделей соединения димеров в тетрамеры. Модель А11 предполагает, что два антипараллельных димера взаимодействуют таким образом, что сегменты 1В их центральных доменов значительно перекрываются. Согласно другой модели, А22, два антипараллельных димера перекрываются в области сегментов 2В. В третьей модели, А12, два димера антипараллельны и полностью перекрываются (расположены «в регистре»). Для виментина была предложена также четвертая модель взаимодействия между димерными комплексами в составе филаментов – ACN. Если два тетрамера, образованные согласно моделям А11 и А22, оказываются рядом, то по одному димеру из каждого тетрамера будут взаимодействовать по принципу «голова к хвосту». В этом случае 5–10 N-концевых остатков сегмента 1А одного димера будут 32 перекрываться с 5–10 C-концевыми остатками сегмента 2В другого димера. Сходные данные были получены также для кератинов (Steinert et al., 1993) и десминовых ПФ (Geisler et al., 1992). Измерения, проведенные с помощью метода малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (Svergun et al., 2002), указывают на то, что димеры в тетрамере находятся на расстоянии 3,4 нм друг от друга, в то время как расстояние между суперскрученными спиралями в димерах составляет всего 1,5 нм. Возможно, такое разъединение связано с тем, что непосредственный контакт кислых центральных доменов электростатически неблагоприятен. Также оказалось, что соединение димеров в тетрамер в соответствии с моделью А11 происходит во многом благодаря второй половине N-концевого домена (аминокислотные остатки с 35 по 70), то есть электростатическое притяжение положительно заряженной «головы» и кислого центрального домена, повидимому, является движущей силой (Meng et al., 1994; Sokolova et al., 2006). 1.2.2.3. Формирование протофиламентов единичной длины и дальнейшие этапы сборки Существование димеров и тетрамеров виментина предсказано по первчной структуре белка и доказано in vivo (Sokolova et al., 2006), но сведений о других промежуточных компонентах сборки в литературе крайне мало. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей показал, что сборка виментиновых ПФ in vitro происходит с последовательным образованием различных олигомеров, включающих тетрамеры, октамеры и, наконец, протофиламент единичной длины (unit length filament – ULF) (Sokolova et al., 2006). Вопрос о существовании октамеров in vivo до сих пор открыт; большинство исследований говорит о том, что тетрамеры объединяются непосредственно в протофиламенты единичной длины. ULF обычно состоит из восьми тетрамеров и имеет диаметр около 16 нм при длине 60 нм. Поперечное сечение ULF скорее овальное, чем круглое (Herrmann et 33 al., 2004). Отдельные ULF могут значительно различаться по количеству образующих их виментиновых тетрамеров (Sokolova et al., 2006). Последним этапом сборки является формирование собственно филамента. Эксперименты in vitro и математическое моделирование показали, что на самых ранних стадиях сборки de novo тетрамеры быстро объединяются в ULFs, после чего ULF собираются в короткие филаменты за счет латеральных взаимодействий (Kirmse et al., 2007). Формирование длинных филаментов представляет собой более сложный процесс – они образуются как за счет объединения ULF, так и за счет добавления тетрамеров и ULF к существующим филаментам. Показано также объединение как коротких, так и длинных филаментов и обмен субъединицами по всей длине филамента. Наличие такого большого количества вариантов сборки характеризует ПФ как чрезвычайно динамичные структуры (Czeizler et al., 2012). Количество тетрамеров, приходящихся на поперечный срез одного филамента, варьирует в зависимости от типа ПФ и условий сборки. Для виментина показано, что один филамент может состоять из 24–40 полипептидов, то есть обычно из 3–8 тетрамеров (Herrmann et al., 2004). На последнем этапе сборки происходит уплотнение субъединиц филаментов до толщины 10–12 нм. Возможно, этот этап также сопровождается перестройкой внутри филаментов, потому что варианты сборки тетрамеров А22 и А12 обнаруживаются только в зрелых структурах (Sokolova et al., 2006). Также на основании результатов экспериментов in silico ряд авторов предполагает, что такое существенное уплотнение может быть результатом перехода из αспиральной в β-тяжевую конформацию на уровне мономеров виментина. Этот переход, возможно, лежит в основе уникальных механических свойств виментина – возникающее при больших механических нагрузках скольжение β-тяжей друг относительно друга позволяет виментину придавать цитоплазме высокую прочность (Qin et al., 2009). Таким образом, ПФ состоят из полипептидов, связанных сильными гидрофобными и электростатическими взаимодействиями, что сообщает им 34 высокую устойчивость к механическим нагрузкам. Кроме того, ПФ проявляют высокую динамичность и подвижность. 1.2.3. Динамика ПФ в клетке В живых клетках сборка, разборка и перемещение ПФ происходят непрерывно. Как уже было сказано, субъединицы ПФ и зрелые полимеры находятся в цитоплазме в равновесии, и включение новой субъединицы (как тетрамера, так и ULF) может происходить в любом месте филамента. Кроме того, к перемещению внутри клетки способны субъединицы ПФ на любых этапах сборки, а также зрелые фибриллы. Возможно, это объясняется различным взаимодействием ПФ с молекулярными моторами (Helfand et al., 2004). Для виментина было показано, что они могут перемещаться в цитоплазме и по направлению к клеточной поверхности, и по направлению к ядру. Средняя скорость перемещения длинных филаментов составляет 0,2–0,3 мкм/мин, субъединицы же двигаются быстрее (1–2 мкм/сек), в основном вдоль микротрубочек (Yoon et al., 1998). Большинство из них (65–70%) перемещается к периферии клетки за счет связывания с кинезином (Gyoeva et al., 1991). Движение к минус-концу микротрубочек, к ядру, обусловлено взаимодействием с динеиндинактиновым комплексом (Helfand et al., 2002). Поддержанию сети ПФ способствует также связывание белков, ассоциированных с ПФ (intermediate filament associated proteins – IFAP). Длинные виментиновые ПФ взаимодействуют с IFAP, например, с плектином, который образует поперечные сшивки между отдельными фибриллами, препятствуя тем самым их движению. По-видимому, такое взаимодействие необходимо для стабилизации ПФ в областях цитоплазмы, подвергающихся механическому стрессу (Helfand et al., 2004). Кератиновые ПФ, в отличие от виментиноподобных, всегда являются гетерополимерами (см. выше). Поэтому для поддержания стабильной сети кератинов необходим баланс между субъединицами I и II типа. Избыток кератинов одного из типов приводит к нарушению сети ПФ. Интересно, что в 35 клетках, одновременно экспрессирующих кератин и виментин, длинные кератиновые филаменты двигаются в 3 раза медленнее виментиновых (0,06 мкм/мин), а кератиновые субъединицы в 15 раз медленнее виментиновых субъединиц. Кроме того, транспорт кератиновых субъединиц в основном направлен к ядру (84%). Причина этих различий кроется том, что большая часть кератиновых субъединиц ассоциирована с сетью актиновых микрофиламентов и перемещается с помощью миозина. Виментин же, как уже было упомянуто, перемещается в основном по микротрубочкам (Helfand et al., 2004). Особый интерес представляет формирование системы ПФ в нейронах. Субъединицы нейрофиламентов перемещаются вдоль аксона со скоростью, равной 1,8 мкм/сек (Roy et al., 2000), так как они транспортируются по микротрубочкам при помощи кинезина и динеина. Движение этих структур прерывается долгими паузами, так что двигаются они только 27% времени, а в зрелых сенсорных аксонах нейрофиламенты находятся в покое около 99% времени (Brown, 2000). Итак, ПФ проявляют большую подвижность внутри клетки. Они взаимодействуют с моторными белками и IFAP, которые, в свою очередь, помогают им в распределении и формировании внутриклеточных сетей ПФ. Вместе с тем несомненно, что и сборка-разборка, и транспорт, и взаимодействие ПФ с другими органеллами находятся под регуляторным контролем внешних и внутренних факторов и могут модулироваться, прежде всего за счет фосфорилирования. 1.2.4. Фосфорилирование белков ПФ Одним из наиболее хорошо изученных способов регуляции структуры, динамики и взаимодействия ПФ с другими органеллами клетки является фосфорилирование различными протеинкиназами. Как уже было упомянуто выше, сосредоточение большого числа сайтов фосфорилирования в N-концевом домене виментина косвенно указывает на важность этого домена и этой посттрансляционной модификации для сборки и стабильности филаментов, а 36 также регулируемого взаимодействия с клеточными органеллами. Так, фосфорилирование играет основную роль в регуляции структуры ПФ и их сборке (Ku et al., 1996). Кроме того, при помощи фосфорилирования могут контролироваться связь с IFAP и тканеспецифические взаимодействия ПФ (Liao et al., 1996), а также изменения структуры ПФ при стрессе (Caulin et al., 2000). Здесь следует отметить, что фосфорилированию виментина было посвящено довольно много исследований и получены обширные данные, хотя порой сильно различающиеся в зависимости от метода исследования (in vitro или in vivo). 1.2.4.1. Фосфорилирование ПФ in vitro В ранних работах, посвященных исследованию структуры и функций ПФ, было установлено, что фосфорилирование in vitro немедленно вызывает их деполимеризацию. Кроме того, оказалось, что протеинкиназа А (ПКА) и ПКС имеют различные участки фосфорилирования в этом белке (Inagaki et al., 1987). Дальнейшие исследования показали, что и другие ПФ разрушаются вследствие сайт-специфического фосфорилирования in vitro целым рядом протеинкиназ, причем участки фосфорилирования находятся преимущественно в N-концевом домене (Минин и др., 2008). 1.2.4.2. Фосфорилирование ПФ in vivo Первые данные о том, что благодаря фосфорилированию ПФ претерпевают значительные изменения in vivo, были получены на клетках, входящих в митоз. Оказалось, что активация протеинкиназы cdc2 (cell division cycle) на ранних стадиях митоза приводит к фосфорилированию ПФ и их коллапсу к ядру во многих типах клеток (Tsujimura et al., 1994). Впоследствии с использованием антител, специфичных к различным фосфорилированным формам виментина, удалось показать существенную роль остатков серина-55 и серина-82 виментина. Оказалось, что после того, как cdc2 фосфорилирует серин-55, с этим сайтом связывается и активируется протеинкиназа Polo 1, которая, в свою очередь, фосфорилирует серин-82 (Izawa et al., 2006). Этот подход оказался успешным и 37 для обнаружения двух участков фосфорилирования виментина в процессе цитокинеза – серин-38 и серин-72. Было установлено, что для разделения двух дочерних клеток необходимо участие Rho-киназы, фосфорилирующей серин-38 и серин-71 виментина (Kosako et al., 1999), и киназы Aurora B, которая фосфорилирует серин-72 (Goto et al., 2003). Коллапс и фрагментация сети ПФ наблюдается также при активации ПКА в фибробластах (Lamb et al., 1989) или кальций/кальмодулин-зависимой киназы II в астроцитах (Ogawara et al., 1995). Действие ПКА может быть объяснено тем, что фосфорилирование ею головного домена виментина ингибирует его взаимодействие с участком на α-спиральном домене (Gohara et al., 2001). Сходные изменения есть в клетках, обработанных ингибиторами фосфатаз, что вызывает повышение уровня фосфорилирования белков ПФ (Hocevar et al., 1993). Однако перечисленные изменения не наблюдаются в интерфазных клетках, и вопрос о функциях фосфорилирования виментина этими протеинкиназами остается открытым. Возможно, эти реакции участвуют в небольших перестройках сетей ПФ и носят локальный характер. Следует отметить, что в опытах in vivo были обнаружены далеко не все из многочисленных сайтов фосфорилирования, известных по опытам in vitro. Например, для ПКС в исследованиях in vitro были найдены 11 сайтов фосфорилирования (Koch et al., 2003). При этом инъекция в клетки конститутивно-активного мутанта ПКС позволяла обнаружить фосфорилирование in vivo, а активация эндогенной ПКС форболовым эфиром (ТРА) – нет (Takai et al., 1996). На основании этих данных авторы сделали вывод, что участие ПКС в фосфорилировании виментиновых ПФ зависит от локализации самой киназы, и в интерфазных клетках сеть филаментов для нее недоступна. Важно отметить, что один и тот же аминокислотный остаток виментина может фосфорилироваться разными протеинкиназами. Это хорошо видно из данных опытов in vitro, приведенных в обзоре (Минин et al., 2008). Например, в гладкомышечных клетках в регуляции сокращения принимает участие протеинкиназа PAK1 (р21-активируемая киназа). Она фосфорилирует остаток 38 серина-55 виментина. Это приводит к частичной разборке ПФ и их переориентации в клетках. Предполагают, что в результате перераспределяются белки, участвующие в регуляции сокращения актомиозиновых комплексов, такие как Rho-киназа и адаптерный белок р-130 (Li et al., 2006). Таким образом, фосфорилирование этого аминокислотного остатка является ключевым для перестроек ПФ в митозе, но может участвовать и в других не менее важных процессах. Итак, в N-концевом домене виментина сосредоточено большое число участков фосфорилирования, которые важны в основном для регуляции процессов сборки-разборки этих цитоскелетных структур. Однако гораздо хуже изучено участие фосфорилирования ПФ в регуляции их взаимодействия с другими органеллами. 1.2.5. Функции виментина. Болезни, связанные с ПФ ПФ, в отличие от тубулиновых микротрубочек и актиновых микрофиламентов, не являются полярными и не могут служить транспортными путями для передвижения органелл. «Традиционной» функцией ПФ считается обеспечение механической прочности клеток (Fuchs et al., 1994). Однако в последнее время показано их участие в организации функционирования белков, вовлечѐнных в клеточную адгезию, миграцию и передачу сигналов, а также в транспорте липидов (Toivola et al., 2005). Кроме того, ПФ играют важную роль в распределении и функционировании мембранных органелл, в частности митохондрий (Styers et al., 2005). Вышеупомянутое перераспределение Rho-киназы и р-130 при фосфорилировании виментина в ходе регуляции сокращения гладкомышечных клеток говорит о том, что ПФ могут выступать в роли каркаса для различных сигнальных путей. Другим примером является способность виментина регулировать передачу сигнала в каскаде, включающем протеинкиназу ERK. ERK1/2-путь – один из сигнальных путей, активируемых стимуляцией βадренергических рецепторов катехоламинами. При взаимодействии рецептора с 39 лигандом непосредственно с цитоплазматическим доменом рецептора связывается киназа Src, что приводит в итоге к активации ERK. Однако в отсутствие сети виментиновых филаментов активация ERK не происходит. Возможно, виментиновые филаменты являются в данном случае одной из регуляторных структур рецептора, которая обеспечивает передачу сигнала через Src на ERK (Kumar et al., 2007). О важности ПФ в физиологии клетки говорит также большое количество известных патологий, связанных с нарушениями как в структуре ПФ, так и в их связывании с другими органеллами, в частности, с митохондриями. Так, в сердечных и скелетных мышцах мышей, лишенных десмина, изменяется морфология митохондрий и их внутриклеточная локализация. В таких митохондриях также наблюдается прогрессирующее разрушение матрикса, а сами они собираются в группы около сарколеммы (Balogh et al., 2005; Milner et al., 2000). Все эти изменения приводят к нарушению функций митохондрий: снижается максимальная скорость дыхания, АДФ-стимулируемое потребление кислорода, исчезает креатинкиназа, падает уровень цитохрома с, белок Bcl-2 перемещается с внутренней мембраны митохондрий на их наружную мембрану (Milner et al., 2000). У человека в настоящее время известно более 80 заболеваний, прогрессия которых обусловлена нарушениями в белках ПФ. Среди них разнообразные дегенеративные поражения кожи, такие как буллезный эпидермолиз, и ламинопатии – группа патологий, связанных с точечными мутациями в гене ламина А (Worman et al., 2002). Известно, что при некоторых из этих заболеваний нарушается внутриклеточное распределение митохондрий. Одной из возможных причин нейропатии Шарко-Мари-Тус, согласно последним данным, являются мутации в белке нейрофиламентов NF-L, приводящие к скоплению митохондрий в теле нейрона, уменьшению количества митохондрий в аксоне и снижению аксонального транспорта нейрофиламентов (Brownlees et al., 2002). Нарушения распределения митохондрий в клетках также наблюдается у больных буллезным 40 эпидермолизом, который вызывается мутациями в кератинах К5 или К14 (Bonifas et al., 1991). Таким образом, роль цитоскелета в распределении митохондрий, которое, в свою очередь, оказывает влияние на их функции, не вызывает сомнения. Поэтому можно предположить, что многообразные перестройки цитоскелетных структур, которые сами являются объектом сложной регуляции, приводят к изменениям в работе митохондрий. Следовательно, изучение процессов регуляции структуры цитоскелета позволило бы лучше понять, какие стимулы важны для обеспечения нормального распределения и функционирования митохондрий. 1.3. Белок Rac1 и его эффектор протеинкиназа РАК1 Одним из основных факторов, позволяющих регулировать внутриклеточный транспорт, является способность цитоскелета к структурным перестройкам в ответ на внешние стимулы (Минин et al., 2004). Центральную роль в регуляции организации компонентов цитоскелета играют Rho-ГТФазы – подгруппа суперсемейства Ras малых ГТФ-гидролаз, а именно белки RhoА, Сdc42 и Rac1 (Hall et al., 2000; Ridley, 1996; Van Aelst et al., 1997). Rho-ГТФазы в клетках активируются в ответ на сигналы, полученные клеточными рецепторами от внешних ростовых факторов. Например, лизофосфатидная кислота активирует RhoА, брадикинин активирует Сdc42. Rho-ГТФазы включают нижестоящие белки-мишени, которые либо непосредственно изменяют структуру актиновых микрофиламентов, микротрубочек и ПФ, либо передают сигнал на дальнейшие эффекторы. Малые ГТФазы совершают цикл между активной ГТФ-формой, в которой они могут связываться с различными белками-мишенями, и неактивной ГДФформой. Переход из одной формы в другую регулируется многочисленными клеточными факторами. Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GDP/GTP exchange factors – GEF) стимулируют присоединение ГТФ к Rho-ГТФазам, тем 41 самым активируя их. Белки, активирующие ГТФазу (GTPase-activating proteins – GAP), увеличивают ГТФ-азную активность Rho-белков и инактивируют их (Etienne-Manneville et al., 2002; Schmidt et al., 2002). В клетке часть молекул ГТФаз находятся в цитозоле, а часть связаны с внутренней стороной цитоплазматической мембраны за счет прикрепления геранил-геранильного или фарнезильного остатков к цистеину в С-концевой области в процессе посттрансляционной модификации. Считается, что Rho-белки активны только в случае прикрепления к мембране. Растворенные же молекулы связаны в цитозоле с ингибиторами диссоциации гуаниловых нуклеотидов (GDP dissociation inhibitors – GDI) и поэтому не работают (Moissoglu et al., 2006). Наиболее хорошо изученной функцией Rho-белков является регуляция динамики актинового цитоскелета. В клетках млекопитающих RhoA, Rac1 и Cdc42 стимулируют образование стресс-фибрилл, ламеллоподий и филоподий, соответственно. RhoA при активации индуцирует образование стресс-фибрилл и зрелых фокальных контактов, при помощи которых клетки прикрепляются к субстрату. Известными мишенями активированного RhoA является белок mDia1 (Watanabe et al., 1999) и Rho-киназа (Ishizaki et al., 1997). mDia1 с большим сродством связывает белок профилин, являющийся фактором обмена АДФ на АТР в актине, и тем самым вызывает усиленную полимеризацию актина (Wasserman, 1998). Rhoкиназа фосфорилирует легкие цепи миозина, что способствует сборке актомиозиновых филаментов (Amano et al., 1996). C другой стороны, Rho-киназа активирует протеинкиназу LIMK. Последняя фосфорилирует и тем самым ингибирует кофилин, что приводит к стабилизации актиновых филаментов (Maekawa et al., 1999). Cdc42 вызывает образование филоподий в клетках млекопитающих. Он связывает и активирует белок N-WASP. N-WASP, как и WAVE, способен непосредственно связывать G-актин и активировать комплекс Arp2/3. Комплекс Arp2/3 взаимодействует с молекулами актина и функционирует как центр нуклеации нового актинового филамента (Etienne-Manneville et al., 2002). 42 Rho-белки также принимают активное участие в регуляции системы микротрубочек. Активация RhoА стимулирует образование стабильных микротрубочек, направленных к переднему краю клеток, в фибробластах (Cook et al., 1998). Сdc42, помимо участия в образовании актиновых филоподий, стимулирует процесс переориентации центра организации микротрубочек (Palazzo et al., 2001). Таким образом, представители семейства Rho ответственны за разнообразные перестройки цитоскелета. Однако последние данные показывают, что их влияние на клетку намного обширнее, о чем ниже будет рассказано на примере белка Rac1 – наиболее хорошо изученного представителя семейства Rho. 1.3.1. Белок Rac1 1.3.1.1. Строение белка Rac1 Белок Rac1 (ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) – один из ключевых представителей семейства Rho (Bosco et al., 2009). Rac1 представляет собой небольшой белок (192 аминокислотных остатка). Он содержит высококонсервативный 20 кДа ГТФазный домен, характерный для всех ГТФгидролаз. В состав этого домена входят пять α-спиралей, шесть β-тяжей и пять петель. Наиболее консервативными участками являются именно петли, поскольку они образуют активный центр фермента. Сравнение структуры ГТФазного домена в ГТФ- и ГДФ-связанных состояниях позволило выявить регионы, подвергающиеся наибольшим конформационным изменениям при переходе из одного состояния в другое. Ими оказались участки Switch1 (аминокислотные остатки с 26 по 45) и Switch2 (аминокислотные остатки с 59 по 74). Эти участки являются наиболее важными при взаимодействии Rac1 с его эффекторами (р21активируемыми киназами (РАКs), арфаптином, NADPH-оксидазой и другими) и регуляторами (GEFs, GAPs, GDIs). Они получили название эффекторных петель. 43 1.3.1.2. Подходы к изучению функций белка Rac1 Одним из возможных подходов к изучению функций белка Rac1 является внесение точечных мутаций в эффекторные петли или вблизи них. Оказалось, что такие мутации могут существенно изменять работу Rac1 как в отношении гидролиза ГТФ, так и в отношении взаимодействия белка с его эффекторами. Так, аминокислотный остаток Gln61 играет важную роль в стабилизации γфосфата ГТФ в реакции гидролиза. Мутантный белок с точечной заменой глутамина на лейцин в положении 61 (Rac1Q61L) не способен к спонтанному и GAP-активируемому гидролизу ГТФ (Rittinger et al., 1997). Тем же эффектом обладает замена валина на глицин в положении 12 – остаток валина существенно больше глицина и отталкивает ГТФ от Gln61 в активном центре фермента. Поэтому белки Rac1G12V и Rac1Q61L являются конститутивно-активными формами Rac1. Напротив, ГТФаза с точечной заменой треонина на аспарагин в положении 17 связывает внутриклеточные GEF, однако не способна к обмену гуаниловых нуклеотидов. Комплекс Rac1(T17N)-GEF не активирует нижестоящие белки-мишени (Feig, 1999), то есть обладает свойствами доминантно-негативного мутанта. В лаборатории L. Van Aelst были получены точечные мутанты белка Rac1 по Switch-регионам, которые способны взаимодействовать с одними эффекторами и не взаимодействовать с другими. Например, мутация Y40H нарушает взаимодействие Rac1 с киназой РАК1, а мутация F37L, напротив, позволяет Rac1 взаимодействовать только с РАК1-киназой, но не с какими-либо другими эффекторами (см. таблицу 1). Эти точечные (в том числе двойные точечные) мутанты Rac1 используются для изучения функций этого белка в различных процессах. Другим подходом является конструирование химерных белков, в составе которых Rac1 может активироваться в ответ на внешние сигналы. Примером такого подхода служит белок LOV2-Rac1, наряду с собственно Rac1 содержащий домен LOV2 (light, oxygen, voltage) из фототропина овса. Домен LOV2 – это высококонсервативный домен, участвующий в регуляции широкого ряда 44 биологических процессов. В частности, у растений он содержит FMN и является светочувствительным. Он входит в состав белков фототропинов – серинтреониновых протеинкиназ, обеспечивающих фототропизм, открывание устьиц, перемещение хлоропластов и разворачивание листьев (Briggs et al., 2002). Важным свойством LOV2-домена является наличие высокоподвижной части – спирали Jα. При освещении синим светом (с максимумом длины волны 458 нм) образуется ковалентная связь между консервативным остатком цистеина в LOV2домене и FMN. Как следствие, происходит разворачивание спирали Jα. Таким образом, LOV-домен переходит из закрытой конформации в открытую (Harper et al., 2003). Таблица 1. Точечные мутанты белка Rac1 по эффекторным петлям теряют способность к взаимодействию с частью белков-мишеней (по (Joneson et al., 1996; Ming et al., 2007; Werner et al., 2002)). Мишень POR1 Эффект Rac1G12V Rac1G12VY40H Rac1G12VF37L Формирование + + ламеллоподий Rho-киназа Фосфорилирование + + легких цепей миозина PAK-киназа Фосфорилирование + + многих белков NADPHПродукция + + оксидаза АФК SRF Активация + экспрессии генов Циклин D1 Прогрессия G1-фазы + клеточного цикла В составе химерного белка LOV2-Rac1 LOV2-домен и белок Rac1 сближены в пространстве, что мешает связыванию Rac1 со своими эффекторами. А при освещении синим светом, как уже было сказано выше, спираль Jα разворачивается. Как следствие, на белке Rac1 открывается участок для 45 связывания эффектора, и Rac1 может осуществлять передачу сигнала (см. рисунок 3) (Wu et al., 2009). Рисунок 3. Принцип работы светочувствительного химерного белка LOV2Rac1. 1.3.2. Функции белка Rac1 Подобно другим представителям семейства Rho, малая ГТФаза Rac1 активируется в ответ на сигналы, полученные клеточными рецепторами от внешних факторов роста. Инсулин, тромбоцитарный фактор роста (platelet-derived growth factor – PDGF) и эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor – EGF) индуцируют образование ламеллоподий и раффлинг (Bishop et al., 2000). Эти факторы действуют через определенные GAPs и GEFs, влияя на активность Rac1. Известно, что Rac1 инактивируется такими GAPs, как 3BP-1 и p190 RhoGAP. Замену ГДФ на ГТФ осуществляют Vav1, Tiam1, SOS и другие GEFs. Будучи связанным с RhoGDI-1, белок Rac1 находится в цитоплазме и неактивен (Buchsbaum, 2007). Передачу сигнала Rac1 осуществляет, как уже было сказано, за счет связывания с эффекторными белками. Cреди активностей белка Rac1 можно выделить две большие группы – не влияющие на структуру актинового цитоскелета и влияющие на его структуру. 1.3.2.1. Регуляция концентрации АФК белком Rac1 Одной из функций белка Rac1 является регуляция продукции АФК. Известно три источника АФК в клетке. Одним из них, как уже было сказано выше, является дыхательная цепь митохондрий. Было показано, что Rac1 может 46 регулировать образование АФК в митохондриях (Werner et al., 2002). Однако этот путь не является единственным. Так, в фагосомах нейтрофилов, где АФК служат для уничтожения патогенов, их продукция NADPH-оксидазой цитоплазматической мембраны. В нефагоцитирующих клетках уровень АФК повышается при активации рецепторов EGF (Bae et al., 1997) либо PDGF (Sundaresan et al., 1995), что также связано с активацией NADPH-оксидазы. Показано, что в клетках эндотелия и гладкомышечных клетках стенки сосуда присутствует большое количество различных изоформ NADPH-оксидазы, что отражает огромную важность АФК для регуляции тонуса сосудов и функций эндотелия. NADPH-оксидаза состоит из двух мембраносвязаных субъединиц p22phox и gp91phox, трех цитозольных субъединиц p67phox, p47phox, p40phox, а также требует присутствия малых ГТФаз Rac1 и Rac2 для сборки активного комплекса (Ming et al., 2007). При поступлении сигнала от растворимых либо нерастворимых медиаторов воспаления белок Rac1 замещает ГДФ в активном центре на ГТФ и перемещается на плазматическую мембрану (Dinauer, 2003). Далее к Rac1 присоединяется комплекс из субъединиц p47phox и p67phox, причем первая служит адаптером для присоединения второй (Groemping et al., 2005). Р67phox является мишенью активированного Rac1 (Koga et al., 1999). В составе этого комплекса Rac1 максимально эффективно активирует электронный транспорт через флавоцитохром b – перенос электронов от NADPH на кислород, благодаря чему происходит образование АФК (Sarfstein et al., 2004). Хотя данная функция белка Rac1 не связана напрямую с подвижностью клеточных органелл и целых клеток, Rac1 может опосредованно влиять на миграцию. Это происходит за счет индукции АФК, которые ингибируют тирозиновые фосфатазы и, следовательно, усиливают сигналинг от тирозинкиназных рецепторов и нерецепторных тирозинкиназ (Barrett et al., 1999; Lee et al., 1998). 47 1.3.2.2. Регуляция динамики цитоскелета белком Rac1 Rac1 вызывает повышенную нуклеацию и полимеризацию актина за счет связывания с двумя эффекторами – РI-4-P5K и WAVE. Активация РI-4-P5K приводит к росту внутриклеточного уровня фосфатидил-инозитидов, которые связывают кэпирующие белки и тем самым способствуют удлинению актиновых микрофиламентов (Machesky et al., 1998; Tolias et al., 2000). WAVE взаимодействует с мономерным актином и активирует комплекс Arp2/3, необходимый для нуклеации и полимеризации актина (Machesky et al., 1998). Все это влечет за собой образование ламеллоподий и мембранный раффлинг в клетках млекопитающих. Кроме того, эффект Rac1 на актиновые микрофиламенты и тубулиновые микротрубочки связан с работой протеинкиназы РАК1, о чем подробнее будет рассказано ниже. Перестройка актинового цитоскелета под действием белка Rac1 может сопровождаться реорганизацией сети ПФ. Например, экспрессия конститутивноактивных мутантов Rac1 или Сdс42 наряду с формированием ламеллоподий и филоподий приводит к коллапсу ПФ: вместо хорошо различимой радиальной сети виментиновые филаменты в таких клетках собираются вокруг ядра (Meriane et al., 2000; Valgeirsdottir et al., 1998). К такому же эффекту приводит активация ГТФаз Rac1 и Cdc42 PDGF и брадикинином соответственно, а также экспрессия RhoG, который активирует и Rac1, и Cdc42 (Meriane et al., 2000). Как уже было сказано выше, перестройки ПФ регулируются преимущественно фосфорилированием. Например, фосфорилирование виментина по остатку серина-55 вызывает частичную разборку и переориентацию сети ПФ в гладкомышечных клетках. Оказалось, что этот эффект исчезает при ингибировании PAK1 (Tang et al., 2005). Кроме того, фосфорилирование серин-55 регулирует активацию PAK1 (Li et al., 2006). Таким образом, протеинкиназа РАК1 представляется важным связующим звеном в передаче сигнала от белка Rac1 на ПФ и другие элементы цитоскелета, перестройка которых может, в свою очередь, регулировать распределение и функционирование мембранных органелл. 48 1.3.3. Эффектор белка Rac1 – протеинкиназа РАК1 Белок РАК1 принадлежит к семейству РАК серин-треониновых протеинкиназ, которые связываются с малыми ГТФазами семейства Rho и в некоторых случаях активируются ими. РАК-киназы играют ключевую роль во многих клеточных процессах, таких как морфогенез и движение клетки, ее выживаемость, транскрипция генов, гормональный сигналинг, апоптоз. Помимо основной (киназной) функции, было показано их участие в роли каркасных белков. PAK-киназы экспрессируются во множестве тканей, замечена их повышенная экспрессия при некоторых формах рака (Arias-Romero et al., 2008). В настоящее время известно 6 представителей семейства РАК, объединяемых в две группы в зависимости от структуры, способа регуляции и тканевой специфичности. К группе I относятся РАК1, РАК2 и РАК3, экспрессирующиеся в мозгу, мышцах, селезѐнке. Киназы группы I высококонсервативны как по вторичной структуре, так и по аминокислотной последовательности: N-концевой домен содержит более 88%, С-концевой – более 93% идентичных аминокислотных остатков (Jaffer et al., 2002). РАК-киназы группы II (РАК4, РАК5, РАК6) отличаются от группы I другой доменной структурой и меньшей консервативностью первичной структуры (60% и 75% соответственно). Между собой группы схожи менее чем на 40%; способ активации киназы у группы II также существенно отличается от группы I. Такие различия позволяют заключить, что две группы семейства РАК регулируются поразному и имеют разные мишени. 1.3.3.1. Строение протеинкиназы РАК1 Протеинкиназа РАК1 была обнаружена одной из первых среди эффекторов белка Rac1 (Manser et al., 1994). Как и другие представители группы I, РАК1 состоит из С-концевого каталитического домена (catalytic tail – CT) и N-концевого р21-связывающего домена (p21-binding domain – PBD), который частично перекрывается с аутоингибиторным доменом (protein kinase inhibitory domain – PID). PBD является регуляторным доменом и, хотя получил свое название по 49 способности связывать Rac1, содержит последовательности для взаимодействия с другими факторами – два классических и один неклассический SH3 (Src homology 3)-связывающих мотива. С ними взаимодействуют адаптерные белки Nck, Grb2 и фактор обмена нуклеотидов PIX (PAK-interacting exchange factor) соответственно (Pacheco et al., 2010). Наряду с общими для всех киназ группы I признаками РАК1 имеет также ряд индивидуальных особенностей. Так, в молекуле РАК1 имеется аминокислотный остаток треонина-212, который может фосфорилироваться некоторыми циклин-зависимыми киназами и ERK (extracellular regulated kinase), а также участок связывания легких цепей динеина, который вместе с участком ядерной локализации позволяют РАК1 проникать в ядро клетки (Lightcap et al., 2009). В целом, сложная доменная структура РАК1 предполагает наличие многоступенчатого механизма включения и регуляции ее киназной активности. 1.3.3.2. Регуляция киназной активности РАК1 Неактивная РАК1 присутствует в клетке в виде димера, причем каталитический домен одной молекулы сближен с аутоингибиторным доменом другой. Активация РАК1 может происходить несколькими разными способами. Первым из них является взаимодействие с малыми ГТФазами (Rac1, Cdc42, TC10, CHP, Wrch-1). Связывание малой ГТФазы приводит к серии конформационных изменений в РАК1, в результате чего аутоингибиторный домен диссоциирует от киназного домена с последующим автофосфорилированием нескольких аминокислотных остатков в молекуле киназы. Наиболее важным из них является треонин-423, расположенный в активационной петле киназного домена (Bokoch, 2003). Известно, что фосфорилирование по этому остатку повышает киназную активность РАК1 по отношению к другим субстратам. После активации малые ГТФазы диссоциируют от РАК1 (Buchwald et al., 2001). Кроме фосфорилирования/автофосфорилирования по треонину-423, для РАК1 показано фосфорилирование по другим аминокислотным остаткам – серину-144, серину199, серину-204, что может приводить к активации киназы или увеличению ее 50 активности, в том числе за счет нарушения взаимодействия РАК1 с PIX (Chong et al., 2001). Также известны механизмы активации РАК1, независимые от малых ГТФаз. Связывание РАК1 с мембраной через адаптерные белки Nck и Grb2 приводит к активации киназы с помощью фосфорилирования ключевого аминокислотного остатка треонина-423 3-фосфатидилинозитид-зависимой киназой 1 (King et al., 2000). Эти адаптерные белки рекрутируют РАК1 на плазматическую мембрану за счет взаимодействия со сфингозином или фосфатидной кислотой, что также приводит к активации РАК1 (Arias-Romero et al., 2008). Nck и Grb2 также могут присоединять РАК1 к активированному тирозинкиназному рецептору на плазматической мембране (Puto et al., 2003). Инактивация РАК1 может происходить при участии фосфатаз POPX1 (partner of PIX 1) и POPX2 (partner of PIX 2). Они связываются с комплексом РАК/РIX, дефосфорилируют треонин-423 и другие фосфорилированные аминокислотные остатки. Также есть данные о ряде белков, которые ингибируют РАК1 за счет непосредственного связывания с ней. Белки hPIP1 (РАК interacting protein) и Merlin связываются с PBD-доменом РАК1 и блокируют активацию РАК1 и/или связывание с ГТФазами, что приводит к ингибированию РАК1-опосредованной передачи сигнала на нижестоящие белки-мишени. Белок nischarin взаимодействует с киназным доменом, в результате чего РАК1 не может фосфорилировать белки-субстраты (Pacheco et al., 2010). Взаимодействие РАК1 с малой ГТФазой Chp (Cdc42 homologous protein) приводит к убиквитинилированию РАК1 с последующей протеасомной деградацией (Koh et al., 2002). В связи с отсутствием низкомолекулярных ингибиторов РАК1 многие исследователи в своих работах используют аутоингибиторный домен киназы, PID, который представляет собой участок с 83 по 149 аминокислотный остаток РАК1 (Zhao et al., 1998). Этот домен ингибирует активность РАКs группы I и не влияет на активность РАКs группы II. Количество РАК1 в клетке может регулироваться на уровне экспрессии генов. В случае некоторых видов рака количество мРНК РАК1 увеличено по 51 сравнению с нормой. Хотя на сегодняшний день не известны транскрипционные регуляторы РАК1, было показано, что уровень экспрессии РАК1 обратно коррелирует с уровнем эндогенной микроРНК mIR-7 (Dummler et al., 2009). 1.3.3.3. Функции протеинкиназы РАК1 РАК1 выполняет в клетке множество функций, наиболее изученной из которых является регуляция организации цитоскелета, морфологии и подвижности клетки, где она выступает как эффектор малых ГТФаз семейства Rho. РАК1 вызывает формирование ламеллоподий и филоподий, развитие мембранного раффлинга, исчезновение актиновых стресс-фибрилл и увеличение подвижности клетки (Arias-Romero et al., 2008). Можно выделить несколько эффектов РАК1, которые обеспечивают увеличение подвижности клетки. Первым из них является инициация полимеризации актина и поддержание его стабильности на переднем крае клетки. Активированная РАК1 перемещается из цитоплазмы на передний край клетки, где ингибирует киназу легких цепей миозина на переднем крае клетки. Это приводит к разборке стресс-фибрилл (Sanders et al., 1999). РАК1 ингибирует активность белка кофилина, что способствует поддержанию целостности актиновых филаментов на ведущем крае клетки. РАК1 также активирует комплекс Arp2/3 (Vadlamudi et al., 2004). Другим важным фактором в регуляции подвижности клетки является динамика микротрубочек на переднем крае клетки. Статмин, также известный как онкопротеин 18, – это белок, дестабилизирующий микротрубочки. Фосфорилирование активной РАК1 приводит к его ингибированию и, как результат, стабилизации микротрубочек на ведущем крае клетки (Wittmann et al., 2003). Интересно, что некоторые эффекты РАК1 на организацию цитоскелета связаны не с киназной функцией РАК1. Так, взаимодействие РАК1 с гуанилатциклазой приводит к увеличению количества цГМФ и подвижности клетки (Guo et al., 2010). 52 Во время митоза РАК1 фосфорилирует гистон Н3, что необходимо для активации транскрипции и начала митоза. В митотических клетках РАК1 в большинстве своем располагается в области центросом и веретена деления, что позволяет предположить участие РАК1 в динамике центросом (Molli et al., 2009). РАК1 также оказывает цитопротекторное действие – при наличии сигналов выживаемости РАК1 фосфорилирует и ингибирует проапоптотический белок Bad. Более того, она взаимодействует с легкими цепями динеина и проапоптотическим белком BimL, вызывая их деградацию и блокаду проапоптотического сигнала от BimL. РАК1 ингибирует апоптоз, активируя сигналы выживаемости в клетке, такие как каскад митоген-активируемых киназ, JNK- и NF-κВ-сигналинг (Kumar et al., 2009). Известно, что РАК1 фосфорилирует виментин. В опытах in vitro было показано фосфорилирование N-конца виментина этой киназой по нескольким участкам (остаткам серина 26, 38, 51, 66, 73). Такое фосфорилирование приводило к реорганизации виментиновых филаментов и к неспособности виментина образовывать 10 нм филаменты (Goto et al., 2002). В опытах in vivo было показано фосфорилирование виментина по остаткам серина-55 и серина-38. Это приводило к реогранизиции сети ПФ в клетках гладкой мускулатуры, причем этот эффект исчезал при ингибировании РАК1 киназы (Tang et al., 2005). Таким образом, белок Rac1 является универсальным внутриклеточным регулятором, активным и в нервных, и в эпителиальных, и в мышечных клетках, как и в клетках мезенхимального происхождения. Он модулирует перестройки разнообразных цитоскелетных структур за счет взаимодействия с большим количеством эффекторных белков (например, РАК1-киназой) и через них может регулировать функционирование органелл, связанных с этими структурами, в частности митохондрий. 1.4. Перестройки цитоскелета как способ регуляции функционального состояния митохондрий 53 1.4.1. Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий Известно, что распределение и функционирование митохондрий зависит от цитоскелета. Во-первых, для митохондрий важно, чтобы они были заякорены в правильном месте клетки (Appaix et al., 2003; Filippin et al., 2003; Reipert et al., 1999). Во-вторых, под строгим контролем внешних и внутренних факторов находится не только транспорт митохондрий вдоль цитоскелетных структур (Ligon et al., 2000; Morris et al., 1993), но и их заякоривание (Chada et al., 2003; Leterrier et al., 1994; Minin et al., 2006). Ранее в нашей лаборатории было показано, что форма и распределение митохондрий зависят от регуляторного каскада, запускаемого фибронектином (Некрасова et al., 2005). Распластывание клетки на субстрате происходит в результате взаимодействия с белками внеклеточного матрикса, в частности с фибронектином. Но при этом разные участки молекулы фибронектина по-разному влияют на клеточную морфологию. Известно, что при культивировании клеток на 120 кДа фрагменте фибронектина не образуется стресс-фибрилл и зрелых фокальных контактов (Ishiguro et al., 2000). Оказалось, что при этом структура митохондрий сильно отличается от нормальной – короткие шарообразные органеллы оказываются сосредоточенными в околоядерной области. Добавление сыворотки до 10% вызывает вытягивание митохондрий и переход части их на периферию клетки. Тот же эффект имеет добавление чистого фибронектина и его 40 кДа фрагмента (Некрасова et al., 2005). По-видимому, 40 кДа фрагмент фибронектина запускает ряд реакций, приводящих к образованию актиновых стресс-фибрилл и зрелых фокальных контактов через свой известный рецептор синдекан-4. В сигнальном каскаде, запускаемом синдеканом-4, участвуют ПКС и белки семейства Rho. Было сделано предположение, что они влияют на перестройку актинового цитоскелета, а также приводят к восстановлению связи митохондрий и цитоскелета. Как следствие, митохондрии удлиняются и выходят на периферию клетки. 54 Далее в нашей лаборатории было показано, что подвижность митохондрий регулируется прикреплением к фибриллярному актину, и это прикрепление находится под контролем белка RhoA и его эффектора mDia1 у млекопитающих и диафантуса у дрозофилы (Minin et al., 2006). Было замечено, что лизофосфатидная кислота приводит к существенному снижению подвижности митохондрий в клетках линии CV-1. Тот же эффект имеет экспрессия конститутивно-активного мутанта белка RhoA (Minin et al., 2006) и конститутивно-активного мутанта белка mDia1 – только формин-зависимая полимеризация актина приводит к замедлению быстрых движений митохондрий по микротрубочкам. Однако изменение подвижности митохондрий под действием RhoА и mDia не является следствием простого увеличения вязкости цитоплазмы из-за повышенной полимеризации актина. Оказалось, С-концевой фрагмент белка N-WASP увеличивает полимеризацию актина, но не изменяет подвижность митохондрий. Тот же эффект наблюдается и в опытах с джасплакинолидом, известным стабилизатором F-актина. Он увеличивает количество F-актина, но не приводит к заякориванию митохондрий. То есть ингибирование движений митохондрий не является следствием увеличения вязкости цитоплазмы из-за полимеризации актина, а определяется специфическими взаимодействиями. Также было показано, что эта регуляция специфична для митохондрий, поскольку другие клеточные органеллы (лизосомы, пероксисомы) не изменяют свою подвижность при формин-зависимой полимеризации актина. Таким образом, mDia1 регулирует именно подвижность митохондрий в клетках млекопитающих. Таким же эффектом обладает и белок диафантус у дрозофилы. Консервативность данного регуляторного механизма указывает на его высокую биологическую значимость (Minin et al., 2006). Но вопрос о том, какие именно цитоскелетные структуры заякоривают митохондрии, требовал дальнейшего изучения. В клетках дрозофилы, возможно, митохондрии напрямую взаимодействуют с пучками актина, образованными по формин-зависимому механизму, поскольку они лишены ПФ (Goldstein et al., 2000). А в клетках млекопитающих 55 посредниками между митохондриями и параллельными пучками актина могут выступать ПФ (Appaix et al., 2003; Leterrier et al., 1994; Wagner et al., 2003). На примерах разных типов клеток, лишѐнных ПФ, было показано, что они влияют на распределение и морфологию митохондрий, а также на их функционирование. В скелетных и сердечных мышцах из мышей, лишѐнных десмина, наблюдается нарушение функций митохондрий: снижается максимальная скорость дыхания, АДФ-стимулированное потребление кислорода, падает уровень цитохрома с. Похожий эффект показан для первичной культуры фибробластов, выделенных из мышей, лишѐнных гена виментина (Tolstonog et al., 2005). В таких клетках митохондрии обладают низким потенциалом по сравнению с клетками, содержащими виментин. То есть взаимодействие митохондрий с цитоскелетом может влиять не только на их подвижность и распределение в клетке, но и на их функциональное состояние. 1.4.2. Роль функционального состояния митохондрий в физиологии клетки. Цитотоксические препараты Важность взаимодействия митохондрий с виментином для их нормальной работы не вызывает сомнений. В свою очередь, митохондрии регулируют функциональное состояние клетки в целом, поскольку выполняют ряд центральных ролей в клеточной физиологии (см. главу 1.1). В частности, митохондрии являются местом локализации факторов, участвующих в апоптозе. Одна из ключевых стадий в развитии апоптоза – это нарушение внешней митохондриальной мембраны и выход цитохрома с в цитозоль (Vianello et al., 2012). Известные антиапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL осуществляют свои функции, по-видимому, за счет связывания с наружней мембраной митохондрий и сохранения ее непроницаемости для цитохрома с (Vander Heiden et al., 2000). Эти белки содержат сигнал локализации в наружней митохондриальной мембране – участок, богатый гидрофобными аминокислотами и фланкированный двумя кластерами позитивно заряженных аминокислот (Rapaport, 2003). 56 Ранее в нашей лаборатории были получены результаты, свидетельствующие о том, что в N-концевой части молекулы виментина имеется участок (аминокислотные остатки с 41 по 94), отвечающий требованиям сигнальной последовательности локализации в наружней митохондриальной мембране (Nekrasova et al., 2011). Такое взаимодействие приводит к увеличению потенциала митохондрий (Chernoivanenko et al., 2015). Также было показано, что митохондрии окислительному в клетках, стрессу, содержащих вызванному виментин, менее гиперэкспрессией белка подвержены Rac1 или добавлением в среду перекиси водорода (Матвеева и др., 2010). Обнаруженное различие в устойчивости к окислительному стрессу указывает на возможное митопротекторное действие виментина в клетках. Можно предположить, что взаимодействие с виментином также влияет на устойчивость клеток к проапоптотическим факторам, например, к известным химиотерапевтическим препаратам – адрибластину и винкристину. Адрибластин (также известный как доксорубицин) – это препарат из группы антрациклинов. Он является ключевым в химиотерапии как солидных опухолей, так и гемобластозов у пациентов всех возрастных групп (Granados-Principal et al., 2010). Повреждающее действие адрибластина на клетки обусловлено его прямым взаимодействием с ДНК, а также рядом опосредованных эффектов. Адрибластин способен попадать в цитоплазму клетки путем простой диффузии через цитоплазматическую мембрану. В ядро он проникает в комплексе с 20S субъединицей рибосом, где впоследствии диссоциирует от 20S субъединицы и встраивается непосредственно в ДНК. Это вызывает образование множественных двунитевых разрывов и нарушение упаковки ДНК в ядре (Quiles et al., 2002). Также антрациклины широко известны как ингибиторы топоизомеразы II. Например, адрибластин стабилизирует комплекс топоизомераза II-ДНК. В его составе в цепи ДНК есть двунитевые разрывы, и ДНК ковалентно связана с остатками тирозина в активном центре фермента (Minotti et al., 2004). Таким образом, основным эффектом адрибластина на клетки является внесение двунитевых разрывов в ДНК как при встраивании его в ДНК, так и за счет 57 ингибирования топоизомеразы II. В дальнейшем такие клетки уходят в апоптоз в результате работы опухолевого супрессора р53. Известно, что адрибластин вызывает фосфорилирование р53 и его перемещение в ядро (Quiles et al., 2002). Р53 выступает транскрипционным активатором многих генов, ответственных за апоптоз, в частности, семейства Bcl-2 (Vousden et al., 2002)). Часть из этих малых белков оказывает антиапоптотическое действие (Bcl-2, Bcl-xL), другие же являются проапоптотическими (Bax, Bak, Bad, Bid) (Juin et al., 2013). Фосфорилирование р53 при действии адрибластина вызывает резкое уменьшение соотношения Bcl-2/Bax. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению трансмембранного потенциала митохондрий и клеточной смерти (Liu et al., 2008). Опосредованные эффекты адрибластина связаны с продукцией активных форм кислорода (АФК) и их повреждающим действием. С химической точки зрения адрибластин представляет собой хинон и может быть восстановлен до семихинона различными клеточными редуктазами, в частности, комплексом I митохондрий. Семихинон, в свою очередь, взаимодействует с молекулярным кислородом с образованием супероксид-аниона O2•-, окисляясь при этом до хинона. Циклические превращения хинон-семихинон-хинон производят огромное количество супероксид-аниона, который вызывает образование других активных форм кислорода и азота (Chen et al., 2007). Одним из результатов повышения уровня выработки АФК под действием адрибластина является перекисное окисление липидов, происходящее преимущественно в митохондриальных мембранах (Huertas et al., 1991). Это обусловлено накоплением адрибластина во внутренней мембране митохондрий за счет его взаимодействия с кардиолипином (Quiles et al., 2002). Также показана активация NAD(P)H-зависимых оксидаз под действием адрибластина (Gilleron et al., 2009). Кроме того, как сам адрибластин, так и продукты его метаболизма (вторичный спирт доксорубицинол) могут катализировать диссоциацию железа от ферритина и цитоплазматической аконитазы. Это нарушает метаболизм железа и приводит к образованию гидроксил-радикала за счет взаимодействия адрибластина с ионом железа (Chen et al., 2007). 58 Таким образом, адрибластин вызывает повышение продукции АФК в митохондриях. С другой стороны, адрибластин вызывает снижение трансмембранного потенциала митохондрий за счет снижения экспрессии антиапоптотических и повышения экспрессии проапоптотических белков семейства Bcl-2. Следовательно, именно митохондрии выступают ключевой мишенью токсического действия адрибластина. Наряду с адрибластином в клинической практике широко распространен другой химиотерапевтический агент – винкристин. Винкристин – алкалоид, получаемый из листьев барвинка розового (Vinca rosea). В качестве монотерапии злокачественных новообразований он начал применяться с 1960х годов. В настоящее время винкристин включен в протоколы лечения первичных острых лимфобластных лейкозов у пациентов всех возрастных групп, а также солидных опухолей у детей (Gidding et al., 1999). Кроме того, винкристин оказывает специфическое иммуносупрессивное действие при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре. Считается, что антипролиферативное действие винкристина состоит в нарушении динамики микротрубочек. Винкристин способен связываться с субъединицами тубулина (как изоформы α, так и β) в присутствии ГТФ. В больших концентрациях он препятствует сборке нормальных микротрубочек, в том числе микротрубочек веретена деления, и вызывает самосборку тубулина в нефункциональные агрегаты (Lobert et al., 1996). Ранее считалось, что именно нарушение веретена деления ответственно за противоопухолевое действие винкристина. Но последние данные показывают, что более низкие концентрации винкристина также обладают способностью останавливать клеточное деление за счет стабилизации микротрубочек. Веретено деления при этом формируется, однако не может разобраться, и расхождение дочерних хромосом становится невозможным (Panda et al., 1996). По-видимому, именно аберрантный арест клеточного цикла в М-фазе является пусковым механизмом развития апоптоза (Kung et al., 1990). Следует отметить, что несмотря на широкое применение винкристина в клинике, в целом механизм его действия изучен недостаточно. Тем 59 не менее развитие апоптоза в присутствии винкристина показано для широкого ряда клеточных культур – от нормальных тимоцитов до клеток лимфомы, аденокарциномы и других (Hannun, 1997). 1.4.3. Модель механизма регуляции взаимодействия митохондрий с цитоскелетом Научным интересом нашей лаборатории является изучение механизма регуляции взаимодействия митохондрий с ПФ. В одной из работ было показано, что связь митохондрий и ПФ находится под строгим регуляторным контролем (Некрасова et al., 2007). Оказалось, что известный активатор ПКС, форболовый эфир, увеличивает подвижность митохондрий в клетках, содержащих виментин. При этом в безвиментиновых клетках он не оказывает такого действия. Это подтверждает роль виментина в заякоривании митохондрий. Чрезвычайно интересным представлялся вопрос о механизме влияния виментиновых ПФ на подвижность митохондрий. Имеются сообщения об активации ПКС с последующим фосфорилированием виментина по N-концу, что приводит к разборке виментиновых филаментов в митозе (Takai et al., 1996). Можно было бы предположить, что коллапс ПФ к ядру снижает вязкость цитоплазмы на периферии клетки, следствием чего является увеличение подвижности митохондрий. Однако при обработке форболовым эфиром виментиновые филаменты сохраняются интактными (Некрасова et al., 2007). Следовательно, имеет место специфическая регуляция связи митохондрий с виментином – нарушается связь митохондрий и ПФ без изменения целостности последних. Возможно, в данном случае форболовый эфир выступает активатором малой ГТФазы Rac1. Роль малой ГТФазы Rac1 в регуляции подвижности митохондрий была продемонстрирована в работе Минина с соавт. (Minin et al., 2006). Как уже было сказано ранее, уменьшение подвижности митохондрий под действием конститутивно-активного мутанта RhoА и mDia1 не может объясняться простым 60 повышением вязкости цитоплазмы при полимеризации актина, поскольку увеличение F-актина по Arp2/3-зависимому механизму под действием конститутивно-активного белка Rac1 не приводит к замедлению митохондрий, а, наоборот, вызывает их значительное ускорение. То есть белок Rac1 может выступать регулятором, обеспечивающим нарушение связи митохондрий с цитоскелетными структурами. Такими структурами в клетках млекопитающих могут быть виментиновые ПФ. Поскольку в поведении митохондрий в виментин-содержащих и безвиментиновых клетках наблюдается значительная разница при действии внешних стимулов (Некрасова et al., 2007), был сформулирован следующий вопрос – нужен ли виментин для эффекта Rac1 на подвижность митохондрий? Известно, что Rac1 участвует в перераспределении ПФ за счет работы своего эффектора – протеинкиназы РАК1. На основании данных литературы и собственных результатов в настоящей работе предлагается следующий механизм. В ответ на внешние сигналы в клетке активируется малая ГТФаза Rac1. Она может активировать свой эффектор протеинкиназу РАК1. Вероятно, что активная РАК1 фосфорилирует виментин по известным участкам (остаткам серина-55 и серина-38). Можно предположить, что это нарушает взаимодействие митохондрий с N-концевым участком виментина, в результате чего увеличивается подвижность митохондрий. Таким образом, при активации Rac1 наряду с перестройкой систем микротрубочек и актиновых микрофиламентов происходит изменение сети ПФ. Как следствие, митохондрии, не связанные с виментином, приобретают способность транспортироваться в области повышенного потребления энергии. Кроме того, происходит снижение их трансмембранного потенциала, т.е. изменяется их функциональное состояние. Последнее, в свою очередь, приведет к повышению чувствительности клеток к цитотоксическим препаратам. 61 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящей работы было изучить, как взаимодействие виментина с митохондриями регулируется малой ГТФазой Rac1, и как это взаимодействие влияет на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам. Для этого были поставлены следующие задачи: 1. Выяснить, как малая ГТФаза Rac1 влияет на относительную подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий в клетках с виментином и клетках без виментина. 2. Определить, какой эффектор белка Rac1 отвечает за регуляцию подвижности и потенциала митохондрий. 3. Изучить роль остатка серина-55 в молекуле виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с ПФ. 4. Выяснить, как связывание митохондрий с виментином влияет на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам. 62 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Клеточные линии и культивирование клеток В работе были использованы линии мышиных клеток, предоставленные доктором Р. Эвансом (Университет Колорадо, США): MFT-16, не экспрессирующие виментин, и MFT-6, клетки дикого типа. Клетки были получены из первичных эмбриональных фибробластов мыши (Holwell et al., 1997). Для получения линий клеток, стабильно экспрессирующих мутантные формы виментина, ретро-вирусные частицы нарабатывали в клетках линии HEK293. Клетки культивировали в среде DMEM (Dulbecco`s modified Eagle`s medium) (ПанЭко, РФ), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот», РФ), 100 мкг/мл пенициллина (Sigma, США), 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США), при температуре +37ºС, во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2, в чашках Петри диаметром 60 мм. Для определения устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам клетки культивировали в 96-луночном планшете в течение 72 часов в тех же условиях. При пересаживании клеток исходную культуру обрабатывали раствором трипсина-версена (1,25 мг/мл, 0,256 мг/мл соответственно) в PBS (8,1 мM Na2HPO4; 1,45 мM KH2PO4; 0,11 M NaCl; 3,42 мM KCl; рН 7,4) в течение 1-2 мин. Затем для остановки трипсинизации добавляли 5 мл DMEM. Клетки суспендировали при помощи интенсивного пипетирования и разводили средой культивирования в отношении 1:4-1:5. Воду для приготовления растворов и сред получали при помощи системы Mili-Q (Millipore, США). Линии клеток, стабильно экспрессирующие мутантные формы виментина, культивировали в присутствии 0,5 мкг/мкл пуромицина. Непосредственно перед экспериментом среду культивирования заменяли на среду без пуромицина. 63 2.2. Трансфекция клеток Перед проведением трансфекции клетки культивировали на покровных стѐклах в чашках Петри диметром 30 мм 1 сутки в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки. Трансфекцию клеток проводили при помощи липосомного реагента Lipofectamin 2000 (Invitrogen, США). Количество липосомного реагента и ДНК брали из расчета 10 мкл и 4 мкг на 1 чашку диаметром 30 мм с 2 мл среды. Также трансфекцию клеток проводили при помощи липосомного реагента TransIT (Mirus Bio, США). Количество липосомного реагента и ДНК брали из расчета 7,5 мкл и 2,5 мкг на 1 чашку диаметром 30 мм с 2 мл среды. Клетки наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии спустя 1 сутки после трансфекции. 2.3. ДНК-конструкции 2.3.1. Конструкции, кодирующие различные формы белка Rac1 Для изучения роли малой ГТФазы Rac1 в регуляции подвижности митохондрий использовали плазмиды, кодирующие точечные мутанты белка Rac1 – конститутивно-активный (рEGFP-Rac1Q61L или рEGFP-Rac1G12V) и доминантно-негативный (pEGFP-Rac1T17N), слитые с зеленым флуоресцентным белком (enhanced green fluorescent protein – EGFP). Также использовали плазмиду, кодирующую конститутивно-активный мутант белка Rac1, слитый с красным флуоресцентным белком (red fluorescent protein – RFP) – pRFP-Rac1G12V. Для экспрессии двойных точечных мутантов белка Rac1, слитых с EGFP, использовали плазмиды pEGFP-Rac1G12VY40H и pEGFP-Rac1G12VF37L. Трансфецированные клетки находили по зеленой флуоресценции EGFP либо красной флуоресценции RFP. 64 Для изучения роли активации белка Rac1 на подвижность митохондрий в режиме реального времени использовали плазмиду pRFP-LOV2-Rac1G12V, полученную в нашей лаборатории из вектора pTriEx-mVen-PA-Rac1-N-term2, любезно предоставленного доктором К. Ханом (Университет Северной Каролины, США), и вектора pTag-RFP (ЗАО «Евроген», РФ). Культивирование клеток, экспрессирующих pRFP-LOV2-Rac1G12V, проводили в отсутствие синего света для исключения спонтанной активации фоточувствительного домена. 2.3.2. Конструкции, кодирующие различные формы виментина Для восстановления сети ПФ в безвиментиновых клетках использовали плазмиду, кодирующую виментин человека, – pVim, полученную из вектора pEGFP-Vim, любезно предоставленного Р. Голдманом (Северо-западный университет, США). Для визуализации сети ПФ в клетках проводили коэкспрессию pVim с pmCherry-Vim – плазмидой, кодирующей виментин человека, слитый с красным флуоресцентным белком mCherry. В этом случае трансфецированные клетки находили по красной флуоресценции белка mCherry. Также для восстановления виментиновых ПФ использовали плазмиды pVimWT-IRES2-EGFP, pVimS54A-IRES2-EGFP, pVimS55Е-IRES2-EGFP, pVimS38A-IRES2-EGFP, pVimS38Е-IRES2-EGFP, pVimS54Е-IRES2-EGFP, pVimS55A-IRES2-EGFP, pVimP56R-IRES2-EGFP. Эти плазмиды кодируют бицистронные мРНК, с которых считываются одновременно два белка. Вопервых, это один из вариантов виментина (дикого типа либо с точечными заменами S38A, S38Е, S54A, S54Е, S55A, S55Е, P56R соответственно). Во-вторых, это маркерный белок EGFP, позволяющий находить трансфецированные такой плазмидой клетки. Плазмиды были получены с использованием плазмиды рIRESGFP (ClonTech) и кДНК разных форм виментина. кДНК мутантных форм виментина были получены в нашей лаборатории. Для этого были использованы следующие праймеры: 1. S38A – GCTCTGGGCAGCGCG и GTAGGTGCGGGTGGACGT; 2. S38E – GAGCTGGGCAGCGCG и GTAGGTGCGGGTGGACGT; 65 3. S54A – GCTTCCCCGGGCGGC и GGCGTAGAGGCTGCGG; 4. S54E – GAATCCCCGGGCGGC и GGCGTAGAGGCTGCGG; 5. S55A – GCCCCGGGCGGCGT и GGCCGAGGCGTAGA; 6. S54E – GAACCGGGCGGCGT и GGCCGAGGCGTAGA. Получение плазмиды, кодирующей виментин с заменой P56R, было описано ранее (Nekrasova et al., 2011). Трансфецированные клетки находили по зеленой флуоресценции EGFP. Для одновременной экспрессии в клетках различных форм виментина вместе с белком Rac1G12V также использовали бицистронные конструкты. В отличие от вышеописанных, в них вместо EGFP закодирован химерный белок EGFP-Rac1G12V. Эти плазмиды были получены в нашей лаборатории на основе плазмид pVimWT-IRES2-EGFP, pVimS38A-IRES2-EGFP, pVimS38Е-IRES2-EGFP, pVimS54A-IRES2-EGFP, pVimS54Е-IRES2-EGFP, pVimS55A-IRES2-EGFP, pVimS55Е-IRES2-EGFP, pVimP56R-IRES2-EGFP соответственно и кДНК EGFPRac1G12V. Трансфецированные клетки находили по зеленой флуоресценции EGFP. 2.3.3. Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК1 Для изучения роли протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности митохондрий малой ГТФазой Rac1 использовали плазмиду pEGFP-PAK1-CT, кодирующую каталитический домен РАК1, слитый с EGFP. Также использовали две плазмиды, кодирующие доминантно-негативный мутант РАК1 и его неактивную форму, содержащую точечную замену L107F – pEGFP-PID и pEGFPPIDL107F. Плазмиды были любезно предоставлены доктором У. Кнаус (Исследовательский Институт Скриппса, флуоресцентной меткой служил EGFP. США). В обоих случаях 66 2.4. Окрашивание клеток митохондриальными потенциалзависимыми красителями Для визуализации митохондрий окрашивали клетки потенциалзависимыми флуоресцентными красителями MitoTracker Red CMXRos или MitoTracker Deep Red FM (Molecular Probes, США), специфичными по отношению к митохондриям. К клеткам, выращенным на покровных стѐклах, добавляли краситель до конечной концентрации 0,1 мкМ и инкубировали 30 минут при температуре +370С. Затем заменяли среду инкубации свежей подогретой (+370С) средой культивирования и наблюдали препарат с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы исключить выброс красителей из клеток Р-гликопротеином, продуктом гена множественной лекарственной устойчивости, в среду инкубации добавляли ингибитор Ргликопротеина верапамил в концентрации 2,2 мкM (Marques-Santos et al., 2003). Для определения трансмембранного потенциала митохондрии окрашивали потенциалзависимым красителем TMRE в конечной концентрации 50 нМ в течение 30 минут. Для ингибирования Р-гликопротеина также добавляли верапамил. Возбуждение флуоресценции проводили галогеновой лампой для уменьшения фототоксического эффекта. Полученные в результате флуоресцентной микроскопии изображения анализировали в программе ImageJ. 2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание 2.5.1. Фиксация клеток Для анализа актиновых микрофиламентов и ПФ клетки промывали PBS, затем фиксировали в течение 10 минут в 4% растворе формалина в PBS. После такой фиксации стекла промывали PBS и помещали на 15 минут в wash-буфер (1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% TritonX100 в PBS). 67 2.5.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание После инкубации в wash-буфере клетки инкубировали с раствором первых антител. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации в растворе первых антител стекла промывали wash-буфером 3 раза по 10 минут, и помещали в раствор вторых антител на 1 час. После этого препараты снова промывали wash-буфером 3 раза по 10 минут и заключали в фиксирующий раствор Aqua Poly/Mount (Polysciences, США). 2.5.3. Антитела к виментину и окраска актиновых микрофиламентов Для выявления ПФ использовали кроличьи антитела 3С8, реагирующие с виментином мыши, и моноклональные антитела V9 к человеческому виментину (Sigma, США). В качестве вторых антител использовали кроличьи антитела, полученные против иммуноглобулинов мыши, и антитела из мыши либо козы, полученные против иммуноглобулинов кролика. Антитела были конъюгированы с FITC либо TRITC (Jackson, США). Для окраски актиновых микрофиламентов использовали фаллоидин, меченый TRITC. 2.6. Микроскопия 2.6.1. Методика проведения микроскопии живых и зафиксированных клеток Покровные стекла с живыми клетками заключали в камеру объемом 2 мл, заполненную средой DMEM, содержащей 10% сыворотки, и наблюдали при помощи микроскопа Axiovert 200 с объективом Plan-Neofular 100х (Carl Zeiss, ФРГ). Клетки наблюдали при температуре +36±20С, поддерживаемой в инкубаторе PeCon (ФРГ). Изображения клеток получали при помощи фазового контраста и эпи-флуоресценции, используя 12-битную цифровую камеру Axio Cam MR3 и программное обеспечение AxioVision Rel. 4.6 (Carl Zeiss, ФРГ). Флуоресценцию EGFP и FITC снимали при λex = 489 нм, λem = 508 нм. 68 Флуоресценцию MitoTracker Red, RFP, mCherry, TMRE, TRITC снимали при λex = 579 нм, λem = 600 нм. Флуоресценцию MitoTracker Deep Red снимали при λex = 650 нм, λem = 670 нм. Изображения сохраняли на жестком диске в виде 12-битных графических файлов. Для анализа подвижности митохондрий снимали серию из 30 изображений живой клетки с интервалом между кадрами 4 сек. Для определения трансмембранного потенциала митохондрий снимали одиночные изображения живых клеток. Обязательным условием выбора поля зрения являлось одновременное наличие в нем клеток, экспрессирующих анализируемые конструкты, наряду с контрольными клетками, не экспрессирующими эти конструкты. Для оценки морфологии различных цитоскелетных структур снимали клетки, зафиксированные и окрашенные соответствующими антителами. Типичная фибробластах, картина распределения полученная при митохондрий помощи в флуоресцентной культивируемых микроскопии, представлена на рисунке 4 А. 2.6.2. Анализ относительной подвижности митохондрий Для оценки подвижности отдельных митохондрий наблюдали за изменением их положения на последовательности кадров, полученных с помощью прижизненной флуоресцентной видеомикроскопии. В каждом кадре отмечали точками положение геометрического центра для митохондрий малого размера или одного из концов для длинных органелл. Наблюдая за перемещением точки в серии кадров, получали траекторию движения митохондрии (см. рисунок 4 Б). На рисунке 4 Б видно, что движение митохондрий неравномерное и представляет собой перемещения, прерывающиеся длительными остановками. Многие органеллы не перемещались на значительные расстояния, а находились в относительном покое на протяжении всего времени наблюдения. 69 Рисунок 4. Движение митохондрий в клетках MFT-16, окрашенных MitoTracker Red CMXRos. A – первый кадр из последовательности, полученной при помощи флуоресцентной микроскопии; Б – траектории перемещения митохондрий за 30 кадров. Масштаб 5 мкм. Для количественной оценки подвижности митохондрий в клетках было введено понятие относительной подвижности митохондрий. Для определения этого параметра в каждом кадре отмечали положение митохондрий точками. После этого находили координаты полученных точек с помощью программы ImageJ, находящейся в свободном доступе (NIH, США). Затем определяли расстояние, пройденное митохондрией за промежуток времени между кадрами. Далее делили величину этого расстояния на время между кадрами и получали среднюю скорость перемещения митохондрии на данном временном интервале. Величину относительной подвижности митохондрий в клетке определяли как отношение числа перемещений митохондрий со скоростью больше 0,2 мкм/сек к общему числу всех зарегистрированных перемещений митохондрий в данной клетке. Для подсчета относительной подвижности митохондрий учитывали движения всех митохондрий на периферии клетки, которые присутствовали в поле микроскопа в течение съемки. Результаты представляли в виде среднее±стандартная ошибка среднего в % (standard error of mean – SEM). Число экспериментов указывали как n=число клеток в каждом измерении. 70 2.6.3. Определение трансмембранного потенциала митохондрий Для определения трансмембранного потенциала митохондрий также использовали данные прижизненной флуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивали потенциалзависимым красителем TMRE с добавлением верапамила. Полученные изображения анализировали в программе ImageJ. Чтобы определить яркость отдельных митохондрий, сначала определяли их границы при помощи программы ImageJ. Для определения границ отдельных митохондрий к исходному изображению (рисунок 5 Б) применяли фильтр Gaussian blur с диаметром размытия 7 пикселей (этот показатель соответствует средней ширине митохондрий на получаемых изображениях). В результате получали «размытое» изображение, которое затем вычитали из исходного. Такое преобразование позволяет сделать границы митохондрий более контрастными и уменьшить уровень шума на изображении (рисунок 5 В). Полученное изображение далее конвертировали в бинарное (рисунок 5 Г) при помощи введения порога (thresholding) по алгоритму IsoData. Этот метод разделяет изображение на объекты и фон при помощи введения первоначального порога. Затем рассчитываются средние значения яркости всех пикселей, имеющих значение яркости на границе или выше порога, и всех пикселей, имеющих значение яркости ниже порога. Далее рассчитывается среднее из этих двух значений, значение порога увеличивается, и процесс повторяется до тех пор, пока значение порога не достигнет этого среднего значения. И так далее до тех пор, пока значение порога не будет равняться (среднее значение фона + среднее значение объектов)/2. На полученном бинарном изображении (рисунок 5 Г) определяли контуры каждой митохондрии (рисунок 5 Д) с помощью анализатора частиц (Particle analyzer) из программы ImageJ. По полученным границам митохондрий определяли их яркость как среднее значение интенсивности флуоресценции по всем пикселям, попавшим в каждый контур. Рассчитанные значения яркости корректировали с учетом уровня фона, который определяли как среднее значение яркости пикселей в области, свободной от клеток. В каждом эксперименте 71 обсчитывали 10-15 участков, содержащих по 15-40 митохондрий. Данные представляли как средние значения интенсивности флуоресценции всех митохондрий с указанием SEM. Рисунок 5. Определение трансмембранного потенциала митохондрий в клетках, окрашенных митохондриальным потенциалзависимым красителем TRME, при помощи программы ImageJ. A – исходное изображение. Б – участок исходного изображения А, где митохондрии лежат в один слой и не перекрываются. В – изображение, полученное при вычитании исходного изображения Б, обработанного фильтром Gaussian blur с диаметром 7 пикселей, из исходного изображения Б. Г – бинарное изображение, полученное конвертированием изображения В при помощи введения порога по алгоритму IsoData. Д – контуры каждой митохондрии, полученные с помощью анализатора частиц. 2.7. Получение линий клеток, стабильно экспрессирующих различные типы виментина Линии клеток, стабильно экспрессирующие различные формы виментина, получали при помощи ретровирусной трансфекции. Для этого кДНК виментина дикого типа и виментина с точечными заменами S55A, S55E, P56R были клонированы в ретровирусный вектор pBABE-puro (Cell Biolabs, США) согласно 72 инструкции производителя. Вирусные частицы нарабатывали при трансфекции клеток линии HEK293 равными количествами соответствующего конструкта pBABE-puro-Vim и вспомогательной плазмиды pCL-Eco (Imgenex, США). Трансфекцию проводили липосомным агентом TransIT-LT1 (Mirus Bio, США). Через 48 часов после трансфекции снимали супернатант, содержащий вирусные частицы. Им обрабатывали целевые клетки линии MFT-16 в течение 4-8 часов в присутствии 8 мкг/мл полибрена (Sigma, США). Через 48 часов после инфекции клетки подвергали селекции пуромицином в конечной концентрации 2 мкг/мл. Чтобы избежать выброса антибиотика Р-гликопротеином, в среду культивирования добавляли верапамил в конечной концентрации 2,2 мкM. 2.8. Определение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам 2.8.1. МТТ-тест МТТ-тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Нтетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Клетки, растущие в логарифмической фазе, снимали с подложки версеномтрипсином, тщательно пипетировали и вносили в лунки 96-луночного планшета так, чтобы конечная концентрация клеток составила около 2-20 тыс. клеток в мл. Оставляли планшет в СО2-инкубаторе на 16-24 часа для распластывания. Готовили серийные разведения исследуемого препарата в отдельных эппендорфах как двадцатикратные растворы, вносили в лунки соответствующий объем. Для каждого значения конечной концентрации цитотоксического препарата измерение проводили в трех повторах. Оставляли клетки в СО2-инкубаторе на 72 часа. После вносили в лунки вводный раствор МТТ (до конечной концентрации 50 мкг/мл). Инкубировали 2 часа до развития интенсивной темно-фиолетовой окраски внутри клеток (формазан). Отбирали среду и растворяли формазан в ДМСО, измеряли оптическую плотность при 540 нм. 73 В качестве применяемых в цитотоксических препаратов противоопухолевой терапии использовали лекарства – два часто адрибластин (доксорубицин) и винкристин. Плотность клеток при посадке в 96-луночный планшет составила 2*103 клеток на лунку. Эта величина существенно меньше описанных в литературе, поскольку клетки линии MFT-16 и линий, полученных на ее основе, отличаются высокой скоростью роста. Время инкубации клеток с цитотоксическими препаратами также было увеличено с 48 часов до 72 часов во избежание ложноположительных результатов МТТ-теста. 2.8.2. Тест с нейтральным красным Тест с нейтральным красным основан на поглощении живыми клетками этого красителя и его накоплении в лизосомальной фракции. Для теста с нейтральным красным клетки рассаживали также, как для МТТ-теста. Нейтральный красный добавляли к клеткам в виде водного раствора до конечной концентрации 50 мкг/мл. Инкубировали 2 часа, после чего клетки тщательно промывали фосфатно-солевым буфером и фиксировали формалином. Поглощенный клетками нейтральный красный растворяли в 5% растворе уксусной кислоты в 50% растворе этилового спирта. Фотометрировали при 540 нм. 2.8.3. Построение кривых выживаемости Для того чтобы сравнивать кривые выживаемости различных клеточных линий и исключить влияние на эксперимент плотности культуры в лунках, проводили нормировку. В каждом 96-луночном планшете значение оптической плотности в каждой лунке с цитотоксическим агентом делили на среднее значение оптической плотности в контрольных лунках (без препарата) и умножали на 100. Полученную величину обозначали как процент выживших клеток. Построение кривых выживаемости было проведено с помощью пакета drc в программной среде вычислений R (Ritz et al., 2005). Суть метода заключается в 74 аппроксимации данных по токсичности препаратов четырехпараметрической логарифмической функцией вида: где f(x) – процент выживаемости клеток, x –концентрация препарата. Экспериментальные данные по процентам выживаемости клеток и соответствующим им концентрациям препарата обрабатывали пакетом drc в среде R. Исходя из концентрации и экспериментальных значений выживаемости (включая все повторы, совершенных для каждой концентрации), программа методом наименьших квадратов подбирала параметры b, c, d, e для функции, указанной выше. То есть программа подбирала такую функцию, которая наилучшим образом описывает полученную в конкретном опыте экспериментальную зависимость. Параметр «e» в данной модели обозначает IC50 – концентрацию препарата, при которой выживает 50% клеток. Параметр «d» – наибольшее значение процента выживаемости, «c» – наименьшее значение, «b» – наклон касательной к заданной функции в точке IC50. Результаты представляли как значения IC50 и IC90 (концентрация препарата, при которой выживает 90% клеток) с указанием стандартной ошибки среднего. Кроме того, в данной программе строили график полученной функции. 75 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Влияние Rac1 на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий Ранее в нашей лаборатории было показано, что малая ГТФаза Rac1 увеличивает относительную подвижность митохондрий в клетках линии CV-1 (Minin et al., 2006). Также было известно, что подвижность митохондрий в клетках, лишенных виментина, выше, чем в клетках, содержащих виментин. При этом восстановление ПФ снижает подвижность митохондрий до контрольного уровня (Nekrasova et al., 2011). Чтобы ответить на вопрос, нужен ли виментин для эффекта белка Rac1 на подвижность митохондрий, было использовано несколько различных подходов. 3.1.1. Сравнение относительной подвижности митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин, в присутствии мутантных форм белка Rac1 Удобной моделью для изучения взаимодействия виментиновых ПФ с митохондриями являются клетки линии MFT-16, лишѐнные виментина (Holwell et al., 1997). В этой линии и контрольной линии MFT-6, содержащей виментин, экспрессировали точечные мутанты белка Rac1 – конститутивно-активный (EGFP-Rac1Q61L) и доминантно-негативный (EGFP-Rac1T17N) методом транзитной трансфекции. Митохондрии окрашивали красителем MitoTracker Red. Относительную подвижность митохондрий в трансфецированных клетках оценивали, используя данные видеомикроскопии (см. Глава 2. МЕТОДЫ, п. 2.6.) и сравнивали ее с подвижностью в контрольных (нетрансфецированных) клетках. Оказалось, что Rac1Q61L увеличивает относительную подвижность митохондрий только в клетках MFT-6 (с 4,5±0,35% до 8,7±0,5%, см. рисунок 6). В безвиментиновых же клетках MFT-16 относительная подвижность митохондрий 76 не изменяется по сравнению с контролем. В то же время при экспрессии EGFPRac1T17N относительная подвижность митохондрий практически не отличается от контрольного уровня как в случае MFT-6, так и в случае MFT-16. А Б *p<0,01 А Б *p<0,01 Рисунок 6. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии MFT-6 (А) и линии MFT-16 (Б) при экспрессии конститутивно-активного белка Rac1 (Rac1Q61L) и доминантно-негативного белка Rac1 (Rac1T17N). Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. 3.1.2. Влияние мутантных форм белка Rac1 на относительную подвижность митохондрий в клетках с восстановленным виментином С другой стороны, можно предположить, что влияние Rac1 на относительную подвижность митохондрий в безвиментиновых клетках MFT-16 проявится в том случае, если в них восстановить систему ПФ. Нормальная сеть ПФ в таких клетках формируется, если экспрессировать в них экзогенный виментин (Shoeman et al., 1999). Для того, чтобы восстановить ПФ в клетках MFT16, их трансфецировали плазмидой pVim с добавлением pmCherry-Vim. Кроме 77 того, в трансфецирующую смесь добавляли мутанты Rac1, меченые EGFP. Митохондрии окрашивали MitoTracker Deep Red. Измеряли относительную подвижность митохондрий в клетках, экспрессирующих одновременно и виментин, и Rac1. Сравнивали ее с контрольным уровнем – относительной подвижностью митохондрий в клетках, экспрессирующих только виментин. Анализ относительной подвижности митохондрий в безвиментиновых клетках MFT-16 с восстановленными ПФ показал, что экспрессия белка EGFP-Rac1Q61L приводит к ее увеличению так же, как в линии клеток MFT-6. В то же время при экспрессии EGFP-Rac1T17N такого эффекта не наблюдалось (см. рисунок 7). Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что Rac1 влияет на относительную подвижность митохондрий только в клетках, содержащих виментин. *p<0,01 *p<0,01 Рисунок 7. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии MFT-16 с восстановленными виментиновыми ПФ при экспрессии конститутивно-активного белка Rac1 (Rac1Q61L) и доминантно-негативного белка Rac1 (Rac1T17N). Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. 78 3.1.3. Кинетика относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих Rac1-LOV2 Для доказательства того, что именно активация белка Rac1, а не просто экспрессия чужеродного белка, увеличивает подвижность митохондрий в виментин-содержащих клетках, использовали фотоактивируемый белок Rac1. Для этого экспрессировали в клетках MFT-6 белок RFP-LOV2-Rac1G12V. Митохондрии окрашивали красителем MitoTracker Deep Red. Здесь следует отметить чрезвычайно высокую светочувствительность домена LOV2. Хотя авторы работы (Wu et al., 2009) использовали для активации LOV2-Rac1G12V синий лазер, оказалось, что этот белок реагирует и на обычный белый свет. Также необходимо подчеркнуть, что длина волны возбуждающего света как для RFP (λex = 579 нм), так и для MitoTracker Deep Red (λex = 650 нм) значительно больше волны, необходимой для разворачивания LOV2 (458 нм), то есть не приводит к активации Rac1. Поэтому оказалось возможным проводить изменение относительной подвижности митохондрий при неактивном Rac1 (в отсутствие света), так и при его активации (в присутствии дневного света). Сначала необходимо было убедиться, что в подобранных условиях эксперимента полностью отсутствует спонтанная активация Rac1. Для этого измеряли относительную подвижность митохондрий в клетках MFT-6, экспрессирующих RFP-LOV2-Rac1G12V, в темноте и на свету, и сравнивали ее с относительной подвижностью митохондрий в клетках, экспрессирующих RFPRac1G12V. В качестве контроля использовали нетрансфецированные клетки. На рисунке 8 видно, что фотоактивируемый белок Rac1 на свету вызывает увеличение относительной подвижности митохондрий так же, как и простой конститутивно-активный мутант Rac1. В отсутствие же света такой белок не оказывает влияния на подвижность митохондрий, то есть полностью отсутствует спонтанная активация. 79 *p<0,01 *p<0,01 Рисунок 8. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии MFT-6 при экспрессии фотоактивируемого белка Rac1 (RFP-LOV2-Rac1G12V) на свету и в темноте. Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. Далее регистрировали кинетику этого процесса. Для этого освещали клетки обычным белым светом и проводили измерение относительной подвижности митохондрий через определенные промежутки времени после освещения. Было замечено, что подвижность митохондрий увеличивалась постепенно и достигала максимума через 40 мин (см. рисунок 9). Таким образом, результаты этих экспериментов показывают, что Rac1 оказывает влияние на относительную подвижность митохондрий в клетках, содержащих виментин. 80 Рисунок 9. Увеличение относительной подвижности митохондрий в клетках линии MFT-6, экспрессирующих белок RFP-LOV2-Rac1G12V, при фотоактивации. 3.1.4. Влияние Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин Далее мы проверяли, как активация Rac1 влияет на функциональное состояние митохондрий, а точнее, на их трансмембранный потенциал. Для этого в клетках линии MFT-16 и контрольной линии MFT-6, содержащей виментин, экспрессировали конститутивно-активный мутант белка Rac1 (EGFP-Rac1Q61L). Митохондрии окрашивали потенциалзависимым красителем TMRE. Трансмембранный потенциал митохондрий в трансфецированных и контрольных клетках измеряли, используя данные видеомикроскопии (см. Глава 2. МЕТОДЫ, п. 2.4, 2.6) и сравнивали его с потенциалом в контрольных (нетрансфецированных) клетках. На рисунке 10 видно, что в клетках MFT-6 белок Rac1 приводит к достоверному падению трансмембранного потенциала митохондрий, в то время как в клетках MFT-16 он не оказывает такого эффекта. Полученные результаты показывают, что белок Rac1 способен модулировать не только подвижность митохондрий, но и их трансмембранный потенциал, от которого зависят все основные функций митохондрий. 81 А *p<0,01 Б А *p<0,01 Б Рисунок 10. Трансмембранный потенциал митохондрий в виментинсодержащих клетках MFT-6 (А) и безвиментиновых клетках MFT-16 (Б) при экспрессии конститутивно-активного белка Rac1 (Rac1G12V). Приведены средние значения интенсивности флуоресценции митохондрий с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. 3.2. Поиск эффектора белка Rac1 в регуляции подвижности митохондрий На следующем этапе работы выясняли, какой именно эффектор белка Rac1 ответственен за регуляцию подвижности митохондрий в клетках. Известно, что у Rac1 есть множество эффекторных белков (см. таблицу 1). Rac1 взаимодействует с белками-мишенями при помощи разных участков молекулы, которые называются эффекторные петли, или Switch-регионы. Введение точечных замен в эти участки избирательно нарушает взаимодействие Rac1 с белками- эффекторами. Мутация Y40H нарушает взаимодействие Rac1 с РАК1, мутация 82 F37L, напротив, позволяет Rac1 взаимодействовать только с РАК1 (Joneson et al., 1996) (см. таблицу 1). Чтобы выяснить, какой именно эффектор белка Rac1 отвечает за увеличение относительной подвижности митохондрий в виментин-содержащих клетках, использовали двойные точечные мутанты белка Rac1 – EGFP-Rac1G12VY40H и EGFP-Rac1G12VF37L. В качестве контроля использовали клетки, трансфецированные pEGFP-Rac1G12V, и нетрансфецированные клетки. Для измерения относительной подвижности митохондрий их окрашивали MitoTracker Red. На рисунке 11 видно, что использованные мутанты белка Rac1 по-разному влияют на морфологию клеток. Клетки, экспрессирующие Rac1G12VY40H, образуют ламеллы. Напротив, клетки, экспрессирующие Rac1G12VF37L, имеют морфологию нормального фибробласта, не имеют гипертрофированных ламеллоподий и других образований. Рисунок 11. Морфология фибробластов линии MFT-6, экспрессирующих Rac1G12VY40H (Б) и Rac1G12VF37L (В) по сравнению с нетрансфецированными клетками (А). Масштаб 10 мкм. Анализ относительной подвижности митохондрий показал, что EGFPRac1G12VF37L, который связывается с РАК1-киназой, увеличивает подвижность митохондрий по сравнению с контрольными клетками. Он ведет себя точно также, как и обычный конститутивно-активный мутант EGFP-Rac1G12V. При 83 этом EGFP-Rac1G12VY40H, не взаимодействующий с РАК1, не влияет на подвижность митохондрий. Она остается на том же уровне, что и в нетрансфецированных клетках (см. рисунок 12). Таким образом, полученные данные говорят от том, что за эффект белка Rac1 на подвижность митохондрий отвечает протеинкиназа РАК1. *p<0,01 Рисунок 12. Относительная подвижность митохондрий в клетках MFT-6 при экспрессии эффекторных мутантов белка Rac1G12V – Rac1G12VY40H и Rac1G12VF37L. Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. Полученные в этих экспериментах результаты говорят также о том, что наблюдаемый эффект Rac1 не связан с перестройкой актинового цитоскелета. Мутант Rac1G12VY40H вызывает практически полную разборку стресс-фибрилл, но не влияет на подвижность митохондрий. Rac1G12VF37L, наоборот, не влияет на морфологию клеток, но подвижность митохондрий при его экспрессии возрастает (см. рисунок 13). Таким образом, ответственной за эффект Rac1 на подвижность митохондрий может быть протеинкиназа PAK1. Чтобы проверить это предположение, было 84 решено использовать конститутивно-активный и доминантно-негативный мутанты PAK1. Рисунок 13. Морфология актиновых микрофиламентов в клетках линии MFT-6, экспрессирующих двойные точечные мутанты белка Rac1. А, Б – белок Rac1G12VY40H. В, Г – белок Rac1G12VF37L. А, В – флуоресценция EGFP. Б, Г – актиновые микрофиламенты. Для окраски актина использовали фаллоидин, меченный TRITC. Масштаб 10 мкм. 3.3. Проверка участия протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности и трансмембранного потенциала митохондрий 3.3.1. Влияние каталитического домена РАК1 на подвижность митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин Одним из возможных подходов для доказательства участия протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности митохондрий является сравнение эффекта от 85 экспрессии ее каталитического домена (РАК1-СТ) в виментин-содержащих и безвиментиновых клетках. Клетки линии MFT-6 и MFT-16 трансфецировали плазмидой pEGFP-РАК1СТ. В качестве контроля использовали нетрансфецированные клетки. Видно, что РАК1-СТ повышает относительную подвижность митохондрий только в виментин-содержащих клетках. В безвиментиновых же она остается на контрольном уровне (см. рисунок 14). А *p<0,01 Б А *p<0,01 Б Рисунок 14. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии MFT-6 (А) и линии MFT-16 (Б) при экспрессии конститутивно-активного мутанта белка РАК1. Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. 3.3.2. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции подвижности митохондрий Другим способом доказательства участия РАК1 в этом процессе является ингибирование ее активности. Низкомолекулярные ингибиторы для нее отсутствуют. Поэтому в настоящей работе был использован аутоингибиторный 86 домен РАК1 – PID (аминокислотные остатки с 83 по 149), для которого показаны доминантно-негативные свойства по отношению к РАК1 (Zhao et al., 1998). Мышиные фибробласты линии MFT-6 трансфецировали одновременно двумя плазмидами – pRFP-Rac1G12V и pEGFP-PID. В качестве позитивного контроля использовали клетки, трансфецированные только pRFP-Rac1G12V. В качестве негативного контроля использовали клетки, трансфецированные одновременно pRFP-Rac1G12V и pEGFP-PIDL107F. Точечная замена L107F не позволяет аутоингибиторному домену взаимодействовать с каталитическим доменом РАК1 (Zhao et al., 1998). При одновременной экспрессии в виментин-содержащих клетках белка RFPRac1G12V и pEGFP-PID относительная подвижность митохондрий снижается до уровня, наблюдаемого в нетрансфецированных клетках. EGFP-PIDL107F, напротив, не оказывает ингибирующего действия на РАК1-киназу. При его экспрессии с RFP-Rac1G12V относительная подвижность митохондрий повышается точно так же, как и в клетках, экспрессирующих только RFPRac1G12V (см. рисунок 15). Этот результат подтверждает участие РАК1 в Rac1зависимом контроле подвижности митохондрий в виментин-содержащих клетках. 3.3.3. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий Затем выясняли, участвует ли РАК1 в эффекте Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий. Мышиные фибробласты линии MFT-6 трансфецировали одновременно двумя плазмидами – pRFP-Rac1G12V и pEGFP-PID. В качестве позитивного контроля использовали клетки, трансфецированные только pRFPRac1G12V. В качестве негативного контроля использовали трансфецированные одновременно pRFP-Rac1G12V и pEGFP-PIDL107F. клетки, *p<0,0 1 87 *p<0,0 1 Рисунок 15. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии MFT-6 при экспрессии аутоингибиторного домена РАК1-киназы (PID) либо аутоингибиторного домена РАК1, не способного связываться с каталитическим доменом (PIDL107F), одновременно с экспрессией Rac1G12V. Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. *p<0,01 **p>0,8 *p<0,0 1 **p>0, 8 Рисунок 16. Трансмембранный потенциал митохондрий в клетках MFT-6 при экспрессии доминантно-негативного мутанта РАК1-киназы (PID) одновременно с Rac1G12V. Приведены средние значения интенсивности флуоресценции митохондрий с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. 88 3.4. Изучение роли остатка серина-55 виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с виментином Одной из возможных мишеней действия протеинкиназы РАК1 является виментин. При этом ранее в нашей лаборатории было показано, что некоторые мутантные формы виментина с делециями или точечными заменами в N-концевой части молекулы, способны формировать нормальную сеть ПФ, но теряют способность связываться с митохондриями. На основании делеционного анализа был выявлен участок молекулы виментина с 45 по 70 аминокислотный остаток, в отсутствие которого виментиновые ПФ не связывают митохондрии (Nekrasova et al., 2011). N-концевая область молекулы виментина содержит несколько сайтов фосфорилирования протеинкиназой РАК1. Один из них (серин-55) находится в участке связывания с митохондриями. Предполагается, что именно фосфорилирование виментина РАК1 приводит нарушении связи митохондрий с виментином и, как следствие, к увеличению их относительной подвижности. 3.4.1. Сборка ПФ из точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование Для изучения эффекта фосфорилирования виментина на подвижность митохондрий в безвиментиновых клетках экспрессировали мутанты виментина, имитирующие его фосфорилированные формы. Поскольку фосфорилирование виментина по некоторым сайтам, например, по серину-55, приводит к частичной разборке и переориентации сети ПФ (Li et al., 2006), на первом этапе работы мы проверили, формируется ли сеть ПФ из молекул виментина, содержащих точечные замены серина на глутаминовую кислоту в положениях 38 и 55. Кроме того, использовали точечный мутант VimS54E. Безвиментиновые клетки линии MFT-16 трансфецировали плазмидами pVimS38E-IRES2-EGFP, pVimS54E-IRES2-EGFP, pVimS55E-IRES2-EGFP, после чего клетки фиксировали и окрашивали антителами к виментину. 89 На рисунке 17 видно, что все мутантные формы виментина формируют нормальные сети ПФ. Рисунок 17. Восстановление виментиновых ПФ в безвиментиновых клетках линии MFT-16. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии виментиновых филаментов в клетках, трансфецированных pVimS38E-IRES2-EGFP (А – В), pVimS54E-IRES2-EGFP (Г – Е), pVimS55E-IRES2-EGFP (Ж – И). А, Г, Ж – фазовоконтрастное изображение. Б, Д, З – флуоресценция EGFP. В, Е, И – виментиновые филаменты. Для окраски виментина использовали антитела V9 и вторичные антитела, меченные TRITC. Масштаб 10 мкм. 90 3.4.2. Влияние точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование, на подвижность митохондрий На клетках, экспрессирующих мутантные формы виментина, имитирующие фосфорилирование, измеряли относительную подвижность митохондрий. Клетки MFT-16 трансфецировали плазмидами pVimS38E-IRES2-EGFP, pVimS54E-IRES2EGFP, а pVimS55E-IRES2-EGFP, нетрансфецированные клетки и в качестве клетки, контроля трансфецированные использовали плазмидой, кодирующей виментин дикого типа – pVimWT-IRES2-EGFP. Мутант виментина VimS55E не оказывает заякоривающего действия на митохондрии – относительная подвижность митохондрий в его присутствии такая же, как и в безвиментиновых клетках (см. рисунок 18). Для остатка серина-54 не показано фосфорилирование РАК1 ни in vivo, ни in vitro. Однако внесение дополнительного отрицательного заряда в участок связывания митохондрий с виментином также нарушает их связь. В то же время замена S38E (вне участка связывания митохондрий с виментином) не препятствует их взаимодействию и снижает относительную подвижность митохондрий подобно виментину дикого типа. Таким образом, именно фосфорилирование виментина в участке связывания с митохондриями приводит к нарушению их заякоривания и увеличению их относительной подвижности. 3.4.3. Сборка ПФ из нефосфорилируемых аналогов виментина Другой удобной моделью для изучения роли фосфорилирования виментина в регуляции его взаимодействий с митохондриями являются нефосфорилируемые аналоги виментина, то есть точечные мутанты с заменой серина на аланин в исследуемых участках – VimS38A, VimS54A, VimS55A. Предполагается, что при одновременной экспрессии таких белков с конститутивно-активным Rac1 относительная подвижность митохондрий повышаться невозможности РАК1 фосфорилировать виментин. не будет из-за 91 *p<0,01 *p<0,01 Рисунок 18. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии MFT-16 при экспрессии точечных мутантов виментина с заменой серина на глутаминовую кислоту в положениях 38, 54, 55 молекулы виментина. Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. Поскольку известно, что фосфорилирование в N-концевой области важно для реорганизации виментиновой сети, на первом этапе мы проверили, не приводит ли к нарушениям в системе ПФ экспрессия таких мутантов. Безвиментиновые клетки линии MFT-16 трансфецировали плазмидами pVimS38А-IRES2-EGFP, pVimS54А-IRES2-EGFP, pVimS55А-IRES2-EGFP, после чего клетки фиксировали и окрашивали антителами к виментину. На рисунке 19 видно, что в случае всех мутантных форм виментина формируются нормальные сети ПФ. 92 Рисунок 19. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии виментиновых филаментов в клетках, трансфецированных pVimS38А-IRES2-EGFP (А – В), pVimS54А-IRES2-EGFP (Г – Е), pVimS55А-IRES2-EGFP (Ж – И). А, Г, Ж – фазовоконтрастное изображение. Б, Д, З – флуоресценция EGFP. В, Е, И – виментиновые филаменты. Для окраски виментина использовали антитела V9 и вторичные антитела, меченные TRITC. Масштаб 10 мкм. 93 3.4.4. Влияние нефосфорилируемых мутантов виментина на регуляцию подвижности митохондрий белком Rac1 Чтобы выяснить, какую роль играет фосфорилирование виментина РАК1 в регуляции подвижности митохондрий белком Rac1, клетки MFT-16 трансфецировали плазмидами pVimS38A-IRES2-EGFP-Rac1G12V, pVimS54AIRES2-EGFP-Rac1G12V, pVimS55A-IRES2-EGFP-Rac1G12V. В этих клетках измеряли относительную подвижность митохондрий и сравнивали ее с таковой в клетках, трансфецированных плазмидами pVimS38A-IRES2-EGFP, pVimS54AIRES2-EGFP, pVimS55A-IRES2-EGFP. В качестве контроля использовали плазмиду, кодирующую виментин дикого типа – pVimWT-IRES2-EGFP, и соответствующую плазмиду, кодирующую одновременно виментин дикого типа и Rac1G12V – pVimWT-IRES2-EGFP-Rac1G12V. Как видно на рисунке 20, все нефосфорилируемые аналоги виментина ингибируют подвижность митохондрий так же, как виментин дикого типа. Значения относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих pVimS38A-IRES2-EGFP, pVimS54A-IRES2-EGFP, pVimS55A-IRES2-EGFP, достоверно не различаются ни между собой, и в сравнении с pVimWT-IRES2EGFP. При этом одновременная экспрессия нефосфорилируемых аналогов виментина с Rac1G12V выявила существенные отличия в поведении виментина с заменой S55A и форм с заменами S54A и S38A. Rac1G12V приводит к увеличению относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих VimS38A или VimS54A, но не оказывает на нее влияния в клетках, экспрессирующих VimS55A. То есть неспособность РАК1 фосфорилировать серин-55 имеет критическое значение в регуляции подвижности митохондрий в этих клетках, в то время как остатки серина-38 и 54 такой роли не играют. 94 *p<0,01 **p>0,8 *p<0,01 **p>0,8 Rac1G12V VimWT - VimWT + VimS38A - VimS38A + VimS54A - VimS54A + VimS55A - VimS55A + Рисунок 20. Относительная подвижность митохондрий в клетках линии VimWT MFT-16 -при Rac1G12V VimWT VimS38A VimS38A VimS54A VimS54A VimS55A VimS55A экспрессии мутантов виментина серина на + -точечных + + - с заменой + аланин в положениях 38, 54, 55 молекулы виментина одновременно с экспрессией Rac1G12V. Приведены средние значения с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. 3.4.5. Влияние нефосфорилируемых аналогов виментина на эффект Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий Для доказательства участия фосфорилирования виментина по остатку серина-55 в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий клетки MFT16 трансфецировали плазмидами pVimS55A-IRES2-EGFP, pVimS55E-IRES2EGFP, pVimS55A-IRES2-EGFP-Rac1G12V, pVimS55E-IRES2-EGFP-Rac1G12V. В этих клетках измеряли трансмембранный потенциал митохондрий. В качестве контроля использовали плазмиду, кодирующей виментин дикого типа – pVimWTIRES2-EGFP, и соответствующую плазмиду, кодирующую одновременно виментин дикого типа и конститутивно-активный белок Rac1 – pVimWT-IRES2EGFP-Rac1G12V. 95 На рисунке 21 видно, что трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, экспрессирующих VimS55A, выше, чем в клетках с VimS55E, и соответствует уровню, наблюдаемому в клетках, экспрессирующих виментин дикого типа. При этом экспрессия белка Rac1G12V не вызывает падение трансмембранного потенциала митохондрий в клетках с виментином VimS55A, как это происходит в клетках с виментином дикого типа. Уровень трансмембранного потенциала в клетках, экспрессирующих VimS55E, исходно низкий, и экспрессия Rac1G12V не влияет на него. фосфорилирование по остатку серина-55 играет роль Таким образом, в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий белком. Мутация S55A в виментине предотвращает падение потенциала, вызванное белком Rac1. 3.5. Влияние взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам Влияние взаимодействия митохондрий с виментином на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам изучали на линии клеток MFT-16 и линиях, стабильно экспрессирующих различные мутантные формы виментина. Эти линии содержали виментин дикого типа (VimWT) или мутанты виментина, несущие точечные замены серина-55: имитирующий фосфорилированный (VimS55E) или дефосфорилированный виментин (VimS55A). В качестве контроля использовали клетки, экспрессирующие виментин VimP56R, для которого ранее было показано нарушение связывания с митохондриями (Nekrasova et al., 2011). Клеточные линии были получены при помощи ретровирусной инфекции с последующей селекцией пуромицином (см. Глава 2. МЕТОДЫ, п. 2.7.). 96 *p<0,01 *p<0,01 Rac1G12V VimWT - VimWT + VimS55A - VimS55A + VimS55E - VimS55E + Рисунок 21. Трансмембранный потенциал митохондрий в клетках MFT-16 VimWT экспрессии VimWT VimS55A VimS55A VimS55E VimS55E при одновременной Rac1G12V и виментина с точечными заменами Rac1G12V - + - + - + S55A и S55E. Приведены средние значения интенсивности флуоресценции митохондрий с указанием SEM, n – число клеток (митохондрий) в каждом измерении. Тест на определение чувствительности клеток к цитотоксическим препаратам проводили так, как описано в Главе 2. МЕТОДЫ, п. 2.8. В подобранных условиях для MTT-теста диапазон концентраций исследуемых препаратов составил 0,003-3,2 мкМ адрибластина и 0,01-50 нМ винкристина. Для теста с нейтральным красным был получен схожий диапазон концентраций и адрибластина, и винкристина, которые позволили получить оптимальные кривые выживаемости. Клетки линии MFT-16 и линий, полученных на ее основе, сравнивали по чувствительности к адрибластину и винкристину. Оказалось, что клетки, экспрессирующие различные формы виментина, обладают разной чувствительностью к цитотоксическим препаратам. На рисунке 22 видно, что кривые выживаемости клеток MFT-16+VimWT и MFT-16+VimS55A в целом 97 смещены в сторону более высоких концентраций относительно кривой, полученной для безвиментиновых клеток MFT-16. Рисунок 22. Кривые выживаемости клеток линии MFT-16 и линий, стабильно экспрессирующих различные мутантные формы виментина в присутствии адрибластина и винкристина. А, В – МТТ-тест. Б, Г – тест с нейтральным красным. А, Б – адрибластин. В, Г – винкристин. В таблице 2 также видно, что значения как IC50, так и IC90 для обоих исследуемых препаратов в линиях MFT-16+VimWT и MFT-16+VimS55A достоверно выше, чем в контрольной линии MFT-16. На основании этих данных 98 можно предположить, что для развития апоптоза клеткам, в которых митохондрии взаимодействуют с виментином, требуются более высокие концентрации адрибластина и винкристина. Таблица 2. Устойчивость клеток MFT-16 и линий, стабильно экспрессирующих различные мутантные формы виментина, к действию адрибластина и винкристина. Виментин МТТ-тест IC90MTT Тест с нейтральным красным IC50MTT IC90НК IC50НК АДРИБЛАСТИН, нМ Vim-/- 1.58±1.10 16.92±4.69 2.38±1.20 24.41±4.78 VimP57R 3.13±1.50 23.96±4.23 3.21±1.40 27.38±4.47 VimS55E 0.10±0.30 4.72±7.37 1.56±1.10 20.16±5.55 VimS55A 9.95±3.10 70.99±9.34 11.60±3.00 79.37±8.81 VimWT 10.71±3.60 82.98±11.27 6.21±2.50 65.87±9.47 ВИНКРИСТИН, нМ Vim-/- 0.12±0.03 0.84±0.07 0.17±0.03 0.88±0.06 VimP57R 0.10±0.03 0.85±0.08 0.16±0.03 0.91±0.07 VimS55E 0.05±0.02 0.66±0.10 0.06±0.02 0.65±0.07 VimS55A 0.17±0.05 2.24±0.28 0.10±0.03 1.19±0.14 VimWT 0.19±0.05 2.16±0.25 0.14±0.04 1.39±0.15 В то же время для клеточных линий MFT-16+VimS55E и MFT-16+VimP56R такого эффекта не наблюдается. Для них кривые выживаемости совпадают с кривыми, полученными для безвиментиновых клеток линии MFT-16. Значения IC50 и IC90 также достоверно не отличаются (см. рисунок 22). При количественном анализе оказалось, что клетки линии MFT-16, MFT-16+VimS55E и MFT-16+VimP56R демонстрируют достоверно более низкие значения как IC90MTT, так и IC50MTT по сравнению с клетками MFT-16+VimWT и MFT16+VimS55A в опытах с адрибластином. Аналогичные данные были получены 99 для теста с нейтральным красным. Те же закономерности были замечены и в опытах с винкристином (см. таблицу 2). Таким образом, несмотря на наличие ПФ в этих клетках, чувствительность к адрибластину и винкристину оказывается такой же, как в безвиментиновых клетках. Полученные данные говорят о том, что именно взаимодействие митохондрий с виментином позволяет клеткам уменьшить чувствительность к действию цитотоксических агентов и сделать их более устойчивыми к внешним воздействиям. 100 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В настоящей работе показано, что регулятором взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ является малая ГТФаза Rac1. Активация Rac1 под действием внешних факторов приводит к активации протеинкиназы РАК1. РАК1 фосфорилирует виментин по остатку серина-55, который расположен в Nконцевой части. Это нарушает взаимодействие митохондрий с виментином, в результате чего возрастает подвижность митохондрий и снижается их трансмембранный потенциал. Практически все функции митохондрий зависят от их потенциала. Поэтому описанная в настоящей работе регуляция связывания митохондрий с виментином малой ГТФазой Rac1 может быть одним из механизмов регуляции их функционального состояния, а следовательно, и метаболизма клетки в целом. Регуляция выработки АФК малой ГТФазой Rac1 и участие митохондрий в этом процессе были описаны ранее (Werner et al., 2002). Авторами этой работы было показано, что обязательным условием для активации NF-κB-сигнального пути с последующей экспрессией коллагеназы-1 при активации Rac1 интегриновыми рецепторами в нейтрофилах является выработка АФК, но не мембранной NADPH-оксидазой. Об этом говорит то, что точечные мутанты Rac1, не связывающиеся с NADPH-оксидазой, тем не менее вызывают увеличение продукции АФК. Препятствует же увеличению продукции АФК в описанной системе добавление антиапоптотического белка Bcl-2. Таким образом, авторы работы (Werner et al., 2002) сделали вывод, что рост АФК в данном процессе обеспечивается неизвестным путем, зависящим от митохондрий. В качестве механизма описанного явления они предложили несколько гипотез, в частности, прямое фосфорилирование антиапоптотического белка Bcl-2 с его последующей инактивацией, однако не рассматривали возможность опосредованного влияния Rac1 на свойства митохондрий, например, через регуляцию их взаимодействия с цитоскелетом. Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что 101 белок Rac1 действует на митохондрии через регуляцию их связи с цитоскелетными структурами – ПФ. Ранее было показано, что ПФ играют важную роль в регуляции распределения и функционирования различных органелл. Например, виментин участвует в эндосомном/лизосомном транспорте. Было показано прямое взаимодействие виментина с периферийными белками аппарата Гольджи: формимино-трансфераза-циклодезаминазой (Gao et al., 2001) и MICAL (Suzuki et al., 2002). Кроме того, известно, что виментин, периферин и α-интернексин связываются с адаптерным белком AP-3 (Styers et al., 2005), который представляет собой гетеротетрамерный комплекс, переносящий везикулы между эндосомнымлизосомным компартментами и регулирующий сортинг лизосом, меланосом, синаптических везикул (Robinson, 2004). Также AP-3 играет важную роль в поддержании уровня клеточного Zn2+. В клетках, нокаутных по гену виментина, наблюдается несвязанный транспорт гликолипидов между компартментом эндосом/лизосом и компартментом Гольджи (Styers et al., 2005). Концентрация везикулярного Zn2+ в них в 40 раз меньше, чем в норме (Styers et al., 2004). В этих клетках также наблюдается сниженное образование аутофагосом. Цитоплазматические ПФ участвуют в поддержании формы и расположения ядра. В клетках, нокаутных по гену виментина, отсутствуют ядерные инвагинации (Sarria et al., 1994), а мутации в некоторых кератинах приводят к изменению формы, размера и положения ядра. Известно также, что виментиновые ПФ регулируют дыхание митохондрий и играют важную роль в поддержании морфологии и организации митохондрий (Tang et al., 2008). Еще в ранних работах при помощи световой и электронной микроскопии были получены данные о колокализации митохондрий и ПФ в клетках (Eckert, 1986). Имеются данные о повышенной энергизованности внутренней мембраны митохондрий, связанных с цитоскелетом на периферии клетки, по сравнению с митохондриями в околоядерной области, не связанными с цитоскелетом (Collins et al., 2002). В нашей лаборатории было показано, что наличие виментина увеличивает трансмембранный потенциал митохондрий 102 (Chernoivanenko et al., 2015). Также было показано, что виментиновые ПФ защищают митохондрии от фрагментации в условиях окислительного стресса (Матвеева и др., 2010), и что в фибробластах, лишенных гена виментина, подвижность митохондрий выше, чем в клетках с виментиновыми ПФ (Некрасова et al., 2007). При восстановлении сети ПФ за счет экспрессии экзогенного виментина в этих клетках подвижность митохондрий снижается до контрольного уровня (Nekrasova et al., 2011). Было показано, что за связывание митохондрий отвечает небольшой участок молекулы виментина – аминокислотные остатки 41 по 94 (Nekrasova et al., 2011). Таким образом, участие виментиновых филаментов в поддержании нормального функционирования и распределения митохондрий не вызывает сомнения. Можно предположить, что связывание с ПФ является способом регуляции работы митохондрий, и, следовательно, находится под строгим регуляторным контролем. Согласно полученным в настоящей работе данным, центральным звеном этой регуляции является малая ГТФаза Rac1. Конститутивно-активный мутант белка Rac1 увеличивает относительную подвижность митохондрий только в клетках, содержащих виментин, и не влияет на нее в безвиментиновых клетках. В то же время при экспрессии доминантно-негативного мутанта белка Rac1 относительная подвижность митохондрий практически не отличается от контрольного уровня как в случае безвиментиновых, так и в случае виментинсодержащих клеток. Это говорит о том, что Rac1 регулирует относительную подвижность митохондрий только в клетках, содержащих виментин. Исследование с помощью фотоактивируемого белка Rac1 показало, что именно активация Rac1 приводит к увеличению подвижности митохондрий. Более того, после начала активации она возрастает постепенно и выходит на плато через 40 минут после начала освещения. Rac1 оказывает влияние не только на подвижность митохондрий, но и на их функциональное состояние, определяемое трансмембранным потенциалом. Оказалось, что под действием Rac1 уменьшается трансмембранный потенциал митохондрий, причем только в клетках, содержащих виментин. 103 Известно, что Rac1 имеет множество белков-мишеней. Поиск белка, ответственного за наблюдаемый эффект Rac1 на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий, проводили с помощью двойных точечных мутантов, соответствующую содержащих мутацию в активирующую эффекторной петле. замену G12V и Точечные замены в эффекторных петлях избирательно нарушают взаимодействие Rac1 c некоторыми эффекторами (Joneson et al., 1996). Анализ двойных точечных мутантов Rac1 показал, что на подвижность митохондрий влияет только белок с заменой F37L, который связывается с РАК1-киназой. При его экспрессии увеличивается подвижность митохондрий по сравнению с контрольными клетками, как и при экспрессии конститутивно-активного белка Rac1G12V. При этом замена Y40H, нарушающая взаимодействие с РАК1-киназой, не позволяет Rac1 увеличивать подвижность митохондрий. Из этих результатов можно заключить, что в регуляции подвижности митохондрий не участвует ингибирование белка RhoA. Экспрессия двойного точечного мутанта Rac1G12VY40H приводит ингибированию белка RhoA и, как следствие, к практически полной разборке стресс-фибрилл. Но подвижность митохондрий при этом не увеличивается. Rac1G12VF37L, наоборот, не приводит к ингибированию RhoA (стресс-фибриллы сохраняются), но подвижность митохондрий возрастает. Кроме того, эти результаты говорят о том, что наблюдаемый эффект белка Rac1 на подвижность митохондрий не связан с коллапсом сети ПФ к ядру. Действительно, можно было бы предположить, что наблюдаемое при активации многих протеинкиназ, включая РАК1, перемещение ПФ к ядру приводит к уменьшению вязкости цитоплазмы на периферии клетки и, как следствие, к ускорению перемещения находящихся там органелл, в том числе митохондрий. Однако этого не происходит – при экспрессии Rac1G12VY40H наблюдается коллапс ПФ к ядру, но подвижность митохондрий не возрастает по сравнению с контрольным уровнем. В клетках, экспрессирующих Rac1G12VF37L, коллапса ПФ не происходит, сеть ПФ сохраняется интактной, подвижность митохондрий же, наоборот, возрастает. 104 Таким образом, полученные данные говорят о том, что за эффект белка Rac1 на подвижность митохондрий отвечает протеинкиназа РАК1. Дополнительными свидетельствами в пользу такой регуляции служат результаты экспериментов с экспрессией каталитического и аутоингибиторного домена РАК1 в клетках. При экспрессии каталитического домена РАК1 увеличивается подвижность митохондрий. Напротив, если экспрессировать доминантно-негативный мутант РАК1 одновременно с конститутивно-активным мутантом Rac1G12V, то относительная подвижность митохондрий сохраняется на контрольном уровне. Кроме того, доминантно-негативный мутант РАК1 предотвращает падение потенциала, вызванное белком Rac1, что является еще одним доказательством участия РАК1-киназы в этом процессе. Протеинкиназа РАК1 способна непосредственно фосфорилировать остатки серина в N-концевой области молекулы виментина. В опытах in vitro было показано фосфорилирование по остаткам серина в положениях 26, 38, 51, 66, 73 (Goto et al., 2002). В опытах in vivo оказалось, что РАК1 фосфорилирует виментин по серину-55 и 38. Следует отметить, что один из этих аминокислотных остатков, серин-55, находится в участке, отвечающем за взаимодействие виментина с митохондриями. Можно предположить, что внесение дополнительного отрицательного заряда в этот участок за счет фосфорилирования серина-55 нарушает заякоривание митохондрий на ПФ, и, как следствие, их подвижность возрастает. Для доказательства участия фосфорилирования виментина в этом процессе были использованы точечные мутанты виментина, несущие замену серина на глутаминовую кислоту в положениях 38 и 55. Ранее было показано, что фосфорилирование по остаткам серина-38 и 55 приводит к реогранизиции сети ПФ в клетках гладкой мускулатуры, причем этот эффект исчезает при ингибировании РАК1-киназы (Tang et al., 2005). Однако в настоящей работе показано, что мутанты виментина, имитирующие фосфорилирование, собираются в нормальную сеть. Анализ относительной подвижности митохондрий в таких клетках показал, что внесение дополнительного отрицательного заряда в участок 105 связывания митохондрий с виментином (точечные замены S54E и S55E) приводит к нарушению связи и увеличению относительной подвижности митохондрий. Замена остатка серина-38, лежащего вне участка связывания митохондрий с виментином, на глутаминовую кислоту, не приводит к такому эффекту. Относительная подвижность митохондрий в этом случае такая же, как при экспрессии виментина дикого типа. Таким образом, именно фосфорилирование виментина в участке связывания с митохондриями приводит к нарушению их заякоривания и увеличению их относительной подвижности, причем этот эффект не связан с разборкой сети ПФ. Другим доказательством участия фосфорилирования виментина в регуляции его взаимодействия с митохондриями являются данные, полученные при одновременной экспрессии конститутивно-активного нефосфорилируемых белка Rac1. Оказалось, аналогов что виментина эффект Rac1 и на подвижность митохондрий блокируется только заменой S55A. Замена S38A и S54A не препятствуют фосфорилированию виментина РАК1 по остатку серина-55 и, следовательно, не влияют на увеличение относительной подвижности митохондрий при активации белка Rac1. Полученные данные согласуются с предложенной в настоящей работе моделью – белок Rac1 активирует протеинкиназу РАК1, но она не может фосфорилировать N-конец виментина, поскольку в положении 55 присутствует аланин вместо серина. Невозможность фосфорилирования в этом сайте приводит к тому, что митохондрии продолжают взаимодействовать с виментином, несмотря на наличие конститутивно-активного белка Rac1. Таким образом, ключевое значение в данной регуляции имеет аминокислотный остаток серина-55. При его фосфорилировании протеинкиназой РАК1 связь митохондрий с виментином нарушается, и, как следствие, их подвижность увеличивается. Кроме того, мутация S55A в виментине препятствует снижению потенциала, вызванному экспрессией конститутивно-активного белка Rac1. На основании собственных данных и данных литературы в настоящей работе предлагается следующая схема регуляции взаимодействия митохондрий с 106 виментином (см. рисунок 23). Малая ГТФаза Rac1 активируется в клетке в ответ на внешние сигналы. Затем она переводит эффекторный белок, протеинкиназу РАК1, в активное состояние. РАК1 фосфорилирует виментин по остатку серина в положении 55, который находится в участке взаимодействия митохондрий с виментином. Внесение дополнительного отрицательного заряда в этом участке приводит к нарушению связи митохондрий с виментином. Как следствие, в митохондриях, не взаимодействующих с виментином, снижается трансмембранный потенциал. Также при этом прекращается митопротекторное действие виментиновых филаментов, и клетки становятся более чувствительными к цитотоксическим препаратам. В настоящей работе было показано, что связь митохондрий с виментином может регулироваться. Взаимодействие с виментином повышает трансмембранный потенциал митохондрий и устойчивость к внешним АФК (Chernoivanenko et al., 2015; Матвеева et al., 2010; Черноиваненко et al., 2011). Следовательно, регуляция этого взаимодействия является способом влиять на функции митохондрий. Таким образом, виментин выступает модулятором свойств митохондрий. Интересно, что участок связывания виментина с митохондриями (аминокислотные остатки с 41 по 94) отвечает требованиям сигнальной последовательности локализации в наружной митохондриальной мембране. Он богат гидрофобными аминокислотами и фланкирован двумя кластерами позитивно заряженных аминокислот (Rapaport, 2003). В нем содержится также консервативный остаток пролина (пролин-56 для виментина), необходимый для эффективного связывания с митохондрией ряда белков (Allen et al., 2002). Замена этого остатка на аргинин приводит к невозможности виментина связываться с митохондриями (Nekrasova et al., 2011), и такой мутант не защищает митохондрии от окислительного стресса (Матвеева и др., 2010). Здесь необходимо отметить, что этот участок похож на последовательности связывания с внешней митохондриальной мембраной других митохондрий – белков семейства Bcl-2. известных модуляторов свойств 107 Рисунок 23. Схема регуляции взаимодействия митохондрий с виментином малой ГТФазой Rac1 и ее эффектором протеинкиназой РАК1. Известно, что белки семейства Bcl-2 влияют на обмен АТФ на АДФ (Vander Heiden et al., 1999), хотя сами локализуются с цитоплазматической стороны наружной мембраны (de Jong et al., 1994), а единственный известный переносчик (ANT) находится во внутренней мембране. То же противоречие имеет место и в случае виментина. Полученные в настоящей работе результаты говорят о том, что виментин влияет на свойства, определяемые внутренней митохондриальной мембраной (например, трансмембранный потенциал), в то время как связывается он с наружной митохондриальной мембраной. В литературе предлагалось несколько объяснений того, как сигнал с наружной митохондриальной мембраны попадает на внутреннюю. Одно из них состоит в том, что проницаемость внешней митохондриальной мембраны для крупных анионов (АТФ и АДФ) не является абсолютной. В этом случае в роли регулирующей молекулы выступает VDAC. Недостаток ростовых факторов имеет несколько последствий, одним из самых существенных среди которых является метаболический арест, приводящий к уменьшению трансмембранного потенциала митохондрий и снижению скорости работы ЭТЦ. Это приводит к накоплению 108 NADH, для которого показана способность переводить VDAC в закрытую конформацию (Zizi et al., 1994). И хотя ANT сохраняет интактное состояние, его работа ограничивается из-за нарушения поступления АДФ в межмембранное пространство (Vander Heiden et al., 2000). Закрытие VDAC приводит к накоплению креатинфосфата в межмембранном пространстве и нарушению обмена многих молекул и ионов между митохондрией и цитозолем. Существует предположение, что закрытие VDAC при недостатке ростовых факторов служит для митохондрии защитой от клеточного стресса. Так, VDACподобные каналы имеются во внешней мембране многих грам-отрицательных бактерий, и они переходят в закрытое состояние при клеточном стрессе, что обеспечивает сохранение гомеостаза межмембранного пространства и, таким образом, защиту внутренней (энергетической) мембраны (Rudel et al., 1996). У эукариот закрытие VDAC наблюдается при аноксии (недостатке кислорода), что обеспечивает прекращение обмена многими молекулами и ионами между цитозолем и митохондрией (Aw et al., 1987). Однако длительное закрытие VDAC приводит к нарушению целостности внешней митохондриальной мембраны, выходу цитохрома с в цитозоль и апоптозу. Поддержание VDAC в открытом состоянии и нормальный обмен метаболитами между митохондрией и цитозолем является необходимым для нормального функционирования как митохондрии, так и клетки в целом. Следовательно, VDAC, регулируя проницаемость внешней митохондриальной мембраны, сам должен являться объектом тонкой регуляции. Упомянутое выше влияние белков семейства Bcl-2 на АТФ/АДФ-обмен (Vander Heiden et al., 1999), может быть объяснено влиянием на работу VDAC, а не ANT. Например, в семейство Bcl-2 входят проапоптотические белки Bax, Bak, Bad и Bid. Они нарушают целостность VDAC, переводя его в патологическую открытую конформацию, которая, в отличие от нормальной открытой конформации, проницаема для цитохрома с (Shimizu et al., 1999). Наряду с проапоптотическими, в это семейство входят и антиапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL. Для VDAC было показано прямое взаимодействие с белком Bcl-xL in vitro (Shimizu et al., 1999). Bcl-xL поддерживает VDAC в открытом состоянии при 109 удалении ростовых факторов из среды (Vander Heiden et al., 2000), препятствуя развитию апоптоза. Таким образом, белки Bcl-2 и Bcl-xL, по-видимому, осуществляют свои антиапоптотические функции за счет поддержания VDAC в нормальном открытом состоянии. Возможно, виментин ведет себя похожим образом. За счет поддержания VDAC в открытом состоянии (то есть сохранения нормального тока метаболитов) он поддерживает высокий уровень трансмембранного потенциала, чего не наблюдается в безвиментиновых клетках (Черноиваненко et al., 2011). Известно, что виментин экспрессируется во многих типах опухолей и служит прогностическим маркером особо неблагоприятных видов рака, включая резистентные и метастатические формы. Резистентность к проводимой химиотерапии опухолей, экспрессирующих виментин, связывают с тем, что его экспрессия коррелирует со способностью раковых клеток к миграции и инвазии в окружающие ткани (Gilles et al., 1999). Для клеток многих опухолей эпителиального метастазировании. происхождения Она экспрессия сопровождается виментина увеличением характерна при подвижности и инвазивности клеток опухоли (Hendrix et al., 1996; Mendez et al., 2010; Wei et al., 2008). Подавление экспрессии виментина в опухолевых клетках приводит к снижению их подвижности и способности к инвазии (McInroy et al., 2007). В настоящей работе впервые было предложено объяснение тому факту, что виментин экспрессируется при резистентных формах рака – виментин, связываясь с митохондриями, может играть для клеток защитную роль. Гибель клеток всегда сопровождается снижением трансмембранного потенциала митохондрий, виментин же сохраняет его на высоком уровне. Чтобы проверить эту гипотезу, на основе клеток MFT-16, лишенных ПФ, методом ретровирусной трансфекции были получены линии, стабильно экспрессирующие различные формы виментина. Был использован виментин дикого типа, способный связываться с митохондриями, или его мутантные формы, которые утратили эту способность. Анализ жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста в присутствии различных концентраций винкристина и адрибластина показал, что только 110 виментин дикого типа и виментин с заменой S55A позволяют клеткам увеличивать устойчивость к действию цитотоксических препаратов по сравнению с безвиментиновыми клетками MFT-16. Виментин c заменой S55E и P56R не обладают таким свойством. Значения IC50 и IC90 для них не отличаются от MFT16. Следует отметить, что значения оптической плотности, получаемые в ходе МТТ-теста, в значительной степени зависят от функционального состояния митохондрий. Связано это с тем, что конвертацию МТТ в формазан осуществляют преимущественно дегидрогеназы цикла Кребса, находящиеся в матриксе митохондрий. Поскольку в настоящей работе изучалось как раз влияние взаимодействия с виментином на митохондрии, в качестве контроля был использован другой тест – с нейтральным красным, который не так сильно зависит от свойств митохондрий. В тесте с нейтральным красным были получены схожие результаты. Таким образом, полученные результаты говорят о том, что виментин оказывает на клетки защитный эффект только в том случае, если он может взаимодействовать с митохондриями. Предложенный в настоящей работе механизм регуляции прикрепления митохондрий к виментиновым ПФ является возможным способом влияния на работу этих органелл и, как следствие, на свойства клетки в целом. Так, на переднем крае мигрирующего фибробласта активна малая ГТФаза Rac1. Наряду с формированием ламеллоподий она может включать протеинкиназу РАК1, которая фосфорилирует виментин по участку связывания с митохондриями. В результате этого митохондрии в передней части клетки перестают взаимодействовать с ПФ. Такое нарушение взаимодействия имеет ряд последствий. Митохондрии получают возможность перемещаться в области цитоплазмы, где продукция АТФ необходима. Кроме того, в них снижается трансмембранный потенциал, что способствует увеличению продукции АФК и поддержанию выбранного направления миграции. Такая регуляция также позволяет модулировать свойства клетки в целом, поскольку взаимодействие митохондрий с виментином увеличивает устойчивость клеток к цитотоксическим воздействиям. 111 ВЫВОДЫ 1. Активация малой ГТФазы Rac1 повышает относительную подвижность митохондрий и уменьшает трансмембранный потенциал митохондрий в виментин-содержащих клетках и не влияет на них в безвиментиновых клетках. 2. Протеинкиназа PAK1 отвечает за увеличение относительной подвижности и увеличение трансмембранного потенциала митохондрий при активации Rac1. 3. Связь митохондрий с виментином регулируется при помощи фосфорилирования виментина по остатку серина-55. 4. Связывание митохондрий с виментином улучшает выживаемость клеток при воздействии цитотоксических препаратов. 112 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АДФ – аденозин-5’-дифосфат АТФ – аденозин-5’-трифосфат АФК – активные формы кислорода ГДФ – гуанозин-5’-дифосфат ГТФ – гуанозин-5’-трифосфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота МТТ – 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид ПКА – протеинкиназа А ПКС – протеинкиназа С ПФ – промежуточные филаменты РНК –рибонуклеиновая кислота ЭПР – эндоплазматический ретикулум ЭТЦ – электрон транспортная цепь ANT – АТФ/АДФ-антипортер (adenine nucleotide translocase) CT – С-концевой каталитический домен протеинкиназы PAK1 (catalytic tail) DMEM – среда для клеток (Dulbecco`s modified Eagle`s medium) EGF – эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor) EGFP – зеленый флуоресцентный белок (enchanced green fluorescent protein) ERK – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами (extracellular signalregulated kinase) FAD/FADH2 – флавинадениндинуклеотид FITC – флуоресцеин-изотиоцианат FMN – флавинмононуклеотид GAP – белок, активирующий ГТФазу (GTPase activating protein) GDI – ингибитор диссоциации гуаниловых нуклеотидов (GDP dissociation inhibitor) GEF – фактор обмена гуаниловых нуклеотидов (guanine nucleotide-exchange factor) 113 GFAP – кислый глиальный белок (glial filament acidic protein) JC-1 – 5,5’,6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’-бензимидазолокарбоцианин йодид JNK – JNK-киназа (Jun N-terminal kinase) LIMK – LIM-киназа (LIM-domain kinase) LOV – домен, чувствительный к свету, кислороду, напряжению (light, oxygen, voltage) МАР – белки, ассоциированные с микротрубочками (microtubule-associated proteins) NAD+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный NADH – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный NADРH – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный NF-L, NF-M, NF-H – лѐгкие, средние, тяжѐлые белки нейрофиламентов (neurofilament light, medium, heavy) N-WASP – neural Wiskott-Aldrich syndrome family protein PAK – р21-активируемая киназа (p21 activated kinase) PBS – фосфатный буфер (phosphate buffered saline) PBD – домен, связывающийся с р21 (р21 binding domain) PDGF – тромбоцитарный фактор роста (platelet-derived growth factor) PI-4-P5K – киназа фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (рhosphatidylinositol-4,5bisphosphate kinase) PIX – PAK interacting exchange factor PTP – permeability transition pore RFP – красный флуоресцентный белок (red fluorescent protein) SEM – стандартная ошибка среднего (standard error of mean) TIM – переносчик внутренней митохондриальной мембраны (translocase of inner membrane) TOM – переносчик внешней митохондриальной мембраны (translocase of outer membrane) ТРА – 12-О-тетрадеканоилфорбол -13-ацетат TRITC – тетраметил-родамин-изотиоцианат 114 TMRE – тетраметил-родамин-этиловый эфир ULF – филаменты единичной длины (unit length filaments) VDAC – потенциал-зависимый анионный канал (voltage-dependent anion channel) WAVE – Wiskott-Aldrich syndrome protein verprolin homologous 115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Виноградов А. Д. Преобразование энергии в митохондриях. // Соросовский образовательный журнал 1999. Т. 9. 2. Кулик А. В., Некрасова О. Е., Минин А. А. Фибриллярный актин регулирует подвижность митохондрий. // Биологические мембраны 2006. Т. 23. С. 3342. 3. Ленинджер А. (1985). Основы биохимии. В 3-х томах. Москва, "Мир". 4. Матвеева Е. А., Черноиваненко И. С., Минин А. А. Виментиновые промежуточные филаменты защищают митохондрии от окислительного стресса. // Биологические мембраны 2010. Т. 27. С. 1-11. 5. Некрасова О. Е., Кулик А. В., Минин А. А. Протеинкиназа С регулирует подвижность митохондрий. // Биологические мембраны 2007. Т. 24. С. 126132. 6. Некрасова О. Е., Минин А. А., Кулик А. В., Минин А. А. Регуляция фибронектином формы и внутриклеточного распределения митохондрий. // Биологические мембраны 2005. Т. 22. С. 58-65. 7. Скулачѐв В. П. (1989). Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. Москва, "Высшая школа". 8. Черноиваненко И. С., Матвеева Е. А., Минин А. А. Виментиновые промежуточные филаменты увеличивают потенциал митохондрий. // Биологические мембраны 2011. Т. 28. С. 43-51. 9. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2008). Molecular biology of the cell, 5th edition. New York, Garland Science. 10. Altmann R. (1890). Die Elementarorganismen und ihre Beziehungen zu den Zellen. Leipzig, Veit. 11. Bers D. M. (2001). Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. Dordrecht, Springer. 116 12. Frederic J., Chevremont M. [Investigations on the chondriosomes of living cells by phase contrast microscopy and microcinematography]. // Arch Biol (Liege) 1952. V. 63. P. 109-131. 13. Klingenberg M., Pfaff E. // Biochim Biophys Acta 1966. V. 7. P. 180-200. 14. Parsons D. F., Williams G. R., Chance B. Characteristics of isolated and purified preparations of the outer and inner membranes of mitochondria. // Ann N Y Acad Sci 1966. V. 137. P. 643-666. 15. Parsons D. F., Yano Y. The cholesterol content of the outer and inner membranes of the guinea pig liver mitochondria. // Biochim Biophys Acta 1967. V. 135. P. 362-364. 16. Quintero O. A., Cheney R. E. Myo19 is a novel unconventional myosin that localizes to mitochondria. // Mol Biol Cell 2004. V. 15 (S). P. 843. 17. Ritz C., Streibig J. C. Bioassay Analysis using R. // J. Statist. Software 2005. V. 12. P. 18. Adam-Vizi V., Chinopoulos C. Bioenergetics and the formation of mitochondrial reactive oxygen species. // Trends Pharmacol Sci 2006. V. 27. P. 639-645. 19. Allen R., Egan B., Gabriel K., Beilharz T., Lithgow T. A conserved proline residue is present in the transmembrane-spanning domain of Tom7 and other tailanchored protein subunits of the TOM translocase. // FEBS Lett 2002. V. 514. P. 347-350. 20. Altschafl B. A., Beutner G., Sharma V. K., Sheu S. S., Valdivia H. H. The mitochondrial ryanodine receptor in rat heart: a pharmaco-kinetic profile. // Biochim Biophys Acta 2007. V. 1768. P. 1784-1795. 21. Amano M., Ito M., Kimura K., Fukata Y., Chihara K., Nakano T., Matsuura Y., Kaibuchi K. Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase). // J Biol Chem 1996. V. 271. P. 20246-20249. 22. Angelides K. J., Smith K. E., Takeda M. Assembly and exchange of intermediate filament proteins of neurons: neurofilaments are dynamic structures. // J Cell Biol 1989. V. 108. P. 1495-1506. 117 23. Appaix F., Kuznetsov A. V., Usson Y., Kay L., Andrienko T., Olivares J., Kaambre T., Sikk P., Margreiter R., Saks V. Possible role of cytoskeleton in intracellular arrangement and regulation of mitochondria. // Exp Physiol 2003. V. 88. P. 175-190. 24. Arias-Romero L. E., Chernoff J. A tale of two Paks. // Biol Cell 2008. V. 100. P. 97-108. 25. Aw T. Y., Andersson B. S., Jones D. P. Mitochondrial transmembrane ion distribution during anoxia. // Am J Physiol 1987. V. 252. P. C356-361. 26. Bae Y. S., Kang S. W., Seo M. S., Baines I. C., Tekle E., Chock P. B., Rhee S. G. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. // J Biol Chem 1997. V. 272. P. 217-221. 27. Ball E. H., Singer S. J. Mitochondria are associated with microtubules and not with intermediate filaments in cultured fibroblasts. // Proc Natl Acad Sci U S A 1982. V. 79. P. 123-126. 28. Balogh J., Li Z., Paulin D., Arner A. Desmin filaments influence myofilament spacing and lateral compliance of slow skeletal muscle fibers. // Biophys J 2005. V. 88. P. 1156-1165. 29. Barrett W. C., DeGnore J. P., Keng Y. F., Zhang Z. Y., Yim M. B., Chock P. B. Roles of superoxide radical anion in signal transduction mediated by reversible regulation of protein-tyrosine phosphatase 1B. // J Biol Chem 1999. V. 274. P. 34543-34546. 30. Becker T., Pfannschmidt S., Guiard B., Stojanovski D., Milenkovic D., Kutik S., Pfanner N., Meisinger C., Wiedemann N. Biogenesis of the mitochondrial TOM complex: Mim1 promotes insertion and assembly of signal-anchored receptors. // J Biol Chem 2008. V. 283. P. 120-127. 31. Behrend L., Henderson G., Zwacka R. M. Reactive oxygen species in oncogenic transformation. // Biochem Soc Trans 2003. V. 31. P. 1441-1444. 32. Berridge M. J., Lipp P., Bootman M. D. The versatility and universality of calcium signalling. // Nat Rev Mol Cell Biol 2000. V. 1. P. 11-21. 118 33. Berry E. A., Guergova-Kuras M., Huang L. S., Crofts A. R. Structure and function of cytochrome bc complexes. // Annu Rev Biochem 2000. V. 69. P. 1005-1075. 34. Beutner G., Sharma V. K., Lin L., Ryu S. Y., Dirksen R. T., Sheu S. S. Type 1 ryanodine receptor in cardiac mitochondria: transducer of excitation-metabolism coupling. // Biochim Biophys Acta 2005. V. 1717. P. 1-10. 35. Bishop A. L., Hall A. Rho GTPases and their effector proteins. // Biochem J 2000. V. 348 Pt 2. P. 241-255. 36. Bokoch G. M. Biology of the p21-activated kinases. // Annu Rev Biochem 2003. V. 72. P. 743-781. 37. Bolter B., Soll J. Ion channels in the outer membranes of chloroplasts and mitochondria: open doors or regulated gates? // EMBO J 2001. V. 20. P. 935-940. 38. Bonifas J. M., Rothman A. L., Epstein E. H., Jr. Epidermolysis bullosa simplex: evidence in two families for keratin gene abnormalities. // Science 1991. V. 254. P. 1202-1205. 39. Bosco E. E., Mulloy J. C., Zheng Y. Rac1 GTPase: a "Rac" of all trades. // Cell Mol Life Sci 2009. V. 66. P. 370-374. 40. Boyer P. D. The ATP synthase--a splendid molecular machine. // Annu Rev Biochem 1997. V. 66. P. 717-749. 41. Brand M. D. The efficiency and plasticity of mitochondrial energy transduction. // Biochem Soc Trans 2005. V. 33. P. 897-904. 42. Briggs W. R., Christie J. M. Phototropins 1 and 2: versatile plant blue-light receptors. // Trends Plant Sci 2002. V. 7. P. 204-210. 43. Brix J., Dietmeier K., Pfanner N. Differential recognition of preproteins by the purified cytosolic domains of the mitochondrial import receptors Tom20, Tom22, and Tom70. // J Biol Chem 1997. V. 272. P. 20730-20735. 44. Brown A. Slow axonal transport: stop and go traffic in the axon. // Nat Rev Mol Cell Biol 2000. V. 1. P. 153-156. 45. Brownlees J., Ackerley S., Grierson A. J., Jacobsen N. J., Shea K., Anderton B. H., Leigh P. N., Shaw C. E., Miller C. C. Charcot-Marie-Tooth disease neurofilament 119 mutations disrupt neurofilament assembly and axonal transport. // Hum Mol Genet 2002. V. 11. P. 2837-2844. 46. Buchsbaum R. J. Rho activation at a glance. // J Cell Sci 2007. V. 120. P. 11491152. 47. Buchwald G., Hostinova E., Rudolph M. G., Kraemer A., Sickmann A., Meyer H. E., Scheffzek K., Wittinghofer A. Conformational switch and role of phosphorylation in PAK activation. // Mol Cell Biol 2001. V. 21. P. 5179-5189. 48. Caulin C., Ware C. F., Magin T. M., Oshima R. G. Keratin-dependent, epithelial resistance to tumor necrosis factor-induced apoptosis. // J Cell Biol 2000. V. 149. P. 17-22. 49. Chada S. R., Hollenbeck P. J. Mitochondrial movement and positioning in axons: the role of growth factor signaling. // J Exp Biol 2003. V. 206. P. 1985-1992. 50. Chada S. R., Hollenbeck P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. // Curr Biol 2004. V. 14. P. 1272-1276. 51. Chen Z. X., Pervaiz S. Bcl-2 induces pro-oxidant state by engaging mitochondrial respiration in tumor cells. // Cell Death Differ 2007. V. 14. P. 1617-1627. 52. Chernoivanenko I. S., Matveeva E. A., Gelfand V. I., Goldman R. D., Minin A. A. Mitochondrial membrane potential is regulated by vimentin intermediate filaments. // FASEB J 2015. V. 29. P. 820-827. 53. Chinopoulos C., Adam-Vizi V. Mitochondria deficient in complex I activity are depolarized by hydrogen peroxide in nerve terminals: relevance to Parkinson's disease. // J Neurochem 2001. V. 76. P. 302-306. 54. Chong C., Tan L., Lim L., Manser E. The mechanism of PAK activation. Autophosphorylation events in both regulatory and kinase domains control activity. // J Biol Chem 2001. V. 276. P. 17347-17353. 55. Collins T. J., Berridge M. J., Lipp P., Bootman M. D. Mitochondria are morphologically and functionally heterogeneous within cells. // EMBO J 2002. V. 21. P. 1616-1627. 56. Colombini M. Purification of VDAC (voltage-dependent anion-selective channel) from rat liver mitochondria. // J Membr Biol 1983. V. 74. P. 115-121. 120 57. Cook T. A., Nagasaki T., Gundersen G. G. Rho guanosine triphosphatase mediates the selective stabilization of microtubules induced by lysophosphatidic acid. // J Cell Biol 1998. V. 141. P. 175-185. 58. Crompton M., Kunzi M., Carafoli E. The calcium-induced and sodium-induced effluxes of calcium from heart mitochondria. Evidence for a sodium-calcium carrier. // Eur J Biochem 1977. V. 79. P. 549-558. 59. Csordas G., Thomas A. P., Hajnoczky G. Quasi-synaptic calcium signal transmission between endoplasmic reticulum and mitochondria. // EMBO J 1999. V. 18. P. 96-108. 60. Czeizler E., Mizera A., Back R. J., Eriksson J. E., Petre I. Quantitative analysis of the self-assembly strategies of intermediate filaments from tetrameric vimentin. // IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform 2012. V. 9. P. 885-898. 61. de Jong D., Prins F. A., Mason D. Y., Reed J. C., van Ommen G. B., Kluin P. M. Subcellular localization of the bcl-2 protein in malignant and normal lymphoid cells. // Cancer Res 1994. V. 54. P. 256-260. 62. De Vos K. J., Sable J., Miller K. E., Sheetz M. P. Expression of phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate-specific pleckstrin homology domains alters direction but not the level of axonal transport of mitochondria. // Mol Biol Cell 2003. V. 14. P. 3636-3649. 63. Dinauer M. C. Regulation of neutrophil function by Rac GTPases. // Curr Opin Hematol 2003. V. 10. P. 8-15. 64. Duchen M. R. Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology. // Mol Aspects Med 2004. V. 25. P. 365-451. 65. Dudek J., Rehling P., van der Laan M. Mitochondrial protein import: common principles and physiological networks. // Biochim Biophys Acta 2013. V. 1833. P. 274-285. 66. Dummler B., Ohshiro K., Kumar R., Field J. Pak protein kinases and their role in cancer. // Cancer Metastasis Rev 2009. V. 28. P. 51-63. 121 67. Eckert B. S. Alteration of the distribution of intermediate filaments in PtK1 cells by acrylamide. II: Effect on the organization of cytoplasmic organelles. // Cell Motil Cytoskeleton 1986. V. 6. P. 15-24. 68. Ernster L., Lee I., Norling B., Persson B. Studies with ubiquinone-depleted submitochondrial particles. // FEBS Lett 1969. V. 3. P. 21-26. 69. Ernster L., Schatz G. Mitochondria: a historical review. // J Cell Biol 1981. V. 91. P. 227s-255s. 70. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology. // Nature 2002. V. 420. P. 629-635. 71. Feig L. A. Tools of the trade: use of dominant-inhibitory mutants of Ras-family GTPases. // Nat Cell Biol 1999. V. 1. P. E25-27. 72. Filippin L., Magalhaes P. J., Di Benedetto G., Colella M., Pozzan T. Stable interactions between mitochondria and endoplasmic reticulum allow rapid accumulation of calcium in a subpopulation of mitochondria. // J Biol Chem 2003. V. 278. P. 39224-39234. 73. Finkel T. Signal transduction by mitochondrial oxidants. // J Biol Chem 2012. V. 287. P. 4434-4440. 74. Fuchs E., Weber K. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. // Annu Rev Biochem 1994. V. 63. P. 345-382. 75. Gao Y., Sztul E. A novel interaction of the Golgi complex with the vimentin intermediate filament cytoskeleton. // J Cell Biol 2001. V. 152. P. 877-894. 76. Geisler N., Schunemann J., Weber K. Chemical cross-linking indicates a staggered and antiparallel protofilament of desmin intermediate filaments and characterizes one higher-level complex between protofilaments. // Eur J Biochem 1992. V. 206. P. 841-852. 77. Gidding C. E., Kellie S. J., Kamps W. A., de Graaf S. S. Vincristine revisited. // Crit Rev Oncol Hematol 1999. V. 29. P. 267-287. 78. Gilleron M., Marechal X., Montaigne D., Franczak J., Neviere R., Lancel S. NADPH oxidases participate to doxorubicin-induced cardiac myocyte apoptosis. // Biochem Biophys Res Commun 2009. V. 388. P. 727-731. 122 79. Gilles C., Polette M., Zahm J. M., Tournier J. M., Volders L., Foidart J. M., Birembaut P. Vimentin contributes to human mammary epithelial cell migration. // J Cell Sci 1999. V. 112 ( Pt 24). P. 4615-4625. 80. Gincel D., Zaid H., Shoshan-Barmatz V. Calcium binding and translocation by the voltage-dependent anion channel: a possible regulatory mechanism in mitochondrial function. // Biochem J 2001. V. 358. P. 147-155. 81. Gohara R., Tang D., Inada H., Inagaki M., Takasaki Y., Ando S. Phosphorylation of vimentin head domain inhibits interaction with the carboxyl-terminal end of alpha-helical rod domain studied by surface plasmon resonance measurements. // FEBS Lett 2001. V. 489. P. 182-186. 82. Goldman R. D., Grin B., Mendez M. G., Kuczmarski E. R. Intermediate filaments: versatile building blocks of cell structure. // Curr Opin Cell Biol 2008. V. 20. P. 28-34. 83. Goldstein L. S., Gunawardena S. Flying through the drosophila cytoskeletal genome. // J Cell Biol 2000. V. 150. P. F63-68. 84. Goto H., Tanabe K., Manser E., Lim L., Yasui Y., Inagaki M. Phosphorylation and reorganization of vimentin by p21-activated kinase (PAK). // Genes Cells 2002. V. 7. P. 91-97. 85. Goto H., Yasui Y., Kawajiri A., Nigg E. A., Terada Y., Tatsuka M., Nagata K., Inagaki M. Aurora-B regulates the cleavage furrow-specific vimentin phosphorylation in the cytokinetic process. // J Biol Chem 2003. V. 278. P. 85268530. 86. Granados-Principal S., Quiles J. L., Ramirez-Tortosa C. L., Sanchez-Rovira P., Ramirez-Tortosa M. C. New advances in molecular mechanisms and the prevention of adriamycin toxicity by antioxidant nutrients. // Food Chem Toxicol 2010. V. 48. P. 1425-1438. 87. Groemping Y., Rittinger K. Activation and assembly of the NADPH oxidase: a structural perspective. // Biochem J 2005. V. 386. P. 401-416. 123 88. Gunter T. E., Chace J. H., Puskin J. S., Gunter K. K. Mechanism of sodium independent calcium efflux from rat liver mitochondria. // Biochemistry 1983. V. 22. P. 6341-6351. 89. Gunter T. E., Pfeiffer D. R. Mechanisms by which mitochondria transport calcium. // Am J Physiol 1990. V. 258. P. C755-786. 90. Gunter T. E., Yule D. I., Gunter K. K., Eliseev R. A., Salter J. D. Calcium and mitochondria. // FEBS Lett 2004. V. 567. P. 96-102. 91. Guo D., Zhang J. J., Huang X. Y. A new Rac/PAK/GC/cGMP signaling pathway. // Mol Cell Biochem 2010. V. 334. P. 99-103. 92. Gyoeva F. K., Gelfand V. I. Coalignment of vimentin intermediate filaments with microtubules depends on kinesin. // Nature 1991. V. 353. P. 445-448. 93. Hajnoczky G., Csordas G., Das S., Garcia-Perez C., Saotome M., Sinha Roy S., Yi M. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. // Cell Calcium 2006. V. 40. P. 553-560. 94. Hall A., Nobes C. D. Rho GTPases: molecular switches that control the organization and dynamics of the actin cytoskeleton. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2000. V. 355. P. 965-970. 95. Hanlon D. W., Yang Z., Goldstein L. S. Characterization of KIFC2, a neuronal kinesin superfamily member in mouse. // Neuron 1997. V. 18. P. 439-451. 96. Hannun Y. A. Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy. // Blood 1997. V. 89. P. 1845-1853. 97. Harper S. M., Neil L. C., Gardner K. H. Structural basis of a phototropin light switch. // Science 2003. V. 301. P. 1541-1544. 98. Helfand B. T., Chang L., Goldman R. D. Intermediate filaments are dynamic and motile elements of cellular architecture. // J Cell Sci 2004. V. 117. P. 133-141. 99. Helfand B. T., Mikami A., Vallee R. B., Goldman R. D. A requirement for cytoplasmic dynein and dynactin in intermediate filament network assembly and organization. // J Cell Biol 2002. V. 157. P. 795-806. 124 100. Hendrix M. J., Seftor E. A., Chu Y. W., Trevor K. T., Seftor R. E. Role of intermediate filaments in migration, invasion and metastasis. // Cancer Metastasis Rev 1996. V. 15. P. 507-525. 101. Herrmann H., Aebi U. Intermediate filaments and their associates: multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. // Curr Opin Cell Biol 2000. V. 12. P. 79-90. 102. Herrmann H., Aebi U. Intermediate filaments: molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular Scaffolds. // Annu Rev Biochem 2004. V. 73. P. 749-789. 103. Herrmann H., Bar H., Kreplak L., Strelkov S. V., Aebi U. Intermediate filaments: from cell architecture to nanomechanics. // Nat Rev Mol Cell Biol 2007. V. 8. P. 562-573. 104. Herrmann H., Haner M., Brettel M., Muller S. A., Goldie K. N., Fedtke B., Lustig A., Franke W. W., Aebi U. Structure and assembly properties of the intermediate filament protein vimentin: the role of its head, rod and tail domains. // J Mol Biol 1996. V. 264. P. 933-953. 105. Herrmann H., Hofmann I., Franke W. W. Identification of a nonapeptide motif in the vimentin head domain involved in intermediate filament assembly. // J Mol Biol 1992. V. 223. P. 637-650. 106. Herrmann H., Strelkov S. V., Burkhard P., Aebi U. Intermediate filaments: primary determinants of cell architecture and plasticity. // J Clin Invest 2009. V. 119. P. 1772-1783. 107. Hill K., Model K., Ryan M. T., Dietmeier K., Martin F., Wagner R., Pfanner N. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins [see comment]. // Nature 1998. V. 395. P. 516-521. 108. Hocevar B. A., Burns D. J., Fields A. P. Identification of protein kinase C (PKC) phosphorylation sites on human lamin B. Potential role of PKC in nuclear lamina structural dynamics. // J Biol Chem 1993. V. 268. P. 7545-7552. 109. Hollenbeck P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. // Front Biosci 1996. V. 1. P. d91-102. 125 110. Holt I. J., He J., Mao C. C., Boyd-Kirkup J. D., Martinsson P., Sembongi H., Reyes A., Spelbrink J. N. Mammalian mitochondrial nucleoids: organizing an independently minded genome. // Mitochondrion 2007. V. 7. P. 311-321. 111. Holwell T. A., Schweitzer S. C., Evans R. M. Tetracycline regulated expression of vimentin in fibroblasts derived from vimentin null mice. // J Cell Sci 1997. V. 110 ( Pt 16). P. 1947-1956. 112. Hoppe U. C. Mitochondrial calcium channels. // FEBS Lett 2010. V. 584. P. 1975-1981. 113. Huertas J. R., Battino M., Mataix F. J., Lenaz G. Cytochrome oxidase induction after oxidative stress induced by adriamycin in liver of rats fed with dietary olive oil. // Biochem Biophys Res Commun 1991. V. 181. P. 375-382. 114. Inagaki M., Nishi Y., Nishizawa K., Matsuyama M., Sato C. Site-specific phosphorylation induces disassembly of vimentin filaments in vitro. // Nature 1987. V. 328. P. 649-652. 115. Ishiguro K., Kadomatsu K., Kojima T., Muramatsu H., Tsuzuki S., Nakamura E., Kusugami K., Saito H., Muramatsu T. Syndecan-4 deficiency impairs focal adhesion formation only under restricted conditions. // J Biol Chem 2000. V. 275. P. 5249-5252. 116. Ishizaki T., Naito M., Fujisawa K., Maekawa M., Watanabe N., Saito Y., Narumiya S. p160ROCK, a Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, works downstream of Rho and induces focal adhesions. // FEBS Lett 1997. V. 404. P. 118-124. 117. Izawa I., Inagaki M. Regulatory mechanisms and functions of intermediate filaments: a study using site- and phosphorylation state-specific antibodies. // Cancer Sci 2006. V. 97. P. 167-174. 118. Jaffer Z. M., Chernoff J. p21-activated kinases: three more join the Pak. // Int J Biochem Cell Biol 2002. V. 34. P. 713-717. 119. Jones D. P., Go Y. M. Redox compartmentalization and cellular stress. // Diabetes Obes Metab 2010. V. 12 Suppl 2. P. 116-125. 126 120. Joneson T., McDonough M., Bar-Sagi D., Van Aelst L. RAC regulation of actin polymerization and proliferation by a pathway distinct from Jun kinase. // Science 1996. V. 274. P. 1374-1376. 121. Jouaville L. S., Pinton P., Bastianutto C., Rutter G. A., Rizzuto R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. // Proc Natl Acad Sci U S A 1999. V. 96. P. 13807-13812. 122. Juin P., Geneste O., Gautier F., Depil S., Campone M. Decoding and unlocking the BCL-2 dependency of cancer cells. // Nat Rev Cancer 2013. V. 13. P. 455465. 123. Jung D. W., Baysal K., Brierley G. P. The sodium-calcium antiport of heart mitochondria is not electroneutral. // J Biol Chem 1995. V. 270. P. 672-678. 124. King C. C., Gardiner E. M., Zenke F. T., Bohl B. P., Newton A. C., Hemmings B. A., Bokoch G. M. p21-activated kinase (PAK1) is phosphorylated and activated by 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1). // J Biol Chem 2000. V. 275. P. 41201-41209. 125. Kirichok Y., Krapivinsky G., Clapham D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. // Nature 2004. V. 427. P. 360-364. 126. Kirmse R., Portet S., Mucke N., Aebi U., Herrmann H., Langowski J. A quantitative kinetic model for the in vitro assembly of intermediate filaments from tetrameric vimentin. // J Biol Chem 2007. V. 282. P. 18563-18572. 127. Klaunig J. E., Kamendulis L. M. The role of oxidative stress in carcinogenesis. // Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004. V. 44. P. 239-267. 128. Koch M. H., Vachette P., Svergun D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. // Q Rev Biophys 2003. V. 36. P. 147-227. 129. Koga H., Terasawa H., Nunoi H., Takeshige K., Inagaki F., Sumimoto H. Tetratricopeptide repeat (TPR) motifs of p67(phox) participate in interaction with the small GTPase Rac and activation of the phagocyte NADPH oxidase. // J Biol Chem 1999. V. 274. P. 25051-25060. 127 130. Koh C. G., Tan E. J., Manser E., Lim L. The p21-activated kinase PAK is negatively regulated by POPX1 and POPX2, a pair of serine/threonine phosphatases of the PP2C family. // Curr Biol 2002. V. 12. P. 317-321. 131. Koopman W. J., Distelmaier F., Esseling J. J., Smeitink J. A., Willems P. H. Computer-assisted live cell analysis of mitochondrial membrane potential, morphology and calcium handling. // Methods 2008. V. 46. P. 304-311. 132. Kosako H., Goto H., Yanagida M., Matsuzawa K., Fujita M., Tomono Y., Okigaki T., Odai H., Kaibuchi K., Inagaki M. Specific accumulation of Rhoassociated kinase at the cleavage furrow during cytokinesis: cleavage furrowspecific phosphorylation of intermediate filaments. // Oncogene 1999. V. 18. P. 2783-2788. 133. Krebs H. A., Johnson W. A. Metabolism of ketonic acids in animal tissues. // Biochem J 1937. V. 31. P. 645-660. 134. Krendel M., Sgourdas G., Bonder E. M. Disassembly of actin filaments leads to increased rate and frequency of mitochondrial movement along microtubules. // Cell Motil Cytoskeleton 1998. V. 40. P. 368-378. 135. Ku N. O., Liao J., Chou C. F., Omary M. B. Implications of intermediate filament protein phosphorylation. // Cancer Metastasis Rev 1996. V. 15. P. 429-444. 136. Kumar A., Molli P. R., Pakala S. B., Bui Nguyen T. M., Rayala S. K., Kumar R. PAK thread from amoeba to mammals. // J Cell Biochem 2009. V. 107. P. 579585. 137. Kumar N., Robidoux J., Daniel K. W., Guzman G., Floering L. M., Collins S. Requirement of vimentin filament assembly for beta3-adrenergic receptor activation of ERK MAP kinase and lipolysis. // J Biol Chem 2007. V. 282. P. 9244-9250. 138. Kung A. L., Zetterberg A., Sherwood S. W., Schimke R. T. Cytotoxic effects of cell cycle phase specific agents: result of cell cycle perturbation. // Cancer Res 1990. V. 50. P. 7307-7317. 139. Lamb N. J., Fernandez A., Feramisco J. R., Welch W. J. Modulation of vimentin containing intermediate filament distribution and phosphorylation in living 128 fibroblasts by the cAMP-dependent protein kinase. // J Cell Biol 1989. V. 108. P. 2409-2422. 140. Langford G. M. Myosin-V, a versatile motor for short-range vesicle transport. // Traffic 2002. V. 3. P. 859-865. 141. Lee S. R., Kwon K. S., Kim S. R., Rhee S. G. Reversible inactivation of proteintyrosine phosphatase 1B in A431 cells stimulated with epidermal growth factor. // J Biol Chem 1998. V. 273. P. 15366-15372. 142. Lemeshko V. V. Model of the outer membrane potential generation by the inner membrane of mitochondria. // Biophys J 2002. V. 82. P. 684-692. 143. Letai A., Coulombe P. A., Fuchs E. Do the ends justify the mean? Proline mutations at the ends of the keratin coiled-coil rod segment are more disruptive than internal mutations. // J Cell Biol 1992. V. 116. P. 1181-1195. 144. Leterrier J. F., Rusakov D. A., Nelson B. D., Linden M. Interactions between brain mitochondria and cytoskeleton: evidence for specialized outer membrane domains involved in the association of cytoskeleton-associated proteins to mitochondria in situ and in vitro. // Microsc Res Tech 1994. V. 27. P. 233-261. 145. Li Q. F., Spinelli A. M., Wang R., Anfinogenova Y., Singer H. A., Tang D. D. Critical role of vimentin phosphorylation at Ser-56 by p21-activated kinase in vimentin cytoskeleton signaling. // J Biol Chem 2006. V. 281. P. 34716-34724. 146. Liao J., Ku N. O., Omary M. B. Two-dimensional gel analysis of glandular keratin intermediate filament phosphorylation. // Electrophoresis 1996. V. 17. P. 1671-1676. 147. Lightcap C. M., Kari G., Arias-Romero L. E., Chernoff J., Rodeck U., Williams J. C. Interaction with LC8 is required for Pak1 nuclear import and is indispensable for zebrafish development. // PLoS One 2009. V. 4. P. e6025. 148. Ligon L. A., Steward O. Role of microtubules and actin filaments in the movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons. // J Comp Neurol 2000. V. 427. P. 351-361. 129 149. Liu J., Mao W., Ding B., Liang C. S. ERKs/p53 signal transduction pathway is involved in doxorubicin-induced apoptosis in H9c2 cells and cardiomyocytes. // Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008. V. 295. P. H1956-1965. 150. Lobert S., Vulevic B., Correia J. J. Interaction of vinca alkaloids with tubulin: a comparison of vinblastine, vincristine, and vinorelbine. // Biochemistry 1996. V. 35. P. 6806-6814. 151. Lopez L. A., Sheetz M. P. A microtubule-associated protein (MAP2) kinase restores microtubule motility in embryonic brain. // J Biol Chem 1995. V. 270. P. 12511-12517. 152. Machesky L. M., Insall R. H. Scar1 and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex. // Curr Biol 1998. V. 8. P. 1347-1356. 153. Maekawa M., Ishizaki T., Boku S., Watanabe N., Fujita A., Iwamatsu A., Obinata T., Ohashi K., Mizuno K., Narumiya S. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. // Science 1999. V. 285. P. 895-898. 154. Manser E., Leung T., Salihuddin H., Zhao Z. S., Lim L. A brain serine/threonine protein kinase activated by Cdc42 and Rac1. // Nature 1994. V. 367. P. 40-46. 155. Marques-Santos L. F., Oliveira J. G., Maia R. C., Rumjanek V. M. Mitotracker green is a P-glycoprotein substrate. // Biosci Rep 2003. V. 23. P. 199-212. 156. McCormack J. G., Halestrap A. P., Denton R. M. Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. // Physiol Rev 1990. V. 70. P. 391-425. 157. McInroy L., Maatta A. Down-regulation of vimentin expression inhibits carcinoma cell migration and adhesion. // Biochem Biophys Res Commun 2007. V. 360. P. 109-114. 158. Meier T., Polzer P., Diederichs K., Welte W., Dimroth P. Structure of the rotor ring of F-Type Na+-ATPase from Ilyobacter tartaricus. // Science 2005. V. 308. P. 659-662. 130 159. Mendez M. G., Kojima S., Goldman R. D. Vimentin induces changes in cell shape, motility, and adhesion during the epithelial to mesenchymal transition. // FASEB J 2010. V. 24. P. 1838-1851. 160. Meng J. J., Khan S., Ip W. Charge interactions in the rod domain drive formation of tetramers during intermediate filament assembly. // J Biol Chem 1994. V. 269. P. 18679-18685. 161. Meriane M., Mary S., Comunale F., Vignal E., Fort P., Gauthier-Rouviere C. Cdc42Hs and Rac1 GTPases induce the collapse of the vimentin intermediate filament network. // J Biol Chem 2000. V. 275. P. 33046-33052. 162. Michels G., Khan I. F., Endres-Becker J., Rottlaender D., Herzig S., Ruhparwar A., Wahlers T., Hoppe U. C. Regulation of the human cardiac mitochondrial Ca2+ uptake by 2 different voltage-gated Ca2+ channels. // Circulation 2009. V. 119. P. 2435-2443. 163. Milner D. J., Mavroidis M., Weisleder N., Capetanaki Y. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. // J Cell Biol 2000. V. 150. P. 1283-1298. 164. Ming W., Li S., Billadeau D. D., Quilliam L. A., Dinauer M. C. The Rac effector p67phox regulates phagocyte NADPH oxidase by stimulating Vav1 guanine nucleotide exchange activity. // Mol Cell Biol 2007. V. 27. P. 312-323. 165. Minin A. A., Kulik A. V., Gyoeva F. K., Li Y., Goshima G., Gelfand V. I. Regulation of mitochondria distribution by RhoA and formins. // J Cell Sci 2006. V. 119. P. 659-670. 166. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. // Pharmacol Rev 2004. V. 56. P. 185-229. 167. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. // Nature 1961. V. 191. P. 144-148. 168. Moissoglu K., Slepchenko B. M., Meller N., Horwitz A. F., Schwartz M. A. In vivo dynamics of Rac-membrane interactions. // Mol Biol Cell 2006. V. 17. P. 2770-2779. 131 169. Molli P. R., Li D. Q., Murray B. W., Rayala S. K., Kumar R. PAK signaling in oncogenesis. // Oncogene 2009. V. 28. P. 2545-2555. 170. Morris R. L., Hollenbeck P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. // J Cell Sci 1993. V. 104 ( Pt 3). P. 917-927. 171. Morris R. L., Hollenbeck P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. // J Cell Biol 1995. V. 131. P. 1315-1326. 172. Nangaku M., Sato-Yoshitake R., Okada Y., Noda Y., Takemura R., Yamazaki H., Hirokawa N. KIF1B, a novel microtubule plus end-directed monomeric motor protein for transport of mitochondria. // Cell 1994. V. 79. P. 1209-1220. 173. Nekrasova O. E., Mendez M. G., Chernoivanenko I. S., Tyurin-Kuzmin P. A., Kuczmarski E. R., Gelfand V. I., Goldman R. D., Minin A. A. Vimentin intermediate filaments modulate the motility of mitochondria. // Mol Biol Cell 2011. V. 22. P. 2282-2289. 174. Nicholls D. G. The physiological regulation of uncoupling proteins. // Biochim Biophys Acta 2006. V. 1757. P. 459-466. 175. Ogawara M., Inagaki N., Tsujimura K., Takai Y., Sekimata M., Ha M. H., Imajoh-Ohmi S., Hirai S., Ohno S., Sugiura H., et al. Differential targeting of protein kinase C and CaM kinase II signalings to vimentin. // J Cell Biol 1995. V. 131. P. 1055-1066. 176. Olson G. E., Winfrey V. P. Identification of a cytoskeletal network adherent to the mitochondria of mammalian spermatozoa. // J Ultrastruct Mol Struct Res 1986. V. 94. P. 131-139. 177. Ott M., Zhivotovsky B., Orrenius S. Role of cardiolipin in cytochrome c release from mitochondria. // Cell Death Differ 2007. V. 14. P. 1243-1247. 178. Pacheco A., Chernoff J. Group I p21-activated kinases: emerging roles in immune function and viral pathogenesis. // Int J Biochem Cell Biol 2010. V. 42. P. 13-16. 132 179. Pachter J. S., Liem R. K. alpha-Internexin, a 66-kD intermediate filament-binding protein from mammalian central nervous tissues. // J Cell Biol 1985. V. 101. P. 1316-1322. 180. Palade G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. // J Histochem Cytochem 1953. V. 1. P. 188-211. 181. Palazzo A. F., Joseph H. L., Chen Y. J., Dujardin D. L., Alberts A. S., Pfister K. K., Vallee R. B., Gundersen G. G. Cdc42, dynein, and dynactin regulate MTOC reorientation independent of Rho-regulated microtubule stabilization. // Curr Biol 2001. V. 11. P. 1536-1541. 182. Panda D., Jordan M. A., Chu K. C., Wilson L. Differential effects of vinblastine on polymerization and dynamics at opposite microtubule ends. // J Biol Chem 1996. V. 271. P. 29807-29812. 183. Pilling A. D., Horiuchi D., Lively C. M., Saxton W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. // Mol Biol Cell 2006. V. 17. P. 2057-2068. 184. Puto L. A., Pestonjamasp K., King C. C., Bokoch G. M. p21-activated kinase 1 (PAK1) interacts with the Grb2 adapter protein to couple to growth factor signaling. // J Biol Chem 2003. V. 278. P. 9388-9393. 185. Qin Z., Kreplak L., Buehler M. J. Hierarchical structure controls nanomechanical properties of vimentin intermediate filaments. // PLoS One 2009. V. 4. P. e7294. 186. Quiles J. L., Huertas J. R., Battino M., Mataix J., Ramirez-Tortosa M. C. Antioxidant nutrients and adriamycin toxicity. // Toxicology 2002. V. 180. P. 7995. 187. Rapaport D. Finding the right organelle. Targeting signals in mitochondrial outermembrane proteins. // EMBO Rep 2003. V. 4. P. 948-952. 188. Rehling P., Model K., Brandner K., Kovermann P., Sickmann A., Meyer H. E., Kuhlbrandt W., Wagner R., Truscott K. N., Pfanner N. Protein insertion into the mitochondrial inner membrane by a twin-pore translocase. // Science 2003. V. 299. P. 1747-1751. 133 189. Reipert S., Steinbock F., Fischer I., Bittner R. E., Zeold A., Wiche G. Association of mitochondria with plectin and desmin intermediate filaments in striated muscle. // Exp Cell Res 1999. V. 252. P. 479-491. 190. Ridley A. J. Rho: theme and variations. // Curr Biol 1996. V. 6. P. 1256-1264. 191. Rittinger K., Walker P. A., Eccleston J. F., Nurmahomed K., Owen D., Laue E., Gamblin S. J., Smerdon S. J. Crystal structure of a small G protein in complex with the GTPase-activating protein rhoGAP. // Nature 1997. V. 388. P. 693-697. 192. Rizzuto R., Bernardi P., Pozzan T. Mitochondria as all-round players of the calcium game. // J Physiol 2000. V. 529 Pt 1. P. 37-47. 193. Rizzuto R., Pinton P., Carrington W., Fay F. S., Fogarty K. E., Lifshitz L. M., Tuft R. A., Pozzan T. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. // Science 1998. V. 280. P. 17631766. 194. Robinson M. S. Adaptable adaptors for coated vesicles. // Trends Cell Biol 2004. V. 14. P. 167-174. 195. Roy S., Coffee P., Smith G., Liem R. K., Brady S. T., Black M. M. Neurofilaments are transported rapidly but intermittently in axons: implications for slow axonal transport. // J Neurosci 2000. V. 20. P. 6849-6861. 196. Rudel T., Schmid A., Benz R., Kolb H. A., Lang F., Meyer T. F. Modulation of Neisseria porin (PorB) by cytosolic ATP/GTP of target cells: parallels between pathogen accommodation and mitochondrial endosymbiosis. // Cell 1996. V. 85. P. 391-402. 197. Salnikov V., Lukyanenko Y. O., Lederer W. J., Lukyanenko V. Distribution of ryanodine receptors in rat ventricular myocytes. // J Muscle Res Cell Motil 2009. V. 30. P. 161-170. 198. Sanders L. C., Matsumura F., Bokoch G. M., de Lanerolle P. Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase. // Science 1999. V. 283. P. 2083-2085. 199. Sarfstein R., Gorzalczany Y., Mizrahi A., Berdichevsky Y., Molshanski-Mor S., Weinbaum C., Hirshberg M., Dagher M. C., Pick E. Dual role of Rac in the assembly of NADPH oxidase, tethering to the membrane and activation of 134 p67phox: a study based on mutagenesis of p67phox-Rac1 chimeras. // J Biol Chem 2004. V. 279. P. 16007-16016. 200. Sarria A. J., Lieber J. G., Nordeen S. K., Evans R. M. The presence or absence of a vimentin-type intermediate filament network affects the shape of the nucleus in human SW-13 cells. // J Cell Sci 1994. V. 107 ( Pt 6). P. 1593-1607. 201. Sazanov L. A. Respiratory complex I: mechanistic and structural insights provided by the crystal structure of the hydrophilic domain. // Biochemistry 2007. V. 46. P. 2275-2288. 202. Schmidt A., Hall A. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch. // Genes Dev 2002. V. 16. P. 1587-1609. 203. Shimizu S., Narita M., Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. // Nature 1999. V. 399. P. 483-487. 204. Shoeman R. L., Hartig R., Berthel M., Traub P. Deletion mutagenesis of the amino-terminal head domain of vimentin reveals dispensability of large internal regions for intermediate filament assembly and stability. // Exp Cell Res 2002. V. 279. P. 344-353. 205. Shoeman R. L., Hartig R., Traub P. Characterization of the nucleic acid binding region of the intermediate filament protein vimentin by fluorescence polarization. // Biochemistry 1999. V. 38. P. 16802-16809. 206. Sickmann A., Reinders J., Wagner Y., Joppich C., Zahedi R., Meyer H. E., Schonfisch B., Perschil I., Chacinska A., Guiard B., Rehling P., Pfanner N., Meisinger C. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. // Proc Natl Acad Sci U S A 2003. V. 100. P. 13207-13212. 207. Sideris D. P., Petrakis N., Katrakili N., Mikropoulou D., Gallo A., Ciofi-Baffoni S., Banci L., Bertini I., Tokatlidis K. A novel intermembrane space-targeting signal docks cysteines onto Mia40 during mitochondrial oxidative folding. // J Cell Biol 2009. V. 187. P. 1007-1022. 208. Smets I., Caplanusi A., Despa S., Molnar Z., Radu M., VandeVen M., Ameloot M., Steels P. Ca2+ uptake in mitochondria occurs via the reverse action of the 135 Na+/Ca2+ exchanger in metabolically inhibited MDCK cells. // Am J Physiol Renal Physiol 2004. V. 286. P. F784-794. 209. Sokolova A. V., Kreplak L., Wedig T., Mucke N., Svergun D. I., Herrmann H., Aebi U., Strelkov S. V. Monitoring intermediate filament assembly by smallangle x-ray scattering reveals the molecular architecture of assembly intermediates. // Proc Natl Acad Sci U S A 2006. V. 103. P. 16206-16211. 210. Song J., Midson C., Blachly-Dyson E., Forte M., Colombini M. The sensor regions of VDAC are translocated from within the membrane to the surface during the gating processes. // Biophys J 1998. V. 74. P. 2926-2944. 211. Starkov A. A., Fiskum G. Regulation of brain mitochondrial H2O2 production by membrane potential and NAD(P)H redox state. // J Neurochem 2003. V. 86. P. 1101-1107. 212. Starkov A. A., Fiskum G., Chinopoulos C., Lorenzo B. J., Browne S. E., Patel M. S., Beal M. F. Mitochondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex generates reactive oxygen species. // J Neurosci 2004. V. 24. P. 7779-7788. 213. Steinert P. M., Marekov L. N., Fraser R. D., Parry D. A. Keratin intermediate filament structure. Crosslinking studies yield quantitative information on molecular dimensions and mechanism of assembly. // J Mol Biol 1993. V. 230. P. 436-452. 214. Steinert P. M., Marekov L. N., Parry D. A. Diversity of intermediate filament structure. Evidence that the alignment of coiled-coil molecules in vimentin is different from that in keratin intermediate filaments. // J Biol Chem 1993. V. 268. P. 24916-24925. 215. Stock D., Gibbons C., Arechaga I., Leslie A. G., Walker J. E. The rotary mechanism of ATP synthase. // Curr Opin Struct Biol 2000. V. 10. P. 672-679. 216. Strelkov S. V., Kreplak L., Herrmann H., Aebi U. Intermediate filament protein structure determination. // Methods Cell Biol 2004. V. 78. P. 25-43. 217. Styers M. L., Kowalczyk A. P., Faundez V. Intermediate filaments and vesicular membrane traffic: the odd couple's first dance? // Traffic 2005. V. 6. P. 359-365. 136 218. Styers M. L., Salazar G., Love R., Peden A. A., Kowalczyk A. P., Faundez V. The endo-lysosomal sorting machinery interacts with the intermediate filament cytoskeleton. // Mol Biol Cell 2004. V. 15. P. 5369-5382. 219. Sundaresan M., Yu Z. X., Ferrans V. J., Irani K., Finkel T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. // Science 1995. V. 270. P. 296-299. 220. Suzuki T., Nakamoto T., Ogawa S., Seo S., Matsumura T., Tachibana K., Morimoto C., Hirai H. MICAL, a novel CasL interacting molecule, associates with vimentin. // J Biol Chem 2002. V. 277. P. 14933-14941. 221. Svergun D. I., Koch M. H. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. // Curr Opin Struct Biol 2002. V. 12. P. 654-660. 222. Takai Y., Ogawara M., Tomono Y., Moritoh C., Imajoh-Ohmi S., Tsutsumi O., Taketani Y., Inagaki M. Mitosis-specific phosphorylation of vimentin by protein kinase C coupled with reorganization of intracellular membranes. // J Cell Biol 1996. V. 133. P. 141-149. 223. Tan W., Colombini M. VDAC closure increases calcium ion flux. // Biochim Biophys Acta 2007. V. 1768. P. 2510-2515. 224. Tanaka Y., Kanai Y., Okada Y., Nonaka S., Takeda S., Harada A., Hirokawa N. Targeted disruption of mouse conventional kinesin heavy chain, kif5B, results in abnormal perinuclear clustering of mitochondria. // Cell 1998. V. 93. P. 11471158. 225. Tang D. D., Bai Y., Gunst S. J. Silencing of p21-activated kinase attenuates vimentin phosphorylation on Ser-56 and reorientation of the vimentin network during stimulation of smooth muscle cells by 5-hydroxytryptamine. // Biochem J 2005. V. 388. P. 773-783. 226. Tang H. L., Lung H. L., Wu K. C., Le A. H., Tang H. M., Fung M. C. Vimentin supports mitochondrial morphology and organization. // Biochem J 2008. V. 410. P. 141-146. 227. Taylor S. W., Fahy E., Zhang B., Glenn G. M., Warnock D. E., Wiley S., Murphy A. N., Gaucher S. P., Capaldi R. A., Gibson B. W., Ghosh S. S. Characterization 137 of the human heart mitochondrial proteome. // Nat Biotechnol 2003. V. 21. P. 281-286. 228. Territo P. R., Mootha V. K., French S. A., Balaban R. S. Ca(2+) activation of heart mitochondrial oxidative phosphorylation: role of the F(0)/F(1)-ATPase. // Am J Physiol Cell Physiol 2000. V. 278. P. C423-435. 229. Toivola D. M., Tao G. Z., Habtezion A., Liao J., Omary M. B. Cellular integrity plus: organelle-related and protein-targeting functions of intermediate filaments. // Trends Cell Biol 2005. V. 15. P. 608-617. 230. Tolias K. F., Hartwig J. H., Ishihara H., Shibasaki Y., Cantley L. C., Carpenter C. L. Type Ialpha phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase mediates Racdependent actin assembly. // Curr Biol 2000. V. 10. P. 153-156. 231. Tolstonog G. V., Belichenko-Weitzmann I. V., Lu J. P., Hartig R., Shoeman R. L., Traub U., Traub P. Spontaneously immortalized mouse embryo fibroblasts: growth behavior of wild-type and vimentin-deficient cells in relation to mitochondrial structure and activity. // DNA Cell Biol 2005. V. 24. P. 680-709. 232. Tolstonog G. V., Shoeman R. L., Traub U., Traub P. Role of the intermediate filament protein vimentin in delaying senescence and in the spontaneous immortalization of mouse embryo fibroblasts. // DNA Cell Biol 2001. V. 20. P. 509-529. 233. Traub P., Scherbarth A., Wiegers W., Shoeman R. L. Salt-stable interaction of the amino-terminal head region of vimentin with the alpha-helical rod domain of cytoplasmic intermediate filament proteins and its relevance to protofilament structure and filament formation and stability. // J Cell Sci 1992. V. 101 ( Pt 2). P. 363-381. 234. Tretter L., Adam-Vizi V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. // J Neurosci 2004. V. 24. P. 7771-7778. 235. Trinczek B., Ebneth A., Mandelkow E. M., Mandelkow E. Tau regulates the attachment/detachment but not the speed of motors in microtubule-dependent 138 transport of single vesicles and organelles. // J Cell Sci 1999. V. 112 ( Pt 14). P. 2355-2367. 236. Tsujimura K., Ogawara M., Takeuchi Y., Imajoh-Ohmi S., Ha M. H., Inagaki M. Visualization and function of vimentin phosphorylation by cdc2 kinase during mitosis. // J Biol Chem 1994. V. 269. P. 31097-31106. 237. Tsukihara T., Aoyama H., Yamashita E., Tomizaki T., Yamaguchi H., ShinzawaItoh K., Nakashima R., Yaono R., Yoshikawa S. The whole structure of the 13subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A. // Science 1996. V. 272. P. 11361144. 238. Vadlamudi R. K., Kumar R. p21-activated kinase 1: an emerging therapeutic target. // Cancer Treat Res 2004. V. 119. P. 77-88. 239. Valgeirsdottir S., Claesson-Welsh L., Bongcam-Rudloff E., Hellman U., Westermark B., Heldin C. H. PDGF induces reorganization of vimentin filaments. // J Cell Sci 1998. V. 111 ( Pt 14). P. 1973-1980. 240. Van Aelst L., D'Souza-Schorey C. Rho GTPases and signaling networks. // Genes Dev 1997. V. 11. P. 2295-2322. 241. Vander Heiden M. G., Chandel N. S., Li X. X., Schumacker P. T., Colombini M., Thompson C. B. Outer mitochondrial membrane permeability can regulate coupled respiration and cell survival. // Proc Natl Acad Sci U S A 2000. V. 97. P. 4666-4671. 242. Vander Heiden M. G., Chandel N. S., Schumacker P. T., Thompson C. B. Bcl-xL prevents cell death following growth factor withdrawal by facilitating mitochondrial ATP/ADP exchange. // Mol Cell 1999. V. 3. P. 159-167. 243. Vasington F. D., Murphy J. V. Ca ion uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. // J Biol Chem 1962. V. 237. P. 2670-2677. 244. Vianello A., Casolo V., Petrussa E., Peresson C., Patui S., Bertolini A., Passamonti S., Braidot E., Zancani M. The mitochondrial permeability transition pore (PTP) - an example of multiple molecular exaptation? // Biochim Biophys Acta 2012. V. 1817. P. 2072-2086. 139 245. Vogtle F. N., Wortelkamp S., Zahedi R. P., Becker D., Leidhold C., Gevaert K., Kellermann J., Voos W., Sickmann A., Pfanner N., Meisinger C. Global analysis of the mitochondrial N-proteome identifies a processing peptidase critical for protein stability. // Cell 2009. V. 139. P. 428-439. 246. Vousden K. H., Lu X. Live or let die: the cell's response to p53. // Nat Rev Cancer 2002. V. 2. P. 594-604. 247. Wagner O. I., Lifshitz J., Janmey P. A., Linden M., McIntosh T. K., Leterrier J. F. Mechanisms of mitochondria-neurofilament interactions. // J Neurosci 2003. V. 23. P. 9046-9058. 248. Wallace D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. // Science 1999. V. 283. P. 1482-1488. 249. Wang Q., Shoeman R., Traub P. Identification of the amino acid residues of the amino terminus of vimentin responsible for DNA binding by enzymatic and chemical sequencing and analysis by MALDI-TOF. // Biochemistry 2000. V. 39. P. 6645-6651. 250. Wasserman S. FH proteins as cytoskeletal organizers. // Trends Cell Biol 1998. V. 8. P. 111-115. 251. Watanabe N., Kato T., Fujita A., Ishizaki T., Narumiya S. Cooperation between mDia1 and ROCK in Rho-induced actin reorganization. // Nat Cell Biol 1999. V. 1. P. 136-143. 252. Weber J. ATP synthase--the structure of the stator stalk. // Trends Biochem Sci 2007. V. 32. P. 53-56. 253. Wei J., Xu G., Wu M., Zhang Y., Li Q., Liu P., Zhu T., Song A., Zhao L., Han Z., Chen G., Wang S., Meng L., Zhou J., Lu Y., Ma D. Overexpression of vimentin contributes to prostate cancer invasion and metastasis via src regulation. // Anticancer Res 2008. V. 28. P. 327-334. 254. Werner E., Werb Z. Integrins engage mitochondrial function for signal transduction by a mechanism dependent on Rho GTPases. // J Cell Biol 2002. V. 158. P. 357-368. 140 255. Wiedemann N., Kozjak V., Chacinska A., Schonfisch B., Rospert S., Ryan M. T., Pfanner N., Meisinger C. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. // Nature 2003. V. 424. P. 565-571. 256. Wikstrom M., Verkhovsky M. I. Towards the mechanism of proton pumping by the haem-copper oxidases. // Biochim Biophys Acta 2006. V. 1757. P. 10471051. 257. Wittmann T., Bokoch G. M., Waterman-Storer C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. // J Cell Biol 2003. V. 161. P. 845-851. 258. Worman H. J., Courvalin J. C. The nuclear lamina and inherited disease. // Trends Cell Biol 2002. V. 12. P. 591-598. 259. Wu Y. I., Frey D., Lungu O. I., Jaehrig A., Schlichting I., Kuhlman B., Hahn K. M. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. // Nature 2009. V. 461. P. 104-108. 260. Yang Z., Roberts E. A., Goldstein L. S. Functional analysis of mouse C-terminal kinesin motor KifC2. // Mol Cell Biol 2001. V. 21. P. 2463-2466. 261. Yi M., Weaver D., Hajnoczky G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. // J Cell Biol 2004. V. 167. P. 661-672. 262. Yoon M., Moir R. D., Prahlad V., Goldman R. D. Motile properties of vimentin intermediate filament networks in living cells. // J Cell Biol 1998. V. 143. P. 147157. 263. Zhao Z. S., Manser E., Chen X. Q., Chong C., Leung T., Lim L. A conserved negative regulatory region in alphaPAK: inhibition of PAK kinases reveals their morphological roles downstream of Cdc42 and Rac1. // Mol Cell Biol 1998. V. 18. P. 2153-2163. 264. Zizi M., Forte M., Blachly-Dyson E., Colombini M. NADH regulates the gating of VDAC, the mitochondrial outer membrane channel. // J Biol Chem 1994. V. 269. P. 1614-1616.
