СлизиСтая оболочка полоСти рта – новый иСточник получения

76
Оригинальные исследования
Слизистая оболочка полости рта – новый источник
получения миобластов
В.Л. Зорин 1, 2, И.И. Еремин 2, В.А. Рыбко 3, А.И. Зорина 1, К.В. Котенко 2,
А.А. Пулин 2, П.Б. Копнин 1, 3
1
Институт стволовых клеток человека, Москва, Россия
2
Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна ФМБА России,
Москва, Россия
3
Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина, Москва, Россия
Oral mucosais a new source for myoblast derivation
V.L. Zorin 1, 2, I.I. Eremin 2, V.A. Rybko 3, A.I. Zorina 1, K.V. Kotenko 2, A.A. Pulin 2, P.B. Kopnin 1, 3
1
Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia
2
A. I. Burnazyan Federal Medical Biophysical Center FMBA of Russia, Moscow, Russia
3
N. N. Blokhin Cancer Research Center, Moscow, Russia
В ведущих лабораториях мира ведутся интенсивные
исследования тканеспецифичных стволовых клеток. Основная цель этих исследований – разработка более совершенных методов, направленных на восстановление тканей.
Актуальной задачей таких исследований является оптимизация условий индукции дифференцировки и поиск новых
источников клеток. В качестве источника клеточного материала представляется весьма перспективным использование слизистой оболочки полости рта (десны) человека.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки
десны (ММСКд) обладают рядом особенностей, среди которых следует отметить высокую пролиферативную активность и способность к мультилинейной дифференцировке.
Однако миогенная дифференцировка ММСКд еще не была
показана.
Исследование проведено на 10 культурах ММСКд, полученных из биоптатов десны 10 здоровых добровольцев.
продемонстрирована возможность получения ММСКд с
высоким пролиферативным потенциалом, а также способность этих клеток к эффективной дифференцировке в ортодоксальных (адипо-, хондро- остеогенном) направлениях
и, впервые, в миогенном направлении как на ранних, так и
на поздних пассажах.
Полученные нами результаты обосновывают преимущества использования ММСКд в регенеративной медицине, в
частности, для лечения заболеваний мышечной ткани различной этиологии.
Ключевые слова: десна, регенеративная медицина,
мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки десны, мультилинейная дифференцировка, миогенная
дифференцировка.
По мере старения, а также при ряде врожденных
и (или) приобретенных заболеваний в скелетной
мускулатуре нарушаются процессы естественной
регенерации мышечной ткани [1], что сопровождается формированием патологических состояний,
таких как мышечные дистрофии, нейромышечные заболевания, саркопения и другие миопатии
[2]. Стандартные подходы к лечению многих выше
перечисленных заболеваний в большинстве случаев неэффективны, что приводит к инвалидизации
и в конечном итоге – к летальному исходу [3].
В связи с этим, одним из интенсивно развивающихся направлений современной тканевой инженерии является разработка медицинских технологий
на основе клеток, обладающих высоким миогенным
потенциалом, для лечения повреждений мышечной
ткани любого генеза, включая травмы [4]. В норме
поврежденные мышечные волокна восстанавливаются за счет сателлитных клеток (СК), располагае-mail: zorin@hsci. ru
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
Leading laboratories in the world intensively research
tissue-specific stem cells. The main goal of such work is
development of improved technique of tissue regeneration
stimulation. Optimization of conditions of differentiation
induction, and search for new sources of cells are actual
problems in this field of science. Human gingival mucosa is
one of promising sources of cells. Gingival mucosa-derived
multipotent mesenchymal stromal cells (gm MMSC) have a
number of features, notably the high proliferative activity and
ability to multilineage differentiation. However, their myogenic
differentiation has not been proofed yet.
The study was conducted on 10 gm MMSC cultures
obtained from gingival mucosa biopsy samples of 10 healthy
volunteers. Possibility of gm MMSC obtainment with high
proliferative potential and ability of cells to efficiently
differentiate not only into orthodox (adipogenic, osteogenic,
chondrogenic) directions but also in myogenic direction during
both early and late passages was demonstrated for the first
time in our work.
Our results of gm MMSC investigation and characteristics
of the cell’ssource, confirm advantages of gm MMSC use in
regenerative medicine, in particular for the treatment of the
muscle tissue diseases of different etiology.
Key words: gingiva, regenerative medicine, gingival
mucosa-derived multipotent mesenchymal stromal cells,
multilineage differentiation, myogenic differentiation.
ющихся в нишах между сарколеммой и базальной
мембраной миофибрилл [5]. Однако СК являются
редкой и малочисленной клеточной популяцией скелетной мышечной ткани, выделение которой, а также экспансия in vitro сопряжены с существенными
трудностями [6]. По этой причине поиск доступных
источников клеток, обладающих высоким миогенным потенциалом, а также получение этих клеток
в необходимом для проведения терапии количестве
представляет собой одну из актуальных проблем
в данной области [7].
В настоящее время наиболее исследованным
и охарактеризованным типом клеток, используемым в регенеративной медицине, являются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки
(ММСК). ММСК описывают в литературе как субстрат-зависимые фибробластоподобные клетки,
обладающие клоногенными свойствами и способностью к самоподдержанию [8–10]. Они экспрес-
77
Оригинальные исследования
сируют определенный набор поверхностных маркеров, большинство которых общие с фибробластами
[11–13], обладают мультипотентностью и, при соответствующей индукции, способны дифференцироваться в трех ортодоксальных направлениях (остео-,
хондро- и адипогенном), а также при определенных
условиях – в эндотелиальном, миогенном, нейрогенном направлениях [8–11, 14, 15].
Основными источниками ММСК в постнатальном периоде являются костный мозг, жировая
ткань и другие соединительные ткани организма [8,
16]. При этом ММСК, выделенные из различных
типов тканей, могут значительно отличаться как
по эффективности дифференцировки и колониеобразования, так и по пролиферативному потенциалу, определяющему эффективность их экспансии
in vitro [17, 18].
При выборе источника ММСК для применения
клеточной терапии немаловажную роль играют его
характеристики, в частности доступность и степень
инвазивности получения образца ткани [19]. Так,
одним из легкодоступных источников получения
клеточного материала для проведения клеточной
терапии является слизистая оболочки полости рта
(десна). Биопсия десны малотравматична и сопровождается незначительным дискомфортом для пациента, раневой дефект заживает без образования
рубца [20]. При этом известно, что выделенные из
десны ММСК (ММСКд) обладают рядом характеристик, делающих данные клетки весьма привлекательными для использования в регенеративной
медицине [21, 22]. В частности, ММСКд обладают
выраженными иммуномодулирующими свойствами
[22]. Благодаря своему происхождению из клеток
нейрального гребня [23], наряду с ортодоксальными направлениями, они способны дифференцироваться и в нейроны [23, 24]. Кроме того, по
данным ряда исследователей, количество ММСК,
способных к мультипотентной дифференцировке,
намного выше в слизистой оболочке полости рта по
сравнению с другими тканями [25–27]. Так, в первичных культурах фибробластов десны до 90% клеток характеризуется типичными маркерами ММСК
и 40–70% экспрессируют гены плюрипотентности
Oct4, Sox2 и Nanog [25], а также активную теломеразу [26].
В данной работе впервые показана способность
ММСКд дифференцироваться в миогенном направлении, что представляет особый интерес для регенеративной медицины, в частности, для лечения патологии мышечной ткани.
Материал и методы
Биопсия. После подписания здоровыми донорами (n = 10, женщины и мужчины, средний возраст
36±2 лет) добровольного информированного согласия, в условиях хирургического стоматологического
кабинета с соблюдением правил асептики под местным проводниковым обезболиванием раствором
Ультракаина 40 мг/мл (1,7 мл) выполнялась биопсия
слизистой оболочки полости рта в ретромолярной
области. Биоптаты диаметром 2–3 мм помещали
в стерильные пробирки (BD Falcon, США) с транспортировочной питательной средой: α-MEM (Sigma,
США), 2% FBS (HyClone, США), 200 ед. /мл пенициллина, 200 мг/мл стрептомицина, 200 ед. /мл
амфотерицина (Stem Cell Technologies, США) – мар-
кировали и доставляли в течение 2 ч при температуре +4°С в лабораторию.
Выделение и культивирование ММСКд. В условиях лабораторно-производственного комплекса
(cтандарт GMP) биоптат десны промывали в питательной среде α-MEM (Sigma, США), дополненной
антибиотиком (гентамицин, 50 мкг/мл, Sigma, США).
Фрагмент переносили в пробирку объемом 15 мл с
питательной средой α-MEM с 10% FBS (HyClone,
США), 20 мкг/мл гентамицина, 0,05% раствором
коллагеназы II типа (Sigma, США) и инкубировали
в течение 12 ч при температуре 37°С. Полученную
суспензию клеток пипетировали с последующим
центрифугированием при 200 g в течение 10 мин.
Клеточный осадок ресуспендировали в питательной
среде DMEM/F12 (HyClone, США), содержащей гентамицин 20 мкг/мл, 20% FBS (HyClone, США), и
рассевали с плотностью 3–5×104кл./см2 в культуральные флаконы (NUNC, США). ММСКд культивировали при 37°С и 5% СО2, смену среды проводили каждые 3–4 сут., культуры пассировали при
достижении ими 50% конфлюэнтности монослоя.
Визуальный контроль роста и морфологии культур
проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для исследований использовали клеточные
культуры 1–10 пассажей.
Определение времени удвоения клеточных культур. ММСКд рассевали в культуральные флаконы
с плотностью 1×104 клеток/cм2 и культивировали до
формирования 90% монослоя. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Время удвоения популяции
р
(Т 1/2 ) на 1, 2 и 3 пассажах оценивали по формуле:
р
(Т 1/2 ) = Tк × ln (2) / ln (Nк / N0),
р
где (Т 1/2 ) – время удвоения клеточной популяции
на пассаже p; Тк – длительность культивирования
пассажа в часах; N0 – исходное количество клеток;
Nк – число клеток через Тк. В качестве оценочного
параметра использовали среднее арифметическое
от полученных на трех пассажах значение – T1/2:
6
Т1/2 =Σ = Т 1/2 / 3.
р
р=4
Иммунофенотипический анализ ММСКд. Полученные клеточные культуры высевали на покровные
стекла и через 2 сут. проводили иммунофлуоресцентный анализ. Экспрессию белков, характерных
для клеток мезенхимного ряда, коллагена I, III типов, эластина и виментина – определяли, используя первичные моноклональные антитела и вторичные, меченые Alexa488 (Life Technologies, США).
Клетки визуализировали посредством микроскопа
Axioplan 200 с камерой AxiocamтмHRm, используя
программное обеспечение AxioVision (Carl Zeiss,
Германия).
Для цитофлуориметрического анализа суспензию
клеток фиксировали 1% раствором параформальдегида на фосфатно-солевом буфере (pH = 7,4) и
применяли флуоресцентные антитела к CD34, CD45,
CD73, CD90, CD324, цитокератинам 14, 15, 16, 19
(BDPharmingen, США), CD105 (Life Technologies,
США), согласно рекомендациям производителей.
Экспрессию α-гладкомышечного актина (α-SMA)
оценивали с использованием первичных моноклональных антител к α-SMA человека (DAKO, США) и
вторичных, меченых флуоресцеином (FITC) антител
(Life Technologies, США). Экспрессию антигенов опрегены & клетки Том IX, № 3, 2014
78
Оригинальные исследования
деляли на цитофлуориметре FACS Cantoтм II c программным обеспечением «FACSDivaтм» (BD, США).
Индукция остеогенной дифференцировки. Для
индукции остеогенной дифференцировки использовали набор «Human mesenchymal stem cell functional
identification kit» (R&D Systems, США). Согласно
протоколу производителя, клетки высевали с плотностью 4×103/см2 и культивировали до достижения
ими конфлуэнтного монослоя. Затем среду культивирования заменяли на α-MEM (Sigma, США) с содержанием 10% FBS (HyClone, США). В среду также
добавляли компоненты, индуцирующие остеогенную
дифференцировку: 10 нМ дексаметазона, 10 мМ
β-глицерофосфата и 0,2 мМ аскорбиновой кислоты.
Экспрессию синтезируемого клетками остеокальцина (маркера остеогенной дифференцировки) выявляли иммуноцитохимическим методом, используя в
качестве первичных – моноклональные антитела к
остеокальцину человека (R&D Systems, США), вторичных – антитела, меченые флуоресцеином (FITC)
(Life Technologies, США). Для визуализации ядер использовали краситель DAPI (Sigma, США). Анализ
проводили на микроскопе Axioplan 200 с камерой
AxiocamHRc, используя программное обеспечение
AxioVision (Carl Zeiss, Германия).
Индукция адипогенной дифференцировки. Для
индукции адипогенной дифференцировки использовали набор «Human Mesenchymal Stem Cell Functional
Identification Kit» (R&D Systems, США). Согласно
протоколу производителя, клетки высевали на покровные стекла по 5×103/см2 и культивировали в
течение 3 нед. в среде DMEM c содержанием 10%
FBS (HyClone, США). В среду также добавляли компоненты, индуцирующие адипогенную дифференцировку: 1 мкM дексаметазона, 5 мкM 3-изобутил1-метилксантина, 5 мкг/мл инсулина и 50 мкM
индометацина. Индукционную среду меняли два раза
в неделю. По окончании индукции клетки фиксировали 4% параформальдегидом, проводили пермеабилизацию мембран 0,3% раствором TritonX100
(Sigma, США) и блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом
буфере (Sigma, США) в течение 60 мин. при 37°С.
Экспрессию адипоцитарного белка FABP4 определяли
иммуноцитохимическим методом, используя в качестве первичных – моноклональные антитела к FABP4
человека (R&D Systems, США), вторичных – антитела, меченые FITC (Life Technologies, США). Для визуализации ядер использовали краситель DAPI (Sigma,
США). Анализ проводили с помощью микроскопа
Axioplan 2, камеры Axiocam HRc и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия)
Индукция хондрогенной дифференцировки. Для
индукции хондрогенной дифференцировки использовали набор реактивов «Human Mesenchymal Stem
Cell Functional Identification Kit» (R&D Systems,
США). Клетки в количестве 2×105 /20 мкл помещали в центр покровного стекла на 30 мин для полной
клеточной адгезии. После этого добавляли среду
DMEM/F12, 10% FBS (HyClone, США) со следующими индуцирующими хондрогенез компонентами:
10 нг/мл трансформирующего фактора роста-β3
(TGF-β3), 10 нМ дексаметазона, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 40 мкг/мл пролина, 100 мкг/мл
пирувата, 6,25 мкг/мл инсулина, 6,25 мкг/мл трансферрина, 6,25 нг/мл селенита натрия. Индукционную
среду меняли 3 раза в неделю. По окончании культивирования клетки фиксировали 4% параформальдегены & клетки Том IX, № 3, 2014
гидом, проводили пермеабилизацию мембран 0,3%
раствором TritonX100 (Sigma, США) и блокировали
1% раствором бычьего сывороточного альбумина в
фосфатно-солевом буфере (Sigma, США) в течение
60 мин при 37°С. Экспрессию аггрекана (агрегирующий протеогликан, показатель хондрогенной дифференцировки) определяли иммуноцитохимическим
методом. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к аггрекану человека
(R&D Systems, США), вторичных – антитела, меченые FITC (Life Technologies, США). Для визуализации
ядер использовали краситель DAPI (Sigma, США).
Анализ проводили помощью микроскопа Axioplan 2,
камеры Axiocam HRc и программного обеспечения
AxioVision (Carl Zeiss, Германия).
Активация миофибробластов. Для активации
ММСКд и конверсии их в миофибробласты клетки
рассевали с плотностью 5×104/см2 в среде DMEM
(HyClone, США) с добавлением трансформирующего
фактора роста-β1 (TGF-β1) (PeproTech, США) в концентрации 2–20 мкг/мл. Анализ TGB-β1-индуцированных
миофибробластов проводили после 3 сут. инкубации. Для этого культуры инкубировали с первичными
мышиными антителами, специфичными к α-SMA человека (DAKO, США), с последующим окрашиванием вторичными антителами кролика против мыши,
мечеными FITC (LifeTechnologies, США).
Индукция миогенной дифференцировки. Для индукции миогенной дифференцировки клетки рассевали с высокой плотностью 5×105/см2, культивировали в среде DMEM/F12, 20% FBS (HyClone, США)
до 90–100% конфлюэнтного монослоя, затем среду
заменяли на DMEM с низким содержанием глюкозы
(HyClone, США) с добавлением 2% лошадиной сыворотки (BioInd, Израиль) и инкубировали при 37°С
и 5% СО2 до появления миотубоподобных структур.
Оценка эффективности миогенной дифференцировки. Для оценки эффективности индукции
миогенной дифференцировки клетки, посеянные
на предметные стекла, фиксировали 4% параформальдегидом. Затем культуры инкубировали с первичными мышиными антителами, специфичными к
человеческому скелетному миозину (AbD Serotec,
Великобритания), актину (Thermo Scientific, США)
и ядерному фосфопротеину MyoD1 (DAKO, США),
индуцирующему миогенез, с последующим окрашиванием вторичными антителами кролика, мечеными
FITC (Life Technologies, США). Проводили съемку изображений при помощи микроскопа Axioplan 2, камеры
Axiocam HRc и программного обеспечения AxioVision
(Carl Zeiss, Германия). Далее, используя программу
ImageJ (National Institutes of Health, США), выделяли и измеряли процент специфически окрашенной
площади на снимках по отношению ко всему полю.
Для каждого случая было проанализировано по 25
независимых полей зрения и даны усредненные значения для всех пациентов.
Cтатистический анализ. Все эксперименты проводили в трех повторах для каждой из 10 культур.
Для статистической обработки полученных данных
применяли описательные методы (определение среднего значения, стандартного отклонения), критерий
Шапиро – Уилка для выявления соответствия распределения признаков закону нормального распределения, а также U-критерий Манна – Уитни для сравнения
двух независимых групп при статистической значимости различий p<0,05, используя программное обеспечение Graph Pad Prism 5.0 (Graph Pad Software).
79
Оригинальные исследования
Результаты
Пролиферативная активность. Все исследованные культуры ММСКд, независимо от пассажа, были
статистически неразличимы по времени удвоения,
которое, в частности, составило 36±1,2 ч на первом
и 38±1,2 ч на десятом пассажах (рис. 1А).
Характеристика иммунофенотипа. Клетки культур
ММСКд с 1 по 10 пассажи имели сходную фибробластоподобную морфологию (рис. 1А, Б), а также
профиль экспрессии основных белков и поверхностных антигенов, свойственных для мезенхимных
клеток (рис. 1В). Так, по данным проточной цитофлуориметрии, все ММСКд характеризовались наличием маркеров ММСК (CD73, CD90, CD105) и
экспрессией внутриклеточных белков фибробластов (коллаген I и III типов, эластин, виментин).
При этом не отмечена экспрессия эпителиальных
(CD324, цитокератины 14, 15, 16, 19) и гемопоэтических (CD31, CD34, CD45) маркеров.
Остео-, адипо-, хондрогенная дифференцировка.
При культивировании 10 образцов ММСКд, полученных от разных доноров, в культуральной среде
с соответствующими индукционными факторами
установлено, что клетки сохраняли способность к
остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировке вплоть до 8 пассажа. Полученные результаты
подтверждены иммуноцитохимическим исследовани-
ем (рис. 2): выявлена экспрессия специфических для
остеобластов, адипоцитов и хондроцитов маркеров
(остеокальцина, FABP4, аггрекана соответственно).
Активация миофибробластов. В дополнение
к трем описанным выше направлениям дифференцировки во всех культурах ММСКд при воздействии
хемокина TGF-β1 наблюдался эффект активации клеток и экспрессия в них α-SMA (рис. 3, 4). Такие активированные миофибробласты меняли морфологию,
часто увеличивались в размерах, а в актиновой сети
появлялись ярко выраженные стресс-фибриллы.
(рис. 3Б, В). Установлено, что степень активации
миофибробластов зависела от концентрации TGF-β1
(рис. 4).
Индукция миогенной дифференцировки in vitro.
При культивировании ММСКд в культуральной среде с миогенными факторами во всех исследуемых
клеточных культурах (1–10 пассажи) отмечено
формирование многоядерных миотуб (рис. 5А).
В контрольных культурах ММСКд (без добавления
индукционных миогенных факторов) данные структуры не определялись.
В вытянутых многоклеточных волокнах миотуб (рис.
5Б) выявлена экспрессия маркеров поперечно-полосатых мышц: MyoD1, скелетного миозина, скелетного
актина. При иммуноцитохимическом окрашивании скелетного актина в миотубах регистрировали характерную
поперечно-полосатую исчерченность (рис. 5Б).
А
В
Мезенхимальные маркеры
CD73 (5’-Nucleotidase, Ecto)
>95%
CD90 (Thy-1 cell Surface Antigen)
>95%
CD105 (Endoglin)
>95%
Collagen I
>95%
Collagen III
>95%
Elastin
>99%
Vimentin
>99%
P4HB (Prolyl 4-hydroxylase)
>99%
Гемопоэтические / эндотелиальные маркеры
Б
CD31 (Platelet/ Endothelial Cell Adhesion
Molecule)
<1%
CD34 (Hematopoietic Progenitor Cell Antigen)
<1%
CD45 (Lymphocyte Common Antigen)
<1%
Эпителиальные маркеры
CD324 (Epithelial Cadherin)
<0,5%
Cytokeratins 14-16, 19
<0,5%
Дифференцировочные маркеры
Рис. 1. Характеристика ММСКд:
А, Б – культуры ММСКд на 1 и 10 пассажах,
на гистограмме приведено время удвоения 1
и 10 пассажах;
В – иммунофенотип ММСКд на первом пассаже.
А – световая микроскопия;
Б – флуоресцентная микроскопия, окраска ядер
DAPI;
В – проточная цитофлуориметрия.
Бар – 100 мкм
Aggrecan
<1%
Osteocalcin
<1%
FABP4 (Fatty Acid Binding Protein 4)
<0,5%
α-SMA (α-Smooth Muscle Actin)
<2,5%
MyoD1 (Myogenic Differentiation 1)
<0,5%
Sk-myosin (Skeletal Myosin Heavy Chain)
<1%
Sk-actin (α-Skeletal Muscle Actin)
<2%
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
80
Оригинальные исследования
II
III
FABP4
Osteocalcin
Aggrecan
I
Рис. 2. Культуры ММСКд, дифференцированные в трех ортодоксальных направлениях после 6 пассажа:
А – хондрогенном; Б – остеогенном, В – адипогенном. I – экспрессия соответствующего маркера
дифференцировки; II – окраска ядер DAPI; III – совмещение I и II. Флуоресцентная микроскопия.
Бар – 20 мкм
А
Б
В
Рис. 3. Культура ММСКд: А – до индукции миофибробластогенеза; Б, В – после активации миофибробластов;
В – миофибробласт из зоны, отмеченной звездочкой, при большем увеличении.
Флуоресцентная микроскопия. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к α-SMA, окраска ядер DAPI.
Бар – 100 мкм.
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
81
Оригинальные исследования
1024
А
Б
35
30
events
25
20
IgG
control
15
10
0
5
100
101
102
103
104
0
Сontrol
1
5
10
20
mkg/ml mkg/ml mkg/ml mkg/ml
Рис. 4. Миофибробласты в культуре ММСКд после воздействия TGF-β1: А – количество клеток;
Б – доля миофибробластов в культуре в зависимости от концентрации TGF-β1. Проточная цитофлуориметрия
А
sk-actin
sk-myosin
myoD1
Б
I
II
III
Рис. 5. Миотубы в культуре ММСКд после индукции миогенной дифференцировки:
А – световая микроскопия; Б – флуоресцентная микроскопия, иммунофлуоресцентная реакция с антителами
к маркерам миогенной дифференцировки: I – экспрессия маркера; II – окраска ядер DAPI; III – совмещение I и II;
Бар – 20 мкм
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
82
Оригинальные исследования
Однократная индукция миогенной дифференцировки в культурах ММСКд на первом, пятом или
десятом пассажах вызывала формирование миотуб.
Эффективность дифференцировки при пассировании сохранялась: площадь, занимаемая миотубами,
составляла около 20% (рис. 6).
А
Б
30
25
20
15
10
5
0
1
5
10
30
25
20
15
10
5
0
1
5
10
30
25
20
15
10
5
0
1
5
10
Рис. 6. Культуры ММСКд, подвергнутые индукции
миогенной дифференцировки на 1, 5
и 10 пассажах:
А – внешний вид культур, бар – 200 мкм;
Б – доля клеток, экспрессирующих скелетный
актин, в зависимости от пассажа,
на котором проводилась индукция миогенной
дифференцировки
Обсуждение
Одной из актуальных задач регенеративной медицины является поиск и изучение клеточных популяций, способных активно пролиферировать и дифференцироваться в заданном направлении, с целью
последующего применения этих клеток в терапевтических целях. В частности, для лечения патологии
мышечной ткани перспективным считается применение популяций взрослых стволовых клеток, тканевой источник которых легкодоступен, а сами клетки
можно нарастить in vitro в достаточном для проведения терапии количестве. После трансплантации
данные клетки должны полноценно интегрироваться
в мышечную ткань с последующим обеспечением
функциональной коррекции патологии, включая дистрофический фенотип [28].
Одними из первых клеток, исследованных на
предмет возможности использования в лечении мышечных дистрофий [6], стали СК – миогенные клетки-предшественницы, расположенные между сарколеммой и базальной мембраной миофибрилл [29],
благодаря которым и происходит поддержание потенциала роста и регенерации взрослых скелетных
мышц. Большинство исследователей рассматривают
трансплантацию СК как идеальный метод для восстановления мышечной ткани [28, 30]. Однако при работе с СК возникает ряд ограничений: данные клетки
являются труднодоступной, редкой и малочисленной
клеточной популяцией скелетной мускулатуры, а после трансплантации in vivo происходит значительное
снижение их миогенного потенциала [1, 31–33].
В качестве альтернативного источника в настоящее время рассматриваются и другие клетки,
обладающие миогенным потенциалом [30]. Одними из перспективных клеток на эту роль являются
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
ММСК, выделенные из костного мозга или жировой
ткани. Показано, что данные клетки обладают способностью к миогенной дифференцировке [14, 30],
а в эксперименте, проведенном G. Ferrariс соавт.
(1998), выявлена их способность восстанавливать
поврежденные мышечные волокна [32]. Миогенный
потенциал ММСК костного мозга и жировой ткани
делает эту клеточную популяцию привлекательным
кандидатом для терапии при мышечных заболеваниях, однако следует учитывать, что процедура забора
образца костного мозга и липоаспирата достаточно
инвазивна и требует наличия специальных навыков
у хирурга, проводящего манипуляцию. Кроме того,
после забора биоматериала донору необходим период восстановления.
В настоящей работе представлен новый источник ММСК, способных к дифференцировке в миогенном направлении, – слизистая оболочка полости
рта (десна). Данный источник клеточного материала
является перспективным для применения в области
регенеративной медицины: слизистая оболочка полости рта легкодоступна, получение образца ткани
малотравматично, раневой дефект заживает быстро
и без образования рубца, требуется небольшой объем биоптата (2–3 мм3) для получения необходимого
количества клеток, а трудоспособность донора, подвергнутого процедуре, не снижается.
Исследование культур клеток, выделенных нами
из десны, продемонстрировало, что данные клетки соответствуют общепринятым критериям ММСК
[34]. Во-первых, при иммунофенотипическом анализе ММСКд установлено, что данные клетки обладают профилем экспрессии основных белков и
поверхностных антигенов, характерным для ММСК:
экспрессия CD73, CD90, CD105, внутриклеточных белков фибробластов (коллаген I и III типов,
эластин, виментин), отсутствие эпителиальных
(CD324, цитокератины 14, 15, 16, 19) и гемопоэтических (CD31, CD34, CD45) маркеров (см. рис. 1В).
Во-вторых, подтверждена способность ММСКд к
дифференцировке в трех ортодоксальных направлениях. При добавлении в культуральные среды
соответствующих индукционных факторов во всех
культурах ММСКд как на ранних, так и на поздних
пассажах показана экспрессия специфических для
остеобластов, адипоцитов и хондроцитов маркеров
(см. рис. 2). Также зарегистрирован высокий пролиферативный потенциал исследуемых клеточных
культур. Так, при культивировании в описанных условиях, время удвоения клеточных культур составило 36±1,2 ч на 1 и 38±1,2 ч на 10 пассажах
(cv/ рис. 1А). Следует отметить, что время удвоения
ММСК, выделенных из костного мозга, при аналогичных условиях составляет 55±3 ч [33]. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что
ММСКд обладают более высоким пролиферативным
потенциалом по сравнению с ММСК костного мозга.
Учитывая преимущества десны как источника клеточного материала, а также пролиферативный потенциал ММСКд, можно рассматривать данный тип
клеток в качестве более привлекательного кандидата для применения в регенеративной медицине,
включая лечение дегенеративных заболеваний
мышечной ткани.
Кроме трех канонических путей дифференцировки показана способность полученных нами
культур ММСКд к TGF-β1-зависимой экспрессии
α-SMA в части клеток и их «конверсии» в мио-
Оригинальные исследования
фибробласты. Добавление в культуральную среду
хемокина TGF-β1 приводило к образованию миофибробластов. Среднее количество миофибробластов напрямую зависело от концентрации TGF-β1
(см. рис. 4). Таким образом, полученная нами
первичная культура ММСКд обладала также способностью к дифференцировке в миофибробласты
в ответ на индукционные стимулы.
В результате миогенной индукции ММСКд in vitro
нами были получены многоядерные миотубы (см.
рис. 5А). При этом индукция миогенной дифференцировки сопровождалась экспрессией маркеров
поперечно-полосатой мышечной ткани: MyoD1, скелетных миозина и актина, которые локализовались
в удлиненных многоклеточных волокнах миотуб. При
иммунофлуоресцентном окрашивании скелетного
актина в миотубах четко выявлялась поперечнополосатая исчерченность (см. рис. 5). Следует отметить, что образование миотуб наблюдалось как на
ранних, так и на поздних пассажах культивирования
ММСКд, выделенных из всех 10 биоптатов (см. рис.
6А, Б, В). При этом эффективность дифференцировки, независимо от пассажа ММСКд, сохранялась
на одинаково высоком уровне, то есть даже на 10-м
пассаже площадь, занимаемая миотубами (индекс
слияния в миотубы) составляла около 20% (см.
рис. 6 А–В). Важно отметить, что такой же индекс
слияния (20%) выявили M. Dezawaс соавт. (2005)
при работе с «миогенной» субпопуляцией ММСК
костного мозга (Myo-D+, миогенин+), полученной
в специальных условиях с эффективностью миогенной дифференцировки 89% (для получения такой
высокой степени дифференцировки ММСК культи-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Meregalli М., Farini А., Sitziaand С. et al. Advancements in
stem cells treatment of skeletal muscle wasting. Front Physiol. 2014;
5 (48): 1–12.
2. McCullagh К., Perlingeiro R. Coaxing stem cells for skeletal
muscle repair. Adv. Drug Deliv. Rev. 2014; pii: S0169-409X (14)
00148–3 [Epub ahead of print].
3. Shi Х., Garry D. J. Muscle stem cells in development,
regeneration, and disease. Genes Dev. 2006; 20: 1692–708.
4. Cerletti M., Jurga S., Witczak C. A. et al. Highly efficient,
functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic
muscles. Cell 2008; 134: 37–47.
5. Carlson M.E., O’Connor M.S. Hsu M. et al. Notch signaling
pathway and tissue engineering. Front Biosci. 2007;12: 5143–56.
6. Farini A., Razini P., Erratico S. et al. Cell based therapy for
Duchenne muscular dystrophy. J. Cell Physiol. 2009; 221 (3):
526–34.
7. Dezawa M., Ishikawa H., Hoshino M. et al. Potential of bone
marrow stromal cells in applications for neuro-degenerative, neurotraumatic and muscle degenerative diseases. Curr. Neuropharmacol.
2005; 3 (4): 257–66.
8. Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К., Герасимов Ю. В. Пролиферативный и дифференцировочный потенциал скелетных костномозговых колониеформирующих клеток. Цитология 1986; 28 (3):
341–9.
9. Caplan A. I. Mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res. 1991;
9: 641-50.
10. Bianco P., Robey P. G., Simmons P. J. Mesenchymal stem
cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell 2008;
2: 313–19.
11. Hematti P. Mesenchymal stromal cells and fibroblasts: a case
of mistaken identity? Cytotherapy 2012; 14: 516–21.
12. Sorrell J. M., CaplanA. I. Fibroblast heterogeneity: more than
skin deep. J. Cell Sci. 2004; 117: 667-75.
13. Haniffa M. A., CollinM. P., Buckley C. D. et al. Mesenchymal
stem cells: the fibroblasts’ new clothes? Haematologica 2009;
94 (2): 258–63.
14. Zuk P. A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from
human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue
Eng. 2001;7 (2): 211–28.
83
вировали в среде, содержащей смесь цитокинов и
ростовых факторов с последующей трансфекцией
геном, кодирующим Notch 1 межклеточный домен)
[35]. Полученные данные могут свидетельствовать
о достаточно высоком миогенном дифференцировочном потенциале ММСКд, а также о способности
культур таких клеток к сохранению и длительному
поддержанию недифференцированных клеток-предшественниц, что обеспечивает возможность получения in vitro больших объемов клеточного материала
с заданными свойствами.
Заключение
Нами впервые показана принципиальная возможность индукции миогенной дифференцировки ММСК,
выделенных из слизистой оболочки полости рта.
Данные клетки характеризуются высокой пролиферативной активностью и способностью к мультипотентной дифференцировке как на ранних, так и на поздних пассажах. Полученные результаты исследования,
а также особенности тканевого источника клеток обосновывают преимущества использования ММСКд в
регенеративной медицине, в частности, для лечения
заболеваний мышечной ткани различной этиологии.
Благодарности
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда на проведение фундаментальных научных исследований и
поисковых научных исследований в 2014–2016 гг.
Соглашение № 14-25-00166.
15. Oswald J., Boxberger S., Jorgensen B. et al. Mesenchymal
stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem
Cells 2004;22 (3): 377–84.
16. Robey P.G. Cell sources for bone regeneration: the good,
the bad, and the ugly (but promising). Tissue Engin. 2011; 17 (6):
423–30.
17. Sekiya I., Larson B. L., Smith J. R. et al. Expansion of human
adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize
the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells
2002; 20 (6): 530–41.
18. Zorin V. L., Komlev V. S., Zorina A. I. et al. Octacalcium
phosphate ceramics combined with gingiva-derived stromal cells for
engineered functional bone grafts. Biomed. Mater. 2014; 9 (5):
055005.
19. Sakaguchi Y., Sekiya I., Yagishita K. et al. Comparison of
human stem cells derived from various mesenchymal tissues:
superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 2005;
52 (8): 2521–9.
20. Mitrano T. I., Grob M. S., Carrión F. et al. Culture and
characterization of mesenchymal stem cells from human gingival
tissue. J. Periodontol. 2010; 81 (6): 917–25.
21. Zhang Q. Z., Nguyen A. L., Yu W. H. et al. Human oral mucosa
and gingiva: a unique reservoir for mesenchymal stem cells. J. Dent.
Res. 2012; 91 (11): 1011–8.
22. Fournier B. P. J., Larjava H., Häkkinen L. Gingiva as a source
of stem cells with therapeutic potential. Stem Cells Dev. 2013; 22
(24): 3157–77.
23. Xu X., Chen C., Akiyama K. et. al. Gingivae contain neuralcrest- and mesoderm-derived mesenchymal stem cells. J. Dent. Res.
2013;92 (9): 825–32.
24. Marynka-Kalmani K., Treves S., Yafee M. et al. The lamina
propria of adult human oral mucosa harbors a novel stem cell
population. Stem Cells 2010; 28 (5): 984–95.
25. Treves-Manusevitz S., Hoz L., Rachima H. et al. Stem cells
of the lamina propria of human oral mucosa and gingiva develop
into mineralized tissues in vivo. J. Clin. Periodontol. 2013; (40):
73–81.
26. Tomar G. B., Srivastava R. K., Gupta N. et al. Human gingivaderived mesenchymal stem cells are superior to bone marrowderived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
84
Оригинальные исследования
medicine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 393 (3):
377–83.
27. Huang G. T, Gronthos S., Shi S. Mesenchymal stem cells
derived from dental tissues vs. those from other sources: their
biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 2009; 88 (9):
792–806.
28. Price F., Kuroda D., RudnickiM. A. Stem cell based therapies
to treat muscular dystrophy. Biochim. Biophys. Acta. 2007; 1772 (2):
272–83.
29. Mauro А. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J. Biophys.
Biochem. Cytol. 1961; 9: 493–5.
30. Gussoni B., KunkelL. M. The fate of individual myoblasts after
transplantation in to muscles of DMD patients. Nat. Med. 1997; 3:
970–7.
31. Meligy F. Y., Shigemura K., Behnsawy H. M. et al. The
efficiency of in vitro isolation and myogenic differentiation of MSCs
derived from adipose connective tissue, bone marrow, and skeletal
muscle tissue. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2012;48 (4): 203–15.
32. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle
regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science
1998; 279 (5356): 1528–30.
33. Зорин В. Л., Зорина А. И., Еремин И. И. и др. Сравнительный анализ остеогенного потенциала мультипотентныхмезенхимальныхстромальных клеток слизистой оболочки полости рта и
костного мозга. Гены и клетки 2014;9 (1): 50–7.
34. Dominici M., LeBlanc K., Mueller I. etal. Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International
Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006;
8 (4): 315–7.
35. Dezawa M., Ishikawa H., Itokazu Y. et. al. Bone marrow
stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration.
Science 2005;309 (5732):314–7.
Поступила 08.10.2014
гены & клетки Том IX, № 3, 2014