ШЕИН Сергей Александрович Моноклональные антитела к
advertisement
На правах рукописи ШЕИН Сергей Александрович Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому С6 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Чехонин Владимир Павлович доктор медицинских наук, Гурина Ольга Ивановна Официальные оппоненты: Барышников Анатолий Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, директор Ипатова Ольга Михайловна, доктор биологических наук, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. отделом Ведущее учреждение: ФГБУН «Научно-исследовательский институт химической медицины Федерального биологического агентства» физикомедико- Защита состоится « 13 » декабря 2012 г. в 1100 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр.8. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН Автореферат разослан «_____» ноября 2012 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук Карпова Е.А. Актуальность Мультиформная глиобластома – наиболее агрессивная из первичных злокачественных опухолей головного мозга, средняя выживаемость, при которой составляет около 1 года после постановки диагноза [Norden A.D. et al., 2009]. На сегодняшний день не существует эффективных методов лечения данного заболевания. В связи с чем, активно идет поиск и изучение опухоль-ассоциированных антигенов. Прогрессирование солидных опухолей во многом зависит от степени васкуляризации и ангиогенеза в малигнизированной ткани [Folkman J., 2006, Jain R.K. et al., 2007]. Из целого спектра проангиогенных факторов наиболее важным является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который играет ключевую роль в физиологическом и патологическом ангиогенезе [Ferrara N. et al., 2003, Ferrara N., 2004]. Кроме того, повышенный уровень экспрессии VEGF выявлен в различных типах опухолей, в частности в глиомах III-IV степени злокачественности [Schmidt N.O. et al, 1999, Samoto K. et al., 1995, Plate K.H.,.1999], поэтому этот фактор может рассматриваться как перспективная молекулярная мишень, для транспорта контейнерных систем в опухоли мозга. Кроме того, подавление функций VEGF приводит к регрессии неопластических сосудов [Jain R.K., 2001, Jain R.K., 2005] и может сдерживать рост опухоли [Borgstrom P. et al., 1999, Kim K.J. et al., 1993]. Тем не менее, на сегодняшний день существуют противоречивые данные относительно эффективности применения бевацизумаба при опухолях мозга, и целесообразность такого подхода остается спорной [Norden A.D. et al., 2009, Miletic H. et al., 2009, Bergers G., Hanahan D., 2008, Keunen O. et al., 2011, Chi A.S. et al., 2009, Lakka S.S., Rao J.S., 2008]. Так продемонстрирована значительная активация инвазии и инфильтрации опухолевых клеток в паренхиму мозга при антиангиогенной терапии [Lucio-Eterovic A.K. et al, 2009, Paez-Ribes M. et al., 2009, Ebos J.M. et al., 2009, Sakariassen P.O. et al., 2006, Keunen O. et al., 2011, Bikfalvi A. et al., 2011]. Стоит отметить, что большинство исследований противоопухолевых эффектов бевацизумаба проводили на подкожных моделях, в то время как работ на интракраниальных моделях недостаточно. В связи с чем, есть очевидная необходимость изучить целесообразность антиангиогенной терапии на ортотопической (т.е. интракраниальной) аллогенной модели высокоагрессивной глиомы C6 и продолжить разработку новых подходов направленного транспорта лекарств в опухолевую ткань. Один, из которых основывается на поиске привлекательной опухоль ассоциированной мишени и создании высокоселективной наноконтейнерной системы векторного типа, для доставки в опухоли мозга терапевтических и диагностических агентов. 1 Несмотря на то, что значительная часть злокачественных новообразований в высокой степени экспрессирует VEGF и этот белок является перспективной мишенью для адресной доставки контейнерных систем или наночастиц [Yoncheva K., Momekov G., 2011], возможность применения анти-VEGF антител в качестве молекулярного вектора изучена недостаточно. В 2010 г было показано, что бевацизумаб повышает клеточный захват и селективное накопление катионизированных липосом в культуре in vitro [Kuesters G.M., Campbell R.B., 2010]. Такой подход особенно перспективен для высокоселективной доставки контейнерных систем, с диагностическими и терапевтическими агентами, в очаги неконтролируемого ангиогенеза, в том числе в опухоли головного мозга через патологически измененный гемато-энцефалический барьер [Caraglia M. et al. 2012, Chekhonin V.P. et al., 2012]. Однако, вопрос о возможности применения VEGF в качестве мишени и моноклональных анти-VEGF антител в роли вектора для направленного транспорта наноразмерных систем в опухоли мозга in vivo остается открытым. Таким образом, создание селективных векторных систем для адресной доставки на основе анти VEGF антител является актуальной задачей современной биохимии и нейроонкологии. Цель работы: изучить перспективы применения и разработать высокоселективную наноконтейнерную систему на основе моноклональных анти-VEGF антител для направленного транспорта диагностических и терапевтических агентов в глиомы in vivo. Задачи: 1. Изучить перспективу применения антигена VEGF, в качестве молекулярной мишени, и моноклональных анти-VEGF антител, в качестве вектора, для направленного транспорта наноразмерных систем в опухоли мозга. 2. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к рекомбинантному VEGF. Провести иммунохимическую характеристику полученных антител. 3. Оценить эффективность терапии моноклональными антителами к VEGF на интракраниальной аллогенной модели С6 глиомы. 4. Исследовать накопление векторных наночастиц оксида железа на основе моноклональных анти-VEGF антител в глиоме методом МРТ при системном введении. 5. Оценить селективность накопления векторных липосомальных систем на основе моноклональных анти-VEGF антител в опухолевых клетках при системном введении. Научная новизна: 1. Показано, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 накапливаются в опухолевой ткани. 2 2. Впервые in vivo на интракраниальной модели глиомы показано, что полученные анти-VEGF антитела, конъюгированные с липосомами и магнитными наночастицами значительно повышают уровень их накопления в опухолевой ткани. 3. Показано, что анти-VEGF антитела могут использоваться в качестве высокоселективного вектора для направленной доставки наноразмерных систем в злокачественные новообразования центральной нервной системы. 4. Впервые in vivo на интракраниальной модели глиомы показано, что липосомы конъюгированные с моноклональными анти-VEGF антителами при системном введении селективно накапливаются и захватываются опухолевыми клетками. Практическая значимость. Разработана векторная липосомальная контейнерная система на основе моноклональных анти-VEGF антител, которая способна селективно доставлять в глиомы диагностические и лекарственные препараты. Полученные результаты вносят реальный вклад в исследования направленной доставки контейнерных систем в клетки мишени, что позволит значительно повысить эффективность диагностики и терапии онкологических заболеваний, в том числе высокоагрессивных новообразований головного мозга. Апробация диссертационной работы Основные положения диссертационной работы были представлены на межлабораторных конференциях ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского», Москва, 2010-2012; Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2011-2012. Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научно- практической конференции коллектива сотрудников кафедры и Отдела медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России и сотрудников Отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ Социальной и Судебной Психиатрии имени В.П. Сербского 28 июня 2012 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них четыре – статьи в журналах рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 124 машинописных страницах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка. Список литературы включает 6 отечественных и 221 иностранных источника. 3 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Получение моноклональных анти-VEGF антител. Рекомбинантный VEGF-164 для иммунизации был получен и любезно предоставлен для исследований А.В. Леопольд [Леопольд А.В. и др., 2011]. Самок мышей линии Balb/C подкожно иммунизировали рекомбинантным очищенным препаратом VEGF-164 крысы (25 мкг) с полным адъювантом Фрейнда («Difco laboratories», США). Иммунизация состояла из трех циклов: три подкожных иммунизации и заключительное бустерное введение препарата (100 мкг). Получение гибридом проводили по методике Köhler G. и Milstein C. в нашей модификации [Чехонин В.П. и др., 2001]. Слияние спленоцитов иммунизированной мыши с клетками миеломной культуры Sp2/0-Ag14 осуществляли с помощью раствора полиэтиленгликоль/диметилсульфоксид. Скрининг гибридных клеток продуцирующих антиVEGF антитела проводили параллельно несколькими методами трехкратно: твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), иммуноцитохимическим анализом (ИЦХ), иммуногистохимическим анализом (ИГХ) и иммуноблотингом. Для положительного контроля использовали коммерческие анти-VEGF антитела (10 мкг/мл, ab1316 «Abcam», США). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические иммуноглобулины мыши в эквивалентной концентрации. Первичные антитела проявляли козьими антителами к F(ab)2 фрагментам иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена и предабсорбированными сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США). Иммунофлуоресцентный анализ проводили с козьими антимышиными антителами конъюгированными с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США) в разведении 1:1000, ядра клеток докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Моноклональные антитела выделяли из асцита методом аффинной хроматографии на протеин A-агарозе («Invitrogen», США). Для получения первично меченных флуорохромом моноклональных анти-VEGF антител и неспецифических IgG использовали набор Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit («Invitrogen», США). Константа аффинности. Аффинность полученных моноклональных антител к VEGF определяли методом ИФА, путем расчета константы гетерофазного равновесия образования комплексов антиген-антитело [Beatty J.D. et al., 1987]. Wound-healing тест. Исследование биологической активности анти-VEGF антител in vitro проводили на клетках культуры C6. Для этого нарушали клеточный монослой и добавляли анти-VEGF антитела (2 мкг/мл), в качестве контроля вносили неспецифические IgG (2 мкг/мл). Через 9 ч регистрировали степень восстановления монослоя в месте по4 вреждения. Площадь свободной области определяли в программе «Leica LAS AF» и рассчитывали процент оставшейся свободной области через 9 ч относительно первоначальной. Расчеты, построение диаграмм и статистический анализ проводили в программе «Microsoft Excel 2010». Антиангиогенная терапия С6 глиомы. Интракраниальную опухоль моделировали на беспородных крысах с помощью внутримозговой стереотаксической имплантации клеток глиомы С6 [Чехонин В.П. и др., 2007]. Антиангиогенную терапию проводили очищенными моноклональными антителами на модели интракраниальной глиомы C6. Первый этап эксперимента проводили на 9 животных с введением: анти-VEGF антител (n=4), неспецифических IgG (n=2) и PBS (n=3). Все препараты антител вводили в бедренную вену на 5, 12 и 19 сутки после имплантации глиомы в концентрации 3 мг/кг. Второй этап проводили на 14 животных с введением: анти-VEGF антител (n=4), препарата бевацизумаб («Hoffmann-La Roche», Швейцария) (n=4), неспецифических IgG (n=3) и раствор PBS (n=3). Все препараты вводили в бедренную вену по следующей схеме: на 2, 9 и 16 сутки после имплантации в концентрации 10 мг/кг. Анализ выживания проводили по методу Каплана-Мейера, обрабатывали результаты в программе «Statistics 7.0». Магнитно резонансная томография. Исследование накопления магнитных наночастиц, которые были получены и любезно предоставлены для исследований М.А. Абакумовым [Абакумов М.А. и др., 2011, Абакумов М.А. и др., 2012] проводили на томографе Clinscan 7Т («Bruker», Германия) с постоянным магнитным полем 7 Тл. Для визуализации глиомы животным вводили внутривенно раствор наночастиц, конъюгированных с антителами к VEGF, а также с антителами к Сх43. Введѐнная доза наночастиц, в пересчѐте на концентрацию железа, составляла 10 мг/кг. МРТ-сканирование проводили в режиме SWI (табл. 1). Таблица 1. Параметры режима SWI, используемого для диагностики глиомы С6 с помощью магнитных наночастиц. Время повтора импульса Время эхо Кол-во повторов 33 мс 19 мс 1 Тип Толщина среза Параметры матрицы Параметры поля снимка Время исследования 3D 0,5 мм 320*230 пикселей 45*32 мм 2:58 Синтез липосом. В качестве контейнерной системы были использованы липосомы, которые готовили по следующей схеме: смешивали 3,75 мл пальмитоилолеилфосфатидилхолина (РС, 10 мг/мл), 10 мг холестерина, 210 мкл 1,2-дистеароил-sn-глицеро-35 фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] ПЭГ2000, 50 мг/мл), 40 мкл аммониевой соли (DSPE- 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [малеимид(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли (DSPE-ПЭГ-малеимида, 10 мг/мл) и 37 мкл диметилдиоктодециламония бромида (DDAB, 10 мг/мл) в смеси хлороформа и метанола (3:1 по объему) [Perrie Y. et al., 2001, Shi N., Pardridge W.M., 2000]. Все липиды были приобретены в фирме «Avanti Polar Lipids», США. Полученную смесь помещали в роторный испаритель и сушили в течение 2 часов в атмосфере аргона при температуре 40 С и скорости вращения ротора 180 об/мин. Сухой остаток растворяли в 1 мл циклогексана, замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение 5 часов. После лиофилизации к липидной пленке добавляли 2 мл PBS и образующуюся эмульсию обрабатывали ультразвуком, после чего подвергали 5 циклам замораживания (в жидком азоте) – размораживания (водяная баня, 40 С) и последовательно экструдировали через поликарбонатные мембраны с размерами пор 400 и 200 нм («Avanti Polar Lipids, Inc», США). В качестве флуоресцентной метки добавляли 0,1% Dil (1,1’-октадецил 3,3,3’,3- тетраметилиндокарбоцианин перхлорат). Конъюгация антител с липосомами. Раствор антител (4 мг в 1 мл 0,1 М боратного буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА) в течение часа инкубировали с 10-кратным молярным избытком 2-иминотиолана (реагент Траута, 40 мкг). Активированные антитела смешивали со свежеприготовленными липосомами в соотношении: 4 мг антител на 50 мкмоль РС (PBS, рН 7.4), полученную смесь инкубировали в течение ночи при 4оС. Иммунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакционной смеси и несвязанных моноклональных антител с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке с сефарозой CL-4B, уравновешенной PBS буфером (0,5 мл/мин). Полученные векторные липосомы концентрировали на фильтрах с пределом пропускания 30 кДа («Millipore», США) при 1000 g до 4 мл. Оценка накопления липосом in vitro. Эксперимент по захвату липосом in vitro проводили на фиксированных клетках глиомы C6 и глиобластомы U-87 MG человека. Готовили последовательные разведения анти-VEGF иммунолипосом (1:50-400) в полной ростовой среде RPMI-1640 и вносили к клеткам. В качестве контроля использовали немодифицированные липосомы и липосомы конъюгированные с неспецифическими IgG. Клетки инкубировали в течение 2-3 часов при 37°С, после чего трехкратно отмывали PBS без детергентов. Оценка накопления липосом in vivo. Исследование проводили на крысах с интракраниальной глиомой C6. Липосомы синтезировали за 3 дня до введения (50 мкмоль РС, 25 мкмоль холестерина на 6 животных). Перед введением препараты нормировали по по6 глощению флуорохрома Dil на спектрофотометре U-2800 («Hitachi», Япония) на длине волны 550 нм. Иммунохимическую активность подтверждали в ELISA. На 20 сутки развития опухоли векторные липосомы вводили в бедренную вену в объеме 500 мкл (на одно животное: 5 мкмоль пальмитоилолеилфосфатидилхолина, 2,5 мкмоль холестерина и 2,58 нмоль антител). Первой группе вводили липосомы конъюгированные с анти-VEGF антителами (n=3), второй – липосомы конъюгированные с неспецифическими IgG (n=2) и липосомы без векторных групп (n=2). Через двое суток проводили перфузию внутренних органов и извлекали головной мозг, который в течение суток выдерживали в 4% растворе параформальдегида. Срезы мозга докрашивали кроличьими поликлональными анти-GFAP антителами (1:400 в PBS без детергента). Визуализацию накопления проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе DMI 6000 («Leica», Германия) и лазерном конфокальном сканирующем микроскопе A1R MP («Nikon», Япония). Результаты и обсуждения. Иммуноблотинг Для подтверждения иммунохимической специфичности полученных антител по отношению к антигену VEGF, был проведен иммуноблотинг. Рис. 1. Результаты иммуноблотинга антител к VEGF с рекомбинантным и нативным антигеном. А – проявление очищенным препаратом полученных моноклональных анти-VEGF антител. Б – проявление коммерческими антителами к VEGF ab1316 («Abcam», США). 1 – очищенный препарат рекомбинантного thioredoxin/VEGF-164 37 кДа. 2 – лизат клеток E. coli без генетической конструкции с последовательностью VEGF. 3 – лизат клеток С6 глиомы крысы. 4 – лизат нормальных астроцитов крысы. Референсные антитела интенсивно проявляли рекомбинантный VEGF 37 кДа (Б-1, рис. 1), в то время как нативный антиген распознавали значительно слабее: мономер VEGF ~24 кДа (Б-3, рис. 1) и димер VEGF ~48 кДа (Б-4, рис. 1). Полученные моноклональные антитела, в данной постановке эксперимента, практически не проявляли бэнд ре7 комбинантного VEGF 37 кДа (А-1, рис. 1), но распознавали нативный мономер VEGF ~24 кДа (А-3, рис. 1) и выраженно визуализировали нативный димер VEGF ~48 кДа (А-3 и А4, рис. 1). Результаты сравнительного анализа свидетельствуют о том, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела более аффинно связывают нативный димер VEGF. В то же время, коммерческие антитела в большей степени проявляли иммунохимическую активность с рекомбинантным VEGF. Рис. 2. Результаты иммуноблотинга антител к VEGF с рекомбинантным антигеном. 1 – маркер молекулярной массы. 2, 3 – очищенный рекомбинантный thioredoxin/VEGF164 37 кДа, предварительно нагретый до 95°С. 4 и 5 – очищенный рекомбинантный thioredoxin/VEGF-164 37 кДа, внесенный в гель без нагревания. 2, 5 – проявление очищенным препаратом полученных моноклональных антиVEGF антител. 3, 4 – проявление коммерческими антителами к VEGF («Sigma», США). Дальнейшая иммунохимическая характеристика включала идентификацию связывания антител с рекомбинантным антигеном. Коммерческие антитела («Sigma», США) распознавали рекомбинантный VEGF с молекулярной массой 37 кДа, и в тоже время, проявляли бэнды с большей молекулярной массой ~75 и 80 кДа (4, рис. 2). Что свидетельствует о присутствие в белковом препарате димерных форм рекомбинантного VEGF, которые связаны ковалентно через дисульфидный мостик. Анализируемые антитела визуализировали высокомолекулярные димеры VEGF ~75 и 80 кДа (5, рис. 2) и мономер VEGF 37 кДа (2, рис. 2). Серия иммуноблотингов позволила провести иммунохимическую идентификацию моноклональных антител. Эти результаты позволяют предполагать, что полученные нами моноклональные антитела к VEGF специфично распознают как рекомбинантный, так и нативный VEGF, но преимущественно взаимодействуют с нативным димером VEGF. Константа аффинности антител Константа диссоциации составила 6,99 ± 0,78×10-9 M и константа аффинности – 1,37±0,15×108 M-1. Однако, следует учитывать ряд важных факторов. Во-первых, аффинность определялась к рекомбинантному антигену VEGF. Во-вторых, вследствие возмож8 ных конформационных изменений, при сорбции VEGF на поверхности полистирола, а также поверхностных эффектов, константа гетерофазного равновесия может отличаться от константы равновесия в растворе с нативным VEGF. Кроме того, очищенные моноклональные антитела к VEGF содержат примесь эндогенных мышиных иммуноглобулинов G, что также искажает расчетную константу аффинности на 5-10%. По результатам изотипирования, полученные моноклональные иммуноглобулины принадлежат к классу G2a. Иммуноцитохимический анализ Рис. 3. Иммунофлуоресцентный анализ моноклональных антител к VEGF на фиксированных клетках С6 глиомы крысы. A, B – визуализация полученными моноклональными анти-VEGF антителами. С – отрицательный контроль, неспецифические иммуноглобулины мыши. D – коммерческие антитела к VEGF ab1316 («Abcam», США). Анти-VEGF антитела проявляли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий). В иммуноцитохимическом анализе на клетках культуры C6 глиомы крысы полученные антитела к VEGF ярко окрашивали цитоплазму практически всех клеток (A и B 9 рис. 3). При этом наиболее интенсивно визуализировалась зона эндоплазмы (околоядерное пространство). Полученные результаты соответствуют общепринятым данным, поскольку VEGF секретируемый белок, его синтез происходит в эндоплазматическом ретикулуме, откуда в секреторных везикулах экспортные белки транспортируются в направлении цитоплазматической мембраны. Коммерческие антитела к VEGF идентично окрашивали клетки: ярко визуализировали околоядерное пространство и слабее область эктоплазмы (D, рис. 3). В отрицательном контроле специфической флуоресценции не наблюдалось (C, рис. 3). Рис. 4. Иммунофлуоресцентный анализ моноклональных антител к VEGF на фиксированных клетках культуры HUVEC человека. A, B – визуализация полученными моноклональными анти-VEGF антителами. С, D – коммерческие антитела к VEGF ab1316 («Abcam», США). Анти-VEGF антитела проявляли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий). Сравнительный анализ полученных (A и B, рис. 4) и референсных антител (C и D, рис. 4) на клетках культуры человеческих эндотелиоцитов HUVEC показал полную идентичность субклеточной локализации. Анти-VEGF антитела интенсивно окрашивали компартменты ЭПР в зоне перинуклеарного пространства, в то время как по периферии цито10 плазмы визуализировались гранулярные структуры, выстраивающиеся вдоль тяжей цитоскелета. На представленных микрофотографиях хорошо видно, что для клеток HUVEC характерна своя уникальная картина окрашивания, которую воспроизвели полученные нами антитела. По результатам комплексного иммуноцитохимического анализа и сопоставления иммунофлуоресцентной картины можно сделать вывод, что полученные антитела специфично визуализируют цитоплазматический пул нативного VEGF на клеточных препаратах. Это подтверждает наши выводы, сделанные на основании анализа результатов иммуноблот анализа, о том, что полученные антитела с большей аффинностью связывают нативный димер VEGF. Это особенно важно для направленной терапии, поскольку антитела будут селективно распознавать и связывать биологически активный VEGF. Кроме того, было убедительно продемонстрировано, что VEGF экспрессируется глиомными клетками. Иммуногистохимический анализ глиомы C6 крысы. Рис. 5. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга крысы с глиомой С6 моноклональными анти-VEGF антителами. A – визуализация глиомных клеток и VEGF-позитивных астроцитов в периопухолевом пространстве. B – визуализация клеток опухолевой ткани. С – визуализация VEGF-позитивных реактивных астроцитов. D – отрицательный контроль, неспецифические иммуноглобулины. Анти-VEGF антитела проявля11 ли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий). На следующем этапе был проведен иммуногистохимический анализ глиомных клеток C6 в процессе интракраниального развития опухоли. Полученные моноклональные антитела интенсивно окрашивали глиомные клетки (A и B, рис. 5). Локализация флуоресценции, соответствующая иммунофлуоресцентному окрашиванию анти-VEGF антителами, строго совпадала с опухолевым очагом, в то время как интактная ткань оставалась темной. Что свидетельствует о высоком уровне экспрессии VEGF глиомными клетками, не только в культуре in vitro, но и в процессе роста и развития опухоли in vivo. На границе глиомы и паренхимы нервной ткани, в зоне астроглиоза, присутствуют ярко окрашенные клетки звездчатой морфологии – VEGF-позитивные реактивные астроциты (С, рис. 5). Феномен реактивного астроглиоза при повреждениях нервной ткани хорошо известен [Salhia B. et al., 2000]. В отрицательном контроле, при окрашивании неспецифическими мышиными иммуноглобулинами, ни в опухолевой, ни в нормальной ткани флуоресценции не наблюдалось (D, рис. 5). Результатам проведенного иммуногистохимического анализа позволяют сделать следующие выводы. Полученные моноклональные анти-VEGF антитела иммунохимически специфичны к VEGF, селективно визуализируя на срезах мозга VEGF-позитивные структуры. Выраженно окрашивается опухолевая ткань и отдельные реактивные астроциты в перитуморальном пространстве, а также микрососуды в паренхиме нервной ткани. Представленные результаты соответствуют существующим данным иммуногистохимического окрашивания нервной ткани антителами к VEGF [Ogunshola O.O. et al., 2000]. Стоит отметить, что большинство глиомных клеток были VEGF-позитивны. Это свидетельствует в пользу того, что VEGF является опухоль ассоциированным белком, синтез которого значительно повышается в малигнизированной ткани. Исследование биологической активности антител in vitro Хорошо известно, что антитела к VEGF предотвращают активацию рецепторов VEGFR и трансдукцию сигнала [Wedam S.B. et al., 2000], ингибируя пролиферацию и миграцию клеток. В связи с чем, целью нашего эксперимента было изучение влияния антител к VEGF на рост клеток глиомы C6 in vitro. Моноклональные антитела к VEGF в концентрации 2 мкг/мл замедляли восстановления монослоя клеток глиомы С6. В контроле с неспецифическими иммуноглобулинами 12 в эквивалентной концентрации зона повреждения монослоя заполнялась мигрирующими клетками. 80 70 60 Неспец иммуно 2 мкг/м 50 % 40 68 30 20 Анти-VE антител 37 10 Рис. 6. Площадь повреждения монослоя клеток С6 глиомы в процентах через 9 ча0 оси ординат процент оставшейся площади повреждения относительно первонасов. По чальной площади повреждения. Синий столбец – неспецифические иммуноглобулины 2 мкг/мл, через 9 ч сохраняется только 37±2,9% свободной площади, повреждение практически зарастает (n=3, S=2,9). Красный столбец – моноклональные анти-VEGF антитела 2 мкг/мл, через 9 ч сохраняется 68±7,5% свободной площади, ингибирование восстановления монослоя в 1,8 раз (n=3, S=7,5, p<0,05). Площадь повреждения монослоя через 9 часов В случае анти-VEGF антител монослой восстанавливался медленно, через 9 ч инкубации среднее значение площади, свободной от клеток глиомы, составило 68±7,5% от первоначальной площади (рис. 6). Тогда как с неспецифическими IgG площадь повреждения восстанавливалась и заполнялась клетками значительно быстрее: через 9 ч оставалось лишь 37±2,9% свободной площади. Таким образом, достоверно показано (p<0,05), что моноклональные анти-VEGF антитела ингибируют восстановление клеточного монослоя in vitro. Оценка накопления меченных антител в опухоли in vivo На следующем этапе важно было исследовать возможность использования полученных антител в направленной терапии опухолей мозга или адресной доставке лекарств. Для этого моноклональные антитела к VEGF, конъюгированные с флуорохромом, внутривенно вводили крысам с имплантированной глиомой С6. 13 Рис. 7. Флуоресцентный анализ накопления меченных Alexa Fluor 488 антител при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 через 24 ч. A, B – моноклональные анти-VEGF антитела, визуализация накопления в опухолевой ткани. C – моноклональные анти-VEGF антитела, паренхима нервной ткани D– неспецифические иммуноглобулины, опухолевая ткань. Через 24 ч после введения препарата, в опухоли было обнаружено накопление моноклональных анти-VEGF антител (A и B, рис. 7). Визуализировались группы клеток в различных регионах опухоли, как в центре, так и по периферии. В паренхиме нервной ткани специфической флуоресценции не наблюдалось (C, рис. 7), что в первую очередь объясняется интактным гемато-энцефалическим барьером (ГЭБ), не пропускающим высокомолекулярные соединения из кровотока в мозг. При внутривенном введении меченных неспецифических иммуноглобулинов накопление в опухоли отсутствовало (D, рис. 7). Что подтверждает именно специфическое накопление моноклональных анти-VEGF антител в ткани с высокой концентрацией VEGF за счет селективного взаимодействия с антигеном, а не пассивную диффузию из плазмы в межклеточное пространство опухоли. Полученные данные дают основания сделать вывод о том, что при нарушении целостности гематоэнцефалического барьера, вследствие патологических процессов, анти-VEGF антитела могут быть использованы в качестве вектора для направленного транспорта в VEGFпозитивные клетки. 14 Антиангиогенная терапия Мы показали, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела распознают нативный димер VEGF, визуализируют в ИГХ опухолевые ткань, ингибируют рост клеток С6 in vitro и накапливаются в глиоме при системном введении. В связи с чем, была сформулирована задача: изучить эффективность анти-VEGF монотерапии на ортотопической аллогенной модели высокоагрессивной глиомы C6. Рис. 8. Анализ выживаемости контрольных (IgG, PBS) и опытных групп (анти-VEGF антитела, авастин) животных с глиомой С6 по методу Каплана-Мейера. Однако, антиангиогенная терапия, как моноклональными антителами, полученными нами, так и коммерческим бевацизумабом, не продлевала жизнь крысам с глиомой C6 (рис. 8). Достоверных различий по выживаемости между опытными и контрольными группами не обнаружено, все животные погибали между 22 и 28 сутками. Более того, моноклональные анти-VEGF антитела не влияли на объем и рост интракраниальной опухоли. Увеличение терапевтической дозы антител в 3,3 раза (с 3 до 10 мг/кг) и раннее начало лечения также не дали никакого эффекта. В связи с вышеизложенным можно предположить, что анти-VEGF монотерапия не эффективна при ортотопической глиоме C6. Интересно, что в последнее время количество публикаций, в которых отмечается низкая эффективность антиангиогенной терапии опухолей мозга, значительно возросло. Так на интракраниальной ксеногенной модели глиобластомы бевацизумаб практически не влиял на скорость роста глиомы [Keunen O. et al., 2011]. Не смотря на успехи применения бева15 цизумаба при колоректальном раке и раке молочной железы, в случае глиом III-IV степени злокачаственности анти-VEGF терапия остается малоэффективным инструментом. Векторные наночастицы для МРТ-визуализации Установлено, что многие солидные опухоли, в том числе опухоли мозга, гиперэкспрессируют VEGF [Schmidt N.O. et al, 1999, Samoto K. et al., 1995, Plate K.H.,.1999]. Нами было показано, что клетки глиомы in vitro в культуре и при интракраниальном развитии in vivo характеризуются повышенным уровнем синтеза данного фактора. VEGF является секретируемым белком и его концентрация велика в межклеточном пространстве, кроме того, часть изоформ закреплена на мембране клеток и в межклеточном матриксе [Ferrara N., 2004]. В связи с чем, есть основания полагать, что VEGF может использоваться как мишень в молекулярной визуализации патологической ткани. Целью эксперимента было продемонстрировать специфическое накопление векторных магнитных наночастиц (90±5 нм) на основе моноклональных анти-VEGF антител в опухолевой ткани методом МР томографии. Рис. 9. МРТ-визуализация накопления векторных наночастиц в мозге крыс с интракраниальной глиомой С6. A, C – до введения препаратов наночастиц. B, D – через 24 ч после введения магнитных наночастиц 10 мг/кг по железу. B – наночастицы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. D – наночастицы конъюгированные с моноклональными анти-VEGF антителами, накопление детектируется в очаге глиомы. 16 Через 24 часа, после введения наночастиц на основе моноклональных анти-VEGF антител, детектируется селективное накопление анти-VEGF наночастиц в опухолевой ткани (D, рис. 9). При в/в введении препаратов конъюгированных с неспецифическими иммуноглобулинами изменений в накоплении и интенсивности сигнала не наблюдалось (A и B, рис. 9), что объясняется отсутствием векторной специфичности у вводимого препарата. Таким образом, было показано, что моноклональные антитела к VEGF позволяют селективно направлять в клетки мишени наноразмерные структуры, повышая уровень их накопления и тропность к опухолевой ткани. Применение контрастных направленных систем позволит проводить молекулярную визуализацию и неинвазивную диагностику солидных опухолей на ранних стадиях. Накопление липосом in vitro Одним из принципиально новых направлений повышения эффективности лечения опухолей мозга может оказаться адресная высокоселективная доставка наноразмерных контейнерных систем векторного типа на основе моноклональных антител [Yoncheva K., Momekov G., 2011, Kuesters G.M., Campbell R.B., 2010, Caraglia M. et al. 2012, Chekhonin V.P. et al., 2012]. Мы показали, что VEGF является опухолеспецифичной и гиперэкспрессируемой молекулярной мишенью, а моноклональные анти-VEGF антитела – потенциальным вектором для направленной доставки. Поэтому, следующей задачей была разработка контейнерной селективной транспортной системы на основе моноклональных анти-VEGF антител, способной доставлять вещества различной природы в опухоли мозга. В качестве контейнера были использованы stealth-липосомы, модифицированные полиэтилен гликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 2000 Да. Такое внешнее покрытие липосом, состоящее из ПЭГ, продлевает время циркуляции липосом в кровотоке, замедляя системную элиминацию и захват фагоцитирующими клетками. Конъюгацию между липосомами и анти-VEGF антителами осуществляли через малеимидную группу липидов и сульфгидрильную группу активированного белка. 17 Рис. 10. Флуоресцентный анализ накопления липосом на фиксированных клетках С6 глиомы. A, B – визуализация клеток после инкубации с анти-VEGF иммунолипосомами (красный). С – ПЭГилированные липосомы, без конъюгации с антителами. D – липосомы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. Ядра докрашены DAPI (синий). Анти-VEGF иммунолипосомы связывали цитоплазматический пул VEGF и визуализировали практически все клетки на фиксированном препарате C6 глиомы (A и B, рис. 10). В то время как, после инкубации ПЭГилированных липосом с клетками окрашивания не наблюдалось (C, рис. 10). В случае липосом конъюгированных с неспецифическими антителами флуоресцентный сигнал детектировался (D, рис. 10), однако значительно более слабый по сравнению с анти-VEGF липосомами. Более выраженное накопление антиVEGF иммунолипосом (A и B, рис. 10), относительно липосом с неспецифическими IgG (D, рис. 10), свидетельствует о селективном накоплении векторной системы, за счет взаимодействия векторной группы липосом (моноклональные анти-VEGF антитела) с антигеном. 18 Накопление векторных липосом в опухоли in vivo Для исследования селективности накопления векторных липосом в условиях in vivo крысам с С6 глиомой в бедренную вену вводили препараты липосом (210±10 нм) в объеме 500 мкл, нормированные по липидам, белку и флуоресцентной метке (на одно животное по липидному составу ~5 мкмоль фосфатидилхолина и 2,5 мкмоль холестерина). Рис. 11. Флуоресцентный анализ накопления липосом в опухолевой ткани при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 через 48 ч. A – ПЭГилированные липосомы. B – ПЭГилированные липосомы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. C – селективное накопление ПЭГилированных липосом конъюгированных с моноклональными антиVEGF антителами в глиоме. Ядра докрашены DAPI (синий). Сравнительный флуоресцентный анализ срезов мозга выявил значительные отличия в накоплении липосомальных препаратов разной конструкции (рис. 11). Так, ПЭГилированные липосомы, без модификации векторной молекулой, практически не накапливались в опухолевой ткани (A, рис. 11). Накопление липосом с неспецифическими иммуноглобулинами детектировалось в большей степени, наиболее яркие области, представляющие из себя вытянутые структуры, локализованные преимущественно в центральной части опухоли (B, рис. 11). Подобная визуализация, по-видимому, ассоциирована с накоплением иммунолипосом в патологических сосудах, вследствие нарушения их перфузии и застоя плазмы. А благодаря высокой проницаемости опухолевых сосудов и нарушения целостности ГЭБ происходит диффузия липосом из кровотока в межклеточное простран19 ство глиомы. На представленной микрофотографии хорошо видно, что основное накопление метки сконцентрировано вокруг отдельных очагов с интенсивной флуоресценцией (B, рис. 11). Накопление анти-VEGF липосом (C, рис. 11), у всех 3 животных, многократно превосходило аналогичное в контрольных группах (A и B, рис. 11). Стоит отметить, что интенсивно визуализировалась вся опухолевая ткань, как в центральной зоне, таки по периферии. Сопоставление уровня и картины флуоресценции трех проанализированных препаратов подтверждает селективность и специфичность разработанной липосомальной системы на основе анти-VEGF антител. По-видимому, проникновение анти-VEGF липосом происходило из патологических сосудов, подобно липосомам с неспецифическими иммуноглобулинами: хорошо заметны яркие области, с высокой концентрацией липосом (C, рис. 11). Таким образом, циркулируя в кровотоке, иммунолипосомы через патологические сосуды проникают в интерстициальное пространство. Однако, векторные анти-VEGF липосомы селективно накапливаются в области локализации антигена по градиенту VEGF. Видно более равномерное распределение флуоресцентной метки и накопление по всему объему глиомы, что подтверждает направленный транспорт из кровотока в малигнизированную ткань за счет векторной специфичности. Рис. 12. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия накопления иммунолипосом в опухолевой ткани при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 через 48 ч. A – селективный захват анти-VEGF липосом опухолевыми клетками. B – накопление неспецифических иммунолипосом в микрососудах. Ядра докрашены DAPI (синий). Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия позволила на клеточном уровне локализовать накопление липосом в глиоме. Хорошо видно, что анти-VEGF липосомы ак20 тивно захватываются и интернализуются практически всеми опухолевыми клетками (A, рис. 12). Подтверждая вывод о селективности векторной системы и ее эффективном накоплении в опухолевой ткани. При этом, выделяются отдельные клетки накопившие значительно больше флуоресцентной метки. В то время как IgG-липосомы визуализировали микрососуды (B, рис. 12), незначительно захватываясь глиомными клетками. Рис. 13. Флуоресцентный анализ накопления липосом в перитуморальном пространстве. Для визуализации астроцитов срезы докрашены поликлональными антиGFAP антителами. A, B – селективное накопление анти-VEGF липосом в глиомных клетках на границе опухоли и паренхимы мозга. C – ПЭГилированные липосомы. D – липосомы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. Анти-GFAP антитела проявляли антикроличьими иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий). Иммунохимическая визуализация реактивных астроцитов (зеленый цвет) позволила достоверно разграничить перитуморальное пространство от глиомы, и утверждать о высокой селективности векторных иммунолипосом по отношению к опухолевой ткани. Так ПЭГилированные липосомы практически не визуализировали опухолевые клетки (C, рис. 13), как и неспецифические иммунолипосомы, которые накапливались преимущественно в сосудах (D, рис. 13). В то время как, селективное накопление векторных анти21 VEGF липосом выраженно окрашивало опухолевую ткань, совпадая с границей астроглиального вала (A и B, рис. 13). Это свидетельствует о специфичности нашей контейнерной системы по отношению к глиоме и высокой степени ее захвата VEGF-позитивными опухолевыми клетками. Однако, часть реактивных астроцитов также секретирует VEGF, который регулирует репаративный ангиогенез. Интересно, что анти-VEGF липосомы захватываются и отдельными астроцитами (А, рис. 14) в перитуморальном пространстве. Рис. 14. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия захвата антиVEGF иммунолипосом мигрирующими опухолевыми клетками и реактивными астроцитами в перитуморальном пространстве. Для визуализации астроцитов проводили иммунофлуоресцентное окрашивание анти-GFAP антителами. А – захват векторных липосом астроцитами и опухолевыми клетками в перитуморальном пространстве. В – захват векторных липосом глиомной клеткой. Анти-GFAP антитела проявляли антикроличьими иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий). Сканирование перитуморального пространства подтвердило выраженное накопление иммунолипосом в мигрирующих глиомных клетках (А, рис. 14), а также в астроцитах, что свидетельствует об эффективной антиген-направленной доставке и создании высокой концентрации векторизованной системы в данной области опухоли. Возможно, такой подход окажется эффективным в отношении инвазивной популяции клеток, в том числе при терапии резистентных опухолевых фенотипов. Хорошо видно, что интернализованная флуоресцентная метка визуализируется в виде относительно крупной зернистости, которая вероятно является скоплением липосом в эндосомах (B, рис. 14). 22 Заключение. Таким образом, на основании результатов флуоресцентного анализа и оценки накопления липосом можно сделать важные выводы. При системном введении векторные липосомы на основе моноклональных анти-VEGF антител селективно накапливаются в опухолевой ткани. Известно, что вследствие патологического строения сосудистой сети, высокого внутричерепного давления и развития отека, транспорт терапевтических агентов в опухоли мозга затруднен. Нами было показано, что иммунолипосомальные контейнерные системы, способны проникать из системного кровотока через измененный патологическим процессом ГЭБ в глиомную ткань. При таком подходе, высокая проницаемость сосудов и отсутствие полноценного гистогематического барьера, характерных для опухолей, способствуют накоплению липосом, в то время как в нормальной ткани, с интактным ГЭБ, подобного не происходит. Сравнительный анализ показал значительные различия в накоплении ПЭГилированных липосом с неспецифическими и анти-VEGF антителами. В первом случае, визуализация опухолевых клеток обнаруживается вблизи отдельных очагов накопления, в то время как в большей части опухолевой ткани окрашивались только микрососуды. Что, свидетельствует о пассивной диффузии и неспецифической адгезии липосом. В то время как анти-VEGF липосомы накапливаются и распределяются по всем участкам опухоли, активно захватываясь и интернализуясь глиомными клетками. В перитуморальном пространстве визуализируются мигрирующие глиомные клетки и астроциты. Разработанная нами липосомальная система на основе моноклональных антител к VEGF обладает селективностью по отношению к VEGF-позитивным клеткам и эффективно накапливается в патологической ткани при системном введении. Пролонгированная циркуляция контейнерной системы в кровотоке (за счет ПЭГилирования) и тропность к опухолевой ткани (за счет векторных антител) может обеспечить высокоэффективную направленную доставку лекарств в опухоли ЦНС. Подобный подход, основанный на высокоселективной доставке наноразмерных контейнерных систем, может существенно повысить эффективность терапии солидных опухолей, в том числе высокоагрессивных и резистентных глиом. Кроме того, результаты данной работы подтверждают, что VEGF является перспективной опухолеспецифичной мишенью, а моноклональные анти-VEGF антитела – селективным молекулярным вектором для направленной доставки наноконтейнеров и наночастиц в опухоли мозга in vivo. 23 Выводы. 1. Модифицированный способ иммунизации мышей рекомбинантным препаратом VEGF-164 позволил получить В-лимфоциты селезенки, способные при слиянии с клетками миеломной культуры Sp2/0-Ag14 образовывать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные анти-VEGF антитела изотипа G2a, характеризующиеся константой аффинности – 1,37±0,15×108 M-1. Полученные моноклональные анти-VEGF антитела способны специфично распознавать рекомбинантный и нативный VEGF в иммуноблот анализе, а также визуализировать VEGF-позитивные клетки. 2. Препарат моноклональных анти-VEGF антител, меченных флуорохромом Alexa Fluor 488 и введенных внутривенно, способен захватываются клетками интракраниальной глиомы и накапливаться в опухолевой ткани, визуализируясь в иммунофлуоресцентном анализе. 3. Терапия препаратом моноклональных анти-VEGF антител крыс с ортотопической глиомой C6 в концентрации 3 и 10 мг/кг при внутривенном введении не оказывает влияния на выживаемость экспериментальных животных и объем опухоли. 4. Конъюгация моноклональных анти-VEGF антител с магнитными наночастицами оксида железа (гидродинамический диаметр 90±5 нм), и холестерин- фосфатидилхолиновыми липосомами (210±10 нм) объективно повышает уровень их накопления в опухолевой ткани при внутривенном введении и качество визуализации глиом методами МРТ исследования в режиме SWI и флуоресцентного анализа. 5. Внутривенное введение крысам с интракраниальной глиомой С6 ПЭГилированных липосом, конъюгированных с моноклональными анти-VEGF антителами (2,58±0,17 нмоль антител), приводит к их специфичному захвату клетками глиомы и реактивными астроцитами, а также позволяет визуализировать накопление в опухолевой ткани. 24 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Корчагина А.А., Шеин С.А., Гриненко Н.Ф., Павлов К.А., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Лиганд-рецепторный анализ в оценке функциональной активности рекомбинантных VEGF и экстраклеточного фрагмента VEGFR-1 человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т.152(12). С. 647651. 2. Шеин С.А., Гурина О.И., Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Корчагина А.А., Гриненко Н.Ф., Иванова Н.В., Волгина Н.Е., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Получение моноклональных антител к рекомбинантному фактору роста эндотелия сосудов. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. (1) С. 24-28. 3. Чехонин В.П., Шеин С.А., Корчагина А.А., Гурина О.И. Роль VEGF в развитии неопластического ангиогенеза. // Вестник РАМН. 2012. (2) С. 23-34. 4. Абакумов М.А., Шеин С.А., Вишвасрао Х., Нуколова Н.В., Сокольски-Папков М., Cандалова Т.О., Губский И.Л., Гриненко Н.Ф., Кабанов А.В., Чехонин В.П. Визуализация экспериментальной глиомы С6 методом МРТ с помощью магнитных наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012 Т.154(8) С. 242-246. 5. Шеин С.А., Леопольд А.В. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. // Материалы VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2011 г. Вестник РГМУ. 2011. спец. выпуск (1). С. 230. 6. Шеин С.А. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. // Материалы VII Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2012 г. Вестник РГМУ. 2012. спец. выпуск (1). С. 214. 25
