характеристика эпифитных бактерий рода enterobacter и рода
advertisement
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление 06.03.01 (ОКСО 020400.68) ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИФИТНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROBACTER И РОДА LYSINIBACILLUS Работа завершена: "___"_________ 2015 г. ____________________ (Л.Ж.Н. Модисе) ____________________ (А. М. Марданова) ____________________ (О.Н. Ильинская) Работа допущена к защите: Научный руководитель к. б. н., доцент "___"_________ 2015 г. Заведующий кафедрой д.б.н., профессор "___"_________ 2015 г. Казань 2015 СОДЕРЖАНИЕ 1 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ 5 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 1.1 Эпифитная микрофлора растений 7 1.2 Использование бактерий для биоконтроля фитопатогенов 11 1.3 Рост стимулирующая активность эпифитных бактерий 13 1.4 Характеристика бактерий рода Enterobacter 15 1.5. Характеристика бактерий рода Lysinibacillus 16 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 20 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 20 2.1 Объект исследований 20 2.2 Штаммы бактерий 20 2.3 Питательные среды и культивирование микроорганизмов 20 2.4 Идентификация изолятов бактерий 21 2.5 Характеристика свойств штаммов бактерий 21 2.5.1 Изучение морфологии клеток 21 2.5.2 Протеазная и амилазная активность 21 2.6 Чувствительность бактерий к антибиотикам 22 2.7 Исследование антагонистической активности 22 2.8 Статистическая обработка результатов 22 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 23 3.1 Выделение и идентификация бактерий 23 2 3.2 Характеристика морфологии Enterobacter ludwigii и 25 Lysinibacillus fusiformes и способности секретировать гидролазы 3.3 Чувствительность к антибиотикам штамма E. ludwigii 27 3.4 Способность штаммов L. fusiformes и E. ludwigii к антагонизму в 30 отношении бактериальных фитопатогенов 3.5 Способность штаммов L. fusiformes и E. ludwigii к синтезу ауксина – 30 индолил-уксусной кислоты ВЫВОДЫ 34 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 35 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИУК- индол-3-уксусная кислота IAM- Индол-3-ацетамид IAA- индол-3-ацетальдегид 4 ВВЕДЕНИЕ Растения заселены огромным количеством различных микроорганизмов. Так микроорганизмы населяющие поверхность растений называются эпифитами, а микроорганизмы, населяющие растительные ткани, – эндофитами. Бактерии, которые заселяют поверхность листьев и стеблей называются филлосферой, а бактерии, заселяющие поверхность корешков, – ризосферой. Кроме того сообщество эпифитов иногда разделяют на каулосферу (стебли), антосферу цветы), филлосферу (листья) и капросферу (фрукты) [Coutino, 2006]. Микрофлора листовой поверхности растений приспособлена переносить высокие облучения и низкую влажность. Ризосфера, напротив, богата различными питательными соединениями (например, витамины, сахара, аминокислоты и органические кислоты), которые выделяются корнями растений в окружающую почву. Доказана роль ризосферных микроорганизмов в защите растений от патогенных микроорганизмов [Liben, 1965]. Листья подвергаются воздействию частиц пыли и воздуха, приводя к образованию типичной флоры на их поверхности. Кутикулы, воски и выросты помогают в развитии микроорганизмов [Vorholt, 2012]. Исследования о закономерностях микробной жизни в ризосфере и филлосфере сельско-хозяйственных растений имеют большое коммерческое значение по двум причинам. Во-первых, мы должны понимать технику выживания растений при взаимодействии с болезнетворными бактериями и грибками. Это важно для разработки новых способов борьбы с фитопатогенами и их распространением. Во-вторых, это важно для контроля и предотвращения увеличения количества фруктов и овощей, загрязненных патогенными бактериями, такими как Salmonella и E.coli. Развитие стратегий биоконтроля очень важно как для сельского хозяйства в целом, так и для общественного здравоохранения, поскольку вспышки токсикоинфекций. 5 позволит предотвратить Целью настоящей работы являлась сравнительная характеристика штаммов рода Enterobacter и рода Lysinibacillus, выделенных с листьев и корней картофеля, изучение их антагонистической и рост стимулирующей активности. Для достижения этой цели решались следующие задачи: 1) Выделение чистой культуры эпифитных бактерий рода Enterobacter и Lysinibacillus, идентификация бактерий и характеристика их морфологии. 2) Характеристика способности штаммов Enterobacter ludwigii и Lysinibacillus fusiformes секретировать протеазы и амилазы. 3) Характеристика устойчивости штамма E. ludwigii к антибиотикам. 4) Характеристика антагонистической активности штаммов E. ludwigii и L. fusiformes в отношении бактериальных фитопатогенов. 5) Исследование способности штаммов E. ludwigii и L. fusiformes к синтезу ауксина – индолил-уксусной кислоты. 6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Эпифитная микрофлора растений Бактериальные возбудители колонизируют поверхность здоровых листьев, которыми они питаются. Эпифитные бактерии имеют способность размножаться на поверхности растений [Coutino, 2006]. Эти бактерии могут быть удалены с поверхности листьев путем химической дезинфекции или промывкой. Ассоциированные ризобактериями, а бактерии, с корнями связанные с бактерии называются листьями, называются филлобактериями [Vorholt, 2012]. По качественному составу эпифитная микрофлора довольно однообразна и типичными ее представителями являются бактерии (Pseudomonas herbicola, Flavobacterium, Sarcina, Lactobacillus грибы мицелиальные plantarum), (Cladosporium, Botrytis, Alternaria, Fusarium), дрожжи (Saccharomyces, Cryptococcus, Rhodotorula) [Leveau, 2012]. Состав микрофлоры растений зависит от вида, возраста растений, типа почвы и температуры окружающей среды. При повышении влажности численность эпифитных микроорганизмов возрастает, при понижении влажности – уменьшается. Роль эпифитной микрофлоры в жизни растений огромна. Они участвуют в питании растений, предохранении от инфицирования болезнетворными микроорганизмами, стимулировании роста и развития растений продуктами метаболизма [Roberto, 2010]. Среди представителей эпифитной микрофлоры имеются активаторы роста (например, некоторые виды дрожжей Ps. herbicola), образующие витамины, ауксины, фолиевую кислоту, тиамин, рибофлавин и другие соединения. Эпифитные микроорганизмы являются элементом естественной защиты растительного организма за счет проявления природной антагонистической активности по отношению к фитопатогенам [Демченко с соавт., 2004]. Существует ряд эпифитных видов, которые соединяют собой внекорневую и корневую поверхности растений [Pizzirani, 2012].Они обычно очень конкретные и предпочитают отдельные виды растений и отдельные 7 части растений. Обычно многие из этих эпифитов на внекорневой поверхности представлены грамотрицательными палочками, пигментированными и с бродильным метаболизмом [Emelia, 2014]. Те, которые являются непигментированными, обычно имеют высокое содержание ГЦ-пар в геномной ДНК. Низкое содержание тимина защищает клетки от летального воздействия УФ-излучения, присутствующего в солнечном свете. УФ-облучение вызывает димеризацию тимина, что приводит к мутациям [Roberto, 2010].Точно так же пигмент эпифитов может работать как защитный экран против радиации. Все эти свойства бактерий позволяет им выживать и размножаться лучше, чем другим бактериям в популяции данной среды (селективное преимущество) [Maurizio, 2004]. Существуют также специализированные пищевые потребности, которые соответствуют росту и выживанию этих эпифитных бактерий вместо других сапрофитов. Большинство эпифитных бактерий не вредит растению, на котором они живут, но, в некоторых случаях, они могут быть полезны растениям или же приводить к травмам [Leveau, 2012]. Штаммы Pseudomonas syringae, Xanthomonas, Erwinia herbicola являются примерами эпифитов. Штамм Pseudomonas fluorescens также относится к эпифитам. Все эти бактерии способствуют образованию кристаллов льда. Следует отметить, что центры кристаллизации дают очаги для образования льда на растениях при температурах выше нормальной точки замерзания, что может привести к повреждениям растений [Vorholt, 2012]. Эпифитные бактерии, которые вызывают болезни растений, и те, которые вызывают «ледяные» травмы, попрежнему остаются чрезвычайно важными для растениеводства. Исследования олеандра и оливковых растений показало, что эти растения часто несут возбудителя P. syringae и других членов этой группы. Эпифитные сообщества также включают рода Xanthomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Lactobacillus, Acinetobacter, Erwinia, Corynebacterium. Тесная связь в эпифитных сообществах означает, что существуют 8 преимущества, которые способствуют выживанию в течение длительного времени [Vorholt, 2012]. Выживание эпифитных бактерий. Филлобактериями являются бактерии, которые находятся на листьях. Стратегии роста и выживания этих внекорневых бактерий включают способность переносить экстремальные экологические стрессы на поверхности листьев и стратегию избегания стрессов [Emelia, 2014]. Предположили, что вторая стратегия избегания может привести к возникновению потенциальных возбудителей болезней растений [Pal, 2011]. Эпифитные и эндофитные бактерии являются бактериями, которые находятся на двух концах спектра. Патогены, как известно, могут заселять обе поверхности листа. Многие болезни растений вызываются бактериями: бактериальный ожог риса –Xanthomonas campestris; Малвацеарум (бактериальный ожог хлопка) – Xanthomonas axonopodis; Erwinia саrоtоvоrа - мягкая гниль овощей, Erwinia herbicola - травмы сельскохозяйственных культур и Pseudomonas syringae - бактериальный рак черемухи [Christian, 2012]. Известно, что бактерии, ответственные за болезнь, являются эндофитами и не эпифитами. Однако не всегда заболевания вызывается эндофитной популяцией патогена [Pal, 2011]. Есть определенные взаимоотношения между популяциями. Болезнь, в свою очередь, контролируется генотипом хозяина и многими другими параметрами окружающей среды. Обычно бактериальная популяция достигает порогового значения, и только тогда происходят изменения в вирулентности возбудителя. Исследователи Линдов и Битти (1995) предположили, что устойчивые генотипы уменьшают развитие, размер и распределение эндофитной популяции фитопатогенных бактерий. Стратегия колонизации эпифитных бактерий. Было высказано предположение, что у филлобактерий имеется ряд стратегий для колонизации, такие как проникновение, агрегация и модификация листьев [Steven, 2003]. Следует отметить, что регуляция этих процессов относится к плотностно-зависимым взаимодействиям. Способность бактерий чувствовать 9 присутствие других клеток, как правило, осуществляется благодаря чувству кворума. Все стратегии колонизации филлосферы бактериями направлены на улучшение связи между филлобактериями через усиление транскрипции ряда генов, например, генов вирулентности и производства антибиотиков [Steven, 2003]. Общую модель листовой колонизации филлобактерий предложены Битти и Линдов (1999) и эта модель включает 8 этапов: 1) бактериальная иммиграция; 2) изменение среды обитания; 3) бактериальное деление; 4) образование микроколоний, 5) образование больших агрегатов; 6) вторжение внутрь растения; 7) трансформация местообитания и распределение бактерий; 8) выход на поверхность листьев. Считается, однако, что эти этапы могут варьировать в зависимости от различных видов бактерий. Формирование биопленок эпифитными бактериями. Эпифитные бактерии, как известно, отличаются способностью к выживанию и размножению на поверхности временному водному листьев, стрессу, способностью ультрафиолетовому противостоять облучению, экстремальным температурам и недостатку питательных веществ. Одной из лучших стратегий является образование биопленок, что приводит к образованию бактериальных сообществ [Pal, 2011]. Биопленки являются результатом агрегирования, микроколонизации прикрепленных к листовой и корневой поверхности, а также жгутам межклеточного пространства растительных тканей бактерии в биопленках, как известно, связаны с экзополимерной матрицей [Gabriele, 2014]. Первые исследования структур биопленок проводились в 1960-х-1970-х годах. Предложено три модели структуры биопленок. К ним относятся следующие: 1) водно-канальная модель; 2) мозаичная модель биопленки; возникает обычно на воднораспределительных трубках, похожая на первую модель; 3) модель «зубного налета» [Brian, 2011]. Это третья модель биопленки отличается высокой клеточной плотностью и возникает в богатой питательной среде, где бактерии находятся постоянно в жидкости [Gabriele, 2014]. Однако, 10 биопленки также могут существовать в водоненасыщенных условиях. Количество микроорганизмов, встречающихся на листовой поверхности биопленки, значительно ниже, чем в водонасыщенных системах. Следует отметить, что это, вероятно, связано с низкой доступностью питательных веществ [Emelia, 2014]. Штаммы P. fluorescens и Bacillus spp., как упоминалось ранее, являются эпифитными бактериями, которые играют важную роль во взаимодействии с повсеместно распространенными возбудителями болезней растений [Steven, 2003]. Штаммы P. fluorescens и E. herbicola являются эпифитными, обитающими на поверхности листьев. Эти бактерии обладают биологическим свойством подавлять грибковые, бактериальные возбудители болезней сельскохозяйственных культур и, как известно, могут использоваться в качестве агентов биоконтроля для риса и язв цитрусовых [Coutino, 2006]. 1.2 Использование бактерий для биоконтроля фитопатогенов Эпифитные микроорганизмы, размножаясь на поверхности растений, создают биологический барьер, препятствующий фитопатогенных микроорганизмов в растительные ткани, проникновению усиливая тем самым иммунитет растений. Ненормированное использование химических препаратов и внесение повышенных доз удобрений с целью увеличения урожая приводит к нарушению экологического равновесия и селекции резистентных форм возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. В связи с этим возрастает значение видов эпифитов-антагонистов, представляющих практический интерес для биологической защиты растений от болезней. В настоящее время использование микроорганизмов в качестве средств биоконтроля становятся все более важным и перспективным. Биопрепараты рассматриваются как альтернатива химической защиты растений от 11 насекомых, болезней и сорняков в сельском и лесном хозяйстве [Huang, 2012]. Следует отметить, что бактерии и грибы способны к синтезу большого спектра метаболитов с фунгицидной и антибактериальной активностью. Известно, что микотоксины и вторичные токсичные метаболиты, синтезирующиеся мицелиальными грибами, например Aspergillus spp. при соответствующих условиях окружающей среды могут привести к экономическим потерям и могут негативно влиять на здоровье человека. Грибковую контаминацию можно контролировать либо путем термообработки, либо химической обработкой. Очевидно, что лучше не использовать химические пестициды или фунгициды, чтобы избежать загрязнения почвы и многих других проблем со здоровьем. Поэтому микроорганизмы, выделяющие противогрибковые агенты, могут быть использованы в качестве агентов биоконтроля [Koo, 2009]. Механизмы биологического контроля. Примеры биологического контроля болезней растений достаточно хорошо изучены, что позволило определить механизмы, с помощью которых такой контроль осуществляется. Есть три типа антагонизма: антибиоз, конкуренция и эксплуатация [Huang, 2012]. Бактерии рода Bacillus типичные представители филлосферы и ризосферы растений, образуют эндоспоры. Различные штаммы рода Bacillus способны продуцировать ферменты, антибиотики, белки и вторичные метаболиты, которые стимулируют рост и вызывают механизмы защиты растений [Huang, 2012]. Микроорганизмы рода Bacillus являются агентами биоконтроля заболеваний растений. Huangи Tzeng [2012] показали, что Bacillus sp. используются для подавления болезней растений, вызываемыми различными микроорганизмами, в том числе Phytophthora medicaginis, Pythium torulosum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum sojae, Cronartium quercuum, orbiculare, Fusarium Xanthomonas 12 sp., Phytophthora oryzae, Pseudomonas syringae и Ralstonia solanacearum. Разные виды Bacillus были использованы как агенты биоконтроля: B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis. [Huang, 2012]. 1.3 Рост-стимулирующая активность эпифитных бактерий Использование на практике сельского хозяйства биологических препаратов, созданных на основе микроорганизмов, стимулирующих рост растений, является одним из приёмов, способствующих повышению урожая культурных растений [Pal, 2011]. Например, созданы препараты на основе PGPR-бактерий. Они оказывают положительное действие на растения. Известно, что PGPR-бактерии способны к синтезу веществ ауксиновой, гиббереллиновой, цитокининовой, антибиотической и антифунгальной природы [Ланкина с соавт., 2013]. Почвенные бактерии, которые способствуют росту растений, резобактерии, находятся вокруг и на поверхности корня и участвуют в стимуляции роста растений с помощью секреции различных регуляторных веществ в зоне ризосферы [Pal, 2011]. Эти ризобактерии помогают растениям напрямую через обеспечение питания растений или через синтез ростовых гормонов. Также эти бактерии могут косвенно уменьшить тормозящее действие различных болезнетворных микроорганизмов на рост и развитие растений. В настоящее время ризобактерии рассматриваются как альтернатива сельскохозяйственным химикатам, которые дестабилизируют агро-экосистемы и опасны для человека и животных. Ауксины представляют собой специфическую группу гормонов, которые стимулируют рост растительных клеток. Это первые растительные гормоны, которые были обнаружены. Была установлена их важная роль для роста растений. Они впервые были описаны голландским студентом Фрицем в 1926 г. Установлено, что одним из главных мест, где синтезируется ауксин является апикальная меристема [Pal, 2011]. Ауксин известен способностью инициировать формирование и организацию флоэмы и ксилемы. При 13 повреждении растения ауксин может инициировать клеточную дифференцировку и регенерацию сосудистой ткани. Он также помогает растительной клетке удлиняться в ответ на окружающую среду и участвовать в фототропизме, геотропизме и гидротропизме. Фототропизм – это рост растения в ответ на освещение [Pal, 2011]. Ауксин приводит к вытягиванию клеток на темной стороне стебля, поэтому растение изгибается в сторону источника света. Это помогает растению фотосинтезировать более интенсивно. Геотропизм – это когда ауксины удлиняют корни в глубь в землю, одновременно вытягивая клетки в стеблях вверх [Stijn, 2015]. Это помогает растению развить сильную подземная система поддержки и помогает растению получать питательные вещества, необходимые для выживания и развития. Удлинение клеток в стволе вверх помогает растению расти в высоту в сторону солнечного света. Семена обрабатывают ауксином, который повышает эффективность их проращивания. Также в садоводстве используются такие ауксины как NAA (naphthaleheaceticacid) и IBA (indole-3butyricacid), которые в основном применяются для стимуляции инициации роста корней при укоренении черенков растений [Stijn, 2015]. Показано, что многие эпифитные и ризосферные бактерии способны к синтезу ауксина – ндолил-3-уксусной кислоты (IAA), которая является основным естественным ауксином. Есть несколько путей биосинтеза IAA у бактерий. Известно также, что индол-3-уксусная кислота влияет на экспрессию генов в отдельных микроорганизмах и является сигнальной молекулой у некоторых микроорганизмов [Farrar, 2014]. Одной из стратегий защитной системы против фитопатогенных бактерий является негативная регуляция ауксинсигнализации. Было показано, что 80% бактерий, изолированных из ризосферы, способны синтезировать IAA. Аминокислота триптофан – является основным предшественником для синтеза IAA. Добавление триптофана в культуральную среду приводит к увеличению производства IAA. Пять различных путей описаны для синтеза IAA. Первый путь связан с 14 триптофаном. Биохимические и генетические методы были использованы для определения путей биосинтеза IAA [Toneilli, 2010]. Проведенные многочисленные исследования показали, что в одном микроорганизме могут присутствовать Например, есть многочисленные пути индол-3-ацетамидо биосинтеза который (IAM)-путь, ауксина. описан у нескольких патогенов и способствуют выработке больших количеств IAM. Например, такой механизм описан у бактерий Pantoea agglomerans, P. savastanoi, и Agrobacterium [Stijn, 2015]. Образование гиббериллинов свойственно эпифитным и ризосферным бактериям – представителям родов Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Clostridium. Гиббереллины стимулируют либо деление, либо растяжение клеток. Они способствуют также образованию определенных ферментов в семенах. Присутствие гиббереллинов делает возможным развитие партенокарпических, т. е. бессемянных плодов, развивающихся без оплодотворения. подавляют Гиббереллины дифференциацию стимулируют цветочных прорастание почек. Известно семян, но более 37 гиббереллинов [Christian, 2012]. 1.4 Характеристика бактерий рода Enterobacter Род Enterobacter – бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae. Они являются сапрофитами и находятся в почве, сточных водах, а также являются частью синантропной энтеральной флоры человеческого желудочно-кишечного тракта [Coutino, 2006]. Эти бактерии известны в качестве нозокомиальных возбудителей внутрибольничных инфекций. В сообщении Национальной системы эпиднадзора США приводятся данные о нозокомиальных бактериемиях с 1976 по 1989 год в США, где указывается, что на Enterobacter spp. приходится примерно 5% случаев нозокомиальной бактериемии. E.cloacae является главной проблемой для учреждений здравоохранения в глобальном масштабе [Toneilli, 2010]. 15 Enterobacter ludwigii – это грамотрицательные, факультативно- анаэробные, подвижные палочки с оптимальной температурой для роста 37 °С [Coutino, 2006]. Эти бактерии были выделены из различных объектов окружающей среды, а также клинических образцов (из мочи). В комплексе с Enterobacter cloacae может выступать в качестве патогенов, широко встречающихся в окружающей среде [Coutino, 2006]. Штаммы E. сloacae являются причиной нозокомиальных инфекций кровотока в последнее десятилетие. Эти микроорганизмы способны вырабатывать AmpC βлактамазы, кодируемые хромосомными, либо плазмидными генами. Виды рода Enterobacter могут также использоваться в качестве биопрепаратов в сельском хозяйстве [Peng, 2013]. Было показано, что E. ludwigii способствуют росту растений. Было продемонстрировано, что фиксация азота эндофитом Enterobacter spp. Р4-368 способствовала заселению корневых и стволовых структур растения J. Curcas. Обработка растений Enterobacter spp. Р4-368 привела к 49.0 %-ому увеличению среднего количество семян на одно растение и 20 % увеличению среднего веса одного семени растения в модельных опытах в горшках [Coutino, 2006]. Модифицированный штамм бактерий был в состоянии колонизировать корневую ткань и системно передвигаться в ткани стебля, но никаких бактерий не было обнаружено на листьях [Peng, 2013]. 1.5. Характеристика бактерий рода Lysinibacillus Бактерии рода Lysinibacillus - это грамположительные, палочковидные и круглые спорообразующие бактерии семейства Bacillaceae. Бактерии этого рода ранее рассматривались как члены рода Bacillus, но таксономический статус этих микроорганизмов был изменен на род Lysinibacillus в 2007 году. По сравнению с Bacillus, Lysinibacillus содержит лизин и аспартат в пептидогликане клеточной стенки как диагностические аминокислоты, в отличие от мезо-диаминопимеликовой кислоты рода Bacillus. Lysinibacillus обычно встречается в почве и выделяется из растительных тканей, из 16 ферментированных семян растений и даже из печени рыбы фугу [Tanja, 2011]. Экологические изоляты рода Lysinibacillus являются потенциальными агентами биологического контроля болезней, например, растение какао. Lysinibacillus boronitolerans представляют из себя клетки длиной в 3.0– 5.0 мкм и 0,8–1,5 мкм в диаметре. Ее колонии круглые, 2-3 мм в диаметре. Бактерии растут в широком диапазоне температуры - 16-45 °С, с оптимальным ростом при 37 °С. Рост отсутствует при Т⩾50 °C и небольшой рост наблюдается при 16 °C через несколько дней. Рост обычно наблюдается при рН 5.5–9.5, с оптимумом роста при рН 7.0–8.0. Бактерии вида L. tabacifolii были выделены из листьев Nicotiana tabacum. Штамм способен расти при рН 5.0-10.0, температуре 8-40°С и концентрации NaCl 0-7%. Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК показал, что данный штамм был тесно связан с родом Lysinibacillus, и его ближайшими родственниками были L. mangiferihumi и L. sphaericus. L. sphaericus – бактерия известная ранее также как Bacillus sphaericus, спорообразующая, устойчива к воздействию ультрафиолетового света, тепла и химических веществ. Эта бактерия может быть анаэробная при определенных условиях, но, как правило, это факультативный анаэроб. Недостаток питательных веществ приводит к формированию у L. sphaericus С3-41 спор. L. sphaericus был первоначально изолирован от личинок комаров в 1987 году в Китае [Saira, 2014]. Этот микроорганизм способен продуцировать инсектицидный токсин, аналогичный бактерии B. thuringiensis, следовательно, он может быть использован в качестве биопрепарата против насекомых. Этот организм важен для изучения, поскольку он используется в борьбе с насекомыми для сокращения популяции переносчиков таких опасных заболеваний как желтая лихорадка, малярия и вирус лихорадки Западного Нила [Katz et al., 2007]. Секвенирование генома этой бактерии увеличивает наше знание о них, а 17 также предлагает дальнейшее совершенствование важных агентов биологического контроля [Vanden, 2015]. Геном L. sphaericus С3-41 состоит из кольцевой хромосомы размером в 4,63 Мб и большой плазмиды размером 177642 п.о. Средний ГЦ состав плазмидной ДНК равен 33.10%, а хромосомной ДНК – 37.29%. В хромосоме идентифицированы 85 генов тРНК, организованных в 10 оперонов. L. sphaericus С3-41 - это мезофильные, почвенные бактерии. Они способны выжить, размножаться и выводиться из кишечника личинок комаров. Споры L. sphaericus являются алкалифильными, так как кишечник личинок комаров является щелочной средой (pH11). Бактерии являются токсичными для личинок комаров. Когда личинки комаров поглощают бактерии, они проникают в кишечник личинки, освобождают эндотоксин, личинки перестают питаться и погибают. Токсины способны образовывать кристаллические включения. Токсичность бактерий связана с экспрессией нескольких генов, которые функционируют как белки, которые, как известно, инициируют формирование спор. Большинство бактерий имеют свои гены токсинов, которые сгруппированы в хромосоме [Freitas, 2008]. Интересным является наличие бинарного токсина. BinA и BinB – бинарные токсины L. sphaericus С3-41. Именно эти бинарные токсины являются источником токсичности для личинки комаров. Отсутствие протеолитических ферментов и транспортных систем сахаров не позволяют патогенным для насекомых бактериям L. sphaericus метаболизировать полисахариды и использовать широкий спектр органических соединений и аминокислот. Когда клетки бактерии лишены питательных веществ, они образовывают эндоспоры. После образования спор, материнская клетка лизируется и освобождает споры в окружающую среду. Личинки комаров поедают эндоспоры L. sphaericus и погибают. Однако эти токсичные эндоспоры не влияют на взрослых комаров [Vanden, 2015]. В настоящее время L. sphaericus используется в коммерческих целях, для борьбы с личинками комаров. Определенные штаммы были разработаны 18 для коммерческих препаратов, которые используются для контроля популяций комаров. Коммерческий препарат на основе L. sphaericus известен как VectoLex [Coutino, 2006]. Он высокотоксичен для комаров рода Culex, для личинок комаров Anopheles и Aedes. Эти бактерии используются вместо химических веществ, которые оказывают пагубное влияние на водную флору и фауну, людей и животных. Иными словами, они идеально подходят для сельского хозяйства [Freitas, 2008]. В настоящее время предпринимаются усилия для повышения токсичности бактерий L. sphaericus. Проведенные эксперименты показали, что выращивание этой бактерии на среде с яйцом и желтком увеличивает токсичность и начало споруляции. Это приводит к экономии средств, укорочению времени ферментации, более высокой урожайности и увеличению биомассы по сравнению с обычными питательными средами [Coutino, 2006]. Таким образом, бактерии рода Lysinibacillus, широко распространенные в почве и на растениях могут быть использованы в качестве биопрепаратов для борьбы с различными вредителями или переносчиками инфекций человека и растений. 19 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследований Эпифитные бактерии выделяли с поверхности листьев и корешков здоровых образцов картофеля. Для этого раскладывали листья и корешки на поверхность агаризованной среды в чашки Петри и культивировали при 37 оС в течение 24-48 часов. Отбирали колонии вблизи листовой пластинки и корешков, вокруг которых наблюдали зону подавления роста других бактерий. Чистую культуру получали, рассевая изоляты на поверхность среды истощающим штрихом. 2.2 Штаммы бактерий В качестве тест культур фитопатогенных бактерий использовали штаммы Xantamonas campestris, Pectobacterium atroseptica, Serratia plymutica, Pseudomonas putida, Serratia rubidaca из музея лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии ферментов, КФУ. 2.3 Питательные среды и культивирование микроорганизмов Для культивирования использовали среду LB (Лурия-Бертани): триптон – 1.0%, дрожжевой экстракт – 0.5%, NaCl – 0.5%. Mолочная среда (skim milk powder): голодный агар 2%, сухое молоко 20%. Среды Гисса и МПА готовились из готовых сухих сред согласно прописи. Культивирование бактерий E. ludwigii и L. fusiformes проводили в колбах объёмом 100 и 1000 мл при соотношении объёма среды к объёму колбы 1:5 в термостате-шейкере с интенсивностью качания 200 об/мин. Культуру выращивали при температуре 37ºC. В качестве инокулята использовали 12 часовую культуру, выращенную на среде LB. Инокулят вносили в количестве 2% от объема среды. 20 2.4 Идентификация изолятов бактерий Чистую 18-часовую культуру, выращенную при 37° С идентифицировали на MALDIBioТyper (BrukerDaltonik). Исследование с помощью MALDI BioTyper осуществляется на основе сравнения полученного ряда их константных белков с базой данных. Видовая принадлежность определяется при значениях Score 2.300 ... 3.000. 2.5 Характеристика свойств штаммов бактерий 2.5.1 Изучение морфологии клеток Для сравнительной характеристики морфологии штаммов эпифитных E. ludwigii и L. fusiformes бактерии 18-24 час культур окрашивали по Граму и микроскопировали. 2.5.2 Протеазная и амилазная активность Для анализа протеазной активности двух исследуемых штаммов E. ludwigii и L.fusiformes мы использовали молочную среду. На среде с молоком посеяли оба штамма петлей. Посевы культивировали в термостате при температуре 37оС в течение 4 суток. О наличии протеазной активности судили по зоне просветления среды вокруг колонии. Для исследования способности штаммов гидролизовать крахмал, использовали среду МПА с 1% крахмалом. Бактерии сеяли штрихом и культивировали в течение 1-3 сут при 37о С. Для выявления амилазной активности поверхность среды с выросшей культурой заливали раствором Люголя. О наличии активности судили по зоне просветления вокруг колонии. 2.6 Чувствительность бактерий к антибиотикам Для анализа чувствительности двух штамма Enterobacter ludwigii и к антибиотикам использовали дискодиффизионный метод. Использовали диски со следующими антибиотиками: ампициллин, полимиксин, канамицин, гентамицин, карбеницилин, нитрофурантоин, нолидиксовая цефтазидин, кислота, доксициклин, ципрофлоксацин, азитромицин. 21 цетаксин, амикацин, цефазомин, нитроксолин, С помощью дозатора вносили 100 мкл 12-14 часовой культуры (плотность суспензии доводили до 0.5 опт. ед.) исследуемых штаммов на поверхность среды LB и сеяли газоном. Через 10 минут раскладывали диски с соответствующими антибиотиками на газон исследуемых штаммов. Культуры инкубировали в термостате при температуре 37оС в течение 20-24 часов. Измеряли диаметр зоны подавления роста бактерий. 2.7 Исследование антагонистической активности Антагонистическую активность штаммов E. ludwigii и L. fusiformes в отношении фитопатогенных бактерий исследовали методом перпендикулярных штрихов. Для этого к штриху E. ludwigii и L. fusiformes через 24 час культивирования подсевали перпендикулярным штрихом бактерии-фитопатогены. Антагонистическую активность оценивали по зоне подавления роста фитопатогена. 2.8 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с использованием стандартного пакета MicrosoftOfficeExcel путем расчета среднеквадратичного отклонения (σ). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении σ<10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая P<0.05 за достоверный уровень значимости. 22 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Выделение и идентификация бактерий Микрофлора растений составляет неотъемлемую часть внешней среды. Растения населены широким спектром различных микроорганизмов (эпифитных, эндофитных и ризосферных), обладающих антагонистической и/или рост-стимулирующей активностью. Картофель – важнейшая продовольственная, техническая и кормовая культура. Картофелеводству наносят ущерб многочисленные болезни и вредители, уничтожающие значительную часть урожая. Наряду с химическими препаратами для борьбы и профилактики микробных инфекций сельскохозяйственных культур в настоящее время все большее используется биопрепаратов. В настоящее время, например, на рынке представлены различные препараты фитогормонов естественного (Прорастин, Полистин, Фумар) на основе происхождения цитокининов) в сочетании с гуминовыми природными веществами, и (ауксинов, гибберелинов, фульвокислотами, обладающими свойствами, и комбинацией штаммов ризосферных а также бактерицидными и эпифитных микроорганизмов – антагонистов фитопатогенов [Sagova-Mareckova et al., 2015]. Использование сельскохозяйственных альтернативой биологического вредителей использованию и контроля болезней пестицидов. в отношении является эффективной Известно, что пестициды накапливаются в растениях и тем самым наносят вред живым организмам. Различные микроорганизмы могут быть использованы в качествеагентов биоконтроля. Так антибиотики, производимые бактериями, выделенными из растительной микрофлоры вносит важный вклад в подавление илиингибирование роста фитопатогенов [Егоров, 2004]. В настоящей работе выделение бактерий из эпифитной микрофлоры картофеля проводили с целью оценки потенциала использования этих штаммов в качестве биологических агентов в отношении фитопатогенов. Мы 23 выделяли бактерии с вегетативных органов картофеля – листьев и корешков, для чего раскладывали их на поверхности МПА в чашке Петри (рисунок 1). Вокруг листьев и корешков наблюдали бактериальный рост. Для дальнейшего анализа отбирали колонии бактерий, вокруг которых была зона подавления роста других культур. Нами было выделено 2 штамма. Рисунок 1 – Схема выделения бактерий филлосферы и ризосферы картофеля. Для получения чистой культуры бактерии многократно рассевали методом штриха на поверхности МПА. Исследовали морфологию и грампринадлежность чистых культур выделенных бактерий окрашивая препараты по Граму. Как видно из таблицы 1 и рисунка 2, изолят 1 имеет грамположительный, а изолят 2 – грамотрицательный морфотип клеточной стенки. Бактерии идентифицировали на MALDIBioТyper (Bruker Daltonik) (таблица 1). Cистема MALDI BioТyper позволяет идентифицировать микроорганизмы по их белковому составу, в основном по рибосомальным белкам, которые уникальны для всех микроорганизмов. Программное обеспечение анализирующее эти белки, позволяет надёжно и точно проводить идентификацию микроорганизмов получаемых масс-спектров бактерий с базой данных. 24 путём сопоставления Видовая и родовая принадлежность бактерий определяется по величине Score Values (вероятное определение значения) (таблица 2). Таблица 1 – Идентификация бактерий на MALDIBioТyper № 1 2 Название Enterobacter ludwigii Lysinibacillus fusiformes Таблица 2 Грампринадлежность – Источник выделения Корни Score Value 2,424 + Листья 2,000 – Интерпретация результатов идентификации на MALDIBioТyper Спектр Описание Символы Цвет 2.300 ... 3.000 высокая вероятность идентификации вида ( +++ ) зелёный 2.000 ... 2.299 надёждная вероятность идентификации рода ( ++ ) зелёный 1.700 ... 1.999 возможная вероятность идентификации рода (+) жёлтый 0.000 ... 1.699 не точная идентификация (-) красный Таким образом, морфологических на основе Мaldi-анализа свойств была определена и исследований видовая принадлежность отобранных штаммов. Изолят из ризосферы был идентифицирован как E. ludwigii; изолята с поверхности листа – L. fusiformes. 3.2 Характеристика морфологии E. ludwigii и L. fusiformes и способности секретировать гидролазы В работе исследовали свойства двух штаммов эпифитных бактерий E. ludwigii и L. fusiformes, выделенных с листьев и корней. Род Enterobacter бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae. Они являются сапрофитами и находятся в почве, сточных водах, а также являются частью синантропной энтеральной флоры человеческого желудочно-кишечного 25 тракта [Tanja, 2011]. Lysinibacillus - это грамположительные, палочковидные и круглые спорообразующие бактерии семейства Bacillaceae. Организмы этого рода ранее рассматривались как члены рода Bacillus. Lysinibacillus обычно встречается в почве и выделяется из растительных тканей, из ферментированных семян растений и даже из печени рыбы фугу [Tanja, 2011].Мы исследовали морфологию бактерий двух штаммов E. ludwigii и L. fusiformes с помощью окраски по Граму и микроскопии. Результаты представлены на рисунке 2. E. ludwigii L. fusiformes Рисунок 2 – Микроскопия эпифитных штаммов E. ludwigii и L. fusiformes. Окраска по Граму. Как видно из рисунка 2, бактерии L. fusiformes имеют полочковидную форму и окрашиваются по граму положительно. Клетки E. ludwigii имеет форму мелких коккобацилл и окрашиваются грам-отрицательно. Известно, что бактерии, живущие на поверхности растений, могут выделять широкий спектр различных метаболитов с самыми разнообразными свойствами: гидролитические ферменты, стимуляторы роста и др. [Brain, 2011]. 26 антимикробные соединения, Мы исследовали протеазную и амилазную активность штаммов E. ludwigii и L. fusiformes. Протеазную активность определяли по расщеплению казеина, используя среду с молоком (рисинок 3 .1). Известно, что эта среда обычно используется, чтобы продемонстрировать наличие внеклеточной протеазной активности у микроорганизмов. Для определения амилазной активности мы использовали МПА с 1% крахмалом (рисунок 3.2). 1 2 2 протеаза 1 амилаза Рисунок 3 – Внеклеточная протеазная и амилазная активность штаммов L. fusiformes (1) и E.ludwigii (2) на молочной среде и среде с крахмалом соответственно. Как видно из рисунка 3, через 2 суток культивирования вокруг колоний только L. fusiformes появилась зона гидролиза. Это означает, что L. fusiformes обладают экзогенным ферментом, расщепляющим молочный белок (казеин). E. ludwigii не обладает экзогенным протеолитическим ферментом. Бактерии L. fusiformes секретирует в среду амилазу, а E. ludwigii не содержат экзофермент, расщепляющий крахмал (рисунок 3). 3.3 Чувствительность к антибиотикам штамма E. ludwigii Исследовали антибиотикам чувствительность диско-диффузионным штамм эпифитных методом. Мы бактерий к исследовали чувствительность E. ludwigii к 17 различным антибиотикам (рисунок 4). 27 Использовали полимиксин, диски со следующими антибиотиками: гентамицин, карбеницилин, азитромицин, ампицилин, цефатаксин, цефтазидин, рифампицин, цефазолин, амикацин, ципрофлоксацин, доксициклин, нитроксолин, нолидиксовая кислота, нитрофурантоин, канамици. Показали, что штамм E. ludwigii устойчив к ампицилину, карбеницилину, азитромицину, цефазолину, цефтазидину, ципрофлоксацину, нитрофурантоину. Результаты представлены в таблице 3. Русунок 4 - Чувствительность штамма и E. ludwigii к антибиотикам. Дискодиффузионный метод. Таким образом, эпифитные штаммы, выделенные с поверхности корешков картофеля, проявляют резистентность к антибиотикам разных групп. Так E. ludwigii устойчивы к антибиотикам групп пенициллинов, цефалоспоринов и макролидов и может быть отнесен к мультирезистентным штаммам. 3.4 Способность штаммов L. fusiforems и E. ludwigii к антагонизму в отношении бактериальных фитопатогенов Исследовали способность штаммов эпифитных бактерий ингибировать рост бактериальных фитопатогенов Serretia rubidaca, Pseudomonas putida, Xanthamonas campestris и Pectobacterium astrosepticum (таблица 4). 28 Таблица 3 – Чувствительность штамма E. ludwigii к антибиотикам Класс антибиотиков и антимикробных соединений Антибиотики Чувствительность/ Резистентность Enterobacter ludwigii Аминогликозиды 1. Канамицин S Пенициллины 2. Амикацин 3. Гентамицин 4. Ампициллин 5. Карбеницилин 6. Азитромицин S S R R R 7. Олеандомицин R 8. Цефотаксин R 9. Цефтазидин R 10. Цефазолин R Синтетические антибактериальные соединения 11. Нитроксолин S 12. Нитрофурантоин R Хинолоны/фторхинолоны 15. Ципрофлоксацин S 16. Нолидиксовая кислота 17. Полимиксин S Макролиды и азалиды Цефалоспорины Другие антибиотики S Таблица 4 – Aнтагонистическая активность в отношении бактериальных фитопатогенов Штаммы Lysinibacillus fusiformes Enterobacter ludwigii Xanthamonas campestris - Pectobacterium atrosepticum - Pseudomonas putida ++ Serratia rubidaca ++ - - ++ ++ 29 Использовали метод перпендикулярных штрихов. Показали, что штаммы L. fusiforems и E. ludwigii обладают умеренной способностью ингибировать рост колоний фитопатогенных бактерий P. putida и S. rubidaca. 3.5 Способность штаммов L. fusiformes и E. ludwigii к синтезу ауксина – индолил-уксусной кислоты Известно, что как растения, так и некоторые бактерии способны синтезировать ауксин. Ауксины представляют собой специфическую группу гормонов, которые стимулируют рост растительных клеток. Индолилуксусная кислота (IAA) – это первый растительный гормон, который был обнаружен и была доказана его рост стимулирующая активность. Одним из главных мест, где образуется ауксинявляетсяапикальная меристема [Stijn, 2015]. Доказана способность ауксина инициировать формирование и организацию флоэмы и ксилемы. При повреждении растений ауксин может инициировать в нем клеточную дифференцировку и регенерацию сосудистой ткани. Мы исследовали биосинтез IAA в бактериальной культуре эпифитных штаммов L. fusiformis и E. ludwigii. Бактерии культивировали на среде LBили среде LB cдобавлением триптофана. Известно, что триптофан является индуктором синтеза ауксина. Результаты представлены на рисунке 5. Результаты наших исследований показали, что с E. ludwigii синтезируют ауксин – индолил-уксусную кислоту (IAA). Установлено, что биосинтез IAA стимулируется триптофаном на ранних стадиях роста культуры (рисунок 5). Кроме того, показано, что количество ауксина в среде повышается по мере культивирования и достигает максимальных значений на 3 сутки роста культур. 30 ОД600, опт. ед, мл.л Lynsinibacillus fusiformes 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 L.bacillus без трип L.bacillus c трип 0 20 40 60 80 время, час Enterobacter ludwigii 0,25 OD600, опт. ед, мл.л 0,2 0,15 0,1 E.lud без трип 0,05 E.lud c трип 0 0 20 40 60 80 время, час Рисунок 5 – Динамика синтеза ауксина штаммами L. fusiformes и E. ludwigii. В культуральной жидкости E. ludwigii при росте на среде с триптофаном содержание ауксина на 24 час роста в среде гораздо выше, чем на среде без триптофана. Однако на 48 и 72 часы роста уровень ауксина в 31 культуральной среде практически на одном уровне присутствия триптофана в среде независимо от культивирования. Это может свидетельствовать о том, что триптофан приводит к более раннему синтезу и накоплению ауксина на ранних стадиях роста бактерий и не влияет на накопление ауксина в среде культивирования на поздних стадиях роста бактерий. В культуральной жидкости L. fusiformes ауксин накапливался на очень низком уровне на обоих средах. По-видимому, штамм L. fusiformes не способен к эффективному синтезу индолил-уксусной кислоты. Таким образом, штамм ризосферных бактерий E. ludwigii, выделенный из корешков картофеля, способен к синтезу ауксина, что может оказывать ростстимулирующий эффект на растения. Известно, что индолил-уксусная кислота стимулирует рост корневой системы растений. Штамм бактерий L. fusiformes, относящийся к филлосферной микрофлоре, не способен к эффективному синтезу ауксина. 32 ВЫВОДЫ 1) С листьев и корней картофеля выделены штаммы бактерий, идентифицированных как Lysinibacillus fusiformes и Enterobacter ludwigii. 2) Бактерии штамма L. fusiformes обладают внеклеточной амилазной и протеазной активностью. 3) Штамм E. ludwigii устойчив к антибиотикам групп пенициллинов, цефалоспоринов и макролидов. 4) Штаммы L. fusiformеs и E. ludwigii проявляют антагонистическую активность в отношении бактериальных фитопатогенов Serretia rubidaca и Pseudomonas putida. 5) Штамм E. ludwigii способен к синтезу индолил-уксусной кислоты. Уровень ИУК в культуральной жидкости максимален на 3 сутки, на ранней стадии роста биосинтез ауксина индуцируется триптофаном. Штамм L. fusiformes не синтезирует ауксин. 33 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Демченко, Е.В., Влияние сельскохозяйственной культуры и экологогеографической зоны произрастания на состав эпифитной микрофлоры зерна [Текст] /Демченко Е.В., Вершинина Е.В., Петрова А.Е. // Успехи современного естествознания. – 2004. - Т.7. – С.95-96. 2. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках [Teкст] / Егоров, Н.С. //МГУ: Наука, 2004. - 528с. - ISBN: 5-211-04669-2. 3. Ланкина, Е. П. Перспективы использования смешанных культур психрофильных и психротолерантных бактерий в биологической защите растений от болезней [Текст] / Е. П. Ланкина, С. В. Хижняк, С. П. Кулижский // Вестник КрасГАУ. - 2013. - Т.4. - С.101-105. 4. Mоргун, В. В. Ростстимулирующиеризобактерии и их практическое применение [Текст] / В. В. Моргун, С. Я. Коць, Е. В. Куценко // Физиология и биохимия культ. растений. - 2009. - Т.41. - С.187-207. 5. Coutiho, T.A. Epiphytic and endophytic members of the enterobacteriaceae associated with healthy trees [Text] / T.A Coutiho, S.N. Venter // University of Pretoria － 2006.－ P. 7. 6. Christian, O. Production of Indole-3-Acetic Acid via the Indole-3Acetamide Pathway in the Plant-Beneficial Bacterium Pseudomonas chlororaphis O6 Is Inhibited by ZnO Nanoparticles but Enhanced by CuO Nanoparticles [Text] / O.Christian, J.Z. Dimk, E.M Joan , W.B David, Z. Jixun, J. A.Anne // Applied and Environmental Microbiology － 2012.－ V. 78. －N.5. －P. 1404 – 1410. 7. Emelia, A.D. Ecological Succession and Stochastic Variation [Text] / M. Loïs, A.D Emelia , E.C Meghan, A. M. Eren, L. Sheri // Simmons – 2014. – V. 5. – N.1. 34 8. Erika, T. Draft Genome Sequence of Entomopathogenic [Text] / T. Erika, I. Kazuhiro, M. Hiroaki, M. Kazuki, A. Taiki, T. Kousuke, Y. Chisa, M.L. Jae, K.Takahiro // Genome Announc. – 2014. – V. 3. – N.3. – P.1. 9. Farrar, K. Understanding and engineering beneficial plant- microbe interactions: plant growth promotion in energy crops [Text] / K. Farrar, D. Bryant, N. Cope-Selby // Plant Biotechnol J.-2014. - V. 12, No. 9. - P. 1193-1206. 10. Freitas, D. Genotypic and phenotypic diversity of Bacillus spp. isolated from steel plant waste [Text] /D.Freitas, M. Reis, C.Lima-Bittencourt, P. Costa, P. Assis, E. Chartone-Souza, A. Nascimento // BMC Res Notes. 2008. - V.1, No.92. - P.1 - 11. 11.Gabriele, B. Unraveling the plant microbiome: looking back and future perspectives [Text] / B. Gabriele, G. Martin, S. Micheal, Kornelia. S // Front Microbiol. – 2014. –V.158. –N3. 12. Huang, T. DNA polymorphisms and biocontrol of Bacillus antagonistic to citrus bacterial canker with indication of the interference of phyllosphere biofilms [Text] / T. Huang, D. Tzeng, A. Wong, C. Chen, K. Lu, Y. Lee, W. Huang, B. Hwang, K. Tzeng // PLoS One. –2012. – V.7 – N.7. – P.1 – 11. 13. Igbeneghu, O.A. Multiple antibiotic-resistant bacteria [Text] / O.A.Igbeneghu,A.B. Abdu. // J Health Popul Nutr. – 2014. – V.32. –N. 2. – P.176-182. 14. Koo, S.Y. Isolation and Characterization of a Plant Growth-Promoting bacteria [Text / S.Y.Koo, S.C. Kyung // Journal Microbiol Biotechnol. – 2009. – V 19. – N11. – P. 1431–1438. 15. Khalid, A. Screening plant growth-promoting bacteria for improving growth and yield of wheat [Text] / A. Khalid, M. Arshad, Z.A. Zahir // Journal of Applied Microbiology – 2004. – V.96. – N.3 – P. 473–480. 16.Maurizio, L. Quorum Sensing-Controlled Biofilm [Text] / L.Maurizio Labbate , Y.Q. Shu , S.K. Kai, A. R. Scott, G. Michael, K. Staffan // Journal. Bacteriol. – 2004. – V. 186. – N.3 – P. 692-698. 35 17. Micheal, G. Two Separate Regulatory Systems Participate in Control of Swarming Motility of pathogens [Text] / G. Michael, S. Jorgen, E. Leo, W.L. Peter, B.C. Allan, C. Gunna, M. Soren, K. Staffan // Journal of Bacteriology– 1998. –V. 180. – N.3. – P. 742–745 18. Matthew, F. Bacterial Swarming: A Model System for Studying Dynamic Self assembly [Text] / F. Matthew, Copeland, B.W. Douglas // NIH Public Access. –2009. –V.5. – V.6. P. 1174–1187 19. Leveau, J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts [Text] / K. Meyer, J. Leveau // Oecologia. – 2012. – V. 168. – V. 3. – P. 621 – 629 20.Pal, K. K. Biological Control of Plant Pathogens biofilms [Text] / K.K Pal, B. G.McSpadden // The Plant Health Instructor – 2011. 21.Peng, A.Distribution of Endophytic Bacteria in Alopecurusaequalis Sobol and Oxalis corniculata L. from Soils Contaminated by Polycyclic Aromatic Hydrocarbons [Text] / A. Peng, J. Liu,Y. Gao, Z. Chen // PLoS One. - 2013. - V. 9, No. 12. - P. 1 - 10. 22.Pizzirani, K. Diversity of propanil-degrading bacteria isolated from rice rhizosphere and their potential for plant growth promotion [Text] / K. Pizzirani, I.S. Mel // Genet Mol Res. – 2012. – V. 11. – N. 3. – 2021-2034. 23. Roberto, L. F. Bacterial spot and early blight biocontrol by epiphytic bacteria in plants [Text] / L. F. Roberto, S. R. Reginaldo da, A. Eduardo // Pesquisa Agropecuária Brasileira －2010. －V. 45. － N. 12. 24. Sagova-Mareckova, M. Determination of Factors Associated with Natural Soil Suppressivity to Potato Common Scab [Text] / M. Sagova-Mareckova, O. Daniel, M. Omelka, V. Kristufek, J. Divis, J.Kopecky // PLoS ONE. – 2014. – V. 10, No.1. – P.1-13. 25. Stijn, S. Auxin and Plant-Microbe Interactions [Text] / S. Stijn, V.Jos // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology – 2015. V.4. – N.3 26. Saira, А. Genetic, physiological and biochemical characterization of Bacillus sp. strain RMB7 exhibiting plant growth promoting and broad 36 spectrum antifungal activities [Text] / A. Saira, H. Sohail, I. Asma, I. Mazhar, L. George // Plant. Microbial Cell Factories – 2014. – V.144. – N.13. 27.Steven, E. L. Microbiology of the Phyllosphere [Text] / E. L Steven, T. Maria, L. Brand // Applied and environmental microbiology －2003. －V. 69.－N. 4. －P. 1875-1883. 28. Tanja, B. Antimicrobial Activity of Bacillus sp. Natural Isolates and Their Potential Use in the Biocontrol of Phytopathogenic Bacteria [Text] / B. Tanja, K. Milan, S. Slavi, T. Ljub, D. Giuliano, M. Michael, V. Vittorio, F. Djordje // Journal－ 2011. 29. Tonelli, M.L. Selection and in vitro characterization boicontrol agents with potential to protect peanut plants against fungal pathogens [Text] / M.L. Tonelli, T. Taurian, F. Ibáñez, J. Angelini, A. Fabra // Journal of Plant Pathology － 2010. － V.92.－ N. 1. － P. 73-82. 30. Vorholt, J. Microbial life in the phyllosphere [Text] / J. Vorholt // Nat Rev Microbiol. – 2012. – V. 12. – N. 10. – P. 828 – 840. 31. Vanden, P. The importance of the microbiome of the plant holobiont [Text] / k. P. Vanden, A. Quaiser, M. Duhamel, A. Le Van, A. Dufresne // New Phytologist. – 2015. – V.186. – N. 6. – 1196–1206. 37