Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук На правах рукописи КОКОУЛИН МАКСИМ СЕРГЕЕВИЧ Структурное исследование О-антигенных полисахаридов отдельных представителей морских грамотрицательных бактерий методом спектроскопии ЯМР 02.00.10-Биоорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научные руководители: к.х.н., доцент Командрова Надежда Алексеевна д.х.н., ст. науч. сотр. Калиновский Анатолий Иванович ВЛАДИВОСТОК – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ…………………………... 4 ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………... 7 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР……………………………………….... 13 1.1 Общая характеристика липополисахаридов……………………... 13 1.2 Структуры О-антигенов морских грамотрицательных бактерий. 19 1.2.1 Класс Gammaproteobacteria……………………………………….. 20 1.2.1.1 Семейство Vibrionaceae……………………………………………. 20 1.2.1.2 Семейство Pseudoalteromonadaceae………………………...…….. 25 1.2.1.3 Семейство Shewanellaceae………………………………………… 33 1.2.1.4 Семейства Moraxellaceae, Idiomarinaceae, Alteromonadaceae, Oceanospirillaceae………………………………………………….. 35 1.2.2 Класс Flavobacteriia………….………………………………...…... 38 1.2.3 Класс Alphaproteobacteria…………………………………………. 40 1.3 Спектроскопия ЯМР в исследовании углеводов………………… 42 1.3.1 Одномерная спектроскопия ЯМР…………………………………. 43 1.3.2 Двумерная спектроскопия ЯМР…………………………………... 48 1.4 Липополисахариды морских грамотрицательных бактерий как антагонисты эндотоксинов……………….……………………….. 52 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…………………………… 56 2.1 Структурное исследование О-специфического полисахарида Сobetia pacifica KMM 3879T….………………………………….... 58 2.2 Структурное исследование О-специфического полисахарида Сobetia pacifica KMM 3878………………………………...…….... 67 2.3 Структурное исследование О-специфического полисахарида Rheinheimera pacifica КММ 1406T……………………….…….….. 76 2.4 Структурное исследование О-специфического полисахарида Idiomarina abyssalis КММ 227T………………………….…….….. 87 3 2.5 Структурное исследование О-специфического полисахарида Litorimonas taeanensis G5T………………………………………… 99 2.6 Структурное исследование О-специфического полисахарида Echinicola vietnamensis КММ 6221Т………………………………. 111 2.7 Цитокин-индуцирующая активность липополисахаридов............ 119 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ……………………………….. 122 3.1 Приборы и материалы……………………………………………... 122 3.2 Микроорганизмы и условия их культивирования, удаление капсульного материала и обезжиривание бактериальной биомассы…………………………………………………………..... 124 3.3 Выделение липополисахаридов………………………………….... 125 3.4 Электрофорез в полиакриламидном геле………………………… 125 3.5 Выделение О-специфических полисахаридов……………...……. 126 3.6 Компонентный анализ……………………………………………... 126 3.7 Химические методы модификации и расщепления полисахаридов……………………………………………………… 129 3.8 Спектроскопия ЯМР……………………………………………….. 130 3.9 Цитокин-индуцирующая и цитотоксическая активности ………. 130 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………….. 132 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………… 134 4 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ГЖХ – газожидкостная хроматография ДСН – додецилсульфат натрия ИЛ – интерлейкин КПС – капсульный полисахарид КССВ – константа спин-спинового взаимодействия ЛПС липополисахарид ЛСБ – липополисахарид-связывающий белок МС – масс-спектрометрия ОПС О-специфический полисахарид ПААГ полиакриламидный гель ФНО – фактор некроза опухоли ЭПС – экзополисахарид ЯМР – ядерный магнитный резонанс ЯЭО – ядерный эффект Оверхаузера 2S,8S-AlaLys – 2-[(S)-1-карбоксиэтил]амино-L-лизин (аланинолизин) 2,4HO3,3,4MePro-5-oxo – 2,4-дигидрокси-3,3,4-триметил-5-оксопролин 4еLeg – 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-D-глицеро-D-тало-нон-2-улозоновая кислота 6dxylHexN-4-ulo – 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-ксило-гексоз-4-улоза 6dTal4Ac – 4-О-ацетил-6-дезокси-талоза 8eLeg – 8-О-ацетил-5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро-D-галакто-нон-2улозоновая кислота Ac – ацетат Ala – аланин Am – ацетимидат Ara арабиноза Ara4N 4-амино-4-дезокси-арабиноза Ara2,3,4N – 2,3,4-триамино-2,3,4-тридезокси-арабиноза 5 Col – 3,6-дидезокси-L-ксило-гексоза (колитоза) COSY – Correlation Spectroscopy DEPT – Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DQF – Double Quantum Filtering Fo – формиат FucN – 2-амино-2,6-дидезокси-галактоза Fuc3N – 3-амино-3,6-дидезокси-галактоза Fuc4N – 4-амино-4,6-дидезокси-галактоза FucN4N – 2,4-диамино-2,4,6-тридезокси-галактоза Gal – галактоза GalA галактуроновая кислота GalNA – 2-амино-2-дезокси- галактуроновая кислота GD – Gated Decoupling Glc – глюкоза GlcN 2-амино-2-дезокси-глюкоза GlcN3N 2,3-диамино-2,3-дидезокси-глюкоза GlcN3NA – 2,3-диамино-2,3-дидезокси-глюкуроновая кислота Gly – глицин Gro – глицерин GroN – 2-амино-1,3-пропандиол (2-аминоглицерин) GulN3NA – 2,3-диамино-2,3-дидезокси-гулуроновая кислота Н2ВС – Heteronuclear 2 Bond Correlation Hb – гидроксибутират Hep гептоза HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC – Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation HSQC – Heteronuclear Single-Quantum Coherense IdoA – идуроновая кислота Kdo 3-дезокси-D-манно-октулозоновая кислота 6 Man манноза ManNA – 2-амино-2-дезокси-маннуроновая кислота ManN3NA – 2,3-диамино-2,3-дидезокси-маннуроновая кислота Mal – малонат MTPA – α-метокси-α-трифторметил-α-фенилацетилхлорид Neu – 5-амино-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновая кислота NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Pp – пропионат Pse – 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро-L-манно-нон-2-улозоновая кислота Pyr – пируват QuiN – 2-амино-2,6-дидезокси-глюкоза Qui3N – 3-амино-3,6-дезокси-глюкоза Qui4N – 4-амино-4,6-дидезокси-глюкоза QuiN4N – 2,4-диамино-2,4,6-тридезокси-глюкоза Rha – рамноза RhaN3N – 2,3-диамино-2,3,6-тридезокси-манноза Rib-ol – рибит ROESY – Rotating-frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Ser – серин She – 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-4-С-(3′-карбоксамид-2′,2′-дигидроксипропил)D-галактоза S-2HOGlt – (S)-2-гидроксиглутаровая кислота Thr – треонин TOCSY – Total Correlation Spectroscopy Yer – 3,6-дидезокси-4-C-(1-гидроксиэтил)-D-ксило-гексоза (иерсиниоза) 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Химическое изучение биополимеров, образующих поверхность бактериальной клетки, является одной из важнейших проблем современного естествознания, которая состоит в изучении молекулярных основ взаимодействия живых клеток друг с другом и с окружающей средой. Решение этой проблемы представляет не только теоретический интерес, но является также актуальной практической задачей, потому что имеет прямое отношение к познанию таких биологических явлений как иммунитет к инфекционным возбудителям, тканевая несовместимость, злокачественный рост ткани, проникновение вируса в живую клетку и т.д. Липополисахариды (ЛПС) или эндотоксины являются одними из основных компонентов внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий и представляют собой специфический класс биополимеров, которые обладают широким спектром биологического действия [1]. Они являются антигенами бактериальной клетки; играют важную роль в определении специфичности каналов, ответственных за транспорт необходимых для роста клетки веществ; защищают ее от летального действия детергентов, ядов, некоторых антибиотиков; являются рецепторами для ряда специфических бактериофагов и бактериоцинов; играют ключевую роль в процессах межклеточного узнавания. Многие патофизиологические проявления грамотрицательных инфекций, в том числе септический шок, ассоциированы с уникальными, эндотоксическими свойствами этих углеводсодержащих биополимеров [2, 3]. Биологические свойства молекулы ЛПС определяются своеобразной химической структурой составляющих его компонентов: О-специфического полисахарида (ОПС), олигосахарида кора и липида А. Тонкие вариации в структуре О-специфических полисахаридных цепей определяют серологическую специфичность грамотрицательных бактерий и могут использоваться в качестве молекулярной основы при создании внутривидовых классификационных схем микроорганизмов. Липид А является эндотоксическим центром молекулы ЛПС и отвечает за большинство физиологических и патофизиологический реакций, 8 обусловленных воспалительным процессом, вызванным грамотрицательными микроорганизмами, таких как летальная токсичность, пирогенность, адъювантность, митогенная стимуляция и др. Несмотря на значительный прогресс в области структурного анализа полисахаридов, антигены грамотрицательных бактерий исследованы крайне неравномерно. Наряду с довольно хорошо изученными полисахаридными антигенами патогенных и условно-патогенных бактерий, существуют менее изученные и совсем неизученные роды микроорганизмов. К последним можно отнести практически все микроорганизмы морского происхождения, хотя по количеству и разнообразию они не уступают наземным формам бактерий. Микробные ценозы океана, как древнейшие на земле, включают особые, иногда лишь им присущие таксоны микроорганизмов, которые формировались на протяжении длительного периода эволюции. Микроорганизмы, находясь в весьма специфических условиях обитания, таких как открытые воды морей и океанов (низкая температура, высокое гидростатическое давление, соленость, циркуляция водных масс, низкие концентрации органических веществ) или морской шельф (резкие изменения температуры и солености, активное перемешивание, влияние приливных волн, наземных стоков и радиации), отличаются от наземных форм рядом приспособительных особенностей. Прежде всего, это относится к клеточной стенке бактерий, которая играет определяющую роль во взаимодействии микроорганизма с окружающей средой. Кроме того, они способны синтезировать физиологически активные соединения, отличные от тех, которые синтезируют наземные бактерии [4]. Имеющиеся на данный момент в мировой литературе результаты структурных исследований показывают, что клеточные стенки морских грамотрицательных бактерий различных родов и видов продуцируют антигены уникального строения. Эти биополимеры содержат необычные кислые моносахариды, N-ациламино- и N-ацилдиаминосахара, кетосахара, высшие моносахариды, а также различные заместители неуглеводной природы, как распространенные в природе, так и не найденные в других источниках [5-8]. 9 Изучение липополисахаридов направлено на решение таких фундаментальных задач, как классификация бактерий, выяснение взаимосвязи между структурой и функцией липополисахаридов, в том числе механизмов иммунного ответа к ним. Структура О-антигенов может служить в качестве одного из хемотаксонамических критериев, позволяющих устанавливать филогенетическое родство и прослеживать пути эволюции микроорганизмов. Знание строения ЛПС имеет важное практическое значение для создания искусственных вакцин и антибактериальных средств, включая препараты, изменяющие чувствительность бактерий к антибиотикам. Особое место в решении этих задач занимают ЛПС морских грамотрицательных бактерий, которые, в отличие от ЛПС наземных бактерий, часто проявляют низкую токсичность и могут быть потенциально активными субстанциями при разработке новых эффективных иммуномодуляторов и лекарственных средств, направленных на предотвращение септического шока [9, 10]. Таким образом, грамотрицательных структурные бактерий исследования являются одной из О-антигенов морских актуальных проблем современной биоорганической химии. Необходимость ее решения стимулирует создание новых эффективных методов, совершенствующих арсенал инструментов структурного анализа сложных углеводов, что позволяет открывать новые биологически важные моносахариды и их производные. Цели и задачи исследования. Цель исследования: установить строение Оантигенов отдельных представителей ранее неизученных морских грамотрицательных бактерий родов Cobetia, Rheinheimera, Idiomarina (класс Gammaproteobacteria), Litorimonas (класс Alphaproteobacteria) и Echinicola (тип Bacteriodetes) и оценить биологическую активность ЛПС из указанных выше морских микроорганизмов. Для реализации цели в ходе исследования было необходимо решить следующие задачи: 1. Выделить ЛПС из 6 штаммов 5 родов ранее неизученных микроорганизмов: Cobetia pacifica KMM 3879T, C. pacifica KMM 3878, Rheinheimera pacifica 10 КММ 1406T, Idiomarina abyssalis KMM 227T, Litorimonas taeanensis G5T, Echinicola vietnamensis КММ 6221Т. 2. Выделить О-антигенные полисахариды и определить их моносахаридный состав. 3. Установить полную структуру повторяющихся звеньев О-антигенных полисахаридов для всех исследуемых микроорганизмов. 4. Оценить цитотоксическую и цитокин-индуцирующую активности выделенных ЛПС. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые выделены и установлены полные структуры ОПС из 6 штаммов 5 родов морских грамотрицательных бактерий: C. pacifica KMM 3879T, C. pacifica KMM 3878, R. pacifica КММ 1406T, I. abyssalis KMM 227T, L. taeanensis G5T и E. vietnamensis КММ 6221Т. Среди них обнаружены три новых сульфатированных ОПС из морских бактерий C. pacifica KMM 3879T, C. pacifica KMM 3878 и I. abyssalis KMM 227T. В составе ОПС C. pacifica KMM 3878 идентифицирован дисульфатированный моносахарид − 2,3-О-дисульфат-D-галактоза; ОПС I. abyssalis KMM 227T содержит 3-(4-гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-Dглюкозу, сульфатированную по второму положению. Оба производных моносахаридов впервые обнаружены в природе. ОПС L. taeanensis G5T содержит моносахарид 2-ацетиламино-2,6-дидезоксиL-гексоз-4-улозу, впервые обнаруженный в природе, и редкий для бактериальных полисахаридов компонент (3S,5S)-3,5-дигидроксигексановую кислоту. Для установления конфигурации асимметрических центров (3S,5S)-3,5- дигидроксигексановой кислоты был применен метод Мошера, который впервые использован в структурной химии углеводов. Впервые изучена иммуностимулирующая активность ЛПС C. pacifica KMM 3879T, C. pacifica KMM 3878, R. pacifica КММ 1406T, I. abyssalis KMM 227T, L. taeanensis G5T и E. vietnamensis КММ 6221Т. Установлено, что все исследованные ЛПС не токсичны в диапазоне концентраций от 0.01 до 100 мкг/мл. Показано, что ЛПС всех бактерий являются слабыми индукторами провоспалительных 11 цитокинов, таких как ФНО- и ИЛ-6 и представляют интерес с точки зрения изучения их антагонистических свойств. В дальнейшем, возможно, они могут быть использованы в качестве потенциально активных субстанций при разработке новых эффективных иммуномодуляторов и лекарственных средств, направленных на предотвращение септического шока. Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на 5-й Балтийской конференции по микробным углеводам (Суздаль, Россия, 2012), 1-м Симпозиуме по морским ферментам и полисахаридам (Нячанг, Вьетнам, 2012), 2-й Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, Россия, 2014), 6-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, Россия, 2014). Личный вклад соискателя. Автор лично участвовал в планировании экспериментов, обсуждении полученных результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций. Выделение и очистка ЛПС и ОПС, химические анализы, запись и интерпретация ЯМР-спектров проводились автором лично или при его непосредственном участии. Основные положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Морские грамотрицательные бактерии C. pacifica KMM 3879T и C. pacifica KMM 3878, (класс Gammaproteobacteria) продуцируют различные по структуре сульфатированные ОПС. В составе О-антигенного полисахарида C. pacifica KMM 3878 впервые обнаружен в природе остаток 2,3-Одисульфат-D-галактозы, а также остаток 3,4-О-[(S-карбоксиэтиледен)]-Dгалактозы − редкий для бактериальных гликанов компонент. 2. Глубоководные морские грамотрицательные бактерии R. pacifica КММ 1406T и I. abyssalis KMM 227T, (класс Gammaproteobacteria) продуцируют высокоаминированные кислые О-антигенные полисахариды. В составе ОПС R. pacifica КММ 1406T одновременно присутствуют D- и L- изомеры 2ацетиламино-2-дезокси-галактуроновой кислоты. ОПС I. abyssalis KMM 227T содержит впервые обнаруженный в природе остаток 3-(4- 12 гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-D-глюкозы, сульфатированный по второму положению. 3. В составе О-антигенного полисахарида морской грамотрицательной бактерии L. taeanensis G5T, (класс Alphaproteobacteria), впервые идентифицирован остаток 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-L-гексоз-4-улозы, а также обнаружен редкий моносахарид 2-ацетиламино-4-[(3S,5S)- дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-D-глюкоза. 4. ОПС морской бактерии E. vietnamensis КММ 6221Т, (тип Bacteroidetes), построен из разветвленных тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих в своем составе остатки 2-ацетиламино-2-дезокси-D-глюкозы, D-глюкуроновой кислоты, D-галактозы и остаток редкого моносахарида колитозы. 5. ЛПС C. pacifica KMM 3879T, C. pacifica KMM 3878, R. pacifica КММ 1406T, I. abyssalis KMM 227T, L. taeanensis G5T и E. vietnamensis КММ 6221Т не обладают цитотоксической активностью в диапазоне концентраций от 0.01 до 100 мкг/мл. и являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-α и ИЛ-6. Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи в зарубежных рецензируемых журналах и 7 тезисов в материалах научных конференций. 13 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Общая характеристика липополисахаридов ЛПС представляют собой уникальный класс биополимеров, являющихся специфическими компонентами клеточной оболочки грамотрицательных бактерий. В комплексе с белками и фосфолипидами они располагаются на внешней поверхности наружной мембраны, способствуя сохранению ее целостности и стабильности, и принимают непосредственное участие во взаимодействии бактерий с окружающей средой. ЛПС обладают широким спектром биологических свойств, из которых наибольшее внимание исследователей привлекают токсичность и антигенность, поэтому их часто называют, в зависимости от контекста, бактериальными эндотоксинами или соматическими антигенами [11]. ЛПС грамотрицательных бактерий имеют целый ряд общих особенностей. Молекула полностью достроенного ЛПС (S-форма) содержит гидрофобную часть, называемую липидом А, к которой через олигосахарид кора присоединяется ОПС, построенный из повторяющихся олигосахаридных звеньев. Такая структура ЛПС характерна для большинства встречающихся в природе диких штаммов бактерий, образующих колонии гладкой формы. Потеря в процессе биосинтеза ОПС приводит к появлению шероховатых колоний, и их ЛПС (R-форма) содержит только липид А и олигосахарид кора. На поверхности клеточной стенки гладких штаммов бактерий, наряду с молекулами ЛПС S-формы, присутствуют также и молекулы ЛПС R-формы. Кроме того, часть молекул ЛПС S-формы имеет Оантиген, который представлен только одним олигосахаридным фрагментом (SRформа). Такого рода гетерогенность имеет биологическое значение, так как благодаря именно этому достигается более плотная упаковка молекул ЛПС на клеточной поверхности, обеспечивая защиту бактериальной клетки от проникновения вредных для ее жизнедеятельности веществ. Еще одной возможной причиной гетерогенности ЛПС является присутствие некоторых компонентов в нестехиометрическом количестве, таких, например, как О- 14 ацетильные или фосфатные группы или моносахаридные остатки, присоединенные в виде боковых цепей [12, 13]. Липид А является наиболее консервативной частью молекулы ЛПС. У большинства изученных на сегодняшний день бактерий, гидрофильная основа липида А представлена -(1→6)-связанным дисахаридом 2-амино-2-дезокси-Dглюкозы (-D-GlcN-(1→6)-α-D-GlcN, диаминогенциобиоза), фосфорилированного в положения О-1 восстанавливающего остатка α-D-GlcN и О-4’ невосстанавливающего остатка -D-GlcN. Первый моносахарид кора – 3-дезоксиD-манно-октулозоновая кислота (Kdo) или его 3-гидроксилированное производное присоединяется к невосстанавливающему остатку -D-GlcN в положение О-6’. Один или оба остатка GlcN могут быть заменены 2,3-диамино2,3-дидезокси-D-глюкозой (D-GlcN3N) [1-3,12-14]. В литературе также имеется информация о структурах липида А, углеводный остов которых представлен три-, тетра- и пентасахаридами, в составе которых были обнаружены, помимо вышеназванных моносахаридов, D-галактуроновая кислота (D-GalA), D-манноза (D-Man) и гептоза (Hep) [15, 16]. Липофильные свойства липиду А придают остатки жирных кислот, ацилирующие аминогруппы и некоторые гидроксильные группы углеводного остова. Среди кислот, N-ацилирующих моносахариды, наиболеее часто встречаются (R)-3-гидрокси-, 3-оксо- и (R)-3-ацилоксиалкановые кислоты. Еще большее разнообразие наблюдается среди О-ацилирующих кислот: обычно это неразветвленные насыщенные кислоты, реже разветвленные насыщенные или неразветвленные ненасыщенные алкановые кислоты, содержащие от 10 до 22 атомов углерода, а также их (S)-2-окси-, (R)-3-окси- и (R)3-ацилоксипроизводные. Кроме того, в составе липида А присутствуют «необязательные» компоненты, такие как 4-амино-4-дезокси-L-арабиноза (LAra4N), D-GlcN, D-Man, D-арабиноза (D-Ara), 2-аминоэтилфосфат и некоторые другие [14-16]. Липид А играет важную роль в организации и функционировании внешней мембраны. Он имеет жесткую конформацию, при которой цепи жирных кислот находятся по одну сторону дисахаридной основы. Эти цепи ориентированны 15 перпендикулярно внешней мембране клеточной стенки и образуют ее наружный слой, удерживаемый за счет гидрофобных взаимодействий с внутренним фосфолипидным слоем [12]. Липид А ответственен за целый ряд патофизиологических процессов, вызываемых ЛПС в организме млекопитающих, в частности, за его токсические свойства, такие как пирогенность, летальная токсичность, опухолевый некроз, способность вызывать локальную реакцию Шварцмана и эндотоксинную толерантность. Кроме того, липид А обладает адъювантной и митогенной активностями, стимулирует пролиферацию и секрецию иммуноглобулинов, усиливает фагоцитоз, активируя комплемент и макрофаги [2, 3, 12, 14]. Исследования синтетических аналогов липида А показали, что для проявления большинства токсических свойств (летальная токсичность, митогенная и гемолитическая активности, способность вызывать эндотоксинную толерантность) достаточно присутствия диаминогенциобиозы, ацилированной (R)-3-окситетрадекановой кислотой в положения N-2, N-2′, O-3 и O-3′, а фосфатные группы и их «необязательные» заместители не являются необходимыми. Пирогенность и способность вызывать локальную реакцию Шварцмана связаны с негидроксилированными кислотами, О-ацилирующими 3оксиалкановые кислоты, а антикомплементарная активность в значительной степени зависит от аггрегации липидных молекул. Для проявления максимальной эндотоксической углеводного активности остова, важным является фосфорилированного в наличие положения дисахаридного О-1 и О-4’ и ацилированного шестью остатками жирных кислот с длиной цепи 12-14 атомов углерода (гексаацилированный липид А) [17]. Кор выполняет роль связующего звена между липидом А и ОПС и представляет собой довольно большой олигосахарид. Образующие кор моносахариды группируются в два участка: гексозный, удаленный от липида А, и внутренний, построенный из гептоз и Kdo. У многих бактерий внутренний участок кора представлен тетрасахаридом L-α-D-Hep-(1→3)-L-α-D-Hep-(1→5)-[αKdo-(2→4)]-α-Kdo, в котором моносахаридные остатки могут быть замещены 16 другими сахарами, остатками фосфорной кислоты, ацетильными группами, этаноламином или аминокислотами. Некоторые ЛПС включают биосинтетический предшественник L,D-Hep D-глицеро-D-манно-гептозу (D,DHep). Другие могут содержать только D,D-Hep либо не содержать гептоз вообще. Фосфатные группы и этаноламин необязательно присутствуют в стехиометрическом количестве. Внутренняя область кора за счет присутствия Kdo и фосфатных групп концентрирует на себе отрицательный заряд, что позволяет молекулам ЛПС через двухвалентные катионы и полиамины связываться с другими компонентами наружной мембраны, обеспечивая ее целостность и стабильность. Мутации бактерий, сопровождающиеся снижением содержания фосфатных групп, приводят к потере способности внешней мембраны служить барьером для антибиотиков [18, 19]. Моносахаридный состав внешней области кора более разнообразен, чаще всего она включает такие распространенные сахара как D-глюкоза (D-Glc), Dгалактоза (D-Gal), 2-ацетиламино-2-дезокси-D-глюкоза (D-GlcNAc) а иногда и другие моносахариды. Следует отметить, что разделение кора на две области в соответствии с моносахаридным составом не является абсолютно строгим. Так L,D-Hep может входить не только во внутреннюю, но и во внешнюю область кора, и, напротив, во внутренней области обнаруживают, кроме гептоз и Kdo, также и другие моносахариды, например, D-Glc, D-Gal, L-рамнозу (L-Rha), DGlcN, L-Ara4N, присутствующих в виде боковых ответвлений [18, 19]. Кор ЛПС также играет важную роль в жизнедеятельности бактерий. Наличие кора, представленного хотя бы одним моносахаридом, является необходимым условием жизнеспособности микроорганизма. Оно существенно для проявления некоторых биологических свойств липида А, в частности, митогенности. Это связано с увеличением подвижности углеводородных цепей липида А в присутствии кора, что облегчает принятие ими биологически активной конформации, и стабилизацией этой активной конформации. В Rмутантных бактериях, у которых О-специфическая полисахаридная цепь ЛПС отсутствует, кор принимает на себя функции соматического антигена. Антитела, 17 полученные к R-штаммам бактерий, специфичны также к соответствующим Sштаммам благодаря присутствию, как уже говорилось ранее, на поверхности клетки наряду с S-формами и R-форм ЛПС [19]. Структурная вариабильность кора, как правило, выше вариабельности липида А, но по сравнению с О-антигеном, эта область ЛПС может рассматриваться как довольно консервативная. С точки зрения состава и структуры ОПС является наиболее вариабельным компонентом ЛПС. Повторяющиеся звенья ОПС представляют собой линейные или разветвленные олигосахариды, чаще всего включающие от двух до восьми моносахаридов, хотя известны и большие по величине звенья, а также полисахариды с моносахаридным повторяющимся звеном (гомополимеры). Длина полисахаридной цепи может варьироваться от одного повторяющегося звена до 50 и более звеньев. Моносахаридный состав ОПС чрезвычайно разнообразен. Среди них нейтральные сахара, амино- и диаминосахара, уроновые кислоты, дезокси- и дидезоксисахара, высшие и разветвленные моносахариды, как распространенные в природе, так и не найденные в других источниках. Кроме того, полисахаридные цепи ЛПС часто содержат неуглеводные заместители, присоединенные простой эфирной, сложноэфирной или ацетальной связями по гидроксильным группам и аминогруппам моносахаридов, карбоксильной группой а уроновых также связанные кислот. амидной Природа, связью с последовательность, аномерная конфигурация и тип замещения индивидуальных моносахаридных остатков внутри повторяющейся единицы является характерным и уникальным для каждого ЛПС. В силу разнообразия компонентов и их связей возможно существование большого количества структур О-специфических цепей, что находит свое подтверждение в природе [1, 12, 13, 20, 21]. Полисахаридная цепь ЛПС является носителем иммунологической специфичности бактериальной клетки, иными словами, каждому, серологически отличному от другого, S-штамму бактерий соответствует О-специфический полисахарид со своей собственной уникальной структурой. Согласно 18 современным представлениям иммунологические детерминанты (О-факторы) определяются выделяется сродством регулярной небольшими олигосахаридными иммунодоминантный к активному структуре центру моносахарид, фрагментами, в обладающий наибольшим специфического полисахарида О-антитела. которых Благодаря иммунодетерминантные участки многократно повторяются вдоль полимерной цепи, образуя поливалентный антиген. В процессе эволюции происходит изменение состава и структуры Оцепей ЛПС, что приводит к развитию все новых О-специфических активностей на клеточной поверхности бактерий. Необходимые для роста и размножения бактерии липид А и присоединенная к нему зона внутреннего кора оказываются недоступными для узнавания клетками хозяина [1-3, 13]. Химическое строение ОПС имеет большое значение, поскольку именно они играют особо важную роль в процессе взаимодействия, как с вирусом, так и с организмом человека, обуславливая специфичность антигенных и фагоцитарных свойств микроорганизмов. Олигосахаридные детерминанты внутри повторяющихся единиц функционируют как рецепторы для бактериофагов, которые могут разрушать полисахарид посредством индуцированных или связанных с фагом ферментов [2, 3, 13]. Большое разнообразие О-антигенов является результатом генетических вариаций в структуре генных кластеров, участвующих в процессе биосинтеза ОПС, а также за счет различных генов профага, которые вызывают дополнительные изменения, такие как гликозилирование боковыми моносахаридами или O-ацетилирование. При биосинтезе полисахаридов сначала образуется так называемое «биологическое» повторяющееся звено, а затем происходит полимеризация всей цепи. В случае гомогликанов и некоторых гетерогликанов (состоящих из дисахаридных повторяющихся звеньев) возможен альтернативный путь биосинтеза, при котором происходит постепенное наращивание полисахаридной цепи путем переноса отдельных моносахаридных единиц. В последнее время было показано, что во многих гетерогликанах первый моносахарид повторяющегося звена ОПС, который переносится на липидный 19 носитель, тем самым инициируя биосинтез О-антигена, является производным 2амино-2-дезоксигексозы или 2-амино-2,6-дидезоксигексозы имеющей D-глюкоили D-галакто-конфигурацию [20]. Большинство структурных исследований посвящено определению только «химического» повторяющегося звена, которое может совпадать с «биологическим» или отличаться от него в результате циклических перестановок моносахаридных компонентов. 1.2 Структуры О-антигенов морских грамотрицательных бактерий Грамотрицательные бактерии являются важнейшим компонентом морских экосистем, ареалы их обитания весьма разнообразны и охватывают прибрежные и открытые акватории океанов, глубоководные и гидротермальные впадины, грунты; помимо свободноживущих форм микроорганизмов, некоторые виды бактерий способны колонизировать внешние оболочки и внутренние поверхности морских животных и растений. Отдельные группы микроорганизмов образуют высоко специфические симбиотические взаимосвязи с организмом хозяина [4]. Экстремальные условия морской среды обитания находят свое отражение в устройстве клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в частности, в таком ее важном компоненте, как ЛПС. У большинства изученных морских грамотрицательных бактерий сохраняется общая архитектура молекулы ЛПС, т.е., как и в случае наземных микроорганизмов, молекула ЛПС построена из липида А, олигосахарида кора и О-специфической цепи. Отличительной особенностью молекул липида А морских бактерий является их низкая степень ацилирования и фосфорилирования, низкое содержание жирных кислот, характерных для липида А наземных бактерий, присутствие в некоторых случаях разветвленных 3гидрокси- и ненасыщенных жирных кислот [10]. Немногочисленная информация о структурах олигосахарида кора морских микроорганизмов свидетельствует о том, что они также отличаются от таковых для наземных бактерий. Для них характерны более короткие олигосахаридные цепи с большим суммарным отрицательным зарядом [6, 7]. 20 Общей особенностью большинства О-антигенных полисахаридов морских грамотрицательных бактерий является их кислый характер, присутствие редко встречающихся моносахаридов и их этерифицированных или амидированных производных. Анионный характер ОПС морских бактерий, скорее всего, связан с процессом адаптации к морской окружающей среде, поскольку наличие отрицательно заряженных участков в полисахаридной цепи способствует ионному взаимодействию с катионами двухвалентных металлов. Эти ионные мостики делают более компактной общую упаковку мембраны, обеспечивая тем самым большую устойчивость бактериальной клетки к внешним факторам морской среды [6, 7]. В настоящем литературном обзоре обобщены сведения о структурных исследованиях ОПС морских бактерий, принадлежащих к родам Vibrio, Alivibrio, Listonella, Pseudoalteromonas, Shewanella, Alteromonas, Microbulbifer, Marinomonas, Idiomarina и Psychrobacter класса Gammaproteobacteria, Arenibacter, Cellulophaga, Tenacibaculum класса Flavobacteriia и Sulfitobacter класса Alphaproteobactera. 1.2.1 Класс Gammaproteobacteria 1.2.1.1 Семейство Vibrionaceae Представители семейства Vibrionaceae образуют одну из доминирующих групп морской среды и составляют значительную часть морских гетеротрофных бактериальных популяций. Некоторые их виды патогенны для человека, рыб, отдельных беспозвоночных и их личинок. Существующие на сегодняшний день данные позволяют утверждать, что морские представители семейства Vibrionaceae продуцируют ЛПС с очень необычными и интересными структурами полисахаридных цепей. Галофильные морские грамотрицательные бактерии Vibrio vulnificus являются патогенными микроорганизмами для некоторых видов рыб и вызывают ряд серьезных заболеваний у человека. На основании фенотипических характеристик, изоляты бактерий V. vulnificus подразделяются на три биотипа, 21 которые все являются условно патогенными для человека. Штаммы биотипа 1 наиболее часто изолируют из клинических образцов, штаммы биотипа 2 являются патогенными в основном для угрей [22-24]. Заболевания людей в большинстве случаев связывают с употреблением в пищу зараженных данным микроорганизмом морепродуктов. В составе ОПС микроорганизмов V. vulnificus (Таблица 1) были обнаружены такие производные моносахаридов, как 2,4-диацетиламино-2,4,6-тридезокси-Dглюкоза кислота (D-QuiNAc4NAc), (L-GalNAmA) 2-ацетимидоиламино-2-дезокси-L-галактуроновая и 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкуронамид, ацетилированный по второй и ацилированный остатком яблочной кислоты (Mal) по третьей аминогруппам (D-GlcNAc3N(R-Mal)AN). Таблица 1. Структуры ОПС V. vulnificus. Микроорганизм Структура V. vulnificus YJ016 →3)-α-L-GalpNAmA-(1→3)-β-D-QuipNAc4NAc-(1→3) 4 -α-L-Fucp-(1→3)-α-D-GlcpNAc-(1→ (биотип 1) [25] ↑ 1 β-D-GlcpNAc6Ac V. vulnificus CECT 5198, →4)--D-GlcpNAc3N(R-Mal3Aс)AN-(1→4) S3-I2-36 (биотип 2) [26] V. vulnificus CECT 4602 (биотип 2) [28] -α-L-GalpNAmA-(1→3)-α-D-QuipNAc-(1→ β-L-RhapNAc3N(S-3Hb) 1 ↓ 3 →4)-α-D-GlcpNAc-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3) -β-D-GlcpNAc-(1→ Интересно отметить, что полисахариды V. vulnificus CECT 5198 и S3-I2-36 [26] имеют схожую структуру с ОПС морской бактерии Pseudoalteromonas rubra ATCC 29570T [27]. Отличием является ацетилирование остатка L-GalNAmA в третье положение, другая абсолютная конфигурация остатка яблочной кислоты и замена остатка 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-D-глюкозы (D-QuiNAc) его 22 биосинтетическим предшественником 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-D-ксилогексоз-4-улозой (D-6dxylHexN-4-ulo) (Таблица 3). Главной особенностью полисахарида V. vulnificus CECT 4602 [28] является наличие необычного компонента 2-ацетиламино-(3-гидроксибутаноил)-амино2,3,6-тридезокси-L-маннозы (β-L-RhapNAc3NHb). Ранее N-диацетилированное производное этого моносахарида было найдено в составе ОПС Proteus penneri O66 [29] и капсульного полисахарида (КПС) Escherichia coli K48 [30]. Бактерии Vibrio ordalii и Listonella anguillarum (ранее Vibrio anguillarum) являются одними из важнейших патогенных микроорганизмов для некоторых промысловых видов рыб семейств лососевых и тресковых [31]. Среди множества штаммов бактерий L. anguillarum, заболевания рыб в большинстве случаев вызывают микроорганизмы, отнесенные к серогруппам O:1 и O:2. На основании данных реакции агглютинации с кроличьей сывороткой, полученной против L. anguillarum O:2, некоторые штаммы V. ordalii были классифицированы как патогены серогруппы O:2 [32]. В состав ОПС (Таблица 2) этих бактерий входят остатки редко встречающихся производных моносахаридов: 2-формиламино-2-дезокси-D- галактуроновой кислоты (D-GalNFoA), 2-ацетиламино-3-(N-формил-L-аланил)амино-2,3-дидезокси-D-глюкуронамида (D-GlcNAc3N(L-Ala2Fo)AN), ацетиламино-3-(N-ацетил-L-аланил)-амино-2,3-дидезокси-D-глюкуронамида GlcNAc3N(L-Ala2Ac)AN), 2(D- 3-ацетимидоил-2-ацетиламино-2,3-дидезокси-D- глюкуроновой кислоты (D-GlcNAc3NAmA), 2,3-диацетиламино-2,3-дидезокси-Lгулуроновой кислоты (L-GulNAc3NAcA), 3-ацетимидоил-2-ацетиламино-2,3дидезокси-D-маннуроновой кислоты (D-ManNAc3NAmA), 2,4-диацетиламино2,4,6-тридезокси-D-галактозы (D-FucNAc4NAc), 3-ацетиламино-3,6-дезокси-Lглюкозы (L-Qui3NAc). Кроме того, они содержат остатки 4-амино-4,6-дидезоксиD-глюкозы (D-Qui4N), амидированной остатком 2,4-дигидрокси-3,3,4-триметил-5оксопролина (2,4HO3,3,4MePro-5-oxo) и 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-D-глюкозы (D-QuiNAc) этерефицированной остатком пропионовой кислоты (Pp). 23 Таблица 2. Структуры ОПС V. ordalii и L. anguillarum. Микроорганизм Структура повторяющегося звена ОПС V. ordalii O:2 →4)--D-GlcpNAc3N(L-Ala2Fo)AN-(1→4) (MT 601) [32] --D-GlcpNAc3NAmA-(1→4) -α-L-GulpNAc3NAcA-(1→3)--D-6dxylHexpN-4-ulo-(1→ L. anguillarum O:2a →4)--D-GlcpNAc3N(L-Ala2Fo)AN-(1→4) (ATCC 19264) [33] --D-ManpNAc3NAmA-(1→4) -α-L-GulpNAc3NAcA-(1→3)--D-QuipNAc4NAc-(1→ L. anguillarumO:2b [35] →4)--D-GlcpNAc3N(L-Ala2Ac)AN-(1→4) --D-ManpNAc3NAmA-(1→4) -α-L-GulpNAc3NAcA-(1→3)--D-QuipNAc4NAc-(1→ L. anguillarum (1282) [35] -D-GlcpNAc3N(L-Ala2Fo)4AcAN-(1[→4) --D-GlcpNAc3N(L-Ala2Fo)AN-(1→4) --D-ManpNAc3NAmA-(1→4)--D-Quip3NAc-(1→3) -α-D-FucpNAc4NAc-(1→] L. anguillarum (SJ40T) [36] L. anguillarum (V-123) [37] -L-Quilp3NAc4Me-(1[→4)--L-Quilp3NAc-(1→4) --L-Quip3NAc-(1→)] 2 ↑ 1 α-D-QuipNAc3/4Pp →3)-α-D-GalpNAcAN-(1→4)-α-D-GalpNFoA-(1→3) -α-D-QuipNAc-(1→3)--D-Quip4N-(1→ 4 ↑ 1 2,4HO3,3,4MePro-5-oxo Единственным отличием ОПС L. anguillarum O:2а [32] от L. anguillarum O:2b [33] является заместитель по аминогруппе остатка L-Ala. Серологическая реакция между микроорганизмами L. anguillarum O:2а (ATCC 19264) и V. ordalii O:2 (MT 601), по мнению исследователей, вызвана присутствием в составе О- 24 антигенов обоих микроорганизмов остатков D-GlcNAc3N(L-Ala2Fo)AN и LGulNAc3NАcA. Также следует отметить, что структура О-антигенного полисахарида L. anguillarum O:2 (ATCC 19264) является практически идентичной структуре ОПС V. cholerae O8, за исключением того, что 2,3-диамино-2,3дидезокси-D-маннуроновая кислота находится в форме амида и несет другой заместитель по третьему положению [34]. Патогенный микроорганизм L. anguillarum (1282), классифицированный на основании серологических, биохимических и генетических характеристик как атипичный изолят, продуцирует ОПС, имеющий общий структурный элемент с ОПС L. anguillarum O:2a (ATCC 19264): →4)--D-GlcpNAc3N(L-Ala2Fo)AN(1→4)--D-ManpNAc3NAmA-(1→ [35]. Одной из главных отличительных особенностей ОПС L. anguillarum (1282) является то, что моносахаридный остаток на невосстанавливающем конце полисахаридной цепи ацетилирован по четвертому положению. О-антигенный полисахарид L. anguillarum (SJ40T) [36] является единственным среди бактериальных гликанов, содержащим остаток пропионовой кислоты. Как и в случае L. anguillarum (1282), для его ОПС характерна микрогетерогенность: моносахаридный остаток, на невосстанавливающем конце полисахаридной цепи, метилирован по четвертому положению. Повторяющееся звено ОПС L. anguillarum (V-123) [37] имеет общий структурный фрагмент с ОПС Pseudomonas aeruginosa IID 1008 (ATCC 27584): αD-GalpNAcAN-(1→4)-α-D-GalpNFoA-(1→3)-α-D-QuipNAc [38]. Амидированные остатком 2,4-дигидрокси-3,3,4-триметил-5-оксопролина производные моносахаридов в составе бактериальных гликанов более не найдены. Люминесцентные бактерии Alivibrio fischeri (ранее Vibrio) известны как симбионты гавайского кальмара бобтейла − Euprymna scolopes. Будучи локализованными в специализированном органе, эти бактерии играют важную роль в жизнедеятельности моллюска, помогая ему охотиться и обеспечивать защитный камуфляж [39, 40]. Структурное изучение ЛПС дикого штамма A. fischeri ES114 показало, что повторяющееся звено его ОПС представлено одним 25 пентасахаридом, состоящим из двух остатков 3,6-дидезокси-4-C-(1- гидроксиэтил)-D-ксило-гексозы (иерсиниозы, Yer), двух остатков 2-ацетиламино2,6-дидезокси-L-галактозы (L-FucNAc) и одного остатка 5,7-диацетиламино3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновой кислоты (8-эпи- легионаминовая кислота, 8eLeg5Ac7Ac) [41]: α-Yer-(1→4)-α-8eLeg5Ac7Ac-(2→3)--FucNAc-(1→3)--FucNAc-(1→ 8 ↑ 1 α-Yer Производные иерсиниозы и 8-эпи-легионаминовой кислоты впервые были обнаружены в составе О-антигенов представителей родов Yersinia и Legionella соответственно, в честь которых и получили свои тривиальные названия [42, 43]. Важно отметить, что наличие единственного повторяющегося звена ОПС в составе ЛПС A. fischer ES114, как было показано исследователями, играет важную роль в процессе колонизации микроорганизмами тканей животного-симбионта. 1.2.1.2 Семейство Pseudoalteromonadaceae Род Pseudoalteromonas, семейства Pseudoalteromonadaceae, был образован в 1995 году на основании ревизии гетерогенного рода Alteromonas и, на данный момент, включает в себя 43 вида (www.bacterio.net). Грамотрицательные бактерии рода Pseudoalteromonas представляют собой облигатные морские бактерии, широко распространенные в морской среде и выделяемые из различных морских источников. Бактерии это рода привлекают внимание исследователей тем, что продуцируют широкий набор биологически активных соединений, таких как антибиотики, токсины и антитоксины, антиопухолевые и антимикробные вещества, а также широкий спектр ферментов [44, 45]. С точки зрения строения ОПС, бактерии рода Pseudoalteromonas являются наиболее изученными среди морских микроорганизмов (Таблица 3). 26 Идентичные О-антигенные полисахариды тетродотоксин-продуцирующей бактерии P. tetraodonis IAM 14160Т и бактерии P. carrageenovora IAM 12662T, изолированных из образца кожи рыбы Фугу [46] и с поверхности красной водоросли, соответственно, [47], содержат редкий среди бактериальных полисахаридов моносахарид 3,6-дидезокси-L-ксило-гексозу (колитоза, Col). Интересно отметить, что гексасахаридное повторяющееся звено данных полисахаридов содержит аналогичный тетрасахаридный фрагмент α-Colp(1→2)-βD-Galp-(1→3)-[α-Colp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc, что и О-антиген Aeromonas enteropelogenes 1354 [48] и КПС Vibrio cholerae O139 [49]. Общий терминальный тетрасахаридный фрагмент является «колитозным» аналогом антигенной детерминанты групповых веществ крови Lewisb: α-L-Fucp-(1→2)-β-D-Galp(1→3)–[α-L-Fucp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc. Еще один идентичный фрагмент: Colp(1→2)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc, содержит ОПС Providencia alcalifaciens O6: H6 (2634) [50]. Микроорганизм P. atlantica, так же как и P. carrageenovora IAM 12662T, был изолирован из образца красной водоросли. Главной особенностью его ОПС является наличие высшего моносахарида тетрадезокси-L-глицеро-L-манно-нон-2-улозоновой диацетилированное производное 5,7-диацетиламино-3,5,7,9кислоты псевдоаминовой (Pse5Ac7Ac, кислоты) [51]. N- Другое производное псевдоаминовой кислоты 5-ацетиламино-3,5,7,9-тетрадезокси-7формиламино-L-глицеро-L-манно-нонулозоновая кислота (Pse5Ac7Fo) было идентифицировано в ОПС другого представителя рода Pseudoalteromonas P. distincta КММ 638Т [52]. Оба производных моносахарида редко обнаруживают в природе. Группа из семи штаммов, включая типовой штамм P. aliena KMM 3562T, была выделена из проб морской воды, взятых в Амурском заливе Японского моря вблизи Владивостока. По своим свойствам выделенные штаммы были близки штамму бактерии P. distincta KMM 638T, изолированному из образца морской глубоководной губки. Однако дальнейшие исследования показали, что эти бактерии необходимо отнести к отдельному виду P. aliena [53]. 27 Отличительной особенностью ОПС P. aliena KMM 3562T [54] является присутствие в его составе амидов D-GlcA и 2-ацетиламино-2-дезокси-Dманнуроновой кислоты (D-ManNAcA) с аминокислотой L-серином (L-Ser). Если первое производное моносахарида было обнаружено в составе ОПС P. alcalifaciens O60 [55] и КПС E. сoli K40, K54 и K96 [56, 57], то амид D-ManNAcA с L-Ser в составе бактериальных полисахаридов более не обнаружен. Микроорганизм Pseudoalteromonas sp. КММ 634 был изолирован из морской губки Hexactinellida, взятой на глубине 400 метров. О-антигенный полисахарид данной бактерии по своей структуре является уникальным среди антигенных полисахаридов грамотрицательных бактерий [58]. В его состав входит ряд необычных компонентов, среди которых 2-ацетиламино-4-[(S)-3гидроксибутаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-D-глюкоза (D-QuiNAc4N(S-3Hb)), 2,3-диацетиламино-2,3-дидезокси-D-глюкуроновая кислота (D-GlcNAc3NAcA) и более не обнаруженный в природе амид 2,3-диацетиламино-2,3-дидезокси-Dманнуроновой кислоты с L-аланином (D-ManNAc3NAcA6(L-Ala)). Кислый ОПС бактерии P. haloplanktis КММ 223 [59], изолированной из образца морской воды, содержит два остатка D-QuiNAc4N(S-3Hb). Помимо этого редкого моносахарида, в его состав входит остаток L-идуроновой кислоты (L-IdoA). Lидуроновая кислота хорошо известный компонент гликозаминогликанов млекопитающих (дерматансульфат, гепарансульфат и гепарин), но редко встречается в бактериальных полисахаридах. Ранее она была найдена в составе ОПС Shigella boydii B15 [60] и E. coli O112ab [61] и экзополисахариде (ЭПС) Butyrivibrio fibrisolvens X6C61 [62]. Кроме того, идуроновая кислота неустановленной абсолютной конфигурации идентифицирована в составе КПС Clostridium perfringens (Hobbs 10) [63]. Таблица 3. Структуры ОПС Pseudoalteromonas spp. Микроорганизм Структура повторяющегося звена ОПС P. tetraodonis IAM 14160Т [46] P. carrageenovora α-Colp(1→2)-β-D-Galp 1 ↓ 3 →2)-α-Colp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GalpNAc(→ IAM 12662T [47] IAM 14165 [51] P. distincta КММ 638Т [52] P. aliena КММ 3562Т[54] α-D-Quip4NAc 1 ↓ 4 →3)-β-D-GlcpA6(L-Ser)-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-ManpNAcA6(L-Ser)-(1→4) -β-D-GlcpNAc(→ 28 P. atlantica β-Psep5Ac7Ac 2 ↓ 6 →3)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-GlcpNAc-(1→4)-α-D-GalpA-(1→3)-β-D-QuipNAc-(1→ →4)-β-D-QuipNAc-(1→4)-α-Psep5Ac7Fo-(2→ 3 ↑ 1 α-D-GlcpA-(1→4)-β-D-GalpNAc-(1→4)-α-D-GalpNAc3AcA Pseudoalteromonas sp. КММ 634 [58] P. haloplanktis КММ 223 [59] P. haloplanktis ATCC 14393T [64] →3)-α-D-QuipNAc4N(S-3Hb)-(1→4)-β-D-ManpNAc3NAcA6(L-Ala)-(1→4) -β-D-GlcpNAc3NAcA-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→ →4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-QuipNAc4N(S-3Hb)-(1→2)-α-L-IdopA-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→ 4 ↑ 1 α-D-QuipNAc4N(S-3Hb) →3)-β-D-QuipNAc4NAc-(1→2)-β-D-Quip3N(D-AlaAc)-(1→4)-α-D-GalpNAcА-(1→4) α-D-Galp2,6Ac-(1→4)-α-L-GalpNAcA-(1→ P. flavipulchra NCIMB P. nigrifaciens КММ 158 и КММ 161 [70, 71] P. nigrifaciens КММ 156 [73] →3)-α-L-6dTalp4Ас-(1→3)-β-D-Galp-(1→7)-α-Kdop-(2→ 29 2033T [66] →4)-α-L-GulpNAcA-(1→4)-β-D-GlcpNAc3Ac-(1→3)-α-D-Galp-(1→ 4 ↑ 1 α-D-Fucp3N(4-Hb) →4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-L-Rhap-(1→3)-β-L-Rhap-(→ 3 ↑ 1 α-D-Glcp3(R-Lac) P. elyakovii КММ 162 [76] →2)-α-D-Glcp-(1→4)-β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→6)-α-D-Glcp-(1→ P. rubra ATCC 29570T [27] →4)-α-L-GalpNAm3AcA-(1→3)-α-D-6dxylHexpN-4-ulo-(1→4) --D-GlcpNAc3N(S-Mal)A-(1→ P. agarivorans КММ 232 (S-форма) →6)-β-D-Manp-(1→4)-α-L-Rhap2SO3--(1→ [81] P. agarivorans КММ 232 (R-форма) [82] NCIMB 1770 [83] Pseudoalteromonas sp. КММ 637 [84] Pseudoalteromonas sp. KMM 639 [85] →4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-GalpA-(1→4)-β-D-Manp-(1→ →3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-D-Galp-(1→ 6 ↑ Gro-2-P 30 P. marinoglutinosa β-D-ManpNAcA 1 4 3)-α-D-FucpNThrAc(13)-α-D-GalpNAc-(13)-α-L-Rhap-(1 β-D-ManpNAc 1 ↓ 4 →3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→ 31 О-антигенный полисахарид микроорганизма P. haloplanktis ATCC 14393T также имеет кислый характер и содержит остатки 3-(N-ацетил-D-аланил)-амино3,6-дидезокси-D-глюкозы (D-Qui3N(D-AlaAc)) и 2-ацетиламино-2-дезокси-D- и L-галактуроновых кислот (D-GalNAcA и L-GalNAcA) [64]. Этот О-антиген первый бактериальный полисахарид, для которого было установлено одновременное присутствие в его составе D- и L-изомеров GalNAcA. Другое редкое производное аминосахара D-Qui3N(D-AlaAc), ранее было обнаружено только однажды как компонент ОПС P. penneri 14 [65]. В составе ОПС микроорганизма P. flavipulchra NCIMB 2033T были обнаружены остатки 4-О-ацетил-6-дезокси-L-талозы (L-6dTal4Ac) и Kdo [66]. Среди 6-дезоксигексоз, встречающихся в бактериальных полисахаридах, L-6dTal является наиболее редким моносахаридом, причем, обычно L-6dTal находится в ацетилированной или метилированной форме. Kdo тоже редко входит в состав Оантигенных полисахаридов, но является обязательным компонентом олигосахарида кора ЛПС. Оба моносахарида были обнаружены в составе ОПС P. alcalifaciens O36 [67], ЭПС Burkholderia caribensis MWAP71 [68] и КПС другой морской бактерии рода Pseudoalteromonas P. nigrifaciens IAM 13010T [69]. Две морские бактерии, выделенные из мантии дальневосточных моллюсков Crenomytilus grayanus и Patinopecten yessoеnsis, на основании их физиологических и биохимических свойств а также данных ДНК–ДНК гибридизации, были идентифицированы как P. nigrifaciens КММ 158 (описанный ранее как Alteromonas macleodii 2MM6) и P. nigrifaciens КММ 161, соответственно. Оантигенные полисахариды, выделенные из обоих штаммов P. nigrifaciens, имеют идентичное строение и построены из разветвленных тетрасахаридных звеньев [70, 71]. Главной особенностью данных полисахаридов является присутствие нигде более не обнаруженного производного моносахарида 3-(4-гидроксибутаноил)амино-3,6-дидезокси-D-галактозы (D-Fuc3N(4-Hb)). Тетрасахаридное повторяющееся звено ОПС еще одного штамма P. nigrifaciens КММ 156 (ранее Alteromonas), изолированного из мантии мидии C. 32 grayanus, содержит остаток D-Glc, этерифицированный остатком (R)-молочной кислоты (R-Lac) [72]. В бактериальных полисахаридах остаток D-Glcp3(R-Lac) был обнаружен только в составе ОПС P. vulgaris O25 (PrK 48/57) [73], а также в составе гликокаликса P. fragi ATCC 4973 [74] и ЭПС P. marginalis ATCC 10844 [75]. Кроме того, данный моносахарид является деамино-аналогом мурамовой кислоты, которая широко распространена в природе как компонент пептидогликанов клеточной стенки бактерий. Штамм P. elyakovii КММ 162 был выделен из целомической жидкости мидии C. grayanus. Стоит отметить, что ОПС данного микроорганизма [76] имеет общий структурный элемент с ОПС E. coli O22 [77] и Hafnia alvei PCM 1546 и 1189 [78, 79]: →4)-β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→6)-α-DGlcp-(1→. Антигенный полисахарид типового штамма P. rubra ATCC 29570T [27], выделенного в Средиземном море, имеет трисахаридную природу повторяющегося звена и построен из остатков D-6dxylHexN-4-ulo, L-GalNAmA и амида D-GlcNAc3NAN с яблочной кислотой, ранее обнаруженного в составе идентичных ОПС V. vulnificus CECT 5198 и S3-I2-36 [26] (Таблица 1). Микроорганизм P. agarivorans КММ 232 изолирован из образца воды, отобранной на глубине 500 метров в Северо-Западной части Тихого океана. По своим физиолого-биохимическим и генетическим свойствам данный штамм был первоначально идентифицирован как P. marinoglutinosa. Дальнейшие фенотипические, филогенетические исследования и ДНК-ДНК гибридизация показали, что это бактерия представляет новый вид рода Pseudoalteromonas, который был описан как P. agarivorans [80]. При наращивании на твердой питательной среде микроорганизм образует два типа колоний: гладкие (S-форма) и шероховатые (R-форма). Отличительной особенностью ОПС P. agarivorans КММ 232 (S-форма) является наличие сульфатной группы, которая была впервые идентифицирована в составе ОПС грамотрицательных бактерий [81]. R-форма морской бактерии P. agarivorans KMM 232 продуцирует полноценный ЛПС, Оантигенный полисахарид которого содержит в своем составе 2,6-дидезокси-2-(N- 33 ацетил-L-треонил)-амино-D-галактозу (D-FucNThrAc), впервые обнаруженную в природе [82]. На фоне остальных выделяются структуры ОПС бактерий P. marinoglutinosa NCIMB 1770 [83], Pseudoalteromonas sp. KMM 639 [84] и Pseudoalteromonas sp. КММ 637 [85], построенные из довольно распространенных в природе моносахаридов. 1.2.1.3 Семейство Shewanellaceae Бактерии рода Shewanella, семейства Shewanellaceae, являются предметом научных исследований в течение уже многих лет. К настоящему времени этот род содержит 62 вида (www.bacterio.net), включая свободноживущие и симбионтные формы микроорганизмов. Некоторые микроорганизмы рода Shewanella являются патогенами важных промысловых видов рыб, инициируют гнилостные процессы в пищевых продуктах, богатых белком; отдельные виды патогенны для человека (S. algae и S. putrefaciens) они вызывают некроз ткани и сепсис. Антигенный состав бактерий этого рода практически не изучен (Таблица 4). Штамм бактерий S. algae BrY был выделен из донных отложений прибрежных вод Атлантического океана. Особенностью ОПС данного микроорганизма является то, что связь между остатками L-Rha и L-FucN в его повторяющемся звене, происходит через остаток S-Mal, что для бактериальных полисахаридов было найдено впервые [86]. Другой, патогенный штамм S. algae 48055, выделенный из крови больного, продуцирует ЛПС, О-антигенный полисахарид которого имеет кислый характер. В состав полисахарида входит сиаловая кислота 5-ацетиламино-3,5-дидезоксиD-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновая кислота (Neu5Ac), и амид D-GalA с 2амино-1,3-пропандиолом (2-аминоглицерином, GroN) [87]. Примечательно, что структура этого полисахарида очень схожа со структурой ОПС V. cholerae H11 non-O1 [88], которая отличается только присутствием остатка D-QuiNAc вместо D-GlcNAc и связью между остатком GlcNAc и одним из остатков D-GalA6(GroN). 34 Микроорганизм S. putrefaciens A6, выделенный из потрошеной трески, продуцирует фенол-растворимый полисахарид, повторяющееся звено которого построено из двух высших сахаров: 8-О-ацетил-7-ацетамидино-5-ацетиламино3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновой кислоты (производное 8-эпи-легионаминовой кислоты, 8eLeg5Ac7Am) и С-разветвленного моносахарида − 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-4-С-(3′-карбоксамид-2′,2′- дигидроксипропил)-D-галактозы (She), названного шеванеллозой [89]. Таблица 4. Структуры ОПС Shewanella spp. Микроорганизм S. algae BrY [86]: S. algae 48055 [87] S. putrefaciens Структура повторяющегося звена ОПС →3)-α-D-QuipNAc4N(R-3Hb)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2) -α-L-Rhap-(1→2)-S-Mal-(4→2)-α-L-FucpN-(1→ →3)-β-D-GalpA6(GroN)-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→3) -β-D-GalpA6(GroN)--(1→4)-α-Neup5Ac(2→ →4)-α-8e-Legp5Ac7Am8Ac-(2→3)-β-Shep-(1→ A6 [89] S. putrefaciens S29 [91] S. fidelis KMM 3582T [93] →4)-α-L-QuipNAc-(1→3)-α-D-GlcpNAc-(1→3) -β-α-D-Quip4NAc-(1→3)--α-D-Galp-1-P-(O→ →3)-β-D-GalpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3) -β-D-GalpNAc-(1→2)--α-D-GalpA6(2S,8S-AlaLys)-(1→ S. japonica KMM 3299T [95] →3)-α-D-Fucp4NAc-(1→4)-α-D-GalpA-(1→3) -α-L-FucpNAc-(1→3)--β-D-QuipNAc4NAc-(1→ S. japonica KMM 3601 [96] →4)-α-4eLegp5Ac7Ac-(2→4)-β-D-GlcpA3Ac-(1→3) -β-D-GalpNAc-(1→ Уникальный моносахарид шеванеллоза также был найден в составе О-антигенов энтеробактерий Morganella morganii KF1676 и RK4222 [90]. Интересно отметить, что ОПС обоих штаммов M. morganii состоят из дисахаридных повторяющихся звеньев, в которых второй моносахарид также является производным 8-эпилегионаминовой кислоты только с другим положением N-ацильных групп (8eLeg5Am7Ac). Негалофильные бактерии 35 S. putrefaciens S29, изолированные из разложившейся морской рыбы, синтезируют фосфорилированный полисахарид [91], принадлежащий к семейству полимеров, которые известны, главным образом, как полисахариды клеточной стенки грамположительных бактерий [92]. Отличительной особенностью ОПС микроорганизма S. fidelis KMM 3582T, изолированного из образца донного песка, является наличие амида D-GalA с остатком необычной аминокислоты − 2-[(S)-1-карбоксиэтил]-амино-L-лизина (аланинолизин, 2S,8S-AlaLys) [91]. Идентичный амид является компонентом ОПС Pr. rustigianii O14 [94]. Два штамма микроорганизма S. japonica KMM 3299T и KMM 3601 были выделены из образца морской воды, собранной в бухте Троица, Японское море. О-Антигенный полисахарид типового штамма S. japonica KMM 3299T построен из линейных тетрасахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из остатков DGalA, D-QuiNAc4NAc, L-FucNAc и редкого моносахарида 4-ацетиламино-4,6дидезокси-D-галактозы (D-Fuc4NAc) [95]. Второй штамм S. japonica KMM 3601 продуцирует ОПС отличный от О-антигена типового штамма [96]. В его состав входит 5,7-диацетиламино-3,5,7,9-тетрадезокси-D-глицеро-D-тало-нон-2- улозоновая кислота (производное 4-эпи-легионаминовой кислоты, 4еLeg). Этот уникальный моносахарид также был обнаружен в составе ОПС L. pneumophilla non-1 [97] и L. pneumophilla 2 [98, 20]. 1.2.1.4 Семейства Moraxellaceae, Idiomarinaceae, Alteromonadaceae, Oceanospirillaceae Бактерии галофильными рода и Psychrobacter, психротолерантными семейства Moraxellaceae, (некоторые виды являются психрофильные) микроорганизмами, что обеспечивает их повсеместное распространение в морской среде обитания. Отдельные штаммы микроорганизмов были выделены из Антарктического морского льда, встречаются и глубоководные штаммы бактерий. Микроорганизмы P. muricolla 2pSТ, P.maritimus 3pS и P. cryohalolentis K5T выделенные из образца подземной морской воды, собранной на глубине 11 36 метров в Колымской низменности [99], синтезируют ОПС с уникальными структурами (Таблица 5). Таблица 5. Структуры ОПС Psychrobacter spp. Микроорганизм Структура повторяющегося звена ОПС P. muricolla →4)-α-L-GulpNAcA6Gly-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→ 2pSТ [99] P.maritimus 3pS [101] →2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpNAcA-(1→3) -α-D-QuipNAc4N(S-3Hb)-(1→3)-β-D-QuipNAc4N(S-3Hb)-(1→ P. cryohalolentis K5T [103] β-L-Arap2,3,4NAc-(1→4)-β-D-GlcpNAc3NAcAN-(1→3) -α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha 1 ↓ 4 →4)-β-D-QuipNAc4NAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→ В составе полисахарида P. muricolla 2pSТ [99] обнаружено редкое производное моносахарида амид L-GulNAcA с аминокислотой глицином (Gly). Первичный амид L-GulNAcA был найден в составе ОПС P. tolaasii NCPPB 2192 [100], амид L-GulNAcA с Gly, также как и с другими аминокислотами, в природе был найден впервые. Антигенный полисахарид P. maritimus 3pS [101] содержит общий с ОПС P. fluorescens IMV 247 [102] трисахаридный фрагмент: →2)-α-L-Rhap-(1→4)-α-DGalpNAcA-(1→3)-α-D-QuipNAc4NHb-(1→. Главной особенностью нейтрального ОПС P. cryohalolentis K5T является наличие уникального моносахарида 2,3,4-триацетиламино-2,3,4-тридезокси-Lарабинозы (L-Ara2,3,4NAc) [103]. Род Idiomarina, семейства Idiomarinaceae был образован в 1985 году и в настоящее время насчитывает 21 вид (www.bacterio.net). Бактерии I. zobellii KMM 231T были выделены из образца воды, отобранной на глубине 4000 метров. Повторяющееся звено ОПС данного микроорганизма представляет собой 37 пентасахарид, построенный из остатков D-GlcA, D-GlcNAc, D-FucNAc и двух необычных моносахаридов D-Qui4N и L-GulNA [104]: →3)-α-D-Qui4pN-(1→4)-α-D-GlcpA-(1→6)-α-D-GlcpNAc-(1→4)-α-L-GulpNA-(1→3)-α-D-FucpNAc-(1→ Особенностью данного полисахарида является наличие двух аминосахаров со свободными аминогруппами (D-Qui4N L-GulNA), идентифицированных в составе бактериальных полисахаридов впервые. Как правило, судя по существующим на сегодняшний день данным, для морских бактерий характерен кислый характер их О-антигенных полисахаридов. Но бывают и исключения, например микроорганизмы Alteromonas addita КММ 3600Т, Microbulbifer thermotolerans КММ 6242 и Marinomonas communis ATCC 27118T продуцируют ОПС, не содержащие моносахаридов с кислым характером. Как видно из таблицы 6, повторяющиеся звенья их ОПС построены из довольно распространенных в природе моносахаридов [105-107]. Таблица 6. Структуры ОПС A. addita, M. thermotolerans, M. communis Микроорганизм A. addita Структура повторяющегося звена ОПС →3)-α-D-Galp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-D-Glcp-(1→ КММ 3600Т [105] M. thermotolerans →3)--D-Ribf-(1→4)--D-Galp-(1→ КММ 6242 [106] M. communis →2)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap(1→ ATCC 27118T[107] Примечательно, что повторяющееся звено О-антигенного полисахарида M. thermotolerans КММ 6242 [106], изолированного из морского ежа Strongylocentrotus intermedius, является структурным элементом ОПС некоторых энтеробактерий [20, 108, 109]. 38 1.2.2 Класс Flavobacteriia Класс Flavobacteriia относится к типу Bacteroidetes и объединяет большую, гетерогенную группу грамотрицательных бактерий, некоторые из которых являются патогенами многих видов рыб. На данный момент исследованы структуры О-антигенов только нескольких морских представителей семейства Flavobacteriaceae данного класса. Так, например, бактерии Tenacibaculum maritimum (ранее Flexibacter maritimus), являются причиной больших экономических потерь, связанных с высокой смертностью среди промысловых видов рыб семейства лососевых [110, 111]. Структура ОПС этой бактерии была установлена на основании данных спектроскопических методов анализа углеводов, проведенных на нативном полисахариде и продуктах его метанолиза. Было показано, что он состоит из дисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих высший сахар – 8-амино-5ацетиламино-7-[(S)-3-гидроксибутаноил]-амино-3,5,7,8,9-пентадезокси-L-маннонон-2-улозоновую кислоту (конфигурация при С-8 неизвестна, Sug) и 2ацетиламино-3-O-ацетил-4-[(S)-2-гидроксиглутар-5-ил]амино-2,4,6-тридезокси-Dглюкозу QuiNAc3Ac4NAcyl) [112]: →4)-Sugp(S-3Hb)-(2→2)-S-2HOGlt-(5→4)-β-D-QuipNAc4N3Ac-(1→ Повторяющиеся звенья ОПС соединяются через остаток (S)-2- гидроксиглутаровой кислоты, что для бактериальных полисахаридов было найдено впервые. К непатогенным микроорганизмам семейства Flavobacteriaceae, среди прочих, относятся бактерии рода Cellulophaga. В настоящее время этот род насчитывает 7 видов (www.bacterio.net), для 3-х из которых установлена структура ОПС (Таблица 7). 39 Таблица 7. Структуры ОПС Cellulophaga spp. Микроорганизм Структура повторяющегося звена ОПС C. fucicola →4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-Psep-(2→ NNО 15860T [113] C. baltica →3)-α-D-GlcpNAc-(1→2)-β-D-Manp-(1→3) NNO 15840T [115] -β-D-Manp2OAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→ C. pacifica KMM α-D-Fucp4NAc 1 ↓ 4 →3)-β-D-ManpNAcA-(1→4)-β-D-ManpNAcA-(1→3) -β-D-GlcpNAc-(1→ 3664T [116] О-антиген бактерии C. fucicola NNО 15860T, изолированной из бурой водоросли Fucus serratus, построен из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих, наряду с повсеместно распространенными D-Glc и D-Gal, остаток редко встречающегося моносахарида Pse5Ас7Ас [113]. Структуру, схожую со структурой C. fucicola NN015860T, имеет ОПС E. coli O136 [114]. Единственным отличием является присутствие остатка β-D-GlcNAc вместо остатка β-D-Glc. Повторяющееся звено ОПС бактерии C. baltica NNO 15840T, также выделенной из бурой водоросли, имеет тетрасахаридную структуру и состоит из довольно распространенных остатков моносахаридов, как среди наземных, так и морских микроорганизмов [115]. Интересной представляется структура ОПС микроорганизма C. pacifica KMM 3664T, изолированного из образца воды, собранной в Амурском заливе Японского моря [116]. Все остатки тетрасахаридного повторяющегося звена ОПС этого микроорганизма являются аминосахарами. Совместное присутствие двух редких моносахаридов D-ManpNAcA и D-Fucp4NAc было найдено лишь однажды в составе энтеробактериального общего антигена [117, 118]. Род Arenibacter относится к семейству Flavobacteriaceae и в настоящее время насчитывет 7 видов (www.bacterio.net). Структура О-антигена 40 микроорганизма A. palladensis KMM 3961T, изолированного из зеленой водоросли Ulva fenestratа, содержит такой довольно редкий компонент бактериальных полисахаридов как L-GalNAcA [119]: →2)-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→4)-α-L-GalpNAcA-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→ 1.2.3 Класс Alphaproteobacteria С точки зрения структурной химии углеводов, морские грамотрицательные бактерии класса Alphaproteobacteria являются наименее изученными микроорганизмами. До последнего времени был исследован О-антигенный полисахарид только одной бактерии Sulfitobacter brevis КММ 6006, относящейся к семейству Rhodobacteraceae. Род Sulfitobacter был образован в 1995 для морских грамотрицательных бактерий, выделенных из H2S/O2 зоны Черного моря, и на данный момент насчитывает 11 видов (www.bacterio.net). Микроорганизм S. brevis КММ 6006 был выделен из донного осадка, собранного в бухте Чажма Японского моря. Антигенный полисахарид, выделенный из клеточной стенки S. brevis КММ 6006 представляет собой тейхоево-подобный гликополимер, построенный из остатков рибита (Rib-ol), глицерина (Gro) и GlcNAc [120]: →1)-Rib-ol-(5→P→1)→Gro→(3→P→ 4 ↑ 1 -D-GlcNAc Такие полимеры распространены в составе клеточных стенок грамположительных микроорганизмов и не свойствены грамотрицательным бактериям [92]. Подводя итог вышесказанному, стоит отметить, что О-антигенные полисахариды морских микроорганизмов изучены неравномерно. Несмотря на большое разнообразие микроорганизмов класса Alphaproteobacteria и типа 41 Bacteriodetes, с точки зрения структурной химии углеводов они до сих пор остаются малоизученными. Существующие в настоящее время данные позволяют утверждать, что ОПС морских грамотрицательных бактерий отличаются большим разнообразием, встречаются как кислые полисахариды, так и нейтральные. Подавляющее большинство ОПС морских бактерий построены из довольно редко встречающихся в природе компонентов, среди которых производные уроновых, 2амино-2-дезоксигексуроновых и 2,3-диамино-2,3-дидезоксигексуроновых кислот. Широко представлены и различные N-ацильные производные аминосахаров, кетосахаров и высших моносахаридов. Среди заместителей неуглеводной природы встречаются остатки карбоновых кислот, неорганических кислот, различные аминокислоты и их производные. Кроме того, встречаются ОПС, состоящие только из повсеместно распространенных моносахаридов, но, как правило, такие полисахариды являются исключением из общей тенденции. Для установления структуры ОПС используется комплекс химических и физико-химических методов, включая различные виды экстракций, очистки, реакций специфической и неспецифической деградации гликанов, массспектрометрии (МС), газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и ГЖХ-МС летучих производных моносахаридов. Но все же, важнейшим в настоящее время является метод спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Современные методы спектроскопии ЯМР открывают возможность установления первичной структуры полисахаридов, ограничивая применение деструктивных химических методов, что является очень важным при работе с полисахаридами, имеющими сложную структуру и содержащими кислото- и щелочно-лабильные компоненты или наоборот моносахариды с устойчивыми гликозидными связями, какими и являются О-антигенные полисахариды грамотрицательных бактерий. 42 1.3 Спектроскопия ЯМР в исследовании углеводов Спектроскопию ЯМР высокого разрешения можно применять для решения самых разнообразных химических проблем, изучение которых другими методами или невозможно, или очень затруднено. К преимуществам метода можно отнести его быстроту, отсутствие необходимости подвергать деструкции исследуемое вещество и, в большинстве случаев, однозначность получаемой с его помощью информации. В настоящее время метод спектроскопии ЯМР признан ключевым физикохимическим методом исследования полисахаридов, поскольку практически все, как структурные, так и конфигурационные различия между их компонентами (моносахаридами и неуглеводными заместителями), оказывают влияние на резонансную частоту ядер и, следовательно, находят отражение в спектрах ЯМР. Более того, некоторые виды взаимодействий между моносахаридами, выявляемые в различных одно- и двумерных экспериментах ЯМР, позволяют получить информацию об их взаимном пространственном расположении. Таким образом, этот метод дает не только исчерпывающую информацию о первичной структуре цепи полимера, но и о конформационных свойствах полисахаридов в водных растворах. Используя одномерные эксперименты можно получить предварительные данные о структуре, моносахаридном составе (1H-, 13 C-ЯМР), наличии кетосахаров и дезоксисахаров (DEPT-135), определить конфигурации аномерных центров и размеры циклов моносахаридных остатков (13C-ЯМР, GD). Двумерные эксперименты дают информацию о геминальных и вицинальных протон-протонных взаимодействиях (1Н,1Н-COSY), взаимодействии протонов всей связанной спиновой системы (1Н,1Н-TOCSY), прямых протон-углеродных (1Н,13С-HSQC) и дальних протон-углеродных взаимодействиях, в том числе трансгликозидных (1Н,13С-HMBC), контактах (1Н,1Н-NOESY, 1Н,1Н-ROESY). пространственных протон-протонных 43 Комбинирование всех экспериментов позволяет наиболее близко подойти к решению задачи определения структуры полисахаридов [121]. 1.3.1 Одномерная спектроскопия ЯМР Достаточно разрешенные спектры ЯМР регулярных полисахаридов содержат всю информацию о структуре повторяющегося звена, и для таких полимеров нет принципиальных препятствий для определения их первичной структуры. Прежде всего, сам факт наличия регулярности наиболее просто устанавливается именно с помощью спектроскопии ЯМР: спектры 13 С-ЯМР регулярных полисахаридов содержат сигналы единичной или кратной единичной интегральной интенсивности в соответствии с числом атомов углерода в повторяющемся звене. Спектры 13 С-ЯМР нерегулярных полисахаридов отличаются наличием нескольких наборов линий различной интегральной интенсивности, а для наиболее сложных нерегулярных полимеров они нередко оказываются совершенно неразрешенными. Это обычно связано с содержанием нестехиометрических заместителей: О-ацетильных и фосфодиэфирных групп, а также боковых моносахаридных остатков. Полисахариды со скрытой регулярностью можно изучать методом спектроскопии ЯМР после их несложной модификации [122]. По количеству сигналов аномерных протонов и атомов углерода можно определить размер олигосахарида или повторяющегося звена полисахарида. Из-за дезэкранирующего эффекта двух атомов кислорода, присоединенных к аномерному атому углерода, последний, так же, как и связанный с ним аномерный протон, резонирует в более слабом поле по сравнению с другими сигналами протонов и углеродов сахарных остатков (Н 4,4-5,5 м.д.; С 90-112 м.д.). Однако в этой области могут резонировать также некоторые неаномерные атомы, например, Н-5 атом галактуроновой кислоты в спектрах 1Н-ЯМР или ацетальный атом углерода пировиноградной кислоты в спектрах 13С-ЯМР. В связи 44 с этим окончательный вывод о размере повторяющегося звена можно сделать только в результате рассмотрения всей совокупности спектральных данных [123]. Возможность определения моносахаридного состава непосредственно из спектров ЯМР базируется на индивидуальности спектров 1H-ЯМР или родоначальных моносахаридов: пираноз и фураноз [124-127]. 13 С-ЯМР Важная информация заключена в величинах констант спин-спинового взаимодействия (КССВ). Поскольку моносахариды различаются взаимной ориентацией протонов, данные о КССВ позволяют однозначно идентифицировать их на основании уникального набора констант. Так, для β-глюкопиранозы, у которой все протоны цикла находятся в аксиальном положении, КССВ составляют 8-10 Гц, в то время как маннопираноза, у которой Н-2 атом занимает экваториальное положение, отличается небольшой величиной КССВ 3JН2-H3 (~2 Гц), а галактопираноза с экваториальным Н-4 атомом также небольшой КССВ 3JН3-H4 (~3 Гц) и еще меньшей КССВ 3JН4-H5 [121, 123, 128]. Наличие различных производных сахаров (аминосахаров, дезоксисахаров, уроновых кислот и т.д.) не только не усложняет, а скорее облегчает спектроскопическое определение моносахаридного состава. Так как химические сдвиги ядер 13 С зависят от гибридизации атома углерода, наличия электроотрицательных заместителей и взаимодействия протонов при данном атоме углерода с протонами при других атомах, в спектрах 13 полисахаридов области, можно выделить особые, неперекрывающиеся С-ЯМР характерные для атомов углерода в том или ином окружении. Так, наличие аминосахаров можно установить по сигналам атомов углерода, связанных с азотом при С 44-58 м.д. Сахара с дезоксизвеном при одном из кольцевых атомов углерода характеризуются наличием сигналов при С 32-43 м.д. Признаком наличия в полисахариде уроновых кислот служат химические сдвиги сигналов в диапазоне С 173-177 м.д., изменяющие свое положение при изменении pD раствора. Метильные группы дают сигналы в наиболее сильном поле. Так, сигналы N-ацетильных групп (СН3) находятся в области С 23-24 м.д., О- 45 ацетильных (СН3) в области С 21-22 м.д., а 6-дезоксисахаров в области С 1218 м.д. [121-124, 126, 127]. Химические сдвиги ядер 1Н расположены в значительно более узком диапазоне по сравнению с таковыми для ядер 13 С. На величину химического сдвига протона оказывают влияние те же факторы, что и на величину химического сдвига атомов углерода, но, в отличие от химических сдвигов атомов углерода, влияние протон-протонных взаимодействий через пространство мало сказывается на химических сдвигах самих протонов, однако возрастает влияние анизотропии ближайших химических связей. В результате этого, выделение четких диапазонов химических сдвигов в протонном спектре полисахарида затруднительно и часто условно. Протоны при атомах углерода с электроотрицательным заместителем резонируют в диапазоне Н 3.0-5.5 м.д., протоны метильных групп N- и О-ацетатов – при Н 2.0-2.2 м.д., метиленовые протоны дезоксисахаров – при Н 1.7-2.5 м.д., а метильные протоны 6дезоксисахаров – при Н 1.2-1.5 м.д. На величину химического сдвига протонов влияет О- или N-ацилирование соседних функциональных групп. Оно приводит к значительному сдвигу их сигналов в слабое поле и позволяет определить положение ацилирования в остатках моносахаридов[121-123, 128, 129]. Данные спектра 1H-ЯМР можно упростить путем редактирования в набор простых подспектров с помощью одномерной селективной спектроскопии 1D TOCSY. Эксперимент 1D TOCSY является одномерным аналогом 2D TOCSY (см. ниже) эксперимента и имеет значительное преимущество по сравнению с ним изза более короткого времени измерения и лучшего цифрового разрешения. Полезной для анализа состава, в частности для выявления кетосахаров и ацеталей пировиноградной кислоты, является возможность различать сигналы первичных, вторичных, третичных предоставляемая спектроскопией и четвертичных атомов углерода, 13 С-ЯМР. С этой целью обычно используют эксперимент DEPT-135, основанный на спин-спиновых взаимодействиях ядер 1Н и 13С [121, 123]. 46 Размеры моносахаридных циклов в повторяющемся звене полисахарида определяются на основании существенного различия спектров моносахаридов в пиранозной и фуранозной формах. Для фуранозидов с транс-ориентацией заместителей при С-1 и С-2 атомах, сигнал С-1 атома находится в более слабом поле (С 106-112 м.д.), чем сигнал С-1 атома любых сахаров в пиранозной форме и остатков в фуранозной форме, имеющих цис-ориентированые заместители при С1 и С-2 атомах. При цис-ориентации заместителей при С-1 и С-2 атомах область резонанса С-1 атома фуранозидов перекрывается с областью резонанса С-1 атома некоторых пиранозидов (главным образом с экваториально ориентированной ORгруппой). Однако, в спектре 13 С-ЯМР, снятом без подавления спин-спинового взаимодействия углеродов с протонами (GD спектр), КССВ 1JC1-H1 фуранозидов, при любой конфигурации гликозидного центра, составляют 1JC1-H1 170-175 Гц, а для пиранозидов с экваториально ориентированной OR-группой у С-1 атома, КССВ 1JC1-H1 существенно меньше (158-163 Гц). Кроме того, для фуранозидов характерны слабопольные сигналы кольцевых С-4 атомов в области резонанса С 83-88 м.д. В этой же области могут находиться сигналы неаномерных атомов углерода, участвующих в образовании гликозидных связей, но их число не может превышать число остатков в повторяющемся звене полисахарида [122, 123]. Конфигурацию гликозидных связей в спектроскопии ЯМР углеводов можно определить несколькими способами. Во-первых, по значению КССВ 3JH1-H2. Для βпиранозидов с глюко- и галакто- конфигурацией с аксиальным Н-2 атомом, величина КССВ 3JH1-H2 составляет 7-8 Гц, а для α-аномеров – не превышает 4 Гц. Для пиранозидов с манно-конфигурацией (Н-2 атом имеет экваториальную ориентацию) этот подход неприменим – вне зависимости от аномерной конфигурации КССВ 3JH1-H2 не превышает 2 Гц (1.6 Гц в случае диэкваториальных протонов и 0.8 Гц в случае аксиально-экваториальной ориентации протонов) [121, 122, 128]. Во-вторых, по КССВ аномерного углерода с ближайшим протоном в GD спектре. Для альдопиранозидов с экваториальной OR-группой у С-1 атома КССВ 1JC1-H1 составляет 158-163 Гц, с аксиальной – 169-175 Гц [121, 122, 130]. Втретьих, по положению сигналов С-5 атома в пиранозах или С-1 атома в 47 фуранозах в спектрах 13С-ЯМР полисахаридов. Пиранозы не могут быть гликозилированы в положение 5, а разница между химическими сдвигами α- и βаномеров наибольшая именно для этого атома углерода [126], что особенно важно для маннопираноз. Для установления положений замещения моносахаридных остатков используют эффекты гликозилирования – смещение сигналов α-атомов углерода, участвующих в образовании гликозидной связи, и соседних с ними β-атомов по отношению к их положению в спектрах незамещённых моносахаридов. Эффекты всегда положительны, могут достигать 11 м.д., а β-эффекты могут быть как положительными, так и отрицательными, и их абсолютная величина не превышает 4 м.д. Величины - и -эффектов значительно меньше и обычно не учитываются [131]. Аналогичным образом по эффектам замещения устанавливают места присоединения большинства неуглеводных групп, причем для этой цели используются данные спектров как 1Н-, так и 13С-ЯМР. Например, положение О-ацетильной группы легко определить по ее сильному дезэкранирующему эффекту, вызывающему значительное (на 0.5-1.5 м.д.) смещение в слабое поле сигнала протона при ацетоксильной группе. Величина влияния на химические сдвиги 13 С-ЯМР молочной и пировиноградной кислот близка по величине к эффектам гликозилирования. Для фосфатных групп этот подход имеет меньшее значение в связи с возможностью использования для определения их локализации двумерной корреляционной спектроскопии (см. ниже). О наличии фосфатных групп свидетельствует сигнал (или сигналы) в спектре 31Р-ЯМР, в котором монофосфатные группы резонируют в области от -5 до +5 м.д., а дифосфатные группы от -7 до -12 м.д. Наиболее удобным способом определения положения неуглеводных заместителей является сравнение спектров ЯМР исходного и модифицированного (О-дезацетилированного, дефосфорилированного, дезацилированного) полисахаридов [123]. При известной конфигурации одного из звеньев дисахарида по эффектам гликозилирования можно определить конфигурацию второго звена. Эффекты гликозилирования зависят от стереохимии моносахаридов и позволяют установить, совпадают 48 конфигурации ли моносахаридов в звене, или различаются. Анализ эффектов гликозилирования является основным способом определения абсолютной конфигурации новых, редких и кислотолабильных сахаров, исследование которых химическими методами часто не даёт удовлетворительного результата [131]. 1.3.2 Двумерная спектроскопия ЯМР Для полного установления структуры сложных углеводов с помощью спектроскопии ЯМР необходимо отнесение всех сигналов, проявляющихся в спектрах 1Н- и 1 Н,1Н-COSY, 1 13 С-ЯМР. Для этого используют двумерные корреляционные Н,1Н-TOCSY, 1 Н,13С-HMQC или TOCSY эксперименты. С помощью методов 1 Н,13С-HMBC выявляют связи 1 1 Н,13С-HSQC, Н,1Н-NOESY, 1 1 Н,13С-HSQC- Н,1Н-ROESY и между компонентами (моносахаридами и неуглеводными заместителями). В случае фосфорилированных соединений также используют 1Н,31Р-HMQC, 1Н,31Р-HMQC-TOCSY и 1Н,31Р-HMBC эксперименты. 1 Н,1Н-COSY – гомоядерная протонная корреляционная спектроскопия. Этот метод выявляет корреляционные кросс-пики между протонами, связанными прямым спин-спиновым взаимодействием. Корреляционные кросс-пики в спектрах 1Н,1Н-COSY появляются на месте пересечения координат химических сдвигов протонов, имеющих измеримую КССВ. Осью симметрии спектра является диагональ, на которой расположены диагональные кросс-пики, повторяющие одномерный спектр, корреляционные кросс-пики находятся вне диагонали. Сигналы аномерных протонов служат стартовыми точками для расшифровки спектров. Координаты корреляционных кросс-пиков Н-1/Н-2 позволяют определить местонахождение сигналов Н-2 атома остатков; кросс-пики Н-2/Н-3 дают возможность найти положение сигналов Н-3 атома и т.д. Расшифровка может быть затруднена чрезмерной близостью корреляционных кросс-пиков к диагонали или перекрыванием кросс-пиков различных остатков. Кроме того, следует учитывать, что появление и интенсивность недиагональных кросс-пиков зависят от величины КССВ. Наибольшая константа наблюдается 49 между двумя аксиальными протонами пиранозного цикла, а в случае их диэкваториального или экваториально-аксиального расположения она существенно меньше. Иногда цепочка корреляций прерывается на одном из этапов, как это происходит, например, в случае моносахаридов с галактоконфигурацией: вследствие слишком малой величины 3JH4-H5 в спектрах 1Н,1НCOSY часто отсутствует кросс-пик между Н-4 и Н-5 атомами. Это также относится и к спектрам 1Н,1Н-TOCSY [121, 123, 132-134]. 1 Н,1Н-TOCSY – гомоядерная протонная полная корреляционная спектроскопия. Этот метод отличается от 1Н,1Н-COSY тем, что при достаточном времени смешения выявляет корреляционные кросс-пики между всеми протонами изолированной спиновой системы (5-6 шагов), а не только теми, которые связаны прямым спин-спиновым взаимодействием. Учитывая выше сказанное в отношении зависимости появления и интенсивности корреляционных кросспиков от КССВ, 1Н,1Н-TOCSY эксперимент позволяет установить относительную конфигурацию моносахаридных остатков. Так, для остатков с глюко- конфигурацией, в спектре 1Н,1Н-TOCSY наблюдаются корреляционные кросспики между H-1 атомом и всеми протонами связанной спиновой системы. Для остатков с манно-конфигурацией можно наблюдать взаимодействие Н-1 и Н-2 атомов и Н-2 атома со всеми протонами моносахаридного остатка вплоть до Н-6 атома. Для остатков с галакто-конфигурацией, как уже говорилось раньше, 1Н,1НTOCSY эксперимент выявляет взаимодействие между Н-1, Н-2, Н-3 и Н-4 атомами, а также между Н-6 и Н-5 атомами. В отношении сахаров с галактоконфигурацией трудность отнесения, связанную с обрывом цепочки корреляций, можно преодолеть с помощью двумерных 1 Н,1Н-NOESY или 1 Н,1Н-ROESY экспериментов (см. ниже). Данные этих экспериментов позволяют коррелировать химические сдвиги сигналов пространственно сближенных протонов, какими являются Н-4 и Н-5 атомы галактозы и ее производных. В случае β-галактозы, пространственно сближенными также являются Н-1 и Н-5 атомы [121-123, 132]. 13 Отнесение сигналов в спектрах гетероядерных 1 Н,13С-HMQC или С-ЯМР осуществляется с помощью 1 Н,13С-HSQC и 1 Н,13С-HSQC-TOCSY 50 экспериментов, которые выявляют химические сдвиги атомов углерода по химическим сдвигам связанных с ними протонов. В некоторых случаях, например, при значительном перекрывании корреляционных пиков Н/С, дополнительно используется комбинированный 1 Н,13С-HSQC-TOCSY эксперимент, дающий возможность наблюдать корреляцию каждого сигнала протона не только с сигналом присоединенного к нему атома углерода, но и с сигналами всех атомов углерода данной спиновой системы. Применяется также 1 Н,13С-DEPT-HMQC эксперимент, который выявляет корреляционные кросс-пики СН2-групп, находящиеся в противофазе к пикам СН- и СН3-групп. В некоторых случаях, при перекрывании сигналов протонов и сложности их отнесения к соответствующим углеродам, применяется 1Н,13С-Н2ВС эксперимент, с помощью которого коррелируют сигналы протонов и углеродных атомов, разделенные двумя связями [121, 123, 132-134]. Для установления последовательности моносахаридных остатков используют эксперименты, основанные на ядерном эффекте Оверхаузера (ЯЭО) – 1 Н,1Н-NOESY и 1 Н,1Н-ROESY. В данных методах наблюдается корреляция химических сдвигов пространственно сближенных до расстояния 4 Ǻ протонов, включая и аномерный протон гликозилирующего моносахарида, и протон гликозилированного моносахарида. Могут, однако, наблюдаться заметные корреляции и с близко расположенными протонами соседнего моносахарида и даже протонами остатков, не связанных между собой гликозидной связью, но сближенных пространственно (в разветвлённых полисахаридах). Эти трудности обычно удается преодолеть, учитывая данные о положениях гликозилирования, полученные на основании анализа химических сдвигов сигналов в спектрах 13 С- ЯМР. Особенностью 1Н,1Н-ROESY эксперимента является то, что он проводится во вращающейся системе координат, что, в отличие от 1Н,1Н-NOESY, позволяет наблюдать ЯЭО вне зависимости от молекулярной массы исследуемого вещества. С помощью 1Н,1Н-NOESY и 1Н,1Н-ROESY экспериментов также устанавливают местоположение неуглеводных заместителей. На основании пространственных корреляций протонов N-ацильных заместителей аминосахаров с NH-протонами 51 моносахаридов, при записи спектров в смеси Н2О и D2O, можно определить положение N-ацильных заместителей [121, 123, 132-134]. Альтернатива гомоядерным экспериментам, предназначенным для определения порядка связи и основанным на ЯЭО – гетероядерный 1Н,13С-HMBC эксперимент. В 1Н,13С-HMBC эксперименте наблюдаются корреляции сигналов между атомами углерода и протонами, разделёнными двумя и тремя связями, при наличии между ними спин-спинового взаимодействия. В спектре 1Н,13С-HMBC присутствуют корреляционные кросс-пики аномерных протонов и трансгликозидных атомов углерода – или наоборот, аномерных атомов углерода и протонов, связанных с трансгликозидными атомами углерода. Его преимуществом перед 1Н,1Н-NOESY и 1Н,1Н-ROESY экспериментами является возможность однозначного одновременно положения определения последовательности гликозилирования напрямую из сахаров спектра, и без дополнительной информации. Эксперимент 1Н,13С-HMBC применяют также для определения положения N-ацильных заместителей аминосахаров и амидных заместителей (преимущественно -аминокислот) карбоксильных групп уроновых кислот. Этот подход основан на том, что атом углерода СО-группы ацильного заместителя или остатка уроновой кислоты коррелирует с протоном при атоме углерода, несущим аминогруппу [121, 123, 132-134]. Эффективность структурных исследований полисахаридов методом спектроскопии ЯМР зависит от правильности выбора экспериментов для решения конкретной задачи, последовательности решения задач, взаимного сопоставления результатов исследования с помощью различных экспериментов. Методы спектроскопии ЯМР открывают возможность установления полной структуры полисахаридов, в большинстве случаев без применения химических методов. Это ускоряет исследования и снижает расход выделенного вещества, которое впоследствии можно использовать для дальнейших биологических исследований. 52 1.4 Липополисахариды морских грамотрицательных бактерий как антагонисты эндотоксинов. Бактеримия и бактериальный шок (сепсис) являются широко признанной проблемой в госпитальной внутрибольничных инфекций медицине. Самую составляют большую бактериемии, категорию вызываемые грамотрицательными микроорганизмами. Основной причиной возникновения грамотрицательной бактеримии у госпитализированных больных является их низкая устойчивость к инфекции, которая в свою очередь является результатом иммунных нарушений у пациентов. Лечение инфекционных болезней само по себе, в общем, не представляет большой трудности, учитывая современный уровень антибиотикотерапии, однако, осложнения, сопровождающие развитие инфекций, включая сепсис, все еще остаются трудноизлечимыми и вызывают высокую смертность. Согласно современной концепции развития сепсиса [135, 136], при попадании возбудителя в кровоток начинается гипервоспалительный процесс, который приводит к подавлению реакций иммунной системы и неспособности последней противостоять инфекции. Центральным событием инфекционного процесса является активация макрофагов и моноцитов крови, которые продуцируют большой набор разнообразных воспалительных медиаторов. К ним относятся ФНО-α (фактор некроза опухоли), интерлейкины (ИЛ-1-β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12) [137], липидные медиаторы, такие как лейкотриены, простагландины и фактор активации тромбоцитов, а также оксид азота и -интерферон. Активация комплемента при одновременном ингибировании фибринолиза приводит к таким осложнениям, как рассеянная внутрисосудистая коагуляция и множественная полиорганная дисфункция, что в конечном итоге заканчивается смертью пациентов. ЛПС играют важную роль в проявлении грамотрицательного сепсиса и другими острыми патофизиологическими эффектами, индуцируемыми эндотоксинами [138]. Сепсис начинается, когда бактерии преодолевают защитные 53 барьеры макроорганизма. При этом происходит выделение эндотоксинов, важная стадия в клинике грамотрицательного сепсиса, поскольку «свободный» ЛПС является гораздо более сильным стимулятором иммунокомпетентных клеток в сравнении с ЛПС, ассоциированным с наружной мембраной бактерий [139]. В низких концентрациях (ниже пг/мл) ЛПС проявляет иммуностимулирующую активность и усиливает устойчивость макроорганизма к инфекциям [140]. Он активирует компоненты плазмы (коплемент и молекулы свертывания крови) и клетки иммунной системы (моноциты и макрофаги, полиморфоядерные клетки и лимфоциты) [135, 136], что приводит к продукции цитокинов (ФНО-α, интерлейкины) и других провоспалительных медиаторов [137, 141]. Цитокины, высвобождаемые на ранней фазе иммунного ответа, служат сигналом для эндотелиальных клеток, начинающих привлекать лейкоциты из кровотока, активируют фагоцитарные клетки в тканях. Образование и высвобождение цитокинов обычно происходит кратковременно и жестко регулируется [142]. В нормальных, гомеостатических условиях эти реакции необходимы для управления защитными механизмами врожденного иммунитета. Однако при высоком содержании ЛПС, выделяющегося из мертвых бактериальных клеток, в крови человека или животных подобные процессы становятся бесконтрольными. Происходящий при этом синтез чрезмерного количества цитокинов, в особенности ИЛ-1-β и ФНО-α приводит к возникновению шокового синдрома, который проявляется в виде дисфункции многих органов и систем и представляет угрозу для жизни. Находясь в виде свободно циркулирующих агрегатов, ЛПС подвергается нейтрализации, представляющей собой процесс, в котором участвуют scavengerрецепторы класса А макрофагов. В противном случае ЛПС активирует иммунокомпетентные клетки, что приводит к воспалительным реакциям. ЛПСсвязывающий белок (ЛСБ) транспортирует ЛПС к рецептору CD14, его мембранной форме mСD14 (экспрессирующейся главным образом на фагоцитах) и растворимой форме sCD14 (ко-фактор клеток, чувствительных к CD14управляемой активации ЛПС, но не экспрессирующих CD14 самостоятельно) 54 [143, 144]. Существует четкое различие во взаимодействии sCD14 и mСD14 с ЛСБ и ЛПС: с рецептором mСD14 ЛПС-ЛСБ образует тройной комплекс на поверхности клеток, в случае рецептора sCD14 ЛСБ исполняет роль переносчика, транспортируя ЛПС от ЛПС-агрегатов [145, 146]. Рецептор CD14 не имеет трансмембранного домена и не передает сигнал напрямую внутрь клетки. Для дальнейшей передачи сигнала, приводящей к продукции провоспалительных медиаторов, на макрофагах существует другой, специфичный по отношению к ЛПС рецептор, относящийся к классу toll-like рецепторов TLR-4 [147]. Рецептор TLR-4 обладает сравнительно низкой аффинностью к ЛПС, поэтому в качестве ко-факторов передачи сигнала в этом процессе участвуют CD14 и ЛСБ. Способность ЛПС активировать клетки посредством TLR-4 увеличивается, если в системе присутствует миелоидный фактор дифференцировки 2 белок MD-2 [148]. Таким образом, передача сигнала ЛПС осуществляется тримолекулярным комплексом рецепторов, состоящим из CD14, TLR-4 и MD-2. Через TLR-4 ЛПС активирует фактор транскрипции NFkappaB, при этом сигнал ЛПС передается в ядро иммунокомпетентной клетки, происходит экспрессия генов провоспалительных медиаторов, таких как ФНО-α, ИЛ-1-β и другие, и высвобождение растворимых факторов в кровь, что приводит к воспалительному процессу [149]. Современные способы борьбы с септическим шоком основываются на уничтожении бактерий с помощью антибиотиков и дополнительных мерах интенсивного лечения, включающих терапию с помощью протеина С, а также жесткий контроль за содержанием глюкозы в крови пациента и терапию, направленную на пополнение дефицита кислорода в клетках [135]. Однако, при лечении антибиотиками людей, инфицированных грамотрицательными бактериями, выделение ЛПС в кровоток не предотвращается. Более того, при определенных условиях наблюдается увеличение содержания эндотоксина в крови [139]. Следовательно, чтобы лечение сепсиса было успешным, оно должно включать не только уничтожение бактерий с помощью антибиотиков и поддерживающую терапию, но и нейтрализацию «свободного» ЛПС. Одним из 55 способов борьбы с септическим шоком является блокирование эндотоксина в местах его клеточной рецепции. Вещества, способные ингибировать эти процессы получили название антагонистов эндотоксинов. Исследование способности ЛПС и липидов А морских микроорганизмов выступать в качестве антагонистов эндотоксинов патогенных грамотрицательных бактерий показали перспективность данного направления [10]. Так, например, ЛПС морской бактерии M. communis ингибировал индуцированный эндотоксином E. coli синтез ФНО-α в иммунокомпетентных клетках цельной крови человека. Причем ЛПС M. сommunis проявлял более ярко выраженные антагонистические свойства, чем «свободный» липид А того же микроорганизма, что свидетельствует о том, что физико-химические свойства препаратов, при идентичности эндотоксического центра, играют немаловажную роль в проявлении биологического действия. Кроме того, для ЛПС M. сommunis была показана универсальность его ингибирующего действия. ЛПС M. сommunis ингибировал продукцию ФНО-α в клетках крови человека, индуцированную E. coli О55: В5 (S-форма), Y. pseudotuberculosis (S-форма), S. enterica subsp. enterica серовар Minnesota R7 (ЛПС R-форма) [10, 150]. Антагонистическое действие было показано и для ЛПС некоторых других морских грамотрицательных бактерий, причем их ингибирующая активность проявлялась при гораздо меньших концентрациях, чем в случае хорошо известного синтетического антагониста эндотоксинов Е5531. Это делает перспективным комплексное изучение ЛПС морских грамотрицательных бактерий, которые могут представлять интерес для терапии грамотрицательного сепсиса и эндотоксикоза [10]. 56 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морские микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем и играют существенную роль в процессах трансформации и минерализации органического материала в морской среде. Морфологические и физиолого-биохимические признаки и свойства морских микроорганизмов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, гидростатическое давление, низкие температуры, неравномерное поступление питательных веществ и др. Как отмечалось ранее, структуры О-антигенных полисахаридов морских бактерий исследованы крайне неравномерно. В связи с этим, изучение структуры биогликанов, образующих поверхность бактериальной клетки морских микроорганизмов, принадлежащих к разных таксономическим группам и выделенных из различных источников, является актуальной задачей. В качестве объектов исследования были отобраны штаммы микроорганизмов, выделенные из морских объектов и находящиеся в Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН: C. pacifica 3879 T, C. pacifica 3878, R. pacifica КММ 1406T, I. abyssalis KMM 227T (класс Gammaproteobacteria), L. taeanensis G5T (класс Alphaproteobacteria), и E. vietnamensis KMM 6221T (тип Bacteroidetes). На момент начала исследования, информация о структуре ОПС была лишь для одного представителя из выбранных для изучения родов I. zobellii KMM 231T [104]. Сведения о составе и структуре ЛПС бактерий, принадлежащим к родам Cobetia, Litorimonas, Rheinheimera и Echinicola, в литературе отсутствовали. Штаммы С. pacifica KMM 3879T и С. pacifica КММ 3878 были изолированы из образца донного песка, собранного в прибрежных водах Японского моря [151]. Микроорганизмы R. pacifica КММ 1406T [152] и I. abyssalis KMM 227T [153] выделены из образцов морской воды, отобранных на глубине 5000 и 4000 метров, соответственно, в Северо-Западной части Тихого океана. Бактерии L. taeanensis G5T были выделены из образца песка, собранного в литоральной зоне пляжа в 57 Южной Корее [154]. Штамм E. vietnamensis KMM 6221T изолирован из образца воды, отобранной на ферме по выращиванию мидий во Вьетнаме [155]. Наращивание микробной биомассы проводилось в лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН на модифицированной среде YouschimizuKimura [156]. ЛПС выделяли из сухой, обезжиренной бактериальной массы экстракцией горячим водным фенолом по методу Вестфаля, предварительно удаляя капсульный материал с поверхности клеток обработкой физиологическим раствором. Электрофоретический анализ ЛПС в 14%-ном ПААГ с визуализацией углеводных компонентов свидетельствовал о преобладании S-форм ЛПС (Рисунок 1). Рисунок 1 – Электрофореграмма ЛПС в ДСН-ПААГ а) визуализация окрашиванием красителем на основе AgNO3 b) визуализация окрашиванием раствором О-толуидинового синего. 1 ЛПС E. coli O55:B5, 2 ЛПС С. pacifica KMM 3879T, 3 ЛПС С. pacifica KMM 3878, 4 ЛПС R. pacifica КММ 1406T, 5 ЛПС I. abyssalis KMM 227T, 6 ЛПС E. vietnamensis KMM 6221T, 7 ЛПС Сellulophaga pacifica (морская бактерия), 9 ЛПС L. taeanensis G5T. Деградация 58 ЛПС, выделение и структурный анализ О-антигенных полисахаридов проводились индивидуально для каждого микроорганизма. 2.1 Структурное исследование О-специфического полисахарида Сobetia pacifica KMM 3879T О-антигенный полисахарид С. pacifica KMM 3879T был получен при мягкой кислотной деградации ЛПС 2% уксусной кислотой, с последующей гельхроматографией углеводной компоненты. ОПС был дополнительно очищен от сопутствующего минорного гликополимера – 1,3-поли(глицерофосфата) – с помощью ионообменной хроматографии. Анализ моносахаридного состава методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных полиолов и метилгликозидов показал наличие остатков Rha, Glc и Gal в соотношении 1:1:1. Абсолютная D-конфигурация остатков Glc и Gal и Lконфигурация остатка Rha была определена на основании величин их удельного оптического вращения. Спектры 1Н- и 13 C-ЯМР ОПС указывали на структурную нерегулярность полисахарида, вследствие присутствия в нестехиометрическом количестве Оацетильных групп, идентифицированных по характерным сигналам при С 21.7. и Н 2.17 м.д. Для дальнейшего структурного исследования ОПС был подвергнут Одезацетилированию. Первичный анализ спектра 13 C-ЯМР (Рисунок 2) модифицированного полисахарида (ОПС-1) показал наличие трех сигналов в области резонанса аномерных атомов углерода при С 99.3 (двойной интегральной интенсивности) и С 104.7 м.д., что указывало на трисахаридный размер повторяющегося звена. Кроме того, в спектре присутствовали: сигнал атома углерода метильной группы 6-дезоксисахара при С 17.9 м.д. и сигналы остальных кольцевых атомов углерода моносахаридных остатков в области 61.9-83.0 м.д. 59 Рисунок 2 – Спектр 13С-ЯМР ОПС-1 C. pacifica KMM 3879T 60 Эксперимент DEPT-135 показал наличие сигналов атомов углерода одной свободной и одной замещенной гидроксиметильных групп при С 61.9 и С 67.0 м.д., соответственно. Из данных GD эксперимента следовало, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме, а также то, что два моносахаридных остатка с сигналами С-1 атомов при С 99.3 м.д имели αконфигурацию гликозидной связи (КССВ 1JC1-H1 173.9 и 169.6 Гц), а один моносахаридный остаток с сигналом С-1 атома при С 104.7 м.д. – βконфигурацию (КССВ 1JC1-H1 160.0 Гц). В спектре 1H-ЯМР полисахарида, соответственно, присутствовали сигналы трех аномерных протонов при Н 5.09 (КССВ 3JH1,H2 ~ 4 Hz), 4.94, 4.79 (КССВ 3 JH1,H2 ~ 8 Hz) м.д. и сигналы протонов метильной группы 6-дезоксисахара при Н 1.40 (КССВ 3JH5,H6 ~ 6 Hz) м.д. Полное соотнесение сигналов в спектрах 1H- и 13 C-ЯМР ОПС-1 было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1H-COSY, 1H, 1HTOCSY и гетероядерных 1H, 13C-HSQC и 1H, 13C-HSQC-TOCSY экспериментов. Из спектров 1H, 1H-COSY и 1H, 1H-TOCSY были выделены спиновые системы для трех моносахаридных остатков с глюко-, манно- и галакто-конфигурациями. Спиновая система остатка -D-Glcp была идентифицирована на основании корреляций H-1 атома со всеми остальными протонами спиновой системы. Для остатка -L-Rhap были выявлены взаимодействия между атомами Н-1 и Н-2 и между Н-2 атомом и всеми остальными протонами. Последний моносахаридный остаток -D-Galp был обнаружен на основании наличия корреляционных кросспиков от H-1 до H-4 атома, и H-5 атома с H-6. Анализ спектра 1H, 13 C-HSQC ОПС-1 (Рисунок 3) позволил соотнести сигналы протонов всех моносахаридных остатков с соответствующими им атомами углерода (Таблица 7). Последовательность и порядок замещения моносахаридных остатков в полисахариде были определены с помощью 1H, 1H-ROESY и 1H, экспериментов. 13 C-HMBC 61 Рисунок 3 – Спектр 1Н,13С-HSQC ОПС-1 C. pacifica KMM 3879T 62 В спектре 1H, 1H-ROESY ОПС-1 наблюдались следующие корреляции: H-1 α-D-Glcp/H-2 α-L-Rhap при Н/Н 5.09/ 4.06, H-1 β-D-Galp/H-4 α-L-Rhap при Н/Н 4.79/ 3.83 и H-1 α-L-Rhap/H-6 α-D-Glcp при Н/Н 4.94/ 3.91 м.д. Таблица 7 – Данные спектров 1Н- и 13 С-ЯМР ОПС-1 C. pacifica KMM 3879T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток 6)--D-Glcp3SO3--(1 Н/С 1 H 1 1 корреляционные 4 5 6 (6a,6b) 3.82 4.27 3.91,3.91 C 99.3 71.2 83.0 68.8 71.6 67.0 H 4.94 4.06 4.14 3.83 3.90 1.40 C 99.3 77.9 70.9 82.3 68.8 17.9 H 4.79 3.72 4.36 4.31 3.74 3.78,3.82 104.7 71.0 81.5 68.0 75.9 61.9 13 Из данных спектра 1H, 3 3.75 4.56 13 -D-Galp3SO3--(1 2 5.09 13 2,4)--L-Rhap-(1 1 C 13 кросс-пики C-HMBC ОПС-1 (Рисунок 4) были выделены между аномерными протонами и гликозилированными атомами углерода: Н/С H-1 α-D-Glcp/С-2 α-L-Rhap, H-1 βD-Galp/С-4 α-L-Rhap и H-1 α-L-Rhap/С-6 α-D-Glcp при 5.09/77.9, 4.79/82.3 и 4.94/67.0 м.д., соответственно. Эти данные определили последовательность моносахаридных остатков и продемонстрировали, что остаток α-D-Glcp был замещен в положение 6, а остаток α-L-Rhap – в положения 2 и 4. Остаток β-DGalp замещения не имел и находился в боковом ответвлении. Таким образом, повторяющееся звено полисахарида представляет собой разветвленный трисахарид, в боковой цепи которого находится остаток β-D-Galp, а в точке разветвления остаток α-L-Rhap. Значительное смещение в слабое поле сигналов С-3 атомов остатков α-DGlcp и β-D-Galp к С 83.0 и 81.5 м.д., соответственно, в спектре 13С-ЯМР ОПС-1, по сравнению с их положением в незамещенных моносахаридах (С 74.0 и 74.1 м.д., соответственно), указывало на присутствие неуглеводных заместителей 63 Рисунок 4 –Фрагмент спектра 1Н,13С-HMBC ОПС-1 C. pacifica KMM 3879T 64 в третьем положении обоих остатков. Анализ полисахарида турбидиметрическим методом показал присутствие в его составе сульфатных групп (23%), что было подтверждено методом ИК-спектроскопии по наличию характерной полосы интенсивного поглощения при 1253 см-1. Кроме того, положительные α-эффекты для сигналов С-3 атомов (+9.0 и +7.4 м.д.) и отрицательные β-эффекты для С-2 (-1.5 и -2.2 м.д.) и С-4 атомов (-2.1 и -2 м.д.) остатков α-D-Glcp и β-D-Galp, соответственно, также указывали на наличие сульфатных групп и находились в согласии с литературными данными для α- и β-эффектов сульфатирования моносахаридов [157, 158]. Сравнение спектров 13 С-ЯМР нативного и модифицированного полисахаридов позволило определить местоположение О-ацетильной группы. Интенсивность сигналов С-1 и С-3 атомов углерода остатка α-D-Glcp при С 99.3 и 83.0 м.д. в спектре 13С-ЯМР ОПС была меньше по сравнению с сигналами для С-1 и С-3 атомов остатков α-L-Rhap и β-D-Galp. Кроме того, в спектре присутствовали дополнительные сигналы небольшой интенсивности при С 97.2 и 80.5 м.д., которые в спектре интегральной 13 С-ЯМР ОПС-1 отсутствовали. Интенсивность сигнала С-2 атома при С 71.2 м.д. остатка α-DGlcp в спектре 13С-ЯМР ОПС, по сравнению с интенсивностью этого же сигнала в спектре 13 С-ЯМР ОПС-1, также была меньше. Таким образом, на основании полученных результатов и литературных данных (эффекты О-ацетилирования [159]), было установлено, что О-ацетильная группа находится во втором положении остатка α-D-Glcp (степень ацетилирования составляла 30-50%). Для подтверждения наличия сульфатных групп и места присоединения Оацетильной группы нативный ОПС был десульфатирован и модифицированный полисахарид (ОПС-2) изучен методом спектроскопии ЯМР, включая двумерные эксперименты. Полное соотнесение сигналов в спектрах 1Н- и 13С-ЯМР для ОПС2 приведено в Таблице 8. 65 Таблица 8 – Данные спектров 1Н- и 13 С-ЯМР ОПС-2 C. pacifica KMM 3879T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный Н/С 1 6)--D-Glcp-(1 6)--D-Glcp2OAc-(1 1 2 3 4 5 6 (6a,6b) 5.01 3.55 3.77 3.55 4.16 3.92,3.92 C 99.3 72.8 74.0 70.4 71.8 67.4 H 5.23 4.66 3.97 3.56 4.13 3.96,3.96 95.8 4.92 74.5 71.6 70.6 72.1 67.3 4.03 4.12 3.77 3.86 1.38 99.2 4.64 77.3 70.8 82.3 68.9 18.0 3.56 3.66 3.91 3.67 105.0 72.8 73.8 69.9 76.5 H 13 1 13 2,4)--L-Rhap-(1 1 H 13 β-D-Galp-(1 1 C C H 13 C 3.75,3.79 62.1 Смещение сигналов С-3 атомов остатков α-D-Glcp и β-D-Galp в спектре 13СЯМР ОПС-2 в более сильное поле к С 74.0 и 73.8 м.д., соответственно, по сравнению с сигналами С-3 атомов этих остатков в спектре 13 С-ЯМР ОПС-1 (С 83.0 и 81.5 м.д., соответственно, Таблица 7), свидетельствовало об отсутствии сульфатных групп. Следовательно, полученные данные подтверждают, что остатки α-D-Glcp и β-D-Galp в нативном полисахариде замещены в положение 3 сульфатными группами. Место присоединения О-ацетильной группы было подтверждено с помощью эксперимента 2D Selective-TOCSY-DQFCOSY [160] при инверсии сигнала H-1 атома остатка α-D-Glc2OAc при H 5.23 м.д., используя соответствующий 1D TOCSY спектр в качестве внешней проекции. Смещение в более слабое поле сигналов H-2, H-1 и H-3 атомов остатка α-D-Glcp2OAc на 1.11, 0.22 и 0.20 м.д., соответственно, по сравнению с сигналами остатка α-D-Glcp, подтверждало частичное О-ацетилирование остатка α-D-Glc по 2 положению. Абсолютная D-конфигурация остатков α-Glc и β-Galp и L-конфигурация остатка -Rhap были подтверждены на основании величин химических сдвигов сигналов и эффектов гликозилирования, найденных из анализа спектра 13 С-ЯМР 66 ОПС-2 [131]. Сравнительно небольшие α-эффекты для С-2 атома остатка α-Rhap (+5.2 м.д.) и С-1 атома остатка α-D-Glcp (+6 м.д.) в структурном дисахаридном фрагменте α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap свидетельствовали о том, что остатки α-DGlcр и α-L-Rhap имели разную абсолютную конфигурацию (в случае одинаковой абсолютной конфигурации, α-эффекты на C-2 и С-1 атомы остатков α-Rhap и αGlcр были бы значительно больше ~ +9.7 и +9.2 м.д., соответственно). Положительные α-эффекты на С-4 атом остатка α-L-Rhap (+5.2 м.д.) и С-1 атом остатка β-D-Gаlp (+7.3 м.д.), в структурном дисахаридном фрагменте β-D-Gаlp(1→4)-α-L-Rhap, свидетельствовали о том, что остатки β-D-Gаlp и α-L-Rhap также имели разную абсолютную конфигурацию. Таким образом, на основании всех полученных данных, установлено, что повторяющееся звено ОПС C. pacifica KMM 3654T представляет собой разветвленный трисахарид и имеет следующую структуру: →6)-α-D-Glcp2Ac(30-50%)3SO3--(1→2)-α-L-Rhap-(1→ 4 ↑ 1 β-D-Galp3SO3Структура О-антигенного полисахарида C. pacifica KMM 3654T является необычной для грамотрицательных бактерий. Ранее был обнаружен только один сульфатированный ОПС морской бактерии P. agarivorans KMM 232 (S-форма) [81]. Кроме того, несколько грамотрицательных бактерий продуцируют сульфатированные ЭПС [161-164]. Наиболее близким по структуре к ОПС C. pacifica KMM 3654T является ЭПС морской бактерии Pseudomonas WAK-1, повторяющееся звено которого также содержит остатки D-Glcp, D-Galp и две сульфатные группы [161]. 67 2.2 Структурное исследование О-специфического полисахарида Сobetia pacifica KMM 3878 Мягкий кислотный гидролиз ЛПС 1% уксусной кислотой приводил к частичной деградации полисахарида, в связи с наличием в его составе кислотолабильных компонентов. Деградация ЛПС с помощью ацетатного буфера (pH=4.5) и последующая гель-хроматография полисахаридной компоненты позволили получить ОПС С. pacifica KMM 3878. Моносахаридный анализ ОПС методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных полиолов и метилгликозидов выявил наличие остатков Gal и 3,4-O-[1-карбоксиэтилиден]-галактозы (Рисунок 5) в соотношении ~ 2:1. Определение абсолютной конфигурации моносахаридов методом ГЖХ в виде ацетилированных октилгликозидов показало, что все остатки Gal имеют Dконфигурацию. Анализ полисахарида турбидиметрическим методом обнаружил присутствие в его составе сульфатных групп (22.9%), наличие которых было также подтверждено методом ИК-спектроскопии (характерная полоса поглощения при 1253 см-1). Рисунок 5 – Масс-спектр ацетилированного метилгликозида 3,4-O-[1карбоксиэтилиден]-галактозы 68 Спектр 13 C-ЯМР ОПС (Рисунок 6) содержал, среди прочих, три сигнала аномерных атомов углерода в области C 98.6-103.7 м.д. и сигналы, характерные для остатка пировиноградной кислоты при C 24.6 (СН3), 109.1 (ацетальный атом углерода) и 178.8 м.д. (СООН). Эксперимент DEPT-135 показал наличие сигналов атомов углерода одной свободной и двух замещенных гидроксиметильных групп при C 61.6, 70.1 и 70.7 м.д., соответственно. Отсутствие в спектре 13 С-ЯМР сигналов неаномерных и негликозилированных атомов углерода в области более слабого поля чем 81.0 м.д., указывало на то, что все моносахаридные остатки находятся в пиранозной форме. Анализ GD-спектра ОПС подтвердил, что все моносахаридные остатки находятся в пиранозной форме и показал, что все три остатка имели β-конфигурацию гликозидных связей (КССВ 1JC1-H1 160.7-166.3 Гц). В спектре 1H-ЯМР полисахарида были выделены шесть сигналов в области слабого поля при Н 4.78 (КССВ 3JH1,H2 ~ 7 Hz), 4.74 (КССВ 3JH1,H2 ~ 5 Hz), 4.61, 4.52 (двойной интегральной интенсивности), 4.45 (КССВ 3JH1,H2 ~ 8 Hz) м.д., три из которых принадлежали аномерным протонам. В области сильного поля наблюдался сигнал протонов метильной группы остатка пировиноградной кислоты при Н 1.59 м.д. Полное соотнесение сигналов в спектрах 1H- и 13 C-ЯМР О-антигенного полисахарида было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1HCOSY, 1H, 1H-TOCSY и гетероядерных 1H, 13 C-HSQC 1H, 13 C-H2BC и 1H, 13 C- HMBC экспериментов. Анализ спектров 1H, 1H-COSY и 1H, 1H-TOCSY ОПС выявил спиновые системы для трех моносахаридных остатков c галакто-конфигурацией на основании корреляционных кросс-пиков от H-1 до H-4 атома и H-5 атома с H-6, обозначенных как -D-GalIp, -D-GalIIp и -D-GalIIIp. Данные спектра 1H, 13C-HSQC (Рисунок 7) ОПС позволили отнести сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для остатков -D-GalIIp и D-GalIIIp (Таблица 9). 69 Рисунок 6 – Спектр 13С-ЯМР ОПС C. pacifica KMM 3878 70 Рисунок 7 –Спектр 1H, 13C-HSQC ОПС C. pacifica KMM 3878 71 В спектре 1H, 13C-HSQC также присутствовал корреляционный кросс-пик, соответствующий метильной группе пировиноградной кислоты при Н/C 1.59/24.6 м.д. Плохое разрешение сигналов Н-2 и Н-3 атомов остатка -D-GalIp не позволило провести соотнесение сигналов его С-2, С-3 и С-4 атомов. Полное соотнесение сигналов для остатка -D-GalIp было проведено с использованием 1H, 13 C-H2BC эксперимента (Таблица 9). Присутствие в спектре 1H, 13 C-H2BC ОПС (Рисунок 8) корреляционного кросс-пика H-1/C-2 при Н/C 4.78/77.2 м.д. свидетельствовало о том, что сигнал С-2 атома остатка -D-GalIp находился при C 77.2 м.д. Наличие наблюдаемого нами корреляционного кросс-пика H-3/C-2 при Н/C 4.52/77.2 м.д. возможно только в том случае, если сигнал С-3 атома находится при C 79.1 м.д. Следовательно, С-4 атому остатка -D-GalIp соответствовал сигнал при C 74.8 м.д. Таблица 9 – Данные спектров 1Н- и 13 С-ЯМР ОПС C. pacifica KMM 3878 (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток 4-β-D-Gal I p2,3SO3--(1 6)-β-D-GalIIp3,4(S-Pyr)-(1 Н/С 1 4 5 6 (6a,6b) 4.51 4.52 4.61 3.81 3.82,3.87 C 103.0 77.2 79.1 74.8 75.0 61.6 H 4.45 3.46 4.22 4.10 4.26 3.99,4.18 C 103.4 74.5 79.7 76.2 73.7 70.1 H 4.74 3.59 3.73 4.02 3.86 3.86,4.23 C 104.6 72.1 73.7 70.0 75.3 71.2 H 1.59 H 13 1 13 6)-β-D-GalIIIp-(1 1 13 S-Pyr 1 13 C 1 4.78 2 3 178.8 109. 24.6 Линейный характер полисахарида следовал из относительно слабопольных сигналов для С-4 атома остатка -D-GalIp и С-6 атомов остатков -D-GalIIp и -DGalIIIp при 74.8, 70.1 и 71.2 м.д., соответственно, наблюдаемых в спектре 13С-ЯМР ОПС. 72 Рисунок 8 – Фрагмент спектра 1Н,13С-H2BC ОПС C. pacifica KMM 3878 73 В спектре 1H, 1H-ROESY ОПС присутствовали все три межзвеньевые корреляции между H-1 -D-GalIp/H-6 -D-GalIIp, H-1 -D-GalIIp/H-6 -D-GalIIIp и H-1 -D-GalIIIp/H-4 -D-GalIp при Н/Н 4.78/ 3.99, 4.45/ 3.86, 4.23 и 4.74/4.61 м.д., соответственно. Спектр 1 H, 13 C-HMBC ОПС (Рисунок 9) показал наличие межзвеньевых корреляционных кросс-пиков между аномерными протонами и гликозилированными атомами углерода: H-1 -D-GalIp/С-6 -D-GalIIp, H-1 -DGalIIp/С-6 -D-GalIIIp и H-1 -D-GalIIIp/С-4 -D-GalIp при Н/C 4.78/ 70.1, 4.45/ 71.2 и 4.74/ 74.8 м.д., соответственно. Эти данные определили последовательность и порядок замещения в полисахаридной цепи. Место присоединения остатка пировиноградной кислоты установлено на основании данных 1H, 13C-HMBC эксперимента по наличию корреляции между Н3 атомом -D-GalIIp остатка и ацетальным атомом углерода остатка пировиноградной кислоты (Н/C 4.22/109.1 м.д.), что возможно, если остаток пировиноградной кислоты присоединяется в положение 3 остатка -D-GalIIp. Кроме того, в спектрах 1H- и 13C-ЯМР ОПС химические сдвиги сигналов остатка пировиноградной кислоты и остатка -D-GalIIp находились в соответствии с литературными данными для 3,4-O-[1-карбоксиэтилиден]-β-D-галактопиранозы (α-эффекты на C-3 и C-4 атомы остатка -D-GalIIp имели значение +5.6 и +6.2 м.д., соответственно; сигнал C-1 атома пировиноградной кислоты при С 109.1 м.д. был таким же, как для 1,3-диоксоланового кольца) [165, 166]. Таким образом, остаток пировиноградной кислоты присоединен к остатку -D-GalIIp в положения 3 и 4. Абсолютная S-конфигурация остатка пировиноградной кислоты была определена из данных спектров 1 H- и 13 C-ЯМР на основании значений химических сдвигов сигналов метильной группы при Н 1.59 и С 24.6 м.д., соответственно [165]. Кроме того, единственный корреляционный кросс-пик CH3-группы пировиноградной кислоты с Н-2 атомом остатка -D-GalIIp при Н/Н 1.59/3.46 м.д., найденный из спектра 1H, 1H-ROESY, также указывал на S-конфигурацию ацетального углерода остатка пировиноградной кислоты. 74 Рисунок 9 – Фрагмент спектра 1Н,13С-HMBC ОПС C. pacifica KMM 3878 75 В случае R-конфигурации наблюдался бы корреляционный кросс-пик CH3группы с H-4 атомом остатка -D-GalIIp. Локализация сульфатных групп определена на основании величин химических сдвигов сигналов в спектре 13 С-ЯМР ОПС и эффектов сульфатирования [158]. Значительное смещение в слабое поле сигналов С-2, С-3 и H-2, H-3 атомов остатка -D-GalIp к C 77.2 (α-эффект +5.6 м.д.), 79.1(α-эффект +5.3 м.д.) и Н 4.51 (α-эффект +0.99 м.д), 4.52 (α-эффект +0.87 м.д) м.д., соответственно, по сравнению с их положением в незамещенных моносахаридах (C 73.2 и 74.1 м.д., соответственно), указывало на присутствие сульфатных групп во втором и третьем положениях остатка -D-GalIp. Такие небольшие наблюдаемые эффекты сульфатирования, по сравнению с литературными данными (+7.2 м.д. для С-2, +7.8 м.д. для С-3 атомов), могут быть вызваны нарушением аддитивности в результате 2,3-расположения сульфатных групп в моносахаридном остатке. Таким образом, на основании полученных данных, установлено, что ОПС C. pacifica KMM 3678 построен из линейных трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих остатки -D-Galp, пировиноградной кислоты и сульфатные группы: →4)-β-D-Galp2,3SO3--(1→6)-β-D-Galp3,4(S-Pyr)-(1→6)-β-D-Galp-(1→ Как и в случае ОПС C. pacifica KMM 3879T, повторяющееся звено Оантигенного полисахарида C. pacifica KMM 3878 представлено трисахаридом, cодержащим две сульфатные группы. Отличительной особенностью данного полисахарида является наличие дисульфатированного моносахарида 2,3-Одисульфат-D-галактозы, обнаруженного в природе впервые. Пировиноградная кислота является частым компонентом бактериальных полисахаридов, но остаток D-Galp3,4(S-Pyr) был идентифицирован лишь в составе ОПС P. mirabilis O24 PrK 47/57 [164] и КПС Klebsiella pneumoniae K13, K30, K33 [167-169]. 76 2.3 Структурное исследование О-специфического полисахарида Rheinheimera pacifica КММ 1406T ОПС R. pacifica КММ 1406T был получен при деградации ЛПС 2% уксусной кислотой и последующей гель-хроматографии углеводной фракции. Анализ моносахаридов методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных метилгликозидов показал, что в состав полисахарида входят остатки GalN, GalNA, QuiN4N, Qui4N в соотношении ~ 1:2:1:1. Анализ полисахарида с помощью аминокислотного анализатора привел к идентификации Ala и двух аминосахаров, один из которых имел время удерживания такое же, как у GalN, а другой – как у GalNA. Абсолютная D-конфигурация остатка Ala была определена на основании величины его удельного оптического вращения. Абсолютная Dконфигурация остатка GalN установлена методом ГЖХ в виде ацетилированных октилгликозидов. Первичный анализ спектра 13 C-ЯМР ОПС (Рисунок 10) показал, среди прочих, наличие сигналов пяти аномерных атомов углерода при C 98.6, 99.0, 99.2, 103.3 и 103.7 м.д., указывающих на пентасахаридный размер повторяющегося звена, одной CH2-OH-группы при 60.3 м.д. (С-6 D-GlcN, данные эксперимента DEPT-135), семи атомов углерода, связанных с азотом в области C 50.5 58.5 м.д. (C-2 остатков D-GalN, GalNAI и GalNAII, C-4 остатка Qui4N, C-2 и C-4 остатка QuiN4N и C-2 остатка Ala), трех CH3-групп при C 18.1 (C-3 остатка Ala), 17.8 и 18.0 м.д. (C-6 остатков QuiN4N и Qui4N, соответственно), трех СООНгрупп при C 172.8, 174.1 и 177.0 м.д. (C-6 остатков GalNAII и GalNAI и C-1 остатка Ala, соответственно), шести N-ацетильных групп в области C 22.9-23.5 м.д. (CH3) и 175.3-175.9 м.д. (CO). Анализ GD-спектра ОПС показал, что все моносахаридные остатки находятся в пиранозной форме и что остатки с С-1 атомом углерода при C 103.3 и 103.7 м.д. имеют β-конфигурацию гликозидной связи (КССВ 1JC1-H1 162.3 и 161.1 Гц, соответственно), а остатки с С-1 атомом углерода при C 98.6, 99.0 и 99.2, м.д. α-конфигурацию (КССВ 1JC1-H1 175.3, 175.3 и 171.4 Гц, соответственно). 77 Спектр 1H-ЯМР полисахарида содержал шесть сигналов в аномерной области (пять сигналов аномерных протонов при H 5.35 (КССВ 3JH1,H2 ~ 4 Hz), 5.23 (КССВ 3JH1,H2 ~ 4 Hz), 5.11 (КССВ 3JH1,H2 ~ 4 Hz), 4.63 (КССВ 3JH1,H2 ~ 6-8 Hz), 4.48 (КССВ 3JH1,H2 ~ 6-8 Hz) м.д. и один при H 5.07 м.д. для H-5 остатка GalNAII), три сигнала CH3-групп при H 1.38 (С-3 остатка D-Ala, КССВ 3JH2,H3 ~ 7 Hz), 1.11 (C-6 остатка Qui4N, КССВ 3JH5,H6 ~ 6 Hz) и 1.09 м.д. (C-6 остатка QuiN4N, КССВ 3 JH5,H6 ~ 6 Hz), а также шесть сигналов протонов N-ацетильных групп в области H 1.95-2.04 м.д. Полное соотнесение сигналов в спектрах 1H- и 13 C-ЯМР ОПС было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1H-COSY, 1H, 1HTOCSY и гетероядерных 1H, 13C-HSQC, 1H, 13C-H2BC, 1H, 13C-HSQC-TOCSY и 1H, 13 C-HMBC экспериментов. Анализ спектров 1 H, 1 H-COSY и 1 H, 1 H-TOCSY позволил выделить спиновые системы для трех моносахаридных остатков c галакто-конфигурацией: для одного из них наблюдалась корреляция от H-1 до H-4 атома и между атомами H-6 и H-5 (A); два других имели корреляционные кросс-пики от H-1 до H-4 атома и между H-4 и H-5 атомами (B и E). Кроме того, спектры 1H, 1H-COSY и 1H, 1HTOCSY показали наличие двух спиновых систем, соответствующих моносахаридным остаткам с глюко-конфигурацией, определенных на основании корреляционных кросс-пиков от H-1 до H-6 атома, причем H-6 атомы этих остатков принадлежали метильным группам 6-дезоксисахаров (C и D), а также спиновой системы, состоящей из протонов фрагмента остатка D-Ala. Моносахаридные остатки обозначены в соответствии с их расположением в таблице 10. Анализ спектра 1H, 13 C-HSQC ОПС (Рисунок 11) позволил соотнести сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для всех моносахаридных остатков (Таблица 10). . 78 Рисунок 10 – спектр 13С-ЯМР ОПС R. pacifica KMM 1406T 79 Было установлено, что С-2 атомы моносахаридных остатков A, B, C и E при C 51.1, 50.5, 57.7 и 52.6 м.д., соответственно, также как C-4 атомы остатков C и D при C 56.7 и 58.5 м.д., соответственно, связаны с атомами азота. Корреляционные кросс-пики H-2/C-2 и H-6/C-6 при Н/C 4.16/51.1 и 3.55, 3.66/60.3 м.д., соответственно, свидетельствовали о том, что моносахаридный остаток А являлся производным α-D-GalpN. Корреляционный кросс-пик H-2/C-2 при Н/C 4.28/50.5 и присутствие дальнего спин-спинового взаимодействия между сигналом Н-5 атома и карбоксильной группой при Н/C 4.29/174.1 м.д. (данные спектра 1H, 13CHMBC) позволили идентифицировать остаток B как производное α-GalpNАI. Корреляционные кросс-пики H-2/C-2 при Н/C 4.07/52.6 м.д. (данные спектра 1H, 13 C-HSQC) и H-5/C-6 при Н/C 5.07/172.8 м.д. (данные спектра 1H, 13 C-HMBC) показали, что остаток Е также являлся производным α-GalpNАII. Кросс-пики H2/C-2, H-4/C-4 и H-6/C-6 при Н/C 3.85/57.7, 3.61/56.7 и 1.09/17.8 м.д., соответственно, позволили определить остаток С как производное -QuipN4N. Из-за плохого разрешения сигналов Н-3 и Н-4 атомов моносахаридного остатка D, для соотнесения сигналов его С-3 и С-4 атомов был использован 1H, 13C-H2BC эксперимент (Рисунок 12). Присутствие в спектре 1 H, 13 C-H2BC ОПС корреляционных кросс-пиков H-2/C-3 при Н/C 3.48/75.2 и H-5/C-4 при Н/C 3.40/58.5 м.д. указывало на то, что сигнал С-3 атома находился при C 75.2 м.д., а сигнал С-4 атома – при C 58.5 м.д. На основании данных, полученных в результате 1H, 13C-H2BC эксперимента, а также корреляционного кросс-пика Н6/С-6 при Н/C 1.11/18.0 м.д., найденного из спектра 1H, 13C-HSQC, был сделан вывод, что моносахаридный остаток D являлся производным -Quip4N. Наличие остатка D-Ala, было подтверждено по наличию кросс-пика H-2 атома этого остатка с сигналом углерода его карбоксильной группы при Н/C 4.25/177.0 м.д., найденного из спектра 1H, 13C-HMBC. Значительное смещение в слабое поле химических сдвигов сигналов С-4 атомов остатков -D-GalpN, -GalpNAI, -GalpNAII, С-3 атома остатка QuipN4N и С-2 атома остатка -Quip4N при C 77.3, 76.7, 81.4, 77.1 и 81.9 м.д., 80 соответственно, (Таблица 10) по сравнению с их значениями в незамещенных моносахаридах (C 69.9, 70.9, 70.9, 72.8 и 75.1 м.д., соответственно [131, 170-172]), указывало на порядок замещения моносахаридных остатков в полисахариде. Таблица 10 – Данные спектров 1Н- и 13 С-ЯМР ОПС R. pacifica KMM 1406T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток A 4)--D-GalpNAc-(1 Н/С 1 H 1 5.35 2 3 4.16 4.03 4 4.07 5 6(6a,6b) 3.92 3.55, 3.66 13 C 99.2 51.5 67.4 77.3 72.2 H 5.23 4.28 4.00 4.43 4.29 C 98.6 50.5 68.7 76.7 71.8 174.1 H 4.63 3.85 3.81 3.61 3.56 1.09 C 103.3 57.7 77.1 56.7 70.9 17.6 H 4.48 3.49 3.52 3.52 3.40 1.11 C 103.7 81.9 75.2 58.5 71.7 18.0 H 5.11 4.07 4.16 4.57 5.07 99.0 52.6 68.4 81.4 70.8 B 4)--L-GalpNAcAI-(1 1 13 C 3)--D-QuipNAc4NAc-(1 1 13 D 2)--D-Quip4N(Acyl)-(1 1 13 E 4)--D-GalpNAcAII-(1 1 13 1 D-AlaAc C H 13 C 60.3 172.8 4.25 1.38 177.0 51.3 18.1 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δH 1.95-2.04; δC 22.9-23.5 (Me), 175.3-175.9 (CO) Таким образом, повторяющееся звено полисахарида представляло собой линейный пентасахарид, состоящий из остатков α-GalpN, -QuipN4N, -Quip4N, двух остатков α-GalpNА и D-Ala. Рисунок 11 – Спектр 1Н,13С-HSQC ОПС R. pacifica KMM 1406T 81 Ala-2 82 Рисунок 12 – Фрагмент спектра 1Н,13С-H2BC ОПС R. pacifica KMM 1406T 83 Последовательность моносахаридных остатков в полисахариде была определена с помощью 1H, 1H-ROESY и 1H, 13C-HMBC экспериментов. Спектр 1H, 1 H-ROESY ОПС содержал корреляционные кросс-пики не только между протонами в моносахаридных циклах, но и целый ряд межзвеньевых корреляций. Учитывая порядок замещения моносахаридов, определенный из спектра 13C-ЯМР ОПС, корреляции при Н/Н 5.35/4.43, 5.23/3.81, 4.63/3.49, 4.48/4.57 и 5.11/4.07 м.д. были интерпретированы как корреляции между сигналами аномерных протонов и протонами при атомах углерода, участвующих в образовании гликозидных связей: H-1 -D-GalpN/H-4 -GalpNAcAI, H-1 -GalpNAcAI/H-3 QuipN4N, H-1 -QuipN4N/H-2 -Quip4N, H-1 -Quip4N/H-4 -GalpNAcAII и H-1 -GalpNAcAII/H-4 -D-GalpN, соответственно. Спектр 1 H, 13 C-HMBC ОПС (Рисунок 13) показал наличие межзвеньевых корреляционных пиков между сигналами аномерных протонов и гликозилированными атомами углерода: H-1 D-GalpN/C-4 -GalpNAcAI, H-1 -GalpNAcAI/C-3 -QuipN4N, H-1 -QuipN4N/C-2 -Quip4N, H-1 -Quip4N/C-4 -GalpNAcAII и H-1 -GalpNAcAII/C-4 -D-GalpN при Н/С 5.35/76.7; 5.23/77.1, 4.63/81.9, 4.48/81.4 и 5.11/77.3 м.д., соответственно. Места присоединения остатка D-Ala и N-ацетильных групп были определены также с помощью 1H, 13C-HMBC эксперимента. Было установлено, что сигналы протонов при С-2 атоме остатков -D-GalpN, -GalpNAcAI, QuipN4N и -GalpNAcAII, при С-4 атоме остатка -QuipN4N и С-2 атоме остатка D-Ala коррелируют с соответствующими сигналами карбонильных атомов углерода N-ацетильных групп при Н/С 4.16/175.9, 4.28/175.7, 3.85/175.3, 4.07/175.3, 3.61/175.8 и 4.25/175.3 м.д., соответственно. Корреляционный кросспик между С-1 атомом остатка D-AlaAc и Н-4 атомом остатка -Quip4N при С/Н 177.0/3.52 м.д. свидетельствовал о том, что остаток аминокислоты присоединялся к аминогрупе в положении 4 остатка -Quip4N. 84 Рисунок 13 – Фрагмент 1Н,13С-HMBC-спектра ОПС R. pacifica KMM 1406T 85 Абсолютные конфигурации моносахаридных остатков были определены на основании значений химических сдвигов сигналов и - и β-эффектов гликозилирования, найденных из анализа спектра 13 C-ЯМР ОПС [131]. Сравнительно небольшой α-эффект на С-4 атом остатка -GalpNAcAI (+5.8 м.д.) в структурном дисахаридном фрагменте -D-GalpNAc-(1→4)--GalpNAcAI свидетельствовал о том, что остатки -D-GalpNAc и -GalpNAcAI имели разные D-L абсолютные конфигурации (в случае одинаковой абсолютной конфигурации, α-эффект на C-4 атом остатка -GalpNAcAI был бы значительно больше ~ +9.3 м.д). Относительно небольшой α-эффект на С-3 атом (+4.3 м.д.) и отрицательный β-эффект на С-4 атом (-1.4 м.д.) остатка -QuipNAc4NAc в структурном дисахаридном фрагменте -L-GalpNAcAI-(1→3)--QuipNAc4NAc свидетельствовал о том, что эти остатки имели различные L-D абсолютные конфигурации. Незначительный положительный β-эффект (+0.6 м.д.) на С-3 остатка -Quip4N(D-AlaAc) в структурном дисахаридном фрагменте ОПС -DQuipNAc4NAc-(1→2)--Quip4N(D-AlaAc) указывал на то, что остатки -DQuipNAc4NAc и -Quip4N(D-AlaAc) имели одинаковую D-конфигурацию (в противном случае β-эффект на С-3 был бы ~ -1.3 м.д). Большой положительный αэффект на С-4 атом остатка -GalpNAcAII (+10.5 м.д.) в структурном дисахаридном свидетельствовал фрагменте об идентичной -D-Quip4N(D-Ala)-(1→4)--GalpNAcAII D-конфигурации этих моносахаридов. Отрицательный β-эффект (-1 м.д.) на С-3 атом остатка -D-GalpNAc в структурном дисахаридном фрагменте -D-GalpNAcAII-(1→4)--D-GalpNAc, подтверждал, что остатки -D-GalpNAcAII и -D-GalpNAc имели одинаковую абсолютную D-конфигурацию. Для подтверждения полной структуры повторяющегося звена ОПС подвергали сольволизу безводной трифторметансульфокислотой с последующей гель-хроматографией полученных продуктов. Полученный при этом олигосахарид был изучен методом спектроскопии ЯМР. Анализ олигосахарида с помощью двумерных 1H, 1H-COSY, 1H, 1H-TOCSY, 1H, 1H-ROESY, 1H, 13С-HSQC и 1H, 13С- 86 HMBC экспериментов, включая полное соотнесение сигналов в спектрах1H-и 13CЯМР (Таблица 11), позволил установить его структуру: α-L-GalpNAcAI-(1→3)-α, β-D-QuipNAc4NAc Таблица 11 – Данные спектров 1Н- и 13 С-ЯМР олигосахарида, полученного при сольволизе ОПС R. pacifica KMM 1406T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток -L-GalpNAcAI-(1 3)--D-QuipNAc4NAc Н/С 1 H 1 5.23 2 3 4.18 3.83 4 4.32 5 4.13 6 (6a,6b) 13 C 97.9 50.8 68.6 70.7 73.0 175.9 H 5.08 4.11 4.00 3.71 4.05 1.19 C 91.6 55.8 73.7 56.3 67.1 17.8 H 5.21 4.20 3.82 4.31 4.13 C 98.3 50.8 68.6 70.7 72.9 175.9 H 4.63 3.91 3.84 3.71 3.62 1.23 95.8 58.2 76.3 56.3 71.7 17.8 1 13 -L-GalpNAcAI-(1 1 13 3)-β-D-QuipNAc4NAc 1 13 C Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δC 22.8-23.2 (Me), 174.6-175.3 (CO) Анализ эффектов гликозилирования, найденных из данных спектра 13 C- ЯМР олигосахарида подтвердил различную абсолютную конфигурацию остатков α-L-GalpNAcAI и D-QuipNAc4NAc. Таким образом, на основании полученных результатов установлено, что повторяющееся звено ОПС R. pacifica KMM 1406T представляет собой линейный пентасахарид и имеет следующую структуру: →4)-α-D-GalpNAc-(1→4)-α-L-GalpNAcA-(1→3)-β-D-QuipNAc4NAc-(1→2)-β-D-Quip4N(DАlaAc)-(1→4)-α-D-GalpNAcA-(1→ Интересно отметить, что все пять моносахаридных остатков в повторяющемся звене представлены аминосахарами. ОПС R. pacifica KMM 1406T является вторым бактериальным полисахаридом, содержащим одновременно D- и L-изомеры GalNAcA. Ранее оба этих остатка были обнаружены в ОПС P. 87 haloplanktis ATCC 14393 [64]. Кроме этого, ОПС R. pacifica KMM 1406T имеет очень близкую структуру повторяющегося звена с ОПС P. haloplanktis ATCC 14393 и КПС Alteromonas sp. КMM 155 [173]. О-антигенный полисахарид P. haloplanktis ATCC 14393 также построен из пентасахаридных повторяющихся звеньев и содержит остаток β-D-Quip3N(DАlaAc) вместо β-D-Quip4N(DАlaAc) и остаток α-D-Galp2,6Ас вместо α-D-GalpNAc. Отличием КПС Alteromonas sp. КMM 155 от ОПС R. pacifica KMM 1406T является отсутствие остатка α-DGalpNAcA. 2.4 Структурное исследование О-специфического полисахарида Idiomarina abyssalis КММ 227T ЛПС I. abyssalis КММ 227T был получен из сухих бактериальных клеток экстракцией горячим водным фенолом. Мягкий кислотный гидролиз ЛПС 1% уксусной кислотой привел к частичной деградации полисахарида. Поэтому ОПС был получен в условиях мягкого щелочного гидролиза ЛПС 0.1М раствором NaOH и последующей гель-хромотографии углеводной компоненты. Моносахаридный анализ ОПС методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных метилгликозидов привел к идентификации остатков Rha, GlcNA, QuiN4N, Qui3N в соотношении ~ 1:2:1:1. Спектр 13C-ЯМР ОПС (Рисунок 14) содержал сигналы для пяти аномерных атомов углерода при C 99.6, 101.8, 102.5, 103.4 и 104.2 м.д., пяти атомов углерода, связанных с азотом в области C 56.1-57.3 м.д. (С-2 остатков GlcNAI и GlcNAII, C-3 остатка Qui3N, C-2 и C-4 остатка QuiN4N), трех CH3-групп при C 17.3-18.0 м.д. (C-6 остатков Rha, Qui3N и QuiN4N), трех атомов углерода 4гидроксибутановой кислоты при C 28.7, 33.8 м.д. и 62.2 м.д. (C-2, C-3 и C-4 атомы соответственно), четырех N-ацетильных групп в области C 23.5-23.8 м.д., (СН3) и в области C 175.2 – 175.4 м.д. (СО), трех COOH-групп при C 173.6, 174.6 (C-6 остатков GlcNAI и GlcNAII) и 178.1 (С-1 остатка 4-гидроксибутановой кислоты) м.д. Анализ спектра 13 C-ЯМР ОПС, снятого без подавления спин- 88 спинового взаимодействия углеродов с протонами, показал, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме, остатки с С-1 атомом углерода при C 101.8, 102.5, 103.4 и 104.2 м.д., имели β-конфигурацию гликозидной связи (КССВ 1JC1-H1 160.0 166.4 Гц), а остаток с С-1 атомом углерода при C 99.6 м.д. α-конфигурацию (КССВ 1JC1-H1 175.5). Соответственно в спектре 1H-ЯМР ОПС были выделены сигналы для пяти аномерных протонов при H 5.14 (3JH1,H2 < 3 Гц), 4.65 (3JH1,H2 ~ 6-8 Гц), 4.55 (3JH1,H2 ~ 6-8 Гц), 4.52 (3JH1,H2 ~ 6-8 Гц), 4.44 (3JH1,H2 ~ 6-8 Гц) м.д., трех CH3-C-групп при H 1.32 (КССВ 3JH2,H3 ~ 6 Hz), 1.31 (КССВ 3JH5,H6 ~ 6 Hz) и 1.23 (КССВ 3JH5,H6 ~ 5 Hz) м.д., сигналы CH2- и CH2ОН-групп 4-гидроксибутановой кислоты при H 2.34, 1.84 и 3.61 м.д. соответственно, а также сигналы протонов N-ацетильных групп в области H 1.93 – 2.07 м.д. Полное соотнесение сигналов в 1 H- и 13 C-ЯМР-спектрах ОПС было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1H-COSY, 1H, 1HTOCSY и гетероядерных 1H, 13C-HSQC, 1H, 13C-H2BC1H, 13C-HSQC-TOCSY и 1H, 13 C-HMBC экспериментов. Данные спектров 1H, 1H-COSY и 1H, 1H-TOCSY ОПС позволили выделить спиновые системы для пяти моносахаридных остатков. Две спиновые системы для моносахаридов с глюко-конфигурацией, обозначенные как А и С, были выделены на основании корреляционных кросс-пиков от H-1 до H-5 атомов. На основании корреляционных кросс-пиков от H-1 до H-6 атомов, (Н-6 атомы принадлежали метильным группам 6-дезоксисахаров), были выделены еще две спиновые системы для моносахаридов c глюко-конфигурацией, обозначенные как B и E. Корреляции, наблюдаемые между сигналами H-1 и Н-2 атомов и от Н-2 до H-6 атома (H-6 атомы этого остатка также принадлежали метильной группе 6дезоксисахара), выявили наличие спиновой системы, моносахаридному остатку с манно-конфигурацией (D). соответствующей 89 Рисунок 14 – Спектр 13С-ЯМР ОПС I. abyssalis КММ 227T 90 Кроме сигналов спиновых систем, соответствующих моносахаридным остаткам, в спектре были выделены корреляционные кросс-пики, отнесенные к взаимодействию между атомами Н-2, H-3 и Н-4 остатка 4-гидроксибутановой кислоты. Моносахаридные остатки обозначены в соответствии с их раположением в таблице 12. Таблица 12 – Данные спектров1Н- и 13 С-ЯМР ОПС I. abyssalis КММ 227T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток A 4)--D-GlcpNAcAI-(1 Н/С 1 4 5 3.55 3.69 3.69 3.65 C 103.4 56.1 72.4 82.7 76.9 173.6 H 4.52 3.61 3.84 3.50 3.49 1.23 C 101.8 57.3 79.4 56.9 71.1 18.2 H 4.55 3.83 3.88 3.73 3.86 C 102.5 56.3 76.5 77.8 76.5 174.6 H 5.14 3.95 3.76 3.43 4.37 1.31 C 99.6 83.1 70.8 73.8 69.9 17.9 H 4.65 4.06 3.99 3.25 3.65 1.32 C 104.2 78.9 56.7 74.4 74.3 18.2 H 2.34 1.84 3.61 178.1 33.8 28.7 62.2 H 13 B 3)--D-QuipNAc4NAc-(1 1 13 C 3,4)--D-GlcpNAcAII-(1 1 13 D 2)--L-Rhap-(1 1 13 E -D-Quip3N(4Hb)-(1 1 13 4Hb = -CO-CH2-CH2-CH2OH 1 13 C 1 4.44 2 3 6 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δH 1.93-2.07; δC 23.5-23.8 (Me), 175.2-175.4 (CO) Анализ спектра 1H, 13C-HSQC (Рисунок 15, Таблица 12) позволил соотнести сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для всех моносахаридных остатков. Было показано, что С-2 атомы остатков A, B и C при C 56.1, 57.3 и 56.3 м.д., соответственно, также как C-4 атом остатка B и С-3 атом остатка E при C 56.9 и 56.7 м.д., соответственно, связаны с атомами азота. Корреляционные кросс-пики H-2/C-2 при Н/C 3.55/56.1 м.д. и наличие дальнего спин-спинового взаимодействия между сигналом Н-5 атома и карбоксильной 91 группой при Н/C 3.65/173.6 м.д. (данные спектра 1H, 13 C-HMBC) позволило идентифицировать остаток А как производное β-GlcpNАI. В связи с плохим разрешением сигналов Н-3 и Н-4 атомов точное соотнесение сигналов его С-3 и С-4 атомов было проведено с использованием 1H, 13 C-H2BC эксперимента. Присутствие в спектре 1H, 13C-H2BC ОПС корреляционных кросс-пиков H-2/C-3 при Н/C 3.55/72.4 м.д. и H-5/C-4 при Н/C 3.65/82.7 м.д. указывало на то, что сигнал С-3 атома находился при C 72.4 м.д., а сигнал С-4 атома – при C 82.7 м.д. Корреляционные кросс-пики H-2/C-2 при Н/C 3.83/56.3 м.д. (данные спектра 1H, 13C-HSQC) и H-5/C-6 при Н/C 3.86/174.6 м.д. (данные спектра 1H, 13CHMBC) свидетельствовали о том, что остаток C также являлся производным βGlcpNАII. Кросс-пики между H-2/C-2, H-4/C-4 и H-6/C-6 при Н/C 3.61/57.3, 3.50/56.9 и 1.23/18.2 м.д., соответственно, в спектре 1H, 13 C-HSQC, позволили идентифицоравать остаток В как производное -QuipN4N. Корреляционные кросс-пики H-3/C-3 и H-6/C-6 при Н/C 3.99/56.7 и 1.32/18.2 м.д., соответственно, указывали на то, что моносахаридный остаток E являлся производным -Quip3N. Последний моносахаридный остаток D с манно-конфигурацией был идентифицирован как α-Rhap. Присутствие остатка 4-гидроксибутановой кислоты было показано на основании наличия спин-спинового взаимодействия между атомами H-2 и H-3 этого остатка с сигналом углерода его карбоксильной группы при Н/C 2.34, 1.84/178.1 м.д. Значительное смещение в слабое поле химических сдвигов сигналов С-4 атома остатка -GlcpNAI, С-3 атома остатка -QuipN4N, С-3 и С-4 атомов остатка -GlcpNAcAII и С-2 атома остатка -L-Rhap при C 82.7, 79.4, 76.5, 77.8 и 83.1 м.д., соответственно, в спектре незамещенных соответственно) моносахаридах [131, 13 С-ЯМР ОПС, по сравнению с их значениями в (C 170-172], 73.1, 72.8, указывало 74.5 на и 73.1, порядок 72.1 м.д., замещения моносахаридных остатков в полисахариде. Наличие 3,4-дизамещенного остатка GlcpNAcAII означало, что полисахарид имел разветвленную структуру, с точкой разветвления на данном моносахариде. 92 Рисунок 15 – Спектр 1Н,13С-HSQC ОПС I. abyssalis КММ 227T 93 Последовательность замещения моносахаридных остатков в ОПС была определена с помощью 1H, 1H-ROESY и 1H, 13C-HMBC экспериментов. В спектре 1H, 1H-ROESY ОПС присутствовали корреляционные кросс-пики между аномерными протонами и протонами при атомах углерода участвующих в образовании гликозидных связей: H-1 -GlcpNAI/H-3 -QuipN4N, H-1 GlcpNAcAII/H-4 -GlcpNAI, H-1 -Rhap/H-4 -GlcpNAcAII и H-1 -Quip3N/H-2 Rhap при Н/Н 4.44/3.84, 4.55/3.69, 5.14/3.73 и 4.65/3.95 м.д., соответственно. Спектр 1H, 13C-HMBC ОПС (Рисунок 16) показал наличие корреляционных кросспиков между аномерными протонами и гликозилированными атомами углерода: H-1 -GlcpNAI/С-3 -QuipN4N, H-1 -GlcpNAcAII/С-4 -GlcpNAI, H-1 -Rhap/ С-4 -GlcpNAcAII и H-1 -Quip3N/С-2 -Rhap при Н/С 4.44/79.4, 4.55/82.7, 5.14/77.8 и 4.65/83.1 м.д., соответственно. На основании того, что химический сдвиг сигнала С-3 атома моносахаридного остатка -GlcpNAcAII был сдвинут в слабое поле к C 76.5, по сравнению с его значением в незамещенном моносахариде (C 74.5 м.д.), было сделано предположение, что остаток -QuipN4N гликозилировал остаток -GlcpNAII в положение 3. Эти данные подтверждали, что остаток GlcpNAII являлся точкой разветвления. Наличие корреляций H-1 -Quip3N/С-2 -L-Rhap и H-1 -L-Rhap/С-4 GlcpNAcAII и отсутствие корреляции с атомами остатка -Quip3N свидетельствовало о том, что дисахаридный фрагмент -Quip3N-(1→2)--LRhap1→ находился в боковой цепи и присоединялся к остатку -GlcpNAcAII в положение 4. Места присоединения остатка 4-гидроксибутановой ацетильных групп также были определены с помощью кислоты 1 H, 13 и N- C-HMBC эксперимента. Химический сдвиг сигнала С-3 атома остатка -Quip3N при С 56.7 м.д. указывал на то, что аминогруппа, при этом атоме углерода ацилирована. 94 Рисунок 16 – Фрагмент спектра 1Н,13С-HMBC ОПС I. abyssalis КММ 227T 95 Корреляционные кросс-пики между С-1 атомом остатка 4- гидроксибутановой кислоты и Н-3 и Н-2 атомами остатка -Quip3N при С/Н 178.1/3.99 и 178.1/4.06 м.д., соответственно, свидетельствовали о том, что остаток 4-гидроксибутановой кислоты присоединялся по аминогруппе при С-3 атоме остатка -Quip3N. В спектре 1H, 13C-HMBC наблюдались корреляционные кросс-пики между Н-2 атомами остатков -GlcpNAcAI и -GlcpNAcAII и соответствующими сигналами карбонильных атомов углерода N-ацетильных групп при Н/С 3.55/175.7 и 3.83/175.3. Химические сдвиги сигналов С-2 и С-4 атомов остатка QuipN4N при С 57.3 и 56.9 м.д., соответственно, указывали на то, что аминогруппы при этих атомах углерода также ацетилированы (сигналы СО атомов N-ацетильных групп при 175.5 и 175.6 м.д.). Значительное смещение в более слабое поле сигналов С-2 (C 78.9 м.д., αэффект +5.8 м.д.) и Н-2 (Н 4.06 м.д., α-эффект +0.71 м.д.) атомов остатка Quip3N(4Hb) в спектре незамещенном 13 С-ЯМР ОПС по сравнению с их значениями в моносахариде, указывало на присутствие неуглеводного заместителя во втором положении этого остатка. Анализ полисахарида методом ИК-спектроскопии показал наличие в составе полисахарида сульфатной группы (полоса поглощения при 1253 см-1). Таким образом, повторяющееся звено полисахарида представляло собой разветвленный пентасахарид, в точке разветвления которого находился остаток -GlcpNAcAII, а в боковой цепи дисахарид -Quip2SO3-3N(4Hb)-(1→2)--Rhap. Для подтверждения предполагаемой структуры и последовательности моносахаридов в основной цепи ОПС был подвергнут распаду по Смиту. В результате гель-хроматографии продуктов реакции был выделен модифицированный полисахарид (ОПС-1), который был изучен методом спектроскопии ЯМР, включая 2D 1H, 1H-COSY, 1H, 1H-TOCSY, 1H, 13C-HSQC и 1H, 13 C-HMBC эксперименты (Таблица 13). 96 Сопоставление данных спектров 13 С-ЯМР ОПС и ОПС-1 полисахаридов показало отсутствие в спектре 13С-ЯМР ОПС-1 характеристичных сигналов при С 99.6 и 17.9 м.д. для остатка -Rhap; при С 104.2, 56.7 и 18.2 м.д. для остатка Quip3N(4Hb); при С 178.1, 33.8, 28.7 и 62.2 м.д. для остатка 4-гидроксибутановой кислоты. Это подтвердило замещение остатка -Rhap по второму положению и нахождение дисахаридного фрагмента -Quip2SO3-3N(4Hb)-(1→2)--Rhap в ответвлении. Следовательно, основная цепь ОПС-1 построена из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка -D-GlcpNAcA и один остаток -QuipNAc4NAc. Линейный характер ОПС-1 следовал из относительно слабопольных сигналов для С-4 атома остатка -GlcpNAcAI и С-3 атомов остатков QuipNAc4NAc и -GlcpNAcAII при С 82.5, 79.2 и 81.7 м.д., соответственно. Наличие спин-спинового взаимодействия между Н-1 атомом остатка QuipNAc4NAc и С-3 атомом остатка -GlcpNAcAII при Н/С 4.49/81.7 в спектре 1 H, 13C-HMBC ОПС-1 подтвердило, что остаток -QuipNAc4NAc гликозилировал остаток -GlcpNAcAII в положение 3. Кроме того, в спектре 1H, 13C-HMBC ОПС-1 обнаружены корреляционные кросс-пики между Н-2 и Н-4 атомами остатка QuipNAc4NAc и соответствующими сигналами карбонильных атомов углерода Nацетильных групп при Н/С 3.75/174.9 и 3.57/175.8 м.д, соответственно, отсутствовавшие в спектре 1H, 13C-HMBC ОПС, и которые также подтверждали, что аминогруппы этого остатка ацетилированы. Таким образом, установлено, что ОПС-1 имеет следующую структуру: →4)-β-D-GlcpNAcAI-(1→3)-β-QuipNAc4NAc-(1→3)-β-D-GlcpNAcAII-(1→ Абсолютная L-конфигурация остатка Rha была определена на основании величины его удельного оптического вращения. Абсолютные конфигурации остатков -QuipNAc4NAc, Quip3N(4Hb), -GlcpNAcAI и -GlcpNAcAII были определены на основании величин химических сдвигов сигналов в спектрах 13СЯМР ОПС и ОПС-1 и анализа - и β-эффектов гликозилирования [131]. 97 Таблица 13 – Данные спектров 1Н- и 13 С-ЯМР ОПС-1 I. abyssalis КММ 227T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток Н/С 1 4)--D-GlcpNAcAI-(1 4 5 3.55 3.71 3.73 3.64 C 103.4 56.4 72.7 82.5 77.3 174.0 H 4.49 3.75 3.79 3.57 3.57 1.22 C 101.7 56.9 79.2 56.9 71.9 18.2 H 4.59 3.80 3.75 3.62 3.82 102.6 55.3 81.7 71.7 76.6 H 13 3)--D-QuipNAc4NAc-(1 1 13 1 3)--D-GlcpNAcAII-(1 13 C 1 2 4.47 3 6 (6a,6b) 175.4 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δH 1.96-2.08; δC 23.6-24.0 (Me), 174.9175.9 (CO) Сравнительно большой α-эффект для С-2 атома остатка -L-Rhap (+11 м.д.) в структурном дисахаридном фрагменте ОПС -Quip3N(4Hb)-(1→4)--L-Rhap свидетельствовал о том, что остатки -Quip3N(4Hb) и -L-Rhap имели разные D-L абсолютные конфигурации (в случае одинаковой абсолютной конфигурации, αэффект для C-2 атома остатка -L-Rhap был бы значительно меньше ~ +7.4 м.д). Большой отрицательный -эффект для С-3 атома остатка -GlcpNAcAII (-5.2 м.д.) и небольшой положительный α-эффект для С-1 атома остатка α-L-Rhap (+4.4 м.д.), в структурном дисахаридном фрагменте ОПС α-L-Rhap-(1→4)-- GlcpNAcAII, указывал на то, что остатки α-L-Rhap и -GlcpNAcAII имели разные L-D абсолютные конфигурации (в случае одинаковой конфигурации, β-эффект для C-3 атома остатка -GlcpNAcAII был бы положительным ~ +0.3 м.д., а αэффект для С-1 атома остатка α-L-Rhap был бы значительно больше ~ +7.1 м.д.). Большой положительный α-эффект для С-4 (+9.4 м.д.) и отрицательный эффект для С-3 (-1.8 м.д.) атомов остатка -D-GlcpNAcAI в структурном дисахаридном фрагменте ОПС-1 -D-GlcpNAcAII-(1→4)--GlcpNAcAI свидетельствовал о том, что остатки -D-GlcpNAcAII и -GlcpNAcAI имели идентичную D-конфигурацию (в случае разной абсолютной конфигурации, α- 98 эффект для C-4 атома остатка -GlcpNAcAII был бы намного меньше (~ +6.7 м.д.), а β-эффект для С-3 атома был бы положительным (~ +0.1 м.д.) или отсутствовал). Отрицательный β-эффект для С-4 атома остатка -QuipNAc4NAc (-1.2 м.д.) в структурном дисахаридном фрагменте ОПС-1 -D-GlcpNAcAI-(1→3)-- QuipNAc4NAc говорил об идентичной абсолютной D-конфигурации этих остатков (в случае разной абсолютной конфигурации β-эффект для С-4 атома остатка -QuipNAc4NAc был бы значительно меньше (~ -0.1 м.д.) или отсутствовал). И наконец, отрицательный β-эффект для С-4 атома остатка -DGlcpNAcAII (-1.4 м.д.), в структурном дисахаридном фрагменте ОПС-1 -DQuipNAc4Nac-(1→3)--D-GlcpNAcAII подтверждал идентичную D-конфигурацию двух моносахаридных остатков. Таким образом, исходя из всех полученных результатов, было установлено, что ОПС I. abyssalis КММ 227T имеет следующую структуру: 3)--D-QuipNAc4NAc-(13)--D-GlcpNAcAII-(14)--D-GlcpNAcAI-(1 4 ↑ 1 -D-Quip2SO3 3N(4Hb)-(12)-α-L-Rha О-антигенный полисахарид I. abyssalis KMM 227T имеет уникальную структуру, он содержит три кислых компонента в пентасахаридном повторяющеемся звене. В его составе впервые в природе обнаружен остаток 3-(4гидроксибутирамидо)-3,6-дидезокси-D-глюкозы (-D-Quip3N(4Hb). Сульфатные группы, как уже отмечалось ранее, также не являются частым компонентом ОПС грамотрицательных бактерий, а присутствие сульфатной группы в аминосахаре обнаружено впервые. 99 2.5 Структурное исследование О-специфического полисахарида Litorimonas taeanensis G5T Мягкий кислотный гидролиз ЛПС L. taeanensis G5T, выделенного из сухих бактериальных клеток экстракцией горячим водным фенолом, 1 %-ной уксусной кислотой с последующей гель-хроматографией углеводной компоненты привел к получению ОПС. Моносахаридный анализ ОПС методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных метилгликозидов показал наличие только остатков QuiN4N и GalNA. Первичный анализ спектра 13 C-ЯМР ОПС (Рисунок 17) показал наличие трех сигналов в области резонанса аномерных атомов углерода при C 99.0 и 98.0 м.д. (двойной интегральной интенсивности), что указывало на трисахаридный размер повторяющегося звена полисахарида. Кроме этого, в спектре присутствовали: сигнал четвертичного атома углерода при 94.2 м.д. (данные экспериментов DEPT-135 и GD), сигналы четырех атомов углерода, связанных с азотом, в области C 50.3-57.7 м.д., сигнал атома углерода СООН-группы при C 173.5 м.д., два сигнала CH3-групп 6-дезоксисахаров, один из которых имел необычный химический сдвиг C 12.1 м.д., а другой при C 17.2 м.д., пять сигналов, характерных для 3,5-дигидроксигексановой кислоты (сигнал CH3группы при C 22.9 м.д., сигналы СH2-групп при C 44.7, 46.2 м.д. (из данных эксперимента DEPT-135), сигналы CHOH-групп при C 66.4, 67.5 м.д., сигнал COОН-группы при C 174.5 м.д.) и сигналы трех N-ацетильных групп в области C 23.0-23.4 м.д. (CH3) и в области C 175.0-175.4 м.д. (СО). Анализ спектра 13C-ЯМР ОПС, снятого без подавления спин-спинового взаимодействия атомов углерода с протонами, показал, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме и имели α-конфигурацию гликозидной связи (КССВ 1JC1-H 170.3-175.8 Гц). В спектре 1H-ЯМР ОПС присутствовали сигналы трех аномерных протонов при H 5.29 (3JH1,H2 ~ 3 Гц), 5.15 (3JH1,H2 ~ 3 Гц) и 5.09 (3JH1,H2 ~ 3 Гц) м.д., три сигнала протонов CH3-групп при H 1.14 (КССВ 3JH2,H3 ~ 6 Hz), 1.20 (КССВ 3JH5,H6 ~ 100 6 Hz) и 1.22 (КССВ 3JH5,H6 ~ 6 Hz) м.д., сигналы протонов CH2-групп 3,5дигидроксигексановой кислоты при H 2.32, 2.38 и 1.61, 1.75 м.д. соответственно, а также три сигнала протонов N-ацетильных групп в области H 1.89-2.02 м.д. Полное соотнесение сигналов (Таблица 14) в спектрах 1H- и 13C-ЯМР ОПС было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1H-COSY, 1H, 1HTOCSY, 1 H, 1 H-ROESY и гетероядерных 1 H, 13 C-HSQC и 1 13 H, C-HMBC экспериментов. Таблица 14 – Данные спектров 1Н- и 13С-ЯМР ОПС L. taeanensis G5T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток A→4)-α-D-GalNAcA-(1→ B→3)-α-D-QuiNAc4NAcyl-(1→ Н/С 1 2 3 4 5 6 H1 3 С 5.29 98.0 4.28 50.3 3.92 68.5 4.39 76.8 4.3 71.5 173.5 1 5.09 4.11 4.02 3.87 4.29 1.14 57.7 68.2 17.2 3.83 70.3 1.20 12.1 3.97 1.22 66.4 22.9 1 H 13 C→3)-α-L-6dxylHexN-4-ulo- 1 С 98.0 53.3 74.1 H С 5.15 99.0 4.20 3.86 53.7 2.32, 76.0 94.2 4.13 1.61, 2.38 44.7 1.75 46.2 13 (1→ D Acyl=-CO-CH2-CH(ОН)- 1 H CH2-СН(OH)-СН3 13 С 174.5 67.5 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δH 1.89-2.02; δC 23.0-23.4 (Me), 175.0-175.4 (CO) Последовательная корреляция сигналов в спектрах 1H, 1H-COSY и 1H, 1HTOCSY позволила выделить спиновые системы для трех моносахаридных остатков. Одна из них содержала сигналы пяти протонов и была отнесена к остатку гексуроновой кислоты с галакто-конфигурацией (А) на основании корреляций между атомами от H-1 до H-4 и Н-4 атома с Н-5. 101 Рисунок 17 – Спектр 13C-ЯМР ОПС L. taeanensis G 102 Вторая спиновая система была отнесена к остатку 6-дезоксисахара с глюкоконфигурацией (В) на основании корреляций сигналов от Н-1 до Н-6 атома. Третьему моносахаридному остатку с ксило-конфигурацией (С) соответствовали две изолированные спиновые системы, одна из которых содержала три сигнала, включая сигнал протона, резонирующий в аномерной области, а вторая спиновая система содержала сигналы протонов СН3-СН-группы. Кроме того, в спектрах были выделены корреляционные кросс-пики, отнесенные к взаимодействию Н-2, Н-3, Н-4, Н-5 и Н-6 атомов 3,5-дигидроксигексановой кислоты. Обозначения моносахаридных остатков даны в той последовательности, как они приведены в Таблице 14 Корреляционный кросс-пик H-2/C-2 при Н/C 4.28/50.3 и присутствие дальнего спин-спинового взаимодействия между сигналом Н-5 атома и карбоксильной группой при Н/C 4.30/173.5 м.д. (найденого из спектра 1H, 13CHMBC), позволило идентифицировать остаток А как производное -GalpNА. На основании присутствия корреляционных кросс-пиков Н-2/С-2, Н-4/С-4 и Н-6/С-6 при 4.11/53.3, 3.87/57.7 и 1.14/17.2 м.д., соответственно, было показано, что моносахаридный остаток В представлял собой производное -QuiN4N. Эксперимент 1H, 13C-HMBC позволил объединить две изолированные протонные спиновые системы третьего моносахаридного остатка С на основании корреляций между сигналами H-1/C-3, H-1/C-5, H-6/C-5, H-6/C-4 и H-3/C-4 при Н/С 5.15/76.0, 5.15/70.3, 1.20/70.3, 1.20/94.2 и 3.86/94.2 м.д., соответственно. Сигнал С4 атома при 94.2 м.д. указывал на наличие гидратированной кетогруппы – CH(OH)2 [174]. Таким образом, третий моносахаридный остаток С представлял собой 2-амино-2,6-дидезокси-ксило-гексоз-4-улозу (-6dxylHexN-4-ulo). Присутствие остатка 3,5-дигидроксигексановой кислоты было показано на основании корреляционных взаимодействий H-2 и H-3 атомов этого остатка с сигналом углерода его карбоксильной группы при Н/C 2.38/174.5, 2.32/174.5 и 4.13/174.5 м.д., соответственно (данные эксперимента 1H, 13C-HMBC). 103 Рисунок 18 – Спектр 1H, 13C-HSQC ОПС L. taeanensis G5T 104 Последовательность моносахаридных остатков и порядок их замещения в полисахаридной цепи были определены с помощью 1H, 1H-ROESY и 1H, 13 C- НМВС экспериментов. В спектре 1H, 1H-ROESY наблюдались корреляции между сигналами аномерных протонов и сигналами протонов при гликозилированных атомах углерода: α-GalNAcA H-1/α-QuiNAc4N H-3, α-QuiNAc4N H-1/α- 6dxylHexN-4-ulo H-3 и α-6dxylHexN-4-ulo H-1/α-GalNAcA H-4 при Н/H 5.29/4.02, 5.09/3.86 и 5.15/4.39 м.д., соответственно. Спектр 1H, 13C-НМВС ОПС (Рисунок 19) содержал корреляционные кросспики между сигналами аномерных протонов и углеродными атомами, участвующими в образовании гликозидных связей: α-GalNAcA H-1/α-QuiNAc4N C3, α-QuiNAc4N H-1/α-6dxylHexN-4-ulo C-3, α-QuiNAc4N C-1/α-6dxylHexN-4-ulo H-3, α-6dxylHexN-4-ulo H-1/α-GalNAcA C-4 и α-6dxylHexN-4-ulo C-1/α-GalNAcA H-4 при 5.29/74.1, 5.09/76.0, 98.0/3.86, 5.15/76.8 и 99.0/4.39 м.д., соответственно. Эти данные позволили определить последовательность моносахаридных остатков в полисахаридной цепи и показали, что моносахаридные остатки α-QuiNAc4N и α-6dxylHexN-4-ulo замещены в положение 3, в то время как остаток α-GalNAcA замещен в положение 4. Локализация 3,5-дигидроксигексановой кислоты и N-ацетильных групп была определена из 1H, 13C-HMBC эксперимента. Было установлено, что сигналы протонов при С-2 атомах остатков α-GalNAcA, α-QuiNAc4N и α-6dxylHexN-4-ulo коррелируют с соответствующими сигналами карбонильных атомов углерода Nацетильных групп при Н/С 4.28/ 175.4, 4.11/175.0 и 4.20/175.0, соответственно. Сигнал С-4 атома остатка α-QuiNAc4N при С 57.7 м.д. свидетельствовал о том, что аминогруппа в этом положении ацилирована [172]. Таким образом, 3,5дигидроксигексановая кислота присоединялась к аминогруппе при С-4 атоме моносахаридного остатка α-QuiNAc4N. Для подтверждения наличия кетосахара в полисахаридной цепи, ОПС восстанавливали боргидридом натрия, в результате чего карбонильная группа остатка α-6dxylHexN-4-ulo была восстановлена до гидроксильной. 105 Рисунок 19 – Спектр H, 13C-HMBC ОПС L. taeanensis G5T 106 Моносахаридный анализ восстановленного полисахарида показал наличие остатков 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-L-глюкозы и 2-ацетиламино-2,6- дидезокси-L-галактозы – эпимеров по С-4 атому, полученных при восстановлении 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-L-ксило-гексоз-4-улозы. Восстановленный полисахарид был также проанализирован с помощью метода спектроскопии ЯМР. Спектр 13 С-ЯМР восстановленного полисахарида содержал четыре сигнала аномерных атомов углерода в области С 97.4-99.1 м.д., пять сигналов атомов углерода, связанных с азотом в области С 50.0-57.8 м.д., пять сигналов 3,5-дигидроксигексановой кислоты в области С 22.9-67.5 м.д. Кроме того, в спектре наблюдались три сигнала атомов углерода метильных групп 6-дезоксисахаров в области С 16.3-17.7 м.д., четыре сигнала метильных групп N-ацетатов в области С 23.2-23.4 м.д. и шесть сигналов карбоксильных групп при С 174.5-175.4 м.д. Анализ спектра 1Н-ЯМР показал наличие четырех сигналов аномерных протонов при Н 5.05-5.24 м.д., четырех сигналов метиленовых групп при Н 1.60, 1.75, 2.32 и 2.38 м.д., четырех сигналов метильных групп N-ацетатов при Н 1.89-2.02 м.д. и четырех сигналов метильных групп 6-дезоксисахаров при Н 1.13-1.22 м.д. Полное соотнесение сигналов в спектрах 1Н- и 13 С-ЯМР восстановленного полисахарида (Таблица 15) было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1H-COSY, 1H, 1HTOCSY, 1 H, 1 H-ROESY и гетероядерных 1 H, 13 С-HSQC и 1 H, 13 С-HMBC экспериментов. Для определения абсолютной конфигурации моносахаридных остатков и асимметрических центров в 3,5-дигидроксигексановой кислоте необходимо было получить низкомолекулярные фрагменты. Для этого восстановленный полисахарид подвергали сольволизу трифторметансульфоновой кислотой, в результате чего были выделены дисахарид, состоящий из остатков GalNAcA и QuiNAc4NAcyl, и моносахарид QuiNAc в индивидуальном состоянии. Эти соединения были исследованы с помощью одно- и двумерных экспериментов ЯМР (Таблица 16). 107 Таблица 15 – Данные спектров 1H- и 13 С-ЯМР продуктов восстановления ОПС L. taeanensis G5T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток A →4)-α-D-GalNAcA-(1→ Н/С 1 Н 13 С Н 13 С B →3)-α-D-QuiNAc4NAcyl-(1→ 1 C1 →3)-α-L-QuiNAc-(1→ 1 C2 →3)-α-L-FucNAc-(1→ Н 13 С 1 13 D Acyl=-CO-CH2-CH(ОН)-CH2СН(OH)-СН3 1 2 3 4 5 6 (6a,6b) 5.24 4.26 3.90 4.36 4.18 98.1 5.05 97.4 50.4 69.0 4.04 3.86 53.5 74.4 76.7 3.84 57.8 72.1 4.21 68.0 174.5 1.13 17.3 5.15 98.7 4.01 3.80 3.24 3.77 55.1 76.2 74.7 69.0 1.24 17.7 Н 5.20 4.24 4.02 3.80 4.03 1.18 С 99.1 50.0 74.1 72.1 67.8 16.3 2.32, 4.13 1.60, 2.38 1.75 3.98 1.22 1 Н 13 С 174.5 44.8 67.5 46.2 66.4 22.9 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δC 23.2-23.4 (Me), 174.5-175.4 (CO), δН 1.89-2.02 (Me). Абсолютная L-конфигурация остатка QuiNAc, эпимера α-6dxylHexN-4-ulo, была определена на основании величины удельного оптического вращения. Следовательно, и остаток α-6dxylHexN-4-ulo имел такую же L-конфигурацию. Абсолютная конфигурация остатков α-GalNAcA и α-QuiNAc4N была установлена, исходя из величин химических сдвигов сигналов в спектре 13С-ЯМР восстановленного полисахарида и - и β-эффектов гликозилирования, и показано, что они имеют D-конфигурацию. Относительно небольшой положительный αэффект (+5.7 м.д.) для С-4 атома остатка α-GalNAcA в дисахаридном фрагменте αL-QuiNAc-(1→4)-α-GalNAcA свидетельствовал о том, что остаток α-GalNAcA имел D-конфигурацию (в случае L-конфигурации α-эффект для С-4 атома должен был быть больше, +9 м.д.). Незначительный отрицательный α-эффект (-0.1 м.д.) для C-4 атома остатка α-QuiNAc4N в дисахариде α-D-GalNAcA-(1→3)-αQuiNAc4NAcyl указывал на то, что остатки α-D-GalNAcA и α-QuiNAc4N имели одинаковую абсолютную D-конфигурацию. Иная ситуация наблюдалась для 108 дисахаридного фрагмента α-D-QuiNAc4NAcyl-(1→4)-α-L-QuiNAc. Большой отрицательный β-эффект (-2.0 м.д.) для C-4 атома остатка α-L-QuiNAc показывал, что остатки α-D-QuiNAc4NAcyl и α-L-QuiNAc имели различную абсолютную конфигурацию. Таблица 16 – Данные спектров 1 H- и 13 С-ЯМР продуктов сольволиза восстановленного полисахарида L. taeanensis G5T (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток Н/С 1 2 5.23 4.17 3 4 5 6 4.32 4.31 72.4 175.7 3.98 1.17 67.8 17.8 Дисахарид →4)-α-D-GalNAcA-(1→ →3)-α-D-QuiNAc4NAcyl-(1→ –CO-CH2-CH(OH)-CH2-CH(OH)CH3 1 Н 13 С 1 Н 13 С 98.4 5.12 92.0 50.0 4.05 54.1 68.4 4.00 74.5 70.5 3.86 58.0 1 2.34, 2.38 4.14 1.61, 1.76 3.98 С 174.5 44.8 46.2 Н 4.72 3.75 67.5 3.86 С 95.6 57.1 2.38, 2.72 76.7 58.0 72.4 17.8 4.22 4.0 37.4 73.9 1.70, 1.85 44.3 Н 13 →3)-β-D-QuiNAc4NAcyl-(1→ 1 13 –CO-CH2-CH(OH)-CH2-CH(OH)CH3 3.82 1 Н 13 С 171.6 3.86 1.22 66.5 23.0 3.55 1.20 1.20 67.8 22.8 Моносахарид 5.17 3.91 3.73 3.25 3.94 1.31 91.7 55.3 71.5 76.7 68.6 17.8 4.73 3.69 3.52 3.24 3.51 1.34 β-L-QuipNAc 95.8 58.0 73.0 76.2 74.7 17.8 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: дисахарид δН 2.01-2.05 (Me),δC 23.223.4 (Me), 175.6-175.8 (CO); моносахарид δН 1.94-2.07 (Me),δC 22.9-23.2 (Me), 175.6-175.7 (CO) α-L-QuipNAc Для определения абсолютной конфигурации асимметрических центров в 3,5-дигидроксигексановой кислоте применяли метод Мошера с использованием R-, S-α-метокси-α-трифторметил-α-фенилацетилхлорида (MTPA) [175, 176]. Известно, что абсолютную конфигурацию 1,2-, 1,3-,1,4- и 1,5-диолов с двумя 109 хиральными центрами можно определить, сравнив спектры ЯМР бис-(R)- и бис(S)-МТРА-эфиров. Нам не удалось выделить 3,5-дигидроксигексановую кислоту как индивидуальное соединение, поэтому для получения МТРА-эфиров мы использовали дисахарид D-GalNAcA-(1→3)-D-QuiNAc4NAcyl, выделенный при сольволизе восстановленного полисахарида и содержащий 3,5- дигидроксигексановую кислоту. В связи с присутствием двух наборов сигналов протонов для 3,5дигидроксигексановой кислоты в спектре 1Н-ЯМР, дисахарид был восстановлен. Карбоксильную группу GalNAcA метилировали диазометаном для лучшего растворения восстановленного дисахарида в пиридине. МТРА-эфиры модифицированного дисахарида исследовали с помощью спектроскопии ЯМР. На основании разницы сигналов протонов ∆(δS-δR) было установлено, что асимметрические центры в 3,5-дигидроксигексановой кислоте имеют (3S,5S) конфигурацию (Таблица 17). Таблица 17 – Данные спектра 1Н-ЯМР МТРА-эфиров 3,5-дигидроксигексановой кислоты (химические сдвиги, м.д.) МТРА-эфиры 3S,5S- 2 3 4 5 6 дигидроксигексановой кислоты S-МТРА R-МТРА ∆(δS-δR) 3.28 дд 6.03 м (4.7 Гц; 16.9 Гц) 3.94 дд (7.9 Гц; 16.5 Гц) 3.36 дд 6.10 м (5.3 Гц; 16.6 Гц) 3.98 дд (7.2 Гц; 16.9 Гц) -0.08, -0.04 -0.07 2.14 м, 2.36 м 5.52 1.42 д (6.3 Гц) м 2.16 м, 2.30 м 5.36 1.28 д (6.1 Гц) м -0.02, 0.06 0.16 0.14 110 Метод Мошера для определения абсолютной конфигурации асимметрических центров неуглеводных заместителей в структурной химии углеводов был применен нами впервые. Таким образом, на основании полученных результатов установлено, что повторяющееся звено ОПС L. taeanensis G5T представляет собой трисахарид и имеет следующую структуру: →4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-D-QuiNAc4NAcyl-(1→3)-α-L-6dxylHexN-4-ulo-(1→ Где Acyl (3S,5S)-3,5-дигидроксигексановая кислота. Отличительной особенностью данного полисахарида является одновременное присутствие в его составе двух редко встречающихся в природе сахаров: кетосахара – 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-L-ксило-гексоз-4-улозы и 2ацетиламино-4-[(3S,5S)-3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-Dглюкозы. Такой же кетосахар, только с абсолютной D-конфигурацией, был обнаружен в составе ОПС Flavobacterium columnare ATCC 43622 [177], P. rubra ATCC 29570 [27], V. ordalii O:2 [32]и КПС Streptococcus pneumoniae type 5 [178] и Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 [179]. Интересно отметить, что во всех этих полисахаридах, за исключением последнего, 2-ацетиламино-2,6-дидезоксиD-ксило-гексоз-4-улоза гликозилирует в положение 4 моносахарид с β-D-глюко конфигурацией, а сама гликозилирована по положению 3 моносахаридом с α-Lконфигурацией. В случае ОПС L. taeanensis G5T 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-Lксило-гексоз-4-улоза гликозилирует моносахарид с α-D-галакто конфигурацией в положение 4, а гликозилирована в положение 3 моносахаридом, имеющим α-Dглюко конфигурацию. Другой редкий моносахарид, 2-ацетиламино-4-[(3S,5S)-3,5дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-D-глюкоза, был идентифицирован ранее только в ОПС F. psychrophilum (259-93) [171]. Одновременное присутствие 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-L-ксило-гексоз-4-улозы и 2-ацетиламино-4-[(3S,5S)3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-D-глюкозы бактериальных гликанов обнаружено нами впервые. в составе 111 2.6 Структурное исследование О-специфического полисахарида Echinicola vietnamensis КММ 6221Т Кислотный гидролиз ЛПС разбавленной AcOH приводил к частичной деградации полисахарида, в связи с наличием в его составе моносахарида с кислото-лабильной гликозидной связью. Мягкая кислотная деградация ЛПС E. vietnamensis КММ 6221Т ацетатным буфером (pH=4.5), с последующей гель- хроматографией полисахаридной компоненты позволила выделить ОПС. Анализ моносахаридного состава методом ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных полиолов и метилгликозидов привел к идентификации остатков Col , GalN, GlcA и GlcNA в соотношении ~1:1:1:1. Спектр 13 C-ЯМР ОПС (Рисунок 20) содержал четыре сигнала аномерных атомов углерода при C 98.2, 99.9, 102.5 и 103.1 м.д., что указывало на тетрасахаридный размер повторяющегося звена полисахарида. В спектре также присутствовали сигналы двух атомов углерода, связанных с азотом, при C 50.2 и 57.1 м.д. (С-2 атомы остатков GalN и GlcNA), гидроксиметильной группы при C 61.7 м.д. (С-6 остатка GalN, данные эксперимента DEPT-135), метиленовой группы при C 34.1 м.д. (С-3 атом остатка Col, данные эксперимента DEPT-135), метильной группы 6-дезоксисахара при C 16.7 м.д. (С-6 атом остатка Col), карбоксильных групп при C 173.1 и 173.9 м.д. (С-6 атомы остатков GlcA и GlcNA), двух N-ацетильных групп при C 23.3 и 23.7 м.д. (CH3) и при C 175.0176.1 м.д (СО.). Отсутствие в 13 С-ЯМР-спектре сигналов неаномерных и негликозилируемых атомов углерода в области более слабого поля чем 81.0 м.д., указывало на то, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме. Анализ GD-спектра ОПС, подтвердил, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме, а также показал, что остатки с С-1 атомом углерода при C 98.2 и 99.9 м.д. имели α-конфигурацию гликозидной связи (КССВ 1 JC1-H1 174.0 и 173.1 Гц, соответственно), а остатки с С-1 атомом углерода при C 112 102.5 и 103.1 м.д. β-конфигурацию (КССВ 1 JC1-H1 161.5 и 165 Гц, соответственно). В спектре 1H-ЯМР ОПС, соответственно, были выделены четыре сигнала в области резонанса аномерных протонов при Н 5.44 (КССВ 3JH1,H2 ~ 3 Hz), 5.18 (КССВ 3JH1,H2 ~ 2.5 Hz), 4.76 (КССВ 3JH1,H2 ~ 7.2 Hz), 4.61 м.д., сигнал протонов метильной группы остатка 6-дезоксисахара при Н 1.11 (Соl, КССВ 3JH1,H2 ~ 6.5 Hz) м.д., сигналы метиленовых протонов при Н 1.77 и 1.94 м.д. (Соl) и сигналы N-ацетильных групп (CH3) при Н 2.03 (двойной интегральной интенсивности). Полное соотнесение сигналов в спектрах 1H- и 13 C-ЯМР О-антигенного полисахарида было проведено с использованием двумерных гомоядерных 1H, 1HCOSY, 1H, 1H-TOCSY и гетероядерных 1H, 13 C-HSQC 1H, 13 C-H2BC и 1H, 13 C- HMBC экспериментов. Анализ спектров 1H, 1H-COSY и 1H, 1H-TOCSY ОПС позволил выделить спиновые системы для двух моносахаридных остатков c глюко-конфигурацией, на основании корреляционных кросс-пиков от H-1 атома до H-5, обозначенных как остатки А и С. Кроме того, спектры 1H, 1H-COSY и 1H, 1H-TOCSY показали наличие спиновой системы, соответствующей моносахаридному остатку с галакто-конфигурацией (D), определенной на основании корреляций сигналов атомов от H-1 до H-4 и Н-4 до Н-6. Спиновая система остатка, обозначенного как B, была идентифицирована на основании корреляционных кросс-пиков от Н-1 до Н-4 атомов, включая аксиальный и экваториальный Н-3 атомы, и Н-5 атома с Н-6. Обозначения моносахаридных остатков даны в той последовательности, как они приведены в Таблице 18. Анализ спектра 1H, 13 C-HSQC (Рисунок 21) позволил соотнести сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для всех моносахаридных остатков (Таблица 18). . 113 Рисунок 20 – Спектр 13С-ЯМР ОПС E. vietnamensis КММ 6221Т 114 Таблица 18 – Данные спектра 1H- и 13 С-ЯМР ОПС E. vietnamensis КММ 6221Т (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток Н/С 1 A: →4)-β-D-GlcpNAcA-(1→ H 13 1 B: α-Colp-(1→ C H 1 2 3 4 5 4.61 3.74 3.75 3.84 4.00 102.5 57.1 75.6 77.0 75.6 173.9 3.71 4.12 1.11 16.7 5.18 3.99 1.77 (а) 6 (6a,6b) 1.94 (э) 13 1 C: →2,4)-β-D-GlcpA-(1→ C 99.9 64.4 34.1 69.7 67.8 H 4.76 3.54 3.84 3.77 3.93 C 103.1 78.5 76.1 81.7 75.3 H 5.44 4.18 4.04 4.09 3.89 3.68,3.68 98.2 50.2 75.4 69.7 72.0 13 D: →3)-α-D-GalpNAc-(1→ 1 13 C 173.1 61.7 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δН 2.03 (Me),δC 23.3-23.7 (Me), 175.5-176.1 (CO). Было показано, что С-2 атомы остатков A и D при C 57.1 и 50.2 м.д. связаны с атомами азота. Корреляционные кросс-пики H-2/C-2 при Н/C (данные спектра 1H, 13C-HSQC) и H-5/C-6 при Н/C 4.00/173.9 м.д. (данныеспектра 1 H, 13C-HMBC) свидетельствовали о том, что остаток А являлся производным β- GlcpNА. Корреляционные кросс-пики H-3/C-3 и H-6/C-6 при Н/C 1.77, 1.94/34.1 и 1.11/16.7 м.д., соответственно, позволили идентифицировать остаток B как производное α-Сolp. Дальнее спин-спиновое взаимодействие между сигналом Н-5 атома и атомом углерода карбоксильной группы при Н/C 3.93/173.1 м.д., найденое из спектра 1H, 13 C-HMBC, привело к идентификации остатка С как производного β-GlcpАI. Корреляционные кросс-пики H-2/C-2 и H-6/C-6 при Н/C 4.18/50.2 и 3.68,3.68/61.7 м.д., соответственно, определили остаток D как производное α-D-GalpN. 115 Рисунок 21 –Спектр 1H, 13C-HSQC ОПС-1 E. vietnamensis КММ 6221Т 116 Значительное смещение в слабое поле химических сдвигов сигналов С-4 атома остатка β-GlcpNA, С-2 и С-4 атомов остатка β-GlcpA, С-3 атома остатка αD-GalpNAc при C 77.0, 78.5, 81.7 и 75.4 м.д., соответственно (Таблица 18), по сравнению с их значениями в незамещенных моносахаридах, указывало на порядок замещения моносахаридных остатков в полисахариде. Последовательность замещения моносахаридных остатков в полисахариде была определена с помощью 1H, 1H-ROESY и 1H, 13C-HMBC экспериментов. В спектре 1H, 1H-ROESY ОПС присутствовали следующие корреляционные кросс-пики: H-1 β-GlcpNAcA/H-4 β-GlcpA, H-1 α-Colp/H-2 β-GlcpA, H-1 βGlcpA/H-3 α-D-GalpNAc и H-1 α-GalpNAc/H-4 β-GlcpNAcA при Н/Н 4.61/3.77; 5.18/3.54; 4.76/4.04 и 5.44/3.84 м.д., соответственно. Спектр 1H, 13C-HMBC ОПС (Рисунок 22) показал наличие корреляционных кросс-пиков между аномерными протонами и гликозилированными атомами углерода: H-1 β-GlcpNAcA/С-4 β-GlcpA, H-1 α-Colp/С-2 β-GlcpA, H-1 β-GlcpA/С-3 α-D-GalpNAc и H-1 α-GalpNAc/С-4 β-GlcpNAcA при Н/C 4.61/81.7; 5.18/78.5; 4.76/75.4 и 5.44/77.0 м.д., соответственно. Таким образом, повторяющееся звено полисахарида, представляло собой разветвленный тетрасахарид, в точке разветвления которого находился остаток β-GlcpA, а в ответвлении – остаток αColp. Для подтверждения последовательности моносахаридных остатков в полисахаридной цепи ОПС был подвергнут мягкому кислотному гидролизу 1% уксусной кислотой, с последующей гель-хроматографией, и при этом были получены модифицированный полисахарид (ОПС-1) и моносахарид Col. ОПС-1 был проанализирован методом спектроскопии ЯМР (Таблица 19). 117 117 Рисунок 22 – Фрагменты спектра 1Н,13С-HMBC ОПС-1 E. vietnamensis КММ 6221Т 118 Таблица 19 – Данные спектров 1H- и 13С-ЯМР ОПС-1 E. vietnamensis КММ 6221Т (химические сдвиги, м.д.) Моносахаридный остаток Н/С 1 A: →4)-β-D-GlcpNAcA-(1→ 1 2 3 4.62 3.75 3.76 3.86 4.02 C 102.5 57.1 75.5 77.0 75.7 H 4.60 3.36 3.63 3.75 3.95 C 105.5 73.6 74.9 81.4 75.4 173.2 H 5.45 4.35 3.94 4.16 3.88 3.70,3.70 98.7 49.6 78.6 69.5 72.1 61.8 H 13 C: →4)-β-D-GlcpA-(1→ 1 13 D: →3)-α-D-GalpNAc-(1→ 1 13 C 4 5 6 (6a,6b) 174.0 Химические сдвиги для N-ацетильных групп: δН 2.05 (Me), δC 23.3-23.7 (Me), 175.0-175.9 (CO). Для определения абсолютной конфигурации моносахаридов необходимо было получить низкомолекулярные олигосахаридные фрагменты или моносахариды в индивидуальном состоянии. Для этого ОПС-1 был подвергнут сольволизу трифторметансульфоновой кислотой, в результате чего был выделен только один моносахарид GalNAc. Абсолютная D-конфигурация остатка GalNAc была определена на основании величины удельного оптического вращения. Также, на основании величины удельного оптического вращения была подтверждена абсолютная Lконфигурация остатка Col. Абсолютная конфигурация остатков β-GlcNAcA и βGlcA были установлены исходя из величин химических сдвигов сигналов в спектрах 13 С-ЯМР ОПС и ОПС-1 и - и β-эффектов гликозилирования. Небольшой отрицательный β-эффект (-0.1 м.д.) для С-4 атома остатка α-D-GalNAc и большой положительный α-эффект (+8.7 м.д.) для С-1 атома остатка β-GlcA в дисахаридном фрагменте β-GlcpA-(1→3)-α-D-GalpNAc (ОПС-1) свидетельствовал о том, что остаток β-GlcpA имел D-конфигурацию (в случае L-конфигурации βэффект для С-4 атома остатка α-D-GalNAc должен был быть больше ~ -2.8 м.д., а 119 α-эффект для С-1 атома остатка β-GlcA намного меньше ~ +3.4 м.д). Незначительный положительный β-эффект для C-3 (+0.4 м.д.) и относительно большой отрицательный β-эффект для С-5 атомов остатка β-GlcNAcA в дисахаридном фрагменте ОПС-1 α-D-GalpNAc-(1→4)-β-GlcpNAcA указывали на то, что остатки α-D-GalpNAc и β-GlcpNAcA имели одинаковую абсолютную Dконфигурацию (в случае разной абсолютной конфигурации β-эффекты для С-3 и С-5 атомов были бы ~ -1.3 и -0.6 м.д., соответственно). Большой положительный α-эффект для С-4 (+8.7 м.д.) и отрицательный β-эффект для С-3 атомов остатка βD-GlcpA, также как α-эффект для С-1 атома остатка β-D-GlcpNAcA в дисахаридном фрагменте ОПС-1 β-D-GlcpNAcA-(1→4)-β-D-GlcpA подтверждали идентичную D-конфигурацию этих моносахаридов. Таким образом, на основании всех полученных данных, установлено, что повторяющееся звено ОПС E. vietnamensis КММ 6221Т представляет собой тетрасахарид и имеет следующую структуру: α-Colp 1 ↓ 2 →4)-β-D-GlcpNAcA-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→ 2.7 Цитокин-индуцирующая активность исследуемых липополисахаридов Известно, что ЛПС обладают способностью к различными сайтами на поверхности взаимодействию с иммунокомпетентных клеток, что обеспечивает модуляцию различных компонентов иммунной системы хозяина. ЛПС активируют компоненты плазмы (системы комплемента и свертывания крови) и клетки иммунной системы (моноциты и макрофаги, полиморфоядерные клетки и лимфоциты) [135, 136], что приводит к продукции цитокинов (ФНО-, интерлейкины) и других провоспалительных медиаторов [137, 141]. Недавние исследования способности ЛПС морских микроорганизмов выступать в качестве антагонистов эндотоксинов патогенных грамотрицательных бактерий показали 120 перспективность работ в этом направлении [10]. Известные к настоящему моменту антагонисты эндотоксинов являются нетоксичными или слаботоксичными веществами. В рамках данного исследования мы оценили эндотоксический потенциал ЛПС изученных нами морских бактерий. Определение цитотоксической активности ЛПС по отношению к лимфоцитам селезенки мыши показало, что они не обладают токсичностью в диапазоне концентраций эндотоксического от потенциала 0.01 ЛПС до 100 мкг/мл. была Для определена характеристики их способность индуцировать синтез медиаторов восполительного процесса ФНО-α (Рисунок 23) и ИЛ-6 (Рисунок 24) в клетках цельной крови человека. Обнаружено, что максимальной способностью индуцировать синтез ФНО-α (Рисунок 23), среди изученных ЛПС, обладали ЛПС C. pacifica 3879T и I. abyssalis KMM 227T при концентрации 1 мкг/мл. При концентрации 0.1 мкг/мл активность этих ЛПС была невысокой. При концентрации 0.01 мкг/мл невысокую активность проявляли ЛПС L. taeanensis G5T и ЛПС E. vietnamensis КММ 6221Т. Остальные ЛПС не вызывали индукцию синтеза цитокина ФНО-α. 30 С ФНО-а, пг/мл 25 20 0.01 мкг/мл 15 0.1 мкг/мл 1 мкг/мл 10 5 6 5 4 3 2 1 Ко нт ро ль 0 Рисунок 23 Индукция синтеза ФНО-α ЛПС морских бактерий в клетках цельной крови человека. 1 – ЛПС C. pacifica 3879T, 2 – ЛПС C. pacifica 3878, 3 – ЛПС R. pacifica KMM 1406T, 4 - ЛПС I. abyssalis KMM 227T, 5 - ЛПС L. taeanensis G5T, 6 ЛПС E. vietnamensis КММ 6221Т 121 2500 С ИЛ-6, пг/мл 2000 0.01 мкг/мл 1500 0.1 нг/мл 1000 1 мкг/мл 500 6 5 4 3 2 1 Ко нр о ль 0 Рисунок 24 Индукция синтеза ИЛ-6 ЛПС морских бактерий в клетках цельной крови человека. 1 – ЛПС C. pacifica 3879T, 2 – ЛПС C. pacifica 3878, 3 – ЛПС R. pacifica KMM 1406T, 4 - ЛПС I. abyssalis KMM 227T, 5 - ЛПС L. taeanensis G5T, 6 ЛПС E. vietnamensis КММ 6221Т Как видно из данных рисунка 24, наибольшей способностью индуцировать синтез цитокина ИЛ-6 обладали также ЛПС C. pacifica 3879T и I. abyssalis KMM 227T при концентрации 1 мкг/мл. При концентрациях 0.01 и 0.1 мкг/мл их активность была примерно одинакова. ЛПС C. pacifica 3878, L. taeanensis G5T и E. vietnamensis КММ 6221Т проявляли невысокую индуцирующую активность. ЛПС R. pacifica KMM 1406T при всех концентрациях индуцирующей активности не проявлял. Полученные результаты показывают, что ЛПС всех изученных бактерий являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-α и ИЛ-6. Выявленные различия в способности ЛПС индуцировать синтез ФНО-α и ИЛ-6, по-видимому, можно объяснить наличием различных функциональных групп в составе липидов А, обуславливающих их эндотоксическую активность. Это позволяет предположить, что эти ЛПС могут потенциальными антагонистами эндотоксинов грамотрицательных бактерий. 122 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1 Приборы и материалы Операции, требующие отделения осадков, проводили с использованием центрифуг К26 D (ГДР), К70 D (ГДР), К23 (ГДР) и Biofuge stratos (Heraeus, Германия). Величины рН растворов измеряли на цифровом рН-метре pH-420 (Аквилон, Россия). Отделение гликополимеров от веществ низкомолекулярной природы проводили с использованием диализных мембран Spectra/Por (Spectrum, США) с пределом исключения 12-14 кДа и 6-8 кДа. Концентрирование растворов осуществляли на вакуумном ротационном испарителе Rotavapor R-114 (Buchi, Китай) при температуре 35-45 С. Водные растворы образцов лиофилизовали на лиофильной сушке производства New Brunswick Scientific Со. Абсолютные конфигурацию моносахаридных остатков определяли путем измерения величины их удельного оптического вращения на приборе PerkinElmer модель 343 (США). Поглощение раствора смеси (турбидиметрический метод) определяли на спектрофотометре μQuant (Bio-tek instruments, США) при длине волны 630 нм. Спектры 1H-, 13С-ЯМР снимали на приборе AVANCE-III (Bruker, Германия) с рабочей частотой 700.13 МГц для ядер 1H и 176.04 МГц для ядер 13C. Для сбора и обработки данных использовали программу TOPSPIN 2.1. ИК-спектры снимали на Фурье-спектрофотометре Vector 22 (Bruker, Германия) с разрешением 4 см-1 (образцы помещали в таблетки с KBr). Хроматографические методы. В работе были использованы следующие хроматографические методы: препаративная хроматография на бумаге, гельхроматография, ионообменная хроматография, газожидкостная хроматография. 123 Распределительную нисходящую бумажную хроматографию выполняли в системе растворителей бутанол-пиридин-вода (в соотношении 6:4:3 по объёму) на бумаге Filtrak FN-12. Нейтральные моносахариды обнаруживали, используя щелочной раствор азотнокислого серебра, аминосахара – 0.2 % раствор нингидрина в ацетоне. Скорость элюции в колоночной хроматографии контролировали с помощью перистальтического насоса Ismatec (Швейцария). Для препаративной колоночной гель-хроматографии использовали такие носители, как Toyopearl TSK HW-50 (Tosoh, Япония), Toyopearl TSK HW-40 (Tosoh, Япония), Toyopearl DEAE-650 (Tosoh, Япония). Основные параметры разделения представлены в Таблице 20 Таблица 20 Хроматографические колонки и условия разделения Сорбент Размеры, Элюент Скорость элюциии, V0, мл см x см Toyopearl TSK мл/мин 180 х 1,5 0.3% СH3COOH 0.7 100 120 х 1,5 H2O 0.7 60 50 х 1,5 0-1М NaCl в 0.7 50 HW-50 (S) Toyopearl TSK HW-40 (S) Toyopearl DEAE-650 Препаративную дифференциального Трис-НСl, рН 7 гель-хроматографию проточного контролировали рефрактометра RIDK с 101 помощью (Чехия). Препаративную ионообменную хроматографию контролировали с помощью проточного ультрафиолетового детектора Uvicord II (LKB, Швеция). ГЖХ выполняли на хроматографе Agilent 6850 (США), снабженном капиллярной колонкой со стационарной фазой 5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane, в градиенте температур 150-230 С со скоростью 3 град/мин. 124 ГЖХ-МС осуществляли на хроматографе Hewlett Packard 5890 (США), снабженном капиллярной колонкой со стационарной фазой 5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane и соединенном с масс-спектрометром Hewlett Packard 5973 (США), в градиенте температур 120-225 С со скоростью 3 град/мин. 3.2 Микроорганизмы и условия их культивирования, удаление капсульного материала и обезжиривание бактериальной биомассы В работе были использованы микроорганизмы C. pacifica 3879T, C. pacifica 3878, R. pacifica КММ 1406T, I. abyssalis KMM 227T, L. taeanensis G5T, и E. vietnamensis KMM 6221T из Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН. Все микроорганизмы культивировали на жидкой среде следующего состава, (г/л): бактопептон - 5.0; гидролизат казеина - 2.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкоза - 1.0; K2HPO4 - 0.2; MgSO4 - 0.05; NaCl - 15.0; 500 мл дистиллированной воды, 500 мл морской воды. Культивирование проводили в течение двух суток при комнатной температуре при перемешивании (120 об/мин). Биомассу бактерий отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течении 60 мин при 3000 об/мин. Для отмывания капсульного материала с поверхности бактериальных клеток культуру суспендировали в 0.9 % растворе NaCl в течение 2 ч при механическом перемешивании, каждые 30 мин заменяя отмывающий раствор. Обезжиривание клеток проводили, последовательно обрабатывая влажные клетки гексаном (1 x 200 мл), смесью CHCl3:EtOH (2:1, по объему; 2 x 200 мл) и ацетоном (3 x 200 мл), проводя после каждой стадии центрифугирование в течении 30 мин при 4000 об/мин. Выход сухих клеток составлял: 1.4 г/л для E. vietnamensis KMM 6221T, 1.25 г/л для C. pacifica 3879T и C. pacifica 3878, 0.8 г/л для I. abyssalis KMM 227T, 0.6 г/л для R. pacifica КММ 1406T и L. taeanensis G5T. 125 3.3 Выделение ЛПС Бескапсульные обезжиренные клетки растирали до мелкодисперсного состояния. ЛПС экстрагировали из сухой биомассы по методу Вестфаля [177] 45% водным фенолом. Клетки суспендировали в воде (300 мл), затем при перемешивании добавляли 90 % водный фенол (300 мл) и выдерживали 30 мин на водяной бане при 67-68 С при постоянном перемешивании. Смесь охлаждали приблизительно до 10 ºС в бане со льдом. Эмульсию центрифугировали 40 мин при 4000 об/мин, при этом образовывалось три слоя: водный, фенольный и нерастворимый остаток клеток. Водный слой, содержащий ЛПС, отделяли, а фенольный слой и нерастворимый остаток обрабатывали новой порцией воды (500 мл) как описано выше. Экстракцию проводили три раза. Водные экстракты объединяли и осаждали нуклеиновые кислоты трихлоруксусной кислотой при pH = 2. Осадок отделяли центрифугированием, супернатант диализовали против дистиллированной воды трое суток для удаления фенола и небольших количеств бактериальных веществ низкого молекулярного веса. После диализа раствор концентрировали и лиофильно сушили. Выходы ЛПС от сухой бактериальной массы составлял: 11% для E. vietnamensis KMM 6221T, 10.1% для C. pacifica 3879T, 9.8 % для C. pacifica 3878, 4.8% для L. taeanensis G5T, 4.3% для I. abyssalis KMM 227T и 3.6% для R. pacifica КММ 1406T. 3.4 Электрофорез в полиакриламидном геле Электрофорез ЛПС проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН ПААГ) [178] в течение 4 ч при постоянном токе 30 мА. Содержание акриламида в концентрирующем геле составляло 5%, в разделяющем 14%. Перед внесением в лунки, образцы ЛПС кипятили на водяной бане 5 мин. Содержание углеводных фракций визуализировали окрашиванием геля красителем на основе AgNO3 [179]. ЛПС, содержащие отрицательно заряженные компоненты, визуализировали окрашиванием геля 0,01% раствором 126 О-толуидинового синего в смеси С2Н5OH:AcOH:H2O в объемном отношении 2:1:1 в течение двух часов. 3.5 Выделение ОПС Деградацию ЛПС для каждого микроорганизма проводили при различных условиях. ЛПС L. taeanensis G5T гидролизовали 1%-ной уксусной кислотой при 100 С в течение 2 ч. ЛПС C. pacifica 3879T и R. pacifica КММ 1406T гидролизовали 2%-ной уксусной кислотой в течение 3 ч. ЛПС C. pacifica 3878 и E. vietnamensis KMM 6221T гидролизовали ацетатным буфером (рН=4.5) при 100 С в течение 2 и 3 ч, соответственно. ЛПС I. abyssalis KMM 227T обрабатывали раствором 0.1 N NaOH при 37 С в течение 16 ч. Далее для всех ЛПС осадок липида А удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 13000 об/мин и супернатанты последовательно фракционировали гель-хроматографией на колонках с гелем TSK HW-50 (S) и TSK HW-40 (S). ОПС C. pacifica 3879T дополнительно очищали от сопутствующих минорных компонентов ионообменной хроматографией на колонке с гелем DEAE-TSK 650M. Выход ОПС от сухой массы ЛПС составлял: 26,7 % для L. taeanensis G5T, 34 % для C. pacifica 3879T , 40% для R. pacifica КММ 1406T, 36% для C. pacifica 3878, 29% для I. abyssalis KMM 227T и 32% для E. vietnamensis KMM 6221T. 3.6 Компонентный анализ Гидролиз ОПС. ОПС (1-20 мг) гидролизовали 1-2М ТФУ в запаянной ампуле в течение 3 ч при 100 С. Трифторуксусную кислоту удаляли четырёхкратным упариванием с метанолом. Гидролизаты использовали для получения ацетилированных полиолов и для препаративного выделения моносахаридов с помощью метода хроматографии на бумаге. Идентификация моносахаридов в виде ацетилированных полиолов. Смесь моносахаридов, полученную при гидролизе, растворяли в воде (1 мл), 127 добавляли боргидрид натрия (3 мг) и оставляли на ночь при комнатной температуре. Избыток боргидрида разрушали разбавленной уксусной кислотой, упаривали с метанолом (4 раза). Полученную смесь полиолов растворяли в безводном пиридине (0.2 мл), добавляли перегнанный уксусный ангидрид (0.2 мл) и оставляли на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли водой (3-5 мл), ацетилированные полиолы экстрагировали хлороформом. Экстракты трижды промывали водой, сушили над безводным сернокислым натрием и концентрировали. Полученные ацетилированные полиолы использовали для идентификации моносахаридов с помощью методов ГЖХ и ГЖХ-МС. Идентификация моносахаридов в виде ацетилированных метилгликозидов. ОПС (1-2 мг) нагревали в метанолизной смеси (хлористый ацетил-метанол, 1:10 по объему, 0.1 мл) в запаянной ампуле при 100 С в течение 3 ч. Полученную смесь упаривали несколько раз с метанолом и ацетилировали уксусным ангидридом в пиридине в течение ночи при комнатной температуре. Полученные ацетилированные метилгликозиды использовали для идентификации моносахаридов с помощью методов ГЖХ и ГЖХ-МС. Турбидиметрический метод. Образец ОПС 5 мг гидролизовали 2М трифторуксусной кислотой в запаянной ампуле в течение 2 ч при 100 С. В пробу, содержащую 20 мкл раствора гидролизованного образца, добавляли 380 мкл 1М HCl и 100 мкл 0,5 % раствора хлорида бария в желатине. Смесь выдерживали 15 минут при комнатной температуре и количественно оценивали содержание сульфатных групп, измеряя мутность раствора смеси на спектрофотометре при длине волны 630 нм. Контрольные пробы содержали 400 мкл 1М HCl и 100 мкл 0,5 % раствора хлорида бария в желатине. Содержание сульфатных групп в ОПС C. pacifica 3879T составляло 23 %, в ОПС C. pacifica 3878 22.9 % Определение абсолютных конфигураций моносахаридов. Свободные моносахариды L-Rha (C. pacifica 3879T и I. abyssalis KMM 227T), D-Glc и D-Gal (C. pacifica 3879T) и Ala (R. pacifica КММ 1406T) были выделены из гидролизата 128 полисахаридов с помощью нисходящей препаративной хроматографии на бумаге. Удельное оптическое вращение измеряли на приборе Perkin-Elmer модель 343. Удельное оптическое вращение остатка D-Glc []578 +43.5 (с 0,4, вода), по литературным данным []578 +52.7. Удельное оптическое вращение остатка DGal []578 +71 (с 0,4, вода), по литературным данным []578 +80.5. Выделенная Lрамноза (C. pacifica 3879T и I. abyssalis KMM 227T) была обработана 1M HCl в 2 мл метанола в течение 2 ч при 100 С и таким образом превращена в метил Lрамнопиранозид. Абсолютная конфигурация остатков L-Rha была определена на основании удельного оптического вращения полученных метил-L-рамнозидов: []578 -65.4 (C. pacifica 3879T), []578 -64.7 (I. abyssalis KMM 227T) по литературным данным удельное оптическое вращение -метил-L- рамнопиранозида []578 –67.2, вода [180]. Удельное оптическое вращение остатка Ala []D20 -10 (c 0,5, 1N HCl) свидетельствовало о его D-конфигурации, литературные данные для D- Ala []D20 -14,2, 1N HCl [169]. Абсолютную конфигурацию остатков D-Gal (C. pacifica 3878) и D-GalN (R. pacifica КММ 1406T и E. vietnamensis KMM 6221T) определяли методом ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных 2-(S)-октилгликозидов. Смесь моносахаридов, полученную при гидролизе полисахарида, нагревали с 2-(S)-октанолом в присутствие ТФУ (16 ч). Реакционную смесь упаривали досуха и ацетилировали уксусным ангидридом в безводном пиридине в течение ночи при комнатной температуре. Свободный моносахарид L-QuiNAc (L. taeanensis G5T) был выделен в результате сольволиза полисахарида (смотри ниже). Удельное оптическое вращение выделенного QuiNAc []578 –15 (с 0,4, вода) свидетельствовало о его Lконфигурации, по литературным данным удельное оптическое вращение для LQuiNAc []578 –54→–14(вода) [181]. Определение абсолютной конфигурации 3,5-(3S,5S)- дигидроксигексановой кислоты. Дисахарид, полученный после сольволиза (смотри ниже) восстановленного полисахарида L. taeanensis G5T, (12 мг) 129 растворяли в воде, добавляли боргидрид натрия (36 мг) и оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем реакционную смесь нейтрализовали разбавленной уксусной кислотой и подвергали гель-хроматографии на колонке с гелем TSK HW-40 (S). Восстановленный дисахарид (3 мг) растворяли в метаноле и метилировали диазометаном в течение 15 минут. Метилированный дисахарид лиофильно сушили, растворяли в сухом пиридине (0,2 мл) и обрабатывали S-(+)и R-(-)-α-метокси-α-(трифторметил-)-фенилацетилхлоридом [61]. Полученные эфиры Мошера лиофильно сушили и анализировали с помощью метода спектроскопии 1Н-ЯМР [62] 3.7 Химические методы модификации и расщепления полисахаридов Десульфатирование ОПС C. pacifica 3879T. Предварительно обработанный ионообменной смолой КУ-2 (Н+-форма) ОПС C. pacifica 3879T (50 мг) растворяли в 1 мл воды и добавляли 0.5 мл пиридина. Раствор лиофилизовали. К полученной пиридиновой соли полисахарида прибавляли 18 мл DMSO и 2 мл метанола, перемешивая до полного растворения полисахарида, после чего нагревали 4 часа при 100 °С. Раствор диализовали против дисстилированной воды, концентрировали и лиофильно высушивали. Выход десульфатированного полисахарида составил 21 % от массы ОПС. Восстановление ОПС L. taeanensis G5T. ОПС L. taeanensis G5T (100 мг) растворяли в 2,6 мл 1М раствора аммиака, добавляли боргидрид натрия (300 мг) и восстанавливали в течение суток при 37 ºС. Избыток боргидрида разрушали разбавленной уксусной кислотой и смесь разделяли гель-хроматографией на колонке с гелем TSK HW-40 (S). В результате был выделен восстановленный полисахарид (40 мг). Сольволиз восстановленного полисахарида L. taeanensis G5T и ОПС R. pacifica КММ 1406T. Восстановленный полисахарид L. taeanensis G5T (40 мг) растворяли в трифторметансульфоновой кислоте и гидролизовали в запаянной ампуле в течение 2,5 ч при 4 oС. Реакционную смесь нейтрализовали 25 % 130 раствором аммиака и разделяли гель-хроматографией на колонке с гелем TSK HW-40 (S). В результате был выделен дисахарид (12 мг) и L-QuiNAc (4 мг). Сольволиз ОПС R. pacifica КММ 1406T (30 мг) проводили как описано выше 6 ч при 0 oС. Реакционную смесь нейтрализовали и разделяли гель-хроматографией на колонке с гелем TSK HW-40 (S). В результате был выделен дисахарид (12 мг). Периодатное окисление ОПС I. abyssalis KMM 227T. ОПС (30 мг) I. abyssalis KMM 227T растворяли в 0,1 М растворе метапериодата натрия (30 мл) и выдерживали в темноте 72 ч при комнатной температуре. Далее избыток метапериодата натрия разрушали этиленгликолем (500 мкл, 2 ч) и реакционную смесь диализовали против проточной воды 6 ч, а затем против дистиллированной. Окисленный продукт восстанавливали боргидридом натрия (30 мг) в течение 3 ч, нейтрализовали до pH 7 10 %-м водным раствором уксусной кислоты и диализовали двое суток против дистиллированной воды. Окисленный полисахарид гидролизовали 2 %-ой уксусной кислотой 1 ч при 100 С, полученные продукты разделяли гель-хроматографией на колонке с гелем TSK HW-40 (S) и лиофильно сушили. В результате был получен окисленный полисахарид (18 мг). 3.8 Спектроскопия ЯМР Образцы перед съемкой спектров дважды лиофилизовали из 99.0% D2O и растворяли в 99.96% D2O. Спектры ЯМР снимали при 35-50°С, в качестве внутреннего стандарта использовали ацетон (C =31.45, H =2.22). В экспериментах 1H,1H-TOCSY и 1H,1H-ROESY время смешения составляло 180 и 200 мс, соответственно.1H,13C-HMBC эксперименты оптимизировали на дальнюю гетероядерную константу 8 Гц. 3.9. Цитокин-индуцирующая и цитотоксическая активности Индукция цитокинов ФНО-альфа и ИЛ-6. Процесс обработки крови проводили согласно методике [182]. Венозная кровь была собрана в 5 мл 131 стерильные пробирки, содержащие 150I U гепарина, разбавлена 1:5 в стерильной среде 199 (Sigma, США), содержащей 300 мг/л L-глютамина (Sigma, США) и 50 мкг/мл гентамицина («Белмедпрепарат», Белоруссия). Разбавленную кровь (по 0.1 мл в каждой ячейке) в стерильном 96-луночном планшете (Costar, США) инкубировали с ЛПС. Через 24 часа супернатанты были собраны и цитокины определены с помощью специфических тест-систем (ООО «Цитокин», Россия). Для индукции использовали растворы с концентрациями ЛПС 0.01, 0.1 и 1 мкг/мл. Определение жизнеспособности клеток. Мышиные лимфоциты (спленоциты) получали из селезенки мышей линии BALB/С. Цитотоксическое действие исследуемых веществ определяли при помощи прижизненного красителя Trypan blue (трипановый синий). При выполнении эксперимента брали 96-луночную планшету, в каждую лунку добавляли 20 мкл растворителя (H2O дистиллированная), 20 мкл исследуемого вещества и 200 мкл суспензии лимфоцитов селезенки мыши в концентрации 2×106 кл/мл, после чего ставили планшету в термостат на 1 час при 370С. После инкубирования брали по 20 мкл клеток из лунки, наносили на обезжиренное предметное стекло, добавляли 20 мкл красителя Trypan blue, накрывали покровным стеклом и помещали на микроскоп AXIO Imager A1 (Zeiss, Германия). Делали снимки всех лунок в трех повторностях при помощи цветной CCD видеокамеры (AxioCam MRc, Zeiss, Германия), встроенной в микроскоп. В итоге подсчитывали количество живых, неокрашенных клеток и мертвых клеток, окрашенных Trypan blue. Подсчет клеток производили при помощи программы Image Tool Version 3.00 (UTHSCSA, США), затем вычисляли процент погибших клеток относительно общего числа клеток 132 ВЫВОДЫ 1. Впервые установлена полная структура шести О-антигенных полисахаридов из неизученных ранее морских грамотрицательных бактерий: Cobetia pacifica KMM 3879T, Cobetia pacifica KMM 3878, Rheinheimera pacifica КММ 1406T, Idiomarina abyssalis KMM 227T, Litorimonas taeanensis G5T, Echinicola vietnamensis КММ 6221Т. 2. Установлено, что два штамма морского микроорганизма Cobetia pacifica (KMM 3879T и KMM 3878) продуцируют различные по структуре сульфатированные О-специфические полисахариды, построенные из трисахаридных повторяющихся звеньев. Отличительной особенностью Оантигенного полисахарида C. pacifica KMM 3878 является наличие 2,3-Одисульфат-D-галактозы, обнаруженной в природе впервые, и 3,4-О-[(Sкарбоксиэтиледен)]-D-галактозы − редкого компонента для бактериальных гликанов. 3. Показано, что глубоководные морские бактерии Rheinheimera pacifica КММ 1406T и Idiomarina abyssalis KMM 227T продуцируют высокоаминированные кислые О-антигенные полисахариды, построенные из пентасахаридных полисахарид Idiomarina повторяющихся abyssalis звеньев. KMM 227T О-специфический содержит впервые обнаруженную в природе 3-(4-гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-Dглюкозу, сульфатированную по второму положению. 4. В составе Litorimonas О-антигенного taeanensis G5T полисахарида впервые морского микроорганизма идентифицирован ацетиламино-2,6-дидезокси-L-гексоз-4-улозы и остаток обнаружено 2- редко встречающееся в природе производное моносахарида 2-ацетиламино-4[(3S,5S)-3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-D-глюкоза. 5. Показано, что метод Мошера с использованием R-, S-α-метокси-αтрифторметил-α-фенилацетилхлорида позволяет определить абсолютную конфигурацию неуглеводного заместителя с двумя асимметрическими 133 центрами. Конфигурация дигидроксигексановой асимметрических кислоты в составе центров полисахарида (3S,5S)-3,5Litorimonas taeanensis G5T установлена с помощью метода Мошера, который впервые применен в структурной химии углеводов. 6. В результате изучения иммуностимулирующей активности ЛПС C. pacifica KMM 3879T, C. pacifica KMM 3878, R. pacifica КММ 1406T, I. abyssalis KMM 227T, L. taeanensis G5T и E. vietnamensis КММ 6221Т впервые установлено, что все исследованные ЛПС не токсичны и являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО- и ИЛ-6, что представляет интерес с точки зрения изучения их антагонистических свойств. 134 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides – themes and variations // Progr. Lipid Res. 1996. V. 35, N 3. P. 283-313. 2. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 635-700. 3. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. V. 7, N 3. P. 167-202. 4. Rothschild L.J., Mancinelli R.L. Life in extreme environments // Nature. 2001. V. 409, N 6823. P. 1092-1100. 5. Nazarenko E.L., Komandrova N.A., Gorshkova R.P., Tomshich S.V., Zubkov V.A., Kilcoyne M., Savage A.V. Structures of polysaccharides and oligosaccharides of some Gram-negative marine Proteobacteria // Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 23. P. 2449-2457. 6. Leone S., Silipo A., Nazarenko E.L., Lanzetta R., Parrilli M., Molinaro A. Molecular structure of endotoxins from gram-negative marine bacteria: An update // Mar. Drugs. 2007. V 5, N 3. P. 85-112. 7. Nazarenko E. L., Crawford R. J., Ivanova E. P. The structural diversity of carbohydrate antigens of selected gram-negative marine bacteria // Mar. Drugs. 2011. V. 9, N 10. P. 1914-1954. 8. Anwar M.A., Choi S. Gram-negative marine bacteria: Structural features of lipopolysaccharides and their relevance for economically important diseases // Mar. Drugs. 2014. V. 12, N 5. P. 2485-2514. 9. Maaetoft-Udsen K., Vynne N., Heegaard P. M. H., Gram L., Frokiaer H. Pseudoalteromonas strains are potent immunomodulators owing to low-stimulatory LPS // Innate Immun. 2013. V. 19, N 2. P.160–173. 10. Solov'eva T.F., Davydova V.N., Krasikova I.N., Yermak I.M. Marine compounds with therapeutic potential in gram-negative sepsis // Mar. Drugs. 2013. V. 11, N 6. P. 2216-2229. 135 11. Westphal O. Bacterial endotoxins // Trans. Colleg. Int. Allergol. 1975. V. 49, N 1. P. 1-43. 12. Erridge C., Bennett-Guerrero E., Poxton I. R. Structure and function of lipopolysaccharides. // Microbes. Infect. 2002. V. 4, N 8. P. 837 - 851. 13. Caroff M., Karibian D. Structure of bacterial lipopolysaccharides // Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 23. P. 2431-2447. 14. Alexander C., Zähringer U. Chemical structure of lipid A – The primary immunomodulatory center of bacterial lipopolysaccharides // Trends. Glycosci. Glyc. 2001. V. 7, N 76. P. 69-86. 15. Holst O., Molinaro A. Core oligosaccharide and lipid A components of lipopolysaccharides // In: Moran A., Brennan P., Holst O., von Itszstein M (Eds.) Microbial glycobiology: structures relevance and applications. Elsevier, San Diego. 2009. P. 29-56. 16. Silipo A, Molinaro A. Lipid A Structure // In: Knirel Y.A., Valvano M.A. (Eds.) Bacterial Lipopolysaccharides. SpringerWienNewYork. 2011. P. 1-20. 17. Raetz C.R.H. Bacterial lipopolysaccharides: a remarkable family of bioactive macroamphiphiles // In: Neidhardt F.C., Curtiss R. III, Ingraham J.L., Lin E.C.C, Low K.B., Magasanik B., Reznikoff W.S., Riley M., Schaechter M., Umbarger H.E. (Eds.) Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. Washington, D.C.: ASM Press. 1996. P. 1035-1063. 18. Holst O. The structures of core regions from enterobacterial lipopolysaccharides – an update // FEMS Microbiol. Lett. 2007. V. 271, N 1. P. 3-11. 19. Frirdich E, Whitfield C. Lipopolysaccharide inner core oligosaccharide structure and outer membrane stability in human pathogens belonging to the Enterobacteriaceae // J. Endotoxin Res. 2005. V. 11, N 3. P. 133-144. 20. Knirel Y.A. Structure of O-Antigens // In: Knirel Y.A., Valvano M.A. (Eds.) Bacterial Lipopolysaccharides. Springer Wien New York. 2011. P. 41-115. 21. Knirel Y.A. O-Specific polysaccharides of Gram-negative bacteria // In: Moran A, Brennan P, Holst O, von Itzstein M (Eds.) Microbial glycobiology: structures, relevance and applications. Elsevier, Amsterdam. 2009. P. 41-115. 136 22. Bisharat N., Agmon V., Finkelstein R., Raz R., Ben-Dror G., Lerner L., Soboh S., Colodner R., Cameron D.N., Wykstra D.L., Swerdlow D.L., Farmer III J. J. Clinical, epidemiological, and microbiological features of Vibrio vulnificus biogroup 3 causing outbreaks of wound infection and bacteraemia in Israel // Lancet. 1999. V. 354, N 9188. P. 1421-1424. 23. Dalsgaard I., Hǿi L., Siebeling R.J., Dalsgaard A. Indole-positive Vibrio vulnificus isolated from disease outbreaks on a Danish eel farm // Dis. Aquat.Org. 1999. V. 26, N 3. P.187-194. 24. Fouz B., Larsen J.L., Amaro C.J. Vibrio vulnificus serovar A: An emerging pathogen in European anguilliculture // Fish Dis. 2006. V. 29, N 5. P. 285-291. 25. Senchenkova S.N., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Esteve C., Alcaide E., Merino S., Tomas J.M. Structure of a polysaccharide from the lipopolysaccharide of Vibrio vulnificus clinical isolate YJ016 containing 2-acetimidoylamino-2-deoxy-Lgalacturonic acid // Carbohyd. Res. 2009. V. 344. P.1009-1013. 26. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Chizhov A.O., Knirel Y.A., Esteve C., Alcaide E., Merino S., Tomas J.M. Structure of a polysaccharide from the lipopolysaccharides of Vibrio vulnificus strains CECT 5198 and S3-I2-36, which is remarkably similar to the O-polysaccharide of Pseudoalteromonas rubra ATCC 29570 // Carbohyd. Res. 2009. V. 344. P.2005-2009. 27. Kilcoyne M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Senchenkova S.N., Savage A.V. The structure of the Opolysaccharide of the Pseudoalteromonas rubra ATCC 29570T lipopolysaccharide containing a keto sugar // Carbohydr. Res. 2005. V.340. P. 2369-2375. 28. Knirel Y.A., Senchenkova S.N., Shashkov A.S., Esteve C., Alcaide E., Merino S., Tomas J.M. Structure of a polysaccharide from the lipopolysaccharide of Vibrio vulnificus CECT4602 containing 2-acetamido-2,3,6-trideoxy-3-[(S)- and (R)-3hydroxybutanoylamino]-L-mannose // Carbohyd. Res. 2009. V. 344. P.479-483. 29. Arbatsky N.P., Shashkov A.S., Toukach F.V., Moll H., Zych K., Knirel Y.A., Zähringer U., Sidorczyk Z. Structure of the O-specific polysaccharide of a serologically separate strain Proteus penneri 2 from a new proposed serogroup O66 137 // Eur. J. Biochem. 1999. V. 261, N 2. P.392-397. 30. Whittaker D.V., Parolis L.A.S., Parolis H. Structural elucidation of the capsular polysaccharide produced by Escherichia coli O20:K84:H26 // Carbohyd. Res. 1994. V. 262, N 2. P.323-334. 31. Smith P.D. // In: A.E. Ellis (Eds.). Fish Vaccination. Academic Press, London. 1988. P. 67-84. 32. Sadovskaya I., Brisson J.R., Khieu N.H., Mutharia L.M., Altman E. Structural characterization of the lipopolysaccharide O-antigen and capsular polysaccharide of Vibrio ordalii serotype O:2 // Eur. J. Biochem. 1998. V. 253, N 1. P.319-327. 33. Sadovskaya I., Brisson J., Altman E., Mutharia L.M. Structural studies of the lipopolysaccharide O-antigen and capsular polysaccharide of Vibrio anguillarum serotype O:2 // Carbohyd. Res. 1996. V. 283. P.111-127. 34. Kocharova N.A., Perepelov A.V., Zatonsky G.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Jansson P., Weintraub A. Structural studies of the O-specific polysaccharide of Vibrio cholerae O8 using solvolysis with triflic acid // Carbohydr. Res. 2001. V. 330, N 1. P.83–92. 35. Wang Z., Vinogradov E.V., Li J., Lund V., Altman E. Structural characterization of the lipopolysaccharide O-antigen from atypical isolate of Vibrio anguillarum strain 1282 // Carbohydr. Res. 2009. V. 344, N 1. P. 1371-1375. 36. Banoub J., Chon F., Hodder H.J. Structural elucidation of the 0-specific polysaccharide of the phenol-phase soluble lipopolysaccharide of Vibrio anguillarum // Biochem. Cell Biol. 1987. V. 65. P. 19-26. 37. Eguchi H., Kaya S., Araki Y., Kojima N., Yokota S.I. Structure of the Opolysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Vibrio anguillarum V-123 // Carbohydr. Res. 1992. V. 231. P. 159-161. 38. Yokota S.I., Kaya S., Kawamura T., Araki Y., Ito E. The structure of the O-specific chain of lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa IID 1008 (ATCC 27584) // J. Biochem. 1986. V. 99. P. 1551-1561. 39. McFall-Ngai M.J., Ruby E.G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism // Science. 1991. V. 254 P. 1491- 138 1494. 40. Nyholm S.V., Stabb E.V., Ruby E.G., McFall-Ngai M.J. Establishment of an animalbacterial association. Recruiting symbiotic Vibrios from the environment // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. V. 97. P. 10231-10235. 41. Post D.M., Yu L., Krasity B.C., Choudhury B., Mandel M.J., Brennan C.A., Ruby E.G., McFall-Ngai M.J., Gibson B.W., Apicella M.A. The O-antigen and core carbohydrate of Vibrio fischeri lipopolysaccharide: Composition and analysis of their role in Euprymna scolopes light organ colonization // J. Biol. Chem. 2012. V. 287, N 11. P. 8515-8530. 42. Holst O. Lipopolysaccharides of Yersinia. An overview // Adv. Exp.Med. Biol. 2003. V. 529. P. 219-228. 43. Zahringer U., Knirel Y.A., Lindner B., Helbig J.H., Sonesson A., Marre R., Rietschel E.Th. The lipopolysaccharide of Legionella pneumophila serogroup1 (strain Philadelphia 1) // Prog. Clin. Biol. Res. 1995. V. 392. P. 113-139. 44. Jensen P.R., Fenical W. Strategies for the discovery of secondary metabolites from marine bacteria: ecological perspectives // Annu. Rev. Microbiol. 1994. V. 48. P. 559-584. 45. Holmström C., Kjelleberg S. Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents // FEMS Microbiol. Ecology. 1999. V. 30, P. 285-293. 46. Muldoon J., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Ivanova E.P., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of a colitose– containing O-specific polysaccharide of the marine bacterium Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160T // Carbohydr. Res. 2001. V. 333, N 1. P. 41-46. 47. Silipo A., Molinaro A., Nazarenko E.L., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Lanzetta R., Parrilli M. The O-chain structure from the LPS of marine halophilic bacterium Pseudoalteromonas carrageenovora-type strain IAM 12662T // Carbohydr Res. 2005. V. 340. 2693-2697. 48. Knirel Y.A., Senchenkova S.N., Jansson P.–E., Weintraub A., Ansaruzzaman M., Albert M.J. Structure of the O-specific polysaccharide of an Aeromonas trota strain 139 cross-reactive with Vibrio cholerae O139 Bengal // Eur. J. Biochem. 1996. V. 238. P. 160-165. 49. Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.–E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M.J. Structure of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae O139 synonym Bengal containing D-galactose-4,6-cyclophosphate // Eur. J. Biochem. 1995. V. 232. P. 391396. 50. Овчинникова O.Г., Рожальски A., Лю Б., Книрель Ю.A. О-антигены бактерий рода Providencia: структура, серология, генетика и биосинтез // Биохимия. 2013. Т. 78, N 7. P. 1023-1045. 51. Perepelov A.V., Shashkov A.S., Torgov V.I., Nazarenko E.L., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Widmalm G. Structure of an acidic polysaccharide from the agar-decomposing marine bacterium Pseudoalteromonas atlantica strain IAM 14165 containing 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-L-glycero-L-manno-non2-ulosonic acid // Carbohydr. Res. 2005. V. 340. P. 69-74. 52. Muldoon J., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of an acidic polysaccharide from a marine bacterium Pseudoalteromonas distincta KMM 638Т containing 5acetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-7-formamido-L-glycero-L-manno-nonulosonic acid // Carbohydr. Res. 2001. V. 330, N 2. P. 231-239. 53. Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Zhukova N.V., Lysenko A.M., Zelepuga E.А., Prokofeva N.G., Mikhailov V.V., Nicolau D.V., Christen R.. Characterization of Pseudoalteromonas distincta-like sea water isolates and description of Pseudoalteromonas aliena sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. – Vol.54. – P. 1431-1437. 54. Nordmark E.L., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Nazarenko E.L., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Widmalm G. Structure of an acidic polysaccharide from the marine bacterium Pseudoalteromonas aliena type strain KMM 3562T containing two residues of L-serine in the repeating unit // Carbohydr. Res. 2005. V. 340, N 8. P.1483-1487. 55. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Parkhomchuk A.A., Bialczak-Kokot M., 140 Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens O60 // Carbohydr. Res. 2011. V. 346, N 2. P. 377-380. 56. Dengler T., Jann B., Jann K. Structure of the serine-containing capsular polysaccharide K40 antigen from Escherichia coli O8:K40:H9 // Carbohydr. Res. 1986. V.150. P. 233-240. 57. Jann B., Kochanowski H., Jann K. Structure of the capsular K96 polysaccharide (K96 antigen) from Escherichia coli O77:K96:H- and comparison with the capsular K54 polysaccharide (K54 antigen) from Escherichia coli O6:K54:H10 // Carbohydr. Res. 1994. V.253. P. 323-327. 58. Командрова Н.А., Томшич С.В., Шевченко Л.С., Перепелов А.В., Сенченкова С.Н., Шашков А.С., Книрель Ю.А. Структура кислого О-специфического полисахарида морской бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 634 // Биохимия. 2000. Т. 65, № 9. С. 1253-1261. 59. Hanniffy O.M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of a highly acidic Ospecific polysaccharide of lipopolysaccharide of Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223 (44-1) containing L-iduronic acid and D-QuiNHb4NHb // Carbohydr. Res. 1998. V. 307, N 3-4. P. 291-298. 60. Liu B., Knirel Y.A., Feng L., Perepelov A.V., Senchenkova S.N., Wang Q., Reeves P., Wang L. Structure and genetics of Shigella O antigens // FEMS Microbiol. Rev. 2008. V. 32, N 4. P. 627-653. 61. Perepelov A.V., Liu B., Senchenkova S.N., Shashkov A.S., Feng L., Knirel Y.A., Wang L. Structure of the O-polysaccharide of Escherichia coli O112ab containing L-iduronic acid // Carbohydr. Res. 2008. V. 343, N 3. P. 571-575. 62. Andersson M., Ratnayake S., Kenne L., Ericsson L., Stack R.J. Structural studies of the extracellular polysaccharide from Butyrivibrio fibrisolvens strain X6C61 // Carbohydr. Res. 1993. V. 246. P. 291-301. 63. Lee L., Cherniak R. Identification of iduronic acid as a constituent of the «type– specific» polysaccharide of Clostridium perfringens Hobbs 10 // Carbohydr. Res. 141 1974. V. 33, N 2. P. 387-390. 64. Hanniffy O., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of an acidic O-specific polysaccharide of Pseudoalteromonas haloplanktis type strain ATCC14393 containing 2-acetamido-2-deoxy-D- and -L-galacturonic acids and 3-(N-acetyl-Dalanyl)amino-3,6-dideoxy-D-glucose // Carbohydr. Res. 1999. V. 321, N 1-2. P. 132138. 65. Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Kochetkov N.K., Sidorczyk Z., Swierzko A. The structure of Proteus penneri strain 14 O-specific polysaccharide containing D- and L-alanine // Carbohydr. Res. 1991. V. 219. P. 1-3. 66. Muldoon J., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of an acidic polysaccharide from the marine bacterium Pseudoalteromonas flavipulchra NCIMB 2033T // Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 5. P. 459-462. 67. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens O36 containing 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid // Carbohydr. Res. 2007. V. 342, N 3-4. P. 665-670. 68. Vanhaverbeke C, Heyraud A, Achouak W, Heulin T. Structural analysis of the exopolysaccharide from Burkholderia caribensis strain MWAP71 // Carbohyd. Res. 2001. V. 334, N 2. P. 127-133. 69. Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Paramonov N.A., Meshkov S.V., Ivanova E.P. Structure of the capsular polysaccharide from Alteromonas nigrifaciens IAM 13010T containing 2-acetamido2,6-dideoxy-L-talose and 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid // Carbohydr. Res. 1997. V. 299, N 1-2. P. 69-76. 70. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Исаков В.В. Структура О-специфического полисахарида Pseudoalteromonas nigrifaciens KMM 161 // Биохимия. 2002. Т. 67, № 6. С. 810-814. 71. Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Горшкова Р.П., 142 Иванова Е.П., Оводов Ю.С. Структура повторяющего звена кислого полисахарида Alteromonas macleodii 2ММ6 // Биоорган. химия. 1993. Т. 19, № 7. C. 740-751. 72. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Иванова Е.П., Оводов Ю.С., Шашков А.С., Книрель Ю.А. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas haloplanktis KMM 156 // Биоорган. химия. 1993. Т. 19, № 3. C. 327-336. 73. Knirel Y.A., Kaca W., Paramonov N.A., Cedzynski M., Vinogradov E.V., Ziolkowski A., Shashkov A.S., Rozalski A. Structure of the O-specific polysaccharide of Proteus vulgaris O25 containing 3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-Dglucose // Eur. J. Biochem. 1997. V. 247, N 1. P.951-954. 74. Parolis L.A.S, Parolis H., Dutton G.G.S., Wing P.L., Skura B.J. Structure of the glycocalyx polysaccharide of Pseudomonas fragi ATCC 4973 // Carbohydr. Res. 1991. V. 216. P.495-504. 75. Osman S.F., Fett W.F. Structure of the acidic exopolysaccharide of Pseudomonas marginalis Strain ATCC 10844 // Carbohydr. Res. 1993. V. 242. P.271-275. 76. Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Shashkov A.S., Ivanova E.P., Gorshkova N.M. Structure of the O-specific polysaccharide from Pseudoalteromonas elyakovii sp. nov. CMM 162 // Carbohydr. Res. 1998. V. 313, N 1. P. 61-64. 77. Bartelt M., Shashkov A.S., Kochanowski H., Jann B., Jann K. Structure of the Ospecific polysaccharide of the O22-antigen (LPS) from Escherichia coli O22:K13 // Carbohydr. Res.1994. V. 254. P. 203-212. 78. Katzenellenbogen E., Kocharova N.A., Zatonsky G.V., Korzeniowska-Kowal A., Shashkov A.S., Knirel Y.A. Structure of the O-specific polysaccharide from the lipopolysaccharide of Hafnia alvei strain PCM1546 // Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 20. P. 2153-2158. 79. Katzenellenbogen E., Kocharova N.A., Zatonsky G.V., Shashkov A.S., Bogulska M., Knirel YA. Structures of the biological repeating units in the O-chain polysaccharides of Hafnia alvei strains having a typical lipopolysaccharide outer 143 core region // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. V. 45, N 2. P. 269-278. 80. Romanenko L.A., Zhukova N.V., Rhode M., Lysenko A.M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E. Pseudoalteromonas agarivorans sp. nov., a novel marine agarolytic bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 125-131. 81. Командрова Н.А., Томшич С.В., Исаков В.В., Романенко Л.А. Структура сульфатированного О-специфического полисахарида морской бактерии Pseudoalteromonas marinoglutinosa KMM 232 // Биохимия. 1998. Т.63, №10. С. 98-103. 82. Командрова Н.А., Исаков В.В., Томшич С.В., Романенко Л.А., Перепелов А.В., Шашков А.С. Структура кислого О-специфического полисахарида R-формы морской бактерии Pseudoalteromonas agarivorans КММ 232 // Биохимия. 2010. Т. 75, № 5. С. 727-734. 83. Командрова Н.А., Томшич С.В., Исаков В.В., Романенко Л.А. О- специфический полисахарид морской бактерии “Alteromonas marinoglutinosa” NCIMB 1770 //Биохимия. 2001. Т.66, №8. С. 894-897. 84. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Исаков В.В., Зубков В.А., Горшкова Н.М., Романенко Л.А., Иванова Е.П. Структура глицерофосфатсодержащего Оспецифического полисахарида Pseudoalteromonas sp. KMM 639 // Биоорган. химия. 1998. Т. 24, № 11. C. 839-841. 85. Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Горшкова Р.П., Иванова Е.П., Оводов Ю.С. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas sp. 4MC17 // Биоорган. химия. 1993. Т. 19, № 7. C. 733-739. 86. Vinogradov E.V., Korenevsky A., Beveridge T.J. The structure of the O-specific polysaccharide chain of the Shewanella algae BrY lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 3. P. 385-388. 87. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova N. M., Knirel Y.A., Gorshkova R.P. Structure of the acidic polysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Shewanella algaе 48055 // Carbohydr. Res. 1998. V. 309, N 1. P. 103-108. 144 88. Vinogradov E.V., Holst O., Thomas-Oates J.E., Broady K.W., Brade H. The structure of the O-antigenic polysaccharide from lipopolysaccharide of Vibrio cholerae strain H11 (non O1) // Eur. J. Biochem. 1992. V. 210. P. 491-498. 89. Shashkov A.S., Torgov V.I., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova N.M., Gorshkova R.P., Widmalm G. Structure of the phenol-soluble polysaccharide from Shewanella putrefaciens strain A6 // Carbohydr. Res. 2002. V. 337, N 12. P. 11191127. 90. Kilcoyne M., Shashkov A.S., Senchenkova S.A., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Radziejewska-Lebrecht J., Galimska-Stypa R., Savage A.V. Structural investigation of the O-specific polysaccharides of Morganella morganii consisting of two higher sugars // Carbohydr. Res. 2002. V. 337, N. 18. P. 1697-1702. 91. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova N.M., Knirel Y.A., Gorshkova R.P. Structure of a phosphorylated polysaccharide from Shewanella putrefaciens strain S 29 // Carbohydr. Res. 1997. V. 303, N 3. P. 333338. 92. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // In: Aspinall G.O. (Ed.) Polysaccharides. New York: Academic Press. 1983. V. 2. P. 287-363. 93. Kilcoyne M., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Nazarenko E.L., Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Gorshkova R.P. Savage A.V. Structure of an acidic O-specific polysaccharide from marine bacterium Shewanella fidelis KMM 3582T containing Nε-[(S)-1-carboxyethyl]-Nα-(Dgalacturonoyl)-L-lysine // Carbohydr. Res. 2004. V. 339, N 9. P. 1655-1661. 94. Kocharova N.A., Zatonsky G.V., Torzewska A., Macieja Z., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-specific polysaccharide of Providencia rustigianii O14 containing Nε-[(S)-1-carboxyethyl]-Nα-(D- galacturonoyl)-L- lysine. Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 9. P. 1009-1016. 95. Kilcoyne M., Shashkov A.S., Perepelov A.V., Nazarenko E.L., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Widmalm G., Savage A.V. Structure of the O-specific polysaccharide from Shewanella japonica type strain KMM 3299T containing the rare amino sugar Fuc4NAc // Carbohydr. Res. 2005. V. 340, N 8. P. 1557-1561. 145 96. Назаренко Е.Л., Перепелов A.В., Шевченко Л.С., Даева E.Д., Иванова E.П., Шашков A.С., Видмальм Г. Структура О-специфического полисахарида Shewanella japonica КММ 3601, содержащего 5,7-диацетамино-3,5,7,9- тетрадезокси-D-глицеро-D-тало-нон-2-улозоновую кислоту // Биохимия. 2011. Т. 76, N 7. P. 969-975. 97. Книрель Ю.A., Сенченкова С.Н., Кочарова Н.A., Шашков A.С., Хельбиг Ю.Г., Цэрингер У. Идентификация гомополимера 5-ацетамидино-7-ацетамидо3,5,7,9-тетрадезокси-D-глицеро-D-тало-нонулозоновой липополисахаридах бактерий Legionella pneumophila, кислоты не входящих в в серогруппу 1 // Биохимия. 2001. Т. 66. P. 1271-1279. 98. Knirel Y.A., Shashkov A.S., Tsvetkov Y.E., Jansson P-E., Zahringer U. 5,7Diamino-3,5,7,9-tetradeoxynon-2-ulosonic acids in bacterial glycopolymers: chemistry and biochemistry // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 2003. V. 58. P.371417. 99. Kondakova A.N., Novototskaya-Vlasova K.A., Drutskaya M.S., Senchenkova S.N., Shcherbakova V.A., Shashkov A.S., Gilichinsky D.A., Nedospasov S.A., Knirel Y.A. Structure of the O-polysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Psychrobacter muricolla 2pST isolated from overcooled water brines within permafrost // Carbohydr. Res. 2012. V. 349. P. 78-81. 100. Molinaro A., Bedini E., Ferrara R., Lanzetta R., Parrilli M., Evidente A., Lo C.P., Iacobellis N.S. Structural determination of the O-specific chain of the lipopolysaccharide from the mushrooms pathogenic bacterium Pseudomonas tolaasii // Carbohydr. Res. 2003. V. 338, N 11. P. 1251-1257. 101. Kondakova A.N., Novototskaya-Vlasova K.A., Shashkov A.S., Drutskaya M.S., Senchenkova S.N., Shcherbakova V.A., Gilichinsky D.A., Nedospasov S.A., Knirel Y.A. Structure of an acidic polysaccharide isolated from Psychrobacter maritimus 3pS containing a bacillosamine derivative // Carbohydr. Res. 2012. V. 359. P. 7-10. 102. Veremeychenko S.N., Zdorovenko G.M. Peculiarity of the structure of the lipopolysaccharide of Pseudomonas fluorescens IMV 247 (biovar II) // Mikrobiol. 2000. V. 69, N 3. P. 362-369. 146 103. Kondakova A.N., Novototskaya-Vlasova K.A., Arbatsky N.P., Drutskaya M.S., Shcherbakova V.A., Shashkov A.S., Gilichinsky D.A., Nedospasov S.A., Knirel Y.A. Structure of the O-specific polysaccharide from the lipopolysaccharide of Psychrobacter cryohalolentis K5T containing a 2,3,4-triacetamido-2,3,4-trideoxy-Larabinose moiety // J. Nat. Prod. 2012. V. 75, N 12. P. 2236-2240. 104. Kilcoyne M., Perepelov A.V., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Shashkov A.S., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of the O-polysaccharide of Idiomarina zobellii KMM 231T containing two unusual amino sugars with the free amino group, 4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose and 2-amino-2-deoxy-L-guluronic acid // Carbohydr. Res. 2004. V. 339, N 3. P. 477-482. 105. Горшкова Р.П., Исаков, В.В. Денисенко В.А., Назаренк Е.Л. о, Иванова Е.П., Шевченко Л.С.. Структура повторяющегося звена О-специфического полисахарида Alteromonas addita типового штамма KMM 3600Т // Химия природных соединений. 2008. № 5. С. 445-447. 106. Горшкова Р. П., Исаков В. В., Недашковская О. И., Назаренко Е. Л. Строение углеводных антигенов из Microbulbifer sp. KMM 6242 // Химия природных соединений. 2010. N 6. С. 711-713. 107. Зубков В.А., Назаренко Е.Л., Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Горшкова Р.П. Структура повторяющегося звена О-специфического полисахарида Marinomonas communis штамма ATCC 27118(T) // Биоорган. химия. 1999. Т. 25, N 4. C. 290-292. 108. Stenutz R., Weintraub A., Widmalm G. The structures of Escherichia coli Opolysaccharide antigens // FEMS Microbiol. Rev. 2006. V. 30, N 3. P. 382-403. 109. Gajdus J., Glosnicka R., Szafranek J. Primary structure of Salmonella spp. Oantigens // Wiadomosci Chemiczne (Polish) 2006. V. 60, N 9-10. P. 621-653. 110. Handlinger J., Soltani M., Percival S. The pathology of Flexibacter maritimus in aquaculture species in Tasmania, Australia // J. Fish Dis. 1997. V. 20. P. 159-169. 111. Soltani M., Munday B.L., Burke C.M. The relative susceptibility of fish to infections by Flexibacter columnaris Aquaculture.1996. V. 410. P. 259-264. and Flexibacter maritimus // 147 112. Vinogradov E.V., MacLean L.L., Crump E.M., Perry M.B., Kay, W.W. Structure of the polysaccharide chain of the lipopolysaccharide from Flexibacter maritimus // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 1810-1815. 113. Perepelov A.V., Shashkov A.S., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Nedashkovskaya O.I. A pseudoaminic acid-containing O-specific polysaccharide from a marine bacterium Cellulophaga fucicola // Carbohydr. Res. 2007. V. 342, N 10. P. 1378-1381. 114. Staaf M., Weintraub A., Widmalm G. Structure determination of the O-antigenic polysaccharide from the enteroinvasive Escherichia coli O136 // Eur. J. Biochem. 1999. V. 263, N 3. P. 656-661. 115. Томшич С.В., Командрова Н.А., Перепелов А.В., Видмальм Г., Недашковская О.И., Шашков А.С. Структура кислого О-специфического полисахарида Cellulophaga baltica // Биоорган. химия. 2007. Т. 33, N 1. C. 91-95. 116. Perepelov A.V., Shashkov A.S., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Nedashkovskaya O.I. Structure of the O-specific polysaccharide from a marine bacterium Cellulophaga pacifica containing rarely occurred sugars, Fuc4NAc and ManNAcA // Carbohydr. Res. 2013. V. 372. P. 69-72. 117. Erbel P.J., Barr K., Gao N., Gerwig G.J., Rick P.D., Gardner K.H. Identification and biosynthesis of cyclic enterobacterial common antigen in Escherichia coli // J. Bacteriol. 2003. V. 185, N. 6. P. 1995-2004. 118. Vinogradov E.V., Knirel Y.A., Thomas-Oates J.E., Shashkov A.S., L'vov V.L. The structure of the cyclic enterobacterial common antigen (ECA) from Yersinia pestis // Carbohydr. Res. 1994. V. 258. P.223-232. 119. Томшич С. В., Исаков В. В., Командрова Н. A., Шевченко Л. С. Структура Оспецифического полисахарида морской бактерии Arenibacter Palladensis КММ 3961Т, содержащего 2-ацетамидо-2-дезокси-L-галактуроновую кислоту // Биохимия. 2012. Т. 77, N 1. P. 110-115. 120. Горшкова Р.П., Исаков В.В., Шевченко Л.С., Иванова E.П., Денисенко В.A., Назаренко Е.Л. Структура тейхоевой кислоты из морской протеобактерии Sulfitobacter brevis KMM 6006 // Химия природных соединений. 2007. N 6. P. 148 533-536. 121. Bubb W.A. NMR spectroscopy in the study of carbohydrates: Characterizing the structural complexity // Concept. magn. reson. A. 2003. V. 19, N 1. P. 1-19. 122. Чижов О.С., Шашков А.С. Масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия в установлении структуры полисахаридов // Ред. Торгов И.В. Прогресс химии углеводов. Москва: Наука. 1985. С. 30-54. 123. Варбанец Л.Д., Здоровенко Г.М., Книрель Ю.А. Методы структурного анализа липополисахаридов // Ред. В.С. Подгорский. Методы исследования эндотоксинов. Киев: Наукова думка. 2006. С. 105-183. 124. Bock K., Thøgersen H. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in the Study of Mono- and Oligosaccharides // Annu. Rep. NMR Spectrosc. 1983. V. 13, N C. P. 157 125. Angyal, S.J. Hudson’s rules of isorotation as applied to furanosides, and the conformations of methyl aldofuranosides // Carbohydr. Res. 1979. V. 77, N 1. P. 3750. 126. Шашков А.С. Спектры ЯМР 13 С родоначальных гексопираноз // Изв. АН СССР. Сер. Хим. 1983. Т. 6. C. 1328-1336. 127. Шашков А.С., Чижов О.С. Спектроскопия 13 С-ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорган. химия. 1976. Т.2, N 4. C. 437-497. 128. Altona C., Haasnoot C.A.G. Prediction of anti and gauche vicinal proton-proton coupling-constants in carbohydrates – a simple additivity rule for pyranose rings // Org. Magn. Reson. 1980. V. 13, N 6. P. 417-429. 129. Vliegenthart J.F.G., Dorland L., van Halbeek H. High-resolution, 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy as a tool in the structural analysis of carbohydrates related to glycoproteins // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1983. V. 41. P. 209374. 130. Block K., Lundt I., Pederson C. Assignment of anomeric structure to carbohydrates through geminal 13C-H coupling constants // Tetrahedr. Letter. 1973. V. 14, N 13. P. 1037-1040. 131. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N. A 149 computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13CN.M.R. data // Carbohydr. Res. 1988. V. 175, N 1. P. 59-75. 132. Breitmaier E. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemestry // In: Breitmaier E. (Ed.) Wiley, New York. 2002. 133. Duus J.O., Gotfredsen С.H., Bock K. Carbohydrate structural determination by NMR spectroscopy: Modern methods and limitations // Chem. Rev. 2000. V. 100, N 12. P. 4589-4614. 134. Kogan G., Uhrin D. Current NMR methods in the structural elucidation of polysaccharides // in New Advances in Analytical Chemistry (ed Atta-ur-Rahman, Harwood Publishers, Australia). 2000. P. 73-134. 135. Hotchkiss R.S., Karl I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis // N. Engl. J. Med. 2003. V. 148, N 1. P. 138-150. 136. Opal S.M. The host response to endotoxine, anti-lipopolysaccharide stategies, and the management of severe sepsis // Int. J. Med. Microbiol. 2007. V. 297, N 5. P. 365377. 137. Opal S.M., DePalo V.A. Anti-inflamatory cytokines // Chest. 2000. V. 117, N 4. P. 1162-1172. 138. Morrison D.C., Danner R.L., Dinarello C.A., Munfond R.S., Natanson C., Pollack M., Spitzer J.J., Ulevitch R.J., Vogel S.N., McSweegan E. Bacterial endotoxins and pathogenesis of Gram-negative infections: current status and future directions // J. Endotoxin Res. 1994. V. 1, N 1. P. 71-83. 139. Morrison D.C., Bucklin S.E. Evidence for antibiotic-mediated endotoxin release as a contributing factor to lethality in experimental gram-negative sepsis // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 1996. V. 101. P. 3-8. 140. Blease K., Seybold J., Adcock I.M., Hellewell P.G., Burke-Gaffney A. Interleukin4 and lipopolysaccharide synergize to induce vascular cell adhesion molecule-1 expression in human lung microvascular endothelial cells // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1998. V. 18, N 5. P. 620-630. 141. Dinarello C.A., Cytokine as mediators in the pathogenesis of septic shock // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996. V. 216, N 2. P. 133-165. 150 142. Hesse D.G., Tracey K.J., Fong Y., Manogue K.R., Palladino Jr. M.A., Cerami A., Shires G.T., Lowry S.F. Cytokine appearance in human endotoxemia and primate bacteremia // Surg. General Obstet. 1988. V. 166, N 1. P. 147-153. 143. Kirkland T.N., Finley F., Leturq D., Moriarty A., Lee J.D., Ulevitch R.J., Tobias P.S. Analysis of lipopolysaccharide binding by CD14 // J. Biol. Chem. 1993. V. 268, N 33. P. 24818–24823. 144. Ziegler-Heitbrock H.W., Ulevitch R.J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker // Immunol. Today. 1993. V. 14, N 3. P. 121–125. 145. Gegner J.A., Ulevitch R.J., Tobias P.S. Lipopolysaccharide (LPS) signal transduction and clearance. Dual roles for LPS binding protein and membrane CD14 // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N 10. P. 5320-5325. 146. Viriyakosol S., Mathison J.C., Tobias P.S., Kirkland T.N. Structure-function analysis of CD14 as a soluble receptor for lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, N 5. P. 3144-3149. 147. Cantrell D., O'Neill L., Welham M. Signal transduction during innate and adaptive immunity // Biochem. Society Transact. 2001. V. 29. N 5. P. 853-859. 148. Yang H., Young D.W., Gusovsky F., Chow J.C. Cellular events mediated by lipopolysaccharide-stimulated Toll-like receptor 4 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, N 27. P.20861-20866. 149. Faure E.O., Equils P.A., Sieling L., Thomas F.X., Zhang C.J., Kirschning N., Polentarutti M., Muzio M. Bacterial lipopolysaccharide activates NF-kappaB through toll-like receptor 4 (TLR-4) in cultured human dermal endothelial cells. Differential expression of TLR-4 and TLR-2 in endothelial cells // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, N 15. P. 11058-11063. 150. Воробьева E.В., Красикова И.Н., Соловьева T.Ф. Влияние липополисахаридов и липидов А из некоторых морских бактерий на индукцию спонтанного и индуцированного липополисахаридом из Escherichia coli синтеза фактора некроза опухоли альфа клетками периферической крови человека // Биохимия. 2006. Т. 71, N 7. P. 936-944. 151. Romanenko L.A., Tanaka N., Svetashev V.I., Falsen E. Description of Cobetia 151 amphilecti sp. nov., Cobetia litoralis sp. nov. and Cobetia pacifica sp. nov., classification of Halomonas halodurans as a later heterotypic synonym of Cobetia marina and emended descriptions of the genus Cobetia and Cobetia marina // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013. V. 63, N 1 P. 288-297. 152. Romanenko L.A., Uchino M., Falsen E., Zhukova N.V., Mikhailov V.V., Uchimura T. Rheinheimera pacifica sp. nov., a novel halotolerant bacterium isolated from deep sea water of the Pacific // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53, N 6. P. 1973-1977. 153. Ivanova E.P., Romanenko L.A., Chun J., Matte M.H., Matte G.R., Mikhailov V.V., Svetashev V.I., Huq A., Maugel T., Colwell R.R. Idiomarina gen. nov., comprising novel indigenous deep-sea bacteria from the Pacific Ocean, including descriptions of two species, Idiomarina abyssalis sp. nov. and Idiomarina zobellii sp. nov // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50, N 2. P. 901-907. 154. Jung J.Y., Kim J.M., Jin H.M., Kim S.Y., Park W., Jeon C.O. Litorimonas taeanensis gen. nov., sp. nov., isolated from a sandy beach // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. Vol. 61, N 7. P. 1534-1538. 155. Nedashkovskaya O.I., Kim S.B., Hoste B., Shin D.S., Beleneva I.A., Vancanneyt M., Mikhailov V.V. Echinicola vietnamensis sp. nov., a member of the phylum Bacteroidetes isolated from seawater // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57, N 4. P. 761-763. 156. Youschimizu M., Kimura T. Study of intenstial microflora of salmonids // Fish Pathol. 1976. V. 10, N 2. P. 243-259. 157. Honda S., Yuki H., Takiura K. Fourier-transform 13C nuclear magnetic resonance spectra of D-glucose 3- and 6-sulfates // Carbohydr. Res. 1973. V. 28, N 1. P. 150153. 158. Rashid A., Mackie W., Colquhoun I.J., Lamba D. Novel Synthesis of monosulphated methyl α-D-galactopyranosides // Can. J. Chem. 1990. V. 68, N 7. P. 1122-1127. 159. Jansson P.-E., Kenne L. Schweda E. Nuclear magnetic resonance and conformational studies on monoacetylated methyl D-gluco- and D-galacto- 152 pyranosides // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1987. V. 1. P. 377-383. 160. Sato H., Kajihaza Y. 2D Selective-TOCSY-DQFCOSY Experiment for Idenification of Individual Sugar Components in Oligosaccharides // J. Carb. Chem. 2003. V. 22, N 5. P. 339-345. 161. Matsuda M., Hasui M., Okutani K. Structural Analysis of a Sulfated Polysaccharide from a Marine Pseudomonas // Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. V. 59, N 3. P. 535–538. 162. Worawattanamateekul W., Matsuda M., Okutani K. Structural Analysis of a Rhamnose-Containing Sulfated Polysaccharide from a Marine Pseudomonas // Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. V. 59, N 5. P. 875-878. 163. Rougeaux H., Guezennec J., Carlson R. W., Kervarec N., Pichon R., Talaga P. Structural determination of the exopolysaccharide of Pseudoalteromonas strain HYD 721 isolated from a deep-sea hydrothermal vent // Carbohydr. Res. 1999. V. 28, N 3-4. P. 273-285. 164. Rogera O., Kervarecb N., Ratiskola J., Colliec-Jouaulta S., Chevolot L. Structural studies of the main exopolysaccharide produced by the deep- sea bacterium Alteromonas infernus // Carbohydr. Res. 2004. V. 339, N 14. P. 2371-2380. 165. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Vinogradov E.V., Zatonsky G.V., Knirel Y.A., Literacka E., Kaca W. Full structure of the O-specific polysaccharide of Proteus mirabilis O24 containing 3,4-O-[(S)-1-carboxyethylidene]-D-galactose // Carbohydr. Res. 2000. V. 329, N 2. P. 453-457. 166. Garegg P.J., Jansson P.-E., Lindberg B., Lindh F., Lonngren J., Kvarnstrom I., Nimmich W. Configuration of the acetal carbon atom of pyruvic acid acetals in some bacterial polysaccharides galactose // Carbohydr. Res. 1980. V. 78, N 1. P. 127-132. 167. Niemann H., Frank N., Stirm S. Klebsiella serotype-13 capsular polysaccharide primary structure and depolymerization by a bacteriophage-borne glycanase // Carbohydr. Res. 1977. V. 59, N 1. P. 165-177. 168. Lindberg B., Lindh F., Lonngren J., Sutherland I.W. Structural studies of the capsular polysaccharide of Klebsiella type 30 // Carbohydr. Res. 1979. V. 76, N 1. P. 281-284. 153 169. Lindberg B., Lindh F., Lonngren J., Nimmich W. Structural studies of the capsular polysaccharide of Klebsiella type 33 // Carbohydr. Res. 1979. V. 70, N 1. P. 135144. 170. Jansson P.E., Kenne L., Widmalm G. Computer-assisted structural analysis of polysaccharides with an extended version of casper using 1H- and 13C-n.m.r. data // Carbohydr. Res. 1989. V. 188, N 1. P. 169-191. 171. Kocharova N.A., Torzewska A., Zatonsky G.V., Blaszczyk A., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide of Providencia stuartii O4 containing 4-(N-acetyl-l-aspart-4-yl)amino-4,6-dideoxy-dglucose // Carbohydr. Res. 2004. V. 339, N 2. P. 195-200. 172. MacLean L.L., Vinogradov E.V., Crump E.M., Perry M.B., Kay W.W. The structure of the lipopolysaccharide O-antigen produced by Flavobacterium psychrophilum (259-93) // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 2710-2716. 173. Zubkov V.V., Nazarenko E.L., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Paramonov N.A., Ovodov Y.S. Structure of the capsular polysaccharide from Alteromonas sp. CMM 155 // Carbohydr. Res. 1995. V. 275, N 1. P. 147-154. 174. Itakura Y., Komori T. Biologically Active Glycosides from Asteroidea, IX. Steroid Oligoglycosides from the Starfish Asterias amurensis [cf.] versicolor Sladen, 2. Structure Elucidation of Two New Oligoglycoside Sulfates, Versicoside B and Versicoside C // Liebigs. Ann. Chem. 1986. V. 1986, N 2. P.359–373. 175. Dale J.A. Mosher H.S. Nuclear magnetic resonance enantiomer reagents. Configurational correlations via nuclear magnetic resonance chemical shifts of diastereomeric mandelate, O-methylmandelate, and α-methoxy-α- trifluoromethylphenylacetate (MTPA) esters // J. Am. Chem. Soc. 1973. V. 95, N 2. P. 512-519. 176. Freire F., Seco J.M., Quinoa E., Riguera R. Determining the absolute stereochemistry of secondary/secondary diols by 1H NMR: Basis and applications // J. Org. Chem. 2005. V. 70, N 10. P. 3778-3790. 177. MacLean L.L., Perry M.B., Crump E.M., Kay W.W. Structural characterization of the lipopolysaccharide O-polysaccharide antigen produced by Flavobacterium 154 columnare ATCC 43622 // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270, N 16. P. 3440-3446. 178. Jansson P.-E., Lindberg B., Lindquist U. Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 5 // Carbohydr. Res. 1985. V. 140, N 1. P. 101-110. 179. Park S., Kelley K.A., Vinogradov E.V., Solinga R., Weidenmaier C., Misawa Y., Lee J.C. Characterization of the structure and biological functions of a capsular polysaccharide produced by Staphylococcus saprophyticus // J. Bacteriol. 2010. V. 192, N 18. P. 4618-4626. 180. Westphal O. Jann K. Bacterial lipopolysacharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. V. 5. P. 83-91. 181. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. V. 154, N 1. P. 269-277. 182. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. V. 119, N 1. P. 115-119. 183. Aldrich. 1992-1993. P. 1192. 184. Perry M.B. Daoust V. A synthesis of 2-amino-2,6-dideoxy-L-mannose (Lrhamnosamine) and 2-amino-2,6-dideoxy-L-glucose (L-quinovosamine) // Carbohydr. Res. 1973. V. 27, N 2. P. 460-463. 185. Bienvenu J., Doche C., Gutowski M., Lenoble M., Pedrix J. Production of proinflammatory cytokines and cytokines involved in the TH1/TH2 balance is modulated by pentoxifylline // J. Cardiovascul. Pharmacol. 1995. V. 25. P. 80-84.
