ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

56
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
И ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
РОЛЬ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА В ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
МОДИФИКАТОРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ
Н.В. Чердынцева, Н.В. Литвяков, О.В. Кокорев, А.А. Кузнецова, Е.А. Малиновская,
Е.С. Смольянинов, В.А. Евтушенко
Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных
новообразований является использование биотерапевтических воздействий в сочетании с классическими методами (химио-, лучевая терапия, операционное вмешательство). Преимущество такого
комплексного подхода заключается в одновременном повреждающем воздействии на опухолевые клетки и активизации защитных механизмов
организма, оказывающих, в свою очередь, противоопухолевый эффект [2, 8]. В качестве наиболее
перспективных биотерапевтических воздействий
рассматриваются модификаторы биологических
реакций (МБР) – агенты различной природы, проявляющие свой противоопухолевый эффект путем модуляции ответа организма на опухоль. В
число МБР входят природные и синтетические
иммуномодуляторы и адаптогены, цитокины и их
индукторы, цитостатические препараты, а также
физические факторы. Современные представления о механизмах канцерогенеза, взаимоотношениях опухоли и организма, о роли системы иммунитета в противоопухолевой защите, которая
осуществляется в тесном взаимодействии с факторами неиммунной природы, а также данные
последних лет о механизмах действия МБР различной природы позволяют утверждать, что иммунологические факторы принимают активное
участие в реализации их модулирующего действия. В этой связи одним из основных направлений биотерапии является применение агентов,
модулирующих активность противоопухолевого
иммунитета. Целью настоящей работы было изучение противоопухолевого действия модифика-
торов биологических реакций различной природы
и его механизмов.
Материалы и методы
Экспериментальные модели. В работе использованы половозрелые мыши массой 18–20 г, разводки питомника Сибирского отделения Научноисследовательской лаборатории экспериментально-биологических моделей Томского научного
центра РАМН (Томск) следующих линий:
C57Bl/6 (H–2b), F1 (CBA/C57Bl/6) (H–2b/k),
DBA/2j (H–2d). Карцинома легких Льюис (LLC),
полученная в лаборатории опухолевых штаммов
Онкологического научного центра РАМН (Москва), пассировалась методом подкожных трансплантаций на мышах C57Bl/6, опытным мышам
перевивалась в область бедра п/к в концентрации
1×106 кл/мышь.
Терапевтические агенты. Циклофосфан
(ЦФ) вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг на
3-и и 7-е сут после трансплантации опухоли. 5фторурацил (5-ФУ) вводили внутримышечно в
дозе 25 мг/ кг через день 3 раза, начиная с 7-х сут
после перевивки опухоли.
Субалин – препарат на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих человеческий альфа-интерферон (любезно предоставлен
его авторами из НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор»,
г. Бердск) – вводили перорально по 5х108 микробных клеток (2 дозы) в 0,5 мл воды ежедневно
в течение 10–14 сут.
Препарат саназол (АК-2123)-N-(2-метоксиэтил)-2-(3нитро-1триазолил) ацетоамид – гипоксический радиосенсибилизатор из класса нитро-
57
триазолов, синтезированный в Киотском университете (Япония), обладающий низкой токсичностью. В экспериментальных исследованиях на
мышах саназол использовали в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно в течение 7–12 дней.
Низкоэнергетическое лазерное излучение генерировалось лазерной установкой на парах меди
"Малахит" с частотой импульсов 15–22 кГц. В
составе лазерного луча присутствуют две спектральные линии – зеленая (510,6 нм) и желтая
(578,2 нм). Лазерное облучение в дозе 30 Дж/см2
на область опухоли (длительность экспозиции 1
мин) проводили ежедневно в течение 5 дней.
Методы оценки терапевтической эффективности. Оценку противоопухолевой и антиметастатической активности исследуемых агентов
проводили в соответствии с принятыми в экспериментальной онкологии методами [6]. Определяли торможение роста опухоли (%), индекс ингибиции метастазирования (ИИМ,%) и процент
торможения роста метастазов (ТРМ), характеризующий уменьшение суммарной площади метастатических колоний в легких.
Методы оценки функциональной активности
клеток иммунной системы. Активность макрофагов оценивали по их антипролиферативному действию на клетки-мишени мастоцитомы Р-815
(пассировалась в асцитной форме на мышах
DBA) и LLC (пассировалась в асцитной форме на
мышах C57Bl/6) в цитостатическом тесте, а также
по цитолитическому действию на клетки-мишени
LLC. Подсчитывали цитостатический индекс
(ИЦС, %) и цитотоксический индекс (ИЦТ, %)
[1]. Естественную киллерную активность лимфоцитов крови оценивали в мембранотоксическом
тесте по отношению к клеткам-мишеням человеческого эритромиелолейкоза К-562 [7]. Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали в
реакции бласттрансформации по включению 3Нтимидина в ДНК клеток при добавлении в культуральную среду Т-клеточного митогена ФГА в
оптимальной концентрации 10 мкг/мл (“Serva”,
Германия) и без него (спонтанная пролиферация).
Результаты обработаны статистически, достоверность различий между выборками определяли
с помощью непараметрического критерия Вилкоксона–Манна–Уитни.
Результаты и обсуждение
Мы показали, что интраперитонеальное введение ультранизких доз саназола сочетанно с цитостатической терапией циклофосфаном в дозе 60
мг/кг привело к двукратному усилению ингибиции роста первичной опухоли и практически полной отмене метастазирования у мышей с LLC
(табл. 1). Существенное увеличение торможения
роста опухоли и ингибиции метастазирования при
сочетанной терапии циклофосфаном и субалином
свидетельствует о потенцирующем действии пробиотика на антибластомную активность циклофосфана. Как и в случае применения саназола,
более выраженный ингибирующий эффект субалина и его сочетания с цитостатиком отмечен в
отношении метастазов, но не первичного опухолевого узла. Умеренная противоопухолевая и
антиметастатическая активность саназола и субалина выявлена также на модели меланомы В-16
у мышей C57Bl/6 (данные не представлены). Несмотря на низкий индекс ингибиции метастазирования при использовании субалина в моноварианте, обращает на себя внимание значительное торможение роста метастатических колоний (уменьшение их суммарной площади) в легких при применении субалина не только в сочетании с цитостатической терапией, но и в самостоятельном
варианте (табл.1).
Терапия карциномы легких Льюис 5-ФУ в
комбинации с излучением лазера на парах меди
привела к достоверному усилению противоопухолевого и антиметастатического эффекта. Лазерное излучение также ингибировало рост и метастазирование опухоли, при этом антиметастатическое действие было более выражено, чем
влияние на первичный опухолевый узел (табл.1).
Т а б л и ц а 1
Влияние цитостатиков в комбинации с модификаторами
биологических реакций на рост и метастазирование
карциномы легких Льюис у мышей C57Bl/6
Группа
Контроль
ЦФ
ЦФ+саназол
ЦФ+субалин
5-ФУ
5-ФУ+НЛИ
Саназол
Субалин
НЛИ
Доза
–
60 мг/кг
60+1,0 мг/кг
60+2,0 дозы
25 мг/кг
25мг/кг+30Дж/см2
1,0 мг/кг
2 дозы
30Дж/см2
ТРО, ИИМ, ТРМ,
%
%
%
–
–
–`
40
70
80,5
66 * 100 * н/о
79* 98,8* 98,5*
63
40
н/о
80*
77*
н/о
0
72
н/о
37** 5
41**
37** 51** н/о
П р и м е ч а н и е. ЦФ – циклофосфан; 5-ФУ – 5фторурацил; ТРО – торможение роста опухоли; ИИМ – индекс ингибиции метастазирования; ТРМ – торможение роста
метастазов; в каждой группе от 8 до 10 животных; н/о – не
определяли; * – различия достоверны по сравнению с группой ЦФ или 5-ФУ; ** – различия достоверны по сравнению с
контрольной группой.
58
В связи с отмеченным существенным антиметастатическим эффектом саназола, субалина и излучения лазера на парах меди представляется очевидным предположение о важной роли в его реализации эффекторных клеток иммунной системы –
прежде всего ЕКК, макрофагов, цитотоксических
Т-лимфоцитов, поскольку известно, что эти клетки
наиболее эффективно реализуют свое противоопухолевое действие в отношении небольшого числа
опухолевых клеток, что имеет место при формировании метастатических колоний [12].
При оценке естественной киллерной активности спленоцитов выявлено достоверное ее усиление у мышей, получавших циклофосфан в сочетании с саназолом, общая литическая активность
селезенки также возрастала, наряду со способностью спленоцитов оказывать цитостатическое
действие на опухолевые клетки-мишени (табл.2).
Т а б л и ц а 2
Естественная киллерная активность и цитостатическая
активность спленоцитов у мышей линии С57Вl/6
с карциномой легких Льюис, леченных
циклофосфаном и саназолом (X ± m)
Группа животных
Количество
спленоцитов, млн
ИМТ,%
ЕКА спленоцитов в
пересчете
на селезенку, ЛЕ
Индекс
цитостазиса спленоцитов, %
LLC
(1)
LLC+ЦФ
(2)
LLC+ЦФ+
саназол (3)
147,0±21,0
121,0±14,0*
141,0±11,0
62
1500±83
60*
1215±146*
70
1786±194
62,8±6,4*
81,4±2,1 *
91,2±1,9
П р и м е ч а н и е. ЕКА – естественная киллерная
активность; ИМТ – индекс мембранотоксичности; ЛЕ – литические единицы; * – различия достоверны по сравнению с
группой 3 (в каждой группе по 6–8 животных).
Эти результаты согласуются с опубликованными
нами ранее данными о способности саназола модулировать противоопухолевую активность макрофагов и лимфоцитов у мышей C57Bl/6 с меланомой В-16, причем отмечалась положительная
корреляция между активностью эффекторных
клеток и ингибирующим действием препарата на
рост и метастазирование опухоли при разных
схемах его введения [15]. Саназол проявляет иммуномодулирующее действие и при введении
безопухолевым мышам [14].
При сочетанной терапии мышей с LLC циклофосфаном и субалином мы отметили существенное уменьшение ростстимулирующей активности макрофагов по отношению к опухолевым
клеткам по сравнению с их высокой фидерной
активностью у мышей, леченных циклофосфаном.
Введение субалина мышам с карциномой легких
Льюис, не подвергавшимся дополнительным терапевтическим воздействиям, приводило к значительному увеличению мембранотоксической активности ЕКК и тотальной литической активности селезенки, а также существенно усиливало
цитотоксическое и антипролиферативное действие макрофагов на клетки LLC (рис. 1). Обратимый ингибитор функциональной активности макрофагов каррагенан при введении in vivo уменьшал или отменял их активацию под влиянием
субалина. Введение каррагенана мышам с LLC,
леченным субалином, существенно снижало антиметастатическую активность последнего: отмечено повышение интенсивности метастазирования и более чем двукратное увеличение суммарной площади легочных метастазов по сравнению
с мышами, получавшими только субалин [5]. Эти
данные свидетельствуют о том, что макрофаги
являются одной из первоочередных мишеней
действия субалина. При использовании "бестимусных" мышей nude также показана необходимость полноценного Т-клеточного звена для реализации его антибластомного эффекта [11].
Возрастание литического потенциала селезенки под влиянием субалина и саназола связано
с повышением функциональной активности ЕК
клеток, увеличением скорости созревания предшественников и ускорением рециклинга (скорости их восстановления). Основным фактором,
регулирующим эти процессы, является интерферон, стимулирующее влияние на продукцию которого в организме оказывают оба препарата [12].
Определенное значение в повышении литического потенциала селезенки имеют миграционнопролиферативные процессы, так как отмечено
увеличение ее клеточности субалином и саназолом. Согласно представленным выше данным и
результатам исследований, проведенных ранее,
триггерным фактором иммуномодулирующей
активности субалина является продуцируемый им
в кишечнике альфа-интерферон, ключевая роль
которого в активации неспецифических факторов
иммунитета и специфической реакции на антиген
на местном уровне (в слизистой кишечника, в
частности) и системно (кровь, селезенка) экспериментально доказана [17].
59
450
450
400
400
350
% от контроля
300
250
203
202
200
165
150
124
100
50
0
ИМТ
ЛЕ
Кл е тки
ИЦ С
LLC
ИЦ Т
LLC
ИЦ С Р 815
Рис. 1. Влияние субалина на активность ЕК клеток селезенки и перитонеальных макрофагов у мышей
F1(CBAxC57Bl/6) с карциномой легких Льюис:
ИМТ – индекс мембранотоксичности спленоцитов по отношению к клеткам К-562; ЛЕ – литическая активность селезенки, литические единицы; ИЦТ LLC – индекс цитотоксичности перитонеальных макрофагов по отношению к
клеткам карциномы легких Льюис; ИЦС LLC – индекс цитостазиса перитонеальных макрофагов по отношению к
клеткам карциномы легких Льюис; ИЦС Р-815 – индекс цитостазиса перитонеальных макрофагов по отношению
к клеткам мастоцитомы Р-815; клетки – количество спленоцитов. По оси ординат – прирост (%) по сравнению с
контролем (мыши – опухоленосители, не получавшие субалин)
Повышение противоопухолевого эффекта цитостатика при включении в схему лечения излучения лазера на парах меди сочетается с восстановлением либо усилением функциональной активности эффекторных клеток иммунной системы, это
справедливо в отношении как неспецифических
эффекторных механизмов (ЕКК, цитостатические
лимфоциты), так и процессов, лежащих в основе
формирования специфического иммунного ответа (активация пролиферативного ответа лимфоцитов на Т- и В-клеточные митогены) (рис. 2).
При исследовании противоопухолевой активности НЛИ было выявлено, что излучение лазера
на парах меди при достаточно высокой мощности дозы (30 Дж/см2) индуцирует некробиотические и дистрофические процессы в ткани опухоли
на фоне своеобразной воспалительной реакции,
по-видимому опосредующей его противоопухолевое действие. Кроме этого, модулирующее действие НЛИ на иммунологические факторы может
быть реализовано путем регуляции активности
компонентов антиоксидантной системы. В частности, отмеченное нами повышение активности су-
пероксиддисмутазы в крови, с одной стороны, способствует восстановлению иммунокомпетентности; ее снижение в опухоли, с другой стороны,
приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к эндогенным и экзогенным свободнорадикальным повреждающим воздействиям
[10]. В реализацию противоопухолевого действия
НЛИ могут вносить вклад различные механизмы,
связанные как с прямым повреждением опухолевых клеток (термический, фотодинамический эффекты), так и с активацией эндогенных факторов,
приводящих к стимуляции важнейших гомеостатических систем организма, обеспечивающих интегральный терапевтический эффект [4].
Общепринятая в настоящее время точка зрения о триггерном механизме действия НЛИ, независимо от длины волны и, соответственно, первичной точки приложения (первичного фотоакцептора), вызывающем системный ответ на уровне целостного организма, дает основания считать
очевидным вовлечение иммунологических механизмов в реализацию его противоопухолевой активности. Известно, что клетки иммунной систе-
60
*
о
ФГА
6
Индекс стимуляции
ЛПС
5
4
3
2
1
0
Контроль
НЛИ
5-ФУ
5ФУ+НЛИ
Рис. 2. Изменение пролиферативного ответа спленоцитов на ФГА и ЛПС у мышей с карциномой легких Льюис,
леченных 5-фторурацилом и излучением лазера на парах меди:
•
– различия достоверны по сравнению с группой 5-ФУ; о – различия достоверны по сравнению с контрольной группой
мы являются одной из непосредственных точек
приложения действия НЛИ, которое способно
изменять экспрессию их мембранных рецепторов,
функциональную активность, пролиферативный
потенциал, стимулировать продукцию цитокинов,
а также действовать через модуляцию компонентов антиоксидантной системы организма [3].
Установлено, что модификация активности
естественных киллеров различными агентами
может быть одним из механизмов их антиметастатического действия [14]. Цитостатическая активность иммунокомпетентных клеток также может выступать важным фактором, воздействующим на процесс метастазирования, что подтверждается экспериментальными результатами ряда
авторов как в отношении макрофагов, так и спленоцитов [18]. Полученные нами данные указывают на то, что модуляция активности спленоцитов
и макрофагов под действием использованных
МБР может играть важную роль в усилении терапевтической эффективности цитостатиков.
Важное значение в реализации модулирующего действия МБР имеет многокомпонентность
ответной реакции и тесное взаимодействие иммунной системы с факторами неиммунной природы. В совокупности это обеспечивает, с одной
стороны, изменения опухолевых клеток, приводящие к реверсии трансформированного фенотипа, индукции их дифференцировки и созрева-
ния, снижению метастатического потенциала,
устранению резистентности к цитостатическим
воздействиям; с другой – усиление или восстановление эффекторных противоопухолевых реакций хозяина и селективную супрессию или
устранение компонентов, способствующих опухолевому росту.
ЛИТЕРАТУРА
1. Богдашин И.В. Цитостатическое действие клеток иммунной системы на опухолевые клетки // БЭБиМ. 1986. №6.
С. 744–746.
2. Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Гольдберг Е.О. и др. Препараты из растений Сибири и Дальнего Востока, повышающие
эффективность существующих методов лечения опухоли //
Материалы 6-го Национального конгресса "Человек и лекарство". М., 1998. С. 359.
3. Головизнин М.В. Лазерная иммунокоррекция. Подходы, проблемы, перспективы // Лазеры в медицине и биологии.
1995. № 2–3. С. 22–27.
4. Каплан М.А. Лазерная терапия – механизмы действия
и возможности // Laser and health: Abstracts of the International
Congress. Cyprus, 1997. L06.
5. Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Малиновская Е.А., Ильиных И.С., Смольянинов Е.С. Роль макрофагов в реализации антибластомного действия рекомбинантного пробиотика субалина // Вопросы онкологии. (В печати).
6. Методические рекомендации по доклиническому
изучению средств, обладающих способностью ингибировать
процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей / Под ред.
Е.Д.Гольдберга, А.Б.Сыркина. М., 1992.
7. Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. Новая
чувствительная техника тестирования активности нормальных киллеров // Иммунология. 1981. № 3. С. 88–90.
61
8. Хансон К.П., Афанасьев Б.В., Берштейн Л.М. и др.
Современные тенденции в развитии биологической терапии
злокачественных опухолей // Вопросы онкологии. 1996. Т.42,
№5. С. 7–13.
9. Чекнев С.Б. Дифференцировка естественных киллеров с позиции органоспецифической регуляции // Иммунология. 1998. №5. С. 22–31.
10. Чердынцева Н.В., Кузнецова А.А., Кондакова И.В.,
Евтушенко В.А. Модуляция цитостатического действия 5фторурацила и активности антиоксидантных ферментов излучением лазера на парах меди со злокачественными опухолями. // Оптика атмосферы и океана. 1998. Т.11, № 2–3.
С. 246–250.
11. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Смольянинов Е.С.,
Белявская В.А. Влияние рекомбинантного пробиотика субалина на функциональную активность иммунокомпетентных
клеток // БЭБиМ. 1999. Т. 127. Прил. 1. С. 67–70.
12. Чердынцева Н.В. Иммунологические механизмы противоопухолевого действия модификаторов биологических
реакций различной природы: Автореф. ... докт. биол. наук.
Иркутск, 1999. 45 с.
13. Fogler M.E., Volker K., McCormic K.L. NK-cell infiltration into lung and subcutaneous B-16 melanoma is mediated dy
VCAM-1/VLA-4 interaction // J.Immunol. 1996. Vol.156, №12.
P. 4707–4014.
14. Marcovic S.N., Murashko D.M. Role of natural killer and
T-cells in interferon induced inhibition of spontaneous metastases
of the B16F10l murine melanoma // Cancer Res. 1991. Vol. 51,
№4. P. 1124–1128.
15. Tcherdyntseva N., Kokorev O., Kagiya T.Activation of
immunocompetent cells by ultra low dose administration of radiosensitiser AK-2123 in healhty mice // Sensitization Newsletter.
1997. Vol. 4, № 2, С. 6–9.
16. Tcherdyntseva N., Kokorev O., Konovalova N., Kagiya T.
Effect of radiosensitizer AK-2123 on the activity of natural killer
cells and macrophages in B-16 melanoma bearing mice // Sensitization Newsletter. 1998. Vol. 5, № 1. P. 2–6.
17. Tompkins W. A. Immunomodulation and therapeutic effects of the oral use of interferon-alpha: mechanism of action //
J.Interfer.Cytokin Research. 1999. Vol.19. P. 817–828.
18. Wallace P.K., Morahan P.S. Role of macrophages in the
immunotherapy of Lewis lung peritoneal carcinomatosis // J.
Leukoc. Biol. 1994. Vol. 56, №1. P. 41–51.