Г.Г. Юхневич, И.М.Колесник МИКРООРГАНИЗМЫ В

Министерство образования Республики Беларусь
УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
«ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ»
Г.Г. Юхневич, И.М.Колесник
МИКРООРГАНИЗМЫ
В БИОИНДИКАЦИИ
И БИОТЕСТИРОВАНИИ
Лабораторный практикум по одноименной дисциплине
для студентов специальности
1–33 01 01 Биоэкология
специализации 1–33 01 01–04
Токсикология, биоиндикация и нормирование
Гродно 2012
УДК 502.175
ББК 28.4
Ю94
Рекомендовано Советом факультета биологии
и экологии ГрГУ им. Я. Купалы.
Таранда Н.И., кандидат биологических наук, доцент,
(Учреждение образования «Гродненский государственный
аграрный университет»);
Башун Н.З., кандидат биологических наук, доцент.
Юхневич, Г.Г.
Микроорганизмы в биоиндикации и биотестировании: лаб. практикум /
Ю94
Г.Г. Юхневич, И.М. Колесник. – Гродно : ГрГУ, 2012. – 51 с.
ISBN 978-985-515-552-3
Изложены рекомендации по выполнению лабораторных заданий по основным разделам
дисциплины «Микроорганизмы в биоиндикации и биотестировании». Содержит теоретический материал и практические задания, позволяющие сформировать у специалистов-экологов
практические навыки и умения по оценке состояния окружающей среды с использованием
микроорганизмов. Предназначен для студентов, обучающихся по специальностям «Биология»,
«Биоэкология».
УДК 502.175
ББК 28.4
ISBN 978-985-515-552-3
© Юхневич Г.Г., Колесник И.М., 2012
© Учреждение образования
«Гродненский государственный университет
имени Янки Купалы», 2012
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время одним из наиболее востребованных направлений природоохранных исследований является разработка информативных показателей экологического состояния экосистем и надежных, доступных методов их определения. Эти
показатели и методы необходимы для адекватного определения качества объектов
окружающей среды, регламентации их использования.
Наиболее надежные и доступные методы диагностики антропогенных нарушений основаны на ряде микробиологических показателей. Общепризнано, что из всех
представителей биоты микроорганизмы наиболее чутко реагируют на изменение
условий обитания. Немаловажно и то, что микроорганизмы чувствительны именно
к первым, часто малозаметным этапам нарушения, к низким концентрациям поллютантов. Использование в качестве аналитических индикаторов микроорганизмов
нередко является единственно надежным методом определения малых количеств веществ, так как основано на прямом воздействии химического вещества на живую клетку. Ответная реакция микробной культуры на изменение состава среды представляет
собой среднее из показателей миллионов отдельных организмов, что обеспечивает
наиболее объективные и достоверные результаты. Эта особенность делает микроорганизмы крайне привлекательными как для целей мониторинга, так и для теоретического обоснования устойчивости различных объектов к антропогенным воздействиям.
Цель данного практикума – способствовать развитию практических навыков у
студентов при микробиологической оценке состояния объектов (воздух, вода, почва,
пищевые продукты). При этом предполагается, что практикум будет служить дополнительным материалом при рассмотрении теоретических вопросов по одноименной
дисциплине.
Практикум состоит из основной части и приложения. В основной части рассматриваются общепринятые методы выделения микроорганизмов из объектов окружающей среды и их учета; микробиологической оценки воздуха, воды, почвы, пищевых
продуктов, дающие полное представление о возможностях контроля данных объектов с точки зрения их безопасности для здоровья населения. Предлагаются задания
для выполнения лабораторных работ, закрепляющие методический материал. Для
контроля усвоения каждой темы предлагаются вопросы для самопроверки. В приложении представлен состав питательных сред для выделения и обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов.
Исходный уровень знаний:
– экология микроорганизмов, их систематика;
– методы изучения морфологических и культуральных свойств микроорганизмов;
– физиологические свойства микроорганизмов (влияние внешних факторов, питательные среды);
– патогенные микроорганизмы, факторы патогенности.
Ключевые слова: микроорганизмы, кишечная палочка, методы выделения, анализ
воды и почвы.
ТЕМА 1
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКое
исследование вОЗДУХА
Воздух не является благоприятной средой для жизнедеятельности микроорганизмов вследствие отсутствия питательных веществ и влаги, суточных и сезонных температурных перепадов, микробоцидного действия солнечных лучей. Однако, попадая в
воздух, многие микроорганизмы способны какое-то время находиться в жизнеспособном состоянии.
Микробное загрязнение атмосферного воздуха зависит от региона, места, сезона
года. Численность их колеблется от нескольких клеток в 1 м3 над поверхностью гор, морей и океанов до многих тысяч особей над крупными промышленными городами, где
они, адсорбируясь на частицах пыли, дыма и копоти, становятся хорошо защищенными от высыхания, солнечных и ультрафиолетовых лучей. В хвойных лесах микробов
в воздухе не больше, чем в Арктике (2–3 особи на 20 м3). В летнее время микробная
обсемененность атмосферного воздуха в несколько раз выше, чем в зимнее. Дождь и
снег способствуют очищению воздуха от микробов.
В атмосферном воздухе обнаруживаются микрококки (������������
Micrococcus� ��������
roseus��, ���
M��. ����
fla�
vus���
), сарцины (��������
Sarcina� �������
flava��, ���
S��. ������
alba��, ���
S��. �������
rosea��) и другие пигментные бактерии, спороносные бациллы (���������
Bacillus�����������
����������
subtilis��, ���
В. ����������
mycoides��, ���
В. ���������������
mesentericus���
), актиномицеты, грибы родов
Penicillium��, �������������
Aspergillus��, �����
Мисо�r, дрожжи и другие микроорганизмы, устойчивые к свету
и высыханию.
Микрофлора воздуха рабочих и жилых помещений более многочисленна и разнообразна, чем в открытых воздушных бассейнах. Ее количество и видовой состав напрямую зависят от их площади и санитарно-гигиенического режима. При переуплотнении жилищ, на малых производственных площадях, в условиях плохой вентиляции и
сухой уборки в воздухе рабочих и жилых помещений может накапливаться несравнимо большее количество микроорганизмов, чем в атмосферном воздухе.
Помимо микрофлоры, свойственной атмосферному воздуху, в воздухе закрытых
помещений всегда находятся сапрофиты и условно-патогенные микроорганизмы,
обитающие в верхних дыхательных путях здорового человека и окружающих его животных. Особенно много микроорганизмов попадает в воздух при кашле, чихании,
разговоре; даже здоровый человек при каждом акте чихания выделяет в окружающую
среду около 10–20 тыс. микроорганизмов. Более того, при наличии микробоносителей и больных в воздух могут попадать патогенные микроорганизмы: стафилококки,
стрептококки, пневмококки, дифтерийные и туберкулезные палочки, вирусы гриппа,
ветряной оспы, кори и другие возбудители инфекционных заболеваний.
В последнее время внимание санитарных микробиологов привлекают крупные
животноводческие комплексы и птицефабрики. В воздухе птицефабрик может содержаться до 8×106 КОЕ/1м3 микроорганизмов, которые, попадая в атмосферный воздух,
переносятся его потоками на большие расстояния; среди них микроорганизмы
р.р. Staphylococcus��
����������������, Streptococcus��
���������������, �������������
Clostridium��, ����������
Bacillus��, грибы рода Aspergillus� и др.
Микроорганизмы содержатся в воздухе в трех фазах аэрозоля:
1) капельной, или крупноядерной, окруженной водносолевой оболочкой, выделяющейся при кашле и чихании из носоглотки человека, частицы которой сравнительно
быстро оседают (в течение нескольких секунд);
2) мелкоядерной, мелкие капельки которой благодаря большой удельной поверхности и малому весу длительно удерживаются в воздухе;
3) бактериальной пыли, образующейся при подсыхании из крупноядерной и мелкоядерной фаз аэрозоля, легко диспергируемой под воздействием самых малых токов
воздуха и способной длительно находиться во взвешенном состоянии.
Диаметр частиц крупноядерной фазы составляет более 0,1 мм, мелкоядерной – от 0,1
до 0,01 мм, а бактериально-пылевой – от 0,01 до 0,001 мм. При вдохе с потоком воздуха
в верхние дыхательные пути человека легче всего проникают лишь микроорганизмы,
находящиеся в бактериально-пылевой фазе аэрозоля.
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
Задачами санитарно-микробиологического исследования воздуха являются гигиеническая и эпидемиологическая оценка воздушной среды, и, как следствие, разработка комплекса мероприятий, направленных на профилактику аэрогенной передачи
возбудителей инфекционных болезней.
Объектом санитарно-микробиологического исследования воздуха закрытых помещений является воздух больниц (операционных, отделений реанимации, родильных залов роддомов и т.п.), детских садов, школ, поликлиник, аптек, производственных цехов и вспомогательных помещений на предприятиях различного профиля
(пищевых, микробного синтеза и т.д.), а также мест массового скопления людей (кинотеатров, спортивных залов и т.п.).
Санитарно-микробиологическое исследование атмосферного воздуха в крупных
городах проводится в плановом порядке, а также в некоторых случаях по эпидемическим показаниям.
При оценке санитарного состояния закрытых помещений в зависимости от задач
исследования определяются:
– общая бактериальная обсемененность (общее микробное число) – общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м3 воздуха;
– качественный состав микрофлоры воздуха, определяемый по присутствию са�
нитарно-показательных микроорганизмов (стафилококков, α- и β-гемолитических
стрептококков), спорообразующих бактерий, а также непосредственно патогенных микроорганизмов (в зависимости от характера помещений – микобактерий туберкулеза,
коринебактерий дифтерии, дрожжевых и мицелиальных грибов и пр.). Обнаружение
санитарно-показательных бактерий в воздухе свидетельствует о санитарно-эпизоотологическом и эпидемиологическом неблагополучии, так как они выделяются от больных
или бактерионосителей. Появление спорообразующих — показатель загрязненности
воздуха микроорганизмами почвы. При исследовании воздуха медицинских учреждений определяется присутствие микроорганизмов, относящихся к условно-патогенной
флоре (синегнойная палочка, бактерии рода Proteus� и ряд других грамотрицательных
палочек) и вызывающих внутрибольничные инфекции.
При исследовании воздуха на предприятиях пищевого профиля, общественного
питания помимо показателя общей обсемененности определяют те группы микроорганизмов, которые являются характерными возбудителями порчи данных видов
продукции или могут встречаться в данном производственном помещении (дрожжи
и грибы – в холодильниках, стафилококки – в цехе производства мороженого и т.п.).
На предприятиях микробиологической промышленности, где в производстве используются актиномицеты, грибы, спорообразующие бациллы, дрожжеподобные
грибы рода Candida� и др., изучается присутствие и количественное содержание в воздухе микробов-продуцентов с целью предупреждения воздействия их на организм работающих людей (возможность заболевания и развития сенсибилизации).
Исследование атмосферного воздуха в местах орошения земледельческих полей
сточными водами методом дождевания проводится с целью обнаружения микроорганизмов р.р. Salmonella��
������������, �����������
Escherichia.
При изучении присутствия микроорганизмов различных физиологических групп
в воздухе используют питательные среды разного назначения (как стандартные, так и
элективные или дифференциально-диагностические), в зависимости от цели исследования.
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха можно разделить на
4 этапа:
1) отбор проб;
2) обработка, транспортировка, хранение проб, получение концентрата микроорганизмов (если необходимо);
3) микробиологический посев, культивирование микроорганизмов;
4) идентификация выделенных культур.
1.1. Методы отбора проб воздуха. Приборы
Отбор проб воздуха, как и при исследовании любого объекта, является наиболее
ответственным этапом. Правильное взятие проб гарантирует точность исследования.
Тема 1
В закрытых помещениях точки отбора проб устанавливаются из расчета на каждые
20 м2 площади – одна проба воздуха, по типу конверта: 4 точки по углам комнаты (на
расстоянии 0,5 м от стен) и 5-я точка – в центре. Пробы воздуха забираются на высоте
1,6–1,8 м от пола – на уровне дыхания человека в жилых и производственных помещениях. Пробы необходимо отбирать днем (в период активной деятельности человека),
после влажной уборки и проветривания помещения. Атмосферный воздух исследуют
в жилой зоне на уровне 0,5–2 м от земли вблизи источников загрязнения, а также в
зеленых зонах (парки, сады и т.д.) для оценки их влияния на микрофлору воздуха.
Следует обратить внимание на то, что при отборе проб воздуха во многих случаях
одновременно происходит посев его на питательную среду.
Все методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментационные и аспирационные.
Седиментационный – наиболее старый метод, широко распространенный благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и
под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля)
оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей
микробной обсемененности чашки с мясо-пептонным агаром оставляют открытыми
на 5–10 мин (для определения общей обсемененности воздуха) и на 40 мин (для учета
кокковой флоры). Для выявления санитарно-показательных микроорганизмов применяют молочно-солевой или желточно-солевой агар (для определения стафилококков), сусло-агар или среду Сабуро (для выявления дрожжевых и мицелиальных грибов), среду Туржецкого (для обнаружения стрептококков).
По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в термостат на сутки
для культивирования при температуре, оптимальной для развития выделяемого микроорганизма, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной
температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.
Седиментационный метод имеет ряд недостатков: на поверхность среды оседают только грубодисперсные фракции аэрозоля; нередко колонии образуются не из
единичной клетки, а из скопления микробов; на применяемых питательных средах
вырастает только часть воздушной микрофлоры. К тому же этот метод совершенно
непригоден при исследовании бактериальной загрязненности атмосферного воздуха,
характеризующегося значительным движением.
Более совершенными методами являются аспирационные, основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный
раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.).
В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются:
• аппарат Кротова;
• бактериоуловитель Речменского;
• прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1);
• пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1);
• бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1);
• приборы Андерсена, Дьяконова и др.
Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры
№ 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца.
Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального
аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.
Аппарат Кротова. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях центров гигиены
и эпидемиологии.
Принцип работы аппарата Кротова (рисунок 1.1) основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность
питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе
с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе.
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
5
6
7
4
3
8
2
9
1
а)
б)
а) 1 – вентиль ротаметра; 2 – ротаметр; 3 – накидные замки; 4 – диск вращающийся, 5 – крышка; 6 – диск;
7 – клиновидная щель; 8 – корпус; 9 – основание;
б) 1 – цилиндрический корпус; 2 – основание корпуса; 3 – электромотор; 4 – центробежный вентилятор;
5 – восьмилопастная крыльчатка; 6 – диск; 7 – пружины; 8 – чашка Петри; 9 – крышка прибора; 10 – накидные замки;
11 – диски из плексигласа; 12 – клиновидная щель; 13 – разрезное кольцо; 14 – штуцер с диафрагмой; 15 – выводная труба
Рисунок 1.1 – Аппарат Кротова (а – внешний вид, б – схема конструкции)
Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку
вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб
проводят со скоростью 20–25 дм3/мин в течение 5 мин. Таким образом, определяется
флора в 100–125 дм3 воздуха. При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 дм3.
Бактериоуловитель Речменского представляет собой полый стеклянный цилиндр, внутри которого впаяна стеклянная воронка с капилляром, сообщающимся
с приемником (рисунок 1.2). Приемник перед забором пробы воздуха заполняется
3–5см3 улавливающей жидкости (водой, мясо-пептонным бульоном, изотоническим
раствором хлорида натрия).
Прибор Речменского работает по принципу пульверизатора: при прохождении
воздуха через узкое отверстие воронки жидкость из приемника через капилляр в виде
капелек поднимается в цилиндр. Капли жидкости еще больше дробятся, ударяясь о
стеклянную лопаточку и стенки сосуда, создавая облачко из мелких капелек, на которых и адсорбируются находящиеся в воздухе микроорганизмы. Насыщенные бактериями капли жидкости стекают в приемник, а затем опять диспергируются, что
обеспечивает максимальное улавливание бактерий из воздуха. При работе прибор
помещают под углом 15–25°, что обеспечивает стекание улавливающей жидкости в
приемник. Скорость отбора проб воздуха через аппарат Речменского – 10–20 дм3/мин.
По окончании работы жидкость из приемника забирают стерильной пипеткой и засевают (по 0,2 см3) на поверхность плотных питательных сред. Преимуществом бактериоуловителя Речменского является высокая эффективность улавливания бактериальных аэрозолей. Недостатки прибора заключаются в трудности его изготовления,
нестандартности получаемых аппаратов, их большой хрупкости и сравнительно низкой производительности.
Импинджер ПОВ-1 (impinger���
– сталкиваться). Отбор проб воздуха основан на том
же принципе, что и в бактериоуловителе Речменского (рисунок 1.3).
Тема 1
1 – приемник; 2 – капилляр; 3 – лопаточка
Рисунок 1.2 – Прибор Речменского
Рисунок 1.3 – Прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1)
Большим преимуществом являются его портативность, более высокая производительность (20–25л/мин). Колба прибора, в которую помещается улавливающая
жидкость, изготовляется из термостойкого плексигласа, капилляр – из нержавеющей
стали. В колбу вмонтирован пульверизатор, вызывающий диспергирование улавливающей жидкости при просасывании воздуха. Такое устройство дает возможность легко
очищать и стерилизовать колбу с диспергирующим устройством простым кипячением в течение 30 мин (автоклавирование недопустимо, так как оно вызывает деформацию цилиндра).
Перед забором проб воздуха в колбу вносят 5–10 см3 улавливающей жидкости
(чаще всего мясо-пептонный бульон) и устанавливают ее под углом 10°, что обеспечивает естественное стекание жидкости после диспергирования. Воздух, проходя через
колбу и пульверизатор, вызывает образование мелких капелек улавливающей жидкости, на которых оседают микроорганизмы. Прибор ПОВ-1 применяется для исследования воздуха закрытых помещений на общую микробную обсемененность, для
обнаружения патогенных бактерий (например, микобактерий туберкулеза) и респираторных вирусов в воздухе больничных палат.
Пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1). Механизм действия ПАБ-1 основан на принципе электростатического осаждения частиц аэрозоля (а
следовательно, и микроорганизмов) из воздуха при прохождении его через прибор,
в котором эти частицы получают электрический заряд и осаждаются на электродах
с противоположным знаком. На электродах для улавливания аэрозолей помещают
в горизонтальном положении металлические поддоны с твердыми средами в чашках
Петри или жидкой питательной средой (15–20 см3). Прибор переносной с большой
производительностью 150–250 дм3/мин, т.е. за 1 ч можно отобрать 5–6 м3 воздуха. Его рекомендуют применять для исследования больших объемов воздуха при обнаружении
условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, например, при выявлении в воздухе палат больниц возбудителей внутрибольничных инфекций (Pseudomonas� aeruginosa��
������������,
Staphylococcus� �������
aureus� и др.), определении сальмонелл и эшерихий в атмосферном воздухе в местах дождевания при орошении земледельческих полей сточными водами.
Бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1) (рисунок 1.4). Действие прибора основано на аспирационно-ионизационном принципе. БВЭП-1 состоит
из осадительной камеры, в которую вмонтированы электроды: отрицательный в виде
приводящей трубки, через которую поступает воздух (и частички аэрозоля соответственно заряжаются отрицательно), и положительный, на котором оседают бактерии.
В качестве улавливающей среды, находящейся в металлической чаше, применяют
мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5 % мясо-пептонный агар (МПА), а при минусовых
температурах – смесь 66,7 % глицерина с 33,3 % мясо-пептонного бульона. Прибор переносной, работает от электросети и обладает значительно большей эффективностью
в сравнении с аппаратом Кротова.
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
Рисунок 1.4 – Бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1)
При использовании любого из перечисленных приборов получаемые результаты
являются приблизительными, однако они дают более правильную оценку обсемененности воздуха в сравнении с седиментационным методом. Поскольку и отбор и санитарно-микробиологические исследования воздуха не регламентированы ГОСТ, то можно использовать любой прибор для оценки бактериальной загрязненности воздуха.
1.2. Определение общей численности сапрофитных бактерий
Общая бактериальная обсемененность воздуха или микробное число – это суммарное количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м3 воздуха. Для определения общего количества бактерий в воздухе закрытых помещений забирают две пробы (объемом
по 100 л каждая) на чашки Петри с МПА при помощи любого прибора (чаще всего
аппарата Кротова), либо седиментационным методом, расставляя чашки с питательной средой по принципу конверта. Чашки с посевом помещают в термостат на 24 ч,
а затем на 48 ч оставляют при комнатной температуре. Экспозиция чашек с посевами на свету дает возможность подсчитать раздельно количество пигментных колоний
(желтых, белых, розовых, черных, оранжевых и др.), количество спорообразующих бацилл, актиномицетов, грибов.
Бациллы образуют колонии, как правило, крупные, круглые, с неровными краями, сухие, морщинистые. Актиномицеты образуют беловатые колонии, вросшие в
агар. Колонии грибов с пушистым налетом (Mucor���
и �����������
Aspergillus) и плотные – зеленоватые или сероватые (Penicillium). Количество колоний каждой группы (пигментных,
беспигментных, бацилл, актиномицетов, мицелиальных грибов) выражают в процентах по отношению к общему числу колоний. Подсчитывают количество колоний на
обеих чашках, вычисляют среднее арифметическое и делают перерасчет на количество колониеобразующих единиц микроорганизмов в 1 м3 воздуха.
При определении микробного числа методом седиментации по Коху подсчитываются колонии, выросшие на МПА в чашках Петри, и расчет ведется по В.Л. Омелянскому. Если придерживаться этой методики, на чашку площадью 100 см2 за 5 мин
оседает такое количество микробов, которое содержится в 10 дм3 воздуха.
Формула для расчета микробного числа воздуха:
Х =
a × 100 × 1000 × 5
,
b × 10 × t
где X
� – количество колониеобразующих единиц микроорганизмов в 1 м3 (1000 дм3)
воздуха;
а – количество колоний в чашке;
b – площадь чашки (таблица 1.1), см2;
t – время экспозиции, мин;
5 – стандартное время экспозиции, мин;
10 – объем воздуха в дм3, из которого происходит оседание микробов за 5 мин;
100 – площадь, на которую происходит оседание, см2;
1000 – объем воздуха, дм3.
Тема 1
Таблица 1.1 – Площадь чашки Петри в зависимости от диаметра
Диаметр чашки, см
Площадь чашки, см2
8
50
9
63
10
78,5
1.3. Определение стафилококков
Стафилококки являются одним из наиболее распространенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, что обусловливается значительной устойчивостью их к различным факторам окружающей среды. Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и
свидетельствует об эпидемическом неблагополучии. Отбор проб воздуха проводится
с помощью аппарата Кротова в количестве 250 дм3 на 2–3 чашки с молочно-желточносолевым агаром (или молочно-солевым, желточно-солевым) и на чашку с кровяным
агаром. Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч.
Изучают культуральные признаки всех видов колоний, из подозрительных готовят мазки и окрашивают по Граму. В мазках клетки располагаются попарно, одиночно, парами или в виде несимметричных гроздьев винограда.
Помимо качественной характеристики отдельных колоний, подсчитывают количество выросших колоний стафилококков в 1 м3 воздуха.
1.4. Определение стрептококков
Стрептококки также являются санитарно-показательными микроорганизмами
воздуха, в который они попадают от больных скарлатиной, тонзиллитами, ангиной
и носителей стрептококков. Отбор проб воздуха при исследовании на наличие α- и
β-гемолитических стрептококков производят с помощью аппарата Кротова на чашки с кровяным агаром, средами Гарро и Туржецкого. Забирают 200–250 дм3 воздуха,
чашки с посевами выдерживают в термостате 18–24 ч и затем еще 48 ч при комнатной
температуре (после предварительного просмотра и учета).
Через сутки на кровяном агаре вырастают мелкие, плоские, суховатые колонии
с наличием зоны гемолиза (β-гемолитические стрептококки: ���
S��. �����������
pyogenes���
), зеленой каемки метгемоглобина вокруг них (α-гемолитические стрептококки: S. pneumoniae��) или
без них (негемолитические стрептококки S��
���. �����������
viridans���
). При идентификации ���
S��. pyogenes�
используют тест чувствительности к бацитрацину, к которому они обычно высокорезистентны. В мазках, окрашенных по Граму, стрептококки располагаются цепочками,
часто попарно, одиночно или небольшими группами, вследствие чего их трудно дифференцировать от стафилококков.
1.5. Окраска бактерий по методу Грама
Окраска бактерий по методу Грама осуществляется следующим образом:
1) фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него
наносят карболовый раствор генцианового фиолетового. Окрашивание проводят в течение 1–2 мин,
2) бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его в течение 1–2 мин раствором Люголя до почернения,
3) сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96° этиловым
спиртом (препарат погружают несколько раз в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек с мазка),
4) препарат промывают водой;
5) мазок дополнительно окрашивают в течение 1–2 мин водным раствором
фуксина;
6) краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе (можно
с помощью фильтровальной бумаги) и микроскопируют с иммерсионной системой.
10
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
В результате окрашивания грамотрицательные бактерии – розовые, грамположительные – сине-фиолетовые. При проведении окрашивания по Граму обязательна постановка контролей: окрашивание заведомо грамотрицательных бактерий (Еscherichia
соli) и грамположительных (Васillus subtilis или Stарhуlососсиs saprophyticus). При этом
необходимо следить, чтобы используемые штаммы были чистыми.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики: на предметное стекло наносят каплю 3 %-го водного раствора КОН.
Петлей вносят взятую с плотной среды культуру исследуемых бактерий и тщательно эмульгируют. Если после нескольких секунд перемешивания взвесь ослизняется и
суспензия тянется за петлей, это – грамотрицательные бактерии, если нет – грамположительные бактерии.
1.6. Определение патогенных микроорганизмов в воздухе
Ввиду малой концентрации патогенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, их выделение является достаточно трудной задачей.
При исследовании воздуха на наличие микобактерий туберкулеза отбор проб
производят с помощью прибора ПОВ-1 в объеме 250–500 дм3 воздуха. Улавливающую
жидкость затем обрабатывают 3 % раствором серной кислоты (для подавления сопутствующей микрофлоры) и центрифугируют. Осадок засевают в пробирки на одну
из яичных сред. Инкубируют при 37 °С до 3 месяцев. Пробирки первый раз просматривают через 3 недели, затем каждые 10 дней. Выделенную культуру идентифицируют, определяют ее вирулентность (заражением морских свинок – биопроба) и при
необходимости определяют устойчивость к лекарственным препаратам. Отсутствие
роста в течение 3 месяцев дает возможность выдать отрицательный ответ.
При определении в воздухе коринебактерий дифтерии для посева воздуха используют чашки со средой Клауберга.
При расшифровке внутрибольничных инфекций определяют в воздухе присутствие стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, сальмонелл, протеев и др.
Отбор проб воздуха производят с помощью ПАБ-1 в объeме не менее 1000 л. Посев
производят на соответствующие элективные среды. Если используется жидкая среда как улавливающая жидкость, то пробирку с жидкостью помещают в термостат на
сутки для подращивания (получение накопительной культуры), а затем высевают на
элективную среду. В воздухе помещений лечебно-профилактических учреждений не
допускается наличие S��. ������
aureus.
В последние годы в атмосферном воздухе определяют сальмонеллы в районах дождевания земледельческих полей, при орошении их сточными водами, в случае появления заболевания среди персонала станций орошения или населения. Отбор проб
производят с помощью аппарата Кротова на чашки с висмут-сульфитным агаром. Исследуют не менее 200 дм3 воздуха. Посевы инкубируют при 37 °С 18–24 ч. Сальмонеллы образуют на висмут-сульфитном агаре серо-зеленые колонии с черным центром и
подкрашенной в черный цвет средой под колонией. Колонии, характерные для сальмонелл, пересевают на среду Ресселя штрихом по скошенной поверхности и уколом в
столбик среды. При росте сальмонелл исходный цвет скошенной поверхности среды
не изменяется, изменяется только цвет столбика среды. Газообразование определяют
по разрыву столбика. Далее исследование проводят по обычной схеме: посев на пестрый ряд, определение подвижности, агглютинация с поливалентной и монорецепторными сальмонеллезными сыворотками, фаготипирование.
В связи с развитием микробиологической промышленности возникла необходимость исследования воздуха с целью обнаружения грибов-продуцентов при производстве антибиотиков, ферментных препаратов, при изготовлении кормовых дрожжей и др. Для исследования воздуха на содержание грибов отбор проб производят с
помощью аппарата Кротова в объеме от 100 до 1000 дм3 на чашки со средой Чапека,
сусло-агаром (для обнаружения плесневых грибов) и с метабисульфит-натрий-агаром
(МБС-агар) с добавлением антибиотиков (для обнаружения дрожжеподобных грибов
рода Candida). Чашки инкубируют в термостате при температуре 26–27 °С в тече11
Тема 1
ние 3–4 суток (для плесневых грибов) и при 35–37 °С в течение 2–3 суток (для грибов-продуцентов и дрожжеподобных рода Candida). Идентификация проводится с
учетом особенностей плодоносящих гиф и характера мицелия. Считают, что концентрация дрожжеподобных грибов в количестве 500–600 КОЕ/1 м3 воздуха рабочего помещения является предельной, превышение ее ведет к развитию аллергических реакций у рабочих.
Критерии оценки воздуха по санитарно-микробиологическим показателям представлены в таблицах 1.2, 1.3 [15].
Таблица 1.2 – Критерии для санитарной оценки воздуха жилых помещений
(число микроорганизмов в 1 м3 воздуха)
Оценка воздуха
Чистый
Загрязненный
Летний период
Зимний период
ОМЧ
Количество стрептококков
ОМЧ
Количество стрептококков
До 1500
До 16
До 4500
До 36
1500 – 2500
16 – 36
4500 – 7000
36 – 124
Таблица 1.3 – Критерии для санитарной оценки холодильных камер
Воздух
Стены
Общее количество спор мицелиальных
грибов, осевших на чашки Петри
за 5 минут
Общее количество спор мицелиальных
грибов на 1 см2
Хорошо
0 – 10
0 – 20
Удовлетворительно
11 – 15
21 – 100
Более 50
Более 100
Оценка
Плохо
Для снижения численности микроорганизмов в воздухе закрытых помещений применяют следующие средства:
а) химические – обработка озоном, двуокисью азота, распыление молочной кислоты;
б) механические – пропускание воздуха через специальные фильтры;
в) физические – ультрафиолетовое облучение.
Лабораторная работа
«Санитарно-микробиологическое исследование воздуха закрытых помещений»
Цель: провести исследование микрофлоры воздуха закрытых помещений в корпусе университета по количественным и качественным показателям.
Средства исследования, вспомогательные устройства, реактивы и оборудование: весы аналитические, стерильные чашки Петри, МПА, сусло-агар, молочно-солевой агар, желточно-солевой агар, аппарат Кротова, термостат, предметные стекла,
набор красителей, спиртовка, пробы воздуха.
• проба № 1 – воздух аудитории;
• проба № 2 – воздух коридора;
• проба № 3 – воздух пищевого блока.
Требования безопасности. При исследовании следует выполнять правила работы в микробиологической лаборатории.
Подготовка к выполнению исследований. Перед посевом разлить МПА, суслоагар, молочно-солевой агар, желточно-солевой агар в чашки Петри.
Выполнение работы.
1.���������������������������������������������������������
Провести отбор проб воздуха и посев по принципу конверта методом Коха (седиментации) в лаборатории, коридоре, препараторской, туалетах, пищеблоке (по
12
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
заданию преподавателя) на питательные среды для обнаружения сапрофитных микроорганизмов, стафилококков, гемолитических стрептококков, спор мицелиальных
грибов. Чашки Петри с МПА, молочно-солевым агаром, желточно-солевым агаром,
сусло-агаром оставить открытыми на 5 мин.
2.����������������������������������������������������������������������
Определить микробное число и количество санитарно-показательных микроорганизмов с помощью аппарата Кротова. Использовать чашки с МПА, молочно-солевым агаром и сусло-агаром. Для каждой чашки пропустить по 200 дм3 воздуха со
скоростью 20–30 дм3/мин.
3.���������������������������������������������������������������������
Инкубацию посевов проводить при оптимальных температурах роста микроорганизмов [1].
4.�����������������������������������������������������������������������
Через сутки инкубации посевов на МПА чашки Петри вынуть из термостата,
оставив при комнатной температуре на свету для обнаружения сапрофитов-пигментообразователей.
5.������������������������������������������������������������������������
По истечении времени инкубации провести количественный учет по всем контролируемым показателям. Сделать мазки, окрасить их по Граму. Дать характеристику микрофлоры воздуха по культуральным, морфологическим и тинкториальным
признакам.
6.��������������������������������������������������������������������
Определить микробное число воздуха и численность стрептококков в 1 м3,
оформить результаты в виде таблицы 1.4.
7.���������������������������������������������������������������������
Дать санитарно-микробиологическую оценку воздуха исследуемого помещения в соответствии с нормативами.
в аппарате
Кротова
Число стафилококков
(на молочно-солевом,
желточно-солевом
агаре), КОЕ/м3
методом
Коха
в аппарате
Кротова
Число стрептококков
(на кровяном агаре),
КОЕ/м3
методом
Коха
в аппарате
Кротова
Число грибов
(на сусло-агаре),
КОЕ/м3
методом
Коха
в аппарате
Кротова
Общее микробное
число (на МПА),
КОЕ/м3
методом�
Коха
Проба воздуха
Таблица 1.4 – Учет результатов работы
Проба № 1
Проба № 2
Проба № 3
Материал для самоконтроля
1.��������������������������������������������������������
Качественный и количественный состав микрофлоры воздуха.
2.����������������������������������������������������������������������
Правила отбора проб воздуха для санитарно-микробиологического анализа.
3.����������������������������������������������������������������������������������������
Характеристика аспирационного метода санитарно-микробиологического исследования воздуха.
4.������������������������������������������������������������������������������������
Основные приборы, служащие для определения санитарно-микробиологических показателей
воздуха.
5.���������������������������������������������������������������������������������
Седиментационный метод исследования микрофлоры воздуха. Достоинства и недостатки.
6.�������������������������������������������������������������������������������������
Питательные среды для выделения санитарно-показательных микроорганизмов воздуха. Особенности состава.
7.������������������������������������������
Микробное число воздуха и его определение.
8.������������������������������������������������������������������
Санитарно-показательные микроорганизмы воздуха закрытых помещений.
9.����������������������������������
Патогенные микроорганизмы воздуха.
13
ТЕМА 2
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ
В воде рек, озер, морей и океанов постоянно обитает и размножается специфическая для них, автохтонная, микрофлора. В ней доминируют одноклеточные водоросли
и разнообразные аэробные виды водных бактерий практически всех таксономических и физиологических групп, но чаще других – Bacillius cereus, В. mycoides, В. subtilis,
Bacterium aquatilis communis, Micrococcus candidus, M. roseus, Pseudomonas fluorescens, Sarcina
lutea, Proteus, Leptospira. Среди анаэробных бактерий, которых в незагрязненных водах
сравнительно мало, превалирует род Clostridium. Общее количество автохтонной микрофлоры в открытых водоемах зависит от вида водоема, состава и концентрации органических и неорганических веществ, метеорологических условий, сезона.
В прибрежных зонах водоемов численность и видовой состав водных микроорганизмов резко возрастает. Связано это с загрязнением их аллохтонной микрофлорой,
попадающей из почвы с ливневыми, талыми и хозяйственно-бытовыми сточными водами, в которых может находиться микрофлора кишечника человека и животных,
включая и патогенные микроорганизмы: сальмонеллы, шигеллы, холерные вибрионы, энтеровирусы и вирус гепатита А. Все эти патогенные микроорганизмы сохраняются в воде от нескольких дней-недель (шигеллы) до нескольких месяцев (сальмонеллы, холерный вибрион). Именно поэтому водный путь передачи является одним из
возможных факторов распространения кишечных инфекций.
Очищаются водоемы от перечисленных видов энтеропатогенных бактерий и вирусов в результате конкурентной активации автохтонной микрофлоры.
Основными задачами санитарно-микробиологического исследования воды является определение наличия в воде патогенной и условно-патогенной микрофлоры, и,
следовательно, источника этого попадания, а также предупреждение распространения инфекционных заболеваний среди населения.
Санитарно-микробиологическое исследование воды проводится в следующих
случаях:
– при выборе источника централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения и периодическом контроле этого источника;
– при контроле эффективности обеззараживания питьевой воды централизованного водоснабжения;
– при наблюдении за подземными источниками централизованного водоснабжения (артезианскими скважинами, почвенными водами и т.д.);
– при определении состояния и степени пригодности воды источников индивидуального водопользования (колодцев, родников и т.д.);
– при наблюдении за санитарно-эпидемиологическим состоянием воды открытых водоемов: водохранилищ, прудов, озер, рек;
– при контроле эффективности обеззараживания воды плавательных бассейнов;
– при проверке качества и степени очистки сточных вод;
– при определении очага водных вспышек инфекционных болезней.
Объектами санитарно-микробиологического исследования являются воды источников централизованного снабжения, артезианских скважин, колодцев, плавательных
бассейнов, открытых водоeмов (рек, озер), сточные воды.
Санитарно-бактериологическое исследование воды складывается из определения
степени обсемененности (микробного числа) и обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов.
2.1. Отбор, хранение и транспортировка проб
Пробу воды из открытых водоемов берут с глубины 10–15 см от поверхности и
не менее 10–15 см от дна с помощью батометра, а при его отсутствии – с помощью
стерильной бутылки со стерильной резиновой пробкой. Бутыль закрывают пробкой,
к которой прикреплен шнур, и вставляют в тяжелую оправу или к ней подвешивают
14
Санитарно-микробиологическое исследование воды
груз на тросе (шнуре, веревке). Бутыль устанавливают на намеченной глубине, пробку
вынимают с помощью шнура. Пробу воды с небольшой глубины (особенно зимой)
отбирают шестом с прикрепленной к нему бутылью. Бутыль заполняется водой до
верха. Перед закрытием бутыли пробкой верхний слой воды сливается так, чтобы под
пробкой оставался небольшой слой воздуха.
Рисунок 2.1 – Батометр
Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные склянки вместимостью 500 мл с ватно-марлевыми пробками.
Из распределительной сети воду отбирают после предварительной стерилизации
кранов обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего ее спуска в течение 10 мин. Если вода подверглась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие 2 мл 1,5 % стерильного раствора гипосульфита натрия.
При отборе пробы составляется сопроводительный документ, прилагаемый к
анализу. Он должен содержать следующие сведения: а) наименование источника и
его местонахождение; б) дата отбора пробы (год, месяц, число и час); в) место и точка
взятие пробы: для открытых водоемов — расстояние от берега и глубина, с которой
взята проба воды (расстояние от поверхности воды и от дна водоема); для скважины и
колодцев — отметка устья и дна; г) метеорологические условия: температура воздуха
и осадки в день отбора пробы, осадки за предшествующие 10 дней, а также сила и
направление ветра (при отборе пробы из открытого водоема); д) температура воды
при отборе воды; е) особые условия, способных оказать влияние на качество воды в
источник; ж) цель исследования воды; з) место службы, должность и подпись лица,
производившего отбор проб воды.
Доставка воды проводится в контейнерах-холодильниках, поддерживающих температуру +4–10 °С, которая позволяет хранить ее в течение 6 ч. При невозможности
охладить воду исследование должно проводиться в ближайшие 2 ч после забора.
2.2. Определение общего числа микроорганизмов
Общее число микроорганизмов (ОМЧ) — это общее число видимых при двукратном увеличении мезофильных (имеющих температурный оптимум +37 °С) аэробных
и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАМ и ФАнМ), которые способны
образовывать колонии на питательной среде при температуре +37 °С в течение 24 ч.
Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в
анализируемом объекте, используют перемешивание простым встряхиванием или
специальные приборы.
Приготовление разведений. Для определения количества бактерий чаще используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каждого
последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают
на питательные среды.
Посев на питательные среды. Из каждой пробы делают посев не менее двух повторностей. После тщательного перемешивания вносят по 1 см3 воды в стерильные чашки
15
Тема 2
Петри, затем в каждую чашку вливают 8–12 см3 расплавленного питательного агара
(температура агара должна быть не выше +45 °С!). Быстро смешивают содержимое
чашек, избегая образования пузырей. Перемешивание проводят на горизонтальной
поверхности и оставляют чашки до застывания агара. Затем чашки с посевами переворачивают вверх дном, маркируют и ставят в термостат при температуре +37 °С.
Через 24 ч подсчитывают все выросшие колонии (учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний).
Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (Х) вычисляют по формуле:
n
a × 10
X=
,
q
где a – округленно���������������������������������������
e��������������������������������������
среднее арифметическое число колоний;
q – объем посевного материала, внесенного в чашки, см3;
n – степень десятикратного разведения образца продукта.
Результаты анализа выражают числом (от 1,0 до 9,9)×10n КОЕ в 1 см3 пробы.
Если на одной из двух чашек подсчeт колоний невозможен, то учитывают колонии, выросшие на одной чашке. Если из-за сплошного роста невозможен подсчeт колоний на обеих чашках, то в протоколе анализа следует писать: «сплошной рост».
2.3. Определение количества общих колиформных бактерий
и термотолерантных колиформных бактерий
Загрязненность воды выделениями человека или животных определяют путем количественного учета таких санитарно-показательных микроорганизмов, как бактерии
группы кишечной палочки (БГКП). К ним относят все грамотрицательные палочки,
сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре
37±0,5 °С в течение 24–48 часов и не обладающие оксидазной активностью.
Представитель нормальной микрофлоры кишечника человека и животных, типичный условно-патогенный микроорганизм – E��. с����
�����
oli�. В обычных условиях эшерихии
являются сапрофитами, а при снижении устойчивости организма могут проникнуть
в другие органы и ткани и стать причиной тяжелых патологических процессов. Количество E. сoli (коли-индекс) характеризует санитарное состояние объекта.
Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазонегативные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре
+37 °С в течение 24–48 ч.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в состав ОКБ и обладают
всеми их признаками, но, в отличие от них, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +44 °С в течение 24 ч. Таким образом, ТКБ отличаются от ОКБ способностью ферментировать лактозу до кислоты и газа при более
высокой температуре.
Метод мембранной фильтрации (основной метод). Метод основан на фильтровании определенных объемов воды через мембранные фильтры. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре
(«Владипор» МФАС-ОС-1, МФАС-ОС-2, МФАС-МА (№ 4–6)). Мембранные фильтры
подготавливают к анализу в соответствии с инструкциями завода-изготовителя (двойным кипячением на водяной бане в дистиллированной воде).
При исследовании воды неизвестного качества для получения изолированных колоний фильтруют следующие объемы воды: 10, 40, 100 и 150 см3 соответственно на 4
фильтра. Далее фильтры помещают на чашки со средой Эндо и инкубируют 24 ч при
температуре +37 °С. Если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост пленчатых, губчатых, плесневых, прозрачных и расплывчатых колоний, то выдают отрицательный ответ.
16
Санитарно-микробиологическое исследование воды
В случае обнаружения на мембранных фильтрах лактозоположительных колоний
для подтверждения присутствия ОКБ выполняют следующие действия:
•�������������������������
проводят оксидазный тест;
•�������������������������������������������
проверяют принадлежность к группе по Граму;
•������������������������������������������������������������������������
подтверждают способность к газообразованию при посеве 1–2 изолированных
колоний всех типов с каждого сектора в среду подтверждения (ЛПС с индикатором
бриллиантовым зеленым) с последующей инкубацией посевов при температуре
37 °С в течение 24–48 ч.
Постановка оксидазного теста. Полоску фильтровальной бумаги помещают в
чистую чашку Петри и наносят 2–3 капли реактива для оксидазного теста (1 % спиртовой раствор α-нафтола и 1 % водный раствор фенилендиаминового соединения;
перед постановкой теста к 3 частям α-нафтола добавляют 7 частей фенилендиаминового соединения). Возможно использование индикаторных бумажных тест-систем
«СИБ-оксидаза». Реактивы и тест-системы периодически проверяют на тест-культурах:
P��. �����������
aeruginosa� — оксидазоположительной и E��. �����
coli� – оксидазоотрицательной. Часть изолированной колонии изучаемой культуры стеклянной палочкой наносят на пропитанную
реактивом фильтровальную бумагу. Если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое окрашивание, культура считается оксидазоположительной и дальнейшему изучению не подлежит. Если реакция на оксидазу отрицательная (цвет на месте нанесения
культуры не меняется), культура подлежит дальнейшему исследованию.
Определение тинкториальных свойств. Из оксидазоотрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Грамотрицательные бактерии
окрашиваются в красный или розовый цвет.
Определение способности к образованию индола. К бульонной (или выращенной
в пептонной воде) культуре микроорганизмов добавляют 2–3 капли 30 % серной кислоты и осторожно пастеровской пипеткой по стенке наслаивают раствор азотнокислого натрия (0,05 %). При ферментации культурой триптофана до индола на границе
раздела жидкостей появляется розовое кольцо.
Определение ферментации лактозы. Часть оксидазоотрицательной грамотрицательной колонии засевают в две пробирки с жидкой лактозо-пептонной средой.
Для подтверждения наличия ОКБ посевы в ЛПС с индикатором инкубируют при
температуре 37 °С в течение 48 ч. Для подтверждения наличия ТКБ материал сеют в
предварительно подогретую до 44 °С ЛПС с индикатором и инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа результат исследования
считают положительным. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только
кислоты через 24 ч для окончательного учета ОКБ пробирки с посевами оставляют в
термостате до 48 ч.
Учет результатов. Грамотрицательные колонии учитывают как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа. Грамотрицательные колонии учитывают как ТКБ при
отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с
образованием кислоты и газа.
При отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат формулируют: «Не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см3» и «Не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см3».
В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число КОЕ
ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в
100 см3 воды. Вычисления проводят по формуле:
X=
a × 100
,
v
где X – число колоний в 100 см3;
v – объем воды, профильтрованной через фильтры, на которых велся учет;
а – число подсчитанных на фильтрах колоний в сумме.
Окончательный результат выдают в следующем формате: количество КОЕ ОКБ в
100 см3, из них – количество КОЕ ТКБ в 100 см3.
При сплошном росте на всех фильтрах, в случае подтверждения принадлежности
к ОКБ и ТКБ, выдают качественный результат: «Обнаружены ОКБ в 100 см3».
17
Тема 2
Титрационный (двухэтапный бродильный) метод. Данный метод используют в
следующих случаях:
– при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
– при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
– в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний колиформных бактерий.
Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой
воды и подращивании при 37 °С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа БГКП в 100 c�
��
м3 воды по таблицам определения [7].
При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100,0; 10,0; 1,0
и 0,1 см3 воды.
При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санитарноэпидемиологический надзор, производственный контроль) засевают три объема по
100 см3.
При исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по
100,0 см3, три объема по 10,0 см3, и три объема по 1,0 см3.
1. Указанные объемы воды помещают во флаконы и пробирки с глюкозопептонной или лактозо-пептонной средой и индикатором, снабженные поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда. Посев 100,0 и 10,0 см3 воды производится
во флаконы и пробирки соответственно с 10,0 и 1,0 см3 концентрированной среды;
посев 1,0 и 0,1 см3 воды – в пробирки с 10,0 см3 среды нормальной концентрации.
Посевы инкубируют 24 ч при 37 оС. Отсутствие помутнения и образования кислоты и
газа во флаконах и пробирках позволяет получить отрицательный результат на наличие бактерий группы кишечной палочки в исследованном объеме воды и закончить
исследование через 24 ч.
2. Из каждого флакона, где отмечены помутнение, кислота и газ, а также помутнение и кислота при использовании глюкозопептонной среды или помутнение при использовании лактозо-пептонной среды, петлей высевают штрихами на поверхность
среды Эндо, разделенной на 3–4 сектора. Посевной материал следует брать с таким
расчетом, чтобы получить изолированные колонии. При получении сплошного роста
необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения
изолированных колоний. Чашки помещают крышками вниз в термостат и инкубируют 16–18 ч при 37 оС.
3. При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии
пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других нехарактерных для кишечной палочки колоний получают отрицательный результат.
4. Если при высеве из флаконов и пробирок, где отмечены помутнение, кислота и
газ, на секторах среды Эндо выросли лактозоположительные колонии (темно-красные
или красные, с металлическим блеском или без него, выпуклые с красным центром и
отпечатком на питательной среде, то их принадлежность к БГКП подтверждают микроскопированием и постановкой оксидазного теста [7].
Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест
позволяют дать положительный результат о наличии бактерий группы кишечной палочки в анализируемом объеме воды. Анализ воды по этапам очистки заканчивают
учетом результатов по наличию или отсутствию на подтверждающей среде Эндо темно-красных колоний грамотрицательных палочек, не обладающих оксидазной активностью.
5. При анализе питьевой воды учитывают и те сектора, где выросли только розовые и бесцветные колонии, или где темно-красные колонии оказались оксидазоположительными. В этом случае из двух-трех разного типа колоний каждого сектора
приготовляют мазки, окрашивают по Грамму и микроскопируют, а также проверяют
оксидазную активность. При наличии только грамположительных спорообразующих
бактерий получают отрицательный результат.
6. Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из флаконов или пробирок, кроме перечисленных в п. 3, позволяет также получить отрицательный результат. Анализ во всех этих случаях заканчивают через 40–42 ч.
18
Санитарно-микробиологическое исследование воды
7. При росте на секторах оксидазоотрицательных не окрашивающихся по Грамму
палочек две-три изолированные колонии разного типа с каждого сектора засеивают в
полужидкую среду с глюкозой и инкубируют 4–5 ч при 37 оС. При наличии кислоты
и газа получают положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получают
отрицательный результат, анализ заканчивают через 44–48 ч.
При наличии только кислоты пробирки оставляют на 24 ч для окончательного
учета. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газа – положительный результат.
Учет результатов. При исследовании трех объемов по 100 см3 результаты оценивают качественно, и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из трех объемов
делают запись: «Обнаружены ОКБ и ТБК в 100 см3».
При исследовании количественным методом результат анализа выражают в виде
наиболее вероятного числа БГКП (ОКБ и ТКБ) в 100 см3 воды, значение которого определяют по таблице 2.1.
При отрицательных результатах исследования на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение: «Не обнаружены ОКБ и ТКБ в 100 см3».
Таблица 2.1 – Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 см3 питьевой воды (действует
с 01.01.2005 г.) [24]
Число положительных результатов из:
НВЧ
бактерий в
100 см3
Доверительный интервал (95 %)
3 объемов по
100 см3
3 объемов по
10 см3
3 объемов по
1 см3
3
4
5
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
0,3
*
*
0,3
*
*
*
0,6
*
*
*
*
*
*
*
0,4
0,7
*
*
0,7
1,1
*
*
1,1
*
*
*
*
*
0
–
–
0,1
–
–
–
0,1
–
–
–
–
–
–
–
0,1
0,2
–
–
0,2
0,2
–
–
0,2
–
–
–
–
–
1,4
–
–
1,4
–
–
–
2,8
–
–
–
–
–
–
–
1,7
3,4
–
–
3,4
5,2
–
–
5,3
–
–
–
–
–
1
2
Нижний предел
Верхний предел
19
Тема 2
Продолжение таблицы 2.1
1
2
3
4
5
6
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
*
*
0,9
1,4
*
*
1,5
2
*
*
2
3
*
*
3
*
*
*
2
4
6
*
4
8
12
*
9
15
21
29
24
46
110
≥ 240
–
–
0,2
0,3
–
–
0,3
0,4
–
–
0,5
0,6
–
–
0,6
–
–
–
0,5
0,8
1,4
–
0,9
1,6
2,5
–
2
3,2
4,6
6,2
5,1
9,3
23,5
–
–
–
4,3
6,7
–
–
6,9
9,6
–
–
9,9
12,9
–
–
133
–
–
–
10,8
18
29,7
–
20
35
53,8
–
43,6
69,8
100,3
136,4
112,1
216
516,6
–
Примечание: * Вероятность ниже допустимого уровня. Количественный учет невозможен, результат оценивают качественно.
Таким образом, наличие ОКБ необходимо подтвердить в следующих случаях:
•����������������������������������������������
в среде накопления отмечено только помутнение;
•�����������������������������������������������������������������
принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение.
Отрицательное заключение дают, если:
• в среде накопления нет признаков роста;
•���������������������������������
на секторах среды Эндо нет роста;
•����������������������������������������������������������������������
на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий
колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые);
•���������������������������������������������
все колонии оказались оксидазоположительными;
•�����������������������������������������
все колонии оказались грамположительными;
•�������������������������������������������������������������������������
в подтверждающем тесте на среде ЛПС с индикатором не отмечено газообразования.
Для определения ТКБ работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные
лактозоположительные колонии. Делают посев двух-трех изолированных колоний
20
Санитарно-микробиологическое исследование воды
каждого типа из каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред накопления,
инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 ч.
При образовании газа в лактозной среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности к ферментации лактозы до
кислоты и газа в подтверждающих лактозных средах при температуре 44 °С в течение
24 ч дают положительное заключение о наличии в этом объеме воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательное заключение.
2.4. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий
(Clostridium� �����������
perfringens) методом прямого посева
При исследовании воды открытых водоемов о давности фекального загрязнения объекта можно судить по сопоставлению индекса E��. с���
����
oli и сульфитредуцирующих клостридий (C��. perfringens�
������������). Если оба показателя имеют высокое значение, то это
свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. Высокое значение индекса E��. с���
����
oli,
низкое значение индекса вегетативных форм и высокое количество споровых форм
C��. �����������
perfringens указывают на давнее загрязнение.
Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия в условиях культивирования на железо-сульфитном агаре при температуре 44 °С в течение 16–18 ч.
Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях,
приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.
Проведение анализа. В 4 стерильные пробирки объемом не менее 15 см3 вносят
по 5 см3 подготовленной пробы воды (общий объем пробы – 20 см3) и прогревают на
водяной бане при температуре 75 °С в течение 15 мин для исключения вегетативных
форм. Прогретую воду заливают горячим, расплавленным на водяной бане (не кипятить!) железо-сульфитным агаром по 10 см3 в каждую пробирку. Среду заливают
по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку
быстро охлаждают в емкости с холодной водой для создания анаэробных условий.
Посевы инкубируют при температуре 44 °С в течение 16–18 ч. В течение посева поддерживают среду нагретой до 70–80 °С в водяной бане.
Учет результатов. Количественному учету подлежат те посевы, где получены
изолированные черные колонии в толще питательной среды. Результат выража­ют
числом КОЕ спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см3 воды.
В случае сильного роста результат оценивают качественно и в протоколе отмечают: «Обнаружено в 20 см3 воды». При отсутствии роста черных колоний дают ответ:
«Не обнаружено в 20 см3 воды».
2.5. Определение коли-фагов
Коли-фаги – бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli�
����� и формировать
при температуре 37 °С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на
питательном агаре. Метод определения коли-фагов в питьевой воде заключается в
предварительном накоплении их в среде обогащения на культуре Е. �����
coli� и последующем выявлением зон лизиса (просветления) газона Е. �����
coli� на питательном агаре. Метод
предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.
Подготовка тест-культуры E. coli К 12StmR. На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру E. coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином. Через 18±2
часов инкубации при температуре 37±1 °С произвести смыв бактерий с ко­сяка 5 см3
стерильного физиологического раствора (0,85 % раствор NaCl) и по стандарту мутности
готовят взвесь E. coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 см3.
Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E. coli, по­лученной путем подращивания в термостате при температуре 37 °С. Концен­трация 109 бактериальных клеток Е. coli содержится в 2 см3.
21
Тема 2
Проведение качественного анализа на коли-фаги. В исследуемую пробу воды объемом 100 см3 вносят 10 см3 10-кратного питательного бульона и 1 см3 подготовленного
смыва тест-культуры или 2 см3 4-часовой бульонной культуры.
Для контроля культуры 0,1 см3 смыва бактерий Е. coli (или 0,2 см3 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают пита­тельным агаром.
Исследуемую пробу воды 100 см3 и чашку Петри с контролем Е. coli помещают в
термостат и инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18+2 часа.
После инкубации из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 см3 и добавляют 1 см3 хлороформа.
Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объ­ему пробы и
оставляют при комнатной температуре не менее 15 минут до полного осаждения хлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С пита­тельный агар
добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli из расчета 1,0 см3 смыва (или 2 см3
4-часовой бульонной культуры) на 100 см3 агара.
В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл об­работанной
хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесью расплавленного и
остуженного до 45–49 °С питательного агара объемом 12–15 см3, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культу­ры E. coli и осторожно покачивают для
равномерного перемешивания пробы воды и агара. Для полного застывания чашки
оставляют на столе при комнат­ной температуре на 10 минут. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат на 18±2 часов при 37 °С.
Проведение количественного анализа. 100 см3 исследуемой пробы воды разливают на 6 объемов: один флакон – 50 см3 и 5 пробирок по 10 см3. В 50 см3 пробы воды
добавляют 5 см3 питательного бульона 10-кратной концентрации (готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке) и 0,5 см3 смыва
(или 1 см3 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli�
�����.
3
Для контроля культуры 0,1 см смыва бактерий (или 0,2 см3 4-часовой бульонной
культуры) Е. coli�
����� помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы
переносят в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение 18 ч.
После инкубации из объема 50 см3 отмеряют 10 см3 в пробирку. Во все пробирки
(6 объемов пробы воды по 10 см3) добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками, встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объему воды и оставляют на 15 мин при комнатной температуре
(Е. coli
���� погибают, остаются только коли-фаги).
В 100 см3 расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара добавляют 1 см3 смыва суточной агаровой культуры Е. coli
���� (в концентрации 109/см2
3
смыва) или 2 см 4-часовой бульонной культуры Е. ����
coli. Приготовленную смесь разливают в чашки Петри: одну чашку для контроля культуры Е. ����
coli на лизогенность и по
одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. После застывания агара чашки,
предназначенные для посева пробы, делят на 6 секторов, маркируют каждый сектор
в соответствии с исследуемыми объемами и на каждый сектор наносят пастеровской
пипеткой по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа) из 6 пробирок с пробой. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при температуре 37 °С на 18 ч.
Учет результатов. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете.
Учитывают и суммируют зоны лизиса в виде отдельного пятна или отдельной бляшки. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице
наиболее вероятного числа бляшкообразующих единиц (НВЧ БОЕ) (таблица 2.2). В
протоколе анализа указывают НВЧ колифагов в 100 см3 воды и диапазон возможных
колебаний.
22
Санитарно-микробиологическое исследование воды
Таблица 2.2 – Расчет наиболее вероятного числа коли-фагов в 100 см3 воды [24]
Число положительных результатов из:
1 объема
(50 см3)
1
НВЧ в
100 см3
Вероятность
Доверительный интервал
4
16,1
0,4095
Нижний
предел
1,9
1
3
9,3
0,3422
1,1
77,4
1
2
5,6
0,3218
0,7
46,4
1
1
3,2
0,3039
0,4
26,2
1
0
1,4
0,2500
0,2
11,5
0
5
6,9
0,0010
0,8
57,6
0
4
5,1
0,0060
0,6
42,5
0
3
3,6
0,0222
0,4
29,6
0
2
2,2
0,0671
0,3
18,5
0
1
1,1
0,1937
0,1
8,8
5 объемов по 10 см3
Верхний
предел
113,9
В протоколе анализа указывают НВЧ коли-фагов в 100 см3 воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ коли-фагов в 100 см3.
Результат — полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.
2.6. Тест-культуры микроорганизмов
При проведении микробиологического анализа питьевой воды и для контрольных целей используют контрольный колифаг ���������������������������������
MS�������������������������������
2, штамм Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов – 3254 Е. �����
coli� К-12 Ff�
��� StmR���������������������
�������������������������
, которые получают в
ГНИИ Генетика – Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1) [24]. Штамм Е. �����
coli� М 17-02, Pseudomonas
aeruginosa или Pseudomonas fluorescens получают в Государственном Национальном
Органе контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича
Минздравсоцразвития России (Россия, Москва, ул. Сивцев Вражек, д. 41).
Лабораторная работа
«Санитарно-микробиологическое исследование воды»
Цель: провести определение микробного числа, численности санитарно-показательных организмов в природных водах.
Средства исследования, вспомогательные устройства, реактивы и оборудование: весы аналитические, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см3,
колба Бунзена, фильтр Зейтца с мембранными фильтрами, насос вакуумный, стерильная вода в пробирках по 9 см3 и в колбах по 99 см3, питательный агар, среда Эндо, лактозо-пептонная среда (концентрированная и разбавленная), среда Вильсона-Блера,
молочно-ингибиторная среда с 2,3,5-трифенил-2Н-тетразолий-хлоридом (ТТХ), водяная баня, термостат, предметные стекла, набор красителей, спиртовка, пробы воды:
• проба № 1 – вода из проточного водоема (0,5 л);
• проба № 2 – вода водопроводная (0,5 л);
• проба № 3 – вода колодезная (0,5 л).
Метод исследования. Метод основан на определении числа выросших микробных колоний на твердых питательных средах.
Требования безопасности. При исследовании следует выполнять правила работы в микробиологической лаборатории.
Подготовка к выполнению исследований. Приготовить десятикратные разведения воды.
23
Тема 2
Выполнение работы.
1.�����������
Внести 1 см3 воды в пустую стерильную чашку Петри и залить 8–10 см3 расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, тщательно перемешать. Инкубировать при 37 °С 24 часа, подсчитать общее число колоний и определить микробное число данного образца воды.
2.������������������������������������������������������������������������
Определить количество ОКБ и ТКБ в образцах воды (НВЧ), применяя титрационный (двухэтапный бродильный) метод. Определить коли-титр, коли-индекс.
3.�������������������������������������������������������������������
Определить количество ОКБ и ТКБ методом мембранной фильтрации. Промикроскопировать окрашенные по Граму мазки лактозоположительных колоний,
чтобы подтвердить правильность сделанного вывода. Определить коли-индекс и рассчитать коли-титр. Сравнить результаты, полученные двумя методами.
4.�����������������������������������������������������������������������
Определить перфрингенс-титр воды методом прямого посева в среду Вильсона-Блера.
5.�������������������������������������������������������������������������
Для выявления энтерококков в воде после предварительного выдерживания ее
при 60 °С в течение 15 мин высеять глубинным методом на молочно-ингибиторную
среду с ТТХ. Инкубировать при 37 °С, наблюдать изменения среды, подсчитать число колоний, характерных для энтерококков. Промикроскопировать окрашенные по
Граму мазки из этих колоний, чтобы подтвердить правильность сделанного вывода.
Определить число энтерококков в данном образце воды.
6.�����������������������������������������������
Провести качественный анализ воды на коли-фаги.
7.��������������������������������������������������������������������������
Сделать выводы о соответствии качества воды нормативам (таблицы 2.3, 2.4).
8.�������������������������������������������������������������������
Измерения повторить для всех проб, результаты внести в таблицу 2.5.
Таблица 2.3 – Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого
водоснабжения [18]
Наименование показателя
Единица измерения
Норматив
Термотолерантные колиформные бактерии Число бактерий в 100 см3
Отсутствие
Общие колиформные бактерии
Число бактерий в 100 см3
Отсутствие
Общее микробное число
Число образующих колонии бактерий в 1 см
Не более 50
Коли-фаги
Споры сульфитредуцирующих
клостридий
Цисты лямблий
Число бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 100 см3
Отсутствие
Число спор в 20 см3
Отсутствие
Число цист в 50 дм3
Отсутствие
3
Таблица 2.4 – Гигиенические нормативы питьевой воды в источниках нецентрализованного
питьевого водоснабжения населения [3]
Общие колиформные бактерии
Число бактерий в 100 см3
Отсутствие
Общее микробное число
Число образующих колонии микробов в 1 см3
100
Термотолерантные колиформные
бактерии
Число бактерий в 100 см3
Отсутствие
Коли-фаги
Число бляшкообразующих единиц в 100 см3
Отсутствие
Коли-индекс
Число БГКП в 1000 см3
–
Таблица 2.5 – Учет результатов работы
Проба воды
Проба №1
Проба №2
Проба №3
24
Общее микробное
число
Коли-титр
Колииндекс
Перфрингенститр
Число
энтерококков
Количество
колифагов
Санитарно-микробиологическое исследование почвы
Материал для самоконтроля
1.�����������������������������������������������������
Качественный и количественный состав микрофлоры воды.
2.��������������������������������������������������������������
Правила отбора воды для санитарно-микробиологического анализа.
3.���������������������������������������
Микробное число воды и его определение.
4.��������������������������������������������
Санитарно-показательные микроорганизмы воды.
5.�������������������������������������������
Определение коли-титра и коли-индекса воды.
6.�����������������������������������������������������������������������������
Определение численности энтерококков и сульфитредуцирующих клостридий в воде.
7.������������������������������������������
Определение численности коли-фагов в воде.
ТЕМА 3
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ
Почва – главный резервуар и естественная среда обитания микроорганизмов,
принимающих участие в процессах ее формирования и самоочищения, а также в
круговороте веществ (азота, углерода, серы, железа) в природе. Помимо неорганических веществ, почва состоит из органических соединений, образующихся в результате
гибели и разложения живых существ. Микроорганизмы почвы обитают в водных и
коллоидных пленках, обволакивающих почвенные части­цы.
Качественный состав микрофлоры почвы очень разнообразен: множество видов
спорообразующих бактерий, актиномицетов, микоплазм, спирохет, архебактерий,
простейших, цианобактерий, грибов, вирусов. Состав и соотношение между различными группами микроорганизмов изменяется в зависимости от вида почвы, способов
ее обработки, содержания органических веществ, влаги, от климатических условий
и многих других причин. На состав микрофлоры почвы влияет деятельность человека; в частности, регулярное перекапывание почвы отрица­тельно сказывается на сложившихся биоценозах, особенно легких почв (за счет гибели анаэробных бактерий).
Существенный вред микробным сообществам наносит загрязнение почвы отходами,
содержащими токсические продукты. На состав микрофлоры неблагоприятно влияет регулярное попадание в почву выделений человека и животных, способствующее
избыточному размножению отдельных групп микроорганизмов.
Микроорганизмы в почве находятся в сложном биоценозе, характеризующемся
различными взаимоотношениями как между собой, так и с растениями. В околокорневой зоне растений бактерий особенно много: они образуют зону интенсивного размножения и повышенной активности, называемой ризосферой. Микрофлора
ризосферной зоны почвы отличается специфичностью для каждого вида растений.
Микроорганизмы обладают положительным хемотаксисом в отношении корневых
выделений растений и, участвуя в процессах минерализации органических соединений (накапливающихся отмерших клеток корней), обеспечивают растения легкоусвояемыми минеральными веществами, веществами типа витаминов и ауксинов, способствующих активизации метаболизма растений.
Количество микроорганизмов в почве достигает нескольких миллиардов в 1 г.
Больше всего их в унавоженной почве и почве, подвергающейся обработке (пахоте и
аэрации), – до 4,8–5,2 млрд, в песках – 0,9–1,2 млрд. Живая масса микроорганизмов в
почве на 1 га в среднем составляет около 1 000 кг.
Распределение микроорганизмов в почве неравномерно. На поверхности и в слое
толщиной 1–2 мм относительно мало микробов, несмотря на постоянное обсеменение почвы, что объясняется губительным действием ультрафиолетовых лучей солнца
и высушивания. Наиболее обильна микрофлора на глубине 10������������������������
–�����������������������
20 см. В этом слое протекают основные биохимические процессы превращения органических веществ, обусловленные жизнедеятельностью разнообразных микроорганизмов, последовательно
сменяющих друг друга. В более глубоких почвенных слоях флора становится скудной и
на глубине 4–5 м микроорганизмы обнаруживаются в очень малых количествах. Вода,
получаемая из артезианских скважин, практически стерильна, что можно объяснить
25
Тема 3
фильтрационными свойствами почвенных комочков и отсутствием необходимых органических соединений для питания бактерий.
С выделениями человека и животных, с различными хозяйственно-бытовыми и
промышленными отходами в почву поступает громадное количество разнообразных
микроорганизмов. Многие из представителей нормальной микрофлоры человека,
попадая в почву, вступают в ее биоценоз, участвуют в биохимических процессах, а отдельные виды бактерий остаются постоянными обитателями почвы. Поэтому трудно
строго разделить микрофлору почвы на постоянную и временно обитающую в ней.
Так, в фекалиях человека обнаружено более 60 видов микроорганизмов, относящихся
к 8–10 различным семействам. Преобладающей флорой являются анаэробы (до 96 %
от всех видов): бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды; в меньшем количестве
встречаются микроорганизмы p����
.���
p��. Escherichia��
�������������, ��������������
Enterococcus��, ���������
Proteus��, �������������
Clostridium��, грибы
p��. Candida��
���������, и др. Биологическое загрязнение почвы особенно велико на территориях,
где могут скапливаться органические отходы (например, бойни и т.д.), на хозяйственных дворах, в животноводческих комплексах, на пляжах и прилегающих к ним участках. Со сточными водами микроорганизмы попадают в иловые осадки, а затем при
использовании недостаточно обеззараженных иловых осадков и сточных вод на полях
орошения может происходить инфицирование почвы, а затем ягодных культур и овощей, выращиваемых на таких полях. Бактерии, адсорбируясь на поверхности частиц
и осадков сточных вод, могут некоторое время сохранять свою жизнедеятельность и
вирулентность.
В отдельных случаях (при неправильной организации сбора сельскохозяйственного сырья, нарушении режимов хранения и т.п.) сырье, используемое для производства
продуктов питания, может быть контаминированным микрофлорой почвы. Поэтому
очень важно изучать качественный состав микроорганизмов почвы, их физиологобиохимические свойства, способы их обезвреживания.
Знание микрофлоры почвы и тех условий, в которых протекает ее жизнедеятельность, необходимо для правильной оценки санитарно-микробиологических исследований не только собственно почвы, но и объектов, контактирующих (прямо или косвенно) с ней.
Патогенные микроорганизмы, встречающиеся в почве, могут быть разделены на
три группы. К первой группе относится небольшое количество микроорганизмов, постоянно обитающих в почве. Среди них особенное внимание заслуживают клостридии ботулизма (Clostridium� ���������
botulinum), которые попадают в почву с испражнениями
человека и животных. Образуя эндоспоры, бактерии остаются в почве неопределенно
долго. Об этом следует всегда помнить при консервировании (особенно домашнем)
всех овощей, грибов и других продуктов, которые могут содержать остатки земли, а,
следовательно, и споры.
Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (бациллы сибирской язвы – Bacillus� anthracis��
�����������, клостридии столбняка – Clostridium� ��������
tetani��, газовой
гангрены – Cl��. perfringens��
�������������, Cl��
����. novyi���
��������
), которые попадают в почву с фекалиями человека и
животных, другими выделениями, а также с трупами погибших животных. Почва для
них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях клостридии могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время. Например,
споры бациллы сибирской язвы обнаруживаются в почве лугов и выпасов, загрязненных спорами возбудителя через десятки лет, причем В. anthracis�
���������� оказались способными
вегетировать в почве. Вегетация микроба в почве осуществляется при температуре не
ниже 12 °С, достаточной влажности и наличии гумуса и микроэлементов.
В третью группу включены патогенные неспорообразующие микроорганизмы,
попадающие в почву с выделениями человека и животных и сохраняющиеся в течение нескольких недель или месяцев. Все эти микроорганизмы – сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, бруцеллы, микобактерии, лептоспиры, возбудители сапа и др. не образуют спор и поэтому быстро гибнут в результате воздействия различных физических
и биологических факторов.
В составе микрофлоры почвы принято выделять физиологические группы микроорганизмов, участвующие в различных процессах постепенного разложения органических веществ: протеолитические, липолитические, амилолитические. Среди этих
26
Санитарно-микробиологическое исследование почвы
микроорганизмов большую роль в порче пищевых продуктов (преимущественно белковых) играют аммонификаторы.
Особенное влияние на отмирание патогенных микроорганизмов оказывают антагонистические свойства представителей микрофлоры почвы. Именно на последнем
свойстве микрофлоры основаны работы, направленные на повышение антибиотических свойств почвы (озеленение травами территорий населенных мест, способствующее размножению антагонистов-актиномицетов), улучшающие антибактериальные
свойства и повышающие активность процесса самоочищения почвы.
Патогенные микроорганизмы и представители нормальной микрофлоры, в частности р. Escherichia��, находясь в окружающей среде, где условия их существования
резко меняются, нередко изменяют свои свойства. Гибель бактерий группы кишечной палочки и некоторых сапрофитных бактерий предшествует усилению процесса
нитрификации – конечному этапу разложения органических веществ. Показателем
активности самоочищения почвы может считаться увеличение микрофлоры, участвующей в процессе нитрификации.
Таким образом, естественные процессы, протекающие в почве под влиянием ее
микрофлоры, обуславливают самоочищение почвы от попавших в нее микроорганизмов, обезвреживание и уничтожение отбросов и нечистот. При правильном управлении этими процессами опасность передачи инфекционных болезней через почву
может быть сведена к минимуму.
Наряду с положительной ролью микрофлоры почвы в синтезе и минерализации
органических веществ, необходимо отметить те отрицательные последствия, которые наносят микроорганизмы почвы народному хозяйству, разрушая строительные
конструкции, подвергая порче сельскохозяйственную продукцию. Поэтому при производстве пищевых продуктов очень важно не допускать попадания почвенной микрофлоры на сырье и продукцию на любом этапе производственного процесса.
Микробиологическое исследование почвы является важным звеном в ее санитарной оценке.
Задачами санитарно-микробиологического исследования почвы являются обнаружение и предотвращение распространения возбудителей инфекционных заболеваний. Эти мероприятия складываются из нескольких этапов, а именно:
1. Предупредительный надзор. Его проводят в следующих случаях: 1) при планировке, строительстве и реконструкции вновь заселяемых участков и населенных мест;
2) при выборе участков для строительства детских дошкольных учреждений, пионерских лагерей, санаториев и т.д.; 3) при строительстве водохранилищ; 4) при решении
вопросов водоснабжения и канализации населенных территорий; 5) при санитарной
оценке земли на полях орошения, где используются навоз, компосты, стоки животноводческих комплексов; 6) при определении санитарного состояния почвы, загрязняемой различными ядохимикатами; 7) при санитарной оценке пляжей, мест коллективного отдыха.
2. Текущий санитарный надзор осуществляется: 1) при оценке санитарного состояния поверхностных слоев почвы для установления степени влияния биологической
контаминации на способность почвы к самоочищению; 2) при контроле за почвенными и биотермическими методами обезвреживания сточных вод и отбросов; 3) по
эпидемическим показаниям для выяснения возможного пути передачи инфекционной болезни через почву, сроков выживаемости в ней патогенных микроорганизмов,
а также возможности заражения воды (открытых водоемов и грунтовых вод), овощей
(выращиваемых на орошаемых землях).
В зависимости от поставленной цели санитарно-микробиологическое исследование почвы может быть проведено в виде краткого или полного анализа.
Краткий анализ рекомендуется при осуществлении текущего санитарного надзора, он включает определение: 1) индекса бактерий группы кишечных палочек; 2) общего числа сапрофитных бактерий; 3) титра анаэробов Clostridium� ������������
perfringens� и количества
термофильных бактерий, определяющих характер контаминации (навозом, фекалиями, сточной жидкостью, компостом); 4) численности нитрифицирующих бактерий.
В полный санитарно-микробиологический анализ, проводимый при предупредительном санитарном надзоре, входят дополнительные исследования, которые опре27
Тема 3
деляются конкретными задачами. В полный анализ может включаться определение
численности и процентного содержания спор (от общего количества микроорганизмов), количество актиномицетов, грибов, целлюлозоразлагающих микроорганизмов,
основных групп почвенного микробиоценоза. По эпидемическим показаниям проводятся обнаружение и индикация патогенных микроорганизмов – сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, бацилл сибирской язвы.
3.1. Отбор, хранение и транспортировка проб
Изучение микрофлоры почвы дает надежные результаты только в том случае,
если отбор проб проводится правильно. Перед взятием образцов следует сделать
описание местности, в котором указываются характер рельефа, растительность, климат, наличие канализации, сведения о применяемой агротехнике и т.д. При обосновании выбора участка для взятия проб санитарный врач составляет схематический
план обследуемой территории, определяет местонахождение источника загрязнения
(туалеты общественного пользования, выгребные ямы, контейнеры с мусором и пр.).
При исследовании территории в 100 м2 выделяют два участка по 25 м2: один – вблизи источника загрязнения и второй (контрольный) – вдали.
Образцы почвы забираются в 5 точках – по типу конверта: 4 – по углам участка и
1 – в центре. Взятые пробы массой по 200–300 г перемешивают в стерильной посуде и
затем берут средний образец, который помещают в стерильный сосуд с ватно-марлевой пробкой (или пергаментный пакет). Объем образца почвы должен быть не менее
300 г, что необходимо для поддержания определенной влажности в образце при его
транспортировке. При взятии проб с поверхностных слоев земли снимают лопатой
пласт почвы, затем с боковой, отвесной поверхности фламбированным ножом срезают землю толщиной 1–1,5 см, нож снова прожигают и из глубины срезанного участка
набирают образец почвы. Образцы с пахотных почв берут на всю глубину пахотного
слоя. Из глубины слоев пробы почвы забирают буром Некрасова, представляющим
собой штангу с рукояткой, которая служит для вращения бура. В нижней рабочей части бура имеется коробка для забора почвы. Во время бурения полость коробки закрыта, при достижении намеченного расстояния бур поворачивается в обратную сторону,
полость открывается и заполняется почвой. С помощью бура можно брать пробы с
глубины до 3 м. Взятые пробы почвы помещают в стерильную посуду, маркируют и
снабжают сопроводительным документом, в котором указывают номер образца, место и глубину взятия, дату отбора пробы. Обработку проб желательно проводить в
день исследования, хранение допускается в течение 24 ч при температуре 4–5 °С.
3.2. Подготовка проб почвы
Образцы почвы освобождают от крупных включений: камней, щебня, осколков
стекол, корней, листьев растений. Затем помещают в стерильную фарфоровую ступку,
просеивают через стерильное сито с диаметром пор 3 мм и забирают навески для приготовления почвенной суспензии. В зависимости от цели исследования навеска может
быть различной: 1–30 г для определения санитарно-показательных микроорганизмов,
1–10 г для учета почвенных микроорганизмов, 50–60 г для обнаружения патогенных
энтеробактерий.
Навеску почвы высыпают в стерильную колбу и заливают стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10. Полученную почвенную суспензию встряхивают
в течение 10–15 мин на качалке с последующим отстаиванием в течение 2–3 мин. С
помощью такой обработки удается извлечь микроорганизмы из комочков земли и
с поверхности почвенных частиц. Из первого разведения (1:10) почвенной суспензии
готовят ряд последующих 10-кратных разведений: от 1:10 до 1:1 000 при исследовании
чистых почв и до 1:1 000 000 и более – при исследовании сильно загрязненных почв.
3.3. Определение общей численности сапрофитных бактерий
Общее число сапрофитных бактерий определяется количеством микроорганизмов, обнаруживаемых в 1 г исследуемой почвы. Этот показатель имеет относитель28
Санитарно-микробиологическое исследование почвы
ное значение, так как свидетельствует о биологическом состоянии почвы в момент
исследования. Санитарное значение численности сапрофитных бактерий учитывается в комплексе с другими санитарно-микробиологическими показателями, исходя из
особенностей исследуемой почвы.
Для определения общей численности почвенных сапрофитов могут быть использованы два метода: посев на плотные питательные среды и метод прямой микроскопии.
Посев почвенной суспензии производят на МПА глубинным способом. Разведения
выбирают с учетом загрязненности почвы. Посевы инкубируют при 28–30 °С в течение
72 ч и подсчитывают количество выросших колоний. Для подсчета берут такие разведения почвенной суспензии, при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний.
Если вырастает более 150 колоний, то ведется счет на 1/4 площади чашки с последующим перерасчетом на всю площадь.
Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках, выводят среднее арифметическое
и затем определяют число колоний на 1 г почвы (с учетом разведений) по формуле:
б×в
а=
,
г
где а – количество клеток в 1 г почвы; б – среднее количество колоний на чашке; в – разведение, из которого сделан посев; г – количество суспензии в см3, взятой для посева.
Метод прямой микроскопии почвы является очень трудоемким и требует специальной аппаратуры. Чаще всего пользуются методом капилляроскопии по Б.В. Перфильеву и Д.Г. Габе. Для микроскопии к 1 см3 почвенной суспензии в разведении 1:10
добавляют 1–2 капли 1 % раствора акридинового оранжевого и затем помещают каплю суспензии в специальную капиллярную камеру. Капилляр кладут на предметное
стекло и фиксируют парафином. Подсчет микроорганизмов ведется с помощью люминесцентного микроскопа. Последующим перерасчетом устанавливается количество микроорганизмов в 1 г почвы.
Определение общего микробного числа (ОМЧ) почвы и количества почвенных бацилл ведут путем подсчета колоний, вырастающих на МПА при 37 °С в течение 24 ч.
Определение термофильных бактерий. Степень фекального загрязнения почвы
можно определить по количеству термофильных бактерий, температурный оптимум
развития которых равен 58–60 °С. Термофилы представлены в основном спорообразующими грамположительными бациллами и актиномицетами, которые активно
размножаются в компостных кучах, навозе. Поэтому можно заключить, что почвы, в
которых обнаруживается большое количество эшерихий и термофилов, были удобрены навозом или компостом. Почва, содержащая много эшерихий и незначительное
количество термофилов, считается загрязненной фекалиями, так как флора кишечника человека и животных крайне бедна термофилами. Термофильные микроорганизмы не свойственны незагрязненным почвам. Для обнаружения термофилов делают
поверхностный посев разведений почвенной суспензии от 10-1 до 10-6 на 2–3 параллельные чашки с МПА, разлитые более толстым слоем, чем обычно. Инкубируют при
температуре 60 °С в течение 24 ч. Количество выросших колоний подсчитывают, перерасчет на 1 г почвы ведется, как при определении общей численности сапрофитов.
Определение численности дрожжевых и мицелиальных грибов проводят методом
поверхностного посева: сеют 0,1 см3 соответствующего разведения почвенной суспензии шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды (сусло-агара). Чашки инкубируют при 24 °С в течение 5–7 суток. Количество выросших колоний
подсчитывают, проводят перерасчет на 1 г почвы с учетом разведений и количества
посевного материала.
3.4. Определение численности основных видов
санитарно-показательных микроорганизмов
3.4.1. Определение бактерий группы кишечных палочек. Существует возможность
дифференцированного выбора методики определения БГКП в почве.
Прямой посев почвы. Этот метод применяют для исследования почвы из мест
интенсивного фекального загрязнения. Почва засевается в количестве 0,1 или 0,05 см3
29
Тема 3
суспензии, разведенной от 1:10 до 1:1 000 000, в чашки Петри на среду Эндо. Метод
прямого посева используется и при посеве менее загрязненных почв, в этом случае
берется почвенная суспензия в разведениях от 1:10 до 1:1 000. Посевы выращивают в
термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч. Дальнейшая идентификация выросших колоний ведется по общепринятой методике.
Титрационный метод. Рекомендуется при предполагаемой невысокой степени
фекального загрязнения почвы. Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы во флаконы и пробирки с жидкой питательной средой Кесслера:
10 мл (из разведения 1:10) – в 50 см3 среды, по 1 см3 из последующих разведений – в 9 см3
среды. Посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре 37 °С. При отсутствии во
флаконе и пробирках роста, характеризующегося газообразованием и помутнением,
дается отрицательный ответ на присутствие БГКП. Если в засеянных сосудах обнаруживается рост в виде помутнения среды или помутнения и газообразования, следует
сделать высев в чашки Петри со средой Эндо, инкубировать 24 ч при температуре 37 °С.
Дальнейшей идентификации (аналогично определению БГКП в воде) подвергаются
типичные для Escherichia красные или розовые с металлическим блеском колонии. Результат выражается в коли-индексе (количество БГКП, обнаруженных в 1 г почвы) или
коли-титре.
Метод мембранных фильтров. Метод применяется как ускоренный для определения БГКП в слабозагрязненных почвах. Почвенную суспензию 1:10 центрифугируют
при 2000 об/мин в течение 5 мин для осаждения крупных частиц, затем 5–10 см3 суспензии фильтруют через мембранные фильтры № 3. Дальнейший ход исследования
такой же, как при определении БГКП в воде.
3.4.2. Определение перфрингенс-титра. Присутствие Clostridium� �����������
perfringens в почве указывает на ее фекальное загрязнение и имеет определенное индикаторное значение по отношению к возможному присутствию патогенных клостридий (С. tetani,
С. botulinum), которые также попадают в почву с испражнениями человека и животных. Определение перфрингенс-титра является важным критерием для санитарной
оценки почвы и характеристики процессов самоочищения, так как при фекальном
загрязнении почвы уже через 4–5 месяцев отмечается отмирание E. coli, а C. perfringens
обнаруживаются в титре 0,01 г. Clostridium perfringens имеет санитарно-показательное
значение только в том случае, если титр его определяют в комплексе с коли-титром
и другими показателями. Давность фекального загрязнения почвы можно определить также по соотношению количества вегетативных и споровых форм Clostridium�
perfringens.
Предложено несколько методов определения перфрингенс-титра почвы.
Посев почвенной суспензии в среду Вильсона-Блера. Из приготовленных разведений почвенной суспензии от 10-1 до 10-6 переносят по 1 см3 в два параллельных ряда
стерильных пробирок. Один ряд пробирок с разведениями суспензии прогревают при
температуре 80 °С в течение 15 мин (для подавления размножения сопутствующей вегетативной микрофлоры почвы). Затем в пробирки обоих рядов вносят по 9–10 см3 среды
Вильсона-Блера, приготовленной непосредственно перед употреблением. Суспензию
перемешивают со средой, вращая пробирки между ладонями рук, затем для быстрого
застывания агара и выхода кислорода из среды пробирки помещают под струю холодной
воды. Инкубируют в термостате при температуре 43 °С в течение 24 ч, но уже через 2–3 ч
при положительном результате можно наблюдать в толще агара образование круглых
колоний черного цвета, разрывающих агар в месте газообразования. В мазках, приготовленных из черных колоний, видны характерные грамположительные палочки.
Перфрингенс-титр определяется максимальным разведением почвенной суспензии,
при посеве которой развиваются колонии.
3.5. Определение нитрифицирующих бактерий
Одним из показателей процесса самоочищения почвы являются нитрифицирующие бактерии (Nitrosomonas��, �����������
Nitrobacter), участвующие в превращении аммонийных соединений в азотистую и азотную кислоты. Титр нитрификаторов определяют посевом
30
Санитарно-микробиологическое исследование почвы
разведений почвенной суспензии от 1:100 до 1:10 000 во флаконы с жидкой минеральной средой Виноградского. В качестве контроля в термостат помещают два флакона с
незасеянной средой. Посевы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14–15 сут. На
5–7-й день можно проверить образование азотистой или азотной кислоты с помощью
качественной пробы с дифениламином. При добавлении к капле среды (помещенной
на стеклянную пластинку) нескольких капель раствора дифениламина (в концентрированной серной кислоте) появляется синее окрашивание, что указывает на присутствие
нитратов. Среда в контрольных флаконах не должна давать изменения окраски.
3.6. Определение в почве сальмонелл и шигелл
Загрязнение почвы сальмонеллами происходит в результате непосредственного попадания фекалий, преимущественно животных, в меньшей степени – человека.
Практически у всех домашних и многих диких животных сальмонеллы обнаружены
как комменсалы и как возбудители острых сальмонеллезов. Шигеллы попадают в почву с испражнениями человека.
Все представители рода Salmonella� являются потенциально патогенными для человека, вызывая заболевания, разнообразные по клинической картине (от тяжелых
сальмонеллезов до бактерионосительства) и продолжительности. Часто заболевание
протекает легко, что приводит к быстрому выздоровлению, поэтому больные не обращаются к врачу, оставаясь вне поля зрения санитарно-эпидемиологической службы и становясь возможными носителями сальмонелл. Конечно, человек выделяет
бактерий значительно меньше по сравнению с животными, но выделяемые им сальмонеллы адаптированы к его организму и потому эпидемически более опасны. Для
определения сальмонелл в почве могут быть использованы два метода: посев в среду
накопления и метод коагуляции с последующим высевом на дифференциально-диагностические среды.
Первый метод более простой: для обнаружения сальмонелл в подготовленную
почвенную суспензию вносят ингредиенты магниевой среды «М» (из расчета объема
суспензии), инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–20 ч. Затем делают высев
на висмут-сульфитную среду (обычно 3–5 чашек). Идентификация выросших колоний проводится по методике определения сальмонелл. Шигеллы обнаруживают параллельно – посевом в селенитовую среду.
При выделении сальмонелл из почвы методом коагуляции и центрифугирования
по Фикеру к 500 см3 почвенной суспензии добавляют 1,7 см3 10 %-го стерильного раствора сульфата железа и 2 см3 10 %-го стерильного раствора бикарбоната натрия (для
подщелачивания, которое способствует коагуляции). Суспензию тщательно взбалтывают и ставят в холодильник на 1 ч для образования хлопьев, прозрачную жидкость
сливают, а осадок и надосадочную жидкость с хлопьями переносят в центрифужные
пробирки и центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин. После центрифугирования
жидкость над осадком сливают, а осадок обрабатывают 1 см3 25 %-го раствора виннокислого калия (добавляя по каплям до полного растворения осадка) и делают высев на
чашки с висмут-сульфитным агаром и средой Плоскирева.
Для обнаружения сальмонелл и шигелл можно непосредственно исходную почвенную суспензию фильтровать через мембранные фильтры, затем их переносят на
дифференциально-диагностические среды для подращивания.
3.7. Санитарно-микробиологическая оценка почвы
Оценку результатов санитарно-микробиологического исследования почвы проводят
путем сопоставления данных, полученных на опытных и контрольных участках почв одинакового состава, расположенных в непосредственной территориальной близости. Для
оценки интенсивности биологической нагрузки на почву используют такие показатели,
как титры или индексы БГКП, клостридий, энтерококков, а для оценки эпидемической
опасности почвы – патогенных энтеробактерий и энтеровирусов.
Большая численность почвенной сапрофитной микрофлоры свидетельствует об
органическом загрязнении почвы, при микробной контаминации преобладают сани31
Тема 3
тарно-показательные микроорганизмы. В естественных условиях, как правило, микробное и органическое загрязнение происходит одновременно.
Таблица 3.1 – Ориентировочная оценка санитарного состояния подзолистых
почв по микробному числу [25]
Микробное число, КОЕ × 106/г
Виды почв
в незагрязненных почвах
в загрязненных почвах
Домовладений
меньше 2
больше 2
Садов и парков
меньше 2
больше 2
Территорий промышленных предприятий
меньше 2
больше 2
меньше 1,5
больше 1,5
Полей
Таблица 3.2 – Оценка санитарного состояния почвы по микробиологическим
показателям [25]
Категории почвы
Титр, г
Клостридии
Индекс термофильных
микроорганизмов,
КОЕ/г
≥ 0,1
102 – 103
Чистая
≥ 1,0
Нитрифицирующие
бактерии
≥ 0,1
Загрязненная
≤ 0,9
0,09 – 0,001
0,009 – 0,0001
103 – 105
≤ 0,009
≤ 0,0009
≤ 0,00009
105 – 4×106
Сильно загрязненная
БГКП
Таблица 3.3 – Оценка эпидемической опасности почв населенных пунктов [25]
Показатели, КОЕ / г почвы
Объекты
Зоны повышенного риска:
территории детских дошкольных учреждений, школ,
зон рекреации, огородов,
выгульных площадок
Зоны санитарной охраны
водоемов
Санитарно-защитные зоны
Категория загрязнения
Кишечные
палочки
Энтерококки
Патогенные энтеробактерии
Энтеровирусы
Чистая
1–9
1–9
–
–
Загрязнённая
10�������
и выше
10�������
и выше
Наличие
Наличие
Чистая
1–9
1–9
1–9
–
Загрязненная
10�������
и выше
10�������
и выше
10�������
и выше
Наличие
Чистая
1 – 99
1 – 99
–
Загрязненная
100�������
и выше
100�������
и выше
Наличие
Лабораторная работа
«Санитарно-микробиологическое исследование почвы»
Цель: провести определение микробного числа, численности санитарно-показательных микроорганизмов в почве.
Средства исследования, вспомогательные устройства, реактивы и оборудование: весы аналитические, пестики, ступки с резиновыми наконечниками, стерильные
чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см3, простерилизованная вода в пробирках по
9 см3 и в колбах по 99 см3, МПА, среда Эндо, среда Кесслера, среда Вильсона-Блера,
сусло-агар, водяная баня, термостат, предметные стекла, набор красителей, спиртовка,
пробы почвы:
• проба № 1 – почва парков (200 г),
• проба № 2 – почва полей (200 г),
• проба № 3 – почва территорий промышленных предприятий (200 г).
32
Санитарно-микробиологическое исследование почвы
Метод исследования. Метод основан на определении числа выросших микробных колоний на твердых питательных средах.
Требования безопасности. При исследовании следует выполнять правила работы в микробиологической лаборатории.
Подготовка к выполнению исследований. Перед посевом каждый образец почвы в лаборатории просеять через стерильное сито с диаметром ячеек 3 мм (или почву
высыпать на часовое стекло, протертое спиртом, и освободить от посторонних включений). Увлажнить почву до пастообразного состояния и растереть в течение 5 мин
в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой
перчатке. Навеску подготовленной почвы в 10 г перенести в колбу с 99 см3 стерильной
водопроводной воды и встряхивать на качалке 15 мин. Из почвенной суспензии после
2–3-минутного отстаивания приготовить 4 десятикратных разведения для последующего посева.
Выполнение работы.
1.��������������
Внести по 1 см3 почвенной суспензии из разведений 10-2–10-5 в 3 ряда пустых стерильных чашек Петри и залить 10 см3 расплавленного и охлажденного до 45 °С МПА,
тщательно перемешать. Инкубировать при 28 °С, 37 °С и 60 °С 24 часа, подсчитать
общее число колоний и определить общую численность сапрофитов данного образца
почвы, микробное число и численность термофилов.
2.�������������������������������������������������������������������������
Определить коли-титр данного образца почвы, применяя двухэтапный бродильный метод. Внести исследуемую воду в среду Кесслера, как это указано выше, выращивать при 37 °С 24 часа. Затем из всех проб сделать высевы на среду Эндо. Выращивать
при 37 °С 24 часа. Наблюдать изменения среды. Сделать мазки, окрасить их по Граму.
Определить коли-титр и коли-индекс исследованного образца почвы.
3.�������������������������������������������
Для выявления дрожжей и мицелиальных грибов высеять почвенную суспензию поверхностным методом на сусло-агар, подкисленный молочной кислотой (4 см3
на 1 л среды). Инкубировать при 28 °С, подсчитать число характерных колоний. Промикроскопировать препараты «раздавленная капля» из этих колоний. Определить
число дрожжевых и мицелиальных грибов в данном образце почвы.
4.������������������������������������������������������������������������
Определить число спор сульфитредуцирующих клостридий в почве посевом на
среду Вильсона-Блера, как это указано выше. Выращивать при 44 °С в течение 16–18 ч.
Подсчитать количество колоний, характерных для сульфитредуцирующих клостридий.
Промикроскопировать окрашенные по Граму мазки из этих колоний, чтобы подтвердить правильность сделанного вывода. Определить число спор сульфитредуцирующих клостридий в образце почвы.
5.�������������������������������������������������������������������
Измерения повторить для всех проб, результаты внести в таблицу 3.4.
Таблица 3.���������������������������
4 �������������������������
– Учет результатов работы
Проба
почвы
Общее
микробное
число
Число
сапрофитов
Число
термофилов
Число
дрожжей и
грибов
Колититр
Колииндекс
Перфрингенс-титр,
споры
Проба № 1
Проба № 2
Проба № 3
Материал для самоконтроля
1.������������������������������������������������������
Качественный и количественный состав микрофлоры почвы.
2.���������������������������������������������������������������
Правила отбора почвы для санитарно-микробиологического анализа.
3.����������������������������������������
Микробное число почвы и его определение.
4.���������������������������������������������
Санитарно-показательные микроорганизмы почвы.
5.������������������������������������������������
Определение коли-титра и перфрингенс-титра почвы.
6.��������������������������������������������������
Патогенные микроорганизмы, обнаруживаемые в почве.
33
ТЕМА 4
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
КАЧЕСТВА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Пищевые продукты – основной фактор передачи возбудителей бактериальных и
вирусных кишечных инфекций. Особенно опасны как факторы передачи заразного
начала сырое молоко, яйца, салаты, винегреты и другие термически необрабатываемые блюда. В них хорошо размножаются сальмонеллы, шигеллы, стафилококки,
стрептококки, не изменяя при этом вкусовых качеств продуктов. На их долю приходится, в частности, более половины всех случаев пищевых токсикоинфекций у людей.
Не меньшее эпидемиологическое значение в передаче патогенных микробов имеет
мясо животных и птиц. В мясных продуктах обычно обнаруживают энтеробактерии,
фекальные энтерококки, клостридии ботулизма, Bacillus� ������
cereus. Инфицируется мясо
прижизненно (in� vivo)
���� или при забое животных, разделке, транспортировке, хранении и
приготовлении мясных продуктов, когда микробы попадают в них с разделочных досок
и других кухонных предметов, мясорубок и рук микробоносителей. Таким же образом
заражается рыба, крабы, устрицы, в которых могут содержаться холерные и парагемолитические вибрионы. Наконец, длительно хранящиеся продукты часто обсеменяются
сапрофитической гнилостной микрофлорой, вызывающей порчу продуктов.
Характер и интенсивность микробной обсемененности продукта определяется его
физико-химическими свойствами. Так, обычно микробы размножаются в продуктах,
богатых питательными веществами и ростовыми факторами жидкой и полужидкой
консистенции, с нормальным и слабощелочным рН, сладких и полусладких напитках, фаршах и пюре. Плохо выживают в продуктах с очень низкими и высокими значениями рН; медленно развиваются в маринованных, засоленных, копченых, сухих и
порошкообразных. Низкие и очень высокие температуры, которые используются для
консервирования и стерилизации продуктов, неблагоприятно действуют на развитие
микроорганизмов.
Самыми опасными инфекциями, передающимися через продукты, являются ботулизм, сибирская язва, туберкулез, ящур, а интоксикациями – плесневые микотоксины.
Приступая к анализу пищевых продуктов, необходимо представлять, что помимо посторонних (неспецифических) патогенных и гнилостных микробов многие из
них содержат специфическую микрофлору, придающую свойственный им вкусовые
качества и аромат. Например, в приготовлении простокваши, кумыса, творога, сметаны, масла используют молочнокислый и сливочный стрептококки Lactococcus� lactis
������ и
Streptococcus� ��������
cremoris, в изготовлении ацидофилина – Lactobacillus� �����������
acidophilus, для заквашивания кефира – молочнокислые стрептококки и лактобациллы, гидролизующие
лактозу до кислоты, молочные и дрожжеподобные грибы, использующие ее в спиртовом брожении.
Из этого следует, что пищевые продукты – самые сложные объекты санитарномикробиологических исследований. Они проводятся: 1) в плановом порядке – для определения качества сырья, используемого в производстве продуктов питания, и контроля за соблюдением санитарно-гигиенического режима в процессе их изготовления,
транспортировки, хранения и реализации; 2) по эпидемическим показаниям – при
возникновении пищевых токсикоинфекций или вспышек инфекционных заболеваний, которые связывают с употреблением пищевых продуктов.
Качество пищевых продуктов определяют, исследуя в них наличие трех групп
микроорганизмов:
1)���������������������������������������������������������������������
КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов ОМЧ), образующих в течение 72 ч при 30 °С в глубине и на поверхности плотных питательных сред точечные колонии;
2) санитарно-показательных, включающих БГКП, золотистый стафилококк,
В. cereus и сульфитредуцирующие клостридии, которые вызывают пищевые токсикоинфекции;
3)���������������������������������������������������������������
микроорганизмов порчи продуктов (дрожжи, грибы, бактерии рода Proteus).
34
Санитарно-микробиологическое исследование качества пищевых продуктов
4.1. Правила отбора проб
Отбор проб пищевых продуктов производится с помощью стерильных инструментов в стерильную посуду. Объем их определяется нормативно-техническими документами на данный вид продукции. При этом если масса пробы равна массе продукта в потребительской таре, то используют всю упаковку, а если она больше, то
берут несколько упаковок. При их отсутствии прибегают к точечному отбору пробы
из разных частей (мест) продукта. Отбор проб от кусковой продукции массой более
1 000 г ведется с помощью режущих инструментов, а если продукт жидкий или пастообразный, то используют пипетки или металлические половники, которыми его
вначале перемешивают. Из емкостей, оснащенных краном, пробы отбирают после
предварительного его обжигания и слива 1–10 см3 продукта. Сыпучие продукты перед взятием пробы тщательно перемешивают (либо ее составляют из точечных проб).
Пробы замороженных продуктов укладывают в изотермическую тару или обкладывают сухим льдом (температура не должна превышать 15 °С). Скоропортящиеся продукты транспортируют при 5 °С. Микробиологические исследования должны быть
начаты через 4–6 ч от момента их взятия для анализа.
При этом каждый раз в пищевом продукте (исключая молочнокислые, квас и
пиво, имеющие собственную микрофлору) определяют КМАФАнМ, засевая его в питательный агар по 1 мл при глубинном методе или по 0,1–0,2 см3 – при посеве шпателем на поверхность МПА. Общее количество колоний, вырастающих на чашке, должно составлять не менее 15 и не более 300, что требует ориентировочного определения
уровня микробной обсемененности продукта для его разведения.
Установив КМАФАнМ в 1 г или 1 мл продуктов, далее в них выявляют наличие
БГКП или конкретных видов микроорганизмов второй и третьей групп, в частности:
• БГКП и сальмонеллы определяют при оценке качества почти всех важнейших
пищевых продуктов (исключение составляют чай, кофе, макаронные изделия, соленые и маринованные грибы);
• золотистый стафилококк – в мясных продуктах, молоке, рыбе, кремах, тортах;
• сульфитредуцирующие клостридии – в мясных и рыбных продуктах;
• В. cereus
������ – в овощных изделиях, крупах и картофеле, не требующих варки;
• Е. coli
���� – в салатах, заливных и паштетах;
• протей – в меланже, яичном порошке, салатах, студнях, заливных и паштетах,
отварном мясе, отварной и жареной рыбе;
• плесени и дрожжи – в сырах, заквасках, рыбных изделиях, сладостях, кремах,
тортах, специях, пряностях, чае, кофе, майонезе, маргарине, хлебном квасе, других
напитках.
При этом для разных видов продуктов нормируется отсутствие: БГКП – в 0,001–
1,0 г; эшерихий – в 0,1–1,0 г; золотистого стафилококка – в 0,01–1,0 г; сульфитредуцирующих клостридии – в 0,01–0,1 г; В. cereus
������ – в 0,1 г, сальмонелл и иерсиний – в 25 г. Обнаружение в пищевых продуктах протея свидетельствует об их загрязнении гниющими
органическими веществами (Proteus� ��������
vulgaris) или фекалиями (Р. ���������
mirabilis). Продукты, содержащие в 1 г бактерии рода Proteus, выбраковываются.
4.2. Бактериологический анализ молока и молочнокислых продуктов
Молоко – хорошая среда для микроорганизмов. В нем содержатся белки (казеин),
небольшое количество пептона, свободные аминокислоты, жир, лактоза, минеральные соли, витамины (���
A��, ���������������������������������������������
D��������������������������������������������
, Е, С, РР и группы В) и другие соединения.
Свежее молоко при обычных условиях получения содержит несколько тысяч
микроорганизмов в 1 мл, источником которых являются вымя и кожа животных, посуда и аппаратура, воздух и обслуживающий персонал. При соблюдении санитарных
правил в молоке преобладают микрококки, энтерококки и сарцины. Загрязненное
молоко содержит значительное количество бактерий группы кишечной палочки,
маслянокислых (гнилостных) бактерий. Во время хранения изменяются количество
содержащихся в молоке бактерий и соотношение отдельных видов, что выражается
35
Тема 4
в смене нескольких фаз: бактерицидной, смешанной микрофлоры, молочнокислых
бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов, гнилостной микрофлоры.
Микрофлору кисломолочных продуктов можно условно разделить на первичную, включающую микрофлору пастеризованного молока и закваски, и вторичную,
постороннюю, развивающуюся при проведении технологического процесса и хранении. Общее количество микроорганизмов в пастеризованном молоке обычно 50–150
тыс. в 1 см3, что примерно в 20–100 раз меньше, чем клеток, вносимых с заквасками.
Основными пороками кисломолочных продуктов является вспучивание, излишняя кислотность, тягучесть, плесневение, связанных как с нарушением технологического режима сквашивания, так и режима хранения.
При отборе проб после тщательного перемешивания в стерильную колбу наливают 200–500 см3 молока или жидкого молочнокислого продукта с каждой партии и
немедленно приступают к анализу. Твердые молочнокислые продукты (масло, сыр)
для учета численности микроорганизмов берут стерильным щупом из 2–3 мест по
10–15 г и помещают в стерильные банки с притертыми пробками. При исследовании
на мицелиальные грибы делают соскобы с поверхности масла и сыра, особенно с тех
мест, где простым глазом или в лупу виден мицелий гриба.
При микробиологическом анализе молока и молочнокислых продуктов используют установление количества продуктов обмена микроорганизмов (редуктазы), посев на питательную среду и прямой подсчет микроорганизмов под микроскопом.
4.2.1. Проба
�������������������
на редуктазу. В молоке содержатся различные ферменты, в том числе редуктаза – анаэробная дегидрогеназа, катализирующая передачу водорода от
окисляемого субстрата любому ненасыщенному соединению кроме кислорода воздуха. Редуктаза накапливается в молоке главным образом при размножении в нем
микроорганизмов. Поэтому количество ее в молоке — показатель его бактериальной
обсемененности. Обнаруживается редуктаза по обесцвечиванию красителей — метиленового синего, резазурина, трифенилтетралийхлорида (ТТХ).
При редуктазной пробе с метиленовым синим добавляют реактив в молоко, отчего оно окрашивается в синий цвет. Редуктаза восстанавливает метиленовый синий,
переводя его в бесцветную форму. Свеженадоенное молоко восстанавливает метиленовыи синий медленно, с увеличением числа бактерий в молоке скорость восстановления возрастает. По скорости восстановления в молоке метиленового синего можно
примерно определить численность бактерий и степень загрязнения молока. Однако
строгой зависимости между числом бактерий в молоке и временем обесцвечивания в
нем метиленового синего нет, так как каждый вид бактерий выделяет определенное,
неодинаковое количество редуктазы.
Для этого в чистую пробирку наливают 0,5 см3 0,025 %-го раствора метиленового
синего (195 см3 дистиллированной воды и 5 см3 насыщенного раствора краски) и 10 мл
исследуемого молока (предварительно нагретого до 38–40 °С), закрывают резиновой
пробкой. После перемешивания пробирку ставят в водяную баню или термостат при
38–40 °С и наблюдают за обесцвечиванием через 40 мин, 2,5 ч и 3,5 ч. Проба на редуктазу считается законченной, когда наступает полное обесцвечивание молока. Одновременно ставят контроли: а) 10 см3 исследуемого молока + 0,5 см3 дистиллированной
воды; б) кипяченое молоко + 0,5 см3 метиленового синего. Исходя из времени обесцвечивания, выделяют четыре класса качества молока (таблица 4.1).
Таблица 4.1 – Определение качества молока по времени его обесцвечивания [8]
Показатель
Время обесцвечивания
Количество бактерий, × 106 КОЕ/см3
Качество молока
36
Класс
1
2
3
4
более 3,5 ч
3,5 ч
2,5 ч
40 мин
менее 0,5
0,3 – 0,5
0,5 – 4
4 – 20
Высший сорт
Первый сорт
Второй сорт
Несортовое
Санитарно-микробиологическое исследование качества пищевых продуктов
Проба с трифенилтетразолийхлоридом (ТТХ). К 5 мл молока дабавляют 0,5 мл
1 %-го водного раствора ТТХ, перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20 °С). Под действием редуктазы бесцветные соли ТТХ превращаются в формазин, имеющий красную окраску. В зависимости от количества бактерий красное
окрашивание будет появляться через разный промежуток времени:
– при содержании бактерий до 0,5×106 КОЕ/см3 – через 2–3ч;
– (0,5–30)×106 КОЕ/см3 – через 1ч;
– более 30×106 КОЕ/см3 – через 8 мин.
Редуктазная проба с резазурином длится не более 1 ч. В стерильные пробирки
наливают 10 мл анализируемого молока и 1 см3 0,0005 %-го водного раствора резазурина (основной раствор, содержащий 100 мл дистиллированной воды и 0,05 г резазурина, перед работой разводят в 10 раз). Тщательно перемешивают и помещают
на водяную баню при 38–40 °С, изменение окраски учитывают через 20 мин и через
1 ч (таблица 4.2).
Пробирки с молоком, обесцвеченным через 20 мин, убирают, остальные находятся в водяной бане до конца опыта.
Во многих странах официально принята 10-минутная проба с резазурином. Молоко считают непригодным, если за это время исчезает сине-фиолетовое или синестальное окрашивание.
Таблица 4.2 – Классификация молока по редуктазной пробе с применением резазурина
Количество бактерий,
× 106 КОЕ/см3
Продолжительность изменения цвета
Окраска молока
Высший сорт
Менее 0,3
1ч
Сине-стальная
Первый сорт
0,3 – 0,5
1ч
Сиреневая
Второй сорт
0,5 – 4
1ч
Розовая
Несортовое
4 – 20
20 мин
Белая
Качество молока
По европейским стандартам, показатель бактериальной обсемененности в сыром продукте не должен превышать 100 000 КОЕ/см3. В России, согласно новому
ГОСТу Р52054-2003 «Молоко натуральное коровье – сырье. Технические условия»,
для высшего сорта молока ориентировочное количество бактерий составляет до
300 000 КОЕ/см3.
4.2.2. Определение общего количества бактерий молока и молочнокислых продуктов. В зависимости от предполагаемой микробной обсемененности из 2-х последовательных разведений стерильной пипеткой по 1 см3 суспензии вносят в чашки
Петри в двух- и трехкратной повторности и заливают расплавленным и охлажденным
до 45–50 °С МПА. Рекомендуется использовать следующие разведения: молоко и сливки сырые – 10-4–10-5, молоко и сливки пастеризованные – 10-1–10-3. Суспензию с агаром
перемешивают и чашки Петри с посевом помещают на 48 ч в термостат при 37 °С,
подсчитывают выросшие колонии.
Перед исследованием пробу масла расплавляют в банке на водяной бане, нагретой
до 40–50 °С. Из расплавленного масла после тщательного перемешивания стерильной
пипеткой берут 1 см3 и вносят в пробирку с 9 см3 стерильной воды, подогретой до
40 °С. Из полученного таким образом разведения 10-1 готовят все последующие (10-2;
10-3; 10-4; 10-5).
При микробиологическом анализе сыра для приготовления разведения используют измельченную и растертую при подогреве до 45 °С пробу.
4.2.3. Определение коли-титра молочных продуктов. Для выявления кишечной
палочки и определения ее титра в молоке и молочнокислых продуктах используют
газообразующую способность группы бактерий Е. coli����������
��������������
-���������
aerogenes на жидкой среде Кесслера, в состав которой входят бычья желчь и генциановый фиолетовый, подавляющие рост молочнокислых и других грамположительных бактерий.
37
Тема 4
Молоко или молочные продукты вначале разводят в 10-1–10-6. Затем берут 6 пробирок с 5 см3 среды Кесслера и поплавками. В три из них вносят по 1 см3 разведений
10-1–10-3, в остальные – по 0,1 см3 разведений 10-4–10-6. Засеянные пробирки ставят на
48 ч в термостат при температуре 43 °С.
Отсутствие газообразования во всех 6 пробирках указывает на чистоту продукта,
и при этом принято считать, что его коли-титр более 3 см3; при газообразовании в
одной пробирке, засеянной 1 см3 исследуемого продукта, коли-титр равен 3 см3; при
образовании газа более чем в одной пробирке с 1 см3 разведения молока или хотя бы
в одной пробирке с посевом 0,1 см3 коли-титр считается равным 0,3 см3. Такое молоко
непригодно к употреблению. При образовании газа в 6 или 5 пробирках – коли-титр
менее 0,3 см3 (очень загрязненное молоко).
В связи с тем, что в пробах молока могут быть другие бактерии, сбраживающие
лактозу с образованием газа, точно установить наличие кишечной палочки можно,
сделав посев из забродившей жидкости на среду Эндо. Чашки инкубируют в термостате 24 ч при 37 °С. Если бродильная проба положительная и культура на среде Эндо
дает ярко-красные колонии, то в исследуемом субстрате присутствует кишечная палочка. Для полной идентификации нужны дополнительные данные: об отсутствии
разложения желатины, об отсутствии газа и кислоты при выращивании на сахарозе и
об образовании скатола и индола в пептоном бульоне.
На основании определения титра кишечной палочки качество молока подразделяют на классы (таблица 4.3).
Таблица 4.3 – Определение качества молока по коли-титру
Показатель
Коли-титр
Качество молока
Класс
1
2
3
4
более 3 см3
3 см3
0,3 см3
менее 0,3 см3
Высший сорт
Первый сорт
Второй сорт
Несортовое
4.2.4. Определение количества спор лактатсбраживающих анаэробных бактерий
в молоке и молочнокислых продуктах. При оценке качества молока необходимо определить в нем количество спор лактатсбраживающих анаэробных бактерий. Иногда
при нормальной кислотности молоко может быть обильно обсеменено спорами маслянокислых бактерий, которые выдерживают пастеризацию. Развитие лактатсбраживающих маслянокислых бактерий особенно опасно в сыре, так как они вызывают его
вспучивание на поздних этапах созревания вследствие выделения большого количества газов СО2 и Н2. Образование масляной кислоты придает сыру прогорклый вкус и
делает его абсолютно непригодным для реализации или резко снижает его качество.
Проводят посев 1 см3 исследуемого образца молока (молочнокислых продуктов)
и его разведений в пробирки с 10 см3 мясо-пептонно-лактатной среды (или со стерильным цельным молоком, или гидролизованным молоком с 1 % глюкозы), прокипяченной перед анализом в течение 30 мин и охлажденной до 40 °С. Каждый образец
исследуемого молока из выбранных разведений (обычно из 10-2 – 10-4) засевают в две
пробирки со средой, внося посевной материал на дно пробирки и не взбалтывая ее
содержимое. После посева пробирки нагревают на водяной бане до 85 °С в течение
10 мин. Сверху посевы заливают слоем в 1,5–2 см расплавленного и предварительно
охлажденного до 45 °С агара. Пробирки помещают в термостат при 30 °С на 3 суток.
Наличие спор анаэробных лактатсбраживающих бактерий определяют по разрывам агарового столбика вследствие выделения газа, по изменению красного цвета питательной среды на соломенно-желтый, запаху масляной кислоты и наличию в
мазке спорообразующих бактерий, имеющих форму барабанных палочек и дающих
с йодом положительную пробу на гранулезу. Наиболее вероятное число спор вычисляют по количеству пробирок, в которых они дали рост (таблица 4.4).
Результаты опытов, в которых количество пробирок с видимыми признаками роста маслянокислых бактерий при посевах 1; 0,1; 0,01 см3 молока, составляет 002, 012, 021,
022, 102, 112, 122, 202, не могут быть использованы для расчета, так как в 95 % случаев
38
Санитарно-микробиологическое исследование качества пищевых продуктов
они вызваны несовершенной техникой приготовления разведений или присутствием
антибактериальных веществ. При таких результатах исследование молока надо повторить.
Таблица 4.4 – Определение вероятного числа спор лактатсбраживающих анаэробных
бактерий в молоке
Количество пробирок с положительными результатами при разных
объемах посевного материала
1 см3
0,1 см3
0,01 см3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Наиболее
вероятное
число спор в
1 см3
Количество пробирок с положительными результатами при разных
объемах посевного материала
Наиболее вероятное число
спор в 1 см3
1 см3
0,1 см3
0,01 см3
0,0
1
1
2
—
1
0,5
1
2
0
2,0
2
—
1
2
1
3,0
1
0
0,5
1
2
2
—
1
1
0,9
2
0
0
2,5
0
1
2
—
2
0
1
5,0
0
2
0
0,9
2
0
2
—
0
2
1
—
2
1
0
6,0
0
2
2
—
2
1
1
1,3
1
0
0
0,6
2
1
2
20,0
1
0
1
1,2
2
2
0
25,0
1
0
2
—
2
2
1
70,0
1
1
0
1,3
2
2
2
110,0 и более
1
1
1
0,2
4.2.5. Определение протеолитических (гнилостных) бактерий в молоке и молочнокислых продуктах. Протеолитические бактерии учитывают при посеве из 10-3–10-4
разведений (при необходимости из других) на молочный агар в чашках. Для определения их количества чашки с посевами помещают в термостат при 30 °С на 48 ч. Протеолитические бактерии вокруг колоний образуют зоны просветления (протеолиза)
Подсчитывают число колоний, умножают на разведение и определяют обсемененность 1 см3 или 1 г продукта.
4.2.6. Определение дрожжей и мицелиальных грибов в молоке и молочнокислых
продуктах. Для определения количества дрожжей и мицелиальных грибов из пробы
молока (молочнокислых продуктов) и десятикратных разведений производят посев в
чашки Петри с сусло-агаром (рН 4,5), выдерживают при 28–30 °С на 72 ч. Подсчитывают
отдельно колонии дрожжей и мицелиальных грибов.
4.2.7. Микроскопические исследования. Для микроскопического исследования
кислосливочное масло плавят в стеклянном стакане на водяной бане при температуре 40 °С, перемешивают, наливают в центрифужную пробирку и центрифугируют
10 мин. Верхний слой сливают, из осадка готовят препарат. Мазок прогревают на
пламени горелки и обезжиривают, прикладывая к неостывшему мазку фильтровальную бумагу. Окрашивают метиленовым синим в течение 2–3 мин. В свежем кислосливочном масле присутствуют молочнокислые лактококки, в несвежем масле – наряду с
молочнокислыми бактериями встречаются дрожжи, плесневые грибы и гнилостные
бактерии.
При изучении микрофлоры сыра можно также использовать метод отпечатков,
дающий возможность охарактеризовать естественное расположение микроорганизмов в сыре. Сначала у взятого для исследования свежего сыра фламбированным ножом срезают то место, где будет взята проба. Затем срезают тонкий кусочек сыра,
кладут его между двумя сухими чистыми предметными стеклами и сдавливают ими.
Затем стекла осторожно разъединяют и сыр удаляют. Полученный на стекле отпечаток сушат вдали от пламени, фиксируют смесью спирта с эфиром (1:1) и окрашивают
метиленовым синим.
39
Тема 4
4.3. Микробиологический анализ мяса и мясных продуктов
Мясо здорового животного можно считать практически свободным от микроорганизмов. Однако возможно его обсеменение уже при жизни животных в результате
переутомления, во время транспортировки, голодания и истощения, а также при некоторых инфекционных заболеваниях. Наибольшую опасность представляет заражение такими возбудителями, как сибирская язва, сальмонеллез, туберкулез, бруцеллез,
ящур и другие.
После убоя скота причиной обсеменения мяса микрофлорой являются нарушения
санитарного режима при снятии шкуры, разделке туши. Бактерии, попавшие на поверхность мяса, постепенно проникают вглубь него. Скорость проникновения зависит
от температуры окружающей среды и вида микроорганизмов. В мясо, охлажденное до
2–4 °С, бактерии проникают через 30 дней в среднем на глубину 1 см. Если мясо хранить
при температурах, благоприятных для развития микроорганизмов, в нем начнутся микробиологические процессы. Преобладающей микрофлорой в гниющем мясе становятся аэробные гнилостные палочки. Примерно через 3–4 сут. в глубине мяса начинают
размножаться и анаэробы (Clostridium� perfringens,
����������� С. ����������
sporogenes и др.).
По степени свежести мясо подразделяют на доброкачественное, мясо сомнительной свежести и мясо, непригодное в пищу. Доброкачественное мясо имеет сухую корочку бледно-розового или бледно-красного цвета. На разрезе оно плотное, эластичное,
ямка после надавливания быстро исчезает. Несвежее мясо покрыто плотной темнокрасной или ослизненной корочкой. Консистенция его мягкая, несколько дряблая,
образующаяся при надавливании пальцем ямка не заполняется. Запах неприятный,
гнилостный. Такое мясо используют только по указанию ветеринарно-санитарного
надзора. Если поверхность испорченного мяса ослизненная, липкая, на разрезе оно
зеленого цвета, консистенция мяса дряблая, мажущаяся, жир слизистый, с прогорклым запахом, то его бракуют, это непригодное в пищу мясо.
Пробы мяса вырезают стерильным ножом или скальпелем из толщи туши, тушку
птицы берут целиком. Пробы мяса упаковывают в стерильный пергамент.
4.3.1. Микроскопический анализ мяса и мясных продуктов. На предметных стеклах
делают по два мазка-отпечатка: один – из поверхностного слоя, другой – глубинного.
Для приготовления препарата-отпечатка из поверхностного слоя мяса стерильными
ножницами вырезают кусочек (0,5–1 г) и прикладывают его срезанной стороной к поверхности обезжиренного, фламбированного предметного стекла. Чтобы приготовить препараты-отпечатки из глубоких слоев, поверхность мяса прижигают нагретым
шпателем, стерильным ножом делают надрез и берут из глубины небольшой кусочек
(0,5–1 г), который прикладывают к стеклу. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют смесью спирта с эфиром, окрашивают фуксином и микроскопируют, подсчитывая количество микроорганизмов в каждом поле зрения и отмечая их форму.
Препарат-отпечаток свежего мяса окрашивается обычно плохо. Если он получен
из поверхностного слоя мяса, то в поле зрения встречаются единичные палочки и кокки. В препаратах из глубоких слоев микроорганизмы или отсутствуют, или встречаются не во всех полях зрения.
Препарат-отпечаток мяса сомнительной свежести окрашивается удовлетворительно. При просмотре в каждом поле зрения обнаруживается по нескольку десятков
микроорганизмов. Особенно много их в препарате из поверхностного слоя мяса.
Препарат-отпечаток мяса, непригодного в пищу, окрашивается хорошо. При просмотре препаратов из поверхностных и глубинных слоев мяса в поле зрения можно
насчитать в среднем более 30 микроорганизмов.
При разложении мяса в отпечатках почти отсутствуют кокки и все поле зрения
усеяно палочками. Среди гнилостных микроорганизмов преобладают микрококки,
кишечная палочка, флуоресцирующие бактерии, споровые формы. Из аэробных бактерий наиболее активно ведут гнилостный процесс Bacillus���������
subtilis,
�������� В. mycoides,
�������� из факультативно-анаэробных – Proteus� ��������
vulgaris, из анаэробных – С. ����������
putrificus, С. ����������
sporogenes.
40
Санитарно-микробиологическое исследование качества пищевых продуктов
4.3.2. Определение общего количества бактерий мяса и мясных продуктов. Пробу
мяса помещают в металлический противень, поверхность пробы протирают ватным
тампоном, смоченным спиртом, и, удерживая пробу пинцетом, обжигают над пламенем горелки. Затем фламбированным скальпелем на глубине 2–5 см вырезают пробу. К
20 г образца добавляют 80 см3 изотонического раствора хлорида натрия, гомогенизируют в электрическом гомогенизаторе или в стерильной ступке со стерильным пестиком.
Суспензию отстаивают 15 мин, исследуют надосадочную жидкость. Готовят разведения
10-1–10-4. Из 10-3–10-4 разведений по 1 см3 вносят в стерильные чашки Петри, заливают
расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА. После его застывания сверху заливают
4–5 см3 стерильного голодного агара для предупреждения роста бактерий рода Proteus,
обладающих за счет интенсивной подвижности ползучим ростом на плотных питательных средах. Посевы инкубируют 48 ч при 37 °С. Подсчитывают общее количество колоний и устанавливают микробную обсемененность 1 г продукта. Допустимым является
наличие в варенных колбасах микробного числа менее 103 КОЕ/г.
Для выявления анаэробов небольшие кусочки опускают в пробирки с расплавленным и предварительно охлажденным до 50 °С МПА. Вращая пробирки между ладонями, следят, чтобы кусочки мяса осели на дно пробирок, затем помещают в термостат при 40 °С. После инкубирования посевов в термостате в течение нескольких
дней пробирки просматривают визуально. Если мясо несвежее, на МПА развиваются
газообразующие анаэробные формы и в среде обнаруживаются разрывы агара в результате выделения микроорганизмами газа. В пробирках со свежим мясом столбик
МПА будет плотным, не содержащим разрывов и трещин, так как газообразующие
анаэробные формы в нем не развиваются.
4.3.3. Определение коли-титра мяса и мясных продуктов. Определение колититра производится высевом 5 см3 10 % суспензии (1:10) мяса в 10 см3 среды Кесслера.
Инкубируют в термостате при 43 °С 24 ч. В случае роста БГКП отмечается газ в поплавке пробирки. Для подтверждения присутствия БГКП делают высев в чашки Петри
со средой Эндо; посевы инкубируют 24 ч при 37 °С.
Коли-титр варенных колбас должен быть более 10 г.
4.3.4. Определение Proteus�
�������� ���������
vulgaris���������������������������
��������������������������
в мясе и мясных продуктах. Присутствие протея определяют по методу Шукевича посевом 0,5 см3 суспензии мяса в конденсационную влагу свежескошенного МПА. Рост протея через 24 ч при 37 °С характеризуется
поднимающимся по агару вверх ползучим вуалеобразным налетом с неприятным
гнилостным запахом. Идентификацию протея проводят путем микроскопии мазков,
окрашенных по Граму, и определения подвижности. По санитарно-микробиологическим нормам обязательным требованием является отсутствие в мясе и мясных продуктах протей.
4.3.5. Определение микотоксинов в мясных продуктах. При подозрении на содержание в продуктах токсинов определяют наличие в них микотоксинов и ботулотоксина.
Микотоксины – вторичные токсические метаболиты микроскопических мицелиальных грибов, обладающие высокоспецифическим тропизмом к различным тканям,
органам, нервной, эндокринной и иммунной системам. Отличаются они также тератогенностыо и мутагенностью. Известно около 100 различных микотоксинов. Продуцируют их более 200 видов плесне­вых грибов, преимущественно виды трех родов – Aspergillus��,
Penicillium��, Fusarium.
�������� Наибольшее значение в патологии человека имеют афлатоксин Bl�
���
(A��. ������
flavus), зеараленон (Fusarium) и патулин (Penicillium), накапливающиеся, главным
образом, в продовольственном сырье и пищевых продуктах растительного происхождения, орехах и семенах масличных (афлатоксин В1), фруктах и овощах (патулин).
ПДК в них для афлотоксина В1 составляет 0,001 мг/кг, для патулина – 0,05 мг/кг, а
для зеараленона – 1 мг/кг. Определение ПДК в продовольственном сырье и пищевых
продуктах возможно только с использованием физико-химических методов анализа,
включающих экстракцию микотоксинов органическими растворителями с последующей идентификацией. Если для скрининга микотоксинов можно использовать
тонкослойную хроматографию, то их идентификация и количественное определение
41
Тема 4
требуют применения спектрофотометрии и спектрофлюорометрии с учетом спектров адсорбции и флюоресценции МТ. Наиболее чувствительными для этих целей
являются газожидкостная хроматография, инфракрасная спектрофотометрия, массспектрометрия, ядерно-магнитный резонанс, а также радио- и иммуноферментный
методы.
Ботулотоксин определяют чаще всего в консервированных продуктах. При этом
экстракты подозрительных продуктов, взятых из стеклянных банок и металлической
тары с признаками бомбажа, смешивают с равными объемами антитоксических сывороток, выдерживают в термостате при 30–35 °С в течение 30 мин и вводят по 1,5
см3 внутрибрюшинно двум белым мышам или по 6 см3 подкожно морским свинкам.
Контрольных животных инфицируют интактными вытяжками. Эксперимент длится
5 дней. Опытные животные, получившие пищевые экстракты, в которых ботулотоксин нейтрализован специфической сывороткой, выживают. Мыши, зараженные нативным экстрактом, погибают при явлениях парезов мышц живота с формированием «осиной талии», а свинки – с развитием «симптома спины».
Лабораторная работа
«Санитарно-микробиологическое исследование
качества пищевых продуктов»
Цель: определение в пищевых продуктах микробного числа, численности санитарно-показательных микроорганизмов и микроорганизмов порчи.
Средства исследования, вспомогательные устройства, реактивы и оборудование: весы аналитические, пестики, ножи, скальпели, ступки с резиновыми наконечниками, водяная баня, пробирки со стерильной водопроводной водой по 9 см3 в каждой,
стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см3, редуктазник с водой, питательный агар, сусло-агар, пробирки со средой Кесслера с поплавками, термостат, предметные стекла, набор красителей, спиртовка, образцы молока и мяса:
• проба № 1 – свежее молоко;
• проба № 2 – несвежее молоко;
• проба № 3 – свежее мясо;
• проба № 4 – несвежее мясо.
Метод исследования. Метод основан на определении числа выросших микробных колоний на твердых питательных средах.
Требования безопасности. При исследовании следует выполнять правила работы в микробиологической лаборатории.
Подготовка к выполнению исследований. Перед посевом разлить питательные
среды в чашки Петри и пробирки. Гомогенизировать мясо, приготовить десятикратные разведения молока и суспензии мяса.
Выполнение работы.
1.��������������������������������������������������������������������������
Пробы исследуемого молока нагреть до 38–40 °С. Провести редуктазную пробу
с метиленовым синим и с ТТХ, как указано выше (см. п. 4.2.1). Определить качество молока на основании времени, необходимого для полного обесцвечивания пробы
или появления розовой окраски.
2.�����������
Внести 1 см3 молока в пустую стерильную чашку Петри и залить 10 см3 расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, тщательно перемешать. Инкубировать при 37 °С 24 ч, подсчитать общее число колоний и определить микробное
число данного образца молока.
3.����������������������������������������������������������������������
Определить коли-титр данного образца молока, применяя двухэтапный бродильный метод. Внести исследуемую воду в среду Кесслера, выращивать при 43 °С
24 ч. Затем из всех проб сделать высевы на среду Эндо. Выращивать при 37 °С 24 ч.
Сделать мазки, окрасить их по Граму. Сделать выводы о количестве положительных и
отрицательных проб. Определить коли-титр и коли-индекс исследованного образца
молока.
4.���������������������������������������������������������������������
Для выявления количества спор лактатсбраживающих анаэробных бактерий
провести посев 1 см3 исследуемого образца молока и его разведений в пробирки с
42
Санитарно-микробиологическое исследование качества пищевых продуктов
10 см3 питательной среды с лактозой, прокипяченной перед анализом в течение 30 мин
и охлажденной до 40 °С. После посева пробирки нагреть на водяной бане до 85 °С в
течение 10 мин. Сверху посевы заливать слоем в 1,5–2 см расплавленного и предварительно охлажденного до 45 °С агара, пробирки поместить в термостат при 30 °С на
72 ч. Определить число спор лактатсбраживающих анаэробных бактерий в данном
образце молока.
5.�������������������������������������������������������������������������
На предметных стеклах сделать мазки-отпечатки из поверхностного и глубинного слоев мяса. Препараты подсушить на воздухе, зафиксировать смесью спирта с
эфиром, окрасить фуксином и подсчитать количество микроорганизмов в каждом
поле зрения, отмечая их форму. Зарисовать.
6.�������������������������
Из суспензии мяса по 1 см3 внести в стерильные чашки Петри, залить расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА. После его застывания сверху заливать 4–5 см3 стерильного голодного агара, посевы инкубировать 48 ч при 37 °С. Подсчитать общее количество колоний и устанавить микробную обсемененность 1 г продукта.
7.��������������������������������������������
Присутствие протея определить посевом 0,5 см3 суспензии мяса в конденсационную влагу свежескошенного МПА. Установить наличие роста протея через 24 ч при
37 °С. Провести микроскопию мазков, окрашенных по Граму.
8.�������������������������������������������������������������������
Измерения повторить для всех проб, результаты внести в таблицу 4.5.
Таблица 4.5 – Учет результатов работы
Проба молока
Тест с метиленовым синим
Тест
с ТТХ
Общее микробное число
Мазки-отпечатки из поверхностного слоя
Мазки-отпечатки из
глубинного
слоя
Общее микробное число
Коли-титр
Споры лактатсбраживающих
анаэробных
бактерий
Качество
молока
Коли-титр
Протеи
Качество
мяса
Проба №��
1
Проба №��
2
Проба мяса
Проба №��
3
Проба №��
4
Материал для самоконтроля
1.���������������������������������������������������������������������������
Морфологические и культуральные свойства аэробных спорообразующих бактерий.
2.��������������������������������������������
Неспорообразующие аэробы, их характеристика.
3.��������������������������������������������
Спорообразующие анаэробы, их характеристика.
4.�������������������������������
Энтерококки, их характеристика.
5.���������������������������������������������������������������������������������������
Маслянокислые и уксуснокислые бактерии, культуральные и морфологические свойства. Методы выявления и идентификации микроорганизмов порчи продуктов.
43
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА*
1. Воробьев, А.В. Микробиология: учебник / А.В. Воробьев, А.С. Быков, Е.П. Пашков, А.М. Рыбакова. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2003. – 336 с.
2.Выделение и идентификация микроорганизмов: учеб.-метод. пособие / сост
Р.А. Желдакова. – Минск: БГУ, 2003 – 36 с.
3.�������������������������������������������������������������������������
Гигиенические требования к источникам нецентрализованного питьевого водоснабжения населения. Санитарные нормы, правила и гигиенические нормативы: утв.
постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 02.08.2010 г.
№ 105.
4.�������������������������������������������������������������������������
Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные нормы, правила и гигиенические нормативы:
утв. постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 9 июня
2009 г. № 63, с изм. и доп., утв. постановлениями Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 9 сентября 2009 г.№ 99, от 9 декабря 2009 г. № 134, от 18 января
2010 г. № 9.
5.������������������������������������������������������������������������
Гигиенические требования к обеспечению качества атмосферного воздуха населенных пунктов и мест отдыха населения. Санитарные нормы, правила и гигиенические нормативы: утв. постановлением Министерства здравоохранения Республики
Беларусь от 30.06.2009 г. № 77.
6.������������������������������������������������������������������������
Гигиенические требования к содержанию территорий населенных пунктов. Санитарные нормы, правила и гигиенические нормативы: утв. постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 30.12.2009 г. № 143.
7. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.
8.���������������������������������������������������������������������
ГОСТ 9225-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического
анализа. – Введ. 01.01.1986. – 16 с.
9.��������������������������������������������������������������������������
ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб
для химического, бактериологического, гельминтологического анализа.
10. ГОСТ
�����������������������������������������������������������������������
10444.12-88. Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов. – М.: СТАНДАРТИНФОРМ, 2008. – 6 с.
11. ����������������������������������������������������������������
ГОСТ 26668-85. Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб.
12. ������������������������������������������������������������������������
ГОСТ 26669-85. Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.
13. ГОСТ 26670-91. Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.
14. ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий.
15. Кочемасова, З.Н. Санитарная микробиология и вирусология / З.Н. Кочемасова, С.А. Ефремова, А.М. Рыбакова. – М.: Медицина, 1987. – 352 с.
16. Красильников, А.П. Микробиологический словарь-справочник / А.П. Красильников, Т.Р. Романовская. – 2-е изд., доп. и перераб. – Минск.: Асар, 1999. – 400 с.
17. Мараховская, С.В. Качество воды (гигиеническая оценка, методы улучшения): метод. рекомендации / С.В. Мараховская. – Минск.: БГМУ, 2005. – 24 с.
18. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Санитарные правила и
нормы 10-124 РБ 99: утв. постановлением Главного государственного санитарного
врача Республики Беларусь от 19 октября 1999 г. № 46, с изм., утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 26 марта
2002 г. № 16.
*Литература из данного списка была использована при написании практикума.
44
Рекомендуемая литература
19. Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии / М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. – СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2008. – 352 с.
20. Практикум по биологии почв: учеб. пособие / Г.М. Зенова, А.Л. Степанов,
А.А. Лихачева, Н.А. Манучарова. – М.: Изд-во МГУ, 2002. – 120 с.
21. Производство молока и молочных продуктов. Санитарные правила и нормы 2.3.4.13-19-2002: утв. постановлением Главного государственного санитарного
врача Республики Беларусь от 31.12.2002 г. № 147.
22. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: практ. пособие /
под ред. Н.С. Егорова. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. – 215 с.
23. Санитарно-гигиенические требования к производству мяса и мясопродуктов. Санитарные правила и нормы 2.3.4.15-15-2005: утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 23 августа 2005 г.
№ 120, с изм., утв. постановлением Министерства здравоохранения Республики
Беларусь от 4 февраля 2009 г. № 12.
24. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания МУК РБ № 11-10-1-2002. – Минск, 2002. – 43 с.
25. Сборник нормативных документов по гигиенической оценке почвы населенных мест: Инструкция 2.1.7.11-12-5-2004 «Гигиеническая оценка почвы населенных
мест». Инструкция 2.1.7.11-12-3-2004 «Определение токсичности металлосодержащих
отходов». Гигиенические нормативы 2.1.7.9-37-2003 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) кадмия, тилта и фенантрена в торфяной почве» [Текст] / Министерство
здравоохранения Республики Беларусь. – Минск, 2004. – 96 с.
26. Сбойчаков, В.Б. Санитарная микробиология / В.Б. Сбойчаков. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 192 с.
45
ПРИЛОЖЕНИЕ
5. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
5.1. Основные среды
5.1.1. Питательный бульон (МПБ)
5.1.1.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
5.1.1.2. Питательный бульон (десятикратный) для коли-фагов готовят путем увеличения в
10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.
5.1.2. Питательный агар (МПА)
5.1.2.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
5.1.2.2. Питательный агар для определения коли-фагов прямым методом готовят, увеличивая
навеску сухого препарата в 2 раза от прописи.
5.1.2.3. Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1 дм3 дистиллированной воды. Довести рН до 7,0–7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при
121 °С в течение 15 минут.
5.1.2.4. Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг
стрептомицина на 1 см3 питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 см3. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и охлажденный до
температуры 45–49 °С вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 см3 на 10 см3 питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного
агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.
Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 часов.
Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.
5.2. Элективные питательные среды
5.2.1. Питательные среды для обнаружения бактерий группы кишечных
палочек титрационным методом
5.2.1.1. Лактозо-пентонная среда (ЛПС)/глюкозопептонная среда (ГПС, среда Эйкмана). 10 г
пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы (глюкозы) растворяют при нагревании в 1 дм3
дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН (7,4–7,6), разливают по 10 см3 в пробирки, стерилизуют при (112±2) °С 12 мин.
5.2.1.2. Концентрированная ЛПС/ГПС (среда накопления). Готовят по п. 5.4.1, при этом все
ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз; разливают по 1 см3 в про­бирки и по 10 см3 во
флаконы.
5.2.1.3. Среда Кесслера. В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 2,5 г глюкозы,
5,0 г желчи говяжьей сухой (или 50,0 см3 желчи натуральной), 0,05 г кристаллического фиолетового или метилового фиолетового; доводят до кипения. Устанавливают рН 7,3±0,2, разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при (114±1) °С в течение 20 мин.
Селективность среды обеспечивают желчь и красители. Энтеробактерии вызывают газообразование и помутнение среды.
5.2.2. Питательные среды для подтверждения способности ферментировать
лактозу (глюкозу) до кислоты и газа
5.2.2.1. Полужидкая среда с лактозой (глюкозой) из сухого препарата. Готовят по способу, указанному на этикетке. Срок хранения не более 2 недель при комнатной температуре.
Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной
среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ
46
Приложение
скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы.
При инкубации посевов более 5 часов газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие
газа указывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнения среды на месте бывшего
пузырька газа.
5.2.2.2. Полужидкая среда с лактозой (глюкозой). Готовят при отсутствии сухого препарата.
В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 4–5 г
агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2–7,4, добавляют 1 см3 1,6 % спиртового
раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120±2) °С 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на
высоту 3–5 см и стерилизуют при (112±2) °С 12 мин. Срок хранения не более 2 недель при комнатной температуре.
Правильно приготовленная среда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). При образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.
5.2.2.3. Лактозо-пептонная среда. Готовят по п. 5.2.1.1 с добавлением перед стерилизацией
1 см3 1,6 % спиртового раствора бромтимолового синего (бриллиантового синего) на 1 дм3 ЛПС и
разливают по 3–5 см3 в пробирки с поплавками.
5.2.3. Железо-сульфитный агар для выявления сульфитредуцирующих
клостридий (среда Вильсона-Блера)
В 1 дм3 стерильного расплавленного питательного агара добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112+2) °С 12 минут
(основная среда).
Непосредственно перед использованием в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде готовят 20 % раствор сульфита натрия (Na2S03) и 8 % раствор железа сернокислого закисного (FeSO4) или железа хлористого (FeCl2). Раствор сульфита натрия нагревают до
полного растворения реагента. Перед выполнением анализа в 100 см3 расплавленной основной среды вносят 5 см3 20 % раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 см3 8 %
раствора сернокислого железа, перемешивают и стерильно разливают в пробирки высоким
столбиком (12–15 см) для анализа методом мембранной фильтрации или во флаконы для
работы методом прямого посева.
5.2.4. Питательные среды для обнаружения стафилококков
5.2.4.1. Солевая основа. В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 35,0 г питательного агара, 65,0 г хлорида натрия и 20 г сухого агар-агара. Устанавливают рН 7,2±0,1, разливают во
флаконы и стерилизуют при 121 °С 20 мин.
5.2.4.2. Молочно-солевой агар. Перед посевом к расплавленной и охлажденной до 45 °С солевой основе (п. 5.2.4.1) добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, равномерно смешивают и разливают в чашки Петри.
5.2.4.3. Желточно-солевой агар Чистоковича (ЖСА).
5.2.4.3.1. Приготовление желточной эмульсии. Свежее куриное яйцо моют водой, протирают ватой, смоченной в спирте. Отделяют желток и вносят в 100 см3 стерильного физиологического раствора. Приготовленная эмульсия может храниться при 0–5 °С не более 72 ч.
5.2.4.3. Перед посевом к расплавленной и охлажденной до 45 °С солевой основе (п. 5.2.4.1)
асептически добавляют 20 % желточной эмульсии, равномерно смешивают и разливают в
чашки Петри тонким слоем.
Среда также позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу,
от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов (фермент расщепляет
лецитин куриного желтка).
5.2.4.4. Среда Эндо с молоком (по Г.П. Калине). Среду готовят из сухого порошка, но воды
берется меньше: к 90 см3 среды добавляют 10 см3 стерильного молока, 0,2 см3 10 % спиртового
раствора основного фуксина, 0,2 см3 5 % спиртового раствора розоловой кислоты, тщательно
перемешают.
5.2.5. Кровяной агар для выявления стрептококков
К расплавленному и охлажденному до 45–50 °С питательному агару асептически добавляют 5–10 % дефибринированной крови, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки
47
Приложение
Петри, пробирки или другую лабораторную посуду. Для приготовления жидкой среды такое
же количества крови добавляют к питательному бульону.
5.2.6. Питательные среды для выявления дрожжей и микромицетов
5.2.6.1. Среда Сабуро. В 1 дм3 дистиллированной воды растворить при нагревании 40 г глюкозы, 10 г пептона и 20 г агар-агара. Довести рН до 5,6±0,2, разлить во флаконы и стерилизовать автоклавированием при 112 °С в течение 15 минут.
Среду стерилизуют при температуре 121 °С в течение 15 мин.
5.2.6.2. Солодовое агаризованное сусло. Готовят по ГОСТ 10444.12-88.
Для определения дрожжей и плесневых грибов перед применением среду подкисляют
раствором лимонной кислоты с массовой концентрацией 200 г/дм3 или стерильным раствором молочной кислоты с объемной долей кислоты 40 % до уровня рН 3,6±0,1.
Для подавления роста бактерий в сусло-агар добавляют один из противобактериальных
антибиотиков в количестве (на 1 дм3):
– окситетрациклин – 100 мг,
– окситетрациклин с гентамицином – 100 мг и 50 мг соответственно,
– пенициллин и стрептомицин – 50 000–100 000 ED и 40 мг соответственно.
5.2.7. Селенитовая среда
В 1 дм3 дистиллированной воды растворить 5,0 г пептона, 7,0 г дикалия гидрофосфата,
3,0 г натрия дигидрофосфата, 4,0 г лактозы, 4,0 г натрия гидроселенита. Среду нагреть до кипения, установить рН 7,0±1, разлить в стерильные пробирки. Хранить при температуре 5 °С
не более 7 суток.
5.2.8. Мясо-пептонная среда с лактозой
При приготовлении среды к 900 см3 МПБ добавляют 5 г лактата кальция, 15 г ацетата натрия,
0,8 г хлорида цистеина, 40 см3 дрожжевого автолизата или 4 г сухого дрожжевого автолизата и 20 г агара. Смесь нагревают до 95 °С, выдерживают при постоянном помешивании до
расплавления агара и добавляют 10 см3 0,01 %-го водного раствора тетрабората натрия, 10 см3
1 %-го раствора кислого карбоната натрия и 1 см3 0,4 %-го водного раствора индикатора нейтрального красного. При помощи 20 %-го водного раствора молочной кислоты устанавливают
рН 5,7. Приготовленную среду разливают в пробирки по 10 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют 20 мин при температуре 115 °С. Затем ватные пробки заменяют стерильными резиновыми.
Допустимо использовать в анализе упрощенную среду следующего состава: МПБ –
1 л; лактат кальция – 6,5 г; агар – 20 г; 0,4 %-й водный раствор индикатора нейтрального
красного – 1 см3; рН 5,7. Стерилизуют среду при 0,5 атм 20 мин.
5.2.9. Среда Виноградского
В 1 дм3 дистиллированной воды растворить 2,0 г (NH4)2SO4; 1,0 г K2HPO4; 0,5 г MgSO4;
0,4 г FeSO4; 2,0 г NaCl. Среду разливают в колбы на 50 см3 по 15 см3 в каждую. Высота слоя
среды в колбах должна быть 1–1,5 см. В каждую колбу вносят на кончике шпателя небольшое
количество мела.
5.3. Дифференциально-диагностические среды
5.3.1. Фуксин-сульфитная среда Эндо
5.3.1.1. Основная модификация. Готовят в день использования из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Горячую среду разливают в стерильные чашки Петри и оставляют до застывания на поверхности стола. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет
бледно-розовую окраску. Срок хранения чашек со средой не более 2–3 суток в темном месте
или в холодильнике. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом
необходимо подсушить. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашива48
Приложение
ются в темно-красный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные колонии.
5.3.1.2. Повышение дифференцирующих свойств среды. Для повышения дифференцирующих
свойств среды в готовую и охлажденную до 60–70 °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 см3 среды 0,2 см3 5 % спиртового раствора основного фуксина. Срок
хранения раствора фуксина не более 1 месяца.
5.3.1.3. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты. В случаях, когда мембранные
фильтры зарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо
фуксина, допускается добавление на 100 см3 среды Эндо 0,2 см3 5 %-го спиртового раствора
розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты – не более 1 месяца.
5.3.2. Среда Плоскирева (бактоагар Ж)
Выпускается в сухом виде и готовится к употреблению в соответствии с указаниями на
этикетке. Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных
кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Готовая среда коричнево-красного цвета. Является не только дифференциально-диагностической, но и селективной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (кишечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некоторых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов,
дизентерий). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии,
а лактозоположительные – красные.
5.3.3. Висмут-сульфит агар
Среда предназначена для выделения сальмонелл из инфицированного материала. Содержит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неорганические соли, бриллиантовый
зеленый, агар. Выпускается в сухом виде, готовится к употреблению в соответствии с указаниями на этикетке. Стерилизуется кипячением, готовая среда светло-зеленого цвета. Следует
использовать в день приготовления.
Дифференцирующие свойства среды основаны на способности микроорганизмов продуцировать H2S, образующий в реакции с цитратом висмута соединение черного цвета – сернистый висмут. Бриллиантовый зеленый и сульфит натрия – ингибиторы роста микроорганизмов-ассоциантов.
5.3.4. Среды для идентификации представителей семейства Enterobacteriaceae
5.3.4.1. Среда Олькеницкого. К 100 см3 МПА прибавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора,
0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4 см3 индикатора фенолового
красного. Соль Мора и гипосульфит предварительно растворяют в дистиллированной воде.
Углеводы и мочевину также растворяют в дистиллированной воде на водяной бане. Все ингредиенты хорошо перемешивают с МПА, фильтруют через стерильную марлю, устанавливают
рН 7,2–7,4, добавляют 0,4 см3 фенолового красного и разливают в пробирки. Среду Олькеницкого можно приготовить из сухого МПА, расплавленного в 100 см3 дистиллированной воды.
Заливают эту среду в пробирки так, чтобы оставался столбик высотой 2–2,5 см и скошенная
поверхность.
Исходный цвет среды имеет оранжевый оттенок.
Протей изменяет цвет косяка среды Олькеницкого на красный, а столбик среды чернеет;
при росте эшерихии цвет среды становится желтым, в ней появляются пузырьки вследствие
сбраживания углеводов; шигеллы изменяют цвет столбика на желтый, а косяк остается оранжевым; брюшнотифозные сальмонеллы вызывают те же изменения, что и шигеллы, но на дне
среды образуются черные глыбки; паратифозные сальмонеллы видоизменяют среду также,
однако, в столбике появляются еще и пузырьки газа.
5.3.4.2. Трехсахарный агар с железом. В состав среды входит: вода – 1 дм3, пептон – 2 %; глюкоза –
0,1 %; лактоза – 1 %, сахароза – 1 %, железо(II)-аммонийсульфат – 0,02 %, NaCl – 0,5 %, Na2S203
(тиосульфат) – 0,03 %, феноловый красный – 0,0025 %; агар – 1,5 %. После автоклавирования
среду разливают как скошенный агар с высоким столбиком в основании. Посев производится
на поверхность скошенного агара, а также бактериологической иглой глубоко в столбик. В
процессе инкубации определяют: 1) кислотно-щелочную реакцию на поверхности скошенного агара (аэробные условия); 2) кислотно-щелочную реакцию в столбике (анаэробные или
49
Приложение
микроаэрофильные условия); 3) газообразование H2, CO2 (газовые полости или разрыв столбика; 4) образование H2S (почернение за счет сульфида железа). Бактерии, использующие и
глюкозу и лактозу (E. coli), дают кислую реакцию и в столбике и в скошенном агаре. Не сбраживающие лактозу штаммы дают кислую реакцию в столбике и щелочную на скошенном
агаре. Образование H2S фиксируют по почернению среды.
5.3.5. Среды Гисса
Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на
этикетке.
5.4. Реактивы
5.4.1. Реактивы для оксидазного теста
5.4.1.1. Вариант 1. 1 % водный раствор тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.
5.4.1.2. Вариант 2.
Реактив № 1. 1 % спиртовой раствор α-нафтола.
Реактив № 2. 1 % водный раствор фенилендиаминового соединения.
Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1-й – до одного месяца,
2-й – до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь
частей второго раствора.
Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста
(СИБ-оксидаза или аналоги).
Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует
испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa,
Ps. fluorescens) и отрицательную оксидазную реакцию (Е. coli).
5.4.2. Реактивы для окраски препаратов по Граму
5.4.2.1. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана
фиолетового, 10 см3 ректификованного этилового спир­та, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 см3 дистиллированной воды.
5.4.2.2. Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 см3 дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.
5.4.2.3. Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 см3 спирта
этилового ректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 см3 дистиллированной воды.
5.4.3. Изотонический раствор натрия хлорида
К 1 дм3 дистиллированной воды добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный рН и, если нужно, стерилизуют при 120 °С в течение 30 мин.
50
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................... 3
ТЕМА 1. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА .......................................................................................... 4
1.1. Методы отбора проб воздуха. Приборы ............................................................ 5
1.2. Определение общей численности сапрофитных бактерий ............................ 9
1.3. Определение стафилококков ............................................................................. 10
1.4. Определение стрептококков ............................................................................. 10
1.5. Окраска бактерий по методу Грама .............................................................. 10
1.6. Определение патогенных микроорганизмов в воздухе .................................... 11
Лабораторная работа «Санитарно-микробиологическое исследование
воздуха закрытых помещений» ........................................................................................ 12
ТЕМА 2. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
ВОДЫ ................................................................................................................................... 14
2.1. Отбор, хранение и транспортировка проб ..................................................... 14
2.2. Определение общего числа микроорганизмов .................................................. 15
2.3. Определение количества общих колиформных бактерий
и термотолерантных колиформных бактерий ............................................................ 16
2.4. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий
(Clostridium perfringens) методом прямого посева ....................................................... 21
2.5. Определение коли-фагов ...................................................................................... 21
2.6. Тест-культуры микроорганизмов .................................................................... 23
Лабораторная работа «Санитарно-микробиологическое
исследование воды» .............................................................................................................. 23
ТЕМА 3. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ ............................................................................................ 25
3.1. Отбор, хранение и транспортировка проб ..................................................... 28
3.2. Подготовка проб почвы ....................................................................................... 28
3.3. Определение общей численности сапрофитных бактерий .............................. 28
3.4. Определение численности основных видов санитарнопоказательных микроорганизмов ..................................................................................... 29
3.5. Определение нитрифицирующих бактерий ................................................... 30
3.6. Определение в почве сальмонелл и шигелл ..................................................... 31
3.7. Санитарно-микробиологическая оценка почвы .............................................. 31
Лабораторная работа «Санитарно-микробиологическое
исследование почвы» ............................................................................................................. 32
ТЕМА 4. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ .................................... 34
4.1. Правила отбора проб .......................................................................................... 35
4.2. Бактериологический анализ молока и молочнокислых
продуктов ............................................................................................................................ 35
4.3. Микробиологический анализ мяса и мясных продуктов ............................... 40
Лабораторная работа «Санитарно-микробиологическое
исследование качества пищевых продуктов» .................................................................. 42
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА ..................................................................... 44
ПРИЛОЖЕНИЕ ........................................................................................................ 46
51
Учебное издание
ЮХНЕВИЧ Галина Геннадьевна
КОЛЕСНИК Ирина Михайловна
МИКРООРГАНИЗМЫ В БИОИНДИКАЦИИ
И БИОТЕСТИРОВАНИИ
Лабораторный практикум
Ответственный за выпуск И.В. Сивакова
Компьютерная верстка: О.М. Санковская
Дизайн обложки: О.В. Канчуга
Подписано в печать 17.05.2012. Формат 60×84/8.
Бумага офсетная. Ризография. Гарнитура Palatino Linotype.
Усл. печ. л. 6,05. Уч.-изд. л. 3,5. Тираж 100 экз. Заказ
.
Издатель и полиграфическое исполнение:
Учреждение образования «Гродненский государственный
университет имени Янки Купалы».
ЛИ № 02330/0549484 от 14.05.2009.
ЛП № 02330/0494172 от 03.04.2009.
Пер. Телеграфный, 15а, 230023, Гродно.
ISBN 978-985-515-552-3
9 789855 15552 3