Характеристика вирусов гриппа и состояние

На правах рукописи
Курская Ольга Григорьевна
Характеристика вирусов гриппа и состояние популяционного
иммунитета населения Западной Сибири (2009 – 2012 гг.)
03.02.02 - Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Кольцово – 2013
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Научный руководитель:
Ильичева Татьяна Николаевна,
кандидат биологических наук
Официальные оппоненты:
Евстропов Александр Николаевич,
доктор медицинских наук, профессор, Новосибирский государственный медицинский университет, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и
иммунологии.
Рябчикова Елена Ивановна,
доктор биологических наук, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, руководитель группы микроскопических исследований.
Ведущая организация:
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа»
Министерства Здравоохранения Российской Федерации, г. Санкт Петербург.
Защита состоится «06» сентября 2013 г. в 09-00 часов на заседании диссертационного
совета Д 208.020.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»,
тел. (383) 336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан «___» _______ 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
д-р биол. наук, профессор
Г.П. Трошкова
2
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Грипп – это острое инфекционное заболевание дыхательных путей из группы острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), вызываемое вирусами гриппа. В общей структуре инфекционных болезней
на долю гриппа и других ОРВИ приходится до 92%. Грипп вызывает ежегодные подъемы заболеваемости, частые эпидемии и периодические пандемии.
В большинстве случаев грипп протекает как самокупирующееся, неосложненное, острое заболевание, сопровождающееся лихорадкой, интоксикацией и
респираторными симптомами. Однако возможно тяжелое течение болезни и
развитие осложнений, включая летальные исходы, у лиц из групп риска (пожилые люди, дети младшего возраста, лица с фоновыми заболеваниями, включая
хроническую патологию дыхательной и сердечно-сосудистой систем, сахарный
диабет и иммуносупрессию). Хотя показатели смертности от гриппа во время
сезонных эпидемий составляют менее 0,1%, все же ежегодные потери могут
достигать 250 000 – 500 000 человек в мире, включающих в основном детей
первых лет жизни и пожилых людей (WHO, 2009).
Оcобенноcти эпидемичеcкого процеccа при гриппе определяются, в первую очередь, антигенными и генетическими свойствами циpкулиpующих
штаммов и состоянием популяционного иммунитета. Это обуславливает
оcновные методы боpьбы с гриппом: эпидемиологический нaдзор за
pаcпpоcтранением инфекции, своевременную диагностику, а также профилактику заболевания.
Полагают, что причиной пандемии гриппа является проникновение нового
подтипа вируса или некоторых его генов из популяций животных, что обусловливает высокую потенциальную опасность вирусов гриппа животных для человека. В связи с этим юг Западной Сибири привлекает пристальное внимание
специалистов, занимающихся экологией, эпидемиологией и эволюцией вирусов
гриппа. Здесь пересекаются три из шести миграционных путей перелетных
птиц, проходящих через территорию Евразии, это создает благоприятные условия для распространения вируса гриппа птиц и появления реассортантных и рекомбинантных вариантов вируса. Кроме того, Юго-Западная Сибирь – это регион с развитой инфраструктурой и относительно высокой для Сибири плотностью населения. Близость человека и домашних животных (гусей, уток, кур,
свиней) может стать решающим фактором эволюции вируса животного происхождения, в результате которой возможно появление нового штамма высокопатогенного для человека вируса, способного вызвать вспышку тяжелого заболевания. Немаловажным фактором является близость к странам Юго-Восточной
Азии, в которых, как правило, начинались эпидемические вспышки гриппа.
Кроме того, крупные города, такие как Новосибирск и Омск, являются основными транспортными узлами (в том числе и международными).
Таким образом, на территории Западной Сибири актуально проведение вирусологического мониторинга гриппа и исследования популяционного иммунитета населения.
3
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась
характеристика штаммов вирусов гриппа человека, циркулировавших в
Западной Сибири в 2009 – 2012 гг., и оценка состояния популяционного
иммунитета.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1.
Определить этиологическую структуру гриппа у населения Западной Сибири в пандемический период 2009 – 2010 гг. и эпидемические сезоны 2010 –
2011 гг., 2011 – 2012 гг.
2.
Выполнить сравнительный антигенный, молекулярно-генетический и филогенетический анализ штаммов вируса гриппа, циркулировавших в Западной
Сибири в период 2009 – 2012 гг., определить наличие генетических маркеров
устойчивости к противогриппозным химиопрепаратам.
3.
Выявить наличие предсуществующего иммунитета к пандемическому вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 у населения Западной Сибири.
4.
Определить уровень популяционного иммунитета к различным типам/субтипам вируса гриппа у населения Западной Сибири в конце пандемии
2009 – 2010 гг. и в постпандемическом периоде (эпидемические сезоны 2010 –
2011 гг. и 2011 – 2012 гг.).
Научная новизна. Проведен детальный анализ пандемии гриппа (2009 –
2010 гг.) и постпандемического периода в Западной Сибири, изучены основные антигенные, молекулярно-биологические, иммунологические свойства
эпидемически значимых штаммов.
Показано наличие антител к вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 в сыворотках
крови, собранных до начала пандемии 2009 – 2010 гг. у жителей разных регионов Западной Сибири.
Получены современные данные о состоянии популяционного иммунитета
к гриппу у населения Западной Сибири в разных возрастных группах.
Впервые дана характеристика эпидемического процесса при гриппе в Западной Сибири в сравнении с ситуацией в других регионах мира.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные об особенностях эпидемиологической ситуации по гриппу и состоянию популяционного иммунитета к гриппу у населения Западной Сибири могут быть использованы для совершенствования профилактических мероприятий и системы эпидемиологического надзора за гриппом.
Полученные в ходе работы данные были использованы при подготовке
лекционных и практических занятий курсов повышения квалификации врачейвирусологов Центров гигиены и эпидемиологии субъектов РФ, проводимых на
базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» в соответствии с Приказом Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от
23.12.2011 №926 «О проведении краткосрочных курсов повышения квалификации по вопросам совершенствования лабораторной диагностики гриппа» (внутренний приказ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» от 01.02.12 №32-ах).
Внедрение полученных результатов. Создана и принята на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» коллек4
ция из 26 штаммов вируса пандемического и сезонного гриппа различных типов/субтипов, циркулировавших в Западной Сибири в 2009 - 2012 гг.
По результатам работы 40 нуклеотидных последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы зарегистрированы в международной базе данных GenBank и могут служить базой для филогенетических исследований вируса гриппа человека.
Еженедельные данные о лабораторно подтвержденных случаях гриппа
предоставлены во всемирную сеть надзора за гриппом FluNet.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на российских и международных конференциях, в том числе на 10-й Международной конференции по молекулярной эпидемиологии и эволюционной
генетике инфекционных болезней (Амстердам, Нидерланды, 2010), 4-ой Международной конференции по гриппу «Зоонозный грипп и здоровье человека»
(Оксфорд, Великобритания, 2011), Международной конференции «Патогенез
гриппа: взаимодействие вируса и хозяина» (Гонконг, Китай, 2011), XIV международном симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (Стамбул, Турция, 2012), Международной конференции «Сезонный и пандемический грипп»
(Мюнхен, Германия, 2012), Научной конференции с международным участием
«Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии» (Иркутск,
2012), Научной конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2012).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 18 работ (в том числе в трудах международных конференций), 4 из них в
ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, 3 – в международных
журналах.
Личный вклад автора. Планирование экспериментов, анализ материалов,
использованных в диссертационной работе, написание статей осуществлялись
автором лично. Все эксперименты, включая выделение, типирование и субтипирование изолятов вируса гриппа, изучение инфекционных, антигенных
свойств выделенных штаммов, подготовку проб для секвенирования, подготовку образцов сыворотки крови для серологических исследований, проведение
сероэпидемиологических исследований, обработка полученных результатов
выполнены автором лично или под ее руководством при участии Горбатовской
Л.М., Ивановой Е.В., Игнашкиной М.Б. (сбор клинического материала), Дурыманова А.Г., Романовской А.А. (выделение вируса гриппа), Соболева И.А.,
Суслопарова И.М., Сайфутдиновой С.Г. (молекулярно-биологические методы
исследования), Глущенко А.В., Прокопьевой Е.А., Зайковской А.В. (эксперименты на лабораторных животных), Шаршова К.А. (депонировании штаммов в
Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), Шестопалова А.М.,
Михеева В.Н. (организация взаимодействия с ФБУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии»). Общее руководство работой осуществлялось Ильичевой Т.Н.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах
машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована
5
25 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 194 источника, в
том числе 175 работ зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
В июле 2009 г. – феврале 2010 г. в Западной Сибири грипп имел моноэтиологический характер: заболевание вызывали штаммы пандемического
вируса гриппа А(H1N1)pdm09. По молекулярно-биологическим и антигенным
характеристикам штаммы пандемического вируса гриппа были подобны вакцинному штамму A/California/07/2009 и чувствительны к антинейраминидазным препаратам (озельтамивир, занамивир).
2.
До начала пандемии 2009 – 2010 гг. (5,9±1,6)% сывороток крови людей содержали антитела к вирусу гриппа А(H1N1)pdm09. К концу пандемии
зафиксировано значимое увеличение числа серопозитивных лиц в возрастной
группе 18 – 35 лет.
3.
В постпандемический период (сезоны 2010-2011 гг. и 2011 – 2012 гг.)
в Западной Сибири заболевание вызывали штаммы вируса гриппа
А(H1N1)pdm09, А(Н3N2), и вирусы гриппа В двух генетических линий – Victoria и Yamagata.
4.
В мае 2012 г. пятая часть населения Западной Сибири имела защитные
титры антител к эпидемически значимым штаммам вируса гриппа.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в отделе зоонозных инфекций и гриппа Федерального
бюджетного учреждения науки «Государственный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в 2008 – 2012 гг. при поддержке Федеральной целевой
программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» - Госконтракт № 16.522.12.2011.
Проведение работ с клиническими образцами одобрено решением этического комитета IRB 00001360 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (протокол № 2 от
20.05.2008 г.) и решением комитета по биомедицинской этике при ФГБУ НЦ
КЭМ СО РАМН (решение №25 от 19.11.2012 г.).
Сбор клинических образцов (мазки из носа и зева, сыворотка крови) производили в лечебно-профилактических учреждениях городов Новосибирск, Омск,
Томск, Тюмень, Барнаул, р.п. Кольцово и п. Довольное.
Выделение и идентификацию вируса гриппа проводили согласно методикам, рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения (WHO, 2011).
Выделение вируса проводили в культуре клеток MDCK с последующим субтипированием изолятов в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием панели референс-антигенов и референс-сывороток, любезно предоставленной СЦ ВОЗ по гриппу (Атланта, США).
Данные по серотипированию подтверждали методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени с помощью коммерческих наборов реагентов для выявления РНК вирусов гриппа А и
В: «АмплиСенсInfluenzavirusA/B-FL», «АмплиСенсInfluenzavirusA-тип-FL»,
«АмплиСенсInfluenzavirusAsw-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва,
Россия).
6
Анализ антигенных свойств штаммов осуществляли в РТГА с панелью
постинфекционных хорьковых референс-сывороток и референс-антигенов, любезно предоставленных CDC (Атланта, США), согласно методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 2011).
Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, амплификацию, очистку продуктов амплификации и определение нуклеотидной последовательности
проводили в соответствии с протоколами производителя наборов. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ Vector NTI 9, MEGA 4 (K. Tamura et al., 2007). Построение
филогенетических деревьев выровненных нуклеотидных последовательностей
осуществляли с помощью программы MEGA 4 методом Neighbor-joining (N.
Saitou, M. Nei, 1987).
Выделенные штаммы подготовлены для патентного депонирования в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Для длительного хранения
созданной коллекции штаммы лиофилизировались в ампулах с САЖ (А.Ю. Селезнева, 1978).
Наличие в сыворотках крови людей антител против вируса гриппа определяли в РТГА и в реакции микронейтрализации (МН) по методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 2011).
Для статистической обработки данных были использованы общепринятые методы описательной статистики с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel (Microsoft Office Professional Edition, 2007) и Statistica 6,0.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1Пандемический период 2009 – 2010 гг.
В России первый случай заболевания, вызванного пандемическим вирусом
A(H1N1)pdm09, был зарегистрирован в мае 2009 г. у туриста, вернувшегося из
США, а уже в июле появились лабораторно подтвержденные случаи заболевания людей в Екатеринбурге, Томске, Барнауле и во Владивостоке (А.А. Романовская с соавт., 2011).
3.1.1 Выделение вируса гриппа из клинических образцов и секционного
материала и изучение биологических свойств выделенных штаммов
За период с июля 2009 г. по февраль 2010 г. было получено 106 образцов от
людей с подозрением на грипп, причем наибольшее количество образцов было
собрано в ноябре и декабре 2009 г. (32,1% и 44,3% от общего количества собранных проб, соответственно). При этом если в летние месяцы наблюдалось
легкое течение заболевания, то, начиная с ноября 2009 г., стали отмечаться тяжелые случаи гриппа с летальными исходами. Следует отметить, что летом
2009 г. случаи гриппа были связаны с поездками за рубеж или возникали после
контакта с лицами, вернувшимися из-за границы. Осенью же 2009 г. случаи
гриппа не были связаны с поездками в другие страны.
Из полученных образцов нами было выделено 20 штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09. За весь период не было выделено ни одного штамма вируса
гриппа другого типа/субтипа.
7
Для ряда штаммов были проанализированы антигенные свойства в РТГА с
набором специфических хорьковых постинфекционных сывороток (CDC, Атланта, США). Результаты РТГА представлены в таблице 1.
Таблица 1. Антигенные свойства штаммов вируса гриппа A(H1N1)pdm09, выделенных в
2009 г. (РТГА с хорьковыми референс-сыворотками и эритроцитами гуся).
Штамм вируса гриппа
A/California/07/2009
A/Texas/77/2009
A/South Carolina/2/2010
A/England/195/2009
A/Koltsovo/01/2009
A/Koltsovo/02/2009
A/Koltsovo/03/2009
A/Koltsovo/04/2009
A/Koltsovo/05/2009
A/Novosibirsk/02/2009
A/Tomsk/02/2009
A/Tomsk/03/2009
A/Tomsk/05/2009
A/Tomsk/06/2009
A/Barnaul/04/2009
A/Karasuk/01/2010
Референс-сыворотка
A/Texas/
A/South Carolina/
77/2009
2/2010
160
640
80
320
320
320
320
640
640
640
640
1280
640
1280
640
1280
640
1280
640
1280
640
640
640
640
640
640
640
1280
640
1280
320
1280
A/California/
07/2009
5120
320
2560
2560
5120
5120
5120
5120
5120
2560
2560
2560
5120
5120
5120
5120
A/England/
195/2009
160
160
320
320
640
640
1280
1280
640
1280
1280
1280
640
640
640
640
Как видно из таблицы 1, все проанализированные штаммы гомогенны по
своим
антигенным
свойствам
и
подобны
вакцинному
штамму
A/California/07/2009.
С целью изучения молекулярно-генетических и филогенетических характеристик выделенных штаммов получены нуклеотидные и аминокислотные последовательности гемагглютинина и нейраминидазы и проведен их сравнительный анализ с референс-штаммом A/California/07/2009. Всего обнаружено 8
аминокислотных замен для гемагглютинина и 4 замены для нейраминидазы
(табл. 2, 3).
Таблица 2. Аминокислотные замены в гемагглютинине штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09, выделенных в Западной Сибири во время пандемии гриппа 2009 – 2010 гг.
Штамм вируса гриппа
№ GenBank
83
128
203
222
260
283
293
321
A/California/07/2009
A/Novosibirsk/02/2009
A/Omsk/02/2009
A/Tomsk/02/2009
A/Tomsk/03/2009
A/Tomsk/05/2009
A/Tomsk/06/2009
A/Barnaul/04/2009
A/Karasuk/01/2010
A/Koltsovo/03/2009
A/Koltsovo/05/2009
P
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
T
T
T
T
T
T
T
T
T
D
N
K
Q
GU433033
GU211235
GU211243
GU433025
GU560008
GU560016
GU592889
GU562458
–
–
N
H
I
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
P
P
(–) – последовательности не депонированы в GenBank
8
D
D
G
Таблица 3. Аминокислотные замены в нейраминидазе штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09, выделенных в Западной Сибири во время пандемии гриппа 2009 – 2010 гг.
Штамм вируса гриппа
A/California/07/2009
A/Novosibirsk/02/2009
A/Omsk/02/2009
A/Tomsk/02/2009
A/Tomsk/03/2009
A/Tomsk/05/2009
A/Tomsk/06/2009
A/Barnaul/04/2009
A/Karasuk/01/2010
A/Koltsovo/03/2009
A/Koltsovo/05/2009
№ GenBank
GU433035
GU211237
GU211245
GU433027
GU560010
GU560018
GU592891
GU562460
–
–
106
V
I
I
248
N
D
D
I
I
D
D
D
D
D
D
D
I
I
I
I
386
N
452
T
N
K
(–) – последовательности не депонированы в GenBank
Как видно из таблицы 2, в гемагглютинине обнаружены как уникальные мутации для отдельных штаммов, так и замены, общие для всех проанализированных штаммов: P83S, I321V и S203T (последняя замена характерна для всех
штаммов, за исключением A/Koltsovo/05/2009), причем одна из них (S203T)
расположена в антигенном сайте Са1 (R. Xu et al., 2010).
Для одного штамма (A/Karasuk/01/2010), выделенного из секционного материала (фрагмент легкого), обнаружена замена аспарагиновой кислоты на глицин в 222 положении (D222G) гемагглютинина. Данный образец был получен в
конце декабря 2009 г. от женщины 57 лет, находившейся на лечении в стационаре с диагнозом: Острая внебольничная двусторонняя вирусно-бактериальная
пневмония, и получавшей специфическую противовирусную (тамифлю) и антибактериальную терапию. Известно, что данная мутация связана с тяжелым
течением заболевания и неблагоприятным исходом. Предполагается, что такие
мутантные варианты тропны к нижним отделам респираторного тракта и более
устойчивы к противовирусному лечению, чем дикие штаммы (P.K.S. Chan et al.,
2011; A. Kilander et al., 2010.).
Ни у одного описанного нами штамма не обнаружено мутаций, ответственных за резистентность к применяющимся в настоящее время ингибиторам нейраминидазы (озелтамивир, занамивир).
Как показал анализ, по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям штаммы вируса гриппа A(H1N1)pdm09, выделенные во время пандемии в
Западной Сибири, на 99% были подобны референс-штамму A/California/07/2009
и располагались близко к стволу дерева.
3.1.2 Состояние популяционного иммунитета к гриппу у населения Западной Сибири в 2009 – 2010 гг.
Известно, что у части населения обнаруживались антитела к пандемическому штамму A(H1N1)pdm09 до начала пандемии. Так, при анализе сывороток
крови детского и взрослого населения США было показано, что у 33% лиц
старше 60 лет обнаруживались перекрестно реагирующие антитела к пандемическому штамму, в то время как у детей такие антитела отсутствовали (CDC,
2009).
9
Для оценки предсуществующих перекрестно-реагирующиех антител к вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 нами в РТГА были проанализированы сыворотки
крови людей, собранные до начала пандемии: с октября 2008 г. по март 2009 г.
Всего за этот период было собрано 792 образца. Для определения вовлеченности населения Западной Сибири в пандемию нами проводился сбор сывороток
крови у жителей Западной Сибири весной и осенью 2010 г. Всего было собрано
394 образца весной 2010 г. и 1280 образцов осенью 2010 г.
Все сыворотки, собранные до начала, во время и после пандемии, были проанализированы в РТГА на наличие антител к пандемическому вирусу гриппа
A(H1N1)pdm09 и к сезонным штаммам A(H1N1), A(H3N2) и В. В качестве антигенов использовали актуальные штаммы, выделенные на территории Новосибирской области в последний предпандемический сезон и во время пандемии. Результаты сероэпидемиологического исследования представлены в таблице 4.
Таблица 4. РТГА с сыворотками крови, собранными в Западной Сибири до начала и в
конце пандемии
Время
сбора
образцов
Октябрь
2008-март
2009 г.
Март –
апрель
2010 г.
Октябрь –
ноябрь
2010 г.
Возраст и пол
доноров
мужчины
женщины
18-35 лет
36-59 лет
60 лет и старше
Всего
мужчины
женщины
18-35 лет
36-59 лет
60 лет и старше
Всего
мужчины
женщины
18-35 лет
36-59 лет
60 лет и старше
Всего
Процент положительных сывороток к антигену, %± 2σ
A/Koltsovo/
B/Novosibirsk/36/
A/Novosibirsk/65
A/Novosibirsk/31
03/2009
2009 (Victoria
3/2009 (H1N1)
/2009 (H3N2)
(H1N1)pdm09
lin.)
A/Brisbane/59/
A/Brisbane/10/
A/California/07/
B/Brisbane/60/
2007-подобный
2007- подобный
2009- подобный
2008- подобный
34,5±6,7
7,6±3,7
38,0±6,9
29,0±5,7
33,6±5,6
3,9±2,3
40,1±5,8
20,7±6,1
52,6±4,9
4,6±2,1
55,7±4,9
25,5±5,1
20,3±6,5
5,2±3,6
34,6±7,7
27,2±9,3
17,0±7,7
12,8±6,9
34,0±9,8
27,5±9,9
38,6±3,5
5,9±1,6
43,1±3,5
26,0±4,0
14,8±5,8
12,1±5,3
19,5±6,5
6,0±3,9
16,8±5,0
7,3±3,5
15,5±4,9
3,2±2,4
28,2±14,4
7,7±8,5
10,3±9,7
5,1±7,0
14,6±5,1
13,0±4,8
16,1±5,3
3,6±2,7
18,2±6,1
4,4±3,2
22,6±6,6
5,0±3,5
17,3±3,8
8,9±2,9
18,0±3,9
4,3±2,0
5,5±1,9
10,7±2,7
11,2±2,7
6,6±2,1
4,6±1,5
8,8±1,9
12,9±2,3
3,6±1,3
7,8±3,9
17,1±5,4
18,7±5,6
3,6±2,7
4,6±1,7
9,0±2,4
11,8±2,7
6,0±1,9
4,8±1,9
5,0±1,9
11,6±2,9
6,0±2,1
4,9±1,2
8,7±1,6
12,7±1,9
5,6±1,3
Как видно из таблицы 4, до начала пандемии у (5,9±1,6)% населения Западной Сибири имелись антитела к вирусу гриппа A(H1N1)pdm09, при этом наибольший процент положительных сывороток определялся в возрастной группе
60 лет и старше (12,8±6,9%), в то время как в группе 18 – 35 лет антитела к вирусу A(H1N1)pdm09 обнаруживались в (4,6±2,1)% сывороток, а в группе 36 –
59 лет – в (5,2±3,6)%. К концу пандемии отмечалось увеличение процента положительных сывороток до (8,7±1,6)%, при этом наибольший прирост наблюдался в возрастной группе 18 – 35 лет: с (4,6±2,1)% весной 2009 г. до
(17,1±5,4)% к осени 2010 г.
10
Антитела к сезонным вирусам гриппа А(H1N1), A(H3N2) и В до начала пандемии обнаруживались у (38,6±3,5)%, (43,1±3,5)% и (26,0±4,0)% проанализированной выборки соответственно. В конце пандемии мы обнаружили значительное уменьшение количества положительных сывороток к сезонным штаммам
вируса гриппа. Так, весной 2010 г. количество серопозитивных лиц к сезонному
вирусу гриппа A(H1N1) составило (17,3±3,8)%, а осенью 2010 г. – (4,9±1,2)%; к
вирусу гриппа A(H3N2) – (18,0±3,9)% и (12,7±1,9)%; к вирусу гриппа В (Victoria lineage) – (4,3±2,0)% и (5,6±1,3)% соответственно.
Таким образом, результаты исследования популяционного иммунитета к
гриппу у населения Западной Сибири в пандемический период подтверждают
данные вирусологического исследования: увеличение числа серопозитивных
лиц наблюдалось только в отношении вируса A(H1N1)pdm09, являвшегося
этиологическим фактором всех случаев гриппа в данный период.
3.2 Эпидемический сезон 2010 – 2011 гг.
К началу января 2010 г. в большинстве стран мира отмечались низкие уровни заболеваемости пандемическим гриппом (Об итогах пандемии гриппа…,
2010). В августе 2010 г. ВОЗ объявила о завершении первой пандемии 21-го века и наступлении постпандемического периода.
Во время эпидемического сезона 2010 – 2011 гг. было собрано 364 образца
клинического материала. В культуре клеток MDCK было выделено 69 штаммов
вируса гриппа, из них 47 штаммов относились к субтипу A(H1N1)pdm09, что
составило 68,1% от общего числа выделенных штаммов и 94,0% от штаммов
вируса гриппа А. Три штамма (4,3%) относились к вирусу гриппа A(H3N2) и 19
(27,6%) – к вирусу гриппа типа В (линия Victoria). Наибольшее количество
штаммов вируса гриппа было выделено в течение 5-й недели 2011 г.
3.2.1 Выделение вируса гриппа A(H1N1)pdm09, характеристика биологических свойств штаммов, выделенных в 2010 – 2011 гг. и в 2009 – 2010 гг.
Вирус гриппа A(H1N1)pdm09 был доминирующим в этиологии гриппа во
время эпидемического сезона 2010 – 2011 гг. и составил 68,1% от всех штаммов, выделенных на территории Западной Сибири. При анализе возрастной
структуры пациентов, от которых был выделен вирус гриппа A(H1N1)pdm09,
обнаружено, что только 6,2% штаммов данного субтипа были выделены от лиц
старше 60 лет, в то время как от людей в возрасте 0 – 17 лет, 18 – 35 лет и 36 –
59 лет выделено 27,1%, 35,4% и 31,3% штаммов соответственно.
Анализ антигенных свойств штаммов вируса гриппа А(H1N1)pdm09, выделенных в сезоне 2010 – 2011 гг., представлен в таблице 5.
Как видно из данных таблицы 5, штаммы А(H1N1)pdm09, выделенные зимой 2011 г., родственны вакцинному штамму A/California/7/2009, так же как и
штаммы, выделенные в предыдущем сезоне. Только у одного штамма
(A/Tomsk/29/2011) наблюдалось 4-х кратное снижение титра в РТГА с сывороткой к A/California/07/2009 по сравнению с гомологичным титром.
11
Таблица 5. Антигенные свойства штаммов вируса А(H1N1)pdm09, выделенных в эпидемическом сезоне 2010 – 2011 гг. (РТГА с хорьковыми референс-сыворотками и эритроцитами морской свинки)
Штамм вируса гриппа
A/California/07/2009
A/Texas/77/2009
A/South Carolina/2/2010
A/England/195/2009
A/Novosibirsk/KSh/2011
A/Novosibirsk/24k/2011
A/Novosibirsk/53k/2011
A/Novosibirsk/104k/2011
A/Novosibirsk/107k/2011
A/Novosibirsk/89d/2011
A/Novosibirsk/105d/2011
A/Tomsk/18/2011
A/Tomsk/29/2011
A/California/
07/2009
5120
320
2560
2560
10240
2560
2560
2560
2560
2560
2560
2560
1280
Референс-сыворотка
A/Texas/
A/South Carolina/
77/2009
2/2010
160
640
80
320
320
320
320
640
640
640
160
640
160
640
160
640
160
640
160
640
160
640
160
640
160
640
A/England/
195/2009
160
160
320
320
640
80
80
80
80
80
80
160
80
С целью изучения иммуногенных свойств штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09, выделенных в течение сезона 2010 – 2011 гг., мы получили образцы сыворотки крови людей, от которых был выделен вирус гриппа в этом
сезоне. Забор крови осуществлялся однократно, на 21 – 28-е сутки от начала заболевания. Все пациенты, у которых проводился забор крови, не были вакцинированы от гриппа как минимум в течение двух последних сезонов. Наличие
антител в сыворотках крови определяли в РТГА с вакцинным штаммом
A/California/07/2009 и гомологичными антигенами, а также в реакции МН в
культуре клеток MDCK с вакцинным штаммом (таблица 6).
Таблица 6. Титры в РТГА и реакции МН сывороток крови переболевших людей, Кольцово, сезон 2010-2011
№ сыворот-ки
Название штамма, выделенного от данного
пациента
Титр сыворотки в
РТГА с антигеном
A/California/07/
2009(H1N1)pdm09
Титр сыворотки в РТГА с
гомологичным
антигеном
24
27
53
57
102
104
107
110
KSh
A/Novosibirsk/24k/2011
A/Novosibirsk/27k/2011
A/Novosibirsk/53k/2011
A/Novosibirsk/57k/2011
A/Novosibirsk/102k/2011
A/Novosibirsk/104k/2011
A/Novosibirsk/107k/2011
A/Novosibirsk/110k/2011
A/Novosibirsk/KSh/2011
40
20
5
10
5
5
160
10
40
40
5
20
20
80
40
320
20
40
Титр сыворотки в
реакции МН с вирусом гриппа
A/California/07/2009
(H1N1)pdm09
80
20
10
10
10
10
80
10
80
Как видно из таблицы 6, только в трех образцах сывороток обнаружены диагностические титры антител в РТГА и реакции МН к вакцинному штамму и в
пяти образцах в РТГА с гомологичными штаммами. Следует отметить, что при
анализе сывороток крови людей, собранных в конце пандемии, в значительном
числе положительных образцов определялись высокие значения титров антител: 160 – 1280. В 2011 г. титры антител к вирусу А(H1N1)pdm09 были сущест12
венно ниже и только в одном образце сыворотки достигли значения 320 в РТГА
с гомологичным антигеном.
Эти данные подтверждаются результатами анализа сывороток крови двух
групп мышей линии BALB/c, инфицированных штаммами вируса гриппа
A/Novosibirsk/13/2009 (H1N1)pdm09 и А/Novosibirsk/KSH/2011 (H1N1)pdm09.
Инфицирование проводили интраназально в дозе 1000 TCID50 на животное. На
15-е сутки у животных был осуществлен забор крови, после чего полученные
образцы сыворотки крови исследовали в РТГА и реакции МН со штаммами, которыми были инфицированы животные. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7. РТГА и МН с сыворотками крови мышей, инфицированных штаммами вируса А(H1N1)pdm09, выделенными в 2009 и 2011 гг.
Штамм, которым
инфицировали
мышей
A/Novosibirsk/
KSH/2011
(H1N1)pdm09
А/Novosibirsk/
13/2009
(H1N1)pdm09
Сыворотка
KSh-1
KSh-2
KSh-3
KSh-4
KSh-5
KSh-6
Ru-1
Ru-2
Ru-3
Ru-4
Ru-5
Титр в РТГА с антигеном
А/Novosibirsk/K A/Novosibirsk/13/
SH/2011
2009
20
<20
20
<20
20
<20
20
<20
40
20
20
<20
40
40
320
320
80
160
40
160
80
160
Титр в МН с вирусом
А/Novosibirsk/K A/Novosibirs
SH/2011
k/13/2009
40
<20
80
<20
80
<20
160
<20
160
<20
40
<20
40
40
640
1280
320
640
320
160
320
160
KSh-1 – KSh-6 – образцы сыворотки крови мышей, инфицированных вирусом A/Novosibirsk/
KSH/2011(H1N1)pdm09;
Ru -1 – Ru-5 – образцы сыворотки крови мышей, инфицированных вирусом A/Novosibirsk/
13/2009(H1N1)pdm09.
Как видно из таблицы 7, инфицирование мышей штаммом
A/Novosibirsk/13/2009(H1N1)pdm09 привело к развитию выраженного гуморального ответа: в четырех сыворотках из пяти титры антител в РТГА и МН с
обоими штаммам вируса A(H1N1)pdm09 выше пороговых значений (40 для
РТГА и 80 для МН). В то же время в сыворотках крови мышей, инфицированных штаммом А/Novosibirsk/KSH/2011(H1N1)pdm09, определялись антитела
только к гомологичному штамму в одной сыворотке из шести в РТГА и в четырех сыворотках из шести в реакции МН. Таким образом, мы наблюдали изменение способности штаммов вируса гриппа А(H1N1)pdm09, циркулировавших
в пандемический и постпандемический периоды, вызывать образование специфических антител, что может оказать влияние на уровень популяционного иммунитета и, тем самым, на степень защищенности популяции от заболевания,
вызываемого данным субтипом вируса гриппа.
При сравнении аминокислотных последовательностей гемагглютинина выделенных штаммов было обнаружено 16 замен относительно вакцинного
штамма A/California/07/2009, причем 8 из них характерны для всех исследованных штаммов (таблица 8). Некоторые из обнаруженных замен расположены в
антигенных сайтах гемагглютинина (R. Xu et al., 2010): замены S185T (антиген13
ный сайт Sb) и S203T (антигенный сайт Ca1) характерны для всех проанализированных штаммов, замена E235K (антигенный сайт Ca1) присутствует в трех
штаммах, замена L70F (антигенный сайт Cb) обнаружена в одном штамме. У
всех штаммов обнаружены замены (S143G, S185T, A197T, S451N), позволяющие отнести их к генетической группе 7. По данным CDC, штаммы, принадлежащие к данной генетической группе, имеют характерные аминокислотные замены в нейраминидазе: V241I, N369K и N44S, что мы также наблюдали во всех
изученных штаммах(таблица 9). Ни у одного штамма не было обнаружено замен, обусловливающих устойчивость к ингибиторам нейраминидазы. Филогенетическое дерево гена гемагглютинина штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09, выделенных во время сезона 2010 – 2011 гг., представлено на
рисунке 1.
Таблица 8. Аминокислотные замены в гемагглютинине штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09, выделенных в Западной Сибири в постпандемический период (эпидемический сезон 2010 – 2011 гг.)
Штамм вируса
гриппа
A/California/
07/2009
A/Novosibirsk/
24k/2011
A/Novosibirsk/
53k/2011
A/Novosibirsk/
89d/2011
A/Novosibirsk/
104k/2011
A/Novosibirsk/
105d/2011
A/Novosibirsk/
107k/2011
A/Novosibirsk/
KSh/2011
A/Tomsk/
18/2011
A/Tomsk/
29/2011
№
GenBank
CY10
3845
CY10
3847
CY10
3841
CY10
3849
CY10
3843
CY10
3851
JQ041
354
CY10
3853
CY10
3855
16
70
83
97
14
3
18
5
19
7
20
3
21
1
21
5
23
5
31
6
32
1
37
4
45
1
45
8
V
L
P
D
S
S
A
S
K
A
E
T
I
E
S
K
S
G
T
T
T
V
K
N
R
S
G
T
T
T
K
V
K
N
S
G
T
T
T
K
V
K
N
S
G
T
T
T
V
K
N
S
G
T
T
T
V
K
N
S
G
T
T
T
V
K
N
S
G
T
T
T
V
K
N
S
G
T
T
T
V
K
N
G
T
T
T
V
K
N
I
F
S
N
N
E
K
A
R
Таблица 9. Аминокислотные замены в нейраминидазе штаммов вируса гриппа
A(H1N1)pdm09, выделенных в Западной Сибири в постпандемический период (эпидемический сезон 2010 – 2011 гг.)
Штамм вируса гриппа
A/California/07/2009
A/Novosibirsk/24k/2011
A/Novosibirsk/53k/2011
A/Novosibirsk/89d/2011
A/Novosibirsk/104k/2011
A/Novosibirsk/105d/2011
A/Novosibirsk/107k/2011
A/Novosibirsk/KSh/2011
A/Tomsk/18/2011
A/Tomsk/29/2011
№
GenBank
CY103846
CY103848
CY103842
CY103850
CY103844
CY103852
JQ041356
CY103854
CY103856
29
36
44
51
71
75
106
241
248
343
369
451
458
I
H
N
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Q
N
A
V
V
I
I
I
I
I
I
I
I
I
V
I
I
I
I
I
I
I
I
I
N
D
D
D
D
D
D
D
D
D
A
N
K
K
K
K
K
K
K
K
K
S
N
N
N
N
N
N
N
N
N
K
R
Y
T
K
T
14
V
R
Рисунок 1. Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 нуклеотид) штаммов
вируса гриппа A(H1N1)pdm09, сезон 2010 – 2011 гг.
15
3.2.2 Характеристика биологических свойств штаммов вируса гриппа
A(H3N2), выделенных в 2010 – 2011 гг.
В течение эпидемического сезона 2010 – 2011 гг. было выделено 3 штамма
вируса гриппа A(H3N2). Результаты антигенного анализа выделенных штаммов
представлены в таблице 10.
Таблица 10. Антигенные свойства штаммов вируса А(H3N2), выделенных в эпидемический сезон 2010 – 2011 гг. (РТГА с хорьковыми референс-сыворотками и эритроцитами морской свинки)
Референс-сыворотка
Штамм вируса гриппа
A/Uruguay/716/2006
A/Brisbane/10/2007
A/Wisconsin/15/2009
A/Perth/16/2009
A/Rhode Island/01/2010
A/Victoria/361/2011
A/Novosibirsk/76k/2011
A/Novosibirsk/1832/2011
A/Novosibirsk/1927/2011
A/Uruguay A/Brisbane A/Wisconsin
/716/2006
/10/2007
/15/2009
A/Perth/
16/2009
640
640
20
20
20
80
20
20
20
20
80
320
640
320
80
640
640
640
1280
1280
20
20
20
20
20
20
20
20
40
320
640
320
40
1280
640
640
A/Rhode
Island/
01/2010
20
40
160
320
640
80
640
1280
640
A/Victoria/
361/2011
–
–
–
640
–
640
1280
5120
1280
(–) – исследование не проводилось
Как видно из таблицы 10, по антигенным свойствам все штаммы близки между собой и подобны вакцинному штамму A/Perth/16/2009. В то же время они
не проявляли кросс-реактивности с сывороткой к предыдущему вакцинному
штамму A/Brisbane/10/2007.
Для всех выделенных штаммов получены полные нуклеотидные последовательности генов HA (номера в GenBank: JN940427, JN940429, JN940431) и NA
(номера в GenBank: JN940428, JN940430, JN940432). Результаты молекулярногентического исследования подтверждают данные антигенного анализа: в аминокислотных последовательностях гемагглютинина исследованных штаммов
обнаружены замены, общие с вакцинным штаммом A/Perth/16/2009, и отличающие их от вакцинного штамма предыдущего эпидемического сезона
A/Brisbane/10/2007. Кроме того, в структуре гемагглютинина было обнаружено
5 общих для всех штаммов 2010 – 2011 гг. и 4 уникальных аминокислотных замены, отличающих их от вакцинного штамма. Анализ аминокислотных последовательностей нейраминидазы показал сходство исследуемых штаммов с вакцинным штаммом A/Perth/16/2009. Мутаций, обусловливающих устойчивость к
антинейраминидазным препаратам, не обнаружено.
3.2.3 Характеристика биологических свойств штаммов вируса гриппа В,
выделенных в 2010 – 2011 гг.
Всего в течение эпидемического сезона 2010 – 2011 гг. на юге Западной Сибири нами было выделено 19 штаммов вируса гриппа В. Анализ антигенных
свойств выделенных штаммов представлен в таблице 11.
16
Таблица 11. Антигенные свойства штаммов вируса гриппа B (РТГА с хорьковыми референс-сыворотками и эритроцитами петуха)
Штамм вируса гриппа
B/Malaysia/2506/2004 (Vict.lin.)
B/Ohio/1/2005 (Vict.lin.)
B/Brisbane/60/2008 (Vict.lin.)
B/Florida/04/2006 (Yam.lin.)
B/Bangladesh/3333/2007 (Yam.lin.)
B/Novosibirsk/SI/2011
B/Novosibirsk/29k/2011
B/Novosibirsk/91k/2011
B/Novosibirsk/153k/2011
B/Novosibirsk/04/2010
B/Novosibirsk/05/2011
B/Novosibirsk/08/2011
B/Novosibirsk/09/2011
B/Malaysia/
2506/2004
320
320
320
<20
<20
20
40
20
20
80
80
40
80
B/Ohio/
1/2005
640
640
1280
<20
<20
320
160
80
80
160
320
160
320
Референс-сыворотка
B/Brisbane/ B/Florida/
60/2008
04/2006
40
<20
40
<20
<20
640
<20
320
<20
640
160
<20
160
<20
80
<20
80
<20
160
<20
160
<20
160
<20
320
<20
B/Bangladesh/
3333/2007
<20
<20
<20
40
640
<20
<20
<20
<20
<20
<20
<20
<20
Как видно из таблицы 11, все проанализированные штаммы вируса гриппа В
относились к линии Victoria, большинство штаммов были близки к вакцинному
штамму B/Brisbane/60/2008, однако у двух штаммов наблюдалось уменьшение
сродства с сывороткой к B/Brisbane/60/2008 в 8 раз по сравнению с гомологичным штаммом. Также для двух штаммов наблюдалось уменьшение, а для трех
штаммов – отсутствие перекрестной реактивности в РТГА с сывороткой к
B/Malaysia/2506/2004. Полученные данные свидетельствуют об антигеном
дрейфе вируса гриппа В, проявляющемся в уменьшении кросс-реактивности с
сывороткой к вакцинному штамму вследствие уклонения от существующего
иммунного пресса со стороны популяции.
3.2.4 Оценка уровня популяционного иммунитеа к гриппу у населения Западной Сибири в 2010 – 2011 гг.
Для оценки уровня популяционного иммунитета к циркулирующим штаммам вируса гриппа у населения Западной Сибири в сезоне 2010-2011 гг. собрано 1280 образцов сыворотки крови осенью 2010 г. и 840 образцов весной 2011
г. Наличие антител к различным типам/субтипам вируса гриппа определяли в
РТГА. Результаты РТГА представлены в таблице 12.
Таблица 12. Сероэпидемиологические исследования в Западной Сибири в эпидемическом сезоне 2010 – 2011 гг.
Количество положительных сывороток к антигену, (абсолютное
число (%± 2σ))
Время
A/Novosibirsk/
B/Novosibirsk/
Возраст доно- Кол-во A/Novosibirsk/653
A/Novosibirsk/7
сбора образKSh/2011
29k/2011 (Vicров
сыв-ок
/2009 (H1N1)
6k/2011 (H3N2)
цов
(H1N1)pdm09
toria lin.)
A/Brisbane/59/
A/Perth/16/
A/California/07/
B/Brisbane/
2007-like
2009-like
2009-like
60/2008-like
18-35 лет
193
15 (7,8±3,9)
33 (17,1±5,4)
36 (18,7±5,6)
7 (3,6±2,7)
36-59 лет
586
27 (4,6±1,7)
53 (9,0±2,4)
69 (11,8±2,7)
35 (6,0±1,9)
Октябрь ноябрь 2010 60 лет и старше
501
24 (4,8±1,9)
25 (5,0±1,9)
58 (11,6±2,9)
30 (6,0±2,1)
Всего
1280
63 (4,9±1,2)
111 (8,7±1,6)
163 (12,7±1,9)
72 (5,6±1,3)
18-35 лет
101
19 (18,8±7,8)
25 (24,8±8,6)
19 (18,8±7,8)
11(10,9±6,2)
36-59 лет
390
32 (8,2±2,8)
64 (16,4±3,7)
41 (10,5±3,1)
49 (12,6±3,4)
Март –
апрель 2011 60 лет и старше
349
21 (6,0±2,5)
25 (7,2±2,8)
38 (10,9±3,3)
49 (14,0±3,7)
Всего
840
78 (9,3±2,0)
114 (13,6±2,4)
98 (11,7±2,2)
109 (13,0±2,3)
17
Как видно из таблицы 12, в конце эпидемического сезона 2010 – 2011 гг. антитела к «старому» сезонному вирусу гриппа A(H1N1) определялись у
(9,3±2,0)% исследованной выборки, к пандемическому вирусу гриппа
A(H1N1)pdm09 – у (13,6±2,4)%, к вирусу гриппа A(H3N2) – у (11,7±2,2)% и к
вирусу гриппа В (линия Victoria) – у (13,0±2,3)% людей из случайной выборки.
При сравнении процента положительных сывороток в различных возрастных
группах обнаружено, что наименьший процент положительных сывороток к
пандемическому вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 отмечался в возрастной группе
старше 60 лет ((7,2±2,8)%) по сравнению с группами 18 – 35 лет ((24,8±8,6)%) и
36 – 59 лет ((16,4±3,7)%). Эти данные согласуются с возрастной структурой пациентов, от которых выделялся вирус гриппа A(H1N1)pdm09.
В конце эпидемического сезона отмечалось увеличение числа серопозитивных лиц к вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 по сравнению с осенью 2010 г.: с
(8,7±1,6)% до (13,6±2,4)%, причем преимущественно за счет возрастной группы
36 – 59 лет (в 1,8 раза, χ2=12,042). Также весной 2011 г. наблюдалось увеличение числа серопозитивных лиц в отношении вируса гриппа В (линия Victoria) в
2,3 раза (χ2=35,098) по сравнению с осенью 2010 г. во всех возрастных группах.
Что касается сывороток, положительных к вирусу гриппа A(H3N2), то мы не
наблюдали значимого изменения в количестве серопозитивных лиц к данному
субтипу вируса гриппа в конце эпидемического сезона 2010 – 2011 гг. Вместе с
тем, отмечался значимый прирост процента положительных сывороток к «старому» сезонному вирусу гриппа A(H1N1), несмотря на то, что данный субтип
не выделялся с 2009 г.
3.3 Эпидемический сезон 2011 – 2012 гг.
Во время эпидемического сезона 2011 – 2012 гг. было проанализировано 732
образца мазков из носа и зева от лиц с симптомами ОРВИ. Из полученных
образцов в культуре клеток MDCK было выделено 104 штамма вируса гриппа,
из них 96 штаммов (92,3%) относились к вирусу гриппа А(H3N2), 8 штаммов
(7,7%) – к вирусу гриппа типа В. Наибольший процент выделения вируса
гриппа пришелся на 9-ю – 10-ю недели, что, по данным ВОЗ, было характерно
и для европейского региона. За весь эпидемический сезон 2011-2012 гг. на
территории Западной Сибири не было выделено ни одного штамма вируса
гриппа A(H1N1)pdm09.
3.3.1 Характеристика биологических свойств штаммов вируса гриппа
A(H3N2), выделенных в 2011 – 2012 гг.
Доминирующим (92,3% от всех выделенных штаммов) во время сезона
2011–2012 гг. в Западной Сибири был вирус гриппа A(H3N2).
Анализ антигенных свойств штаммов вируса гриппа A(H3N2), выделенных в
течение сезона 2011–2012 гг. (24 штамма), и сравнение их со штаммами, выделенными в 2010–2011 гг. (3 штамма), проводили в РТГА с использованием
хорьковых референс-сывороток (CDC, США). В результате антигенного анализа (таблица 13) было выявлено, что у 11 штаммов, выделенных в сезоне 2011–
2012 гг., наблюдалось 4-кратное, у 7 штаммов – 8-кратное, а у 2 штаммов – 16кратное снижение титра в РТГА с сывороткой, полученной на вакцинный
18
штамм A/Perth/16/2009, в то время как для штаммов, выделенных в сезоне
2010 – 2011 гг., титры в РТГА с данной сывороткой были равны титру с гомологичным антигеном. Для сыворотки A/Brisbane/10/2007 мы наблюдали отсутствие кроссреактивности со штаммами сезона 2010–2011 гг. и повышение
уровня антигенного сродства к некоторым штаммам сезона 2011–2012 гг.
Большинство штаммов вируса гриппа A(H3N2) сезона 2011–2012 гг. проявляли
максимальное сродство к сыворотке, полученной на штамм A/Victoria/361/2011:
ни у одного проанализированного штамма не наблюдалось снижения титра в
РТГА с данной сывороткой более чем в 4 раза по сравнению с гомологичным
штаммом. Таким образом, мы наблюдали антигенный дрейф штаммов вируса
гриппа A(H3N2) сезона 2011 – 2012 гг., проявившийся в снижении антигенного
сродства с сывороткой к вакцинному штамму A/Perth/16/2009 для 40% проанализированных штаммов.
Таблица 13. Сравнительный анализ антигенных свойств штаммов вируса гриппа
А(H3N2), выделенных в эпидемические сезоны 2011 – 2012 гг. и 2010 – 2011 гг. (РТГА с
хорьковыми референс-сыворотками и эритроцитами морской свинки)
Штамм вируса гриппа
A/Brisbane/10/2007
A/Perth/16/2009
A/Victoria/361/2011
A/Novosibirsk/76k/2011
A/Novosibirsk/1832/2011
A/Novosibirsk/1927/2011
A/Novosibirsk/47/2012
A/Novosibirsk/38/2012
A/Novosibirsk/44/2012
A/Novosibirsk/37/2012
A/Novosibirsk/32/2012
A/Novosibirsk/59d/2012
A/Novosibirsk/41k/2012
A/Novosibirsk/155/2012
A/Novosibirsk/59/2012
A/Novosibirsk/56/2012
A/Novosibirsk/15/2012
A/Novosibirsk/16/2012
A/Novosibirsk/26k/2012
A/Novosibirsk/60/2012
A/Novosibirsk/61/2012
A/Novosibirsk/57/2012
A/Novosibirsk/52/2012
A/Novosibirsk/13/2012
A/Novosibirsk/23k/2012
A/Novosibirsk/35k/2012
A/Novosibirsk/22/2012
A/Tyumen/03/2012
A/Omsk/08/2012
A/Omsk/01/2012
A/Brisbane/
10/2007
640
20
80
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
40
40
40
40
80
80
160
160
160
20
160
160
Референс-сыворотка
A/Perth/
16/2009
80
640
80
640
640
640
40
80
80
160
160
160
160
160
160
160
320
320
40
80
80
80
80
320
160
160
80
160
160
320
A/Victoria/
361/2011
–
640
640
1280
5120
1280
160
640
2560
320
640
1280
1280
2560
2560
5120
1280
2560
160
160
640
1280
5120
1280
320
5120
160
640
2560
2560
Примечания: (–) – исследование не проводилось
Для 7 штаммов вируса гриппа A(H3N2), выделенных в Новосибирской области в эпидемическом сезоне 2011 – 2012 гг. (номера в GenBank:
19
A/Novosibirsk/26k/2012(H3N2) – KC135502 и KC135503; A/Novosibirsk/13/2012
(H3N2) – KC135504 и KC135505; A/Novosibirsk/16/2012 (H3N2) – KC135508 и
KC135509; A/Novosibirsk/22/2012(H3N2) – KC135506 и KC135507;
A/Novosibirsk/155/2012(H3N2) – KC135500 и KC135501; A/Novosibirsk/02d/2012
(H3N2) – KC135496 и KC135497; A/Novosibirsk/59d/2012 (H3N2) – KC135498 и
KC135499), а также для штамма A/Tyumen/03/2012 (номера в GenBank –
KC135512 и KC135513) получены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности HA и NA. Филогенетическое дерево гена гемагглютинина
представлено на рис. 2. Филогенетический анализ и анализ аминокислотных
замен в первичной структуре гемагглютинина и нейраминидазы показали сходство штаммов вируса гриппа A(H3N2), выделенных в Западной Сибири в 2011–
2012 гг., с вакцинным штаммом A/Victoria/361/2011. Выделенные штаммы принадлежали к генетическим группам 3В и 3С клады Victoria/208. Ни у одного
штамма не было обнаружено замен, обусловливающих устойчивость к ингибиторам нейраминидазы (озелтамивир, занамивир).
3.3.2 Характеристика биологических свойств штаммов вируса гриппа В, выделенных в 2011 – 2012 гг.
Штаммы вируса гриппа В в эпидемическом сезоне 2011 – 2012 гг. составили
7,7% от всех выделенных штаммов. При этом большинство из них (7 из 8) относились к линии Yamagata, и только 1 штамм принадлежал линии Victoria, в то
время как в течение трех предыдущих эпидемических сезонов на территории
Западной Сибири выделялись только штаммы Викторианской линии. Антигенные свойства некоторых штаммов, выделенных на юге Западной Сибири в 2011
– 2012 гг., представлены в таблице 14.
Таблица 14. Антигенные свойства штаммов вируса гриппа B эпидемического сезона
2011-2012 гг. (РТГА с хорьковыми референс-сыворотками и эритроцитами петуха)
Штамм вируса гриппа
B/Malaysia/2506/2004
(Vict.lin.)
B/Ohio/1/2005 (Vict.lin.)
B/Brisbane/60/2008
(Vict.lin.)
B/Florida/04/2006
(Yam.lin.)
B/Bangladesh/3333/2007
(Yam.lin.)
B/Wisconsin/01/2010
(Yam.lin.)
B/Novosibirsk/02/2012
B/Novosibirsk/03/2012
B/Novosibirsk/34/2012
B/Novosibirsk/51/2012
B/Omsk/01/2012
B/Novosibirsk/74/2012
Референс-сыворотка
B/Malaysia/
2506/2004
B/Ohio/
1/2005
B/Brisbane/
60/2008
B/Florida/
04/2006
B/Bangladesh/
3333/2007
B/Wisconsin/01/2010
320
640
40
<20
<20
<20
320
640
40
<20
<20
<20
320
1280
640
<20
<20
<20
<20
<20
<20
320
40
<20
<20
<20
640
640
<20
<20
<20
–
–
320
<20
<20
<20
<20
<20
40
<20
<20
<20
<20
<20
80
<20
<20
<20
<20
<20
80
160
320
160
160
160
<20
80
160
80
160
640
<20
640
320
640
320
320
<20
(–) – исследование не проводилось
20
–
–
Рисунок 2. Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 нуклеотид) штаммов
вируса гриппа A(H3N2), сезоны 2010 – 2011 гг. и 2011 – 2012 гг.
21
Из данных таблицы 14 видно, что штаммы B/Novosibirsk/02/2012,
B/Novosibirsk/03/2012,
B/Novosibirsk/34/2012,
B/Novosibirsk/51/2012
и
B/Omsk/01/2012 принадлежали генетической линии Yamagata и были подобны
штамму B/Wisconsin/01/2010. Штамм B/Novosibirsk/74/2012 относился к линии
Victoria, однако он проявлял сниженную кросс-реактивность с сывороткой к
штамму, входившему в состав трехвалентной вакцины на сезон 2011 – 2012 гг.
(8-кратное уменьшение титра в РТГА по сравнению с гомологичным). Следует
отметить, что линии вируса гриппа В (B/Victoria/2/87-линия и
B/Yamagata/16/88-линия), различаются генетически и по антигенным свойствам, и антитела к вирусам одной линии не являются протективными в отношении вирусов другой линии.
3.3.3 Оценка уровня популяционного иммунитеа к гриппу у населения Западной Сибири в 2011 – 2012 гг.
Для проведения сероэпидемиологических исследований было собрано 758
образцов в октябре – ноябре 2011 г. и 808 образцов в апреле – мае 2012 г. Наличие антител к эпидемически значимым штаммам вируса гриппа в сыворотках
крови определяли в РТГА (таблица 15).
Таблица 15. Сероэпидемиологические исследования в Западной Сибири в эпидемическом сезоне 2011 – 2012 гг.
Время
сбора
образцов
Возраст доноров
18-35 лет
Октябрь36-59 лет
ноябрь
60 лет и старше
2011
Всего
18-35 лет
Апрель36-59 лет
май
60 лет и старше
2012
Всего
Колво
сывок
193
335
230
758
85
382
341
808
Количество положительных сывороток к антигену,
(абсолютное число (%± 2σ))
B/Novosibirs
A/Novosibirs A/Novosibirsk/ A/Novosibirsk/ B/Novosibirs
k/34/2012
k/653/2009
KSh/2011
23k/2011
k/29k/2011
(Yamagata
(H1N1)
(H1N1)pdm09
(H3N2)
(Victoria lin.)
lineage)
A/Brisbane/ A/California/07/ A/Victoria/361/ B/Brisbane/
B/Wiskonsin/
59/2007-like
2009-like
2011-like
60/2008-like
01/2010-like
35 (18,1±5,5)
59 (30,6±6,6)
44 (22,8±6,0) 32 (16,6±5,4) 37 (19,2±5,7)
20 (6,0±2,6)
65 (19,4±4,3)
36 (10,7±3,4) 49 (14,6±3,9) 19 (5,7±2,5)
26 (11,3±4,2)
16 (6,9±3,3)
33 (14,3±4,6) 35 (15,2±4,7) 12 (5,2±2,9)
81 (10,7±2,2) 140 (18,5±2,8)
113 (14,9±2,6) 116 (15,3±2,6) 68 (8,9±2,1)
13 (15,3±7,8)
25 (29,4±9,9)
18 (21,2±8,9) 22 (25,9±9,5) 33 (38,8±10,7)
38 (9,9±3,1)
101 (26,4±4,5)
78 (20,4±4,1) 76 (19,9±4,1) 66 (17,3±3,9)
47 (13,8±3,7)
49 (14,4±3,8)
61 (17,9±4,2) 53 (15,5±3,9) 59 (17,3±4,1)
76 (9,4±2,1)
174 (21,5±2,9)
157 (19,4±2,8) 150 (18,6±2,7) 158 (19,6±2,8)
Как видно из таблицы 15, в конце эпидемического сезона 2011 – 2012 гг. антитела к вирусу гриппа A(H1N1)pdm09 обнаруживались у (21,5±2,9)% проанализированной выборки, причем, как и в предыдущие сезоны, наибольшее количество серопозитивных лиц наблюдалось в возрастных группах 18 – 35 лет и
36- 59 лет по сравнению со старшей возрастной группой. Вместе с тем, мы не
обнаружили значимого увеличения процента положительных сывороток к вирусу A(H1N1)pdm09 в конце эпидемического сезона по сравнению с началом
сезона. Уровень иммунного населения к вирусу гриппа А(H3N2) в конце эпидемического сезона составил (19,4±2,8)%. По сравнению с началом эпидемического сезона, мы отмечали увеличение количества положительных сывороток к
субтипу А(H3N2) на 4,5% (χ2=5,607), причем прирост наблюдался преимущественно за счет средней возрастной группы. В отношении лиц, имеющих антите22
ла к вирусу гриппа В, мы не обнаружили значимого увеличения числа серопозитивных людей к вирусу линии Victoria в конце эпидемического сезона по
сравнению с осенью 2011 г. В то же время наблюдался значимый прирост числа
серопозитивных лиц к вирусу гриппа В линии Yamagata (в 2,2 раза, χ2=35,474),
причем за счет всех возрастных групп.
Следует отметить, что данные серомониторинга несколько расходятся с результатами выделения вируса гриппа. Так, по данным о циркулировавших в Западной Сибири штаммах, в сезоне 2011-2012 гг. преобладал вирус гриппа
А(H3N2), а по результатам серомониторинга – вирус гриппа В. Это противоречие можно объяснить тем, что, по-видимому, заболевание, вызванное вирусом
гриппа В, протекало в более легкой форме, поэтому мало людей обращалось за
медицинской помощью в лечебные учреждения, где собирался клинический
материал.
4. ВЫВОДЫ
1.
Показано, что предсуществующий иммунитет к пандемическому вирусу
гриппа А(H1N1)pdm09 имели (5,9±1,6)% населения Западной Сибири, при этом
в возрастной группе 18 – 35 лет число серопозитивных лиц составляло
(4,6±2,1)%, в возрастной группе 36 – 59 лет – (5,2±3,6)%, в возрастной группе
60 лет и старше – (12,8±6,9)%.
2.
К октябрю 2010 г. количество серопозитивных лиц к пандемическому
вирусу гриппа А(H1N1)pdm09 в возрастной группе 18 – 35 лет увеличилось до
(17,1±5,4)%. В других возрастных группах не было статистически достоверного
изменения процента положительных сывороток.
3.
В период пандемии в Западной Сибири (июль 2009 г. – февраль 2010 г.)
заболевание вызывали штаммы вируса гриппа A(H1N1)pdm09, по молекулярнобиологическим и антигенным характеристикам подобные референс-штамму
A/California/07/2009; все штаммы были чувствительны к антинейраминидазным
препаратам (озельтамивир, занамивир).
4.
В 2010-2011 гг. в Западной Сибири заболевание вызывали штаммы вируса гриппа А(H1N1)pdm09, А(Н3N2) и вирусы гриппа В со значительным преобладанием вируса гриппа А(H1N1)pdm09. Все штаммы вируса А(H1N1)pdm09
были близки референс-штамму A/California/07/2009 (H1N1)pdm09 и принадлежали генетической группе 7, штаммы А(Н3N2) были вариантами штамма
A/Perth/16/2009 (клада Perth/16), вирусы гриппа В подобны B/Brisbane/60/2008
(линия Victoria).
5.
В эпидемическом сезоне по гриппу 2011-2012 гг. в Западной Сибири циркулировали преимущественно штаммы вируса гриппа A(H3N2) (генетичекая
клада Victoria/208); наблюдалась совместная циркуляция штаммов вируса
гриппа В двух генетических линий – Victoria и Yamagata с преобладанием
штаммов линии Yamagata.
6.
К маю 2012 г. от (18,6±2,7)% до (21,5±2,9)% населения Западной Сибири
имели защитные титры антител к эпидемически значимым штаммам вируса
гриппа (А(H1N1)pdm09, А(Н3N2), B/Victoria, B/Yamagata), циркулировавшим в
Западной Сибири в 2009 – 2012 гг.
23
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Prokopeva E.A. Comparative Analysis of Biological Propertis of Influenza A(H1N1)pdm09
Virus Strains isolated in the Pandemic of 2009 and the Post-Pandemic Period in the Asian Part of
Russia / E.A. Prokopeva, S.G. Sayfutdinova, A.V. Glushchenko, O.G. Kurskaya, A.V. Zaykovskaya, A.G. Durymanov, T.N. Ilyicheva, L.V. Shestopalova, A.M. Shestopalov // Journal of Virology and Microbiology. – 2013. Vol. 2013 (2013). – DOI: 10.5171/2013.890660.
2.
Курская О.Г. Анализ эпидемической ситуации по гриппу в 2011-2012 годах в Западной Сибири / О.Г. Курская, И.А. Соболев, А.Г. Дурыманов, С.А. Дронова, А.М. Шестопалов,
Т.Н. Ильичева // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2013. – Том 11,
выпуск 1. – С. 118-123.
3.
Sobolev I.A. Molecular genetic analysis of influenza A/H3N2 virus strains isolated in Western Siberia in the 2010-2011 epidemic season / I.A. Sobolev, O.G. Kurskaya, I.M. Susloparov, T.N.
Ilyicheva, A.M. Shestopalov // Infection, Genetics and Evolution. – 2012. – Vol. 12(8). – P. 16941698.
4.
Соболев И.А. Эпидемиологическая ситуация по гриппу на юге Западной Сибири в
2011-2012 гг. / И.А. Соболев, О.Г. Курская, Е.В. Иванова, А.Г. Дурыманов, Т.Н. Ильичева,
В.Н. Михеев, А.М. Шестопалов // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО
РАМН. – 2012. – № 5 (87), часть 1. – С. 122-126.
5.
Ilyicheva T.N. Influenza A/H1N1pdm virus in Russian Asia in 2009-2010 / T.N. Ilyicheva,
I.M. Susloparov, A.G. Durymanov, A.A. Romanovskaya, K.A. Sharshov, O.G. Kurskaya, M.B. Ignashkina, A.M. Shestopalov // Infection, Genetics and Evolution. – 2011. – Vol. 11. – P. 21072112.
6.
Курская О.Г. Изучение пандемического гриппа A/H1N1 в Сибирском и Дальневосточном регионах (сезон 2009-2010) / О.Г. Курская, И.М. Суслопаров, А.Г. Дурыманов, М.Б.
Игнашкина, А.В. Глущенко, А.М. Шестопалов, Т.Н. Ильичева // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2011. – Том 9, №2. – С. 156-161.
7.
Курская О.Г. Мониторинг антител к вирусу гриппа А у населения различных регионов
Западной Сибири / О.Г. Курская, Т.Н. Ильичева, А.В. Зайковская, Л.М. Горбатовская, А.М.
Шестопалов, И.Г. Дроздов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. –
2009. – № 3. – С. 92-95.
8.
Курская О.Г. Мониторинг за уровнем антител к вирусу гриппа А у населения районов
Западной Сибири, неблагополучных по гриппу H5N1/ О.Г. Курская, А.В. Зайковская, А.М.
Шестопалов, Т.Н. Ильичева, К.А. Шаршов // Российский иммунологический журнал. – 2008.
– Т. 2 (11). – №2-3. – С.253.
9.
Ильичева Т.Н. Маркеры пандемического вируса гриппа А (H1N1) у населения Сибири
и Дальнего Востока в 2009-2011 гг. / Т.Н. Ильичева, О.Г. Курская, А.Г. Дурыманов, М.Б. Игнашкина, А.В. Глущенко // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской науч.практ. конф. с междунар. участием. – Абакан, 2011. – С. 133.
10.
Ilycheva T.N. Influenza A/H1N1 pdm virus in Western Siberia in 2009-2011 / T.N. Ilycheva, O.G. Kurskaya, A.G. Durymanov, I.M. Susloparov, I.A. Sobolev // International Conference
«Pathogenesis of Influenza: Virus-Host Interaction». –Hong-Kong, China, 2011. – P. 78.
11.
Sobolev I.A. Influenza virus sensitivity to antiviral drugs: rimantadine, oseltamivir and arbidol / I.A. Sobolev, A.A. Romanovskaya, O.G. Kurskaya, A.G. Durymanov, T.N. Ilyicheva // 4th
Oxford International Influenza Conference «Influenza2011: Zoonotic Influenza and Human
Health». – Oxford, UK, 2011. – P.12-13.
12.
Kurskaya O.G. Influenza A markers in sera of Russian population with different risk of
exposure to H5N1 avian influenza virus / O.G. Kurskaya, A.V. Zaykovskaya, A.G. Durymanov,
A.M. Shestopalov // International Conference «Bird Flu 2008: Avian Influenza and Human
Health». – Oxford, UK, 2008. – С. 31.
13.
Ильичева Т.Н. Маркеры вируса гриппа у населения Западной Сибири / Т.Н. Ильичева,
О.Г. Курская, А.Г. Дурыманов, А.М. Шестопалов // Проблемы совершенствования межгосу-
24
дарственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа: материалы Междунар. науч.практ. конф. – Новосибирск, 2008. – С. 33.
14.
Ilyicheva T.N. Surveillance for H5N1 Avian Influenza Infection among Different Humans
Populations in Western Siberia / T.N. Ilyicheva, O.G. Kurskaya, A.G. Durymanov, A.M. Shestopalov, I.G. Drozdov // The 9th International Meeting "Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases" (MEEGID IX). – University of California at Irvine, USA, 2008. – Р.
238.
15.
Игнашкина М.Б. Особенности вирусов гриппа, вызвавших сезонный подъем заболеваемости в Новосибирской области в 2008-2009 г. / М.Б. Игнашкина, О.Г. Курская, А.А. Романовская, А.Г. Дурыманов, М.В. Кулак // Медицинская геномика и протеомика: материалы
науч. конф. – Новосибирск, 2009. – С. 126.
16.
Sharshov K.A. Avian and Human Influenza Virus Surveillance in Asian part of Russia
(2010-2011) / K.A. Sharshov, A.G. Durymanov, M. V. Sivay, S.G. Saifutdinova, O.G. Kurskaya //
XIV International Symposium on Respiratory Viral Infections. – Istanbul, Turkey, 2012. – Р. 56.
17.
Sobolev I.A. Investigation of Circulation of the Influenza Virus in the Human Population in
Western Siberia in 2011-2012 / I.A. Sobolev, O.G. Kurskaya, A.G. Durymanov, T.N. Ilyicheva,
A.M. Shestopalov // Programme and Abstract book: Incidence, Severity, and Impact: International
Conference on Seasonal and Pandemic Influenza. – Munich, Germany, 2012. – P.67.
18.
Курская О.Г. Особенности эпидемического сезона по гриппу 2011 – 2012 гг. на юге
Западной Сибири / О.Г. Курская, И.А. Соболев, Е.В. Иванова, А.Г. Дурыманов, Т.Н. Ильичева, В.Н. Михеев, А.М. Шестопалов // Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика,
лечение: сборник статей конф. молодых специалистов. – Санкт-Петербург, 2012. – С.53.
25