Готовые среды BBL в чашках для изоляции микобактерий

 Готовые среды BBL в чашках для изоляции микобактерий
Middlebrook 7H10//7H10 Agar
Middlebrook 7H11//7H11 Selective Agar
Middlebrook 7H10//7H11 Selective Agar
8801671JAA
2010/07
Русский
НАЗНАЧЕНИЕ
Данные среды используются в качественных методиках для изоляции и культивирования микобактерий, в особенности
Mycobacterium tuberculosis, в клинических и неклинических образцах.
Middlebrook 7H10//7H10 Agar (агар Миддлбрука) поставляется в двухсекторных чашках I Plate, содержащих в обоих
секторах одну и ту же среду и позволяющих выполнить посев двух образцов.
Middlebrook 7H11//7H11 Selective Agar (селективный агар Миддлбрука) поставляется в двойных чашках с двумя средами,
обладающими умеренной и высокой селективностью, для выделения микобактерий из образцов, содержащих смешанную
флору. Агар Миддлбрука Middlebrook 7H11 Agar находится в секторе, отмеченном выпуклой римской цифрой «I».
Селективный агар 7H11 Selective Agar находится в секторе с отметкой «II».
Селективный агар Миддлбрука Middlebrook 7H10//7H11 Selective Agar поставляется в двойных чашках с двумя средами,
обладающими умеренной и высокой селективностью. Агар Миддлбрука Middlebrook 7H10 Agar находится в секторе с
выпуклой отметкой «I». Селективный агар 7H11 Selective Agar находится в секторе с отметкой «II».
КРАТКИЙ ОБЗОР И ОПИСАНИЕ
Агар Миддлбрука Middlebrook 7H10 Agar основан на усовершенствованной рецептуре агара с олеиновой кислотой и
альбумином, разработанной Миддлбруком (Middlebrook) и Коном (Cohn) для ускорения роста туберкулезных бацилл in vitro
1–3
и для расширения области применения данной методики при проверке чувствительности к лекарственным препаратам.
Благодаря относительно простому химическому составу этот агар поддерживает рост загрязняющих микроорганизмов в
4
меньшей степени, чем среды на яичной основе, которые обычно используются для культивирования микобактерий.
5
Кон и др. разработали агар Миддлбрука Middlebrook 7H11 Agar, добавив гидролизат казеина в агар 7H10 Agar. Агар 7H11
Agar стимулирует рост требовательных к питательной среде и устойчивых к лекарственным препаратам штаммов M.
tuberculosis, которые плохо растут (или вообще не растут) на агаре 7H10 Agar или на других широко используемых
5,6
средах.
Селективный агар 7H11 Selective Agar — это агар 7H11 Agar, модифицированный путем добавления четырех
противомикробных препаратов: полимиксина B, карбенициллина, амфотерицина B и триметоприм лактата. Мичисон
7
(Mitchison) и др. изначально разработали среду, снижающую необходимость в предварительной очистке от загрязнений.
Они обнаружили, что щелочные агенты, используемые для подавления роста загрязняющих микроорганизмов,
ингибировали некоторые виды микобактерий. Макклэтчи (McClatchy) рекомендовал уменьшить концентрацию
8
карбенициллина, выбранную Мичисоном и др., чтобы снизить ингибирующее воздействие среды на микобактерии.
ПРИНЦИПЫ МЕТОДИКИ
Агар Миддлбрука Middlebrook 7H10 Agar — это определенная среда, обогащенная олеиновой кислотой и альбумином и
включающая в себя глицерол, декстрозу и неорганические компоненты, являющиеся источником питательных веществ для
поддержания роста микобактерий. Каталаза разрушает токсичные пероксиды, которые могут присутствовать в среде.
Малахитовый зеленый действует как ингибитор, частично подавляющий рост загрязняющих бактерий.
Агар Миддлбрука Middlebrook 7H11 Agar состоит из агара 7H10 Agar с добавлением панкреатического гидролизата казеина
для стимулирования роста требовательных к питательной среде штаммов M. tuberculosis.
Противомикробные препараты, добавленные в агар 7H11 Agar, повышают эффективность выделения микобактерий из
6
образцов, содержащих смешанную флору. Полимиксин B — это полипептидный антибиотик, избирательно ингибирующий
9
большинство видов грамотрицательных бацилл, включая Pseudomonas, но не ингибирующий виды Proteus.
Карбенициллин — это полусинтетический пенициллин, который эффективно действует как на грамположительные, так и на
9
грамотрицательные бактерии, включая штаммы Escherichia coli, устойчивые к другим противомикробным препаратам.
Амфотерицин B — это противогрибковый антибиотик; триметоприм лактат — это синтетический противомикробный
препарат, ингибирующий рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая виды Proteus.
РЕАГЕНТЫ
Middlebrook 7H10 Agar
Примерная рецептура* на литр очищенной воды
Пиридоксин..................................................................1,0 мг
Магния сульфат...................................................... 0,05 г
Цинка сульфат ............................................................1,0 мг
Железа-аммония цитрат ....................................... 0,04 г
Меди сульфат .............................................................1,0 мг
Натрия цитрат ........................................................ 0,4 г
Биотин..........................................................................0,5 мг
Аммония сульфат................................................... 0,5 г
Кальция хлорид...........................................................0,5 мг
Мононатрия глутамат ............................................ 0,5 г
Малахитовый зеленый ............................................... 0,25 мг
Динатрия фосфат................................................... 1,5 г
Добавка OADC ........................................................100,0 мл
Монокалия фосфат ................................................ 1,5 г
Глицерин......................................................................5,0 мл
Агар ....................................................................... 13,5 г
* При необходимости изменяется и/или дополняется для соответствия критериям эффективности.
1
Добавка OADC
Примерная рецептура* на литр очищенной воды
Натрия хлорид.................................................................... 8,5 г
Альбумин бычьей сыворотки (фракция V) ..................... 50,0 г
Декстроза .......................................................................... 20,0 г
Каталаза.............................................................................. 0,03 г
Олеиновая кислота ............................................................ 0,6 мл
* При необходимости изменяется и/или дополняется для соответствия критериям эффективности.
Агар Middlebrook 7H11 Agar — это агар Миддлбрука Middlebrook 7H10 Agar, модифицированный путем добавления
панкреатического гидролизата казеина в количестве 1,0 г/л.
Селективный агар 7H11 Selective Agar — это агар Миддлбрука Middlebrook 7H11 Agar с добавлением следующих
противомикробных препаратов из расчета на один литр:
Полимиксин В .................................................................... 200 000 единиц
Карбенициллин................................................................. 50,0 мг
Амфотерицин В ................................................................ 10,0 мг
Триметоприм лактат ........................................................ 20,0 мг
Предупреждения и меры предосторожности
Для диагностики in vitro
Если наблюдается избыток влаги, переверните чашку вверх дном со смещенной крышкой и просушите во избежание
образования непроницаемого слоя между верхней и нижней частями чашки во время засеивания.
В клинических образцах могут присутствовать патогенные микроорганизмы, в том числе вирус гепатита и вирус
иммунодефицита человека (ВИЧ). При работе с любыми предметами, загрязненными кровью и другими биологическими
10–13
жидкостями, соблюдайте правила, принятые в учреждении, а также стандартные меры предосторожности.
Подготовленные чашки, контейнеры для образцов и другие загрязненные материалы стерилизуйте в автоклаве перед
утилизацией.
При неаэрозольной обработке клинических образцов, например при подготовке окрашивания мазков кислотоустойчивых
штаммов, необходимо использовать изолирующее оборудование и средства биологической защиты, а также применять
меры биологической безопасности 2 уровня. Все операции, связанные с образованием аэрозолей, необходимо проводить в
биологическом защитном шкафу класса I или II. При лабораторной обработке культур M. tuberculosis и M. bovis необходимо
использовать изолирующее оборудование и средства биологической защиты, а также применять меры биологической
12
безопасности 3 уровня. При исследовании животных также требуется соблюдение специальных методик.
Условия хранения. После получения храните чашки в темноте при температуре от 2 до 8 °C. Избегайте замораживания и
перегрева. Открывайте непосредственно перед использованием. Сведите к минимуму воздействие света. Приготовленные
чашки, хранящиеся в оригинальной обертке при температуре от 2 до 8 °C, можно засеивать до истечения срока годности и
инкубировать до 8 недель. Перед посевом дайте среде нагреться до комнатной температуры.
Разложение продукта. Не используйте чашки при наличии признаков бактериального заражения, изменения цвета,
высыхания или других признаков разложения продукта.
Воздействие прямых или непрямых солнечных лучей на эти среды способствует образованию формальдегида,
14
подавляющего рост микобактерий.
ВЗЯТИЕ И ОБРАБОТКА ОБРАЗЦОВ
4,6,15–17
Дополнительную информацию о методиках сбора и обработки образцов см. в соответствующих документах.
МЕТОДИКА
Поставляемые материалы. В соответствии с заказом. Middlebrook 7H10//7H10 Agar, Middlebrook 7H11//7H11 Selective Agar
или Middlebrook 7H10//7H11 Selective Agar.
Необходимые, но непоставляемые материалы. Дополнительные питательные среды, реагенты, культуры
микроорганизмов для контроля качества и лабораторное оборудование, необходимое для выполнения методики.
Методика тестирования. Соблюдайте асептическую методику работы. Поверхность агара должна быть гладкой и влажной,
но без избытка влаги.
Образцы, полученные асептическим методом от пациентов с подозрением на микобактериальное заражение (оперативно
отделенные частицы ткани, аспирированное содержимое патологических очагов и стерильные жидкости организма), могут
быть засеяны непосредственно на среды для первичной изоляции. Для очистки загрязненных образцов следует
4
использовать методики расщепления и деконтаминации.
Для образцов мокроты рекомендуется использовать раствор N-ацетил-L-цистеина и гидроксида натрия (NALC-NaOH) в
качестве мягкого, но эффективного растворяющего и деконтаминирующего вещества. Подробные инструкции по
4,6,15–17
деконтаминации и расщеплению см. в соответствующих справочных материалах.
После посева держите чашки закрытыми от света; инкубируйте их в перевернутом виде (агаром вверх) в атмосфере,
насыщенной углекислым газом, при температуре 35 – 37 °C до 8 недель. С помощью препаровальной лупы изучите
поверхность агара на наличие колоний через 5 – 7 дней с начала инкубации и затем делайте это еженедельно в течение 8
недель.
2
Контроль качества
1. Проверьте чашки на наличие признаков разложения в соответствии с описанием в разделе «Разложение продукта».
2. Проверьте эффективность путем засева репрезентативной выборки чашек с чистыми культурами стабильных
контрольных микроорганизмов, которые дают известные требуемые реакции. Рекомендуется использовать следующие
тестовые штаммы.
ТЕСТОВЫЙ ШТАММ
СРЕДЫ
ОЖИДАЕМЫЙ РЕЗУЛЬТАТ
Mycobacterium tuberculosis H37Ra
ATCC 25177
7H10
7H11
7H11 Selective
Рост
Mycobacterium kansasii, группа I
ATCC 12478
7H10
7H11
7H11 Selective
Рост
Mycobacterium scrofulaceum, группа II
ATCC 19981
7H10
7H11
7H11 Selective
Рост
Mycobacterium intracellulare, группа III
ATCC 13950
7H10
7H11
Рост
Mycobacterium fortuitum, группа IV
ATCC 6841
7H10
7H11
7H11 Selective
Рост
Escherichia coli ATCC 25922
7H11 Selective
Ингибирование (от частичного до полного).
Candida albicans ATCC 10231
7H11 Selective
Ингибирование (от частичного до полного).
Следуйте требованиям контроля качества в соответствии с применимым местным, региональным и/или федеральным
законодательством, требованиями аккредитации и методиками контроля качества, принятыми в лаборатории.
Рекомендуется использовать соответствующие руководства Национального комитета по клиническим лабораторным
стандартам США (NCCLS) и положения Закона об усовершенствовании работы клинических лабораторий (CLIA).
РЕЗУЛЬТАТЫ
После достаточной инкубации в чашках должны быть видны изолированные колонии в областях штрихов и сплошной рост
на участках плотного посева.
Колонии микобактерий могут быть от гладких до шероховатых с ворсинками, и под микроскопом могут быть видны
змеевидные нити или другие текстуры. Некоторые виды дают пигментацию от желтой до красной. M. tuberculosis обычно
образует шероховатые колонии светло-коричневого оттенка в форме змеевидных нитей. Форма организации колоний
определяет, будут ли они прозрачными или непрозрачными. Для подтверждения обнаруженных результатов следует
провести окрашивание по Граму, биохимические и другие процедуры.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДИКИ
Эти готовые среды в чашках предназначены для первичной изоляции. Чашки с первичной средой можно использовать в
некоторых диагностических тестах. Однако для проведения биохимических тестов и применения серологических методик
4,6,15–17
рекомендуется использовать чистую культуру. Дополнительные сведения см. в соответствующих материалах.
Посев образца в одну среду редко позволяет обнаружить все потенциально значимые микроорганизмы. Агенты
селективной среды могут подавлять некоторые штаммы исследуемого вида или неэффективно действовать на рост видов,
которые должны ингибироваться, особенно если в образце содержится большое количество микроорганизмов этих видов.
Поэтому образцы, культивированные на селективной среде, необходимо также культивировать на неселективной среде
для получения дополнительной информации и повышения вероятности выделения потенциальных патогенов.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Middlebrook 7H10//7H11 Selective Agar
Перед выпуском все серии селективного агара Миддлбрука Middlebrook 7H10//7H11 Selective Agar проходят испытания для
подтверждения определенных характеристик продукта.
Образцы тестируются путем распределения по чашке с
использованием 0,01 мл бульонных суспензий 7H9, содержащих Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, M. intracellulare ATCC
13950, M. kansasii ATCC 12478, M. scrofulaceum ATCC 19981 и M. tuberculosis ATCC 25177 (общий объем посевного
3
4
материала — от 10 до 10 КОЕ на чашку). На образцы селективного агара 7H11 Selective Agar также засевается 0,001 мл
физиологического раствора с Escherichia coli ATCC 25922 и Candida albicans ATCC 10231 (общий объем посевного
3
4
материала — от 10 до 10 КОЕ на чашку). Чашки инкубируются при температуре 35 – 37 °C в течение 8 недель в
обогащенной CO2 атмосфере. Все микобактерии проявляют рост от умеренного до обильного. На селективном агаре 7H11
Selective Agar наблюдается частичное или полное ингибирование E. coli и C. albicans.
3
НАЛИЧИЕ
№ по каталогу
295964
297250
298292
Описание
BBL Middlebrook 7H10//7H10 Agar, 20 чашек в упаковке
BBL Middlebrook 7H11//7H11 Selective Agar, 20 чашек в упаковке
BBL Middlebrook 7H10//7H11 Selective Agar, 100 чашек в коробке 
СПРАВОЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
1. Middlebrook, G., M.L. Cohn, W.E. Dye, Russell, Jr., and D. Levy, 1960. Microbiologic procedures of value in tuberculosis. Acta.
Tuberc. Scand. 38:66-81.
2. Middlebrook, G., M.L. Cohn, and W.B. Scheffer. 1954. Studies on isoniazid and tubercle bacilli. III. The isolation, drugsusceptibility and catalase testing of tubercle bacilli from isoniazid-treated patients. Am. Rev. Tuberc. 70:852-872.
3. Middlebrook, G., and M.L. Cohn. 1958. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am. J. Public Health. 48:844-853.
4. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS. Centers for
Disease Control, Atlanta.
5. Cohn, M.L., R.F. Waggoner, and J.K. McClatchy. 1968. The 7H11 medium for the cultivation of mycobacteria. Am. Rev. Respir.
Dis. 98:295-296.
6. Nolte, F.S., and B. Metchock. 1995. Mycobacterium, p. 400-437. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and
R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
7. Mitchison, D.A., B.W. Allen, L. Carrol, J.M. Dickinson, and V.R. Aber. 1972. A selective oleic acid albumin agar medium for
tubercle bacilli. J. Med. Mycol. 5:165-175.
8. McClatchy, J.K., R.F. Waggoner, W. Kanes, M.S. Cernich, and T.L. Bolton. 1976. Isolation of mycobacteria from clinical
specimens by use of a selective 7H11 medium. Am. J. Clin. Pathol. 65:412-415.
9. Garrod, L.P., and F. O’Grady. 1971. Antibiotic and chemotherapy, 3rd ed. Williams & Wilkins, Baltimore.
10. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from
occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
11. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services,
Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol
17:53-80.
12. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS
Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.
13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from
risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive
89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.
14. Milliner, R.A., K.D. Strottmeier, and G.P. Kubica. 1969. Formaldehyde: a photothermal activated toxic substance produced in
Middlebrook 7H10 medium. Am. Rev. Respir. Dis. 99:603-607.
15. Cernoch, P.L., R.K. Enns, M.A. Saubolle, and R.J. Wallace, Jr. 1994. Cumitech 16A, Laboratory diagnosis of the
mycobacterioses. Coordinating ed., R.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
16. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 1998. Bailey & Scott’s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis.
17. Isenberg, H.D. (ed.). 1992. Clinical microbiology procedures handbook, vol.Ê1. American Society for Microbiology, Washington,
D.C.
4
5