Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина
advertisement
На правах рукописи ИСАКОВ Михаил Андреевич ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АТОКСИЧНЫХ ФОРМ ЭКЗОТОКСИНА A PSEUDOMONAS AERUGINOSA И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Михайлова Наталья Александровна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Коровкин Сергей Анатольевич доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич Ведущая организация: НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН Защита диссертации состоится «___» _____________ 2010 г. в___часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а. С диссертацией можно И.И. Мечникова РАМН. ознакомиться в библиотеке НИИВС Автореферат разослан «___» ____________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Яковлева И.В. им. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Несмотря на значительные успехи в различных областях медицины, проблема нозокомиальных инфекций, вызываемых P. aeruginosa, ещѐ далека от разрешения. В настоящее время этот возбудитель способен быстро вырабатывать мультиустойчивость к антибиотикам самых различных классов, в связи с чем обычная терапия часто не приводит к положительным результатам (Strateva T. and Yordanov D., 2009). В России и зарубежом отсутствуют иммунопрепараты для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых P. аeruginosa. В то же время множество экспериментальных вакцин и моноклональных антител протестированы в доклинических испытаниях, а часть из них достигла клинической фазы исследований. В литературе имеется незначительное количество сообщений о рандомизированных контролируемых испытаниях по оценке эффективности вакцин против синегнойной инфекции у пациентов с кистозным фиброзом или пациентов из группы риска, однако ни одна из вакцин не получила разрешения на использование в практике здравоохранения (Doring G. and Pier G.B., 2008; Johansen H.K. and Gotzsche P.C., 2008). По данным литературы, перспективными для разработки являются поликомпонентные конъюгированные генно-инженерные вакцины (Doring G. et al., 2007), при создании которых используют наиболее иммуногенные антигены P. aeruginosa. Синегнойная патогенности, палочка такими как обладает гемолизин, многочисленными лецитиназа, протеаза, факторами эластаза, экзотоксин S, экзотоксин А и другими. Существенную роль в поражении организма хозяина при развитии синегнойной инфекции играет именно экзотоксин А, ингибирующий синтез клеточных белков и вызывающий летальный эффект у экспериментальных животных (Liu, P.V., 1973). Установлено, что экзотоксин А продуцируют более 90% клинических штаммов P. aeruginosa (Вертиев Ю.В. и др., 1982). Экзотоксин А синтезируется в виде 1 одной полипептидной цепи. Анализ кристаллической структуры показал, что его молекула состоит из трѐх доменов: домен I (с 1 по 252 аминокислотные остатки), необходимый для связывания с рецептором на клетках-мишенях, домен II (с 253 по 404 аминокислотные остатки), осуществляющий трансмембранный перенос токсина в клетку, и домен III (с 405 по 613 аминокислотные остатки), обладающий токсической активностью (Allured, V.S. et al. 1986). Именно домен III инактивирует эукариотический фактор элонгации 2 при помощи АДФ-рибозилирования, ингибируя белковый синтез в клетках и апоптоз. Изменение аминокислотной последовательности домена III в ряде случаев приводит к снижению токсичности экзотоксина А (Douglas, C.M. and R.J. Collier, 1987). Целесообразность включения экзотоксина А в вакцину против синегнойной инфекции не вызывает сомнений, однако иммунобиологические свойства его доменов практически не изучены, что затрудняет выбор наиболее иммуногенной и безопасной атоксичной формы экзотоксина А. Цель и задачи исследования Целью данного исследования является получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A P. aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств. Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи: 1. Создать генно-инженерные конструкции на основе плазмиды рЕТ28, несущие: а) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую полную рамку считывания гена экзотоксина А (ТохА), используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из P. aeruginosa; б) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домен I (aTox1); в) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домены I и II (aTox1,2); г) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую домены I, II и часть домена III (aTox1,2,∆3). 2 2. Получить бактериальные (E. coli) продуценты рекомбинантных белков aTox1, aTox1,2, aTox1,2,∆3 и ТохA и оценить степень их экспрессии. 3. Получить очищенные рекомбинантные белки aTox1, aTox1,2, aTox1,2,∆3 и ТохА. 4. Оценить токсичность полученных белковых препаратов для животных. 5. Изучить иммуногенные свойства рекомбинантных белков aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,∆3 на экспериментальных животных. 6. Изучить протективные свойства полученных белковых препаратов aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,∆3. 7. Получить специфические иммунные сыворотки к рекомбинантным белкам aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,∆3 и оценить их защитные свойства. Научная новизна Впервые сконструированы штаммы-продуценты (E. coli) рекомбинантного экзотоксина A P. aeruginosa – ТохА и его атоксичных форм: aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,∆3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного ТохА и нативного экзотоксина А. Впервые полученные делеционные рекомбинантные белки aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,∆3 оказались нетоксичными для животных. Выявлены иммуногенные свойства рекомбинантных белков – aTox1,2 и aTox1,2,∆3; трехкратное их введение мышам индуцировало увеличение титра специфических антител в 8000 раз. Максимальную протективную активность проявлял рекомбинантный белок aTox1,2,∆3 с индексом эффективности 8,9. Иммунные сыворотки крови кроликов к рекомбинантному белку aTox1,2,∆3 (титр 1:420000) обладали протективными свойствами (индекс эффективности 7,3). 3 Практическая значимость На основе очищенного рекомбинантного белка aTox1,2,∆3 может быть сконструирован новый иммунобиологический препарат для иммунизации доноров с целью получения антитоксической плазмы, а так же возможно его использование в качестве компонента комплексной противосинегнойной вакцины. Рекомбинантный разработке экзотоксин тест-систем, А целесообразно предназначенных для использовать оценки при антитоксической активности специфических иммунобиологических препаратов. Основные положения, выносимые на защиту 1. Сконструированные штаммы-продуценты (E. coli) pET28-аТох1, pET28-aTox1,2, pET28-aTox1,2,Δ3 и pET28-ToxA характеризуются высоким выходом целевых продуктов (на уровне 40 – 70 %). Технологические приѐмы получения и очистки рекомбинантных белков позволяют наработать их в количествах, достаточных для биологического тестирования. 2. Полученный очищенный рекомбинантный белок ToxA (73,8 кДа) идентичен по токсическим свойствам нативному экзотоксину А. Очищенные рекомбинантные белки аТох1 (38,6 кДа), aTox1,2 (49,0 кДа), aTox1,2,Δ3 (65,8 кДа) атоксичны, а варианты aTox1,2 и aTox1,2,Δ3 обладают иммуногенными и протективными свойствами. 3. Иммунная сыворотка к рекомбинантному белку aTox1,2,Δ3 способна защищать животных от введения экзотоксина А. Апробация работы Основные результаты диссертационной работы доложены на: итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно- технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007); 4 Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (СанктПетербург, 2008); XII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2008); XIII Всероссийском научном форуме с международным иммунологии в участием имени Санкт-Петербурге» академика В.И.Иоффе (Санкт-Петербург, «Дни 2009); XII международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); IX межгосударственной научнопрактической конференции государств – участников СНГ (Волгоград, 2008); II съезде микологов России (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН 2 апреля 2010 года. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 – статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 223 источника, из которых 31 отечественные. Работа изложена на 140 страницах иллюстрированного 15 рисунками и 7 таблицами. 5 машинописного текста, СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Объекты исследования Материалом исследований явились: штамм E. coli DH5α (F-, endA1, glnV44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, deoR, nupG, Φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–) (Invitrogen); штамм E. coli BL21(DE3) (F–, ompT, gal, dcm, lon, hsdSB(rB- mB-), λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) (Novagen); токсигенный штамм синегнойной палочки РА103; плазмиды pBluescript-KS(+) (Stratagene) и pET28b(+) (Novagen); очищенные препараты экзотоксина А P. aeruginosa (Уфимский НИИВС им. И.И. Мечникова и фирмы Sigma); рекомбинантные белки аТох1, аТох1,2, аТох1,2,Δ3 и ToxA; кроличья сыворотка к анатоксину P. aeruginosa (Уфимский НИИВС им. И.И. Мечникова); мышиные и кроличьи сыворотки к рекомбинантным белкам аТох1, аТох1,2, аТох1,2,Δ3, а также сыворотки крови интактных животных. Всего исследовано 350 сывороток животных. Эксперименты проводили на животных из филиала «Андреевка» ГУ НЦБМТ РАМН. Методы исследования Для получения геномной ДНК P. aeruginosa использовали Wizard® Genomic DNA Purification Kit A1120 фирмы Promega. Процедуру проводили согласно рекомендациям производителя. Для выделения плазмидной ДНК использовали наборы фирмы Sigma “GenElute Plasmid miniprep kit (#PLN350) или “GeneElute high performance plasmid maxiprep kit” (#NA0310). Все генноинженерные манипуляции (ПЦР, рестрикция, хлороформная очистка ДНК, лигирование, приготовление и трансформация компетентных клеток, сайтнаправленный мутагенез) проводили в соответствии с общепринятыми 6 методиками (Sambrook J. and Russell D., 2001). Для получения бактериальных продуцентов рекомбинантных белков использовали штамм E. coli BL21(DE3) (Novagen). Первичный отбор клонов осуществляли рестрикционным анализом. Окончательный отбор проводили секвенированием на приборе ABI Prism 3100 согласно рекомендациям производителя. Рекомбинантные белки аТох1, аТох1,2, аТох1,2Δ3 и ТохА получали при выращивании соответствующего бактериального продуцента в среде LuriaBertani c канамицином и добавлением индуктора изопропил-бета-d- тиогалактопиранозида в ферментѐре Анкум 2М (Россия). Электрофорез белковых продуктов проводили в полиакриламидном геле по методу Лэммли (Sambrook J. and Russell D., 2001). Хроматографическую очистку рекомбинантных белков осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Ni-сефарозы High Performance (GE healthcare) в денатурирующих условиях (в присутствии 8 М мочевины) в соответствии с протоколом QIAGEN (Qiaqen. The QIAexpressionist, 2001). Концентрацию белка определяли на спектрофотометре Pharmacia LKB/Ultraspec II при длине волны 280 нм, используя коэффициенты экстинкции, равные 0,7 для аТох1, 0,77 для аТох1,2, 0,73 для аТох1,2,Δ3 и 0,8 для ТохА, рассчитанные в программе Vector NTI Advance 10. Диализ очищенных рекомбинантных белков проводили в TrisHCl буфере (рН 9,0) в течение 18-24 ч при температуре 4 °С. Иммуноблоттинг осуществляли по общепринятой методике (Sambrook J. and Russell D., 2001), используя для анализа специфичности сыворотку крови кролика, иммунизированного синегнойным анатоксином. Для удаления неспецифического взаимодействия в сыворотку добавляли клеточный лизат E. coli штамма BL21(DE3). В качестве хромогена использовали диаминобензидин. Для проведения ИФА полученный белок разводили в 10 мМ карбонатнобикарбонатном буфере pH 9,4 до концентрации 10 мкг/мл и сорбировали в течение суток при температуре 4 °С в 96 луночных планшетах. При постановке ИФА в качестве конъюгатов использовали меченые пероксидазой хрена 7 антитела против IgG кролика и против IgG мыши. Для визуализации применяли раствор хромогена тетраметилбензидина. Оптическую плотность измеряли в приборе “Labsystems Multiskan Plus” при длине волны 450 нм. За титр принимали разведение сыворотки, при котором значение оптической плотности было в два раза выше, чем в лунке с буфером разведения. Для оценки токсичности рекомбинантного белка ТохА использовали белых беспородных мышей массой 18-20 г. Препарат вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. ЛД50 вычисляли по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьѐва (Ашмарин И.П. и Воробьев А.А., 1962). Для иммунизации животных препараты рекомбинантных белков, растворенные в Tris-HCl буфере, сорбировали на геле гидроксида алюминия (Al(OH)3) (ФГУП «НПО «Микроген» в г. Уфе «Иммунопрепарат») в течение суток при температуре 4 °С из расчета 1 мг белка на 3 мг гидрооксида алюминия. В работе использовали мышей массой 16-18 г и кроликов массой 22,5 кг. Мышам препараты вводили внутрибрюшинно в дозах от 6,25 до 100 мкг белка в объеме 0,5 мл. При иммунизации кроликов препараты вводили подкожно в дозе 100 мкг в объеме 0,5 мл. При анализе протективных свойств рекомбинантных белков аТох1, аТох1,2 и аТох1,2,Δ3 интактным и иммунизированным мышам внутрибрюшинно вводили различные дозы рекомбинантного ТохА в объеме 0,5 мл. Учет погибших животных проводили в течение пяти дней. Для оценки превентивной активности иммунных сывороток крови кроликов мышам внутрибрюшинно вводили 0,5 мл сыворотки крови кроликов, иммунизированных рекомбинантной формой аТох1,2,Δ3 или 0,5 мл сыворотки интактных кроликов. Через 2 ч всем мышам инъецировали рекомбинантный экзотоксин А в различных дозах в объѐме 0,5 мл. Наблюдение осуществляли в течение пяти дней, регистрируя гибель животных. Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам (Ашмарин И.П. и Воробьев А.А., 1962). 8 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе исследования с помощью полимеразной цепной реакции амплифицировали ген toxA P. aeruginosa, несущий открытую рамку считывания экзотоксина А. В качестве матрицы использовали геномную ДНК штамма PA103 P. aeruginosa, экзотоксина А. характеризующегося Амплификат встраивали высоким в уровнем полилинкер синтеза плазмиды pBluescript-KS(+) (Stratagene). Сравнение нуклеотидной последовательности, полученной путѐм амплификации гена toxA из штамма РA103, с уже известной в базе данных GenBank (accession number K01397.1) доказало их идентичность, за исключением двух синонимичных нуклеотидных замен: аденина в позиции 648 на цитозин и цитозина в позиции 1092 на тимин, которые не привели к изменению аминокислотной последовательности белка ToxA. Степень гомологичности аминокислотных последовательностей белка ToxA P. aeruginosa, имеющихся в базе данных GenBank , составляла не менее 98%. Таким образом, высокая консервативность экзотоксина А позволяет предположить, что препараты на его основе будут вызывать иммунный ответ с нейтрализующей активностью против большинства вариантов экзотоксина А, в том числе синтезируемых внутрибольничными штаммами P. aeruginosa. С целью исследования какие антигенные детерминанты экзотоксина А обладают протективным эффектом, получены делеционные варианты, исходя из трехдоменной структуры белка. При помощи генно-инженерных манипуляций последовательность гена tохА переносили в систему экспрессии рекомбинантных белков на основе плазмиды pET28(+)b (Novagen). При этом были созданы четыре продуцента (E. coli штамм BL21(DE3)) рекомбинантных белков: рET28-TохA – экспрессирующий экзотоксин А (М.м. 73,4 кДа); рET28аTох1 - экспрессирующий домен I экзотоксина A (М.м. 38,6 кДа); pET28аTох1,2 - экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I и II (М.м. 49,0 кДа); и рET28-аTох1,2,Δ3 - экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I, II и части домена III (М.м. 65,8 кДа). 9 Молекулярная масса рекомбинантных белков, синтезирующихся после индукции, определѐнная электрофоретически в 12% ПААГ по Лэммли, соответствовала теоретически рассчитанной (рис 1). Уровень индукции рекомбинантных белков среди общего количества бактериальных белков составлял от 10 % до 34 % в зависимости от штамма-продуцента. Полученные рекомбинантные белки - TохA, aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,∆3, имели на N-конце дополнительную аминокислотную последовательность из шести гистидинов, что позволило провести их очистку методом ионно-аффинной хроматографии, используя в качестве сорбента Ni-сефарозу High Performance (GE healthcare). Выход препаратов составил от 38,8 % до 71,4 %, а степень чистоты была не менее 66 % (табл. 1). Рис. 1. Анализ белковых продуктов, полученных в результате экспрессии рекомбинантных белков и после их хроматографической очистки. Дорожки 1,4,7,11 – белки, полученные при выращивании биомассы продуцента без индуктора; дорожки 2,5,8,12 – белки, полученные при выращивании биомассы продуцента с индуктором; 3,6,9,13 – хроматографически очищенный препарат; дорожки 10,14 – маркер молекулярной массы. Рекомбинантные белки отмечены стрелкой. 10 Таблица 1 Результаты хроматографической очистки рекомбинантных белков. Наименование рекомбинантного белка Содержание от общего клеточного белка после индукции, % ТохА аТох1,2,∆3 аТох1,2 аТох1 10±1,7 34±5,8 14±2,4 12±2 Количество белка (мг) до очистки после очистки 7,5±1,3 24,5±4,2 10,1±1,7 8,6±1,5 1,8±0,3 14,4±2,4 7,2±1,2 3,6±0,6 Чистота препарата после очистки, % Итоговый выход рекомбинантного белка, % 66±11,2 76±12,9 71±12,1 84±14,3 38,8±6,5 58,8±10 71,4±12,1 41,7±7,1 Исследование биологических свойств полученного рекомбинантного экзотоксина А (ТохА) выявило наличие выраженной токсической активности – ЛД50 для белых беспородных мышей составила 2,53±0,73 мкг. ЛД50 высокоочищенного нативного экзотоксина А P. aeruginosa (Sigma) соответствовала 0,5±0,12 мкг, а для нативного экзотоксина P. aeruginosa (Уфимский НИИВС им. И.И. Мечникова), полученного высаливанием культуральной жидкости концентрированным раствором сульфата аммония – 16,3±2,7 мкг на мышь. Проведѐнные токсикологические исследования рекомбинантных делеционных форм aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,Δ3 для оценки влияния препаратов на организм экспериментальных животных (мыши и крысы) показали, что введение белков, сорбированных на геле гидрооксида алюминия, не вызывало изменений в поведении животных в течение всего срока наблюдения. Незначительное снижение темпов роста массы отмечено только при введении высоких доз рекомбинантного белка aTox1,2,Δ3 белым мышам (рис. 2), что, вероятно, связано с воспалительной реакцией, а не с токсичностью препарата. 11 Среднее изменение массы животного после введения препарата, г 4 3 2 Контроль 1 25 мкг 50 мкг 0 1 2 3 4 5 6 100 мкг 7 200 мкг -1 -2 -3 Дней после инъекции Рис. 2. Оценка токсичности рекомбинантной формы экзотоксина А aTox1,2,Δ3 для мышей. Таким образом, рекомбинантные белки с делецией С-концевой области экзотоксина А (aTox1, aTox1,2 и aTox1,2,Δ3) оказались безопасными и нетоксичными для исследованных групп животных. С помощью ИФА и иммуноблоттинга установлено, что белки аТох1,2, аTox1,2,Δ3 и ТохА специфично реагировали с антителами сыворотки крови кроликов, иммунизированных анатоксином P. aeruginosa (рис. 3). Очистка рекомбинантных белков ионообменной хроматографией на Ni-сефарозе не влияла на специфичность их связывания с антителами к анатоксину. Вариант аТох1, не взаимодействовал с иммунной сывороткой к анатоксину P. aeruginosa, что вероятно связано с отсутствием антигенных детерминант на его поверхности. 12 Рис. 3. Анализ в иммуноблоттинге белковых продуктов, полученных в результате экспрессии рекомбинантных белков и после их хроматографической очистки. Дорожка 1 – маркер молекулярной массы; 2 –белки, полученные при выращивании штамма BL21 (DE3); 3,5,7,9 – белки, полученные при выращивании продуцента с индуктором; 4,6,8,10 – хроматографически очищенный препарат. В качестве первичных антител использовали сыворотку крови кроликов против синегнойного анатоксина, а вторичных – козьи антитела, меченные пероксидазой хрена. На следующем этапе роботы изучены протективные свойства рекомбинантных белков аТох1, аТох1,2 и аTox1,2,Δ3 в опытах активной защиты животных. Белых беспородных мышей массой 16±1 г дважды с двухнедельным интервалом внутрибрюшинно иммунизировали рекомбинантными атоксичными формами экзотоксина А в дозах 25 и 50 мкг белка, сорбированного на гидрооксиде алюминия, на животное. В качестве контроля использовали неиммунизированных мышей той же партии. Через две недели после последнего введения исследуемых образцов мышам внутрибрюшинно вводили рекомбинантный ToxA (табл. 2). Препараты аТох1,2 и аTox1,2,Δ3 обладали дозозависимым протективным эффектом: индексы 13 Таблица 2 Протективная активность рекомбинантных делеционных вариантов экзотоксина А P. aeruginosa. Препарат Доза введения рекомбинантного токсина, мкг Количество мышей павших/выживших ЛД50, мкг 𝑋±σ Индекс эффективности aТох1 25 мкг 100 50 25 12,5 6,25 10/0 10/0 10/0 9/1 7/3 5,1±1,2 (р>0,1)* (р<0,01)** 0,8 aТох1 50 мкг 100 50 25 12,5 6,25 10/0 10/0 10/0 8/2 6/4 6,6±1,3 (р>0,1)* (р<0,01)** 1,1 аТох1,2 25 мкг 100 50 25 12,5 6,25 10/0 9/1 5/5 1/9 0/10 24,0±4,8 (р<0,01)* (р<0,01)** 3,9 аТох1,2 50 мкг 100 50 25 12,5 6,25 6/4 5/5 3/7 0/10 0/10 аТох1,2,Δ3 25 мкг 100 50 25 12,5 6,25 9/1 6/4 4/6 2/8 0/10 31,6±6,3 (р<0,01)* (р<0,05)** 5,1 aТох1,2,Δ3 50 мкг 100 50 25 12,5 6,25 6/4 4/6 2/8 1/9 0/10 55,0±10,3 (р<0,01)* 8,9 Контроль (интактные мыши) 25 12,5 6,25 3,125 1,0625 0/10 9/1 6/4 1/9 0/10 6,2±1,2 - 51,4±10,3 (р<0,01)* (р>0,1)** * – при сравнении значений опытных групп с контролем ** – при сравнении значений опытных групп с aТох1,2,Δ3 в дозе 50 мкг 14 8,3 эффективности 8,3 и 8,9 определены для групп животных, получивших препарат аТох1,2 или аTox1,2,Δ3 в дозе 50 мкг. В дозе 25 мкг индексы эффективности для этих же делеционных вариантов составили 3,9 и 5,1, соответственно. Вариант аTox1 в исследованных дозах не защищал мышей от введения рекомбинантного ТохА. Полученные результаты позволяют предположить, что подавление транслокационной и ферментативной функций токсина, а так же инактивация его повреждающего воздействия на организм животного происходит за счѐт специфического взаимодействия антител c эпитопами, расположенными на доменах II и III экзотоксина А. Отсутствие протективных свойств рекомбинантного белка аТох1, вероятно, связано с рядом причин: низкой иммуногенностью вследствие небольшого размера (М.м. менее 40 кДа); или наличием слабо иммуногенных эпитопов. Кроме того, можно предположить, что антитела против домена I не способны инактивировать рецепторную функцию нативного экзотоксина А, вследствие низкой аффинности или отсутствия направлености на участок, ответственный за узнавание экзотоксином А рецептора клеток-мишеней. Так как полученный белок аТох1 не проявил протективных свойств, его дальнейшее исследование не представлялось целесообразным. Для оценки способности рекомбинантных белков аТох1,2 и аТох1,2,Δ3 стимулировать образование специфичных антител белых мышей иммунизировали трехкратно, внутрибрюшинно с интервалом в две недели, дозами 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкг белка, сорбированного на гидроксиде алюминия. Через две недели после каждого введения пять мышей из каждой группы использовали для получения сыворотки крови. Контролем служили сыворотки интактных животных той же партии. Пулы полученных сывороток протестировали в ИФА с сорбированным на планшетах рекомбинантным экзотоксином А. Изучение иммуногенных свойств позволило установить, что атоксичные варианты аТох1,2 и aTox1,2,Δ3 стимулировали в организме животных синтез 15 антител, специфичных к рекомбинантному экзотоксину А, при этом прослеживалась прямая зависимость между титром антител, дозой вводимого препарата и количеством проведѐнных иммунизаций (рис. 3). 6 1750000 1500000 12 1250000 25 1000000 750000 50 500000 Доза препарата (мкг) Титр антител 2000000 100 250000 0 1 2 3 Количество иммунизаций A) 6 Титр антител 1750000 1500000 12 1250000 1000000 25 750000 50 500000 250000 Доза препарата (мкг) 2000000 100 0 1 Б) 2 3 Количество иммунизаций Рис. 3. Титр антител в ИФА к рекомбинантным белкам аТох1,2,Δ3 (А) и аТох1,2 (Б), в зависимости от дозы и количества иммунизаций. 16 Изучение динамики накопления специфических IgG антител в ответ на введение препарата аТох1,2 выявило, что значительное повышение титров происходило при двукратной иммунизации дозой 100 мкг (титр 1:920000) и трехкратных иммунизациях дозами 25, 50 и 100 мкг (титры 1:737000, 1:763000 и 1:1584000, соответственно). Однократное введение любой используемой дозы вызывало слабую выработку антител (максимальный титр 1:12000 в дозе 100 мкг). Рекомбинантный белок aTox1,2,Δ3 обладал схожими иммуногенными свойствами. Максимальные значения титра специфических IgG антител к aTox1,2,Δ3 выявлены после трехкратной иммунизации дозами 50 и 100 мкг белка (титры 1:953000 и 1:1638000). Однократная иммунизация не стимулировала заметного накопления антител во всех исследуемых дозах. Препарат aTox1,2,Δ3 оказался более иммуногенным по сравнению с аТох1,2, что наиболее заметно проявилось при введении низких доз (6 и 12 мкг). Оптимальная схема иммунизации состояла из двукратного введения аТох1,2 или аТох1,2,Δ3 в дозе 100 и 50 мкг, соответственно. В результате проведѐнных исследований, установлено, что препараты аТох1,2 и аТох1,2,Δ3 обладали антигенными, иммуногенными и протективными свойствами. Поскольку вариант аТох1,2,Δ3 имеет в своѐм составе часть домена III, на котором могут присутствовать дополнительные антигенные детерминанты, о чѐм свидетельствуют данные по оценке иммуногенных и протективных свойств, в дальнейших экспериментах по изучению длительности иммунного ответа и протективных свойств иммунных сывороток использовали делеционный вариант белка аТох1,2,Δ3. При изучении длительности иммунного ответа на рекомбинантный белок аТох1,2,Δ3 белых беспородных мышей трѐхкратно с двухнедельным интервалом иммунизировали в дозе 25 мкг белка, сорбированного на Al(OH)3. С интервалом в три недели собирали тотальную кровь от пяти мышей и определяли титр специфических антител в сыворотках методом ИФА. Максимальный уровень антител был достигнут после третьей иммунизации (титр 1:590000). Однако уже через 3 недели после последней иммунизации 17 происходило значительное снижение титра антител, которое продолжалось в течение 6 недель и далее не изменялось, находясь в пределах 1:60000-1:80000 (срок наблюдения – 15 недель после последней иммунизации). При изучении иммунного ответа у кроликов на введение аТох1,2,Δ3 в дозе 100 мкг белка, сорбированного на Al(OH)3, установлено, что после третьей иммунизации титр антител достигал уровня 1:460000 и до 9-й инъекции определялся в пределах от 1:250000 до 1:420000, после 10-й иммунизации происходил рост титра до максимальных значений (титр 1:750000). В последующие месяцы наблюдали постепенное снижение титров антител в сыворотках, однако даже через шесть месяцев после последней инъекции уровень антител (титр 1:45000) оставался значимо выше (более чем в 25 раз) в сравнении с сыворотками интактных кроликов (титр 1:1600). По истечении 6 месяцев после первого цикла иммунизаций дополнительное введение препарата аТох1,2,Δ3 в дозе 100 мкг индуцировало мощный (более чем в 15 раз) синтез специфичных антител против экзотоксина А. Результаты изучения динамики титров антител на двух видах животных подтвердили иммуногенные свойства рекомбинантной атоксичной формы аТох1,2,Δ3. Кроме того, выявлено, что иммунизация препаратом приводила к образованию антиген-специфических клеток памяти. Однако, следует отметить, что иммунный ответ оказался недостаточно стойким. Для повышения иммуногенных свойств атоксичной рекомбинантной формы aTox 1,2,Δ3 экзотоксина А P. aeruginosa провели сравнительное тестирование трѐх адъювантов: Al(OH)3, хитозана и очищенной ДНК E. сoli. Мышей двукратно с двухнедельными интервалами иммунизировали в дозе 50 мкг белка. Первая группа животных получала только рекомбинантный белок, вторая - aTox1,2,Δ3, сорбированный на Al(OH)3. Животные третьей группы дополнительно с сорбированным белком получали очищенную ДНК E. coli в дозе 25 мкг на особь. Четвертую группу мышей иммунизировали белком aTox1,2,Δ3 с добавлением хитозана до конечной концентрации 0,5 %. Животных контрольной группы не иммунизировали. По истечении двух недель 18 после последней иммунизации мышам вводили очищенный рекомбинантный экзотоксин А (табл. 3). Полученные результаты показали, что препарат aTox 1,2,Δ3 обладал слабыми иммуногенными свойствами. При использовании адъюванта Al(OH)3 иммуногенность препарата выросла в 4 раза, а в сочетании с ДНК E. coli эффект усилился в 9 раз. Применение хитозана для повышения иммуногенности препарата aTox 1,2,Δ3 оказалось менее эффективным, по сравнению с Al(OH)3. Таблица 3 Влияние адъювантов на протективные свойства атоксичной рекомбинантной формы аТох1,2,Δ3 в дозе 50 мкг на мышь. Доза введения рекомбинантного токсина, мкг Количество мышей павших/выживших ЛД50, мкг 𝑋±σ Индекс эффективности Тох1,2,Δ3 40 20 10 5 10/0 10/0 9/1 6/4 5±1 (р<0,05)* 2 Тох1,2,Δ3 +Al(OH)3 40 20 10 5 6/4 5/5 3/7 1/9 20±4 (р<0,01)* (р<0,01)** 8 Тох1,2,Δ3 +Al(OH)3 +ДНК E.coli 40 20 10 5 1/7 1/9 1/9 0/10 45,1±9 (р<0,01)* (р<0,01)** 18,04 Тох1,2,Δ3 +хитозан 40 20 10 5 6/1 7/3 3/7 0/10 15,6±3,1 (р<0,01)* (р<0,01)** 6,24 Контроль (интактные мыши) 10 5 2,5 1,25 10/0 10/2 8/4 0/12 2,5±0,4 - Препарат * – при сравнении значений опытных групп с контролем ** – при сравнении значений опытных групп с aТох1,2,Δ3 При изучении протективной активности антител, полученных к белку 19 aTox 1,2,Δ3 (табл. 4), установлено, что сыворотки обладали защитными свойствами, нейтрализуя летальное действие рекомбинантного полноразмерного экзотоксина А. Индекс эффективности защитных свойств иммунной сыворотки оказался равным 7,3, что почти в четыре раза выше по сравнению с сывороткой крови интактных кроликов. Выявление протективного эффекта иммунных сывороток еще раз подтвердило, что полученная делеционная форма аТох1,2,Δ3 обладает иммуногенными свойствами. Таблица 4 Протективные свойства сывороток крови кроликов, содержащих антитела к аТох1,2,Δ3, в опытах пассивной защиты белых мышей. ЛД50, мкг 𝑋±σ Индекс эффективности 11,1±2,2 (р<0,01)* 7,3 10/0 5/5 3/7 0/10 2,9±0,6 1,9 10/0 8/2 2/8 1/9 0/10 1,5±0,3 - Сыворотка Доза введения токсина, мкг Количество мышей павших/выживших Против Тох1,2,Δ3 (титр 1:420000) 25 10 5 2,5 1,25 10/0 4/6 2/8 2/8 0/10 Интактных кроликов (титр 1:1600) 5 2,5 1,25 0,625 Контроль (интактные мыши) 5 2,5 1,25 0,625 0,313 * – при сравнении значений опытных групп с контролем и сывороткой интактных кроликов 20 Таким образом, результаты изучения сконструированных рекомбинантных белков - атоксичных форм экзотоксина А P. аeruginosa дают основание предположить, что на их основе могут быть разработаны иммунобиологические препараты для диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых синегнойной палочкой, хотя для окончательных выводов нужны дополнительные исследования. 21 ВЫВОДЫ 1. Созданы четыре штамма-продуцента (E. сoli) рекомбинантных белков: рET28-TохA – экспрессирующий экзотоксин А; рET28-аTох1 синтезирующий домен I экзотоксина A; pET28-аTох1,2 - синтезирующий вариант, состоящий из доменов I и II, и рET28-аTох1,2,Δ3 - экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I, II и части домена III. 2. Выявлены антигенные свойства очищенных рекомбинантных белков TохA, аTох1,2 и аTох1,2,Δ3. 3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного и нативного экзотоксина А P. aeruginosa. 4. Установлена атоксичность для животных рекомбинантных делеционных вариантов белков - аTох1, аTох1,2 и аTох1,2,Δ3. 5. Полученные рекомбинантные белки аTох1,2 и аTох1,2,Δ3, обладали протективной активностью против рекомбинантного ТохА (индекс эффективности соответствовал 8,9) и иммуногенными свойствами, о чѐм свидетельствовала динамика накопления антител у иммунизированных мышей (титр возрастал от 1:200 до 1:1640000). 6. Иммунные сыворотки крови кролика против атоксичной формы аTох1,2,Δ3 (титр 1:420000) защищали мышей от введения 7,3 ЛД50 рекомбинантного экзотоксина А. 22 СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств рекомбинантной атоксичной формы экзотоксина А и рекомбинантного белка F наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa. / Вертиев Ю.В., Калошин А.А. и Исаков М.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. – №2. – С. 39-44. Исаков М.А. Получение рекомбинантного экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Калошин А.А. и Михайлова Н.А. // Биотехнология. – 2009. – №3. – С. 29-33. Исаков М.А. Изучение влияния различных иммуномодуляторов и адъювантов на протективные свойства рекомбинантной формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Калошин А.А., Кривцов Г.Г., Михайлова Н.А., Зверев В.В. // Медицинская иммунология. Материалы XIII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 8-11 июня 2009 г. – Т. 11. №4-5. – С. 317-318. Исаков М.А. Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Вертиев Ю.В., Калошин А.А. и Михайлова Н.А. // Санкт-Петербург. 17-18 апреля 2008г. Тезисы всероссийской научной конференции. Вестник российской военномедицинской академии. – 2008. – №2(22). – Стр. 470-471. Михайлова Н.А. Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков Pseudomonas aeruginosa. / Калошин А.А., Злыгостев С.А., Исаков М.А., Гатыпова Е.В. // Сборник тезисов XII Всероссийского форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2 (11). – №2-3. – С.338. Калошин А.А. Получение рекомбинантной анаформы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa и исследование его защитных свойств. / Вертиев Ю.В., Исаков М.А., Михайлова Н.А. // Москва 11-12 ноября 2008 г. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва. – 2008. – С. 60. Михайлова Н.А. Поликомпонентная вакцина для профилактики и иммунотерапии инфекций, вызываемых оппортунистическими бактериями и грибами. / Блинкова Л.П., Батуро А.П., Калошин А.А., Романенко Э.Е., Злыгостев С.А., Горбатко Е.С., Исаков М.А., 23 Гатыпова Е.В., Леонова А.Ю. // В сборнике «Современная микология России». Тезисы докладов 2-го съезда микологов России. – Москва. – Т. 2. – С. 494. 8. Михайлова Н.А. Разработка поликомпонентной вакцины против оппортунистических инфекций. / Блинкова Л.П., Батуро А.П., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Калошин А.А., Романенко Э.Е., Злыгостев С.А., Горбатко Е.С., Исаков М.А., Гатыпова Е.В., Леонова А.Ю. // В сб. «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников содружества независимых государств». Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ. – Волгоград. – 2008. – С. 114. 9. Михайлова Н.А. Экспериментальная разработка поликомпонентной вакцины против оппортунистических инфекций. / Зверев В.В., Семенов Б.Ф., Блинкова Л.П., Батуро А.П., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Калошин А.А., Романенко Э.Е., Злыгостев С.А., Горбатко Е.С., Исаков М.А., Сидорович Е.В., Леонова А.Ю. // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва. – 2008. – С. 81. 10. Исаков М.А. Получение и исследование рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Калошин А.А. // Сборник тезисов. Биология – наука XXI века. 12-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых. – 10-14 ноября 2008. – С. 239. 11. Михайлова Н.А. Разработка поликомпонентной вакцины для профилактики и иммунотерапии инфекций, вызываемых условнопатогенными микроорганизмами. / Зверев В.В., Семенов Б.Ф., Блинкова Л.П., Батуро А.П., Калошин А.А., Дорофеева Е.С., Исаков М.А., Гатыпова Е.В. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления “Живые системы” ФЦП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы”. – Москва. – 2007. – С. 210-211. 24
