профессор кафедры биохимии СПбГУ, д.б.н.
advertisement
Отзыв официального оппонента на диссертационную работу Ямщиковой Е.В. «Биологическая активность обогащённых пролином пептидов системы врождённого иммунитета» представленную на соискание учёной степени кандидата биологических наук по спеуиальностям 14.03.03 – патологическая физиология и 03.01.04 – биохимия Работа Ямщиковой Е.В. посвящена актуальной проблеме современной физиологии и биомедицины – изучению одного из звеньев врождённого иммунитета, антимикробных пептидов, защищающих клетки животных и человека от возбудителей многих опасных инфекций. В работе рассматриваются сравнительно мало изученные пептиды, относящиеся к семейству бактеницинов – антимикробные пепетиды из лейкоцитов козы, обогащённые пролином (ОПП). При этом следует подчеркнуть особенность диссертационной работы, заключающуюся в том, что была изучена биологическая активность не только природных пептидов, структура которых была установлена ранее [Samova et al., 1999, 2009], но и тех же пептидов, полученных путём химического синтеза. При этом было показано, что по антибактериальноа активности обе группы пептидов сходны. Изучение разных видов биологической активности синтетических пептидов демонстрирует движение в направлении использования ОПП как фармакологических постулирует агентов, возможность т.е. представленная практического работа применения не ОПП, только но и демонстрирует эту возможность экспериментально. С другой стороны, химический синтез отдельных фрагментов самого большого из 4-х изучаемых бактеницинов из лейкоцитов козы ChBac5, позволяет провести исследование роли этих фрагментов в проявлении различных видов биологической активности. Проведённое исследование показывает, что в лейкоцитах коз содержится набор пептидов, проявляющих различные виды биологической активности: антимикробной, цитотоксической, ранозаживляющей. Из 1 четырёх исследованных пептидов, каждый проявляет тот или иной вид активности в различной степени. Наряду с возможным применением ОПП для усиления защитных функций организма, эти пептиды могут быть использованы для коррекции различных нарушений в работе организма, при воспалении, росте опухолей и в процессе заживления ран. Все эти состояния были смоделированы в диссертационной работе и диссертанткой прослежено влияние ОПП на эти процессы. Полученные результаты показываю практическую значимость рецензируемой работы. Многие данные получены Е.В. Ямщиковой впервые. Так, впервые выявлены синергические эффекты антимикрбного действия ОПП при совместном применении с наночастицами серебра и антибиотиком рифампицином. В работе впервые получены данные о способности пептидов ChBac3.4, mini-ChBac7.5Nα и фрагментов крупного пептида Bac5 связывать липополисахрид, являющийся ведущим структурным компонентом наружней мембраны грамотрицательных бактерий. Именно грамотрицательные бактерии являются главной мишенью обогащённых пролином пептидов, поэтому изучение механизма их проникновения в бактериальную клетку является исключительно важным. И такого рода данные, представленные диссертанткой удачно дополняют уже имеющиеся в литературе. Что качается влияния изученных бактеницинов на грамположительные бактерии, то здесь значительная бактериостатическая активность получена лишь в отношении бактерий Micrococcus luteus Listeria и monocytogenes. В отношении последнего микроорганизмы известно, что его перемещение в клетке связано с активной полимеризацией актина клетки-хозяина, поэтому возможно, что механизмом действия ОПП является влияние на полимеризацию актина. Тем более, что из данных научной литературы известно, о шапероне Dnak, как внутриклеточной мишени ОПП, а мономер актина очень похож по молекулярной структуре на DnaK. 2 Недавно была обнаружена корреляция между присутствием в бактериальной клетке расщепляющей актин и DnaKпротеазы – протеализина – к способности продуцирующих его бактерий проникать в клетки эукариот и вызывать реорганизацию из цитоскелета. В плане дискуссии хотелось бы обсудить с автором вопрос о возможности такого механизма в исследованных им процессах и механизмах влияния обогащённых пролином пептидов на бактериальную инвазию. Обращают на себя внимание данные диссертационной работы по цитотоксическому действию бактеницина ChBac3.4 в отношении опухолевых клеток человека. Диссертантка попыталась выяснить механизм такого действия и использовав дополнительные подходы, пришла к выводу, что этот ОПП, будучи более гидрофобным, действует в большей степени на опухолевые клетки, чем на нормальные. Таким образом, в диссертационной работе представлены не только результаты экспериментов, но и возможные механизмы биологической активности антимикробных пептидов, что придаёт ей значительную научную ценность. Диссертационна работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, общего заключения и выводов. В диссертации 13 таблиц и 23 рисунка. Список цитированной литературы содержит 17 работ на русском и 212 – на иностранных языках. Диссертация и список литературы хорошо оформлены, почти не содержат опечаток. Обзор литературы изложен на 50 страницах и в соответствии с темой работы в нём рассмотрены вопросы защитных систем организма от инфекций, фагоцитоз и большая часть (44 стр.) посвящена антимикробным пептидам вообще и механизмам действия обогащённых пролином пептидов. Обзор написан чётко, логично и рассматривает почти все механизмы и подходы, которые втор использует при проведении экспериментальной 3 работы, вплоть до «возможного применения обогащённых пролином пептидов». Также подробно и детализировано описаны «Методы» (23 стр.). Прежде всего это: 1. биохимические методы выделения, очистки и идентифакации обогащённых пролином пептидов из лейкоцитов козы, 2. методы оценки влияния пептидов на микроорганизм и 3. методы оценки влияния пептидов на эукариотические клетки. Таким образом, автор показывает себя в этом разделе как биохимик, микробиолог и как клеточный биолог, владеющий как препаративными методами электрофореза и хроматографии, так и аналитическими методами биохимии, микробиологии и клеточной биологии. Так же по трём вышеуказанным направлениям разделены и результаты работы. Правда не всегда чётко видно, где результаты опутов с синтетическими, а где с природными пептидам, но возможно такое деление не всегда оправдано. Основные результаты уже изложены в первой части отзыва. Анализ экспериментальных данных, проведённый в главе «Обсуждение результатов» показывает, что диссертантка является не только хорошим экспериментатором, но также хорошо ориентируется в «море» литературных данных и всегда находит «маяк» для интерпретации собственных результатов. Сформулированные автором выводы диссертации вполне обоснованны и следуют из полученного экспериментального материала. Результаты достаточно полно изложены в 12 публикациях, приведённых в автореферате. Содержание автореферата соответствует основным положениям диссертации. Таким образом, в работе Е.В. Ямщиковой получены новые данные фундаментального плана, расширяющие наши представления о биологической роли обогащённых пролином антимикробных пептидах из 4 семейства бактеницинов в реализации и регуляции защитных реакций организма, а также намечены реальные подходы для их использования для коррекции патологических состояний организма, связанных с воспалением, ростом опухоли или заживлением ран. Диссертанткой использован целый арсенал современных методов биохимии, микробиологии и клеточной биологии. Сделанные выводы являются конкретными и хорошо отражают научную и практическую значимость диссертации. Таким образом, диссертационная работа Ямщиковой Е.В. «Биологическая активность обогащённых пролином пептидов системы врождённого выполненной иммунитета» является законченной, научно-исследовательской работой самостоятельно фундаментального характера. По актуальности, поставленным целям и задачам, объёму проведённых исследований, новизне полученных результатов, их научной и практической значимости настоящая диссертационная работа полностью отвечает требованиям, предъявляемым к кандидатским диссертациям в соответствии с п.7 "Положения о порядке присуждения ученых степеней…" (утвержденным Постановлением Правительства РФ № 74 от 30.01.2002 г., с изменениями от 20.06.2011 г. № 475), а её автор Ямщикова Е.В. несомненно заслуживает присвоения ей искомой степени кандидата биологических наук по специальностям 14.03.03 – патологическая физиология и 03.01.04 – биохимия. Профессор кафедры биохимии СПбГПУ, доктор биологичеких наук Н.В. Кулёва 19 мая 2012г. 5
