Изучение биологических объектов методами атомно
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тольяттинский государственный университет» Нагорнов Ю.С. Изучение биологических объектов методами атомно-силовой микроскопии учебное пособие Тольятти 2012 УДК 577.3 ББК 28.07 Н 16 Печатается по решению научно-методического совета ФГБОУ ВПО «ТГУ» Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. Рецензент: Мерсон Д.Л. – доктор физико-математических наук, зав. кафедрой «Нанотехнологии, материаловедение и механика» ФГБОУ ВПО «ТГУ» Рецензент: Дышловенко П.Е. – кандидат физико-математических наук, доцент кафедры систем автоматизированного проектирования ФГБОУ ВПО «УлГТУ» Н 16 Нагорнов Ю.С. Изучение биологических объектов методами атомно-силовой микроскопии. Тольятти: ТГУ, 2012. 67 с. ISBN 978-5-88504-085-3 В учебном пособии представлена современная научная информация о возможностях атомно-силовой микроскопии в изучении живых объектов. Приводится описание принципа работы атомно-силового микроскопа и его технических особенностей, которые необходимо учитывать при работе с биологическими объектами. Приведены характерные особенности методик атомно-силовой микроскопии, которые позволяют не только визуализировать микромир живых объектов, а также получать дополнительную информацию о свойствах поверхности. В качестве примеров представлены научные данные изучения живых объектов методами атомно-силовой микроскопии: рассмотрен вопрос приготовления образцов молекул ДНК и результаты измерения, возможности использования комбинированных атомно-силовых и оптических исследований, приведены данные исследования структуры и организации макромолекул, а также изучения клеток крови в различных состояниях и воздействиях. УДК 577.3 ББК 28.07 © Нагорнов Ю.С. © ФГБОУ ВПО «ТГУ» 2 СОДЕРЖАНИЕ Введение Глава 1 Основы атомно-силовой микроскопии 1.1 Принцип работы атомно-силового микроскопа 1.2 Техника измерений атомно-силовой микроскопии 1.3 Методики атомно-силовой микроскопии 4 6 10 16 Глава 2 Применение атомно-силовой микроскопии для изучения биологических объектов 2.1 Протоколы приготовления образцов молекул ДНК для измерения 26 методом АСМ 2.2 Комбинированные АСМ и оптические исследования биологических 29 образцов 2.3 Исследование структуры и организации макромолекул с помощью АСМ 2.4 Изучение клеток крови методами АСМ 2.5 Изучение вирус - клеточного взаимодействия методами АСМ 2.6 Влияние фемтосекундного лазерного излучения на клетки крови 34 39 45 49 Заключение Список литературы 63 64 3 ВВЕДЕНИЕ В последние годы, благодаря появлению нанотехнологий, диагностика в медицине продвинулась на существенно новый уровень - в мир наноструктур. Столь распространенное в настоящее время понятие «нанотехнологии» столетия назад казалось недостижимым, однако человечество неукоснительно шло по пути открытия наноструктур. Первые исследователи наблюдали микромир, используя лишь естественную оптическую систему, доставшуюся им от природы, однако глаз способен различать детали объекта, отстоящие друг от друга не менее чем на 0,08 мм. Затем человечество стало открывать инструменты, позволяющие заглянуть в неизведанный мир. При археологических раскопках в древнем Вавилоне находили двояковыпуклые линзы - самые простые оптические приборы; линзы были изготовлены из отшлифованного горного хрусталя. В конце XVII века был изобретен микроскоп, который к концу XIX века достиг предела своего разрешения — с помощью светового микроскопа можно видеть детали, расстояние между которыми составляет до 0,2 мкм. Следующим этапом погружения в глубь микромира стал электронный микроскоп, позволивший получить разрешение до 0,1–0,01 нм. В конце ХХ века человечеству казалось, что достигнут предел возможностей, но в 1959 г. профессор Ричард Фейнман в своей знаменитой лекции «There’s Plenty of Room at the Bottom» показал перспективы для дальнейшего развития. И уже в 1981 г. Герд Биннинг и Генрих Рорер создают сканирующий туннельный микроскоп, который позволил ученым увидеть отдельный атом. Через пять лет после этого изобретения один из его разработчиков - Г. Биннинг совместно с К. Куэйтом и К. Гербером разработали новый тип микроскопа, который назвали атомно-силовым микроскопом (АСМ). АСМ позволяет наблюдать рельеф поверхности с большим пространственным разрешением — несколько ангстрем вдоль поверхности и сотые доли ангстрема по высоте. С его помощью удалось увидеть трехмерную структуру микромира. Атомно-силовая микроскопия в настоящее время становится одним из самых перспективных методов изучения структурных особенностей макромолекул. АСМ позволяет получать изображения объектов с высоким разрешением, сопоставимым с уровнем рентгеноструктурного анализа, в условиях, при которых макромолекулы не подвергаются жесткой обработке и проявляют свою природную активность. Кроме того, АСМ дает возможность не только визуализировать объекты на молекулярном уровне, но и изучать свойства индивидуальных макромолекул: распределение поверхностных зарядов, подвижность отдельных участков, конформационные изменения в зависимости от условий, силу специфического взаимодействия между молекулами. 4 В настоящем учебном пособии будет представлена последняя информация о возможностях АСМ при изучении живых объектов и их элементов. В первой главе приводится описание принципа работы атомно-силового микроскопа и его технических особенностей, которые необходимо учитывать при работе микроскопом. Так же будут приведены методики атомносиловой микроскопии, которые позволяют не только визуализировать микромир живых объектов, а также получать дополнительную информацию, как то распределение электрохимического потенциала, адгезионых сил и многое другое. Во второй главе будут представлены последние данные изучения живых объектов субмикронного размера методами АСМ. В частности будет рассмотрен вопрос по приготовлению образцов молекул ДНК и результаты измерения. Будут рассмотрены возможности использования комбинированных АСМ и оптических исследований биологических объектов. Кроме этого будет рассмотрено исследование структуры и организации макромолекул и изучение клеток крови в различных состояниях и воздействиях. 5 ГЛАВА 1 ОСНОВЫ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 1.1 Принцип работы атомно-силового микроскопа Атомно-силовая микроскопия - вид зондовой микроскопии, в основе которого лежит силовое взаимодействие атомов. На расстоянии около одного ангстрема между атомами образца и атомом зонда (кантилевера) возникают силы отталкивания, а на больших расстояниях - силы притяжения. Идея устройства очень проста - кантилевер, перемещаясь относительно поверхности и реагируя на силовое взаимодействие, регистрирует ее рельеф. В сканирующих зондовых микроскопах исследование микрорельефа поверхности и ее локальных свойств проводится с помощью специальным образом приготовленных зондов в виде игл. Рабочая часть таких зондов (острие) имеет размеры порядка десяти нанометров. Характерное расстояние между зондом и поверхностью образцов в зондовых микроскопах по порядку величин составляет 0,1 – 10 нм. В основе работы зондовых микроскопов лежат различные типы взаимодействия зонда с поверхностью. Так, работа туннельного микроскопа основана на явлении протекания туннельного тока между металлической иглой и проводящим образцом; различные типы силового взаимодействия лежат в основе работы атомно-силового, магнитно-силового и электросилового микроскопов. В основе работы АСМ лежит силовое взаимодействие между зондом и поверхностью, для регистрации которого используются специальные зондовые датчики, представляющие собой упругую консоль с острым зондом на конце (рис. 1). Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Регистрируя контролировать силу взаимодействия зонда с поверхностью [1]. 6 величину изгиба, можно Рис. 1. Схематическое изображение зондового датчика АСМ [1]. Качественно работу АСМ можно пояснить на примере сил Ван-дер-Ваальса. Наиболее часто энергию ван-дер-ваальсова взаимодействия двух атомов, находящихся на расстоянии r друг от друга, аппроксимируют степенной функцией - потенциалом Леннарда-Джонса (рис.2): Первое слагаемое в данном выражении описывает дальнодействующее притяжение, обусловленное, в основном, диполь - дипольным взаимодействием атомов. Второе слагаемое учитывает отталкивание атомов на малых расстояниях. Параметр ro - равновесное расстояние между атомами, U 0 - значение энергии в минимуме. Потенциал Леннарда-Джонса позволяет оценить силу взаимодействия зонда с образцом. Общую энергию системы можно получить, суммируя элементарные взаимодействия для каждого из атомов зонда и образца. Рис. 2. Качественный вид потенциала Леннарда-Джонса [1]. 7 В общем случае данная сила имеет как нормальную к поверхности, так и латеральную (лежащую в плоскости поверхности образца) составляющие. Реальное взаимодействие зонда с образцом имеет более сложный характер, однако основные черты данного взаимодействия сохраняются - зонд АСМ испытывает притяжение со стороны образца на больших расстояниях и отталкивание на малых. Рассмотрим общие черты, присущие различным зондовым микроскопам. Пусть взаимодействие зонда с поверхностью характеризуется некоторым параметром Р. Если существует достаточно резкая и взаимно однозначная зависимость параметра Р от расстояния зонд – образец Р=Р(z), то данный параметр может быть использован для организации системы обратной связи (ОС), контролирующей расстояние между зондом и образцом. На рис. 3 схематично показан общий принцип организации обратной связи сканирующего зондового микроскопа. Рис.3. Схема организации системы обратной связи зондового микроскопа [1]. Система обратной связи поддерживает значение параметра Р постоянным, равным величине Ро, задаваемой оператором. Если расстояние зонд – поверхность изменяется (например, увеличивается), то происходит изменение (увеличение) параметра Р. В системе ОС формируется разностный сигнал, пропорциональный величине ΔP = P - Po , который усиливается до нужной величины и подается на исполнительный элемент ИЭ. Исполнительный элемент отрабатывает данный разностный сигнал, приближая зонд к поверхности или отодвигая его до тех пор, пока разностный сигнал не станет равным нулю. 8 Таким образом можно поддерживать расстояние зонд-образец с высокой точностью. В существующих зондовых микроскопах точность удержания расстояния зонд-поверхность достигает величины ~ 0.01 Å. При перемещении зонда вдоль поверхности образца происходит изменение параметра взаимодействия Р, обусловленное рельефом поверхности. Система ОС отрабатывает эти изменения, так что при перемещении зонда в плоскости X,Y сигнал на исполнительном элементе оказывается пропорциональным рельефу поверхности. Для получения изображения в АСМ осуществляют специальным образом организованный процесс сканирования образца. При сканировании зонд вначале движется над образцом вдоль определенной линии (строчная развертка), при этом величина сигнала на исполнительном элементе, пропорциональная рельефу поверхности, записывается в память компьютера. Затем зонд возвращается в исходную точку и переходит на следующую строку сканирования (кадровая развертка), и процесс повторяется вновь. Записанный таким образом при сканировании сигнал обратной связи обрабатывается компьютером, и затем АСМ изображение рельефа поверхности Z = f(x,y) строится с помощью средств компьютерной графики. Наряду с исследованием рельефа поверхности, зондовые микроскопы позволяют изучать различные свойства поверхности: механические, электрические, магнитные, оптические и многие другие. Для этого используют специальные кантилеверы с магнитными или проводящими покрытиями (Co, TiN, Au, алмазное покрытие). Применение жидкостной атомно-силовой микроскопии позволяет локально проводить электрохимические реакции, прикладывая потенциал между зондом и проводящей поверхностью, что используется для исследования биологических объектов. 9 1.2 Техника измерений атомно-силовой микроскопии Получение АСМ изображений рельефа поверхности связано с регистрацией малых изгибов упругой консоли зондового датчика. В атомно-силовой микроскопии для этой цели широко используются оптические методы (рис. 4). Оптическая система АСМ юстируется таким образом, чтобы излучение полупроводникового лазера фокусировалось на консоли зондового датчика, а отраженный пучок попадал в центр фоточувствительной области фотоприемника [1]. В качестве позиционно чувствительных фотоприемников применяются четырехсекционные полупроводниковые фотодиоды. Основные регистрируемые оптической системой параметры это деформации изгиба консоли под действием Z-компонент сил притяжения или отталкивания ( F Z) и деформации кручения консоли под действием латеральных компонент сил ( F L) взаимодействия зонда с поверхностью. Если обозначить исходные значения фототока в секциях фотодиода через Ioi, I02, I03, I04,а через Ii, I2, I3, I4 - значения токов после изменения положения консоли, то разностные токи с различных секций фотодиода будут однозначно характеризовать величину и направление изгиба консоли зондового датчика АСМ. Действительно, разность токов вида пропорциональна изгибу консоли под действием силы, действующей по нормали к поверхности образца (рис. 5(а)). А комбинация разностных токов вида характеризует изгиб консоли под действием латеральных сил (рис. 5(б)). 10 Рис. 4. Схема оптической регистрации изгиба консоли зондового датчика АСМ [1]. Рис. 5. Соответствие между типом изгибных деформаций консоли зондового датчика и изменением положения пятна засветки на фотодиоде [1]. 11 Величина IZ используется в качестве входного параметра в петле обратной связи атомносилового микроскопа (рис. 6). Система обратной связи (ОС) обеспечивает IZ = const с помощью пьезоэлектрического исполнительного элемента, который поддерживает изгиб консоли Z равным величине задаваемой оператором. При сканировании образца в режиме Z = const зонд перемещается вдоль поверхности, при этом напряжение на Z-электроде сканера записывается в память компьютера в качестве рельефа поверхности Z=f(x,y). Пространственное разрешение АСМ определяется радиусом закругления зонда и чувствительностью системы, регистрирующей отклонения консоли. В настоящее время реализованы конструкции АСМ, позволяющие получать атомарное разрешение при исследовании поверхности образцов. Разрешение скана образца зависит не только от радиуса закругления зонда, но и от шероховатости поверхности. Именно поэтому при исследовании биологических объектов шероховатость подложки должна быть меньше структурных особенностей исследуемых объектов [1]. Зондирование поверхности в атомно-силовом микроскопе производится с помощью специальных зондовых датчиков, представляющих собой упругую консоль -кантилевер (cantilever) с острым зондом на конце (рис. 7). Датчики изготавливаются методами фотолитографии и травления из кремниевых пластин. Упругие консоли формируются из тонких слоев легированного кремния, SiO2 или Si3N4. Один конец кантилевера жестко закреплен на кремниевом основании-держателе. На другом конце консоли располагается собственно зонд в виде острой иглы. Радиус закругления современных АСМ зондов составляет 1-5 нм в зависимости от типа зондов и технологии их изготовления. Угол при вершине зонда – 10-20°. Силу взаимодействия зонда с поверхностью F можно оценить следующим образом: F=k Z , где к - жесткость кантилевера; Z - величина, характеризующая его изгиб. Коэффициенты жесткости кантилеверов k варьируются в зависимости от используемых при их изготовлении материалов и геометрических размеров. При работе зондовых АСМ датчиков в колебательных режимах важны резонансные свойства кантилеверов. Собственные частоты изгибных колебаний консоли прямоугольного сечения определяются следующей формулой [3]: 12 где l - длина консоли; Е - модуль Юнга; J - момент инерции сечения консоли; плотность материала; S - площадь поперечного сечения; i - численный коэффициент (в диапазоне 1-100), зависящий от моды изгибных колебаний. Как видно резонансная частота кантилевера определяется его геометрическими размерами и свойствами материала. Частоты основных мод лежат в диапазоне 10-1000 кГц. 13 Рис. 6. Упрощенная схема организации обратной связи в атомно-силовом микроскопе [1] Добротность кантилеверов, в основном, зависит от той среды, в которой они работают. Типичные значения добротности при работе в вакууме составляют 10 3 - 104. На воздухе добротность снижается до 300 - 500, а в жидкости падает до 10 - 100. В атомно-силовой микроскопии применяются зондовые датчики двух типов - с кантилевером в виде балки прямоугольного сечения и с треугольным кантилевером, образованным двумя балками. Общий вид зондовых датчиков с кантилевером в виде балки прямоугольного и треугольного сечений представлены на рис.8. А) Б) Рис. 7. Схематичное изображение зондового датчика АСМ [1]. А) Б) 14 Рис. 8. Общий вид зондового АСМ датчика с одиночной консолью прямоугольного сечения (А) и с одиночной консолью треугольного сечения (Б) [1]. На рис. 9. показаны электронно-микроскопические изображения выпускаемых серийно зондовых датчиков NSG11 с консолью прямоугольного сечения компании НТ-МДТ [2]. Иногда зондовые датчики АСМ имеют несколько кантилеверов различной длины (а значит, и различной жесткости) на одном основании. В этом случае выбор рабочей консоли осуществляется соответствующей юстировкой оптической системы атомно-силового микроскопа. Зондовые датчики с треугольным кантилевером имеют при тех же размерах большую жесткость и, следовательно, более высокие резонансные частоты. Чаще всего они применяются в колебательных АСМ методиках. Общий вид и габариты зондовых датчиков с треугольной консолью представлены на рис. 10. Изготовление зондовых датчиков для АСМ представляет собой достаточно сложный технологический процесс, включающий в себя операции имплантации, химического и плазменного травления [2]. 15 фотолитографии, ионной Рис. 9. Электронно-микроскопическое изображение АСМ зонда, расположенного на прямоугольной консоли [2]. Рис. 10. Электронно-микроскопическое изображение АСМ зонда, расположенного на треугольном кантилевере [2]. 16 1.3 Методики атомно-силовой микроскопии Контактные методы В идеальных экспериментальных условиях (например, в условиях сверхвысокого вакуума) когда кантилевер приближается к поверхности образца на него начинают воздействовать сила Ван дер Вальса. Они распространяются достаточно далеко и ощутимы уже на расстояниях в несколько десятков ангстрем. Затем на расстояниях в несколько ангстрем начинают действовать силы отталкивания (рис.11). В реальных условиях (в условиях окружающей атмосферы) в воздухе практически всегда присутствует некоторая влажность и на поверхностях образца и иглы присутствуют слои адсорбированной воды. Когда кантилевер достигает поверхности образца возникают капиллярные силы, которые удерживают иглу кантилевера в контакте с поверхностью и увеличивают минимально достижимую силу взаимодействия [2]. Рис. 11. Сила взаимодействия поверхности с зондом в контактном режиме [2]. Электростатическое взаимодействие между зондом и образцом может проявляться довольно часто. Оно может быть как притягивающим, так и отталкивающим. Ван дер Ваальсовы силы притяжения, капиллярные, электростатические и силы отталкивания в точке, 17 где зонд касается образца, в равновесии уравновешиваются силой, действующей на кончик зонда со стороны изогнутого кантилевера. При работе в контактном методе изгиб кантилевера отражает отталкивающую силу и используется непосредственно в системе обратной связи или в их комбинации для отображения рельефа поверхности. Наряду с отображением рельефа в процессе сканирования могут отображаться и другие характеристики исследуемого образца. Если кантилевер с зондом являются проводящими, то появляется возможность отображения сопротивления растекания образца. Если сканирование проводится в направлении перпендикулярном продольной оси кантилевера (в латеральном направлении) силы трения вызывают его скручивание. Измеряя это скручивание с помощью четырехсекционного фотодетектора, можно одновременно с отображением рельефа отображать также и распределение сил трения по поверхности образца. Методы постоянной высоты и постоянной силы При использовании контактных методов кантилевер изгибается под действием сил отталкивания, действующих на зонд. Сила отталкивания F действующая на зонд связана с величиной отклонения кантилевера x законом Гука: F = -kx, где k является жесткостью кантилевера. Величина жесткости для различных кантилеверов варьируется от 0.01 до нескольких N/m. В АСМ величина вертикальных смещений кантилевера измеряется с помощью оптической системы регистрации и преобразуется в электрический сигнал DFL. В контактных методах сигнал DFL используется в качестве параметра, характеризующего силу взаимодействия между зондом и поверхностью образца. Величина DFL прямо пропорциональна силе взаимодействия. При использовании метода постоянной высоты сканер микроскопа поддерживает закрепленный конец кантилевера на постоянной высоте. Таким образом, отклонения кантилевера отражают рельеф поверхности исследуемого образца (рис.12 (А)). Основным достоинством метода постоянной высоты является высокая скорость сканирования. Она ограничивается практически только резонансными свойствами кантилевера. К недостаткам метода постоянной высоты относится требование достаточной гладкости поверхности образцов. При исследованиях достаточно мягких образов (подобно полимерам, биологическим объектам и т.д.) они могут разрушаться или процарапываться, поскольку зонд находиться в непосредственном механическим контакте с поверхностью [2]. 18 А) Б) Рис. 12. Прохождение зонда АСМ в методе постоянной высоты (А) и методе постоянной силы (Б) [2]. При использовании метода постоянной силы величина изгиба кантилевера поддерживается в процессе сканирования постоянной при помощи системы обратной связи (рис.12 (Б)). Таким образом, вертикальные смещения сканера отражают рельеф поверхности исследуемого образца. Основным достоинством метода постоянной силы является возможность наряду с измерениями рельефа поверхности проводить измерения и других характеристик – сил трения, сопротивления растекания и др. К числу недостатков метода постоянной силы относится ограничение скорости сканирования временем отклика системы обратной связи. При сканировании относительно мягких образцов с развитой поверхностью сила давления зонда на поверхность варьируется, одновременно неравномерно прогибается и поверхность образца. В результате полученный рельеф поверхности может быть искажен. Возможное наличие существенных капиллярных сил, обусловленных наличием слоя воды, также приводит к ухудшению разрешения. Контактный метод рассогласования 19 Скорость сканирования в методе постоянной силы ограничена постоянной времени системы обратной связи. Этот недостаток в значительной степени может быть преодолен с использованием того факта, что в процессе сканирования новое значение величины изгиба кантилевера, т.е. сигнал рассогласования, устанавливается быстрее, чем система обратной связи приведет величину изгиба к предустановленному значению. Сигнал рассогласования системы обратной связи, возникающий в процессе сканирования с использованием метода постоянной силы содержит дополнительную информацию относительно рельефа поверхности. Он может быть использован для более полного воспроизведения рельефа. Контактный метод рассогласования может рассматриваться как промежуточный между методом постоянной силы и методом постоянной высоты, если коэффициент усиления системы обратной связи (т.е. скорость отработки сигнала рассогласования) устанавливается таким, чтобы система была способна отрабатывать относительно гладкие особенности рельефа и в то же время быть достаточно медленной, чтобы отрабатывать крутые ступеньки. В результате сигнал рассогласования будет плохо отображать гладкие особенности рельефа и с высоким контрастом отображать резкие шероховатости (рис.13). Такой способ отображения может быть полезным для поиска небольших неоднородностей на большом относительно гладком фоне. Рис. 13. Прохождение зонда АСМ в контактном методе рассогласования [2]. 20 Метод латеральных сил Метод латеральных сил позволяет различать области с различными коэффициентами трения, а также подчеркивать особенности рельефа поверхности. Эти возможности могут быть использованы одновременно с получением рельефа поверхности для более полной характеристики исследуемого образца. Физические основы метода латеральных сил заключаются в следующем. При сканировании по методу постоянной силы перпендикулярно продольной оси кантилевера помимо изгиба кантилевера в нормальном направлении происходит также и его торсионный изгиб. Он обусловлен моментом силы действующей на зонд. Для малых отклонений угол закручивания пропорционален поперечной или латеральной силе. Торсионное закручивание кантилевера измеряется оптической следящей системой микроскопа. При сканировании гладкой поверхности с участками с различными коэффициентами трения угол скручивания меняется на каждом участке. Это позволяет проводить измерения локальной силы трения. Если же поверхность не гладкая, то такая интерпретация затруднена. Для того, чтобы различить участки с различными коэффициентами трения и неоднородности рельефа необходимо использовать второй проход в противоположном направлении (рис.14). 21 Рис. 14. Двухпроходная методика в методе латеральных сил. При прямом проходе измеряется r, а при обратном проходе – l. Коэффициент трения вычисляется как разность этих величин [2]. Метод латеральных сил имеет важное значение при исследованиях полупроводников, полимеров, пленочных покрытий, запоминающих сред, при изучениях поверхностных загрязнений, химических особенностей и фрикционных характеристик и многое другое. Кроме того измерения латеральных сил позволяют относительно просто достигать атомарного разрешения на слюде и на других слоистых материалах. Контактных методов в АСМ достаточно много, но все они направлены на изучение твердых поверхностей и не подходят для исследования биологических объектов, для которых используются полуконтактные методы. Полуконтактные методы Использование колеблющегося кантилевера в сканирующей силовой микроскопии впервые было предложено Биннигом [4]. Одни из наиболее ранних экспериментальных реализаций 22 зондовой микроскопии с колеблющимся кантилевером были представлены в работах [5,6]. В них было продемонстрировано влияние градиентов сил на сдвиг резонансной частоты кантилевера и возможность бесконтактного сканирования поверхности образца. Необходимо отметить также, что ранее Дюриг изучал частотный сдвиг колеблющегося кантилевера в силовом поле иглы сканирующего туннельного микроскопа [7]. В работе [5] была продемонстрирована также возможность зондирования материалов при резком уменьшении амплитуды колебаний кантилевера. Возможность сканирования поверхности образца не только в притягивающих, но и в отталкивающих силах была продемонстрирована в [7]. Относительно слабый сдвиг частоты колебаний под влиянием отталкивающих сил означает, что контакт зонда с поверхностью образца в процессе колебаний не является постоянным. Только в течение короткой части периода колебаний зонд «ощущает» контактные отталкивающие силы. Особенно это касается колебаний с большой амплитудой. Рис.15. Схематичное представление принципа выбора рабочей точки. Z0 – расстояние между острием зонда и поверхностью [1]. Сканирование поверхности образца с колеблющимся кантилевером является не бесконтактным, а скорее прерывисто-контактным. Выбор расстояния от поверхности образца до острия зонда или выбор рабочей точки осуществляется из условия изменения частоты колебаний кантилевера (рис.15). При этом работа АСМ происходит в режиме отталкивания острия зонда и небольшого участка притяжения. Соответствующий метод сканирующей силовой микроскопии назван прерывисто-контактныи или полуконтактным методом. 23 Полуконтактный метод обладает определенными преимуществами по сравнению контактными методами. Прежде всего, при использовании этого метода давление кантилевера на поверхность образца существенно меньше, что позволяет работать с более мягкими и легко разрушающимися материалами, такими как полимеры, биоматериалы и клетки и другие живые объекты. Полуконтактный метод также более чувствителен к различным взаимодействиям с поверхностью, что дает возможность измерять ряд характеристик поверхности – распределение вязкости и упругости, электрических и магнитных доменов. Метод отображения фазы Ощущение контактных отталкивающих сил в процессе сканирования приводит к дополнительному фазовому сдвигу колебаний кантилевера относительно возбуждающих колебаний пьезовибратора. Этот фазовый сдвиг зависит от характеристик материала образца. Регистрация и отображение фазового сдвига в процессе сканирования широко используется в исследованиях наноструктурированных и неоднородных материалов. Такой метод получил название метода отображения фазового контраста. В процессе сканирования по полуконтактному методу, когда колеблющийся кончик зонда касается поверхности образца, он испытывает взаимодействие отталкивающих, адгезионных, капиллярных и других сил. Одновременно регистрируется изменение не только амплитуды колебаний кантилевера, но и сдвиг фазы. Если поверхность образца является неоднородной по своим свойствам, соответствующим будет и фазовый сдвиг (рис. 16). Рис.16. Изменение фазы колебаний на различных участках образца при сканировании [2]. Распределение фазового сдвига по поверхности будет отражать распределение характеристик материала образца. Метод отображения фазы позволяет получать ценную 24 информацию в широкой области применений, в некоторых случаях отображая неочевидные контрасты свойств материалов. Этот метод используется, например, для исследований биологических объектов, образцов с магнитными и электрическими характеристиками, а также для ряда других применений. Рис. 17. АСМ изображение поверхности пленки полиэтилена с размером 1x1 мкм [2]: а) рельеф поверхности, полученный в режиме постоянной амплитуды; б) соответствующее распределение фазового контраста. Метод зонда Кельвина Метод Зонда Кельвина позволяет изучать распределение поверхностного потенциала по образцу. Для этого в процессе сканирования необходимо поддерживать амплитуду колебаний зонда, раскачиваемого электрическим полем на частоте своего механического резонанса, равной нулю, путем изменения постоянного напряжения смещения U0. При сканировании значение переменной составляющей напряжения смещения U 1·sin(ωt) должно быть достаточно большим для возбуждения колебаний зонда. Частота переменного электрического поля выбирается равной резонансной частоте зондового датчика. Если при каком-то значении постоянного напряжения амплитуда колебаний становится равной нулю, значит это напряжение U0 равно поверхностному потенциалу в этой точке. Для исключения влияния рельефа поверхности на результаты исследования используется двухпроходная методика. 25 Рис.18. Первый проход зонда при сканировании для получения рельефа поверхности [2]. В процессе сканирования производится следующая процедура. На первом проходе сканируемой строки определяется рельеф по полуконтактному методу (рис. 18). Во время второго прохода расстояние между сканируемой поверхностью и зондовым датчиком поддерживается постоянным (рис.19). Это расстояние должно быть достаточно большим, чтобы исключить влияние рельефа. В таком случае зонд подвергается воздействию только дальнодействующих сил, основной вклад в которые осуществляется электрическими свойствами образца. Но расстояние dZ не должно быть чрезмерно большим, так как в этом случае уменьшается измеряемый сигнал и ухудшается латеральное разрешение. Рис.19. Второй проход зонда – сканирование осуществляется на фиксированном расстоянии от поверхности. Ф – потенциал поверхности [2]. Полуконтактных методов достаточно много и на всех останавливаться нет смысла при рассмотрении вопросов изучения живых объектов. При исследовании биологических объектов всегда выбирают полуконтактные методы, поскольку только они не разрушают поверхность образца. В этом направлении наиболее интересны субмикронные особенности и нанорельев поверхности мембран живых объектов. Рассмотрим наиболее интересные приложения АСМ к биологическим объектам. 26 ГЛАВА 2 ПРИМЕНЕНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ 2.1 Протоколы приготовления образцов молекул ДНК для измерения методом АСМ Атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее активно используется для изучения структурных особенностей биологических макромолекул (белков, ДНК), поскольку позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров [8-10]. Наряду с исследованием сухих образцов, АСМ позволяет исследовать молекулы и в буферных растворах. Для получения изображений методом АСМ, исследуемые объекты должны быть зафиксированы на какой-либо поверхности. При исследовании молекул ДНК в качестве подложки обычно используется кристаллическая слюда, поверхность которой является атомарно-гладкой. Для того чтобы прикрепить отрицательно заряженные молекулы ДНК на слюду, поверхность которой в воде также имеет отрицательный заряд, существует ряд методов, обзор которых приведен в данной заметке. Приводимые в качестве иллюстраций АСМ изображения были получены на приборах серии Solver и Ntegra компании NT-MDT полуконтактным методом на воздухе и в жидкости. Наиболее простым способом является добавление в буфер ионов двухвалентных металлов, которые играют роль мостиков между отрицательно заряженными поверхностью слюды и молекулой ДНК. Согласно работе [11], для крепления молекул ДНК наиболее подходят ионы никеля, кобальта и цинка, они обеспечивают надежное связывание с поверхностью слюды, достаточное для проведения измерений в жидкости. а) б) 27 Рис. 20. АСМ изображения образца кольцевой плазмидной ДНК pEGFP, приготовленного с помощью ионов никеля. Изображение (а) получено полуконтактным методом в буфере, изображение (б) получено полуконтактным методом на воздухе [2]. Для приготовления образца препарат ДНК разводят до концентрации около 1 мкг/мл в буфере, содержащем 5мМ HEPES и 1-5 мМ NiCl 2. На слюду наносят каплю раствора, инкубируют ее 5 минут и измеряют в буфере (рис. 20а), либо промывают в воде, сушат и измеряют на воздухе (рис. 20б). Крепление ионами магния оказывается более слабым, и не подходит для измерения ДНК непосредственно в буферном растворе. Однако выдержка свежесколотой слюды в воде перед нанесением препарата способствует более сильному связыванию молекул ДНК со слюдой [12]. О силе связывания можно судить по форме молекул: релаксированная форма (рис. 21а) говорит о наличии двумерной диффузии молекул вдоль поверхности слюды и, следовательно, о слабом связывании, скрученность (рис. 21б) указывает на непосредственный захват молекул при касании поверхности [12]. а б Рис 21. Молекулы ДНК, нанесенные из одного препарата на свежесколотую слюду (а) и на слюду, обработанную водой (б). Изображения получены полуконтактным методом на воздухе [2]. Другим способом является модификация поверхности слюды 3-аминопропилтриэтокси силаном (APTES) [13]. На поверхности слюды формируют пленку APTES, которая в воде имеет положительный заряд. Для этого образцы свежеочищенной слюды помещают в эксикатор в присутствии APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) и DIPEA (N,N- Disopropylethylamine) и инкубируют в атмосфере аргона в течение 2 часов при комнатной температуре. На подготовленную таким образом подложку наносят раствор ДНК, не добавляя 28 в буфер ионы металлов. В отличие от образцов, приготовленных с помощью ионов металлов, на образцах приготовленных этим способом молекулы ДНК более скручены (Рис. 22а). Модификацию поверхности слюды также можно проводить при помощи поли-L-лизином (poly-L-lysine). Для этого на свежеочищенную поверхность слюды наносят каплю 0.01% раствора поли-L-лизина с молекулярным весом 30000-70000, инкубируют 15 минут во влажной камере, промывают в воде и сушат. ДНК наносят и измеряют непосредственно в буфере либо высушивают и измеряют на воздухе. Этот обеспечивает способ надежное приготовления связывание, но приводит к сильной конденсации молекул – большая часть молекул образует конденсаты цветочной или палочкообразной формы (Рис. 22б). А) Б) Рис. 22. Плазмидная ДНК на силанизированной слюде (а) и на слюде, обработанной поли-Lлизином (б) [2]. Как видно из рисунков, форма молекул ДНК на поверхности слюды существенно зависит от способа приготовления образца. Используя различные протоколы приготовления образца, 29 из одного и того же препарата можно получить как полностью релаксированные молекулы, так и сильно сконденсированные. Это следует учитывать при проведении исследований и выбирать протокол, наиболее соответствующий условиям научной задачи. В частности, соли двухвалентных металлов целесообразно использовать в тех исследованиях, в которых необходимо получить расправленную молекулу (например, при изучении ДНК-белковых комплексов и картировании ДНК), а модификация слюды силаном или поли-L-лизином более подходит для исследования процессов конденсации молекул ДНК. До сих пор вопрос методики приготовления образцов для АСМ является актуальным и происходит поиск новых способов фиксации биологических объектов на подложку из слюды. Для наблюдения микрообъектов возникает другая проблема – увидеть особенности нанорельефа объектов микронного размера. Для этого совмещают оптические и АСМ методы наблюдения. 30 2.2 Комбинированные АСМ и оптические исследования биологических образцов Методы оптической микроскопии, такие как методы светлого поля, метод фазового контраста, флуоресцентная микроскопия и др. широко используются в различных областях биологических исследований. Большинство биологических лабораторий использует эти методы в обычной практике. Однако разрешение всех этих методов ограничено длиной волны излучения. Характерный диаметр клеток составляет 10÷20 мкм, бактерий от 0.5 до 3÷5 мкм, эти величины в 5 раз мельче мельчайшей частицы, видимой невооруженным глазом. Поэтому первое изучение клеток стало возможным только после появления оптических микроскопов. В конце XVII в. Антонио ван Левенгук изготовил первый оптический микроскоп, до этого люди и не подозревали о существовании болезнетворных микробов и бактерий. Трудности изучения клеток связаны с тем, что они бесцветны и прозрачны, поэтому открытие их основных структур состоялось только после введения в практику красителей. Красители обеспечили достаточный контраст изображения. С помощью оптического микроскопа можно различать объекты, отстоящие друг от друга на 0.2 мкм, т.е. самыми маленькими объектами, которые еще можно различать в оптическом микроскопе являются бактерии и митохондрии. Изображения более мелких элементов клеток искажаются эффектами, вызванными волновой природой света. Для приготовления долго сохраняющихся препаратов клетки обрабатывают фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизовать и сохранить их. Кроме того, фиксация повышает доступность клеток красителям, т.к. макромолекулы клеток скрепляются поперечными сшивками, что стабилизирует и закрепляет их в определенном положении. Чаще всего в качестве фиксаторов выступают альдегиды и спирты (например, глутаральдегид или формальдегид формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и сшивают соседние молекулы). После фиксации ткани обычно нарезают микротомом на очень тонкие срезы (толщиной от 1 до 10 мкм), которые затем помещают на предметное стекло. При таком способе подготовки можно повредить структуру клеток или макромолекул, поэтому предпочтительным методом является быстрое замораживание. Замороженную ткань режут микротомом, установленным в холодной камере. После приготовления срезов клетки окрашивают. В основном для этой цели используют органические красители (малахитовую зелень, судан черный и т.д.). Каждый из них характеризуется определенным сродством к клеточным компонентам, например, гематоксилин обладает сродством к отрицательно заряженным молекулам, поэтому позволяет выявить в клетках ДНК. Если та или иная молекула представлена в клетке в незначительном количестве, то удобнее всего использовать флуоресцентную микроскопию. 31 Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой, большей длины волны. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный оптический, но свет от мощного осветителя проходит через два набора фильтров фильтрации света, полученного от образца. Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает лишь свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель; в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции. Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Для этой цели обычно используют два красителя – флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом. Применяя для окраски и флуоресцеин и родамин можно получать распределение различных молекул. Простейший способ разглядеть детали клеточной структуры – наблюдать свет, рассеивающийся различными компонентами клетки. В темнопольном микроскопе лучи от осветителя направляются сбоку и при этом в объектив микроскопа попадают только рассеянные лучи. Соответственно, клетка выглядит как освещенный объект на темном поле. Одним из основных преимуществ темнопольной микроскопии является возможность наблюдать движение клеток в процессе деления и миграции. Клеточные движения, как правило, совершаются очень медленно и их сложно наблюдать в реальном времени. В этом случае используют покадровую микрокиносъемку или видеозапись. Последовательные кадры при этом разделены во времени, но при воспроизведении записи с нормальной скоростью картина реальных событий ускоряется. В последние годы видеокамеры и соответствующие технологии обработки изображения значительно увеличили возможности оптической микроскопии. Благодаря их применению удалось преодолеть трудности, обусловленные особенностями физиологии человека. Они состоят в том, что: 1. Глаз в обычных условиях не регистрирует очень слабый свет. 2. Глаз не способен фиксировать небольшие отличия в интенсивности света на ярком фоне. 32 Первая из этих проблем была преодолена после присоединения к микроскопу сверхвысокочувствительных видеокамер. Это позволило наблюдать клетки в течение длительного времени при низкой освещенности, исключая длительное воздействие яркого света. Системы обработки изображения особенно важны для изучения в живых клетках флуоресцирующих молекул. Поскольку изображение создается видеокамерой в форме электронных сигналов, его можно соответствующим образом преобразовать в числовые сигналы, направить в компьютер и затем подвергнуть дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Высокий контраст, достижимый с помощью компьютерной интерференционной микроскопии, позволяет наблюдать даже очень мелкие объекты, как, например, отдельные микротрубочки, диаметр которых менее одной десятой длины волны света (0.025 мкм). Отдельные микротрубочки можно увидеть и с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако в обоих случаях неизбежны эффекты дифракции, сильно изменяющие изображение. Диаметр микротрубочек при этом завышается (0.2 мкм), что не позволяет отличать отдельные микротрубочки от пучка из нескольких микротрубочек. Для решения этой задачи необходим электронный микроскоп, предел разрешения которого сдвинут далеко за пределы длины волны видимого света. Взаимосвязь длины волны и предела разрешения сохраняется и для электронов. Однако для электронного микроскопа предел разрешения существенно ниже дифракционного предела. Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. В электронном микроскопе с напряжением 100 000 В длина волны электрона равна 0.004 нм. Согласно теории дифракции, разрешение такого микроскопа в пределе составляет 0.002 нм. Однако в реальности вследствие малой величины числовых апертур электронных линз разрешение современных электронных микроскопов в лучшем случае составляет 0,1 нм. Трудности приготовления образца, его повреждение излучением существенно снижают нормальное разрешение, которое для биологических объектов составляет 2 нм (примерно в 100 раз выше, чем у светового микроскопа). Источником электронов в просвечивающем электронном микроскопе является нить катода, расположенная в вершине цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы избежать рассеивания электронов при столкновениях с молекулами воздуха, в колонне создается вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в оптическом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают внутрь колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается в 33 соответствии с плотностью вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и формирует изображение (подобно формированию изображения в оптическом микроскопе) на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране. Одним из самых больших недостатков электронной микроскопии является то, что биологические образцы необходимо подвергнуть специальной обработке. Во-первых, их фиксируют сначала глутаровым альдегидом, а затем осмиевой кислотой, связывающей и стабилизирующей двойной слой липидов и белков. Во-вторых, электроны обладают низкой проникающей способностью, поэтому приходится делать сверхтонкие срезы, а для этого образцы обезвоживают и пропитывают смолами. В-третьих, для усиления контраста образцы обрабатывают солями тяжелых металлов, такими как осмий, уран и свинец. Для того, чтобы получить трехмерное изображение поверхности используется сканирующий электронный микроскоп, где используются электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью образца. Образец в данном случае фиксируют, высушивают и покрывают тонкой пленкой тяжелого металла, а затем сканируют узким пучком электронов. При этом оценивается количество электронов, рассеиваемых при облучении поверхности. Полученное значение используют для контроля интенсивности второго луча, движущегося синхронно первому и формирующему изображение на экране монитора. Разрешение метода около 10 нм и он не применим для изучения внутриклеточных органелл. Толщина образцов, изучаемых этим методом, определяется проникающей способностью электронов или их энергией. Основными и существенными недостатками всех этих методов является длительность, сложность и высокая стоимость приготовления образца. Атомно-силовая микроскопия, совмещенная с инвертированным оптическим микроскопом, позволяет сочетать общепринятые оптические методики с методами сканирующей зондовой микроскопии. Специально разработанная система освещения позволяет облучать образец конденсором микроскопа при установленной АСМ измерительной головке [2]. Поэтому без потери качества оптических изображений можно использовать все возможности СЗМ: нанометровое разрешение, измерения локальной адгезии и упругости, наноманипулирование сканирующим зондом, измерения силовых кривых и т.д. При этом все измерения проводить на различных участках образца, оптически наводясь и выбирая последовательно качественно различные области биологических объектов. На рис. 23 представлены светлопольное и фазоконтрастное оптические изображения клеток фибробласта человеческого эмбриона, полученные в процессе сканирования АСМ. Клетки были выращены и зафиксированы на покровном стекле с последующим высушиванием. 34 a) б) Рис. 23 Светлопольное a) и фазоконтрастное б) оптические изображения клетки фибробласта с подведенным кантилевером АСМ [2]. Рис. 24. 3D АСМ изображение клетки фибробласта на воздухе –область сканирования отмечена прямоугольником на рис. 23б [2]. В процессе оптического наблюдения за клетками фибробласта был выбран участок, обозначенный на рис.23б светлым прямоугольником. Подведенный кантилевер атомносилового микроскопа на верху рис.23 а и б виден как темно-красный прямоугольник. После выбора области и запуска процесса сканирования кантилевер перемещается в выделенную область и участок становится не виден в оптический микроскоп. При этом одновременно появляется восстановленное компьютером трехмерное АСМ изображение (рис.24). 35 2.3 Исследование структуры и организации макромолекул с помощью АСМ Метод атомно-силовой микроскопии можно применить для визуализации тетрамеризации рибосом-инактивирующих белков второго типа (РИБ II). Результаты, полученные с помощью АСМ, вносят вклад во многие исследования касающиеся биологии РИБ II [16-22]. Растворы токсинов были разбавлены в фосфатно-солевом буфере до концентраций 0.5-2 мкг/мл. На свежесколотую подложку слюды наносили каплю раствора объемом 10 мкл и инкубировали в течение 1 минуты. Затем образец отмывали три раза в деонизованной воде и обдували азотом. Для АСМ измерений использовали полуконтактный метод. Одним из достоинств полуконтактного метода является уменьшение латеральных сил взаимодействия между зондом и образцом по сравнению с контактным методом АСМ. Вертикальные силы также могут быть снижены выбором подходящих значений начальной и рабочих амплитуд колебаний зонда, а также выбором силовой константы кантилевера. Отмеченные достоинства полуконтактного метода АСМ важны при изучении мягких биологических объектов, таких, например, как адсорбированные на слюду макромолекулы, слабо закрепленные на подложке [2]. Для исследования молекул использовался сканирующий зондовый микроскоп Solver P47H, в котором реализована схема сканирования зондом, оборудованный приставкой для проведения измерений с атомарным разрешением. Для экспериментов использовались кремниевые зондовые датчики серии NSG11S с двумя кантилеверами с типичной силовой константой 5.5 Н/м и 10.5 Н/м. Начальная амплитуда колебаний зонда лежала в диапазоне 5-15 нм, рабочая амплитуда лежала в диапазоне 1-10% от начальной амплитуды. Для каждого зондового датчика эти значения определялись экспериментально с помощью амплитудных кривых и качества изображений (рис.25 а и б). а) б) 36 Рис. 25. Изображение, полученное при начальной амплитуде a)10 нм, б)34 нм [2]. Получаемое изображение зависит от выбора значения рабочей амплитуды A sp (рис.26). В случае амплитуды близкой к нулю (режим отталкивания – рис.26а), так же как и в случае амплитуды, слегка меньше начальной (режим притяжения – рис.26г), удается получать изображения с хорошим контрастом и разрешением. Если же рабочая амплитуда Asp выбрана в области перехода или чуть выше, изображение становится нестабильным и частично инвертированным (рис.26 б и в). В отличие от результатов, полученных в работе [23], оказалось, что режим отталкивания так же пригоден для изучения молекул. Более того, режим отталкивания более стабилен, чем режим притяжения и дает большее разрешение. Различие полученных результатов и результатов работы [23] можно объяснить тем, что здесь были использованы зонды меньшей жесткости (5 Н/м и 11 Н/м вместо 25-50 Н/м). После выполнения процедуры выбора значения рабочей амплитуды кантилевера были получены АСМ изображения токсинов, в частности рицина, агглютинина рицина и вискумина (рис.27). Рицин – растительный рибосом-инактивирующий белок второго типа (РИП II). Присутствует в семенах клещевины, и состоит из двух субъединиц (А и В), соединенных дисульфидной связью. А-субъединица (active) способна модифицировать рибосомальную РНК, что приводит к остановке синтеза белка. 37 а) Asp=0.1 nA б) Asp=1.93 nA в) Asp=2.1 nA г) Asp=2.63 nA Рис. 26. Изображения антител полученные при разных рабочих амплитудах Asp [2]. В-субъединица (binding) обусловливает связывание токсина с клеточной мембраной и его доставку к внутриклеточной мишени – рибосоме. Связывание происходит за счет взаимодействия лектиновых центров В-субъединицы с углеводной частью клеточных рецепторов. Видно (рис.27а), что характерный размер рицина порядка 10 нм [2]. 38 a) б) в) Рис. 27. АСМ сканы токсинов: а) молекул рицина б) молекул агглютинина рицина в) молекул вискумина [2]. На рис.27б показано АСМ изображение молекул агглютинина рицина. Агглютинин рицина – второй РИБ из семян клещевины. В отличие от рицина этот белок представлен в виде тетрамера (две В- и две А-субъединицы), образованного за счет ковалентного взаимодействия между двумя А-субъединицами токсина. При этом характерный размер агглютинина рицина порядка 10-15 на 20 нм, т.е. примерно в 2-2,5 раза больше, чем характерный размер рицина. На рис. 27в показано АСМ изображение молекул вискумина. Вискумин - РИБ, продуцируемый в листьях омелы (Viscum album) и имеющий структуру и свойства, сходные со свойствами рицина. Основные отличия этих веществ состоят в спектре сахаров, узнаваемых Всубъединицами токсинов. При этом характерный размер частиц вискумина варьируется от 10 до 20 нм, а форма различных частиц вискумина совпадает либо с частицами рицина либо с 39 частицами агглютинина рицина. Таким образом, атомно-силовая микроскопия позволяет наблюдать процесс организации макромолекул на различных стадиях. 40 2.4 Изучение клеток крови методами АСМ Для изучения изменений формы клеток крови, строения их мембран в процессе взаимодействия эритроцитов с вирусами успешно используется атомно-силовая микроскопия. При исследовании биологических препаратов процесс подготовки образцов имеет решающее значение. Для исследований на воздухе клеток крови применялись две основные схемы приготовления образцов. Наиболее простой способ приготовления образцов для АСМ является метод мазка. Для исследования пригоден простой мазок крови, приготовленный на предметном стекле стандартным для клинической лаборатории методом. Капля крови (10-20 мкл) наносится на чистое предметное стекло и размазывается вторым стеклом. Толщина мазка убывает вдоль направления размазывания. Препарат готов к исследованию практически сразу и не требует дополнительных манипуляций. В световом микроскопе выбирается область, где клетки крови расположены в один слой. Более сложный способ приготовления образцов для исследования клеток крови является способ нанесения клеток из суспензии. В этом случае образец представлял собой суспензию клеток крови – эритроцитов в фосфатном буфере (рН 7,0). Перед сорбцией клетки фиксировали добавлением параформальдегида до конечной концентрации 2% и через 2 часа переводили в дистиллированную воду, доведя концентрацию до 10 8 штук/мл. Каплю суспензии (5-10 мкл) наносили на предметное стекло размером 3х3 см и сушили на воздухе. Стекло крепилось к столику микроскопа с помощью двухстороннего скотча. В зависимости от поставленных задач клетки крови можно исследовать в воздушной среде или в жидкости (солевом буфере). Являясь существенно менее трудоемким по сравнению с жидкостным, воздушный режим обеспечивает высокое разрешение, позволяет наблюдать целостность и характер повреждений мембраны. Как показано в работах [1,2], обезвоживание практически не искажает форму эритроцитов и строение их мембраны. Именно на высушенных образцах получали изображение спектринового скелета мембраны [1]. Сухой режим позволяет регистрировать тонкие нарушения мембранной структуры, то время как при работе в жидкости пространственное разрешение ограничено [3]. Для измерений на воздухе подходят как полуконтактный, так и контактный методы. Оба режима допускают применение error mode с близкими результатами. Параллельно полуконтактный метод позволяет получать изображения в фазовом контрасте, дающие сведения об упругости объекта, а контактный метод дает возможность получить изображение в режиме латеральных сил или сил трения и позволяет измерить упругость объекта в режиме 41 снятия силовых кривых. В данном случае эритроциты на воздухе исследовали полуконтактным методом. При получении изображений мембраны с высоким разрешением параллельно получали два изображения: в режимах HIGH и MAG (error mode). Использование режима фазового контраста при работе на воздухе не давало дополнительной информации и, поэтому, не применялось. Измерения проводили зондами NSG11 компании NT MDT [2]. Исследования проводились на наборе образцов, имеющих разное происхождение, с разным временем воздействия вируса на эритроциты [2]. Для фиксации времени взаимодействия проводилась обработка суспензии эритроцит-вирус добавлением к ней параформальдегида до конечной концентрации 2%. Чтобы уменьшить скорость вирус-клеточного взаимодействия процесс приготовления образцов до этапа фиксации проводился при температуре 4-6 оC. При исследовании на воздухе в оптическом микроскопе, на столике которого размещен АСМ сканер, оценивалось состояние эритроцитов и выбиралось поле для изучения. Благодаря достаточно большой площади скана (70х70 мкм), при первом сканировании в кадр попадало значительное число (десятки) эритроцитов, что давало возможность оценить их состояние (изменения формы), выбрать объект для подробного исследования, а также переходить с одного объекта на другой не перемещая зонд вдоль образца. a) б) Рис. 28. Влияние нарушений в методике приготовления эритроцитов для АСМ на их форму: а) нарушения рН при промывке; б) влияние гипертонированного раствора [2]. На рис.28 представлены нарушения формы эритроцитов при неправильном обращении с суспензией [2]. Нарушение рН (в данном случае закисление раствора) приводит к нарушению целостности мембраны, что провоцирует округление эритроцитов и запуск процесса слияния 42 (рис.28а). Повышение ионной силы приводит к обезвоживанию эритроцитов и, как следствие, искажению мембраны (рис.28б). a) б) Рис. 29. Артефакты искажения изображения эритроцитов, возникающие при сканировании и связанные с [2]: а – возбуждением зонда на краях эритроцитах при резких перепадах высот (на HIGH изображениях малозаметны, проявляются в error mode и phase mode); б – разрыхлением эритроцитарной мембраны и появлением на ней участков, взаимодействующих с зондом при его прилипании. На рис. 29 представлены сканы, на которых видны артефакты искажения изображения эритроцитов, возникающие при сканировании. На рис.29а артефакт связан с возбуждением зонда на краях эритроцитах при резких перепадах высот, которые проявляются в основном в error mode и phase mode. На рис. 29б показан скан эритроцитов петуха, полосы на изображении связаны с разрыхлением эритроцитарной мембраны, в результате чего появляются участки, взаимодействующие с зондом при его прилипании [2]. Данный эффект нельзя в полном смысле отнести к артефактам, т.е. явлениям, не имеющим отношения к предмету исследования. Нарушения в процессе сканирования прямо связаны со строением мембраны и могут использоваться для регистрации произошедших изменений в мембранной структуре, в данном случае видно, что произошло разрыхление мембраны [2]. Мазок крови является простейшим биологическим препаратом, при этом его приготовление занимает всего несколько минут. Присутствие в крови множества белков исключает кристаллизацию солей при высушивании и делает ненужной отмывку соли. В то же время на скане мазка можно найти множество интересных объектов в разных диапазонах 43 увеличения от клеток крови с размерами в несколько микрон до белков крови или особенностей мембраны с размерами единицы нанометров (рис.30). Осаждение клеток из суспензии - более равновесный процесс, чем получение мазка, которое применяется для получения распределения клеток крови по формам и размерам в отсутствие механических искажений. Дополнительным преимуществом применения суспензий клеток крови является возможность модельных экспериментов с клетками. Можно изучать действие на клетки физических или химических воздействий, например лекарств или вирусных частиц (рис.31). a) б) Рис. 30 Сканы получены зондом NSG11 в полуконтактном режиме [2]. а) - 70х70 мкм скан мазка крови человека на предметном стекле. Основную часть клеток составляют красные кровяные клетки - эритроциты. Они имеют близкие размеры, однако легко меняют форму (например, чтобы пройти в капилляр). На скане их форма искажена давлением соседних клеток. Белая стрелка – моноцит, желтая стрелка - тромбоцит. б) - скан 70х45 мкм «монетный столбик» из эритроцитов. Такие столбики наблюдаются в медленно циркулирующей крови под световым микроскопом. 44 a) б) Рис. 31. Сканы эритроцитов, полученные полуконтактным методом [2]. a) – эритроциты макаки резус, осажденные из суспензии. IC mode Форма относительно мягких эритроцитов млекопитающих искажается даже под действием соседних клеток. b) - Эритроциты петуха. IC mode. Имеющие ядро эритроциты птиц являются более жесткими по сравнению с эритроцитами млекопитающих и не искажаются при взаимном контакте. При осаждении клеток из суспензии получение препарата сложнее, чем в методе мазка. Например, существует опасность внесения искусственных искажений формы или строения мембраны, связанных с изменением рН или ионной силы буфера (рис. 28). Для приготовления суспензии каплю свежей крови смешивают с антикоагулянтом (ЭДТА, цитрат натрия, гепарин). Неизбежное нарушение баланса между белками крови и солями буфера приводит к кристаллизации солей в процессе обезвоживания, проявляющихся на скане и искажающих форму эритроцитов [2]. Удаление солей с помощью дистиллированной воды приводит к отрыву от подложки сорбированных на ней клеток. Поэтому при работе с суспензиями следует или использовать иммобилизацию клеток с помощью агентов, связывающих клетки с подложкой (например, полилизин), или переводить клетки перед осаждением на подложку в дистиллированную воду. Последнее требует предварительной химической фиксации клеток, чтобы избежать повреждений и искажений формы, вызываемых низкой ионной силой. В приведенных сканах на рис.31 использовали метод фиксации клеток параформальдегидом с последующим переводом клеток в дистиллированную воду. Кроме этого, искажения формы эритроцитов могут наблюдаться и при суспензионном случае при контакте двух или нескольких клеток (рис.31а). Поэтому для изучения изменений формы следует выбирать одиночно расположенные объекты. По литературным данным 45 сорбция на подложку из суспензии и обезвоживание эритроцитов не приводит к изменениям их формы и строения поверхности мембраны. Сравнение формы искажений, вызываемых разными причинами (влияние химических веществ, ионной силы и рН раствора, болезнь, действие вирусных частиц, механические повреждения) [23]. Метод суспензии дает возможность определить физико-химические механизмы, действующие в каждом случае. В свою очередь эта информация поможет разработать методы лечения или создать эффективные лекарства и вакцины. Изучение эритроцитов методом АСМ может применяться и для прямой диагностики болезней крови [24]. 46 2.5 Изучение вирус - клеточного взаимодействия методами АСМ Простейший живой организм – вирус – целиком состоит из биополимеров – белка и РНК (иногда ДНК), в состав некоторых вирусов входят также липиды. Вирусы являются возбудителями инфекционных болезней растений, животных и человека и размножаются только в живых клетках. Форма различных вирусов очень разнообразна. У многих бактериофагов (вирусов, размножающихся в бактериях) они состоят из головки и отростка, кроме того форма вирионов (зрелых вирусных частиц) бывает прямоугольная, шарообразная, палочкообразная, нитевидная, в виде многогранных шариков и др. По размерам вирусы делят на крупные (300-400 нм в диаметре), средние (80-125 нм) и мелкие (20-30 нм. Использование атомно-силовой микроскопии расширило круг задач, решаемых при исследовании вирусов. Стало возможным изучать механические свойства отдельных вирионов, взаимодействие вирусов друг с другом и с подложкой, процессы деградации вирусных частиц, возникновение и рост вирусных кристаллов и т.д. Способность некоторых вирусов образовывать кристаллические структуры была обнаружена давно и использовалась, в частности, для определения размеров вирусных частиц с высокой точностью. Многие вирусы представляют собой отличные системы для изучения процесса кристаллизации из раствора благодаря своим относительно большим размерам. Кинетика их кристаллизации по меньшей мере на порядок медленнее, чем для общепринятых систем, а большие размеры позволяют визуализацию как кристаллической решетки так и отдельных частиц. В настоящее время с помощью АСМ в жидкости наблюдают динамику и особенности роста кристаллов из многих икосаэдрических растительных вирусов. Техника АСМ, в частности позволяет длительное (до нескольких дней) наблюдение за ростом кристалла, во время которого практически не происходит внешнего воздействия на растущую систему (за исключением слабого воздействия зонда). Максимальное разрешение вирусов (до уровня капсомеров – структурных элементов белковой оболочки) при их АСМ- исследованиях наблюдается именно на кристаллических поверхностях. Изучение взаимодействия вирус-эритроцит может рассматриваться как пример особого случая воздействия на мембрану. Это более сложный процесс, чем химическое или механическое воздействие на мембрану. Взаимодействие вирус-эритроцит является специфичным процессом. Его результаты прямо зависят как от вида вируса, так и происхождения эритроцита. Более того, иногда реакция различна для разных штаммом одного и того же вируса. 47 На рис.32а показана тонкая структура мембраны эритроцитов в норме, особенности рельефа, наблюдаемые на мембране интерпретируются как спектриновый мембранный скелет [16,17]. На рис.32б можно увидеть, что воздействие вирусов влияет на мембрану эритроцитов, в частности, происходит размытие мембранного скелета. На рис.32в видны кластеры, регулярно наблюдающиеся на краю эритроцитов, взаимодействовавших с вирионами и не наблюдающиеся на нативных клетках. В настоящее время причины их появления не ясны. a) б) в) Рис. 32. Тонкое строение мембраны на АСМ сканах эритроцитов [2]: a – контрольный образец. Мембрана имеет классическое строение. b – нарушения рельефа, связанные с действием вирионов. с – кластеры, регулярно наблюдающиеся на краю эритроцитов, взаимодействовавших с вирионами и не наблюдающиеся на нативных клетках. a) б) в) Рис. 33. Последовательные стадии искажения формы эритроцитов макаки-резус под влиянием вирусов [2]: а – контрольный образец; б – влияние на форму эритроцитов вируса гриппа; с – полная деградация эритроцитов макаки резус после 90 минутного взаимодействия с парвовирусом собак. 48 В результате вирус- клеточного взаимодействия меняется форма эритроцитов и тонкое строение их мембраны (рис.33). Форма эритроцитов меняется также от механической деформации [20] и химического воздействия [21,22]. Биохимические механизмы искажения формы эритроцитов пока не ясны [23]. Использование метода суспензии более универсально по применению, однако может привести к появлению артефактов приготовления. Сравнение обзорных сканов с контрольного и опытных образцов дают представление об изменении формы эритроцитов в процессе их взаимодействия с вирусными частицами. Так эритроциты птиц не меняются при их контактах с использованными частицами вируса гриппа и парвовируса, в то время как эритроциты макаки резус изменяются очень быстро и очень сильно (рис.33). При этом вирус краснухи оказывает существенное влияние на форму и состояние эритроцитов птиц (рис.34). a) б) Рис. 34. Формы эритроцитов цыпленка до (а) и после (б) взаимодействия с вирусом краснухи [2]. В тех случаях, когда реакция не идет и взаимодействие вирус-клетка ограничивается сорбцией вирионов на мембране эритроцита, вирусные частицы можно наблюдать на поверхности мембраны (рис.35). Проведение реакции вирус-эритроцит описано в работе [19]. Для АСМ препараты готовили осаждением из суспензии, исследование велось в режиме прерывистого контакта [2]. Сканирование велось сразу в двух режимах – HIGH и MAG. Последний режим соответствует методу рассогласования, который необходим для выделения мелких особенностей, соответствующие дефектам на мембране или сорбированным вирусным частицам с размерами 10-20 нм на фоне резких изменений высоты, связанных с формой эритроцита (перепад около 1 мкм). 49 Error mode дает возможность выявить тонкую структуру мембраны на фоне резких изменений высоты [2]. В этом режиме хорошо различимы нарушения и дефекты на поверхности эритроцитов макаки, вызываемые влиянием вирусных частиц. На эритроцитах птиц наблюдаются сорбированные вирионы гриппа (рис.35). a) б) Рис. 35. Изображения поверхности эритроцита с сорбированными на ней вирионами гриппа [2]: а) в полуконтактном режиме; б) error mode. В случае, если сканирование происходит в полуконтактном режиме мелкие детали рельефа или вирионы гриппа или совсем не видны, или визуализируются только на выделенной части рисунка (рис.35а). В режиме error mode вирионы наблюдаются по всей поверхности эритроцитов, более того, отчетливо видны артефакты, возникающие при сканировании и связанные с возбуждением зонда на резких границах (рис.35б). Надо отметить, что метод рассогласования или error mode предназначается для исследования мелких особенностей поверхности на фоне резких перепадов высоты в кадре [2]. 50 2.6 Влияние фемтосекундного лазерного излучения на клетки крови Изменение формы эритроцитов может возникать вследствие внешних физико-химических воздействий, т. е. клетки могут подвергаться различным обратимым и необратимым трансформациям. В крови млекопитающих в норме абсолютное большинство эритроцитов (до 97%) представляют собой дискоцитарные, с гладкой поверхностью, диаметром 6,5—8 мкм. Хорошо известным примером обратимой деформации эритроцитов является переход от дискоцита к эхиноциту. Понимание механизмов деформации эритроцитов важно для представления о структурной организации и динамическом состоянии мембранных белков и липидов и факторах окружающей среды, которые могут влиять на свойства и целостность мембраны [25]. Когда эритроцит кладут под покровное стекло для исследования методами АСМ микроскопии, наблюдается изменение его формы: двояковогнутый диск покрывается выростами. Такой вид эритроцита получил название эхиноцита. Это обратимая форма, и если отмытые эритроциты поместить в нормальную свежую плазму они опять примут дискоидную форму. Трансформация дискоцит - эхиноцит начинается с нарушения контура двояковогнутой структуры эритроцита с последующим появлением грубых выростов сначала по окружности диска, а затем по всей поверхности клетки, после чего эритроцит принимает в основном сферическую форму. Трансформация эхиноцита обратима до стадии потери мембранного вещества и не зависит от объема. Образование стоматоцита - это другой вариант трансформации эритроцита. Клетки становятся похожими на «открытый рот». Агенты, вызывающие трансформацию дискоцита в стоматоцит, это непроникающие анионы, либо катионные амфиофилы. Следует заметить, что как определенная концентрация стоматоцитогенного или эхиноцитогенного агента, так и специфический рН ведут к гетерогенным изменениям формы в популяции эритроцитов, что указывает на определенную роль исходного состояния мембраны в специфике внутренних факторов [26-47]. В работах [25,26] под руководством проф. Генинг Т.П. было проведено исследование влияния фемтосекундного низкоинтенсивного лазерного излучения на морфологию и состояние мембраны эритроцитов крысы. Суспензию эритроцитов разводили 1:1 0,85% NaCl. Фемтосекундный лазер имел следующие характеристики: длительность импульса – 100 фс, средняя мощность - 1,25 мВт, пиковая мощность – 6 кВт. Время облучения варьировалось от 1 до 10 минут с расстояния 3 и 5 см, так что доза облучения составляла от 27 до 480 мДж/с. 51 Использование ультракоротких лазерных импульсов приводит к диссоциации и образованию радикалов молекул растворителя, т.е. вызывают биохимические реакции, которые обычно наблюдаются в растворах при облучении ионизирующей радиации. Как представляется принципиальное отличие импульсного фотолиза от, например, гамма радиолиза состоит в том, что молекулы растворителя в первом случае диссоциируют вблизи молекул – хромофоров, которые поглощают лазерное излучение, а не во всем облучаемом объеме, как при гамма радиолизе [39]. По результатам проведенного морфологического исследования [25], среди эритроцитов всех экспериментальных групп, по сравнению с контролем, снижено содержание дискоцитов (рис.37) и повышено количество обратимо (эхиноциты) и необратимо (сфероциты) трансформированных эритроцитов. Индекс трансформации у них превосходит таковой у контрольных эритроцитов на несколько порядков (рис.36). Рис.36. Зависимость индекса трансформации (ИТ) от дозы, полученной суспензией эритроцитов, при воздействии фемтосекундного лазерного излучения [25,26]. 52 Рис. 37. График зависимости количества нормальных форм эритроцитов от дозы лазерного облучения [25,26]. Увеличение индекса трансформации происходит в геометрической прогрессии уже при минимальных дозах лазерного облучения (0,69 при дозе 27 мДж/г и 0,91 при дозе 48 мДж/г против 0,126 в контроле) и достигает 27,03 при максимальной дозе облучения 480 мДж/г (табл.1). Соотношение обратимо и необратимо трансформированных клеток было различным: эхиноциты преобладали на начальных минутах облучения лазером, с увеличением времени облучения увеличивалось количество сфероцитов (табл.2). Индекс трансформации эритроцитов в контроле соответствует норме. Таблица 1. Индекс трансформации эритроцитов при различных дозах облучения фемтосекундным лазером [25,26]. Доза облучения Индекс трансформации кон 27 48 81 135 144 240 270 480 тро мДж/ мДж мДж мДж мДж мДж мДж мДж ль 0,1 г /г /г /г /г /г /г /г 0,7±0 0,9± 1,9± 3,4± 8,8± 5,4± 27±1 29±3 ,4 0,5 0,4 2 0,2 2,4 2 ,7 3±0 ,01 Таблица 2. 53 Влияние различных режимов фемтосекундного лазерного излучения на соотношение нормальных и трансформированных форм эритроцитов [25,26]. Типы эритроцитов Дискоциты, % Эхиноциты, % Сфероциты, % Стоматоциты, % кон 27 тро мД ль ж/г ж/г ж/г ж/г 63±1 62±1 37±5 32±8 2 2 * * 4,1± 17±1 45±7 26±3 64±1 74±5 85± 34±9 0,04 ,6* * * 2* * 3* * 22±8 2,7± 16±2 * 2 ,4* 89±1 6,2± 2 4,3± 1,6 0,42 ±0,0 0 44 81 мД 135 мД 144 мД мД ж/г 10,3 ±0,3 * 0 240 270 480 мД мД мДж ж/г ж/г 2,5 /г ±0, 6±3* 22±6 * 2,4± 0,3 33±5 1,9± 16±5 26±1 25±1 1,2± * 1,2 * 3* 1* 0,7 5* 5±2 7,5 ±1, 39±1 2* 26±4 * 4 5* Примечание: * - данные статистически значимо отличаются от таковых в контроле (р≤0,5) На рис.36. представлена зависимость степени трансформации эритроцитов от дозы излучения [25,26]. На рис.37. показано значительное уменьшение количества дискоцитов (нормоцитов) с увеличением дозы лазерного облучения (5,7% при 480 мДж/г против 89,2% в контроле). В работе Калинкина А.А. с соавт. [37], в процессе проведения облучения эритроцитов in vitro лазером РИКТА-МВ установлено, что лазерное излучение оказывает существенное влияние на количество, размер и форму эритроцитов. Показано, что количество эритроцитов после 5 мин экспериментального воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) практически не изменяется, а через 10 и 20 мин достоверно уменьшается. Работами К.Л.Миллер с соавт. [43] показано, что под влиянием НИЛИ (λ=0,63-0,68 мкм и мощностью от 1,7 до 40 мВт) изменялась деформируемость и осмотическая резистентность эритроцитов. Эффект зависит от мощности излучения и времени экспозиции лазера. Л.В.Корси с соавт. [40] показано, что при облучении эритроцитов в различных спектральных диапазонах полупроводниковыми лазерами, лазерами на красителях и твердотельным титан-сапфировым лазером деформируемость эритроцитов при лазерном облучении с длинами волн в окрестности 577, 630, 762 и 1268 нм имеет резонансный характер, подобный полосам спектра поглощения молекулярного кислорода при высоком давлении. При воздействии на эритроциты лазерного излучения фемтосекундным лазером было установлено [25,26], что уже после 1 мин воздействия увеличивается количество 54 морфологически деформированных эритроцитов по сравнению с контролем (рис.38,39). При исследовании сканированных образцов витальных эритроцитов контрольной группы методом сканирующей зондовой микроскопией (СЗМ) обнаруживаются, в основном, нормоциты с дисковидной формой (рис.38). Рис.38. Изображение эритроцитов контрольной группы двумерное и трехмерное изображение [25,26]. После воздействия фемтосекундного ЛИ дозой в 48 мДж/г лазера цитоархитектоника эритроцитов меняется. На сканированном снимке появляются обратимо деформированные формы – эхиноциты [25,26]. Их появление в физиологических условиях связано с изменением полной проницаемости мембраны, с нарушением работы ионных каналов. При режиме 27 мДж/г число эхиноцитов также является преобладающим (рис.39). Рис.39. АСМ- изображение эритроцитов после облучения фемтосекундным лазером дозой 27мДж/г - дву и трехмерное [25,26]. 55 Рис.40. Дву- и трехмерное АСМ- изображения эритроцитов после облучения фемтосекундным лазером дозой 81 мДж/г [25,26]. Рис.41. Дву- и трехмерное АСМ- изображение эритроцитов после облучения фемтосекундным лазером дозой 240 мДж/г (слева) и 135 мДж/г (справа) [25,26]. При дозах облучения 81 и 144 мДж/г появляются сфероциты, что четко видно на АСМизображении (рис.40). Сфероциты образуются и при 5 мин воздействия с дозой облучения 240 мДж/г и 135 мДж/г (рис.41). При 10-минутном воздействии практически все эритроциты на сканированных образцах представляют собой сфероциты [25,26]. Они могут быть неправильной формы с измененными линейными размерами (рис.42). Число эритроцитов снижается, что подтверждают результаты подсчета красных клеток крови в камере Горяева. 56 Рис.42. АСМ- изображение эритроцитов после облучения фемтосекундным лазером дозой 480 мДж/г [25,26]. Результаты морфологических наблюдений свидетельствуют о том, что фемтосекундное лазерное излучение вызывает уменьшение упруговязкостных свойств мембраны эритроцита, что приводит к уменьшению его осмотической устойчивости и сопровождается изменением жесткости эритроцитарных мембран (рис.43). Индекс ригидности - интегральный показатель, который зависит в том числе от состояния мембран эритроцитов (соотношение холестерина и фосфолипидов) и от вязкости внутренней среды эритроцита, определяемого содержанием гемоглобина. На деформируемость клеток крови влияет их форма – при этом отклонение от дискоидной формы нарушает их деформируемость. Методы АСМ позволяют измерять локальные упругие свойства поверхности клеток. Для их оценки использовали модуль Юнга, рассчитываемого по модели Герца для исследования эластичности «мягких» биологических объектов [48]. 57 Рис.43. Кривая ригидности эритроцитов контрольной группы (слева) и после облучения фемтосекундным лазером дозой 27 мДж/г (справа) [25,26]. Результаты исследования показали [25,26], что ригидность мембран эритроцитов в контроле составляла в среднем 1,7 ± 0,5 кПа. При облучении фемтосекундным лазером дозой в 48 мДж/г ригидность статистически значимо повышается до 4,1 ± 1,6 кПа, а при дозе 280 мДж/г – ригидность составляет снова 1,7 ± 0,8 кПа. При облучении дозой 144 мДж/г и 480 мДж/г ригидность остается на уровне контрольной группы (рис.44). На рис.44 представлены данные значений ригидности эритроцитов при действии фемтосекундного лазерного излучения дозой 27 мДж/г, 81мДж/г. При этом, ригидность эритроцитов повышается почти в 4 раза по сравнению с контролем (5,3 ± 1,75 кПа, 5,6 ± 1,52 кПа - соответственно). При облучении дозой 135мДж/г ригидность эритроцита превышает контрольные значения в 5 раз (8,5 ± 3,32 кПа против 1,7 ± 0,54 кПа). 58 А) Б) Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от таковых в контрольной группе. ` - данные, статистически значимо отличающиеся от таковых в предыдущей группе. Рис.44. Изменение ригидности при влиянии на эритроциты in vitro различных доз фемтосекундного лазерного излучения [25,26]: А – при облучении с расстояния 3см, Б – при облучении с расстояния 5 см. Полученные результаты позволяют предполагать [25,26], что фемтосекундное лазерное излучение приводит к падению деформируемости и увеличению жесткости эритроцитарных мембран, что сопровождается появлением атипичных форм эритроцитов. 59 Резистентность - свойство эритроцитов противостоять разрушительным осмотическим, механическим, тепловым воздействиям. Эритроциты в гипертонических солевых растворах сморщиваются, а в гипотонических — набухают. При значительном набухании наступает гемолиз. Осмотическая резистентность эритроцитов отражает стабильность клеточных мембран. Метод определения осмотической резистентности основан на измерении степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипотонических растворах хлористого натрия определенной концентрации [36]. В работе Миллера К.Л. с соавт. (2008) были использованы лазеры 630 и 650 нм с мощностью 1,7, 20 и 40 мВт и выяснено, что действия данных низкоинтенсивных лазеров красной области спектра повышает устойчивость эритроцитов к гипотоническому гемолизу и улучшает их деформируемость вследствие мембраностабилизирующего эффекта. На основании других экспериментальных исследований известно, что в первые минуты лазерного облучения, происходит частичное нарушение мембраны эритроцитарной клетки, которое неизменно ведет к деструктивным изменениям липидно-белкового слоя, в результате чего образуются токсичные продукты перекисного окисления липидов, действующие разрушающе на эритроцитарную мембрану, что приводит к выходу гемоглобина [43]. Эритроциты, как порфиринсодержащие клетки, являются акцепторами (хромофорами) лазерного излучения в красной области спектра [46]. Это во многом объясняет позитивное действие НИЛИ на реологические свойства крови: снижение эритроцитарной агрегации и увеличение способности эритроцитов к деформируемости вследствие изменения их физикохимических свойств (повышение отрицательного электрического заряда на мембране, модификация ее Низкоинтенсивное структуры лазерное и микрореологии облучение вызывает эритроцитарной структурную цитоплазмы) перестройку [33,42]. мембран форменных элементов крови и оказывает мембраностабилизирующее действие, ведущее к изменению пластических характеристик клеток крови, снижению агрегации тромбоцитов и их чувствительности к тромбоксану А2, ингибированию ключевых ферментов арахидоновой кислоты – циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы [41-44]. В работе Калинкина А.А. с соавт.(2006) показано повышение устойчивости мембран эритроцитов к гемолизирующему действию гипотонических растворов, снижение перекисного окисления липидов по уровню МДА при воздействии лазером РИКТА МВ на эритроциты крыс in vitro. Облучение в течение 20 минут данным импульсным лазером мощностью 8 Вт существенно изменяло осмотическую резистентность эритроцитов. Данные по влиянию фемтосекундного ЛИ на клетки крови встречаются только в работах [25,26]. Из данных, представленных в таблице 1, следует, что изменение осмотической резистенности эритроцитов при воздействии на них фемтосекундного лазерного излучения in vitro не зависит от средней интенсивности воздействия [26]. При этом значимое падение 60 степени гемолиза имело место при дозе 144 мДж/г. Наблюдалось снижение максимальной осмотической резистентности эритроцитов при 27 и 48 мДж/г. Эти данные позволяют предположить, что облучение фемтосекундным лазером, возможно, приводит к деструктивным структурным изменениям мембраны эритроцитов, что снижает их осмотические свойства, повышает ригидность и склонность к повышенному гемолизу [25]. Таблица 3. Степень гемолиза при облучении фемтосекундным лазером при различных режимах [25,26]. NaCl, % Контроль 27 мДж/г 48 мДж/г 81 мДж/г 135мДж/г 144мДж/г 0,7 2,97 3,58 3,83 5,47 4,37 4,5 0,6 1,41 2,85 1,76 2,08 2,54 2,72 0,55 2,42 2,09 4,53 2,08 2,69 1,97 0,5 4,27 2,9 3,76 5,61 6,97 2,86 0,45 15,56 15,84 34,55 56,58 40,22 30,84 0,4 55,40 79,03 48,75 85,36 63,03 65,56 0,35 82,07 86,68 76,48 92,07 89,23 76,56 0,3 93,65 88,08 79,92 94,49 91,35 73,7 240мДж/г 270мДж/г 480мДж/г 3,24 2,97 4,15 1,51 3,73 4,02 2,86 3,73 2,46 2,97 3,69 4,93 46,36 44,89 39,52 55,28 67,76 91,78 82,12 77,73 88,06 7 95,28 89,66 90,92 Рис. 45. Содержание гемоглобина в надосадке эритроцитов (г/л) при различных режимах облучения фемтосекундным лазерным излучением [25,26]. Исследование свободного гемоглобина в надосадке облученных эритроцитов показало [25,26], что во всех экспериментальных группах его содержание повышено относительно контрольных значений (рис. 45). Активирование или повреждение биосистем оптическим излучением посредством прямого фотовозбуждения растворенного в них молекулярного кислорода в синглетное состояние, так называемый светокислородный эффект, было 61 обнаружено в 1989 году [34] и в последующем достаточно полно изучен. Было показано, что эффект сопровождается повреждением клеточных и субклеточных мембран, усилением перекисного окисления циклических соединений (холестерин, порфирины и т.д.) и соединений алифатического ряда (жирные кислоты, фосфолипиды), т.е. ЛИ может оказывать прямое деструктивное действие на ткани и органы. Изменение характерной формы эритроцита связано с морфофункциональной нестабильностью клеточной мембраны в результате активации процессов ПОЛ. При накоплении в мембране продуктов ПОЛ происходит его структурная реорганизация с образованием липидных кластеров, малоподвижных конгломератов липидов, ограничивающих подвижность встроенных в мембрану белковых молекул различного функционального назначения [25,26]. В окрестности длин 577, 630, 762 и 1268 нм форма спектра лазерного воздействия на деформируемость эритроцитов близка к форме спектра поглощения кислорода, что косвенно подтверждает механизм прямой фотогенерации синглетного кислорода и его реакционной способности при воздействии на биообъекты. Сведения о механизмах действия лазерной гемотерапии недостаточны: противоречивы даже данные о стимулирующих и угнетающих дозах НИЛИ. Это может быть обусловлено тем, что эффекты лазерного света зависят от параметров излучения, типа облучаемых клеток, их исходного состояния и чувствительности к лазерному воздействию. Предполагается, что одним из механизмов, лежащих в основе терапевтической эффективности лазерного облучения, является нормализующее влияние НИЛИ на процессы перекисного оксиления липидов (ПОЛ) в мембранах клеток и стимуляция антиоксидантной системы (АОС) [31]. НИЛИ в терапевтических дозах оказывает антиоксидантный эффект при облучении крови « in vitro». Фотоактивация супероксиддисмутазы и угнетение процессов ПОЛ при действии красного (632,8нм) и инфракрасного (860 нм) лазерного излучения низкой интенсивности на кровь наблюдались в 75-80% случаев. Основной вклад в активность СОД цельной крови вносят эритроциты. Установлена зависимость изменений активности ферментов от продолжительности воздействия и спектральной характеристики лазера [30]. В работах [25,26] показано, что после воздействия фемтосекундного лазерного излучения в эритроцитах уровень МДА значимо повышается относительно контрольных значений. Однако эффект не является дозозависимым. Можно предположить, что фемтосекундный лазер стимулирует окисление липидов мембран эритроцитов, начиная с 1 минуты воздействия. С этим же, вероятно, связано и проявление повышенного гемолиза, степень которого находилась в прямой зависимости от дозы облучения. В результате, возрастает ригидность и жесткость мембраны эритроцитов. В работах [25,26] также установлено, что увеличение активности ГР при увеличении дозы облучения (рис.46). 62 Рис.46 Активность глутатион-редуктазы в эритроцитах, облученных in vitro фемтосекундным лазером, в зависимости от полученной дозы [25,26]. Динамика активности фермента при этом носит линейный характер при облучении на расстоянии 5 см. При расстоянии 3 см и дозы облучения в 240 мДж/г наблюдается спад активности фермента (рис.46). Активность каталазы – фермента, непосредственно утилизирующего перекись водорода, увеличивалась в эритроцитах после облучения фемтосекундным лазером in vitro (табл.4). Возрастание активности имело место при всех изучаемых режимах мощности и длительности воздействия. При этом до определенной дозы воздействия (рис.47) активность фермента возрастала, и затем снижаясь, изменялась волнообразно, незначительно отклоняясь от уровня, достоверно превышающего контроль [26]. 63 Таблица 4. Уровень МДА (вторичного продукта ПОЛ), активность каталазы (ммоль/мин/л) в эритроцитах крысы и содержание свободного гемоглобина в надосадке после воздействия фемтосекундного лазера в зависимости от дозы облучения [25,26]. Контроль 48мДж/г 144мДж/г 240мДж/г 480мДж/г 27мДж/г 81мДж/г 135мДж/г 270мДж/г МДА, Каталаза, Гемоглобин, г/л мкмоль/л ммоль/мин/л (n=10) (n=8) 139,9±9,99 172,7±10,92 176,1±9,69 172,7±12,8 170,9±12,02 177,83±5,18 172,65±9,05 176,1±12,39 176,1±6,46 (n=10) 8,75±0,81 9,28±1,34 9,23±0,84 12,02±1,98 10,23±1,37 7,78±1,30 9,46±0,69 12,68±3,19 12,72±1,77 1,82±0,39 2,90±0,040 4,22±0,68 3,82±0,64 4,21±0,37 4,72±0,68 4,74±0,68 4,34±0,61 5,09±0,70 Рис.47. Уровень МДА и активность каталазы в эритроцитах, облученных in vitro фемтосекундным лазером, в зависимости от полученной дозы [25,26]. Таким образом, в ходе проведенных биохимических исследований системы ПОЛ-АО выявлено, что активность ферментативного звена АОС меняется значимо при больших дозах облучения, а уровень МДА повышается уже на начальных этапах воздействия [25,26]. 64 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в настоящем учебном пособии представлена современная научная информация о возможностях атомно-силовой микроскопии в изучении живых объектов. При описании принципа работы атомно-силового микроскопа были представлены его технические особенности, которые необходимо учитывать при работе с биологическими объектами. В частности приведены характерные особенности методик атомно-силовой микроскопии, которые позволяют не только визуализировать микромир живых объектов, а также получать дополнительную информацию о свойствах поверхности. К таким характеристикам относится распределение электрохимического потенциала мембраны клетки, упругие свойства или ригидность мембраны. Режим фазового контраста позволяет оценить морфологию поверхности в условиях небольших изменений высоты вплоть до 2-10 нм на фоне больших изменений мембраны или оценить химический состав поверности. В пособии также подробно представлены последние научные данные исследования живых объектов методами атомно-силовой микроскопии. В первую очередь уделено внимание наиболее трудоемкому и сложному процессу приготовления образцов молекул ДНК для исследования методами АСМ. Представлены результаты измерений, демонстрирующие возможности использования комбинированных оптических и атомно-силовых наблюдений. Широко представлены исследования клеток крови методами АСМ, в том числе под действием вирусов и низко интенсивного импульсного лазерного излучения с длиной волны близкой к резонансной полосе поглощения, при которой образуется синглетный кислород. 65 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведени. РАН. Институт физики микроструктур. Нижний Новгород, 2004 г.114с. 2. Интернет-сайт компании "НТ-МДТ" http://www.ntmdt.ru 3. Биргер И.А., Шорр Б.Ф., Иосилевич Г.Б.– Расчет на прочность деталей машин // М.: Машиностроение, 1979, 702 с. 4. Bennig G.K. Atomic force microscope and method for imaging surfaces with atomic resolution. US Patent 4,724,318. 5. Martin Y., Williams C.C. and Wickramasinghe H.K. Atomic force microscope–force mapping and profiling on a sub 100‐Å scale // J. Appl. Phys. 61, 4723 (1987) http://dx.doi.org/10.1063/1.338807. 6. Meyer G. and Amer N.M. Erratum: Novel optical approach to atomic force microscopy // Appl. Phys. Lett. 53, 2400 (1988). 7. Dürig U., Gimzewski J.K. and Pohl D.W. Experimental Observation of Forces Acting during Scanning Tunneling Microscopy // Phys. Rev. Lett. 57, 2403–2406 (1986). 8. Малюченко, Н.В., Тоневицкий, А.Г., Савватеев, М.Н. // Биофизика, т. 48, вып. 5, стр. 830-836, 2003. 9. Savvateev M.N., Kozlovskaya N.V., Moisenovich M.M. et al // AIP Conference Proceedings, V. 696, p. 428, 2003. 10. Savvateev M.N. Application note “AFM study of macromolecules' structure and organization”. Интернет сайт компании НТ-МДТ (www.ntmdt.ru). 11. Hansma H.G., Laney D.E. // Biophys J., 70(4), pp. 1933-1939, 1996. 12. Rivetti C., Guthold M. and Bustamante C. // J. Mol. Biol. V. 264, pp. 919–932, 1996. 13. Lyubchenko Y.L., Gall A.A., Shlyakhtenko L.S., Harrington R.E., Oden P.I., Jacobs B.L. and Lindsay S.M. // J. Biomolec. Struct. Dyn., V. 9, pp. 589-606, 1992. 14. Sandvig K., Grimmer S., Lauvrak S.U., Torgersen M.L., Skretting G., van Deurs B., Iversen T.G. Pathways followed by ricin and Shiga toxin into cells // Histochem. Cell Biol., v. 117, n. 2, pp. 131-141, 2002. 66 15. Moisenovich M., Tonevitsky A., Agapov I., Niwa H., Schewe H., Bereiter-Hahn J. Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells // Eur. J. Cell Biol., v. 81, n. 10, pp. 529-538, 2002. 16. Takeuchi M., Miyamoto H., Sako Y., Komizu H. and Kusumi A. Structure of the Erythrocyte Membrane Skeleton as Observed by Atomic Force Microscopy // Biophys J, May 1998, Vol. 74, N5. p. 2171-2183. 17. Zhang, P. C., Bai, C., Huang, Y. M., Zhao, H., Fang, Y., Wang, N. X. and Li, Q. (1995). "Atomic force microscopy study of fine structures of the entire surface of red blood cells." Scanning Microsc. 9(4): 981-989; discussion 1009-1010. 18. Nowakowski R, Luckham P, Winlove P Imaging erythrocytes under physiological conditions by atomic force microscopy. Biochim Biophys Acta 2001 Oct 1;1514(2):170-6. 19. Zaitsev B.N., Durymanov A.G., Generalov V.M. Atomic Force Microscopy of the Interaction of Erythrocyte Membrane and Virus Particles. Proc. Intern. Workshop "Scanning Probe Microscopy-2002", p. 211-213. Nizhny Novgorod, 03.03-06.03.2002. 20. Ohta Y, Okamoto H, Kanno M, Okuda T Atomic force microscopic observation of mechanically traumatized erythrocytes.. Artif Organs 2002 Jan;26(1):10-7. 21. Cheng Y, Liu M, Li R, Wang C, Bai C, Wang K. Gadolinium induces domain and pore formation of human erythrocyte membrane: an atomic force microscopic study. Biochim Biophys Acta 1999 Oct 15;1421(2):249-60. 22. Girasole, M., Cricenti, A., Generosi, R., Congiu-Castellano, A., Boffi, F., Arcovito, A., Boumis, G. and Amiconi, G. (2000). "Atomic force microscopy study of erythrocyte shape and membrane structure after treatment with a dihydropyridinic drug." Appl. Phys. Letters. 76(24): 3650-3652. 23. Girasole M, Cricenti A, Generosi R, Congiu-Castellano A, Boumis G, Amiconi G. Artificially induced unusual shape of erythrocytes: an atomic force microscopy study. J Microsc 2001 Oct;204(Pt 1):46-52. 24. O'Reilly M, McDonnell L, O'Mullane J. Quantification of red blood cells using atomic force microscopy. Ultramicroscopy 2001 Jan;86(1-2):107-12. 25. Арсланова Д.Р., Абакумова Т.В., Генинг Т.П. и др. Влияние фемтосекундного лазерного излучения на эритроциты IN VITRO // Лазерная медицина. 2011. Т. 15. № 2. С. 215-215. 26. Генинг Т.П., Абакумова Т.В., Арсланова Д.Р. и др. Морфофункциональное состояние нейтрофилов человека при воздействии фемтосекундного лазерного излучения в условиях in vitro // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. N3. 2011. С. 3-15. 67 27. Андреева Л.И. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой. / Л.И. Андреева, Л.А. Кожемякин, А.А. Кишкун //Лаб.дело.-№11.-1988.-с.41-43. 28. Барабой В.А. Перекисное окисление и стресс /В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Голотин, Ю.Б. Кудряшов. – СПб.: Наука, 1992. – 147с. 29. Введение в биомембранологию // Под ред. А. А. Бондарева. — М.: Изд-воМГУ, 1990. —208 с. 30. Волотовская А.В. Мембраноклеточные эффекты лазерного облучения крови / Е.И.Слобожанина, В.С.Улащик // Лазерная медицина. - 2005. - Т.9.Вып.1. – С.4 -9. 31. Девятков Н.Д. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения / С.М.Зубкова, И.Б.Лапрун, Н.С..акеева // Успехи современной биологии. – 1987. - Т.103. - №1. - С.22-27. 32. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма //Успехи соврем. биол. - 1989. – Т.108, вып1.(4). - С.3-18. 33. Жибурт Е.Б., Серебряная Н.Б., Рождественская Е.Н. Некоторые клеточные механизмы действия лазерного излучения крови // Пат. физиология и эксперим. терапия. – 1998. – № 3. – С. 6–7. 34. Захаров С.Д., Еремеев Б.В., Перов С.Н. Кр.сообщ.физ. ФИАН, №1, 15 (1989). 35. Захаров С.Д., Иванов А.В. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей. //Квантовая электроника. – 1999. - №3. – С.192-214. 36. Идельсон Л.И. - В кн.: Справочник по функциональной диагностике. Под ред. И.А.Кассирского. М., 1970, 401c. 37. Калинкин А.А., Авдеенко В.С., Чучин В.Н., Авдеенко К.В. Влияние квантового воздействия на морфологическую картину крови крыс в эксперименте.//Вестник квантовой ветеринарии, 2006. http://www.rikta-vet.ru/rus/information/conferences/? conference=7 38. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник: в 2 т. – СПб.: Интермедика, 1999. – С. 27-28. 39. Козинец Г., Симоварт Ю. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови. — Таллин: Валгус, 1984. — 116с; 40. Корси Л.В. Лазерный способ фотохимической деструкции опухолей без экзогенных сенсибилизаторов / Л.В.Корси, В.Г.Соколов // Сб. статей «Лазерно-оптические системы и технологии» ФГУП «НПО Астрофизика». М., 2009 - С.101-106. 41. Кочетков А.В. Лечебные физические факторы на этапе ранней реабилитации больных церебральным инсультом: автореф. дис. ...д-ра мед. наук. – М., 1998. 68 42. Кривозубов Е.Ф., Борзенков С.А., Бойчев О.Д. Влияние комплексной терапии на реологические свойства цельной крови при бронхиальной астме // Воен.-мед. журнал. – 2000. – № 3. – С. 68– 69 43. Миллер К.Л. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения красной области спектра на осмотическую резистентность и деформируемость эритроцитов / К.Л.Миллер, И.В.Сергеев, Д.П.Дворецкий // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. – 2008. – Т.7, №1(25). – С.26-30. 44. Рассомахин А.А. Клинико-биохимические и клинико-иммунологические параллели при эндоваскулярной лазеротерапии у больных дисциркуляторной энцефалопатией: автореф. дис. ...канд. мед. наук. – Саратов, 1996 45. Трофимов В.А., Киселева Р.Е., Власов А.П. Влияние излучения He-Ne-лазера на липиды тромбоцитов // Бюлл. эксперим. биологии. – 1999. – № 1. – С. 43–45. 46. Чичук Т.В., Страшкевич И.А., Клебанов Г.И. Свободнорадикальные механизмы стимулирующего действия НИЛИ // Вестник Рос. АМН. – 1999. – № 2. – С. 27–31. 47. Bessis M., Mohandas N. Deformability of normal, sharp-altered and pathological red blood сells. // 1975.- Vol.1, № 2.- С.315-329. 48. Henderson RM, Oberleithner H., Pushing, pulling, dragging, and vibrating renal epithelia by using atomic force microscopy //Am J Physiol Renal Physiol. 2000 May;278(5):F689701. 49. Letokhov V.S. Laser biology and medicine //Nature. 1985. Vol.316, №6026. P.325-328. 50. Nishikimi M. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenacine methosulfate and molecular oxygen. /M.Nishikimi, N.Appa, K.Yagi.// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1972.Vol.46.-P.849-854. 69