Дипстрик - ООО ГЕМ

28 PIERRE KÖENIG ST., TALPIOT INDUSTRIAL AREA
P.O.B 53231 JERUSALEM 91531 ISRAEL
PHONE: 972-2-6781861, FAX: 972-2-6781852
e-mail: info@novamed.co.il
ДИПСТРИК
Питательные среды на пластиковой подложке для бактериологического анализа мочи
Кат. №: BD-912
НАЗНАЧЕНИЕ
Дипстрик - устройство для бактериологического анализа мочи, обеспечивающий изоляцию,
идентификацию и количественный учет специфических бактерий в моче1. Устройство
предназначено для использования врачами-клиницистами и работниками бактериологических
лабораторий с целью ускоренной диагностики инфекций мочевыводящих путей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Дипстрик представляет собой пластиковую подложку, покрытую с обеих сторон слоем
питательной среды (хромогенный агар и Мак-Конки агар). Подложка вмонтирована в
завинчивающуюся крышку прозрачной пластиковой пробирки. К краю подложки прикреплено
пластиковое кольцо с зубцами (по три с каждой стороны). Концы зубцов погружают в
контейнер с образцом мочи приблизительно до половины их длины. При помещении подложки
в исходную пробирку кольцо с зубцами застревает в отверстии пробирки, осуществляя
штриховой посев на поверхности питательных сред. В серии полосок штрихов бактериальная
концентрация уменьшается, что обеспечивает рост изолированных колоний даже при высокой
концентрации бактерий в пробе.
Хромогенная питательная среда UriSelect 3 (Bio-Rad Laboratories Ltd., USA) представляет
собой неселективную питательную среду, применяемую для изоляции и количественного учета
микроорганизмов, вызывающих инфекции мочевыводящих путей. Состав среды обеспечивает
рост практически всех известных уропатогенных бактерий. Хромогенных субстраты, входящие
в состав среды, обеспечивают дифференцированную окраску колоний различных бактерий, что
обусловлено их специфической ферментативной активностью (ß-глюкуронидаза, ß-глюкозидаза,
триптофаназа и триптофандеаминаза). Таким образом удается окончательно идентифицировать
Escherichia coli, р. Proteus и стрептококков группы D и ориентировочно - других патогенов
мочевыводящих путей, в т.ч. рр. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter и Serratia, а также
стафилококков и стрептококков группы Б.
Питательная среда Мак-Конки представляет собой селективную среду, позволяющую
дифференцировать колиформные и лактозо-неферментирующие бактерии, при этом подавляя
рост грамположительных микроорганизмов3.
Современная рутинная лабораторная диагностика бактериологического исследования
мочи основана на двух подходах: традиционном посеве на питательные среды в чашки Петри4 и
методе дипслайда5. Дипстрик сочетает в себе комбинацию преимуществ обоих подходов. В
частности, Дипстрик позволяет осуществлять посев исследуемого материала непосредственно
на месте его забора, что исключает чрезмерный рост бактериальной микрофлоры во время
транспортировки образца из поликлиники в лабораторию. С помощью Дипстрика удается
быстро изолировать и идентифицировать патогенные бактерии, а также ориентировочно
определить их титр. Помимо этого, методика отличается простотой и экономически
эффективна.
Хромогенный агар
Формуляция среды является собственностью
производителя (UriSelect 3, Bio-Rad
Laboratories, USA).
Конечная pH 7.3  0.2 при 25C
Мак-Конки агар (содержание г /л) :
Пептон
20 г
Лактоза
10 г
Желчные соли No.3
1,5 г
Хлористый натрий
5г
Aгар
15 г
Нейтральный красный
0,03 г
Кристаллический фиолетовый
0,001 г
Конечная pH 7.2  0,2 при 25C
ПРИНЦИП
Устройство Дипстрика позволяет осуществлять дозированный штриховой посев одновременно
на две питательные среды. В результате с каждой стороны агара получают серию полосокштрихов с уменьшающейся бактериальной концентрацией, что позволяет изолировать колонии
даже при высоких концентрациях микроорганизмов в пробе. Вследствие этого количество
выросших колоний пропорционально количеству бактерий, исходно присутствующих в
образце6. После инкубации количество выросших колоний сравнивают с предоставляемой
производителем таблицей плотности бактериального роста для определения уровня
бактериоурии в исследуемом образце мочи.
КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
Пластиковая подложка со средами в пробирке.
Штатив для транспортировки и инкубации пробирок.
НЕОБХОДИМЫЕ АППАРАТУРА И РЕАКТИВЫ
Инкубатор-термостат (35  2C).
Реактив Ковача (поставляется по запросу).
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
1. Только для использования в целях диагностики In Vitro.
2. Посевы на Дипстрик проводят с соблюдением правил стерильной работы для работы.
3. Остатки проб и контаминированные материалы обезвреживают согласно правилам, принятым
в данном учреждении.
ХРАНЕНИЕ
1. Хранить Дипстрик при температуре 4-8C в течение 6 месяцев или при температуре 15- 25C не более 4-х месяцев.
2. Предохранять от прямых солнечных лучей света.
СРОК ГОДНОСТИ
1. Срок годности исчисляется 6 месяцами. Использовать до конца срока годности, указанного на
крышке пробирки и упаковке.
2.Не использовать Дипстрик, проявляющий одну из следующих характеристик: обесцвечивание,
обезвоживание или сморщивание поверхности агара, рост микроорганизмов перед
использованием или результаты роста, не соответствующие спецификации продукта, согласно
процедуре контроля качества.
СБОР ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Собрать среднюю порцию мочи в чистый контейнер. Рекомендуется произвести посев
материала не позднее 30 мин после сбора пробы. При отсутствии такой возможности пробу
хранят при 4С в закрытом контейнере не более двух часов.
ТЕХНИКА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА
Посев на Дипстрик можно проводить двумя способами – штриховым методом (с помощью
кольца с усиками) и погружением в мочу (метод дипслайда, если предполагается, что титр
бактерий в моче ниже 103 КOЕ/мл).
а. Метод штрихового посева (метод дипстрика).
1. Установить Дипстрик вертикально на ровной поверхности. Одной рукой удерживая
пробирку, отвинтить другой рукой крышку и быстрым движением вытащить подложку
(Рис.1).
Ограничения: не рекомендуется проводить посев, удерживая пробирку в руке.
2. Расположив лопатку строго вертикально, погрузить зубцы на несколько секунд
в контейнер с пробой мочи приблизительно до половины их длины. ( Рис.2).
Ограничения: не прикасаться к внутренним стерильным элементам подложки,
пластикового кольца и зубцов, а также к питательным средам!
3. Вставить зубцы лопатки в отверстие пробирки Дипстрика (Рис.3), а затем
шлепком ладони или ударом пальца с усилием втолкнуть лопатку в пробирку и
ввернуть крышку (Рис.4).
4. Отправить засеянный Дипстрик с прикрепленным к нему направлением на анализ в
лабораторию для последующей инкубации и дальнейшего исследования. Если
немедленная отправка засеянного Дипстрика в лабораторию невозможна, допускается
хранение Дипстрика в закрытом состоянии при комнатной температуре и в
2
5.
6.
защищенном от прямых солнечных лучей месте не более 48 ч или транспортировка при
температуре +2…+8 C в течение 24 ч.
Ограничения: не замораживать Дипстрик!
При поступлении в лабораторию, инкубировать Дипстрик в вертикальном положении
18-24 ч при 35  2C.
Ограничения: при помещении в инкубатор (термостат) необходимо открутить
крышку Дипстрика на полоборота!
Определить концентрацию микроорганизмов в миллилитре пробы, сравнивая плотность
проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к каждой упаковке
Дипстрика
и предоставляемой производителем таблицей (А)
плотности
бактериального роста при посеве штриховым методом.
Рис.1
Рис.2
Рис.3
Рис.4
Б. Метод погружения слайда в пробу (метод дипслайда).
1. Установить Дипстрик вертикально на ровной поверхности. Одной рукой удерживая
пробирку, отвинтить другой рукой крышку и быстрым движением вытащить подложку
(Рис.1).
Ограничения: не рекомендуется проводить посев, удерживая пробирку в руке.
2. Немедленно вставить зубцы подложки в отверстие пробирки Дипстрика, а затем
шлепком ладони или ударом пальца втолкнуть подложку в пробирку для того, чтобы
установить зубцы в верхнюю позицию на горловине пробирки.
3. Извлечь подложку вновь и удерживая строго вертикально, погрузить её на несколько
секунд в контейнер с пробой до полного покрытия агара.
Ограничения: не прикасаться руками к внутренним стерильным элементам подложки,
пластикового кольца и зубцов, а также к питательным средам!
4. Извлечь подложку из пробы, стряхнуть избыток пробы в контейнер, вставить
подложку в пробирку и ввернуть крышку. При ограниченном объёме образца
рекомендуется облить обе питательные среды до полного их покрытия.
5. Отправить засеянный Дипстрик с прикрепленным к нему направлением на анализ в
лабораторию для последующей инкубации и дальнейшего исследования. Если
немедленная отправка засеянного Дипстрика в лабораторию невозможна, допускается
хранение Дипстрика в закрытом состоянии при комнатной температуре и в
3
6.
7.
защищенном от прямых солнечных лучей месте не более 48 ч или транспортировка
при температуре +2…+8 C в течение 24 ч.
Ограничения: не замораживать Дипстрик!
При поступлении в лабораторию, инкубировать Дипстрик в вертикальном положении
18-24 ч при 35  2C.
Ограничения: при помещении в инкубатор (термостат) необходимо открутить
крышку Дипстрика на полоборота!
Определить концентрацию микроорганизмов в миллилитре пробы, сравнивая
плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к каждой
упаковке Дипстрика и предоставляемой производителем таблицей (Б) плотности
бактериального роста при посеве методом дипслайда.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По окончании инкубации исследовать Дипстрик на наличие бактериального роста, который
определяется присутствием колоний на поверхности питательных сред.
Так как образование каждой колонии обусловлено ростом одной бактериальной клетки и в связи
с тем, что концы зубцов захватывают стандартное количество мочи, количество выросших
колоний будет пропорционально общей бактериальной обсемененности образца, т.е.
приблизительной концентрации (титра) бактерий в миллилитре мочи (КOЕ/мл). О наличии
роста бактерий на средах Дипстрика можно судить путем прямого визуального просмотра через
стенку пробирки: при отсутствии видимого роста бактерий на Дипстрике нет необходимости
открывать приспособление. При наличии микробного роста необходимо извлечь устройство из
пробирки и сравнить количество выросших колоний на поверхности хромогенной питательной
среды с соответствующей таблицей плотности бактериального роста в зависимости от
использованной техники посева (см. ниже).
Количество колоний на хромогенной среде Дипстрика
Таблица подсчета микробной концентрации в образце мочи при посеве на Дипстрик
штриховым методом или методом погружения слайда
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Подсчет бактерий. При титре бактерий 105 КOЕ/мл результат считают положительным, 104
КOЕ/мл или при росте на средах более двух видов бактерий - отрицательным, 104-105 КOЕ/мл сомнительным, требующим повторного определения7,8. Пациенты с симптомами
воспалительных заболеваний мочевыводящих путей и титром бактерий в моче ниже 105
КOЕ/мл требуют дополнительного обследования с учетом имеющейся клинической
информации 9,10.
Такие факторы как антимикробная терапия, неправильный сбор мочи мочи и ее случайная
контаминация могут повлиять на результат подсчета бактерий.
4
Идентификация бактерий. Ориентировочная идентификация основана на типичной
морфологии и характерном цвете колоний на питательных средах Дипстрика (в первую очередь,
на хромогенном агаре).
Типичная морфология колоний на питательных средах Дипстрика.
Микроорганизм
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus faecalis
Candida albicans
Хромогенный агар
Пурпурно-красные или бесцветные с
пурпурно-красным центром
Крупные синие или сине-зеленые
Плоские, полупрозрачные, с
металлическим блеском
Оранжево-коричневые с коричневой
окраской среды
Оранжево-коричневые с коричневой
окраской среды
Белые
Мелкие сине-зеленые
Мелкие синие
Белые
МакКонки агар
Розово-красные
Розово-красные
Прозрачные
Полупрозрачные
Прозрачные
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Для окончательной идентификации изолятов необходимы биохимический анализ и определение
их чувствительности к антибиотикам.
1. Интерпретация результатов посева на хромогенный агар
(инкубация 18-24 ч при 35  2C)
Цвет колоний
Пурпурно-красные или
бесцветные с пурпурнокрасным центром
Тест на индол
( 1 капля реактива
Ковача)
ПОЛОЖИТ. ОТРИЦАТ.
E.coli
Синие или сине-зеленые
Микроскопическое
исследование
КОККИ
(Синие колонии
диаметром 0,51,0 мм)
Streptococci
Оранжево-коричневые с
коричневой окраской среды
Белые или
бесцветные
Тест на индол
(1 капля реактива Ковача)
БАЦИЛЛЫ
(синие или синезеленые колонии
диаметром 2,0-3,0
мм)
Klebsiella,
Enterobacter,
Citrobacter, Serratia
ОТРИЦАТ.
Proteus
mirabilis
ПОЛОЖИТ.
Proteus
vulgaris,
Providencia,
Morganella
Необходимость в использовании дополнительных методов идентификации
5
Таблица А. Плотность бактериального роста при посеве штриховым методом.
Кол-во колоний
10-24
25-50
>50
Титр бактерий в миллилитре мочи (КOЕ/мл)
104
105
106
107
<10
103
108
Таблица Б. Плотность пророста колоний методом погружения слайда в пробу.
Титр бактерий в миллилитре мочи (КOЕ/мл)
102
103
104
105
106
107
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Пользователи продукта, желающие произвести свой собственный анализ качества, могут
использовать следующую процедуру. Приготовить суспензии Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Streptococcus faecalis, Proteus mirabilis в титре 104 -105 КOЕ/мл на моче, не содержащей
микроорганизмов, полученной от здорового индивидуума. Подтвердить присутствие бактерий в
приготовленных суспензиях путем посева 10 мкл с помощью калиброванной
бактериологической петли на чашки Петри с питательными средами CLED и Мак-Конки.
Произвести посев приготовленных суспензий на Дипстрик в соответствии с рекомендациями
раздела «ТЕХНИКА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА». Морфология колоний бактерий должна
соответствовать данным, приведенным выше. Если Дипстрик не обеспечивает роста указанных
микроорганизмов, то он не соответствует требованиям качества и не подлежит использованию.
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
На основании результатов, полученных с помощью Дипстрика, можно поставить
предварительный диагноз. Окончательный диагноз ставят на основании не только
бактериологического исследования, но и клинической информации.
Дипстрик способен выявлять бактерии при их титре в моче не ниже 102 КOЕ/мл. Таблица
плотности бактериального роста позволяет определить титр бактерий с точностью до 1 lg.
Корреляция данных, полученных с использованием Дипстрика, и традиционного метода посева
на чашки Петри достигает 97%.
В случаях, когда предполагается, что титр бактерий в моче ниже выявляемого Дипстриком
(дети и т.д.) посев проводят методом погружения подложки в пробу или традиционным методом
на чашки Петри. Для постановки окончательного диагноза полученную информацию
сопоставляют с клиническими данными.
6
При исследовании проб мочи с высоким титром бактерий (107 КOЕ/мл и выше), часто отмечают
сплошной рост колоний. В подобных случаях также рекомендуется использовать стандартному
метод подсчета титра бактерий на чашках Петри с питательной средой.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Yagupsky, M.Rader, N.Peled 2000. Clinical evaluation of a novel chromogenic agar dipslide for
diagnosis of urinary tract infection. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19: 694-698.
The Oxoid Manual, 7th Edition. 1995. Oxoid Unipath, Basingstoke, England. 2-75: 2-76
The Oxoid Manual, 7th Edition. 1995. Oxoid Unipath, Basingstoke, England. 2-144:2-145.
Degre, M. 1970. Quantitative and semiquantitative methods for detection of bacteriuria. Translated from
Tidsskrift for Den norske laegeforening 90: 27-30.
McAllister, T.A. 1973. The day of the Dipslide. Nephron 11:123-133.
Mackey, J.P. and G.H. Sandys. 1965. Laboratory diagnosis of infections of the urinary tract in general
practice by means of a dip-inoculum transport medium. British Medical Journal. 2:1286-1288.
Kass, E.H. 1957. Bacteriuria and the diagnosis of infections of the urinary tract. Arch. Int. Med.
100:709-714.
Berger, S.A., B. Bogokowsky, and C. Block. 1990. Rapid screening of urine for bacteria and cells by
using a catalase reagent. J. Clin. Micro. 28:1066-1067.
Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti. 1987. Laboratory diagnosis of urinary tract infections. In
Cumitech 2A. American Society for Microbiology, Washington D.C.
10. Isenberg, H.D. and R.F. D’Amaato. 1985. Indigenous and pathogenic microorganisms of
humans, p. 30-31. In E.H. Lennette, A. Ballows, W.J. Hausler, Jr., and H.J. Shadomy, Manual
of Clinical Microbiology, Washington, D.C.
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор ООО «ГЕМ»
________________С.А. Гольдберг
«23» июня 2010 г.
7