АмплиСенс® Флороценоз / Бактериальный вагиноз-FL

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
по проведению исследования с использованием набора
реагентов для диагностики бактериального вагиноза
(определения концентрации ДНК Gardnerella vaginalis,
Atopobium vaginae, Lactobacillus spp. и общего количества
бактерий) в клиническом материале методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией
«АмплиСенс® Флороценоз / Бактериальный
вагиноз-FL»
АмплиСенс
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а
ОГЛАВЛЕНИЕ
НАЗНАЧЕНИЕ И ПРИНЦИП РАБОТЫ ............................................................................. 3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ....................................................................................... 4
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................................. 6
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ............................................................................................................ 7
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q
(QIAGEN, Германия) .......................................................................................................... 8
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРА LineGene 9660 (BIOER TECHNOLOGY CO.,LTD). ....................................... 12
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США) .................................................................. 12
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРОВ CFX96 и CFX384 (Bio-Rad, США)............................................................... 14
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРА «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия).......................................................... 18
РАСЧЕТ КОНЦЕНТРАЦИЙ ДНК И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................................................ 21
ВОЗМОЖНЫЕ ОШИБКИ ................................................................................................. 22
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.............................................................................................................. 24
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 2 из 32
НАЗНАЧЕНИЕ И ПРИНЦИП РАБОТЫ
Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании
набора реагентов «АмплиСенс® Флороценоз / Бактериальный вагиноз-FL» при
диагностике бактериального вагиноза. Бактериальный вагиноз – это клинический
симптомокомплекс, развивающийся в результате изменения экологии влагалища,
когда нормальная микрофлора, представленная главным образом лактобациллами
(Lactobacillus
spp.),
полностью
или
частично
замещается
преимущественно
анаэробной микрофлорой. В настоящее время описано более 200 микроорганизмов
(преимущественно анаэробных), обнаруживающихся при бактериальном вагинозе.
Однако данные исследований последних лет показывают, что ключевую роль в
развитии бактериального вагиноза играет Gardnerella vaginalis, так как:
– обнаруживается практически у всех пациенток с бактериальным вагинозом,
–
обладает
наибольшим
патогенным
потенциалом
из
других
описанных
ассоциантов,
– обладает выраженной способностью к адгезии,
– формирует биоплёнку,
– продуцирует факторы патогенности: цитолизин (вагинолизин), сиалидазу.
Другим значимым маркёром бактериального вагиноза является Atopobium
vaginae, микроорганизм, высокоспецифичный для данного синдрома. При этом
Atopobium vaginae имеет повышенную устойчивость к метронидазолу, поэтому его
обнаружение может потребовать изменения тактики терапии.
С учётом этого принцип диагностики бактериального вагиноза с использованием
набора реагентов «АмплиСенс® Флороценоз / Бактериальный вагиноз-FL» основан
на количественном определении и расчёте соотношений между ДНК Gardnerella
vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp. и общего количества бактерий
(Bacteria) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
в режиме «реального времени»
совместно с приборами для ПЦР в режиме «реального времени»:
– Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия);
– Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия);
– LineGene 9660 (BIOER TECHNOLOGY CO.,LTD);
– iCycler iQ, iQ5 (Bio-Rad, США);
– «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия);
– CFX96, CFX384 (Bio-Rad, США).
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 3 из 32
Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции
Название канала детекции для
Канал для флуорофора
разных моделей приборов1
канал для флуорофора FAM
FAM/Green
канал для флуорофора JOE
JOE/HEX/R6GYellow/Cy3
канал для флуорофора ROX
ROX/Orange/TxR
канал для флуорофора Cy5
Cy5/Red
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 1999/45/ЕС и
Регламентом (ЕС) 1272/2008 следующие реагенты подлежат маркировке как
основная опасность
ПДК макс разовая /
среднесменная, мг/м3
Символы опасности и
сигнальное слово вещества
согласно Регламенту (ЕС)
1272/2008
Наименование опасного
вещества в составе
реагента
Заявление об опасности,
дополнительная
информация, факторы
риска (R фразы)
Нет данных
Не требуется
Wng
Утилизация
Р403+
Р233,
Р403+
Р235,
Р405
H302,
H319,
H411,
R22,
R41,
R51/53
автоматический
контроль над
содержанием
вещества в воздухе
рабочей зоны
H319,
H226,
H336
Нет данных
класс опасности
R10,
R36,
R67,
S7, S16,
S24/25,
S26
Р210,
Р233,
Р240,
Р241,
Р242,
Р243,
Р261,
Р264,
Р271,
Р280
Хранение
Заявление об опасности,
дополнительная
информация
Символы опасности,
сигнальное слово согласно
Регламенту (ЕС) 1272/2008
Р303+
Р361+
Р353,
Р304+
Р340,
Р305+
Р351+
Р338,
Р337+
Р313,
Р312,
Р370+
Р378
Wng
H302,
H315,
H319,
R22,
R36/38
Класс опасности 3
Xi
-
Wng
Гуанидин
хлорид
Р501
Тритон
Х-100
Wng
Р501
H225,
H319,
H336,
R11,
R36,
R67
Изопропанол
Dgr
Пары
F
Р264,
Р270,
Р280
Р301+
Р312,
Р302+
Р352,
Р305+
Р351+
Р338,
Р337+
Р313,
Р321,
Р330,
Р332+
Р313,
Р362
по ГН 2.2.5.1313-032
50/10
Отмывочный
раствор
H302,
H315,
H319
Реакция
Xn
R22,
R36/38,
S22
Меры предосторожности
Предупреждение
Лизирующий
раствор
Факторы риска
и безопасности реагента
(R- и S-фразы)
Наименование
реагента
Символы и обозначения
опасности согласно
Директиве 1999/45/ЕС
содержащие опасные вещества:
Расшифровка обозначений:
F: Легковоспламеняющийся
Xn: Вредный для здоровья
Xi: Вызывающий раздражение.
Dgr: Опасно.
Wng: Предупреждение.
1
Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе
методических рекомендаций к набору реагентов.
2
Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе
рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76 «Система стандартов безопасности труда.
«Вредные вещества. Классификация. Общие требования безопасности».
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 4 из 32
Н225:Высокогорючая жидкость и пар.
H226: Горючая жидкость и пар.
H302: Вредно при проглатывании.
H315: Вызывает раздражение кожи.
H319: Вызывает серьезное раздражение глаз.
Н336: Может вызвать вялость или сонливость.
H411: Токсичен для водных организмов с долгосрочными последствиями.
R10: Огнеопасно.
R11: Очень огнеопасно.
R22: Опасно при проглатывании.
R36: Вызывает раздражение глаз.
R36/38: Раздражает глаза и кожу.
R41: Риск серьёзного повреждения глаз.
R51/53: Токсично для водных организмов, может вызывать продолжительные неблагоприятные изменения в
водной среде.
R67: Пары могут вызвать сонливость и головокружение.
S7: Хранить плотно закрытым.
S16: Хранить вдали от источников воспламенения. Не курить.
S22: Не вдыхать пыль.
S24/25: Избегать попадания на кожу и в глаза.
S26: В случае попадания в глаза немедленно промыть глаза большим количеством воды и обратиться за
медицинской помощью.
P210: Хранить вдали от источников тепла, горячих поверхностей, искр, открытого пламени и других источников
воспламенения. Не курить.
P233: Хранить в плотно закрытой таре.
P240: Заземлить / соединить контейнер и приемное оборудование.
P241: Использовать взрывобезопасное электрическое оборудование.
P242: Используйте только неискрящие инструменты.
P243: Принять меры предосторожности против статического разряда.
Р261: Избегать вдыхания паров.
P264: Вымойте руки после работы тщательно.
P270: Не ешьте, не пейте и не курить в процессе использования этого продукта.
P271: Используйте только на открытом воздухе или в хорошо проветриваемом помещении.
P280: Пользоваться защитными перчатками/ средствами защиты глаз.
P301 + 312: При проглатывании: обратиться к врачу при плохом самочувствии.
P302 + 352: ЕСЛИ НА КОЖУ: Промыть большим количеством воды.
P303 + Р361 + Р353: ПРИ ПОПАДАНИИ НА КОЖУ (или волосы): Немедленно снять всю загрязненную одежду.
Промыть кожу водой.
P304 + Р340: При вдыхании: Вынести пострадавшего на свежий воздух и обеспечить удобство дыхания.
P305 + 351 + 338: ПРИ ПОПАДАНИИ В ГЛАЗА: Осторожно промыть глаза водой в течение нескольких минут.
При наличии контактных линз, снять их и продолжить промывание водой.
P312: Обратиться к врачу при плохом самочувствии.
P321: Специальные меры (см. острая токсичность при попадании на кожу в этом документе).
P330: Прополоскать рот.
P332 + 313: В случае раздражения кожи: Обратиться за советом врача.
P337 + 313: Если раздражение глаз не проходит обратиться за медицинской консультацией.
P362: Немедленно снять зараженную одежду.
P370 + Р378: В случае пожара: Использовать огнетушитель для тушения.
P403 + Р233: Хранить в хорошо проветривающемся месте. Держать контейнер плотно закрытым.
P403 + Р235: Хранить в хорошо проветривающемся месте. Хранить в прохладном месте.
P405: Хранить под замком.
P501: Утилизировать содержимое в соответствии с национальными правилами САНПИН 2.1.7.2790-10
"САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОБРАЩЕНИЮ С МЕДИЦИНСКИМИ ОТХОДАМИ".
ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать
правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от
30.08.91.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 5 из 32
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом
эпителиальных
для
клеток
исследования
боковых
стенок
служит
вагинальный
влагалища,
мазок
отделяемое
(соскоб
влагалища).
Получение материала следует производить с помощью универсального зонда или
зонда-тампона на пластиковой основе в пробирку объемом 2 мл с «Транспортной
средой с муколитиком (ТСМ)» или «ТС-ЭДЭМ». Погрузить рабочую часть зонда в
вагинальное отделяемое задненижнего свода влагалища и, вращая зонд, провести
по поверхности эпителия, максимально полно набирая материал на зонд.
Перенести зонд в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть зонда,
содержащую исследуемый материал, обломить в области насечки и оставить в
пробирке с транспортной средой. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская
зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.
Недостоверные результаты могут быть получены в следующих случаях:

материал взят в недостаточном количестве или взятие материала произведено
некачественно;

материал получен из другого локуса (например, цервикального канала);

женщине проводится антибактериальная терапия. В этом случае рекомендуется
провести повторное исследование не ранее, чем через две недели после
окончания терапии;

материал получен от девочек, находящихся в препубертатном периоде (до
наступления менархе) или от женщин, находящихся в менопаузе;

для исследования предоставлен материал от мужчины.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 6 из 32
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
Для экстракции ДНК рекомендуется использование набора реагентов «ДНК-СорбАМ».
Процедура выделения ДНК
1. В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести
по 10 мкл ВКО-FL в случае исследования образцов с помощью наборов
реагентов, в которых ВКО-FL используется в качестве экзогенного контроля.
2. Ресуспендировать сорбент и внести в каждую пробирку по 20 мкл сорбента
универсального, после чего внести по 300 мкл лизирующего раствора, используя
наконечники с фильтром.
Примечание
–
Если
количество
обрабатываемых
клинических
образцов
составляет более 50 за рабочую смену, рекомендуется добавить весь объем
сорбента и ВКО во флакон с лизирующим раствором (2 мл сорбента универсального
и 1 мл ВКО на 30 мл лизирующего раствора). Полученную суспензию тщательно
перемешать и внести по 330 мкл в подготовленные пробирки. Допускается хранение
смеси не более 2 сут при комнатной температуре. Перед применением суспензию
тщательно перемешать.
3. Внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой пробы
отдельный наконечник с фильтром. В пробирку отрицательного контроля
экстракции (В–) внести 100 мкл транспортной среды с муколитиком (ТСМ). В
пробирку
положительного
контроля
экстракции
(BV–)
вносится
90
мкл
транспортной среды с муколитиком (ТСМ) и 10 мкл ПКО BV–; в пробирку
положительного контроля экстракции (BV+) вносится 90 мкл транспортной среды
с муколитиком (ТСМ)» и 10 мкл ПКО BV+.
4. Пробирки плотно закрыть, содержимое тщательно перемешать на вортексе и
инкубировать 5 мин при 65 °С в термостате. После окончания инкубации
содержимое повторно перемешать на вортексе и оставить при комнатной
температуре на 2 мин.
5. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение
30 с. Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость в колбу-ловушку с
помощью вакуумного отсасывателя, используя для каждой пробы отдельный
наконечник без фильтра.
6. Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 7 из 32
7. Повторить п. 5.
8. Поместить пробирки в термостат с температурой 65 С на 5-10 мин для
подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты.
9. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, используя
наконечник с фильтром. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования
сорбента. Поместить в термостат с температурой 65 °С на 5 мин.
10. Центрифугировать
пробирки
при
12
тыс
об/мин
в течение
1
мин
на
микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы
готовы к постановке ПЦР.
Полученные пробы можно хранить в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С
или в течение года при температуре не выше минус 16 °С. При повторном
исследовании проб содержимое пробирок необходимо перемешать на вортексе и
повторить п.10.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q
(QIAGEN, Германия)
Для работы с прибором Rotor-Gene 3000 следует использовать программу RotorGene версии 6, с прибором Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene Q – программу Rotor-Gene
6000 версии 1.7 (build 67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и
программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора RotorGene
3000/для
англоязычной
версии
программы
Rotor-Gene
6000/для
русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000.
Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно
инструкции к набору реагентов. Для проведения амплификации рекомендуется
использование тонкостенных пробирок для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой
(например, Axygen, США) или пробирок для ПЦР к Rotor-Gene, объемом 0,1 мл в
стрипах по 4 шт. с крышками (например, Corbett Research, Австралия; QIAGEN,
Германия) (детекция через дно пробирки).
Программирование амплификатора:
1. Поместить пробирки в ротор амплификатора так, чтобы первая пробирка попала в
лунку
1;
установить
ротор
в
прибор,
закрыть
крышку
(ячейки
ротора
пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования
положения проб в амплификаторе). Пробирки должны быть установлены в лунки
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 8 из 32
ротора в следующем порядке: вначале исследуемые образцы, затем контрольные
образцы (BV-) и (BV+), затем отрицательные контроли, затем ДНК-калибраторы –
FC1, FC2.
ВНИМАНИЕ! Если ротор прибора заполнен не полностью, то его следует
уравновесить. Для этого следует заполнить незанятые места пустыми
пробирками (не используйте пробирки от предыдущих экспериментов).
Лунка 1 обязательно должна быть заполнена какой-либо исследуемой
пробиркой (не пустой).
2. Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.
3. В
открывшемся
окне
выбрать
шаблон
запуска
эксперимента
Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis
probes/Флуоресцентные зонды (TaqMan). Нажать кнопку New/Новый.
4. В открывшемся окне выбрать ротор на 36 лунок 36-Well Rotor/36-луночный
ротор (или на 72 лунки 72-Well Rotor/72-луночный ротор) и отметить, что Вы
не используете пробирки с круглыми крышками (Rotor-Gene 3000)/закреплено
фиксирующее кольцо (Rotor-Gene 6000). Нажать кнопку Next/Далее.
5. В открывшемся окне задать оператора и выбрать объем реакционной смеси:
Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Установить галочку напротив
функции 15 µl oil layer volume/15 μL объем масла/воска. Нажать кнопку
Next/Далее.
6. В открывшемся окне необходимо задать температурный профиль эксперимента.
Для этого нажать кнопку Edit profile/Редактор профиля и задать следующие
параметры амплификации.
Программа амплификации «АмплиСенс-1» для приборов роторного типа
Цикл
Hold/
Удерж.
темп-ры
1 Cycling /
Циклирование
2 Cycling /
Циклирование
Температура, °С
Время
Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
95
15 мин
–
1
95
60
72
95
5с
20 с
15 с
5с
–
–
–
–
FAM/Green,
JOE/Yellow
ROX/Orange
Cy5/Red
60
72
20 с
5
40
15 с
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 9 из 32
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения
тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК
возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции. Поэтому можно
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов.
Примечание – Канал Cy5.5/Crimson включается при необходимости, если
проводятся тесты в формате «мультипрайм», для которых используется этот канал.
7. После того как выбран температурный профиль эксперимента, нажать кнопку
OK/Да.
8. В окне New Run Wizard/Мастер Нового Теста нажать кнопку Calibrate/Gain
Optimisation…/Опт.уровня сигн.
а) осуществлять измерение флуоресценции по каналам FAM/Green, JOE/Yellow,
ROX/Orange,
Cy5/Red
(нажать
кнопку
Calibrate
Acquiring/Optimise
Acquiring/Опт. Детек-мых);
б) установить калибровки всех каналов, указать в графе Min Reading/Миним.
Сигнал 5, Max Reading/Максим. Сигнал 10. Отметить галочкой Perform
Calibration
Before
1st
Acquisition/Perform
Optimisation
Before
1st
Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции. Нажать
кнопку Close/Закрыть.
9. Нажать кнопку Next/Далее, запустить амплификацию кнопкой Start run/Старт.
10. Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
11. Внести данные в таблицу образцов (открывается автоматически после запуска
амплификации). В колонке Name/Имя указать названия/номера исследуемых
клинических и контрольных образцов.
ВНИМАНИЕ! Названия контрольных образцов даются согласно инструкции к
программе в формате Microsoft Exсel.
12. Напротив
всех
исследуемых
клинических
образцов
установить
тип
Unknown/Образец. Для ячеек, соответствующих пустым пробиркам, установить
тип None/Пусто.
ВНИМАНИЕ! При установке типа None/Пусто данные образца анализироваться
не будут.
Анализ результатов:
Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем
каналам – анализируются с помощью программного обеспечения используемого
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 10 из 32
прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени».
Анализ результатов амплификации по каналу FAM/Green:
1. Проверить, чтобы в таблице образцов были обозначены калибраторы и заданы их
концентрации.
2. Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа
Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. FAM/Cycling A.
Green, Show/Показать.
3. Отменить автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold/Порог.
4. В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны
быть
активированы
кнопки
Dynamic
tube/Динамич.фон,
Slope
Correct/Коррект.уклона.
5. В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить уровень
пороговой линии Threshold/Порог = 0,05 (см. табл. 1).
Таблица 1
Канал
флуоресценции
Детектируемый
параметр
ДНК Gardnerella
vaginalis
ДНК Atopobium
vaginae
ДНК Lactobacillus
spp.
ДНК Bacteria
FAM/Green
JOE/Yellow
ROX/Orange
Cy5/Red
NTC Threshold/
Порог Фона
Threshold/
Порог
Slope Correct /
Коррект.
уклона
10-20 %
0,05
включена
10-20 %
0,05
включена
5-10 %
0,05
включена
10-30 %
0,05
включена
6. Выбрать параметр More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов и
установить значение порога отрицательных проб (NTC Threshold/Порог Фона –
ПФ (NTC)) равным 10-20 % (см. табл. 1).
7. В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты)
появятся значения Ct для ДНК Gardnerella vaginalis в каждом исследуемом
образце).
Анализ результатов реакции амплификации по каналам JOE/Yellow, ROX/Orange,
Cy5/Red:
1. Провести анализ результатов по каналам JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red
аналогично пунктам 1-6 анализа канала FAM/Green, используя соответствующие
значения из табл. 1.
Учет результатов
Результат
ПЦР-исследования
считается
достоверным,
если
получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и амплификации ДНК в
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 11 из 32
соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. инструкцию)
и граничными значениями, указанными во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Учет результатов тестирования исследуемых образцов проводят в соответствии с
инструкцией и вкладышем к набору реагентов.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРА LineGene 9660 (BIOER TECHNOLOGY CO.,LTD).
Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно
инструкции к набору реагентов. Для проведения амплификации рекомендуется
использование тонкостенных пробирок для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой или
плоской крышкой (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США) или пробирок
объемом 0,2 мл в стрипах по 8 шт. с прозрачными крышками (например, Axygen, Inc.
(«Эксиджен, Инк»), США) (детекция через дно пробирки).
Запуск прибора и анализ результатов проводить при помощи программного
обеспечения FRT Manager.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США)
Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно
инструкции к набору реагентов. Для проведения амплификации рекомендуется
использование тонкостенных пробирок для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой
или
плоской оптически прозрачной крышкой (детекция через крышку пробирки).
1. Включить прибор и блок питания оптической части прибора.
ВНИМАНИЕ! Лампа должна быть прогрета до запуска эксперимента не менее
15 мин.
2. Открыть программу iCycler/iQ5.
3. Поместить пробирки или стрипы в реакционный модуль амплификатора и
запрограммировать прибор.
ВНИМАНИЕ! Следить за тем, чтобы на стенках пробирок не оставалось капель,
так как падение капли в процессе амплификации может привести к сбою
сигнала и усложнить анализ результатов. Не переворачивайте стрипы при
установке в прибор.
Программирование
амплификатора
осуществлять
согласно
инструкции
производителя прибора:
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 12 из 32
1. Войти в режим создания нового протокола амплификации, нажав кнопку Create
new в модуле Workshop.
2. В открывшемся окне задать соответствующие параметры амплификации (см.
табл. 2). Дать название новому протоколу и сохранить его.
Таблица 2
Программа амплификации «АмплиСенс-1» для приборов планшетного типа
Цикл
1
2
3
Температура,
°С
95
95
60
72
95
Измерение
флуоресценции
–
–
–
–
–
FAM, JOE/HEX,
ROX, Cy5
–
Время
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
60
30 с
72
15 с
Кол-во
циклов
1
5
40
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения
тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК
возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции. Поэтому можно
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов.
3. Создать новую плашку образцов (Plate Setup). Задать схему расположения
пробирок в планшете.
4. В открывшемся окне все образцы обозначить как Unknown. .Для всех образцов
задать измерение флуоресценции по четырем каналам JOE/HEX, FAM, ROX и
Cy5.
5. Задать объем реакции Sample Volume – 25 мкл.
6. Дать название схеме расположения пробирок и сохранить ее.
7. Нажать кнопку Run. В открывшемся окне отметить Use Persistant Well Factors,
нажать кнопку Begin Run и сохранить эксперимент.
Анализ результатов:
Полученные результаты анализируются с помощью программного обеспечения
прибора iCycler iQ5. Результаты интерпретируются на основании наличия (или
отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы
с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет
наличие (или отсутствие) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе
таблицы
результатов.
В
соответствии
со
значениями
Ct
калибраторов
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 13 из 32
автоматически
происходит
построение
калибровочного
графика
и
расчет
концентраций ДНК Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp.
1. Запустить программу и открыть сохраненный файл. Для этого в модуле Workshop
нажать Data file и выбрать файл данных. Перейти в режим Data Analysis.
2. Просматривать данные отдельно по каждому каналу.
3. Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой
линии. Пороговая линия должна пересекать только S-образные (сигмообразные)
кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей и не пересекать
базовую линию. В случае если это не так, необходимо установить вручную уровень
пороговой линии для каждого канала. Для этого нужно нажать кнопку Log View
(переключение в логарифмический вид) и установить уровень пороговой линии
(левой кнопкой мыши) на таком уровне, где кривые флуоресценции носят
линейный характер и отсутствует пересечение с кривыми отрицательных
образцов.
Как
правило,
пороговая
линия
устанавливается
на
уровне,
соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного
для образца FC2 в последнем цикле амплификации».
4. Для анализа результатов нажать кнопку PCR Quant и кнопку Results (расположена
под кнопками с названиями флуорофоров).
Учет результатов
Результат
ПЦР-исследования
считается
достоверным,
если
получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и амплификации ДНК в
соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. инструкцию)
и граничными значениями, указанными во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Учет результатов тестирования исследуемых образцов проводят в соответствии с
инструкцией и вкладышем к набору реагентов.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРОВ CFX96 и CFX384 (Bio-Rad, США)
Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно
инструкции к набору реагентов. Для проведения амплификации рекомендуется
использование тонкостенных пробирок для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой или
плоской оптически прозрачной крышкой (детекция через крышку пробирки).
1. Включить прибор и запустить программу Bio-Rad CFX Manager.
2. В стартовом окне программы выбрать пункт Create a new Run. Назначить для
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 14 из 32
выполнения универсальную программу амплификации и детекции «АмплиСенс1»:
Программа «АмплиСенс-1» для приборов планшетного типа
Цикл
Температура, °С
Время
1
2
95
95
60
72
95
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
3
60
30 с
72
15 с
Измерение
флуоресценции
Кол-во
циклов
1
5
FAM, HEX, ROX и
Cy5
40
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения
тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК
возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции. Поэтому можно
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов.
Примечание – Канал Quasar705 включается при необходимости, если проводятся
тесты в формате «мультипрайм», для которых используется этот канал.
Для этого выбрать или создать эту программу в модуле Experiment Setup в окне
Protocol Editor. Объем реакции Sample Volume задать равным 25 мкл.
ВНИМАНИЕ! Для каждого шага этапов циклирования, нажав на кнопку Step Options,
задать скорость нагревания/охлаждения Ramp Rate 2,5 °С/sec (см. рис. 1).
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 15 из 32
Рисунок 1
3. В
следующем
расположение
окне
(модуль
образцов
в
Plate)
задать
реакционном
схему
блоке
и
планшета
назначить
–
указать
детекцию
флуоресценции по пяти каналам FAM, HEX, ROX и Cy5 для всех образцов. Для
этого с помощью кнопки Select Fluorophores… выбрать (отметить галочками)
нужные флуорофоры в списке. Для всех проб в поле Sample type выбрать
Unknown. Указать идентификаторы образцов в поле Sample name. Сохранить
файл схемы планшета, нажать кнопку OK.
4. Открыть крышку прибора с помощью кнопки Open Lid. Поставить реакционные
пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с заданной схемой планшета.
Закрыть крышку прибора кнопкой Close Lid.
5. Запустить выполнение выбранной программы «АмплиСенс-1» с заданной схемой
планшета, нажав кнопку Start Run.
6. После окончания выполнения программы амплификации и детекции можно
приступить к анализу результатов.
Анализ результатов:
Полученные результаты анализируются с помощью программного обеспечения
прибора CFX96. Результаты интерпретируются на основании наличия (или
отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы
с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет
наличие (или отсутствие) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе
таблицы
результатов.
автоматически
В
происходит
соответствии
построение
со
значениями
калибровочного
Ct
калибраторов
графика
и
расчет
концентраций ДНК Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 16 из 32
1. Запустить программу и открыть сохраненный файл. Для этого выбрать в меню File,
затем Open и Data file и выбрать файл данных.
2. Проанализировать данные отдельно по каждому каналу, выключив все остальные
каналы (сняв галочку в боксе с обозначением канала под основным окном с
графиками Amplification).
3. Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой
линии. Пороговая линия должна пересекать только S-образные (сигмообразные)
кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей и не
пересекать базовую линию. В случае если это не так, необходимо установить
вручную уровень пороговой линии для каждого канала. Для этого нужно поставить
галочку в окне Log Scale (переключение в логарифмический вид) и установить
уровень пороговой линии (левой кнопкой мыши) на таком уровне, где кривые
флуоресценции носят линейный характер и отсутствует пересечение с кривыми
отрицательных образцов. Как правило, пороговая линия устанавливается на
уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции,
полученного для образца FC2 в последнем цикле амплификации».
Область
линейности
кривых
флюоресценции
Пороговая
линия
4. В
таблице
результатов
появятся
значения
пороговых
циклов
Ct
для
анализируемого канала.
Учет результатов
Результат
ПЦР-исследования
считается
достоверным,
если
получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и амплификации ДНК в
соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. инструкцию)
и граничными значениями, указанными во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 17 из 32
Учет результатов тестирования исследуемых образцов проводят в соответствии с
инструкцией и вкладышем к набору реагентов.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ
ПРИБОРА «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия)
Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно
инструкции к набору реагентов. Для проведения амплификации рекомендуется
использование тонкостенных пробирок для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой или
плоской оптически прозрачной крышкой (детекция через крышку пробирки).
Программирование
амплификатора
осуществлять
согласно
инструкции
производителя прибора:
1. Включить прибор и запустить программу RealTime_PCR v.7.3. В стартовом окне
необходимо выбрать существующего оператора или добавить нового оператора и
выбрать режим Работа с прибором.
2. В диалоговом окне Список приборов выбрать необходимый прибор и нажать
кнопку Подключить.
3. В меню Тест выбрать команду Создать новый тест, ввести название нового
теста – BV и нажать кнопку ОК. В появившемся окне Тест задать следующие
параметры:
 Тип – качественный;
 Метод – Пороговый (Ct);
 Пробирки – отметить галочкой образец (включая клинические образцы,
положительные контроли этапа экстракции ДНК (BV–), (BV+), ОК);
 Контроли – положительные-4 (калибраторы FC1,FC2); отрицательные – 1 (К–);
 Объем рабочей смеси в пробирке – 25 мкл;
 Флуорофоры – Fam, Hex, Rox, Cy5 – специфика.
4.
Задать программу амплификации с применением команды Создать новую
программу/редактировать программу (см. табл. 3):
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 18 из 32
Таблица 3
Программа амплификации «АмплиСенс-1» для приборов планшетного типа
Цикл
1
2
3
Температура,
°С
95
95
60
72
95
Измерение
флуоресценции
–
–
–
–
–
Fam, Hex, Rox,
Cy5
–
Время
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
60
30 с
72
15 с
Кол-во
циклов
1
5
40
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения
тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК
возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции. Поэтому можно
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов.
Примечание – Канал Cy5.5 включается при необходимости, если проводятся
тесты в формате «мультипрайм», для которых используются эти каналы.
5. В окне Тест нажать кнопку ОК.
6. Выбрать вкладку Протокол. Нажать кнопку Добавить тест и в появившемся
окне выбрать название BV, указать количество образцов и нажать ОК.
7. Присвоить имена образцам в графе Идентификатор таблицы Протокол
проведения ПЦР. Указать расположение пробирок в рабочем блоке прибора в
окне Свободное заполнение. Нажать кнопку Применить.
8. Указать Объем рабочей смеси – 25 мкл и нажать кнопку Запуск программы.
9. Выбрать закладку Запуск программы амплификации, проверить параметры
теста. Нажать кнопку Открыть блок и установить пробирки в строгом
соответствии с указанным расположением пробирок в рабочем блоке прибора.
ВНИМАНИЕ! Необходимо следить за тем, чтобы на стенках пробирок не
оставалось капель. Не переворачивайте стрипы при установке в прибор.
10.Последовательно нажать кнопки Закрыть блок и Запуск программы.
Сохранить
эксперимент.
Поставить
галочку
Выключить
прибор
по
завершении амплификации.
Анализ результатов:
Полученные результаты анализируются с помощью программного обеспечения
прибора «ДТ-96». Результаты интерпретируются на основании наличия (или
отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 19 из 32
с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет
наличие (или отсутствие) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе
таблицы
результатов.
автоматически
В
происходит
соответствии
построение
со
значениями
калибровочного
Ct
калибраторов
графика
и
расчет
концентраций ДНК Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp.
1. Перейти в режим Просмотр архива и открыть сохраненный файл данных.
2. Указать в выпадающем списке Тип анализа: Сt (Cp) для всех каналов.
3. Указать в выпадающем списке Метод: Пороговый Ct.
4. Нажать кнопку Изменить параметры анализа
и выставить:
 Критерий положительного результата ПЦР – 90 %,
 Величина Threshold – 10 StD на участке линейного фитирования
 Критерии
достоверности
результата:
поставить
галочку,
нижняя
граница/порог положительного результата – 5 %.
5. Отключить Фитирование (сглаживание) данных при помощи кнопки Ф
(отжать кнопку).
6. Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой
линии. При необходимости поочередно для каналов Fam, Hex, Rox, Cy5
установить уровень пороговой линии (левой кнопкой мыши) на таком уровне, где
кривые флуоресценции носят линейный характер.
Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой
линии. Пороговая линия должна пересекать только S-образные (сигмообразные)
кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей и не
пересекать базовую линию. В случае если это не так, необходимо установить
вручную уровень пороговой линии для каждого канала. Для этого поставить галочку
в окне Log_Y (переключение в логарифмический вид) и установить уровень
пороговой
линии
(левой
кнопкой
мыши) на
таком
уровне,
где
кривые
флуоресценции носят линейный характер и отсутствует пересечение с кривыми
отрицательных образцов. Как правило, пороговая линия устанавливается на
уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции,
полученного для образца FC2 в последнем цикле амплификации».
Для дальнейшей работы с данными скопировать результаты значений Ct для
всех каналов в таблицу Excel из таблицы со значениями программного
обеспечения прибора. Для формирования отчета в виде файла Word нажать
кнопку Отчет по результатам анализа
. Далее выбрать галочками
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 20 из 32
параметры, необходимые для отображения в отчете, нажать кнопку Сохранить
отчет как… (рекомендуется сохранять отчет в папку Мои документы),
выбрать
формат
«*MS
Word/Acrobat
Reader/JPEG/HTML»
и
папку
для
сохранения, присвоить имя файлу и нажать кнопку Сохранить.
Учет результатов
Результат
ПЦР-исследования
считается
достоверным,
если
получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и амплификации ДНК в
соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. инструкцию)
и граничными значениями, указанными во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Учет результатов тестирования исследуемых образцов проводят в соответствии с
инструкцией и вкладышем к набору реагентов.
РАСЧЕТ КОНЦЕНТРАЦИЙ ДНК И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ
К каждому набору реагентов прилагается вкладыш, в котором указаны
концентрации
ДНК-калибраторов,
необходимых
для
расчета
концентраций
исследуемых проб, а также характеристики контрольных образцов.
Анализ результатов производится с помощью программы в формате Microsoft
Excel согласно прилагаемой к ней инструкции. Алгоритм расчета, заложенный в
программу, смотрите в Приложении 1.
Для получения результатов необходимо:

внести в расчетную таблицу данные из вкладыша к набору реагентов;

заполнить графы в разделе Информация о постановке;

скопировать названия образцов и значения Ct для всех каналов;

нажать
кнопку
Рассчитать,
после
чего
в
соответствующих
графах
автоматически появятся:
1) значения коэффициентов соотношений концентраций (КС1, КС2 и КС3),
2) статус образцов,
3) заключения по результатам исследования каждого образца.
Далее полученные результаты и заключения необходимо перенести в форму
выдачи результатов, утверждённую в лаборатории. При выдаче результатов
необходимо
параметра.
указывать
Для
референсные
общего
количества
значения
ДНК
для
Bacteria
каждого
исследуемого
референсное
значение
составляет ≥ 106 копий/мл. Меньшее количество ДНК Bacteria в образце может быть
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 21 из 32
получено
вследствие
неадекватного
получения
материала,
исследования
материала от девочек до наступления менархе или женщин, находящихся в
менопаузе,
применения
антибактериальных
препаратов/антисептиков
или
спринцевания в течение 2-х недель до получения материала для анализа и т.д. У
здоровой женщины количество ДНК Lactobacillus spp. должно быть практически
равным концентрации
ДНК Bacteria, т.к. нормальная вагинальная микрофлора
представлена, главным образом, лактобактериями. Gardnerella vaginalis и Atopobium
vaginae могут присутствовать на слизистой влагалища в невысоких концентрациях,
не превышающих концентрацию ДНК Lactobacillus spp.
ВОЗМОЖНЫЕ ОШИБКИ
1. Появление любого значения Calc Conc более 5 копий на реакцию (500 копий/мл)
в таблице
результатов для отрицательного
контрольного
образца
этапа
экстракции (ОК) и/или этапа ПЦР (К–) на каналах для флуорофоров FAM/Green
и/или JOE/HEX/Yellow свидетельствует о наличии контаминации реактивов или
образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются
недействительными.
Требуется
повторить
анализ
всех
проб,
в
которых
обнаружена ДНК Gardnerella vaginalis и/или Atopobium vaginae, начиная с этапа
экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации.
2. Значения копий на реакцию в калибраторах FC1, FC2 более чем на 30 %
отличаются от заданных – необходимо проверить порядок размещения пробирок
в приборе. Для приборов роторного типа лунка 1 обязательно должна быть
заполнена какой-либо исследуемой пробиркой (не пустой).
3. Коэффициент корреляции R2 менее 0,9 – сбой калибровки. Необходимо
проверить правильность задания калибраторов и исправить неточности. Если это
не помогает, переставить ПЦР для всех проб и калибраторов.
4. Отсутствие значений Ct в таблице результатов для положительного контроля
экстракции (BV-) по каналам для флуорофоров ROX/Orange или Cy5/Red.
Результаты анализа по всем образцам считаются недействительными. Необходимо
повторить анализ всех образцов с этапа ПЦР.
5. Отсутствие значений Ct в таблице результатов для положительного контроля
экстракции (BV+) по одному из каналов
JOE/HEX/Yellow,
ROX/Orange
или
Cy5/Red
для флуорофоров: FAM/Green,
или
по
нескольким
каналам.
Результаты анализа по всем образцам считаются недействительными. Необходимо
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 22 из 32
повторить анализ всех образцов с этапа ПЦР.
6. В случае отсутствия сигнала по каналу для флуорофора Cy5 или в случае, когда
значение Конц. расч. по каналу для флуорофора Cy5 для исследуемого образца
менее 105 копий/мл, результат анализа образца считается недостоверным.
Рекомендуется
переставить
ПЦР
для
данного
образца,
в
случае
воспроизводимости результата рекомендуется повторное взятие материала.
7. Если сигнал по каналу для флуорофора Cy5 отсутствует (нет значения Ct) или
когда для исследуемого образца количество Lactobacillus spp. превышает общее
количество бактерий более чем на 0,5Lg, результат анализа образца считается
невалидным, такая проба подлежит повторному тестированию, начиная с этапа
экстракции
ДНК.
В
случае
воспроизводимости
результата
рекомендуется
повторное взятие материала.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 23 из 32
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Программа в формате Microsoft Exсel для получения заключений рассчитывает
коэффициенты соотношений концентраций КС1, КС2 и КС3:
Коэффициент соотношения КС1 отражает соотношение концентраций Lactobacillus
spp. (Lac) и анаэробных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis+Atopobium vaginae
(Gv+Av)),
равен
разнице
логарифмов
концентраций
ДНК
указанных
микроорганизмов:
KC1 = lg [ДНК Lac] – lg [ДНК Gv+Av].
Коэффициент соотношения КС2 отражает соотношение концентраций общего
количества бактерий (Bac) и Lactobacillus spp. (Lac), равен разнице логарифмов
концентраций ДНК указанных микроорганизмов:
KC2 = lg [ДНК Bac] – lg [ДНК Lac].
Коэффициент соотношения КС3 отражает соотношение концентраций
количества
бактерий
(Bac)
и
анаэробных
микроорганизмов
общего
(Gardnerella
vaginalis+Atopobium vaginae (GA)), равен разнице логарифмов концентраций ДНК
указанных микроорганизмов:
KC3 = lg [ДНК Bac] – lg [ДНК Gv+Av].
На основании КС1, КС2 и КС3 автоматически выдаются следующие заключения:
 «Соотношения
концентраций
ДНК
микроорганизмов
соответствуют
бактериальному вагинозу» (при КС1<0,5),
 «На
основании
соотношений
концентраций
ДНК
микроорганизмов
бактериальный вагиноз не установлен» (при КС1>1),
 «Соотношения
концентраций
ДНК
микроорганизмов
соответствуют
промежуточному состоянию микрофлоры» (при 0,5≤КС1≤1),
 «Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют дисбиозу
неуточненной этиологии» (при КС2>1 и КС3>2 и любых значениях КС1),

«Снижение степени бактериальной обсеменённости» (при КС1>1 и общем
количестве ДНК бактерий менее 106 копий/мл и более 105 копий/мл),
 «Количество бактерий недостаточно для анализа» (при общем количестве
ДНК бактерий менее 105 копий/мл).
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 24 из 32
Примеры выдачи результатов:
1. Количество G.vaginalis и/или A.vaginae практически равно или превышает
количество
Lactobacillus
spp.
–
«Соотношения
концентраций
ДНК
микроорганизмов соответствуют бактериальному вагинозу».
Параметры
Результат
ДНК Bacteria - общее количество бактерий
(копий/мл)
3*107
Референсные
значения
≥ 106
Не менее
3*10
ДНК Lactobacillus spp. (копий/мл)
концентрации ДНК
Bacteria
Не превышает
2*107
ДНК Gardnerella vaginalis (копий/мл)
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Не превышает
3*106
ДНК Atopobium vaginae (копий/мл)
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Соотношения концентраций ДНК
микроорганизмов соответствуют
Заключение по результатам исследования
бактериальному вагинозу
Примечание – При лечении стоит учитывать, что Atopobium vaginae проявляет
повышенную устойчивость к метронидазолу.*
* Данное примечание принципиально при выдаче результатов, т.к. обнаружение Atopobium
vaginae в клиническом материале может потребовать изменения тактики терапии
выявленного состояния.
4
2. G.vaginalis и/или A.vaginae отсутствуют или их количество существенно меньше
количества
Lactobacillus
spp.
–
«На
основании
соотношений
ДНК
микроорганизмов бактериальный вагиноз не установлен».
Параметры
ДНК Bacteria - общее количество бактерий
(копий/мл)
ДНК Lactobacillus spp. (копий/мл)
ДНК Gardnerella vaginalis (копий/мл)
ДНК Atopobium vaginae (копий/мл)
Заключение по результатам исследования
Результат
Референсные
значения
1*107
≥ 106
Не менее
концентрации ДНК
Bacteria
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
На основании соотношений ДНК
микроорганизмов бактериальный
вагиноз не установлен
1*107
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 25 из 32
3. Количество G.vaginalis и/или A.vaginae близко к количеству Lactobacillus spp., но
не превышает пограничного значения – «Соотношения концентраций ДНК
микроорганизмов соответствуют промежуточному состоянию микрофлоры».
Параметры
ДНК Bacteria - общее количество бактерий
(копий/мл)
Результат
Референсные
значения
8*106
≥ 106
Не менее
концентрации ДНК
Bacteria
Не превышает
2*106
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Не превышает
2*104
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Соотношения концентраций ДНК
микроорганизмов соответствуют
промежуточному состоянию
микрофлоры
8*106
ДНК Lactobacillus spp. (копий/мл)
ДНК Gardnerella vaginalis (копий/мл)
ДНК Atopobium vaginae (копий/мл)
Заключение по результатам исследования
4. Количество Lactobacillus spp. снижено относительно общего количества бактерий,
при этом G.vaginalis и/или A.vaginae отсутствуют или их количество существенно
меньше общего количества бактерий – «Соотношения концентраций ДНК
микроорганизмов соответствуют дисбиозу неуточненной этиологии».
Параметры
ДНК Bacteria - общее количество бактерий
(копий/мл)
Результат
Референсные
значения
1*107
≥ 106
Не менее
концентрации ДНК
Bacteria
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Соотношения концентраций ДНК
микроорганизмов соответствуют
дисбиозу неуточненной этиологии
4*103
ДНК Lactobacillus spp. (копий/мл)
ДНК Gardnerella vaginalis (копий/мл)
ДНК Atopobium vaginae (копий/мл)
Заключение по результатам исследования
5. G.vaginalis и/или A.vaginae отсутствуют или их количество существенно меньше
количества
Lactobacillus
spp.,
общее
количество
ДНК
бактерий
менее
106 копий/мл и более 105 копий/мл – «Снижение степени бактериальной
обсеменённости».
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 26 из 32
Параметры
ДНК Bacteria - общее количество бактерий
(копий/мл)
ДНК Lactobacillus spp. (копий/мл)
ДНК Gardnerella vaginalis (копий/мл)
ДНК Atopobium vaginae (копий/мл)
Заключение по результатам исследования
Результат
Референсные
значения
9*105
≥ 106
Не менее
концентрации ДНК
Bacteria
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Снижение степени бактериальной
обсеменённости
8*105
6. Общее количество ДНК бактерий менее 105 копий/мл – «Количество бактерий
недостаточно для анализа».
Параметры
ДНК Bacteria - общее количество бактерий
(копий/мл)
ДНК Lactobacillus spp. (копий/мл)
ДНК Gardnerella vaginalis (копий/мл)
ДНК Atopobium vaginae (копий/мл)
Заключение по результатам исследования
Результат
Референсные
значения
7*104
≥ 106
Не менее
концентрации
ДНК Bacteria
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Не превышает
Не обнаружено
концентрацию
ДНК Lactobacillus
Количество бактерий недостаточно для
анализа
1*103
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 27 из 32
Лист вносимых изменений
Редакция
01.02.11
LA
02.04.11
LA
11.05.11
RT
25.07.11
RT
20.09.11
VV
26.09.11
VV
22.02.12
LA
Место внесения
изменений
Суть вносимых изменений
Уточнены результаты автоматической интерпретации
п. Учет результатов,
для нормоценоза, мезоценоза, дисбиоза неясного
пп. Расчет
генеза и дисбиоза анаэробного (бактериального
концентраций ДНК
вагиноза)
Каталожный номер R-B74-100-FT(RG,iQ,Mx) изменен
Нижний колонтитул
на R-B74-100-FT(RG)
Удалено «Москва 2010»
титульная страница
«Вариант» заменен на «формат»
Нижний колонтитул
Титульная
Добавлен символ, обозначающий «изделие для in
страница
vitro диагностики»
«Кат. №» и «дата изменения» заменены на
Нижний колонтитул
соответствующие символы
Добавлены символ, наименование и адрес
производителя
Титульная страница Значок «Изделие для in vitro диагностики»
перемещен в правый нижний угол страницы
Удален каталожный номер с титульной страницы
Добавлен раздел «Меры предосторожности» с
По тексту
таблицей реагентов, содержащих опасные вещества
Добавлены приборы Rotor-Gene Q (Qiagen,
Назначение
Германия); iCycler iQ, iQ5 (Bio-Rad, США); «ДТ-96»
(«ДНК-Технология», Россия).
Проведение
амплификации и
анализ результатов
при помощи
изменены установки калибровки всех каналов в
приборов Rotorграфе Min Reading/Миним. Сигнал с 3 на 5, в графе
Gene 3000/6000
Max Reading/Максим. Сигнал с 8 на 10.
(Corbett Research,
Австралия) и RotorGene Q (Qiagen,
Германия)
добавлены разделы «Проведение амплификации и
анализ результатов при помощи приборов iCycler iQ и
По тексту
iQ5 (Bio-Rad, США)» и «Проведение амплификации и
анализ результатов при помощи прибора «ДТ-96»
(«ДНК-Технология», Россия)»
Удалена фраза: «калибраторы должны находиться в
ячейках, соответствующих названию Standard в
Учет результатов
таблице образцов, концентрация образцов должна
п. 2
соответствовать концентрации, указанной во
вкладыше»
Учет результатов
Удалено: «в окне Standard Curve для коэффициента
п. 3
корреляции»
Удалено: «сбой ПКО BV-», добавлено: «Результаты
Учет результатов
анализа по всем образцам считаются
п. 4
недействительными. Необходимо повторить анализ
всех образцов с этапа ПЦР»
Удалено: «сбой ПКО BV+», добавлено: «Результаты
Учет результатов
анализа по всем образцам считаются
п. 5
недействительными. Необходимо повторить анализ
всех образцов с этапа ПЦР»
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 28 из 32
Редакция
Место внесения
изменений
Учет результатов
п. 6
Учет результатов
п. 7
Учет результатов
Учет результатов
29.07.12
IvI
15.08.12
IvI
29.01.13
VN
Суть вносимых изменений
«Образцы, в которых количество Lactobacillus spp.
менее 1000000 копий/мл и общее количество
бактерий менее 1000000 копий/мл оцениваются как
недостоверные и требуют повторного тестирования,
начиная с этапа выделения ДНК» заменено на «В
случае отсутствия сигнала по каналау Cy5/Red или в
случае, когда значение Конц. расч. по каналу
Cy5/Red для исследуемого образца менее 10000
копий на реакцию результат анализа образца
считается недостоверным. Рекомендуется
переставить ПЦР для данного образца»
«Общее количество бактерий в исследуемых пробах
не должно быть меньше количества Lactobacillus
spp. Если общее количество бактерий меньше
количества Lactobacillus spp. (отсутствие сигнала по
каналу Cy5/Red (нет значения Ct) или когда значение
Calc Conc для исследуемого образца по каналу
Cy5/Red менее 10000 копий на реакцию)» заменено
на «Если сигнал по каналу Cy5/Red отсутствует (нет
значения Ct) или когда для исследуемого образца
количество Lactobacillus spp превышает общее
количество бактерий более чем на 0,5Lg»
указаны наименования расчетов, на основании
которых выдается результат
Указаны два способа интерпретации результатов
исследования
Интерпретация
Уточнена интерпретация результатов, добавлены
результатов. Способ
примеры результатов
1
Замена символа «Только для исследовательских
Титульная страница целей» на символ «Изделие для in vitro
диагностики»
Титульная
Добавлены подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ
страница
Эпидемиологии В.И. Покровского
Изменено название института на краткое ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Титульная
После заголовка добавлено «по проведению
исследования клинического материала с
страница
использованием набора реагентов»
Добавлено «действуют с « »___________2012 г.»
Назначение и
Добавлен принцип работы и описание
принцип работы
бактериального вагиноза
Добавлены новые разделы: «Материал для
исследования», «Экстракция ДНК», «Проведение
амплификации и анализ результатов при помощи
приборов CFX96 и CFX384 (Bio-Rad, США)» и
По тексту
«Приложение 1»
Интерпретация и примеры результатов вынесены в
Приложение 1
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 29 из 32
Редакция
Место внесения
изменений
Проведение
амплификации и
анализ
результатов при
помощи приборов
Rotor-Gene
3000/6000 (Corbett
Research,
Австралия) и RotorGene Q (QIAGEN,
Германия)
Суть вносимых изменений
Изменена информация о рекомендуемых к
использованию пробирках для приборов
планшетного и роторного типа
Разделы дополнены и изменены
Проведение
амплификации и
анализ
результатов при
помощи приборов
iCycler iQ и iQ5
(Bio-Rad, США)
Приложение 1
Изменены формулировки и примеры
автоматических результатов
04.02.13
VN
Титульная
страница
Название документа приведено в соответствие с
действующей инструкцией
28.02.13
VN
Приложение 1
Удалено название программного обеспечения
Титульный лист
Символ
По тексту
Стандартизированы названия контролей (BV+) и (BV-)
Приложение 1
spp. заменено на spp.
Раздел
«Назначение»
Добавлена таблица «Соответствие названий
флуорофоров и каналов детекции»
Раздел
«Проведение
амплификации и
анализ
результатов при
помощи приборов
CFX96 и CFX384
(Bio-Rad, США)»,
подраздел «Анализ
результатов»
Cq заменено на Ct
26.03.13
РЕ
31.05.13
FN
По тексту
06.09.13
GA
Титульный лист
заменен на
Названия каналов детекции для каждой модели
приборов приведены в соответствие с протоколом
№ 20 от 26.02.13
Добавлена отсканированная печать и подпись Врио
директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 30 из 32
Редакция
20.04.15
ME
19.05.15
ME
05.06.15
ChA
Место внесения
изменений
Меры
предосторожности
Суть вносимых изменений
Откорректирована таблица с опасными реагентами
Изменен реагент, использующийся в качестве
отрицательного контроля экстракции. Добавлены
положительные контроли экстракции
Для отрицательного контрольного образца этапа
Возможные ошибки экстракции (ОК) и/или этапа ПЦР (К–) добавлен
пересчет в копии/мл
Назначение и
В список приборов добавлен LineGene 9660 (BIOER
принцип работы
TECHNOLOGY CO.,LTD)
После программы амплификации добавлена фраза
«ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является
Проведение
универсальной для проведения тестов с помощью
амплификации и

анализ результатов комплектов реагентов «АмплиСенс » для выявления
ДНК возбудителей ИППП и др. инфекций органов
при помощи
приборов роторного репродукции. Поэтому можно одновременно
проводить в одном приборе любое сочетание
и планшетного
тестов.»
типов
Добавлен подраздел «Учет результатов»
Экстракция ДНК
Проведение
амплификации и
анализ результатов
при помощи
приборов RotorGene 3000/6000
(Corbett Research,
Австралия) и RotorGene Q (QIAGEN,
Германия)
Проведение
амплификации,
анализ и учет
результатов при
помощи прибора
LineGene 9660
(BIOER
TECHNOLOGY
CO.,LTD).
Проведение
амплификации и
анализ результатов
при помощи
приборов CFX96 и
CFX384 (Bio-Rad,
США)
Проведение
амплификации и
анализ результатов
при помощи
прибора «ДТ-96»
(«ДНК-Технология»,
Россия)
Добавлено примечание о включении канала
Cy5.5/Crimson в случае необходимости
Раздел добавлен
Добавлено примечание о включении канала
Quasar705в случае необходимости
Откорректирован подраздел о прогаммировании
амплификатора, а также добавлено примечание о
включении канала Cy5.5 в случае необходимости.
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 31 из 32
Редакция
Место внесения
изменений
Проведение
амплификации и
анализ результатов
при помощи
приборов роторного
и планшетного
типов
Меры
предосторожности
03.11.15
ChA
16.12.15
ChA
Проведение
амплификации,
анализ и учет
результатов при
помощи прибора
LineGene 9660
(BIOER
TECHNOLOGY
CO.,LTD).
Проведение
амплификации,
анализ и учет
результатов при
помощи прибора
LineGene 9660
(BIOER
TECHNOLOGY
CO.,LTD)
Суть вносимых изменений
Подраздел «Анализ результатов» дополнен в
соответствии с шаблоном
Раздел актуализирован в соответствии с шаблоном
Добавлена фраза «При постановке на приборе
LineGene 9660 использовать ПО FRT-manager.»
Удалено ручное программирование прибора, изменена
фраза с «При постановке на приборе LineGene 9660
использовать ПО FRT-manager» на «Запуск прибора
и анализ результатов проводить при помощи
программного обеспечения FRT Manager»
Формат FRT Форма 2 REF R-B74-100-FT(RG) / VER 16.12.15 / стр. 32 из 32