Кустова Н.А. Лабораторный практикум по микробиологии. М
advertisement
Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Московский государственный университет инженерной экологии Кустова Н.А. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ Москва 2005 Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». Практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен вопросам общей микробиологии. В работах этого раздела изучаются морфологическое строение разных групп микроорганизмов, методы микроскопического исследования, техника микробиологических посевов, методы стерилизации и методы количественного учета микроорганизмов. Второй раздел содержит работы по использованию микробов в биотехнологии для получения различных веществ – органических кислот, спиртов, антибиотиков, ферментов. В работах третьего раздела изучаются вопросы экологической микробиологии. Часть работ показывает роль микроорганизмов в глобальных биогеохимических циклах, а остальные посвящены проблемам биотехнологической охраны окружающей среды. Каждая тема содержит теоретическое введение и практическую часть, в которой даются описание применяемых методов, порядок выполнения работы, содержание отчета по работе, а также контрольные вопросы. 2 ПРЕДИСЛОВИЕ Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов 3 курса специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов 4 курса кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по специализации «Биотехнологическая защита окружающей среды» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». В основу Лабораторного практикума положены «Методические указания к лабораторным работам» под ред. П.И.Николаева, которые использовались на кафедре «Процессы и аппараты микробиологических производств» с момента создания кафедры. В преподавание микробиологии при обучении инженеров для микробиологической промышленности огромный вклад внесла с.н.с., к.б.н. Н.В.Поморцева. Методические указания были подготовлены под ее руководством научными сотрудниками кафедры: М.А.Боруздиной, И.Е.Ломовой, Н.А.Кустовой, Т.А.Махоткиной и К.А.Соловьевой. Изменение учебной программы в соответствии с новой специальностью инженер-эколог вызвало необходимость расширить курс микробиологии и дополнить его задачами по биотехнологическим методам защиты окружающей среды. Лабораторный практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен общей микробиологии: морфологии микроорганизмов, методам ее изучения, технике микробиологических посевов, методам количественного учета микроорганизмов. Второй раздел охватывает некоторые примеры использования микробов в промышленности. Третий раздел освещает вопросы экологии микроорганизмов, их роль в глобальных циклах элементов, а также в биотехнологических способах охраны окружающей среды. В составлении данного практикума приняли участие аспирант кафедры Н.В.Зябрева и с.н.с. Е.С.Горшина. Автор выражает глубокую благодарность доц. каф. микробиологии МГУ Н.Н. Колотиловой за ценные замечания и советы, а также с.н.с. П.П.Макееву за помощь в оформлении текста и иллюстративного материала. 3 ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Правила работы и поведения в лаборатории Правила работы и поведения в микробиологической лаборатории имеют много общего с правилами работы в химических лабораториях, но имеют свою специфику. Микробиолог в большинстве случаев работает с чистыми культурами микроорганизмов, т.е. с микроорганизмами какого-либо одного рода, вида и штамма. Поскольку на всех окружающих предметах и в воздухе находятся посторонние микробы, применяются специальные методы работы, чтобы избежать заражения исследуемой культуры микроорганизма или самого человека. Для этого питательные среды, посуду, инструменты стерилизуют, лабораторию и рабочие места содержат в чистоте, соблюдают определенные правила при работе с микробами. В лаборатории не должно быть никаких лишних предметов. Следует регулярно проводить влажную уборку. Различные поверхности лабораторных помещений периодически подвергают дезинфекции. Дезинфекция – это обеззараживание, т.е. уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Для этого используют 0,5–3%-ный раствор хлорамина или 3–5%-ный раствор фенола (карболовая кислота). Рабочий стол следует дезинфицировать 70%-ным раствором этилового или изопропилового спирта. Дезинфекция воздуха достигается простым проветриванием (не менее 30–60 мин). Более эффективный способ дезинфекции воздуха – облучение помещения ультрафиолетовыми лучами с помощью бактерицидных ламп. Особенно часто ультрафиолетовое облучение применяется для стерилизации бокса. Бокс – специальное небольшое помещение для пересевов чистых культур, количественного учета микроорганизмов на чашках Петри и некоторых других работ, требующих особо чистых условий. Перед работой бокс облучают в течение 40–60 мин. Стол протирают спиртом, стены и пол периодически моют. Вместо бокса лаборатории могут оснащаться ламинарными шкафами (рис. 1), которые также стерилизуются бактерицидными лампами. При 4 работе включают вентилятор для создания ламинарного потока стерильного воздуха, пропущенного через бактерицидные фильтры. Основное оборудование микробиологической лаборатории включает в себя: микроскопы, термостаты для выращивания микроорганизмов, аппаратуру для стерилизации (автоклав и сушильный шкаф), центрифуги, дистиллятор, холодильник для хранения музейных культур микроорганизмов, шкафы для размещения стеклянной посуды и реактивов, необходимые приборы (фотоэлектроколориметры, рН-метры и т.д.). За каждым студентом закрепляют рабочее место, на котором размещают: микроскоп, закрываемый чехлом, бактериологическую петлю, предметные и покровные стекла, стерильные пипетки, спиртовую горелку, полоски фильтровальной бумаги, маркер по стеклу, сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На столе не должно быть ничего, не относящегося непосредственно к выполнению работы. На лабораторных занятиях по микробиологии следует соблюдать правила техники безопасности. 5 Краткие сведения по технике безопасности в лаборатории В микробиологической практике широко применяется посуда из химического стекла. Надо соблюдать осторожность при работе с ней. Осколки разбитой посуды тщательно убирать. При анализах часто применяются крепкие растворы щелочей и кислот. Работать с ними нужно с большой осторожностью, так как эти вещества вредно действуют на кожу рук и одежду. Если кислота случайно пролилась, ее надо засыпать большим количеством соды и затем несколько раз промыть водой. Пролившуюся щелочь надо тщательно вытереть, а предметы, на которые она попала, обработать слабым раствором уксусной кислоты. При попадании кислот или щелочей на кожу человека их необходимо тотчас же смыть большим количеством воды. В микробиологической лаборатории имеют дело с живыми микроорганизмами. Основные работы ведутся стерильно, т.е. работают с одной культурой микроорганизмов, которая не должна заражаться посторонними микробами. Для предупреждения заражения посевов применяют специальные методы стерилизации. Кроме того, важно соблюдать чистоту в лаборатории. Посуда с культурами микроорганизмов не должна оставаться открытой. Биомасса микроорганизмов, если она не нужна для анализов, выбрасывается только после стерилизации в автоклаве. Посевы микроорганизмов производят у пламени газовой или спиртовой горелки, поэтому следует остерегаться ожогов, и прежде всего аккуратно подобрать длинные волосы. Горелка должна гореть только тогда, когда это необходимо. Если при посеве случайно загорится ватная пробка, спиртовка или бумага, огонь гасят полотенцем. При более крупных очагах загорания пользуются огнетушителями. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели и т.д. помещают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. Студенты должны постоянно помнить, что они имеют дело с микроорганизмами, которые далеко не всегда могут быть безопасными, особенно в работах по выделению микробов из объектов окружающей среды. Поэтому в конце занятия студенты должны привести в порядок рабочее место и вымыть руки с мылом. 6 При неисправности электрической сети нужно выключить электроприборы и их централизованное электропитание. РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ТЕМА 1. Морфология микроорганизмов и методы ее изучения Микробиология изучает организмы, которые имеют микроскопические размеры, т.е. измеряются микрометрами или долями микрометров. Один микрометр равен 10-6 метра и сокращенно обозначается мкм. Микроорганизмы характеризуются интенсивным обменом веществ и способны осуществлять разнообразные химические превращения. Разные микроорганизмы отличаются и по своему строению и по тем биохимическим процессам, которые они осуществляют. Объединение их в одну группу вызвано не только малыми размерами, но и общностью методов культивирования и исследования. Для изучения строения микроорганизмов, их внешнего вида, формы, размеров, т.е. для изучения морфологии микроорганизмов, пользуются микроскопом. Наименьшие частицы, которые удается увидеть в современные световые микроскопы, имеют величину более 1/3 длины волны света, т.е. не менее 0,2 мкм, что связано с использованием видимой части света, имеющего длину волны от 0,4 мкм до 0,7 мкм. Устройство микроскопа На рис. 2 показан внешний вид распространенного в научноисследовательской и учебной практике микроскопа МБИ-3. Рассматриваемый объект – препарат помещается на предметный столик и освещается снизу лучами света, которые выходят из осветителя, падают на зеркало, затем проходят через конденсор и фокусируется на препарате. Основные части микроскопа: окуляры, тубус, револьверная насадка с объективами, предметный столик с зажимами для препаратов, конденсор, макрои микровинты для наведения на резкость и, наконец, штатив, в который все это вмонтировано. 7 Перед микроскопированием проверяют правильность установки освещения (по Келеру). Для этого, перемещая патрон осветителя с лампочкой, добиваются четкого изображения нити 8 накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают накал нити лампы. И, наконец, изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все поле зрения. Микроскоп представляет собой оптическую систему с двумя ступенями увеличения: первое увеличение осуществляется объективом, второе – окуляром. Объектив дает увеличенное обратное изображение предмета, которое рассматривается в окуляр. В результате глаз наблюдателя видит сильно увеличенное обратное изображение предмета. Поэтому движение объекта налево воспринимается глазом как движение направо. Общее увеличение микроскопа, т.е. увеличение, при котором рассматривают объект под микроскопом, определяется как произведение увеличений объектива и окуляра. Объективы дают увеличение в 10, 40, 60, 90 раз, окуляры – в 10–20 раз. Если применяется бинокулярная насадка, она дает дополнительное увеличение. На рис. 3 показана принципиальная схема оптической системы микроскопа. Объектив О образует в плоскости Z действительное перевернутое изображение А΄ объекта А. Даваемое объективом изображение увеличивается далее при помощи окуляра Е. Так как Z находится в фокусе окуляра Е, наблюдатель видит увеличенное мнимое изображение А΄ в плоскости Х, которая обычно располагается в 25 см от глаза, т.е. на расстоянии, наиболее удобном для ближнего зрения. Следует иметь в виду, что подобное представление о механизме образования изображения является в высшей степени упрощенным, ибо оно игнорирует влияние дифракции и ряда других факторов. В работе с микроскопом студенты изучают препараты микробов с увеличением в 600–1200 раз. Наибольшее увеличение, которое дает оптический микроскоп, – 3000 раз. Наименьший размер частиц, которые можно рассматривать в таком микроскопе, 9 равен 0,2 мкм, что обусловлено длиной волны видимой части спектра. Морфология микроорганизмов Мир микроорганизмов включает в себя огромное разнообразие форм, которые не составляют единую систематическую группу. Основными объектами микробиологии являются бактерии, но кроме них микробиологи изучают еще дрожжи, грибы, микроскопические водоросли и некоторые простейшие. На рис. 4 представлены основные группы микроорганизмов (за исключением простейших); соотношения их размеров сохранены. Все живые организмы, кроме вирусов, имеют клеточное строение. В соответствии со своей клеточной организацией они делятся на прокариотные и эукариотные. 10 Главное отличие эукариот от прокариот состоит в наличии вторичных полостей, отделяющих ядро и другие клеточные структуры от цитоплазмы. Именно появление вторичных полостей позволило совершить скачок в эволюции всего живого мира за счет увеличения внутренней поверхности мембран эукариот. Это дало возможность в соответствии с увеличением скорости диффузии, одновременно осуществлять большее количество протекающих на мембранах биохимических реакций. Прокариотами являются бактерии, в том числе актиномицеты и цианобактерии. Эукариотами – все растения, животные, дрожжи, грибы, простейшие. Среди прокариот в настоящее время выделяется группа архебактерий, которая включает в себя метаногенов, экстремальных галофилов, (живущих в очень соленой воде) экстремально термофильных бактерий, окисляющих и восстанавливающих молекулярную серу, а также термоплазм, лишенных клеточной стенки. Новое разделение было сделано на основе сравнения нуклеотидных последовательностей в малых отрезках рибосомных РНК. 11 Архебактерии отличаются по составу клеточных стенок, липидов и некоторых других физиолого-биохимических особенностей (например, у них другой механизм фиксации СО2). Таким образом, в строении клеточной организации в настоящее время выделяют 3 группы: архебактерии, (по новой номенклатуре – Archaea, археи), эубактерии (по новой номенклатуре – Bacteria, бактерии), и эукариоты (по новой номенклатуре – Eukarya). Работа 1. Микроскопическое изучение бактерий Морфология бактерий Теоретическое введение Эта группа микроорганизмов наиболее многочисленна, широко распространена в природе и имеет большое промышленное значение. Для наименования микроорганизмов используют бинарную номенклатуру, как в зоологии и ботанике. В соответствии с этой номенклатурой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских слов. Первое слово означает род, а второе – вид. Родовое название всегда пишется с заглавной буквы, а видовое – со строчной. Большинство бактерий – одноклеточные организмы сферической, палочковидной или извитой формы. Среди бактерий есть небольшое количество нитчатых форм. Бактерии очень малы, диаметр клетки шаровидных бактерий составляет 1–2 мкм. Размножаются бактерии делением (при благоприятных условиях деление происходит через 20–80 мин). Некоторые бактерии подвижны. Способность двигаться связана с наличием особых органелл – жгутиков. Наиболее просты по форме шаровидные бактерии (кокки). Они встречаются или в виде единичных шариков, или шариков, сцепленных между собой. По расположению клеток после деления шаровидные бактерии подразделяют на монококки (единичные кокки), тетракокки (объединены по 4), сарцины (объединены по 8), стафилококки (гроздья), стрептококки (цепочки кокков). 12 Палочковидные бактерии представляют собой самую многочисленную группу бактерий. Они имеют цилиндрическую форму клеток с округлыми или заостренными концами и в сильной степени различаются по отношению длины к ширине. Они могут располагаться одиночно либо образуют короткие или длинные цепочки. Палочки могут быть различной длины, обычно несколько мкм, а ширина около 1 мкм. Некоторые палочковидные бактерии образуют внутри клетки особые тельца – споры. Каждая клетка образует одну спору, которая служит для перенесения неблагоприятных условий. Спора при соответствующих условиях (температура, влажность, питательные вещества) прорастает, превращаясь в палочку. Стойкость бактериальных спор превосходит стойкость любых живых организмов. Например, спора сенной палочки Bacillus subtilis выдерживает температуру 100 ОС в течение 3 ч. Такая устойчивость спор затрудняет борьбу с инфекциями. Извитые микроорганизмы различаются по степени изогнутости клеток и по числу витков. Они разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. Если у бактерии один неполный завиток спирали, то она называется вибрионом. Если бактерия имеет несколько спиралевидных завитков, то ее называют спириллой, а микробов, имеющих извитую форму с большим количеством мелких завитков, называют спирохетами. Нитчатые бактерии представляют собой нити, состоящие из цилиндрических или дисковидных клеток. Нити некоторых видов заключены в слизистую оболочку, которая может быть пропитана гидроокисью железа или солями марганца. Процесс аккумуляции тяжелых металлов из растворов происходит в клетках некоторых железобактерий. Крупные нитчатые бактерии р. Beggiatoa откладывают в клетках серу. Нитчатые бактерии обитают обычно в морских и пресных водах, встречаются также в разлагающихся органических остатках, в кишечнике животных. К цианобактериям относится большая группа организмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез. Пигменты клеток цианобактерий помимо хлорофилла а (зеленого цвета) содержат фикоцианин – пигмент 13 синего цвета. По этому признаку раньше их называли синезелеными водорослями. Большинство из них – многоклеточные организмы, представляющие собой длинные, чаще всего неразвлетвленные нити (трихомы). Клетки в нитях объединены общей наружной стенкой. Иногда образуют слизистые скопления – «маты». Размножение осуществляется путем распада нити на отдельные участки. Некоторые виды передвигаются скольжением (р. Spirulina). Актиномицеты (ветвящиеся бактерии, лучистые грибки) – большая группа прокариотных микроорганизмов, которая образует тонкие ветвящиеся нити длиной в несколько мм и диаметром 0,5 – 1,5 мкм. Они являются своеобразной группой микроорганизмов, которая в морфологическом отношении имеет сходство с плесневыми грибами (рис. 5). Клетки значительной части представителей этой группы способны ветвиться, что является характерным признаком грибов. Однако длина ветвящихся нитей актиномицетов достигает нескольких миллиметров, тогда как длина мицелия грибов – нескольких сантиметров. Гифы грибов обычно в несколько раз толще нитей актиномицетов. По морфологии и развитию актиномицеты разделяются на высшие и низшие формы. К высшим относятся организмы с хорошо 14 развитым септированным или несептированным мицелием и особыми органами спороношения. Споры образуются в виде цепочек на специальных спороносящих гифах воздушного мицелия. Строение органов спороношения различно у разных видов: длинные или короткие, прямые или спиралевидные (рис. 6). По наличию мицелия и строению органов спороношения высшие актиномицеты напоминают мицелиальные грибы. Некоторые актиномицеты имеют мицелий только в молодой культуре, который с возрастом распадается с образованием палочковидных и кокковидных клеток. Низшие формы актиномицетов не имеют истинного мицелия. Способность к образованию мицелия выражена у них лишь в тенденции клеток к ветвлению. К низшим актиномицетам относятся, например, виды рода Mycobacterium, которые обладают свойством менять форму клеток с возрастом культуры (рис. 7). Это свойство называется плеоморфизм. Среди высших актиномицетов ведущее место по численности в природных средах занимают виды рода Streptomyces. Актиномицеты играют большую роль в процессах 15 почвообразования и создания плодородия почв. Актиномицеты разрушают сложные органические соединения (целлюлозу, гумус, хитин, лигнин и др.), недоступные многим другим микроорганизмам. Почти все виды рода Streptomyces образуют специфические продукты жизнедеятельности, обладающие антибиотическими свойствами. Некоторые виды являются возбудителями заболеваний растений, животных и человека. Помимо основных форм бактерий существуют cтебельковые и почкующиеся бактерии, несущие выросты, получившие название простек. (рис.8) 16 Функции простек различны. У некоторых бактерий они служат для размножения, у других – для прикрепления клетки к субстрату. 17 Практическая часть Цель работы – изучить морфологию представителей бактерий Порядок выполнения работы Выполняя первую работу, студенты учатся обращению с микроскопом, просматривают готовые препараты представителей бактерий, затем самостоятельно готовят препараты живых бактерий и микроскопируют их. Сначала студенты микроскопируют готовые фиксированные препараты бактерий. Фиксированные препараты представляют собой микроорганизмы, суспендированные в водной среде, высушенные на предметном стекле и окрашенные анилиновыми красителями. Препараты некоторых живых микроорганизмов студенты готовят самостоятельно. Для этого на чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды, в которую прокаленной и остуженной бактериологической петлей вносится небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешивается и накрывается покровным стеклом. Избыток воды снимается фильтровальной бумагой. Препарат помещается на предметный столик и закрепляется зажимами. Сначала, глядя в окуляр и вращая макровинт, добиваются резкого изображения объекта при малом увеличении с объективом 10х. Затем переводят микроскоп на большое увеличение с объективом 40х. Вращение винтов надо производить с осторожностью, так как при слишком резком опускании можно раздавить линзы объективом. При микроскопировании следует иметь в виду, что микроскоп, особенно при больших увеличениях, не захватывает всей глубины объекта, поэтому при постепенном опускании тубуса с помощью микровинта объект виден сначала сверху, а потом – в оптическом разрезе. 1. Просмотр фиксированных препаратов микроорганизмов. Lactococcus lactis – возбудитель молочнокислого брожения; форма клеток шаровидная – кокки; клетки соединены в цепочки. Используется для получения молочнокислых продуктов. 18 Lactobacillus acidophilum – палочковидные бактерии; возбудитель молочнокислого брожения. Используется для получения молочнокислых продуктов. Acetobacter aceti – палочковидные бактерии, окисляющие этанол в уксусную кислоту. Используется для получения пищевого уксуса. Streptomyces griseus – актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика стрептомицина. Saccacharopolyspora erythrae – актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика эритромицина. 2. Просмотр живых препаратов Bacillus subtillis – форма клеток в виде тонких подвижных палочек; образует споры; продуцент ферментных препаратов. Spirulina platensis – цианобактерия; форма клеток в виде одиночной нити, состоящей из цилиндрических клеток, плотно прилегающих друг к другу; обладает скользящим движением. Применяется в виде пищевой добавки. Содержание отчета 1. Латинское название микроорганизма. 2. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 3. Использование изучаемых бактерий в промышленности. Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. Опишите устройство микроскопа. Как определить увеличение микроскопа? Какова форма клеток бактерий. Назовите особенности морфологии актиномицетов. Каких представителей бактерий Вы знаете и каково их практическое значение? Работа 2. Морфология эукариотных микроорганизмов Теоретическое введение 19 К эукариотным микроорганизмам, которые изучаются микробиологами, относятся: грибы, дрожжи, микроводоросли и некоторые простейшие. Морфология грибов Грибы – бесхлорофильные микроорганизмы, имеющие нитевидную форму клеток. Длинные разветвленные нити, образуемые ими, называются гифами. Гифы в совокупности образуют мицелий. По своим размерам гифы грибов намного крупнее актиномицетов. Мицелий у ряда плесневых грибов разделен перегородками (септированный мицелий), а других видов перегородки отсутствуют. В биотехнологии в качестве продуцентов, в основном, используются плесневые грибы. Под названием «плесневые грибы» объединяются некоторые представители фикомицетов, сумчатых и несовершенных грибов. На плотных субстратах плесневые грибы образуют округлые пушистые, паутинообразные, ватоподобные или порошкообразные колонии зеленого, желтоватого, черного или белого цвета. Колонии плесеней состоят из большого количества гифов. Большая часть гифов развивается в воздухе, а часть – в толще субстрата. На гифах часто образуются конидиеносцы, на которых споры образуются или внутри спорангия или в виде экзоспор расположенных цепочками. Конидиеспоры, или конидии, служат для бесполого размножения (рис. 10). Конидии, попадая в благоприятные условия, прорастают в мицелий. Плесневые грибы очень широко распространены в природе и имеют мощный ферментативный аппарат. Поэтому они являются основными деструкторами органических соединений в природе. Плесневые грибы также широко используются в промышленности для получения органических кислот, антибиотиков и ферментов. 20 Морфология дрожжей Дрожжи представляют собой отдельную группу одноклеточных микроскопических грибов, имеющих большое практическое значение. Дрожжевые клетки представляют собой крупные клетки округлой или овальной формы (рис. 11). Некоторые дрожжи могут образовывать рудиментарный мицелий, который называется «псевдомицелий». Размер клеток колеблется от 3 мкм до 10 мкм в длину и от 2 до 8 мкм в ширину. Большинство дрожжей размножаются почкованием. При этом на 21 поверхности клетки появляется небольшая выпуклость – почка (иногда не одна, а несколько), постепенно увеличивающаяся в размерах и, наконец, отделяющаяся от производящей ее клетки. Отделившаяся от материнской клетки почка становится новой дрожжевой клеткой. Некоторые дрожжи размножаются делением. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей (протоплазме) хорошо заметны крупные вакуоли. Вакуоли представляют собой полости внутри протоплазмы, заполненные клеточным соком. Он состоит из растворенных в воде электролитов, белков, углеводов и ферментов. В молодых дрожжевых клетках протоплазма гомогенная, а на более поздних стадиях развития в протоплазме появляются вакуоли, заполненные клеточным соком с продуктами обмена веществ. При истощении питательной среды у многих дрожжей наступает спорообразование. У некоторых видов дрожжей споры округлой формы и покрыты гладкой оболочкой. В благоприятных условиях споры прорастают. Дрожжи широко распространены в природе. Они встречаются на винограде, на других ягодах и фруктах, в молоке, в воде и почве, а также на коже человека. Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и применяются для производства спирта в хлебопечении, виноделии, пивоварении. Морфология простейших Простейшие представляют собой одноклеточные организмы животного мира. Среди микроорганизмов они являются наиболее сложно устроенными, имеющими примитивные органы, свойственные многоклеточным животным. У некоторых из них имеются ротовое и анальное отверстия, сократительные и пищеварительные вакуоли. Размножаются простейшие бесполым (делением клетки) и половым путем. Классификация простейших основана на способах движения. 1. Саркодовые. Передвигаются и захватывают пищу с помощью псевдоподий, или ложных ножек. Типичным представителем является Amoeba. Размеры амеб не превышают 10–15 мкм. 22 2. Жгутиковые. Имеют плотную плазматическую оболочку и передвигаются с помощью жгутиков. Почвенные формы жгутиков очень мелкие (2–5 мкм), а водные крупные (до 20 мкм). Типичным представителем является Euglena. 3. Ресничные. Наиболее высокоорганизованные простейшие. Размеры клеток колеблются от 20 до 80 мкм. Типичным представителем является инфузория-туфелька Paramecium, которую культивируют на корм малькам рыб. 4. Споровики. Неподвижные формы. Многие патогенны, например возбудитель малярии – Plasmodium. Простейшие широко распространены в природе. Они встречаются в водоемах, в иле и почве. Значение простейших в природе весьма разнообразно. Они живут в желудочно-кишечном тракте различных животных, принимая участие в переваривании растительной пищи, участвуют в минерализации органических остатков в почве, а также являются важной составляющей частью биоценоза в очистных сооружениях. Питаясь бактериями и взвешенными веществами, они способствуют осветлению воды. Простейшие выполняют функцию индикаторов: по развитию тех или иных форм можно судить о качестве очистки стоков. Так, преобладание амеб и отсутствие в составе активного ила инфузорий свидетельствует о плохой работе очистных сооружений. Инфузория Tetrahymena широко используется для первичной оценки токсичности. Различные виды простейших представлены на рис. 12. Морфология водорослей Водоросли представляют собой обширную группу растительных организмов. Общее для всех них – наличие хлорофилла и обусловленное этим фотоавтотрофное питание – способность синтезировать органические вещества, используя энергию солнечного света и углекислый газ. У многих водорослей зеленая окраска хлорофилла замаскирована другими пигментами. Среди них встречаются очень мелкие одноклеточные и многоклеточные формы, относимые к микроорганизмам, а также 23 многоклеточные организмы, обитающие в морях и океанах и достигающие иногда гигантских размеров. . Объектами изучения микробиологии являются некоторые водоросли микроскопических размеров. Они имеют разнообразную форму и обитают как на суше, так и в водной среде (рис. 13). 24 Практическая часть Цель работы – изучить морфологию представителей различных групп эукариотов. Порядок выполнения работы Студенты самостоятельно готовят живые препараты представителей грибов, дрожжей, водорослей и простейших; микроскопируют их с объективом х40 и зарисовывают с указанием увеличения микроскопа. Плесневые грибы Aspergillus niger – форма клеток в виде мицелия с перегородками; на некоторых гифах имеются неразветвленные конидиеносцы со спорами. Конидиеносцы одноклеточные, шаровидно вздутые, на поверхности вздутия расположены короткие кеглеобразные клетки (стеригмы), каждая из которых отшнуровывает по цепочке конидий, окрашенных в черный цвет. Применяется для получения органических кислот и ферментов. Penicillium chrysogenum – гифы имеют перегородки; на некоторых гифах имеются разветвленные конидиеносцы со спорами. Конидии образуются на концах мутовчато разветвленных конидиеносцев. Применяется для получения антибиотика пенициллина. 25 Дрожжи Saccharomyces cerevisiae – одиночные дрожжи с овальными и округлыми клетками; размножаются почкованием. Применяются в пивоварении, хлебопечении, производстве спирта. В природе встречаются на поверхности ягод и других плодов. Saccharomyces vini – форма клеток овальная и округлая; размножаются почкованием; после почкования некоторое время не отделяются, образуя небольшие «веточки». Применяются в виноделии. Rhodotorula glutinis – форма клеток эллиптическая; клетки одиночные; размножаются почкованием. Окрашены в оранжевый цвет благодаря содержанию в клетках каротиноидов. Могут расти в средах с углеводородами нефти в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. Candida tropicalis – дрожжи с овальными и сильно вытянутыми клетками, образующие «псевдомицелий». Могут расти в минеральной среде с углеводородами в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. В промышленном масштабе выращиваются на отходах производства спирта, бумаги. Водоросли Chlorella vulgaris – микроскопическая зеленая водоросль, имеющая округлые клетки (5–10 мкм в диаметре); размножаются автоспорами, которые формируются внутри материнской клетки в количестве от 4 до 32 и освобождаются после разрыва ее оболочки. Могут применяться для массового культивирования с целью получения кормового белка, а также для регенерации воздуха в замкнутых системах (подводные лодки, космические станции и т.д.). Scenedesmus sp. – относится к группе зеленых водорослей; имеет овальную форму клеток; наружные клетки часто бывают с заостренными концами; клетки соединены вместе по четыре. Применяется для получения пищевого белка. 26 Простейшие Препарат готовится из активного ила аэротенка. Изучить морфологию обнаруженных представителей простейших и зарисовать их. Содержание отчета 4. Латинское название микроорганизма. 5. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 6. Использование изучаемых микроорганизмов в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите форму клеток представителей грибов и их практическое использование. 2. Опишите форму клеток дрожжей; назовите представителей, и расскажите об их практическом использовании. 3. Расскажите о морфологии микроводорослей и их практическом использовании. 4. Назовите представителей простейших и расскажите об их применении в биотехнологии. Работа 3. Методы изучения морфологии микроорганизмов Самым распространенным методом изучения морфологии бактерий является микроскопирование фиксированных препаратов, приготовленных из чистых культур микроорганизмов или из исследуемой пробы. Исследование микроорганизмов в живом состоянии применяется при изучении более крупных форм и наблюдении подвижности клеток. Приготовление фиксированных препаратов микроорганизмов Для приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов вначале готовят мазок, высушивают его, фиксируют, а затем окрашивают. Мазки готовят на совершенно чистых предметных стеклах. Обезжиривать стекла можно этиловым спиртом, смесью равных объемов спирта и эфира и другими 27 жидкостями. Самым простым и практически удобным способом обезжиривания стекол является протирание их с обеих сторон кусочком хозяйственного мыла. Мыло удаляют со стекла кусочком сухой ваты или салфеткой. При изготовлении мазка из колонии бактерий, выращенных на агаризованной среде, вначале наносят на обезжиренное стекло каплю воды или физиологического раствора. Затем прокаливают бактериологическую петлю в пламени горелки. После этого, охладив петлю на внутренней стенке пробирки, захватывают часть колонии без агара петлей. Петлю с культурой вносят в каплю воды или физиологического раствора на стекле и делают 2–3 круговых движения. Часть бактерий суспендируется в жидкости. Избыток бактерий, оставшихся на петле, сжигают в пламени горелки, нагревая петлю докрасна. Затем охлажденной петлей размазывают каплю суспензии по стеклу. Площадь мазка должна быть в диаметре 1,5–2 см. Мазок должен быть тонким с равномерным распределением материала. Если мазок готовят из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, то, соблюдая те же правила стерильности, набирают каплю культуры петлей или пипеткой и наносят ее на середину обезжиренного стекла. Пипетку с остатком культуры погружают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Каплю равномерно распределяют по стеклу бактериологической петлей. Петлю прожигают в пламени горелки и ставят в штатив или в стакан. Мазок высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха, держа его за продольные ребра высоко над пламенем горелки. Границы мазка очерчивают восковым карандашом с обратной стороны стекла, а со стороны мазка на одном из концов стекла ставят номер препарата. По этим отметкам легко можно ориентироваться в месте расположения мазка на стекле. Высушенный мазок фиксируют. Фиксация преследует следующие цели: 1) убить микробов, что делает препарат безопасным при дальнейшей работе; 2) прикрепить микробов к стеклу, чтобы они не смылись при окраске и промывке водой; 3) улучшить восприимчивость красок. 28 Наиболее простым, пригодным почти для всех микробиологических объектов и самым распространенным в практике методом является фиксация в пламени горелки. Для этого предметное стекло проводят 3–4 раза через наиболее горячую верхнюю часть пламени горелки, не допуская излишнего перегревания препарата, чтобы не вызвать денатурации белка и нарушения структуры и морфологии бактерий. Различают простые и сложные дифференциальные методы окраски. Простой окраской пользуются для обнаружения в исследуемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Простая окраска заключается в нанесении на препарат какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих целей употребляется фуксин – красная окраска, а также щелочной раствор метиленовой синьки (синька Леффлера) – голубая окраска. Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или из капельницы наносят одну из указанных красок. Фуксин выдерживают на мазке 1–3 мин, а синьку – 3–5 мин. Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на предметный столик микроскопа и микроскопируют с иммерсионным объективом ( 90) в проходящем свете. Дифференциальные способы окраски бактерий. Сложные методы окраски имеют большое значение при определении и дифференциации различных видов микробов. Они основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки и применяются для детального изучения структуры клетки и выявления отличительных признаков по отношению к некоторым красителям. При этих методах мазок окрашивают несколькими красками и дополнительно обрабатывают протравами или обесцвечивающими веществами – спиртом, кислотой и др. К этим методам относят важнейший метод окраски для дифференциации бактерий – окраску по Граму. При этом методе выявляется 29 способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой клеточной стенки. Все бактерии по строению клеточной стенки делятся на две группы: 1) красящиеся по Граму – грамположительные и 2) не красящиеся по Граму – грамотрицательные. Отношение к окраске по Граму является настолько важным дифференциальным признаком бактерий, что обязательно упоминается при их характеристике и служит таксономическим признаком. Методика окраски по Граму На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, заранее пропитанной генцианвиолетом. На полоску наносят 3 – 5 капель водопроводной воды. Через 1–2 мин бумажку удаляют пинцетом, а на препарат наливают раствор Люголя. Через 30 сек – 1 мин сливают раствор Люголя. Наносят несколько капель 96О-ного спирта. Обесцвечивают в течение 1 мин до исчезновения сероватофиолетовых струек. Препарат промывают водой. На мазок наливают фуксин и выдерживают 1–2 мин. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетово-синий (например, палочка маслянокислого брожения – Clostridium pasteurianum), а грамотрицательные – в розово-красный цвет (кишечная палочка – Escherichia сoli). Кроме этой традиционной методики окрашивания по Граму имеется быстрый и простой метод для дифференциации по Граму без окрашивания. Клетки бактерий (лучше 1–2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-ного KOH на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5–8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя слизистые тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе 30 щелочи и освобождением ДНК. Метод дифференциации бактерий по Граму без окрашивания следует использовать лишь для предварительной диагностики, либо подсчета примерного соотношения колоний грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выявление живых и мертвых клеток методом окраски метиленовой синью Число живых и мертвых клеток можно определить методом окраски раствором метиленовой сини. Метод основан на различной проницаемости живых и мертвых клеток микроорганизмов. Клеточная проницаемость у мертвых клеток нарушается, поэтому краситель свободно проходит сквозь цитоплазматическую мембрану и адсорбируется протоплазмой. Под микроскопом мертвые клетки выглядят синими, живые – бесцветными или бледноголубыми. Окраска осуществляется следующим образом: на предметное стекло наносится капля 2% раствора метиленовой сини, покрывается покровным стеклом, избыток краски оттягивается кусочком фильтровальной бумаги. Препарат просматривается под микроскопом, в 10 полях зрения считают количество живых и мертвых клеток; число мертвых клеток выражается в %. Пример: среднее число живых клеток в одном поле зрения – 10, среднее число мертвых клеток в одном поле зрения – 5, общее число клеток в одном поле зрения – 15. 15 клеток – 100% 5 клеток – Х Х 5 100 33,3% 15 Таким образом, число мертвых клеток в исследуемой суспензии микроорганизмов составило 33,3%. Определение размеров клеток Для определения размеров клеток микроорганизмов необходимо иметь специальный окуляр со шкалой (окулярный микрометр) и объект-микрометр. Окулярный микрометр, в 31 простейшем случае, представляет собой стеклянный диск с нанесенной на нем линейной шкалой, который вкладывается в окуляр (рис. 14а). Объект-микрометр представляет собой предметное стекло, в центре которого выгравирована линейная шкала длиной 1 мм, с ценой деления 10 мкм. Перед измерением необходимо определить цену деления окулярного микрометра для каждого увеличения микроскопа. Для этого объект-микрометр помещается на предметный столик микроскопа и рассматривается как препарат; при этом одно из видимых делений объект-микрометра совмещается с нулевой отметкой шкалы окулярного микрометра и отмечается совпадение делений той и другой шкалы (рис. 15). Подсчитывают, сколько окулярных и объективных делений приходится на этот отрезок, и вычисляют цену делений окулярного микрометра. Если после этого поместить на предметный столик препарат микроорганизмов вместо объект-микрометра и рассматривать его 32 при том же увеличении, то можно измерить величину микробной клетки, пользуясь шкалой окулярного микрометра как линейкой. Для точных измерений применяется специальный окулярный микрометр со скользящей нулевой отметкой, связанной с измерительным барабаном (рис. 14б). Он позволяет определить размеры микроорганизмов с точностью до десятых долей микрона. Нулевой отметкой служит двойная вертикальная линия, середина которой соответствует пересечению двух тонких линий в виде креста. Перед измерениями необходимо узнать цену деления шкалы измерительного барабана. Эталоном служит объект-микрометр. Вращая измерительный барабан, нулевой отметкой обводят несколько делений шкалы объект-микрометра. Двойная вертикальная линия показывает число полных оборотов измерительного барабана. Проводя измерения микроорганизмов, передвигают нулевую отметку вдоль объекта и считают показания измерительного барабана. Практическая часть Цель работы – освоить основные морфологии микроорганизмов. методы изучения 33 Порядок выполнения работы 1. Приготовить фиксированные препараты молочнокислых бактерий из биокефира и ацидофилина. 2. Выполнить окраску по Граму клеток Bacillus subtilis (грам+) и Escherichia coli (грам-). 3. Определить размеры дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. 4. Определить число живых и мертвых клеток Saccharomyces cerevisiae в суспензии дрожжей. Содержание отчета 1. Морфология клеток молочнокислых бактерий (рисунки фиксированных препаратов молочнокислых бактерий с указанием увеличения микроскопа). 2. Рисунки фиксированных препаратов грамотрицательных и грамположительных бактерий. 3. Определение цены деления измерительного барабана окулярного микрометра. 4. Размеры дрожжевой клетки Saccharomyces cerevisiae. 5. Число живых и мертвых клеток в суспензии дрожжей. Контрольные вопросы 1. Как приготовить фиксированный препарат бактерий? 2. С чем связано различие бактерий в окраске по Граму? 3. В чем заключается метод окраски по Граму? 4. Как определить размер микроорганизмов? 5. Как определить количество живых и мертвых клеток микроорганизмов методом окраски метиленовой синью? Тема 2. Культивирование микроорганизмов: принципы составления питательных сред; методы стерилизации; методы посевов и пересевов микроорганизмов. Классификация и приготовление питательных сред Культивировать микроорганизмы – это значит искусственно создавать условия для их роста. Для культивирования 34 микроорганизмов в лаборатории или в промышленности применяются питательные среды, содержащие все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов вещества. Из окружающей среды питательные вещества поступают в клетку микроорганизма, а из клетки в среду выводятся продукты обмена. Для жизнедеятельности микроорганизмов необходимы вода, углерод, кислород, азот, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо и микроэлементы. Все эти вещества должны содержаться в питательной среде. Даже без одного из них роста или совсем не будет или он будет ничтожным. Углерод, водород, азот, фосфор и сера называются биогенными элементами, так как на их долю приходится около 90– 95% сухой массы клеток. Калий, магний, кальций и натрий называются макроэлементами, или зольными элементами. На их долю приходится до 5–10% сухой массы клеток. Железо, марганец, молибден, кобальт, медь, ванадий, цинк, никель и некоторые другие катионы тяжелых металлов называются микроэлементами и составляют доли процента сухой массы клеток. Наибольшее значение для любого живого организма имеет углерод. Он входит в состав всех органических молекул в клетке и на его долю приходится около 50% сухой биомассы. По отношению к углероду все организмы делятся на автотрофные и гетеротрофные. Автотрофы в качестве источника углерода используют углекислый газ. Гетеротрофы нуждаются в готовых органических соединениях. Источником углерода для большей части микроорганизмов могут служить различные органические вещества: белки и продукты их распада, углеводы, жиры, углеводороды. Азотное питание по своему значению стоит на втором месте после углеродного. Азот входит в состав аминокислот и других клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Азот составляет 14% от сухого вещества клеток. Источником азота служат азотсодержащие органические или минеральные соединения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и нитраты. В качестве органических источников азота используются белки, аминокислоты, нуклеотиды. Некоторые прокариоты могут использовать атмосферный азот. 35 Фосфор и сера входят в состав важных биополимеров клетки. Фосфор (3% сухого вещества клеток) входит в состав нуклеотидов и АТФ, а сера (менее 1%) – в состав некоторых аминокислот. В качестве источника фосфора обычно используют фосфаты, а серы – сульфаты. Фосфор и сера могут также использоваться в виде органических соединений. Для роста микроорганизмов требуются в небольших количествах макроэлементы: ионы щелочных металлов (Na+, K+) и щелочноземельных металлов (Mg2+, Ca2+), которые играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Макроэлементы в клетках микробов необходимы для регулирования проницаемости, осмотического давления, величины рН. Помимо этих металлов, для роста микробов необходим ряд элементов в следовых количествах (микроэлементы). Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность. Одна из основных функций микроэлементов – участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетке связывают с металлами. Кроме основных компонентов питательной среды для нормального развития некоторых микробов необходимы еще добавочные вещества, которые носят название «факторов роста». Факторы роста – это объединенное название различных по химической природе соединений. Главным образом это органические вещества, добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. Они имеют для микробов то же значение, что витамины для высших организмов. Ростовыми факторами в основном являются витамины группы В, которые играют роль регуляторов и стимуляторов обмена веществ у микробов, или аминокислоты. В качестве факторов роста используют дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, нативные белки (кровь, сыворотка) и др. Потребности в источниках питания микроорганизмов весьма разнообразны. По этой причине не существует универсальной 36 среды, одинаково пригодной для культивирования любого микроорганизма. В зависимости от целей культивирования и потребностей данного микроорганизма питательные среды различаются по трем признакам: по составу, физическому состоянию и назначению. По составу питательные среды подразделяются на две группы: 1) естественные (натуральные); 2) искусственные (синтетические). Естественными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств, содержащие органические соединения. Естественные питательные среды обеспечивают интенсивный рост самых разнообразных микроорганизмов. Они содержат богатый набор органических и неорганических соединений, в том числе все необходимые элементы и дополнительные вещества. Например, в лабораторных условиях чаще всего используются следующие питательные среды. 1. Мясо-пептонный бульон (МПБ) – экстракт из мяса, содержит продукты неполного распада белка – пептоны, в которых имеется органический углерод, органический азот, фосфорсодержащие, серосодержащие органические вещества. В МПБ содержатся также все необходимые микроорганизмам минеральные вещества. МПБ применяется при выращивании многих видов бактерий. 2. Пивное сусло – экстракт из проросших зерен ячменя, содержит в качестве источника углерода сахара (в основном мальтозу), азотистые вещества, зольные элементы, различные ростовые факторы и витамины группы В. Пивное сусло является хорошей средой для развития многих микроорганизмов, в частности дрожжей, плесневых грибов. Хорошими естественными средами являются молоко, картофель, отвары из плодов и овощей. В промышленности обычно применяют полусинтетические или естественные среды. Очень часто в качестве источника углерода используют отходы микробиологической или пищевой промышленности: меласса (отход сахарного производства), 37 сульфитный щелок (отход целлюлозно-бумажного производства), гидролизаты (отход гидролизно-спиртового производства) и др. Синтетическими питательными средами называются такие среды, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Они являются результатом более детального изучения потребностей микроорганизмов в питательных веществах. Преимущества синтетических сред заключается в том, что они хорошо воспроизводимы, поэтому они находят все большее применение в экспериментальных исследованиях и в промышленности. Примеры синтетических сред: Среда для культивирования гетеротрофных бактерий, (г/л водопроводной воды): Глюкоза – 20,0 NH4Cl – 1,0 K2HPO4 – 0,5 MgSO4 · 7H2O – 0,5 CaCO3 – 20,0 рH среды – 7,1-7,2 Среда для культивирования бактерий – актиномицетов, (в г/л водопроводной воды): Крахмал – 20,0 K2HPO4 – 0,5 MgSO4 · 7H2O – 0,5 (NH4)2SO4 – 2,0 СaCO3 – 5,0 рH среды – 7,2–7,3 Полусинтетические среды, кроме органических и неорганических соединений известного состава, содержат продукты природного происхождения. В настоящее время в микробиологии широко пользуются готовыми питательными средами, которые выпускают в виде сухих порошков или жидких концентратов. Это экономит время для приготовления сред и позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях. Значение сухих сред возрастает в экспедициях и полевых условиях. 38 По физическому состоянию среды подразделяются на жидкие, плотные и сыпучие. Жидкие среды используются для накопления биомассы или продуктов метаболизма. Жидкие среды готовят растворением в воде всех компонентов питательной среды. Плотные среды готовят из жидких, добавляя агар-агар, желатину или кремнекислый гель. Агар-агар представляет собой высокомолекулярный полисахарид, который получают из морских водорослей. Его добавляют в жидкие среды в количестве 1,5–2,0%. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может использовать его для питания и поэтому он является лишь гелеобразующим средством. В холодной воде этот полисахарид нерастворим, но растворяется в ней при нагревании до 90–100 ОС. При температуре 45ОС агаровая среда застывает в виде студня с гладкой поверхностью, что удобно при работе с большинством культур, которые растут при меньшей температуре. Такие среды используют для выделения чистых культур, хранения культур, количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев. Для уплотнения сред иногда используют желатину. Это белок, получаемый путем вываривания костей и хрящей животных. Образуемый желатиной гель плавится при температуре около 25ОС, которая ниже температуры культивирования большинства микробов. Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами, имеющимися у ряда микроорганизмов. Эти свойства желатины сильно ограничивают ее применение. Чаще всего желатину используют для диагностических целей. Кремнекислый гель используют для уплотнения минеральных сред или сред с низким значением рН. Сыпучие среды: разваренное зерно, компост, отруби, опилки, солома, пропитанные питательным раствором – используют в промышленной микробиологии для получения ферментов, кормовой добавки на целлюлозосодержащих отходах и выращивания грибов. По назначению различают среды универсальные, элективные, накопительные и дифференциально-диагностические. 39 Универсальные среды пригодны для выращивания широких групп микроорганизмов, например, пивное сусло или мясопептонный агар. Элективные среды составляются в расчете на жесткие условия, при которых может развиваться узкая группа микроорганизмов или даже один избранный организм. Элективные среды были предложены С.Н. Виноградским и оказались идеальными для выделения хемосинтетиков. Примером элективных сред могут служить безазотистые среды для выделения азотфиксаторов. Накопительные среды – это среды, на которых определенные виды микробов или их группы растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. В них интересующее вещество дается в избытке, и в результате нужный исследователю организм доминирует. Такой подход предложил М.Бейеринк. Дифференциально-диагностические – это сложные среды, на которых микроорганизмы разных видов растут по-разному, в зависимости от биохимических свойств культуры. Например, среда Эндо для выявления кишечной палочки, на которой колонии кишечной палочки Escherichia coli имеют красноватый цвет с металлическим блеском. Условия культивирования микроорганизмов в зависимости от отношения к кислотности среды, кислороду, температуре При подготовке сред и культивировании микроорганизмов большое значение имеют следующие физико-химические факторы. 1. Величина рН среды – активная кислотность (отрицательный логарифм концентрации водородных ионов) При изготовлении сред важно учитывать требования микроорганизмов к кислотности среды. Для каждой культуры существует определенная зона рН, в пределах которой культура может развиваться. Большинство микроорганизмов, в частности, многие бактерии хорошо развиваются в нейтральной среде. Многие грибы и дрожжи предпочитают слабокислые условия. Есть бактерии, предпочитающие сильнощелочные или сильнокислые среды. Поэтому, приготовив среду, следует измерить величину рН 40 и, если необходимо, довести ее до нужного значения с помощью растворов кислот или щелочей. В большинстве случаев микроорганизмы изменяют рН среды, в которой они развиваются. Это связано с потреблением ими определенных компонентов среды или с образованием продуктов жизнедеятельности. Чтобы удержать значение рН в средах на заданном уровне, можно вводить в среды буферные растворы (фосфатные, ацетатные, лимоннокислые и др.). Иногда в культуры активных кислотообразователей добавляют мел или проводят нейтрализацию раствором щелочи. 2. Условия транспорта кислорода к растущим клеткам. По отношению к присутствию молекулярного кислорода микробы делятся на несколько групп. Большинство микроорганизмов нуждаются в О2 и носят название строгих (облигатных) аэробов. В клетках аэробов большая часть О2 расходуется в процессе дыхания в качестве конечного акцептора водорода, меньшая часть О2 включается в молекулы различных соединений. Вторую, менее обширную группу микроорганизмов составляют те, для жизнедеятельности которых молекулярный кислород не нужен и даже вреден. Такие микроорганизмы получили название облигатных анаэробов. Некоторые группы микроорганизмов могут существовать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Микроорганизмы, растущие как в аэробных, так и в анаэробных условиях, называются факультативными. У аэробов, растущих на жидкой среде, потребность в кислороде удовлетворяется за счет кислорода, растворенного в среде. Растворимость кислорода очень мала (меньше 10 мг/л), поэтому для удовлетворения потребности в кислороде быстрорастущей культуры приходится принимать специальные меры. В лабораторных условиях наливают среду тонким слоем в сосуд с широким дном, закрывая его ватной пробкой. При этом получается большая поверхность, через которую кислород диффундирует в среду и поступает к находящимся микробам. Для снабжения кислородом глубинной культуры применяют встряхивание на качалках (рис. 16). Колбы прочно закрепляются в гнездах платформы, которая приводится в движение мотором; при этом питательная среда распределяется тонким слоем по стенкам колбы и 41 происходит обогащение среды растворенным кислородом. В промышленных условиях для увеличения интенсивности аэрации применяют механическое перемешивание и барботирование. Выращивание анаэробов более сложно, чем культивирование аэробных микроорганизмов, так как они должны быть изолированы от доступа кислорода воздуха. Методы 42 культивирования не строгих анаэробов довольно просты. Для выращивания анаэробов, не образующих газов, используют сосуды, доверху заполненные свежепрокипяченной средой и закрытые резиновыми или завинчивающимися пробками. При выращивании газообразующих анаэробов сосуды дополняются газоотводными трубками. Для контроля за степенью окисленности среды к ней добавляют окислительно-восстановительный краситель резазурин, который в окисленном состоянии окрашивает среду, а в восстановленном оставляет ее бесцветной. Для культивирования строгих анаэробов пользуются герметичными аппаратами – анаэростатами, из которых либо откачивается воздух, либо заполняется инертным газом. 3) Температура среды. Микроорганизмы различаются по своему отношению к температуре. Микроорганизмы, развивающиеся при температуре от 0 до 20ОС, называются психрофилами. Большинство микроорганизмов растут при температуре от 25 до 37ОС. Их называют мезофилами. Существует особая группа теплолюбивых форм – термофилов. Оптимальная температура для их роста 45 - 60 О С. Отклонение температуры от оптимума неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов. Поэтому сосуды с растущей культурой помещают в термостат. Методы стерилизации. Стерилизация посуды и питательных сред Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. В микробиологии под стерилизацией понимают уничтожение всех живых микроорганизмов, в том числе наиболее устойчивых форм микробов, т.е. спор. Для предупреждения развития на питательных средах посторонних микроорганизмов все среды, посуду, пробки стерилизуют, чтобы убить находящихся в них микробов. Только после этого производится посев и выращивание необходимой культуры. Стерилизацию проводят при помощи физических и химических методов. 43 К физическим методам стерилизации относятся: нагревание до высоких температур, ультрафиолетовое облучение, фильтрование. Нагревание 1. Прокаливание на открытом огне – наиболее простой и надежный способ стерилизации. Для этого обрабатываемый инструмент несколько раз проводят через пламя горелки. Так стерилизуют негорючие и теплоустойчивые предметы (шпатели, бактериологические петли и т.д.). 2. Кипячение – несложный вид стерилизации. Основной недостаток кипячения – то, что погибают только вегетативные клетки, а споры остаются жизнеспособными. 3. Стерилизацию сухим жаром используют для стерилизации лабораторной посуды (пробирок, пипеток, чашек Петри). Сухую посуду заворачивают в бумагу или помещают в металлические пеналы. Пробирки закрывают ватными пробками. Стерилизацию проводят в специальных сушильных шкафах при температуре 160– 170ОС в течение 2 часов. 4. Стерилизация паром под давлением – самый надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред, который проводят в автоклаве (рис. 17). Стерилизующим агентом является пар, нагретый до температуры выше 100ОС. Обычно стерилизацию питательных сред в автоклаве выполняют в течение 15–20 мин при избыточном атмосферном давлении 1 атм. (при таком режиме температура достигает 121ОС). Некоторые термолабильные соединения (например, растворы сахаров) следует стерилизовать при давлении 0,5 ати в течение 30 мин. Для стерилизации колбы с питательными средами заполняют не больше, чем наполовину, закрывают ватными пробками и бумажным колпачком. 5. Нагревание среды до 60–70ОС в течение 20 мин называется пастеризацией. При таком режиме погибают бесспоровые формы микробов. Пастеризация применяется в пищевой промышленности для борьбы с патогенными микроорганизмами. 44 Ультрафиолетовое облучение Стерилизацию ультрафиолетовым облучением проводят с помощью бактерицидных ламп. Его применяют для обеззараживания воздуха и поверхностей помещений, предметов и оборудования, воды и пищевых продуктов. В микробиологической лаборатории ультрафиолетом стерилизуют специальное помещение для посевов микроорганизмов (бокс или ламинар). Стерилизация фильтрованием Стерилизацию фильтрованием проводят в тех случаях, когда стерилизуемые растворы не переносят нагревания. С этой целью применяют асбестовые, фарфоровые и другие фильтры, а также 45 мембраны. Чаще всего применяют фильтр Зейтца. Он представляет собой держатель, в который вставляют мембранный фильтр. Монтируя прибор, фильтр закладывают между нижней и верхней частями держателя, и обе части плотно скрепляют винтами. Смонтированный прибор стерилизуют в автоклаве. Одновременно стерилизуют приемник – колбу Бунзена. Перед работой прибор через резиновую пробку вставляют в колбу и соединяют с насосом. Химические методы В лабораторной практике химические методы стерилизации имеют ограниченное применение. В питательные среды добавляют хлороформ, толуол, иногда эфир. После стерилизации, для освобождения от них среду нагревают на водяной бане до 56ОС. Для уничтожения микроорганизмов во внешней среде проводят дезинфекцию. При дезинфекции в лабораториях применяют растворы хлорамина (1–3%), фенола (3–5%) или спирта (70%) и ряд других дезинфицирующих средств. Работа 4. Техника микробиологических посевов Способы микробиологических посевов 1. Посев на пробирку со скошенным агаром Применяется для всех видов экспериментальных работ с микроорганизмами и для хранения культур микроорганизмов. Берут 2 пробирки: одна из них – с исследуемым микробом, другая – стерильная с наклонно застывшей твердой средой. Пробирку с исследуемым микробом помещают в левую руку, правой рукой вынимают пробку так, чтобы входившая в пробирку часть ватной пробки не прикасалась к руке. Держа пробирку возле горелки почти в горизонтальном положении, обожженной петлей берут немного исследуемого материала, прикасаясь сначала к поверхности среды, чтобы охладить петлю и не убить микробов. Закрыв пробирку ватной пробкой, обожженной в пламени горелки, ставят ее в штатив. В левую руку берут (снизу) чистую пробирку с наклонно застывшей средой, также вынимают пробку правой рукой и производят посев снизу вверх зигзагообразным штрихом, легко 46 касаясь поверхности, не разрезая агара. Затем в пламени горелки в пробирку вставляется обожженная ватная пробка. 2. Посев на чашки Петри с сусло-агаром или мясо-пептонным агаром (МПА) Применяется для накопления биомассы и для изолирования (выделения) микроорганизмов одного рода, вида и штамма, т.е. для получения чистых культур, представляющих потомство одной клетки. Применяется также и для проверки чистоты культуры. Сначала готовят водную суспензию выбранной культуры. Для этого прокаленной и остуженной петлей захватывают немного биомассы из пробирки и переносят ее возле пламени горелки в пробирку со стерильной водопроводной водой. Суспензия тщательно перемешивается. Из водного разведения отбирают пробу стерильной пипеткой. 1–2 капли суспензии выливают на поверхность агаровой среды в чашку Петри. Каплю размазывают стерильным шпателем по поверхности первой чашки, затем тем же шпателем – по поверхности второй, а потом третьей чашки. Таким образом, в первой чашке вырастает сплошной газон посеянной культуры, а в третьей – изолированные колонии, каждая из которых представляет собой потомство одной клетки (рис. 18). Культуру на поверхность плотной среды можно посеять и штриховым способом. Для этого прокаленной и остуженной петлей берут немного биомассы и проводят зигзагообразную динию по всей поверхности чашки Петри, затем той же петлей проводят такие же линии по поверхности второй и третьей чашек Петри. Этот способ называется методом «истощающего штриха» (рис. 18Г). 47 3. Посев в жидкие питательные среды Применяется для изучения физиологии и биохимии микроорганизмов. Пользуются двумя способами. А. Прокаленной петлей берут немного исследуемого материала и вносят в пробирку со стерильной жидкой средой. Прикасаясь петлей к стенке пробирки в том месте, где находится граница между воздухом и жидкостью, слегка потирают петлей о стенку пробирки, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде. Б. Посев производится пипеткой из водных смывов с косяков. Стерильной пипеткой набирают стерильную воду и выливают ее в пробирку с культурой. Осторожно размешивают пипеткой культуру в воде, затем выливают смыв в колбу со стерильной средой. 48 При изучении и описании роста культур на различных средах проводят микроскопические и визуальные наблюдения. Для изучения морфологии отдельных клеток микроорганизмов готовят препарат данной культуры и рассматривают его под микроскопом, отмечая внешний вид клеток, их форму, размеры, наличие почек (у дрожжей). Однако для определения видовой принадлежности необходимо еще изучение характера роста микроорганизмов, выращенных на жидкой и плотной среде. При посеве на плотную агаровую среду с разведением в последнюю чашку Петри попадает очень малое количество клеток. При размножении каждой из них образуются отдельные колонии микроорганизмов. Каждый вид микроорганизмов образует колонии характерной формы, консистенции, цвета. По однородности колоний судят о чистоте культуры. При описании роста микроорганизмов на жидкой среде обращают внимание на следующие культуральные признаки: наличие пленки на поверхности среды, ее характер и цвет, наличие постенного кольца, его характер и цвет, наличие осадка, его характер (рыхлый, плотный) и цвет. Схема описания роста микроорганизмов 1. Описание роста культур на пробирках со скошенным агаром. Название культуры. Название среды. Культуральные признаки: мощность штриха; форма роста (ограниченный рост, нитевидный или неограниченный); форма края (лопастной, гладкий и т.п.); профиль роста (плоский, пленчатый, выпуклый); поверхность штриха (гладкая, складчатая, бугристая); характер поверхности (блестящая, матовая); цвет штриха. 49 2. Описание роста микроорганизмов на твердой среде ( на чашках Петри). Название культуры. Название среды. Культуральные признаки, характеризующие колонии (рис. 19): однородность или неоднородность колоний; форма колоний; величина колоний (в мм); цвет колоний; характер поверхности колоний (гладкая, складчатая, блестящая, матовая и т.д.); край колоний (гладкий, волнистый, изрезанный); профиль колоний (плоский, выпуклый, кратерообразный). Микроскопическая картина: форма клеток (округлые, овальные, эллипсовидные, яйцевидные, удлиненные, короткие палочки, длинные палочки); клетки одиночные или соединенные в цепочки из двух или нескольких клеток; у дрожжевых культур отметить, многие ли клетки почкуются или нет, преобладание мелких или крупных клеток; наличие или отсутствие «псевдомицелия» (клетки вытянуты в длину и образуют «веточки» из 5–20 клеток). Отметить возраст культуры (в сутках) и температуру культивирования. 3. Описание роста культуры на жидкой среде. Название культуры (род, вид и, если указано, штамм). Возраст культуры в сутках и температура выращивания. Среда (жидкое сусло, МПБ или минеральная среда с сахарозой). Культуральные признаки: наличие пленки на поверхности среды, ее характер и цвет; наличие помутнения и распределение помутнения в толще среды; наличие кольца у поверхности среды, его характер и цвет; наличие осадка на дне сосуда, его характер и цвет. 50 Практическая часть Цель работы – овладеть методами микробиологических посевов и получить навыки описания культуральных признаков микроорганизмов. Студенты должны сделать посевы различных культур разными способами. При посевах микроорганизмов применяют металлические петли, пипетки и шпатели. Петлей пользуются для взятия небольших количеств культуры с твердых сред. Пипетками 51 отбирают пробы из жидких сред. Шпатели служат для размазывания биомассы по поверхности агаровой среды. Пипетки и шпатели стерилизуются завернутыми в бумагу. Для стерилизации петли ее перед посевом и после посева прокаливают в пламени горелки. Пересевы производятся около пламени горелки. Через пламя проводятся горлышки колб и пробирок, а также пипетки и шпатели, которыми пользуются при посеве. Использованные пипетки и шпатели помещают в специальные сосуды с дезинфицирующим раствором. Порядок выполнения работы Часть 1 1. Посев петлей на пробирку со скошенным агаром. Посев одной из перечисленных дрожжевых культур: Saccharomyces cerevisiae раса ХП Saccharomyces vini – на сусло-агар Bacillus subtilis – на мясо-пептонный агар (МПА) 2. Посев на чашки Петри. (Берется одна из перечисленных культур): Rhodotorula glutinis – на сусло-агар Candida tropicalis – на сусло-агар 3. Посев в жидкую среду. Посев культуры плесневого гриба Aspergillus niger – посев петлей из пробирки на минеральную среду с сахарозой в колбах. На чашках, пробирках и колбах надписывается дата посева, название культуры и фамилия студента. Чашки заворачиваются в бумагу кверху дном. Посевы помещаются в термостат. В тетради делается запись о посевах. Схема записи Дата посева. Способ посева. Название культуры. Название среды. Через неделю проводится просмотр посевов. Студенты рассматривают визуально и под микроскопом культуры, высеянные 52 на 1-м занятии, и проводят описание роста микроорганизмов по приложенной схеме. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. Описать культуральные признаки роста культуры на пробирке со скошенным агаром. 2. Описать культуральные признаки роста культуры на чашках Петри. 3. Описать культуральные признаки роста культуры на жидкой среде. Содержание отчета Название культуры. Название среды. Способ посева. Культуральные признаки. Микроскопическая картина. Возраст культуры. Температура культивирования. Контрольные вопросы 1. Принципы составления питательных сред. 2. Классификация питательных сред по составу, физическому состоянию и назначению. Привести примеры питательных сред. 3. Как микроорганизмы разделяются по отношению к таким физико-химическим факторам как рН, температура, аэрация? 4. Способы стерилизации микробиологической посуды и сред. 5. Основные способы посевов микроорганизмов. 6. Какие признаки используются при описании роста микроорганизмов на жидких и твердых средах? 7. Назовите культуральные признаки исследованной культуры. ТЕМА 3. Методы количественного учета микроорганизмов Для количественной оценки интенсивности роста (размножения) микроорганизмов применяют, в зависимости от вида исследуемой культуры и целей опыта, различные методы. 53 Определение биомассы по сырому весу Метод применяется для предварительных определений биомассы микроорганизмов крупных размеров – дрожжей, грибов, водорослей. Определение биомассы по сырому весу состоит в том, что из среды с микроорганизмами при перемешивании отбирается определенный объем жидкости и отфильтровывается на воронке Бюхнера через 2 бумажных фильтра. На левую чашку весов помещается фильтр с биомассой, а на правую – пустой фильтр. Взвешивание производится с точностью до второго знака. Вес биомассы пересчитывается на единицу объема среды (в г/л). Обычно средняя влажность такой биомассы составляет 75%. Определение биомассы по сухому весу Метод используется при работе с микроорганизмами для более точных исследований. Для определения концентрации биомассы по сухому весу определенный объем культуральной суспензии центрифугируют. Центрифугат (надосадочную жидкость) сливают, оставляя осадок. Осадок дважды промывают водопроводной водой, а затем дистиллированной, взбалтывают с минимальным количеством воды и количественно (без потерь) переносят в бюкс. Бюкс предварительно доводят в сушильном шкафу при температуре 105оС до постоянного веса. Далее бюкс с биомассой помещается в сушильный шкаф и высушивается при температуре 105оС до постоянного веса. Вес биомассы определяется по разности веса бюкса с биомассой и пустого бюкса и пересчитывается на единицу объема. Количественный учет микроорганизмов в счетных камерах Счетная камера Горяева (рис. 20) представляет собой толстое предметное стекло, на поверхности которого выгравирована сетка. Сетка углублена на 0,1 мм. Если сверху положить покровное стекло, то пространство, заключенное между этим стеклом и сеткой, будет представлять собой камеру глубиной 0,1 мм. Сетка разделена на ряд квадратов, некоторые из них, в свою очередь разделены на 16 малых квадратов, Площадь малого квадрата составляет 1/400 мм2, а объем жидкости, расположенной над ним, – 1/4000 мм3. 54 Для определения каплю суспензии помещают в камеру и плотно накрывают плоскошлифованным покровным стеклом. Подсчитывают количество клеток в 50 больших квадратах, пересчитывают число клеток на 1 мл по формуле: М a 1000 n , где m S M – число клеток в 1 мм суспензии, a – среднее число клеток в квадрате сетки, m – глубина камеры в мм , S – площадь квадрата в мм2, n – разведение исходной суспензии. 55 1000 мм3=1 мл. Метод высева на плотные среды (метод Коха) Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. При этом считают, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Такая колония обозначается КОЕ (колониеобразующая единица). Чашечный метод широко используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в почве и других субстратах. Он позволяет не только учесть численность микроорганизмов в субстрате, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний. Детально этот метод будет описан в работах 6 и 7. Нефелометрический метод анализа С помощью этого метода можно измерять концентрацию биомассы в виде водной суспензии. В основе метода лежит измерение светорассеяния (мутности), вызываемого суспензией клеток микроорганизмов, которые дают равномерное устойчивое помутнение. Количество света, рассеиваемого суспензией, пропорционально числу и размерам клеток. Величину светорассеяния измеряют с помощью фотоколориметров. Определения проводят с использованием зеленого светофильтра (550 нм). При высоких концентрациях клеток происходит вторичное рассеяние света, отчего могут получиться заниженные результаты. Поэтому суспензии с большими плотностями биомассы следует предварительно разбавлять средой или дистиллированной водой. Иногда количество биомассы выражают в показаниях нефелометра (оптической плотности). Однако правильнее для определения концентрации клеток использовать калибровочные зависимости величины светорассеяния (оптической плотности) суспензии от веса сухой биомассы или числа клеток в единице объема. 56 ТЕМА 4. Микробиологические методы исследования объектов окружающей среды Микроорганизмы в природе обнаруживаются всюду – в почве, воде, воздухе, на растениях и в организме животных и человека. Количество и биологическое разнообразие микроорганизмов в окружающем мире зависят от условий внешней среды, прежде всего от наличия питательных веществ, температуры, влажности и от других физико-химических и биологических факторов. Обнаружение и количественный учет микроорганизмов в объектах окружающей среды необходимы при санитарно-гигиенических и экологических исследованиях, а кроме того для выделения новых микроорганизмов – продуцентов различных полезных веществ. Работа 5. Исследование микрофлоры воздуха Теоретическое введение Воздух является средой, неблагоприятной для развития микроорганизмов. В нем нет питательных веществ, отсутствует необходимая влага и губительно действует ультрафиолетовый спектр прямых солнечных лучей. Поэтому микрофлора воздуха весьма немногочисленна и довольно случайна. Ее видовой и количественный состав зависит от микрофлоры территории, над которой находится воздух. Микробы попадают в воздух с пылью, уносимой с поверхности земли ветром. Попав в воздух, многие из них отмирают или вновь оседают на поверхности земли. Микробы, находящиеся в воздухе, в основном принадлежат к безвредным видам, но есть и патогенные бактерии, устойчивые к высыханию (туберкулезные и дифтерийные палочки). В 1 г комнатной или уличной пыли может содержаться до 1 млн микробов. Больше всего бактерий в закрытых помещениях, особенно там, где много людей. В воздухе помещений в 1 м3 содержится от 5 до 300 тысяч микроорганизмов. Воздух является источником заражения продовольственных товаров, технологического сырья и оборудования, питательных сред 57 и т.д., поэтому чистота воздуха имеет большое значение как в медицине, так и в промышленной микробиологии. Микрофлора воздуха содержит много пигментированных, а также спороносных бактерий как более устойчивых к ультрафиолетовым лучам. Здесь имеются кокки, сарцины, палочки, споры плесневых грибов и дрожжей. Чтобы установить количество микроорганизмов в воздухе, известно два приема: седиментация (оседание) и аспирация (засасывание). Простейший метод бактериологического исследования воздуха – метод оседания, который основан на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. При помощи этого метода получают общее представление о содержащихся в воздухе микроорганизмах. Для этого открывают чашку Петри с питательной средой на определенное время. Для более точного количественного учета пользуются методом аспирации. При этом определенное количество воздуха фильтруют над питательной средой, пользуясь различными приборами – бактериоулавливателями (прибор Кротова, мембранные фильтры и др.). Практическая часть Цель работы – определить бактериальную загрязненность воздуха в помещении учебной лаборатории. Порядок выполнения работы Часть I Для определения количества микроорганизмов в воздухе по методу Коха выполняются следующие процедуры. 1. Каждый студент устанавливает чашку Петри с мясопептонным агаром (МПА) на определенной высоте (на полу, на высоте от уровня пола 75 см, 150 см, 250 см) 2. Чашки открывают полностью и выдерживают в течение 5 мин. 58 3. Затем чашки закрывают и переносят в термостат с температурой 370С на 24 часа. 4. После чего оставляют при комнатной температуре в помещении лаборатории на 48 часов. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. Произвести подсчет колоний, выросших в чашках Петри. 2. По количеству подсчитанных колоний определяют микробную загрязненность воздуха следующим образом. Экспериментально установлено, что за 5 мин при спокойном состоянии воздуха на площадь 100 см2 оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Определив площадь питательной среды в чашке и зная количество выросших на ней колоний микробов, рассчитывают количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м3 воздуха. Пример. Пусть в чашке Петри диаметром 10 см выросло 25 колоний бактерий. Тогда площадь питательной среды равна r2: 3,14х52=78,5 см2. Если на площадь 78,5 см2 за 5 мин осело 25 микробных клеток, то за это же время на площадь 100 см2 осело бы микробов: 78,5 см2 – л 25 100 см2 – Х Х = 25 х 100 / 78,5 = 32 Таким образом, за 5 мин на площадь 100 см2 осело бы 32 микробных клетки из 10 л воздуха. Чтобы узнать количество бактерий, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха, составим пропорцию: 10 л – 32 микроба 1000 л – Х Х = 32 1000 / 10 = 3200 Следовательно, в 1 м3 воздуха содержится 3200 бактерий. По данным всей группы составляется таблица «Микрофлора воздуха в лаборатории». Содержание отчета 1. Указать место отбора пробы воздуха. 59 2. Количество микроорганизмов в данной пробе, кл/м3. 3. Таблица «Микрофлора воздуха в лаборатории». Контрольные вопросы 1. Что характеризует микрофлору воздуха? 2. Как определить микробную загрязненность воздуха? Работа 6. Исследование микрофлоры воды Теоретическое введение В промышленной микробиологии вода играет очень большую роль: она употребляется для приготовления питательных сред в лабораториях и ферментерах, для мойки аппаратуры и трубопроводов. Вода различных водоемов представляет собой естественную среду, где бактерии, грибы, простейшие и другие микроорганизмы могут развиваться в значительных количествах. Главным фактором, определяющим наличие микроорганизмов в воде, является присутствие в ней питательных элементов в виде остатков растений и животных, растворенных органических и минеральных веществ. Чем больше в воде органических веществ, тем большее количество микробов содержится в ней. Источники загрязнения водоемов – поверхностные стоки с площади водосбора. В этих стоках содержится почвенная микрофлора, а также микрофлора сточных вод хозяйственнобытового и промышленного происхождения. В зависимости от источников загрязнения водоемов состав их микрофлоры сильно различается. В воде могут находиться как типичные почвенные сапрофиты, так и приспособившиеся к условиям обитания специфические водные микроорганизмы, а также патогенные виды. Наиболее чистой является вода из артезианских скважин и ключей. В самом источнике она может быть почти стерильной, но при дальнейшем прохождении по трубам загрязняется. Глубокие почвенные воды чище поверхностных, так как фильтруясь через слои почвы, они освобождаются от взвесей и микробов. Микробы 60 обнаруживаются и в водопроводной воде, но количество их зависит от источника водоснабжения и от способов очистки воды. Водопроводная вода должна удовлетворять требованиям ГОСТа на воду хозяйственно-питьевого и промышленного водоснабжения. Бактериологический анализ воды проводят чаще всего путем высева определенного объема воды на плотные питательные среды. Метод прямого счета бактерий в воде применяется довольно редко. Бактериологическое исследование воды производят с целью: 1) определения качества воды по критерию общего числа микробов в 1 мл воды; 2) обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов, т.е. бактерий, служащих показателем фекального загрязнения воды; 3) обнаружения в воде патогенных микробов, их токсинов и бактериофагов. Важной частью исследования является взятие проб воды. Пробы воды для исследования берут в стерильную посуду. Из открытых водоемов пробы берут с помощью батометра. При взятии проб из водопровода кран предварительно протирают тампоном, смоченным спиртом, а затем обжигают пламенем. После стерилизации кран полностью открывают, застоявшуюся в трубах воду выпускают в течение 10–15 минут, а затем отбирают пробы в стерильные флаконы. Исследование воды проводится немедленно после взятия или не позднее 2–6 часов с момента взятия проб, при условиях хранения при температуре 1–5оС. Обнаружение в пробах воды патогенных микроорганизмов обычно связано с большими трудностями и не всегда дает надежный результат. В связи с этим принято использовать косвенные показатели возможного инфицирования воды патогенными микроорганизмами, определяя количество санитарнопоказательных микроорганизмов (СПМ). К СПМ относят представителей нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, обитающих в кишечнике или воздушнодыхательных путях. К СПМ относятся представители разных систематических групп бактерий. Наиболее важными СПМ во всем 61 мире считаются бактерии группы кишечной палочки (БГКП) Наличие СПМ в воде указывает на зараженность ее экскрементами человека или теплокровных животных и на возможное присутствие в ней других бактерий кишечной группы, в том числе патогенных (возбудителей холеры, дизентерии, брюшного тифа). По количеству БГКП в пробе судят о возможности патогенного загрязнении водоема, которое оценивают по двум показателям – коли-титр и коли-индекс. Коли-титром называется минимальное количество воды в миллилитрах, в котором обнаруживается БГКП. Коли-индекс – это количество БГКП, которое содержится в 1 литре исследуемой воды. Определение общего микробного числа Для определения общего микробного числа из взятых проб в стерильных условиях делают посев на плотные питательные среды 1–0,1 мл воды. Если имеется подозрение на большую бактериальную загрязненность, то пробы воды разводят в десятикратных отношениях. Разведение воды делают обычно не больше, чем 1:1000. Разведение подбирают из расчета получения на чашках от 30 до 300 колоний. Общая обсемененность («общее микробное число») определяется по количеству колоний микроорганизмов, выросших на МПА при глубинном посеве на чашку Петри 1 мл воды. Считается, что общее количество бактерий при посеве 1 мл неразбавленной воды должно быть не более 100. Вода, содержащая от 100 до 500 бактерий в 1 мл, считается сомнительной, а выше 500 – непригодной для питья. Такую воду необходимо дополнительно обеззараживать или кипятить перед употреблением. Практическая часть Цель работы – определить общее микробное число водопроводной воды и воды открытых водоемов загрязненность в пробах, принесенных студентами из разных мест Москвы и Подмосковья. Для определения общего количества микробов пробы воды студенты отбирают в день занятий в стерильные пробирки. 62 Порядок выполнения работы Часть 1 1. В зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемую воду развести стерильной водой. Обычно делают десятикратные разведения от 1:10 до 1:100. 2. Произвести посев 1 мл неразведенной водопроводной воды или 1 мл разведенной воды из естественного водоема. Для этого исследуемую воду в объеме 1 мл из соответствующего разведения, начиная с большего, вносят в стерильные чашки Петри (не менее двух) и заливают 15 мл расплавленного и остуженного до 45оС мясо-пептонного агара. 3. Плавными движениями чашки по столу равномерно перемешать содержимое и оставить на столе до застывания агара. 4. Затем чашки с застывшей питательной средой поместить дном кверху в термостат; при этом одну чашку поместить в термостат при температуре 37оС на 24 часа, а вторую – оставить при комнатной температуре на 48 часов. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. После проращивания микробов произвести подсчет выросших колоний с помощью лупы, отмечая каждую колонию на дне чашки маркером. Количество выросших колоний соответствует количеству микроорганизмов в засеянном объеме воды с соответствующего разведения. 2. Вычислить показатель общего микробного числа воды, выражаемого средним арифметическим от количества выросших колоний. Для этого по каждому посеву следует сосчитать количество колоний, выросших в каждой чашке, и умножить на соответствующее разведение. Результаты, подсчитанные по отдельным чашкам, сложить и затем разделить на количество засеянных чашек. Полученное число и будет являться показателем общего микробного числа воды. Водопроводная вода должна иметь микробное число, не превышающее 100. 63 3. По данным всей группы студенты составляют таблицу «Микрофлора воды в Москве и Подмосковье». Контрольные вопросы 1. С какой целью проводят бактериологическое обследование воды? 2. Как отбирают пробы воды? 3. Как проводят определение общего микробного числа воды? 4. Какие микроорганизмы служат показателем санитарного состояния воды и почему? Работа 7. Исследование микрофлоры почвы Теоретическое введение Почвой называют поверхностный слой суши, которая образуется из горных пород под воздействием воды, воздуха и живых организмов (биоты). Этот небольшой слой суши обладает неоценимым свойством – плодородия и имеет громадное значение для функционирования наземных экосистем и биосферы в целом. Ключевая роль в этих процессах принадлежит микроорганизмам. Они расщепляют мертвую органическую биомассу, участвуют в глобальных циклах элементов (С, N, S, P и Ca), поддерживают газовый состав атмосферы, обеспечивают чистоту поверхностных и грунтовых вод и разлагают ксенобиотики. Важнейшее свойство почвы – плодородие напрямую зависит от деятельности почвенных микроорганизмов по разложению органо-минерального комплекса почвы и сохранению питательных ресурсов в пределах экосистемы. Биота поставляет растениям минеральные ресурсы, которые образуются в процессе минерализации органического вещества. Те питательные вещества, которые в данный момент не используются растениями и могут быть потеряны посредством вымывания (выноса) водными потоками, связываются почвенной биотой и временно переходят в ее биомассу. Этот процесс называется иммобилизацией ресурсов. Затем эти ресурсы снова поступают в среду в результате отмирания биоты и действия хищников. В ненарушенных экосистемах процессы минерализации и иммобилизации тесно связаны с жизнью 64 растений, и таким образом обеспечивается устойчивое состояние экосистемы. Особенностью почвы для обитания микроорганизмов является ее гетерогенность, поскольку в почве имеются твердая фаза (почвенные частицы), жидкая фаза (почвенная вода) и газообразная фаза (почвенный воздух). Жизнедеятельность микроорганизмов в почве осуществляется в основном на почвенных частицах, поверхность которых может составлять несколько десятков метров в 1 г почвы. Фактически в почве «работают» иммобилизованные клетки и ферменты. Почва является благоприятной средой для развития различных групп микроорганизмов – бактерий, грибов, простейших, водорослей. Почвенный раствор представляет собой комплекс разнообразных органических, минеральных веществ и газов, содержание которых зависит от типа почвы, количества осадков, температуры и других факторов. В почве активно протекают процессы разложения органических веществ, либо до конечных продуктов (CO2, H2O, NH3, H2S), либо до промежуточных – органических кислот, аминокислот, спиртов. Эти процессы проводятся при участии различных физиологических групп микроорганизмов – аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих, целлюлозоразрушающих и других. Одновременно с разложением органических веществ в почве происходят синтетические процессы. В почве обитает большое количество автотрофных микроорганизмов, способных синтезировать органические вещества, используя СО2. К ним относятся фотоавтофторы (водоросли и фотоавтотрофные бактерии) и хемоавтотрофы (серобактерии, железобактерии, водород- и метаноокисляющие бактерии). Таким образом, почвенные микроорганизмы оказывают большое влияние на жизнь растений, а тем самым на животных и человека, являясь одним из обязательных звеньев общей экологической системы. Знание количества микроорганизмов, населяющих почву, в том числе отдельных физиологических групп, и оценка процессов, 65 осуществляемых ими, необходимы для понимания роли микроорганизмов в природе. В основе выделения и определения численности представителей отдельных групп микроорганизмов лежит получение накопительных культур с помощью создания элективных условий. Накопительными называют такие культуры, в которых преобладают представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов. Элективными называют условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенной группы микроорганизмов. При создании элективных условий учитывают особенности физиологии и обмена веществ микроорганизмов: требования их к источникам питания, отношение к кислотности среды, аэрации, температуре, способность к образованию спор и др. Элективные условия не всегда оптимальны для роста учитываемых микроорганизмов, но они все же лучше переносятся ими, чем микроорганизмами сопутствующих форм. Количество бактерий в почвах богатых органическими веществами достигает иногда нескольких десятков миллиардов в 1 г, грибов – сотни и тысячи миллионов, количество актиномицетов на порядок меньше – до 10 млн. Водорослей и простейших – несколько сотен тысяч в 1 г почвы. Подавляющее большинство почвенных микроорганизмов являются сапрофитами. Лишь незначительное количество их относится к патогенным видам. Они попадают в почву с выделениями больных людей и животных и могут сохраняться в почве длительное время, особенно споровые формы патогенных микроорганизмов (ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы и др.). Поэтому качественный и количественный состав микрофлоры определяет не только ее плодородие, но и ее изменение под действием антропогенных факторов и санитарногигиеническое состояние. Микробиологи выделяют из почвы штаммы-продуценты для различных биотехнологических производств. 66 Отбор проб Для микробиологического исследования почву берут в стерильные мешочки из синтетической ткани или стеклянные банки с притертой пробкой. В полиэтиленовых мешочках нельзя хранить пробы более суток, т.к. в них создается особый газовый режим. С площади 25 м2 отбирают несколько проб из различных мест на глубине 10 – 30 см по 100 – 200 г. Общий вес пробы должен быть не менее 1 кг. Пробы берут с помощью стерильной ложки или ножа. Из глубины пробы отбирают специальным буром. Анализы необходимо произвести в течение 24 часов. При невозможности проведения анализа в первые сутки пробу необходимо высушить. Иногда проводят замораживание образцов. Подготовка почвы к микробиологическим анализам Для правильного учета количества микрофлоры в почве необходимо провести предварительную подготовку образца. Обычно применяют 10-минутное перемешивание почвенной суспензии в колбе с водой. Более тщательные исследования можно выполнить, если добиться того, чтобы микроорганизмы в суспензии находились в виде одиночных клеток. Для этого необходимо провести диспергирование образца, которое можно выполнить различными способами: растиранием увлажненной почвы, измельчением ее в гомогенизаторе. При изучении микрофлоры почвы следует помнить, что количественные показатели содержания микроорганизмов сильно зависят от метода исследования. Прямые методы подсчета клеток на окрашенных препаратах дают цифры в сотни раз большие, чем при посеве на питательные среды. Во-первых, на препаратах окрашиваются и живые и мертвые клетки. Во-вторых, чтобы учесть все микроорганизмы разных групп, необходимы высевы на разные питательные среды, подходящие для данной группы. Чаще всего определяется общее количество бактерий. В большинстве случаев для изучения и учета почвенных микроорганизмов проводится посев на чашки Петри. При этом можно использовать один и тот же метод для изучения разных групп микроорганизмов – бактерий, актиномицетов, грибов и 67 дрожжей. Однако для выделения разных групп микробов применяются разные питательные среды. Среда Чапека – для грибов и актиномицетов (в г/л дистиллированной воды): глюкоза или сахароза – 20,0; NaNO3 – 2,0; K2HPO4 – 1,0; KCl – 0,5; MgSO4 – 0,5; CaCO3 – 3,0; FeSO4 – 0,01; агар – 20,0. Крахмало-казеиновая среда – для актиномицетов (в г/л): крахмал – 10,0; казеин –0,3; K2HPO4 – 2,0; MgSO4 – 0,05; NaCl – 2,0; KNO3 – 2,0; CaCО3 – 0,02; агар – 20,0. Мясо–пептонный агар (МПА) – для бактерий. Выпускается в виде сухой питательной среды или приготовляется из мясопептонного бульона с добавлением в него агара (20 г/л). МПА – богатая питательными веществами среда, на которой развиваются многие гетеротрофные микроорганизмы. При высеве на МПА выраcтают микроорганизмы различных систематических и физиологических групп: грамотрицательные, не образующие эндоспор бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium и Achromobacter, грамположительные спорообразующие палочки рода Bacillus, кокки родов Micrococcus и Sarcina, различные микобактерии (род Mycobacterium), некоторые актиномицеты и мицелиальные грибы (род Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Alternaria и др.). Актиномицеты играют большую роль в процессах почвообразования и создания плодородия почв. Актиномицеты разрушают сложные органические соединения (целлюлозу, гумус, хитин, лигнин и др.), недоступные многим другим микроорганизмам. Почти все виды рода Streptomyces образуют специфические продукты жизнедеятельности, обладающие антибиотическими свойствами. Некоторые виды являются возбудителями заболеваний растений, животных и человека. Виды рода Streptomyces имеют хорошо развитый мицелий, нити которого не септированы и не расчленяются с возрастом на палочки и кокки. Диаметр мицелия 0,1–1,5 мкм. На плотных агаризованных средах актиномицеты образуют плотные кожистые колонии – гладкие, бугристые, складчатые, бородавчатые, плоские, пленчато-морщинистые. Колонии 68 срастаются с субстратом при помощи субстратного мицелия – нитей отходящих от нижней поверхности колоний и развивающихся в толще среды. На воздушном мицелии актиномицетов образуются органы спороношения – спороносцы разнообразной формы (прямые, извитые, спиральные). Выявление и учет численности видов рода Streptomyces проводят высевом исследуемого материала на среду Чапека или крахмало-казеиновый агар. Среда Чапека и крахмало-казеиновый агар не элективны для актиномицетов. На этих средах хорошо растут не только актиномицеты, но и многие бактерии. Однако актиномицеты легко отличаются от других микроорганизмов характерными плотными компактными колониями, имеющими мицелиальное строение и срастающимися с субстратом. Для ограничения роста грибов и бактерий в питательную среду добавляют антибиотики. Практическая часть Цель работы – определить количество бактерий и актиномицетов в образцах почвы, принесенных студентами. Для посева необходимо подготовить на каждый почвенный образец следующее: 1) 100 мл стерильной воды в колбе объемом 250 мл; 2) пробирки со стерильной водой по 10 мл для приготовления разведений; 3) стерильные пипетки на 1 мл, учитывая, что для каждого разведения нужна другая пипетка; 4) стерильные чашки Петри; 5) стерильные питательные среды. Порядок выполнения работы Часть 1 1. Навеску почвы 10 г увлажнить до пастообразного состояния, растереть пальцем в резиновой перчатке и внести в колбу с 90 мл стерильной водопроводной воды. Содержимое колбы энергично взболтать в течение 5–10 мин до получения равномерной взвеси. 69 2. Почвенную суспензию разбавить, пользуясь методом серийных разведений (рис. 21). Для этого после полуторадвухминутного отстаивания из приготовленной взвеси (1:10) стерильной пипеткой берут 1 мл болтушки и вносят в пробирку с 9 мл стерильной воды. Получают разведение 1:100. После хорошего перемешивания в течение 1 мин и отстаивания в течение 30 сек из пробирки берут 1 мл взвеси стерильной пипеткой и переносят во вторую пробирку с 9 мл стерильной воды. Получают разведение 1:1000. Аналогичным образом переносят 1 мл взвеси из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д., получая нужные десятикратные разведения. Обычно готовят разведения до 1:1000000. Для приготовления очередного разведения используется новая стерильная пипетка. 3. Из 3-го и 4-го разведений перенести по 1 мл пробы в пустые стерильные чашки Петри, предварительно обозначив на них разведение. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений в зависимости от предполагаемого содержания микробов в почве. Из каждого разведения должен быть сделан посев минимум в две чашки. Перед посевом содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают. 4. Подготовленные разведения залить 20 мл расплавленной и остуженной до 45 ОС крахмало-аммиачной среды или среды Чапека. 5. Из 5-го и 6-го разведения аналогичным образом внести по 1 мл в пустые чашки Петри и залить 20 мл расплавленного и остуженного до 45 ОС мясо-пептонного агара. 6. Осторожными круговыми движениями чашки по столу перемешать почвенную суспензию с питательной средой. 7. После застывания среды чашки помещают вверх дном в термостат с температурой 30– 35оС на 34–48 часов, а затем выдерживают 1–2 суток при комнатной температуре. На крышке чашки предварительно указывается номер группы, фамилия студента и степень разведения почвенной взвеси. После застывания среды чашки кверху дном завернуть в бумагу, надписать и поставить в термостат. Температура культивирования 28–30оС. Продолжительность выращивания – 8–10 суток. 70 Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. Определить количество бактерий, содержащихся в 1 г почвы, по количеству выросших в чашке колоний. Для подсчета необходимо брать такие разведения, при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. Чашки с количеством колоний менее 50 считаются недостоверными. При большом количестве выросших колоний (более 150) производят подсчет на ¼ чашки с последующим пересчетом на всю ее площадь. Из суммы колоний, выросших на двух чашках, выводят среднеарифметическое число и 71 производят пересчет на число бактерий, содержащихся в 1 г почвы. Для этого среднее число колоний, выросших на чашках соответствующего разведения, умножают на степень разведения. Пример. В чашках, засеянных почвенной суспензией из разведения 1:10000, выросло в среднем 60 колоний. 60 10000 = 600000 бактерий содержится в 1 г почвы. Удобнее выражать такие большие величины в виде 10n. В нашем примере 600000 = 6 ∙ 105. 2. Все результаты подсчетов колоний и последующих пересчетов заносят в табл. 1. Таблица 1. Численность колоний бактерий, выросших на МПА Разведение Повторность. (№№ чашек) 1:105 1 2 1 2 1:106 Кол-во колоний на чашке Кол-во микроорганизмов в 1 г почвы Описание колоний. Дать описание и зарисовки преобладающих, а также наиболее интересных колоний. Результаты наблюдений заносят в табл. 2. Таблица 2. Признаки колоний бактерий, выросших на МПА №№ колоний Форма Диаметр, мм Цвет Блеск, Харакпрозрачтер ность поверхности Профиль Рисунок колонии 1 2 3 3. Из колоний преобладающих микроорганизмов приготовить препараты и просмотреть их под микроскопом с объективом 40Х. Отметить форму клеток и их сочетаний, подвижность, наличие или отсутствие спор. Микроскопическую картину зарисовать. Все результаты наблюдений и рисунки занести в табл. 3. 72 Таблица 3. Некоторые особенности морфологии клеток бактерий, выросших на МПА №№ колоний Микроскопическая картина (рисунок) Форма клеток Сочетание клеток Подвижность Наличие спор 1 2 3 4. Подсчитать количество колоний актиномицетов в каждой чашке Петри. 5. Вычислить количество актиномицетов в 1 г почвы. 6. Результаты занести в табл. 4. Таблица 4. Численность колоний актиномицетов на среде Чапека или крахмало-казеиновом агаре Разведение Повторность. (№№ чашек) 1:103 1 2 1 2 1:104 Кол-во колоний на чашке Кол-во актиномицетов в 1 г почвы Мелкие колонии, чтобы отличить их от колоний других микроорганизмов, просматривают на чашках под микроскопом при малом увеличении или в стереоскопический микроскоп. Для исследования формы спор и спороносцев у актиномицетов пользуются методом «отпечатков». Для этого из агаризованной среды в чашке Петри вырезают скальпелем небольшой участок с колонией и переносят его на предметное стекло. Затем к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают петлей и снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Это покровное стекло с отпечатком помещают в каплю воды на предметное стекло и рассматривают под микроскопом. Описание внешнего вида колоний актиномицетов и форм спор и спороносцев занести в табл. 5 и зарисовать. 73 Таблица 5. Внешний вид колоний актиномицетов на среде Чапека или крахмало-казеиновом агаре № Размер, ПоверхЦвет мицелия колонии мм ность Воздуш- Субстратного ного Выделение пигмента в среду Рисунок спор и спороносцев 1 2 3 Контрольные вопросы 1. Какую роль выполняют почвенные микроорганизмы? 2. Какие группы микроорганизмов обитают в почве? 3. Как производится отбор образцов почвы для микробиологических исследований? 4. Как проводится предварительная подготовка образцов почвы для посева? 5. Как определить общее количество бактерий в почве? 6. Охарактеризуйте морфологические особенности актиномицетов. РАЗДЕЛ II. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Промышленная микробиология является основой биотехнологии, которая использует биохимическую деятельность клеток или их ферментных систем. Промышленная микробиология изучает микроорганизмы, применяемые для получения полезных для человека продуктов. Это прежде всего производство пищевых продуктов: молочнокислых, алкогольных, хлебопродуктов и др. На жизнедеятельности микроорганизмов основаны некоторые отрасли химической промышленности: получение спиртов, органических кислот, органических растворителей. Особенно широкое применение микроорганизмы нашли в фармацевтической промышленности: в производстве антибиотиков, витаминов, стероидных препаратов. Около 40% всех продуктов экономики имеет биологическую природу. Производство ряда продуктов полностью базируются на микробном синтезе. Некоторые производства включают отдельные 74 микробиологические стадии как обязательные стадии общего процесса (сыроделие, виноделие, хлебопечение, синтез витамина С и др.). Микробы производят как сложные белковые продукты – биомассу, ферменты, азотные бактериальные удобрения, так и простые – ацетон, бутиловый и этиловый спирт, органические кислоты, аминокислоты. Некоторые уникальные вещества сложного строения синтезируются только микроорганизмами – многие антибиотики, витамин В12. В связи с истощением запасов углеводородного сырья и ростом цен на него получение целого ряда продуктов биотехнологии из возобновляемого сырья становится все более перспективным. С помощью микроорганизмов получают дополнительные источники энергии в виде биогаза, этанола, водорода за счет использования ими отходов промышленности и сельского хозяйства, а также солнечной энергии. Микроорганизмы используются при добыче нефти, угля, урана, цветных металлов и золота. Это новое направление называют биогеотехнологией. ТЕМА 5. Получение органических кислот Микробиологическим способом из углеводов, спиртов или углеводородов можно получить различные органические кислоты – уксусную, лимонную, молочную, янтарную, итаконовую, фумаровую, глюконовую, α-кетоглутаровую и др. Продуцентами этих кислот могут быть бактерии, плесневые грибы и дрожжи. Современное производство органических кислот, существующее в большинстве промышленно развитых стран, основано, главным образом, на использовании в качестве продуцентов различных штаммов плесневых грибов, чаще всего Aspergillus niger. Источником углерода в этих процессах являются углеводы – кристаллическая сахароза и глюкоза, свекловичная и тростниковая меласса, гидролизаты древесины, крахмалсодержащее сырье. Микробиологические способы получения органических кислот основаны на неполном окислении соединений углерода в 75 аэробных условиях. Исключением является молочная кислота, которую получают в результате молочнокислого брожения. Продуценты уксусной, лимонной, глюконовой, фумаровой и ряда других органических кислот являются аэробами, и образование кислот осуществляется ими в условиях интенсивной аэрации. Указанные кислоты являются промежуточными продуктами метаболизма источника углерода, полученными в цикле трикарбоновых кислот. С помощью микроорганизмов можно получить более 50 различных кислот. В промышленных масштабах микробиологическим путем получают 6 кислот – лимонную, итаконовую, уксусную, молочную, глюконовую, 2-кетоглюконовую. Работа 8. Получение лимонной кислоты в культуре плесневого гриба Aspergillus niger Теоретическое введение При выполнении задачи студенты знакомятся с культивированием и биохимической активностью плесневых грибов. Плесневые грибы обладают разнообразными ферментами, могут осуществлять различные биохимические превращения и поэтому широко применяются в промышленном производстве ряда веществ, в частности органических кислот. Активным продуцентом лимонной кислоты является гриб Аspergillus niger. Лимонная кислота – это трикарбоновая оксикислота, содержащая 6 атомов углерода: СH2 – COOH | C6H8O7·H2O HO – С – COOH | СH2 – COOH Лимонная кислота входит в состав фруктов – лимонов, клюквы и смородины. Ее широко используют в пищевой промышленности для производства напитков и кондитерских изделий, в химической промышленности для изготовления фотоэмульсий, для окраски тканей, при производстве лаков. 76 Лимонная кислота – прекрасный хелатирующий (комплексообразующий) агент, что позволяет использовать ее в процессах электрогальванизации, дубления кож, приготовления чернил, изготовления синтетических моющих средств. Она используется в фармацевтической промышленности, в том числе при переливании крови. Образование лимонной кислоты в культурах Аspergillus niger происходит в результате окисления сахара кислородом воздуха. Раньше для получения лимонной кислоты в качестве основного сырья была сахароза. Теперь лимонную кислоту получают из мелассы, которая является отходом сахарного производства. Грибы окисляют сахар не полностью – до СО2 и Н2О, а лишь частично, в результате чего сахар превращается в лимонную кислоту. Лимонная кислота образуется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) через ряд промежуточных стадий. Суммарно он может быть выражен уравнением: С6Н12О6 + 1,5 О2 = С6Н8О7 + 2Н2О + Q кДж Лимонная кислота – это обычный метаболит ЦТК, и в небольшом количестве она присутствует в клетках разных микроорганизмов. Некоторые грибы (в первую очередь Аspergillus niger) имеют способность к сверхсинтезу этой кислоты. Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста продуцентов минеральными компонентами (Fe, Mn, N, P, S) среды и одновременном избыточном содержании источника углерода. После полного поглощения из среды дефицитного элемента продуцент прекращает рост, но продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая затем выделяется в среду. 77 Практическая часть Цель работы – ознакомление с процессом образования лимонной кислоты при выращивании плесневого гриба Аspergillus niger. В предлагаемой задаче проводится выращивание культуры гриба Аspergillus niger на среде с сахаром и определение количества образовавшейся лимонной кислоты. Для культивирования применяется среда следующего состав: сахароза – 150 г NH4NO3 – 2,3 г KH2PO4 – 0,2 г MgSO4 · 7H2O – 1,0 г ZnSO4 – 0,013 г FeSO4 · 7H2O – 0,006 г вода водопроводная – 1 л рН 6,6 – 7,0 В качестве источника углерода здесь использована сахароза. Источником азота служит азотнокислый аммоний. Кроме того, вводятся фосфор, сера, магний и микроэлементы: железо, цинк. Надо иметь ввиду, что в водопроводной воде, которая используется для приготовления питательной среды, всегда содержатся неконтролируемые примеси различных элементов, которые, несмотря на их незначительные количества, могут оказывать заметное влияние на развитие Аspergillus niger. Порядок выполнения работы Часть 1 1. С поверхности косяка с культурой Аspergillus niger снять петлей часть темного конидиального слоя, перенести в колбу со стерильной средой, осторожно перемешать, чтобы конидии распределились по поверхности среды. 2. В стерильной среде определить начальное значение рН при помощи рН-метра. 78 3. Записать дату постановки опыта, название культуры, состав среды, величину рН. 4. Посевы поместить в термостат с температурой 300С на 7 суток. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. По окончании выращивания описать картину роста культуры (форма грибной пленки, цвет пленки, цвет культуральной жидкости). Следует отметить, что используемый в задаче штамм Аspergillus niger при развитии на сусло-агаре (например, в посевной культуре на сусло-агаровых косяках) дает большое количество конидий, которые образуют темный слой на поверхности мицелия. При развитии же на жидкой синтетической среде конидий почти не образуется, поэтому мицелиальная пленка обычно имеет белую поверхность, и только в отдельных ее участках можно увидеть немногочисленные конидиальные головки. 2. Культуральную жидкость отделить от мицелия фильтрованием через бумажный фильтр 3. Измерить рН фильтрата при помощи рН-метра. 4. Определить процентное содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости. 5. Рассчитать выход кислоты в процентах от исходного сахара(т.е. количество граммов кислоты на каждые 100 г сахара, введенного в среду). Методика определения содержания лимонной кислоты в культуральной жидкости Определение содержания лимонной кислоты производится путем титрования щелочью: 2 мл фильтрата помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 3–4 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н NaOH до слаборозовой окраски. Полученную величину общей кислотности среды пересчитывают на лимонную кислоту. При этом учитывают, что лимонная кислота является трехосновной и ее молекулярный вес равен 210. Следовательно, 1 грамм-эквивалент лимонной кислоты равен 79 210 : 3 = 70 г, и 1 мл 0,1 н раствора NaOH соответствует 0,007 г лимонной кислоты. Процентное содержание лимонной кислоты рассчитывается по формуле: Х 0,007 B K 100 (%), где A А – объем пробы культуральной жидкости, взятой для титрования, мл; В – число миллилитров раствора NaOH, пошедшего на титрование; К – поправка щелочи. Содержание отчета Дата проведения опыта. Название культуры. Состав среды. Возраст культуры в конце опыта. Описание роста культуры: форма грибной пленки, цвет пленки с верхней и нижней стороны, цвет культуральной жидкости. 6. рН среды: в исходной среде, в конце опыта. 7. Расчет количества лимонной кислоты: объем пробы для титрования; объем 0,1 н NaOH, пошедшего на титрование; процентное содержание лимонной кислоты культуральной жидкости (расчет по формуле). 8. Выход лимонной кислоты в процентах от исходного сахара. 1. 2. 3. 4. 5. в Контрольные вопросы 1. Применение лимонной кислоты. 2. Какой микроорганизм является кислоты? 80 продуцентом лимонной 3. Из какого вещества образуется лимонная кислота? Суммарное уравнение процесса. 4. Как производится выращивание Аspergillus niger? Работа 9. Получение пищевой уксусной кислоты при окислении этилового спирта уксуснокислыми бактериями Теоретическое введение В качестве сырья для получения пищевого уксуса используют виноградное или яблочное вино, сброженные соки различных фруктов и ягод или водный раствор этилового спирта. Спиртовой уксус получают в большем масштабе, чем винный. Уксус содержит кроме уксусной кислоты (6–9%) незначительное количество сложных эфиров, придающих ему особый вкус и приятный аромат, чего лишена уксусная кислота, получаемая химическим путем. Уксусную кислоту используют как в пищевой промышленности, так и для растворения органических красителей, производства медикаментов, пластмасс, синтетических волокон. Для получения пищевой уксусной кислоты используется способность уксуснокислых бактерий окислять этиловый спирт до уксусной кислоты. Этот сложный многоступенчатый процесс выражается суммарным уравнением: СН3СН2ОН + О2 = СН3 СООН + Н2О + 490 кДж. Типичным представителем уксуснокислых бактерий является Acetobacter aceti. Это мелкие бесспоровые грамотрицательные палочки, часто соединенные в цепочки. Спиртовой уксус получают путем периодического или непрерывного культивирования уксуснокислых бактерий на поверхности древесных стружек (буковых), которыми заполнены производственные аппараты различной конструкции, или в глубинных условиях в ферментерах с интенсивным массообменом. Наиболее производительными являются непрерывный глубинный способ, разработанный П.И.Николаевым с сотрудниками. Технологическая схема представляет собой батарею из 4–5 последовательно соединенных ферментеров. В первый ферментер непрерывно поступает питательная среда, содержащая раствор 81 спирта и минеральных солей, а из последнего ферментера непрерывно вытекает готовый 9% уксус. Концентрация уксусной кислоты от первого ферментера к последнему постепенно возрастает, а спирта – снижается. При производственном культивировании в глубинных условиях необходимо бесперебойное аэрирование, так как кратковременные перерывы в подаче воздуха приводят к гибели культуры. При недостатке спирта в среде накопления уксусная кислота переокисляется до конечных продуктов: СО2 и Н2О. Практическая часть Цель работы – изучение способности уксуснокислых бактерий Acetobacter aceti окислять этиловый спирт в уксусную кислоту. Для выращивания Acetobacter aceti используется минеральная среда Лойцянской состава, г/л: (NH4)2HPO4 – 1,0 KH2PO4 – 0,5 MgSO4 –0,5 Источником углерода служит этиловый спирт, который добавляется ежедневно в количестве 0,2–0,5 %. Выращивание уксусно-кислых бактерий можно проводить, осуществляя «воздушное» питание этанолом, например, поставить колбы с культурой Acetobacter aceti в эксикатор, поместив в него сосуд с этиловым спиртом. Среда разливается тонким слоем в конические колбы с ватными пробками. Для засева используется двух- трехсуточная культура Acetobacter aceti на жидкой среде. Выращивание ведется при t 30oС в течение 5–7 суток. В конце опыта определяется количество образовавшейся уксусной кислоты. Порядок выполнения работы 1. В колбы со стерильной средой внести 0,5 мл посевного материала, добавить 2–3 капли этилового спирта, поставить в термостат на 30о. 82 2. Определить рН в стерильной среде при помощи рН-метра. 3. По окончании выращивания Acetobacter aceti описать культуральные признаки (наличие пленки, ее вид, осадок и т.д.) и микроскопическую картину (форма, размер бактерий, подвижность). 4. Определить рН культуральной жидкости при помощи рНметра. 5. Определить количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах. Метод определения содержания уксусной кислоты 10 мл фильтрата культуральной жидкости перенести пипеткой в плоскодонную коническую колбу на 100–200 мл воды и 2–3 капли фенолфталеина, титровать 0,1 н раствором NaOH до слаборозовой неисчезающей окраски. Количество образовавшейся уксусной кислоты вычисляется по формуле: X 0,006 a k 100 (%), где v а – объем 0,1 н раствора NaOH, пошедшего на титрование в миллилитрах; v – объем культуральной жидкости, взятой для титрования в миллилитрах; k – поправка щелочи; 0,006 – количество граммов уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора NaOH. Содержание отчета 1. 2. 3. 4. 5. Дата проведения опыта. Название культуры. Состав среды. Возраст среды. Описание культуры: а) цвет, вид пленки, наличие осадка, запах культуральной жидкости (отметить характерный запах уксусной кислоты); 83 б) микроскопическая картина. 6. рН среды в начале и в конце опыта. 7. Количество образовавшейся уксусной кислоты. Контрольные вопросы 1. Назовите способы получения уксусной кислоты. 2. Какой микроорганизм является продуцентом уксусной кислоты? Каковы его свойства? 3. Из какого вещества образуется уксусная кислота? Напишите суммарное уравнение процесса. 4. Как производится выращивание Acetobacter aceti? ТЕМА 6. Получение биологически активных веществ микробных клеток Работа 10. Изучение антибиотической активности микроорганизмов Теоретическое введение Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности организмов, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов, задерживая их рост или полностью подавляя их развитие. По химическому строению это органические соединения разнообразной природы: алифатические, алициклические (тетрациклины), азотсодержащие гетероциклические (пенициллин и его производные), макролиды, полипептиды и др. Специфичность этих продуктов обмена состоит в том, что для подавления роста микробов достаточно ничтожных концентраций антибиотика, а также в том, что они обладают избирательностью биологического действия. Антибиотики синтезируются живыми клетками не только микроорганизмов, но и высшими растениями и животными. В мире микробов антибиотические вещества распространены очень широко. Их образуют представители разных групп микроорганизмов: актиномицеты, бактерии, плесневые грибы, водоросли. Применение антибиотиков в настоящее время не ограничивается областью медицины. Антибиотики используются в 84 качестве добавки в корм животных для более полного его усвоения, для лечения заболеваний растений, для предотвращения инфицирования в бродильной, консервной и других отраслях промышленности. Применение в немедицинских целях составляет половину всех производимых антибиотиков. В пищевой промышленности используются антибиотики, не применяемые в медицине. Промышленное получение антибиотиков основано главным образом на применении мицелиальных грибов и бактерий, в основном родов Streptomyces и Bacillus. Антибиотики принадлежат к группе микробных продуктов, которые называются вторичными метаболитами, поскольку их синтез не напрямую связан с ростом микроорганизмов (рис. 22). Максимальное накопление антибиотиков происходит в фазе замедленного роста или стационарной фазе развития культуры – продуцента. Клетки микроорганизмов чаще всего выделяют антибиотики в среду. Обычно в культуральной среде накапливается 1–5 % антибиотиков. До настоящего времени в производстве антибиотиков преобладает периодический метод культивирования. Все микроорганизмы, используемые для производства антибиотиков, являются аэробами и выращиваются в условиях интенсивной аэрации и перемешивания. Производство антибиотиков путем микробиологического синтеза и состоит из следующих стадий: ферментации, фильтрования, выделения и очистки и приготовление лекарственной формы. Среды для ферментации содержат углеводы, источник азота (соевая мука, кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат или пептон), углекислый кальций (регулятор рН), минеральные соли и пеногаситель. 85 Понятно, что при выращивании продуцента антибиотика в такой богатой питательной среде необходимо тщательно соблюдать требования стерильности, так как заражение среды посторонними микроорганизмами может снизить выход антибиотика. В процессе производства требуется определять содержание антибиотика в культуральной жидкости в ходе ферментации, во всех промежуточных продуктах при выделении и очистки и в готовых препаратах. Для этого применяют биологические и химические методы. Преимуществом микробиологических методов является их высокая специфичность: посторонние примеси, содержащиеся в исследуемых образцах, не влияют в такой степени на результаты, как при химических методах. Микробиологическим методом можно определять и содержание антибиотиков, химические свойства которых еще точно не известны. 86 Количество антибиотиков выражается в так называемых единицах действия (ЕД). Определение единицы не одинаково для всех антибиотиков. Для антибиотиков, которые еще не получены в чистом виде, определение активности производится путем сравнения со стандартной активностью определенного микроба в строго заданных условиях. У антибиотиков, которые были выделены в чистом виде, единицы активности определяются количеством чистого вещества в микрограммах в 1мг твердого или 1мл жидкого препарата. Основным принципом микробиологических методов количественного определения антибиотиков является определение степени задержки роста микроба, чувствительного к данному антибиотику. Культура микроорганизмов, используемая для этой цели, называется тест-культурой. При производстве и разработке технологии получения антибиотиков наиболее часто используется метод диффузии в агар (метод стерильных зон или зон подавления роста). Этот метод имеет несколько модификаций. (1) Агаризованную среду плотно засевают индикаторными бактериями (тест-культурой), и на поверхность агара ставят ряд цилиндриков. В каждый из них вводят раствор антибиотика известной концентрации, и чашку ставят в термостат. Во время выращивания тест-культуры антибиотик диффундирует в окружающую среду и образует стерильную зону подавления роста. Диаметр этой зоны пропорционален логарифму концентраций антибиотика. Калибровочная кривая, построенная на полулогарифмической сетке, позволяет исследовать растворы, содержащие антибиотик в неизвестной концентрации. (2) В другом варианте цилиндры заменяют бумажными дисками, смоченными растворами антибиотика. (3) Метод агаровых блочков применяется при поиске новых микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Из агаризованной среды с микроорганизмами – продуцентами антибиотиков вырезают круглые блочки и помещают в чашки Петри с питательной средой, засеянной тест-микробом. После 22–24 ч выращивания вокруг 87 агаровых блочков образуются стерильные зоны, если испытуемый микроорганизм выделяет антибиотик, подавляющий рост данной тест-культуры. Практическая часть Цель работы – изучение антибиотической активности культуры актиномицета и количественное определение активности готового лекарственного препарата. Культура актиномицета Saccharopolyspora erythrea вырабатывает антибиотик эритромицин. Определение его активности проводят методом агаровых блочков. Saccharopolyspora erythrea высевают заранее сплошным газоном на твердой среде в чашках Петри. После того, как актиномицет хорошо вырастет, вырезают агаровые блочки с мицелием актиномицета и переносят их в другие чашки Петри, предварительно засеянные тесткультурой. В качестве тест-культуры служат бактерии Bacillus subtilis. Чашки помещают в термостат при 30ºС. Если выделяемый актиномицетом антибиотик подавляет развитие Bacillus subtilis, то через 20–24 ч вокруг агарового блочка образуется зона отсутствия роста тест-культуры. Чем больше выделяется антибиотика или чем он активнее, тем больше будет диаметр зоны отсутствия роста Bacillus subtilis. Как пример количественного определения антибиотической активности готовой лекарственной формы студенты проводят определение активности пенициллина микробиологическим методом. Продуцентом пенициллина является плесневый гриб Penicillium chrysogenum. В качестве тест-культуры служит Bacillus subtilis. На поверхности твердой питательной среды в чашке Петри, засеянной тест-культурой, раскладывают несколько стерильных бумажных дисков (диаметр 8–10 мм), пропитанных раствором пенициллина различной концентрации. После выращивания Bacillus subtilis в термостате в течение 18–20ч измеряют диаметр стерильных зон. По результатам опыта строят график на полулогарифмической миллиметровой бумаге. На линейной абсциссе откладывают диаметры стерильных зон, а на 88 логарифмической ординате – логарифмы взятых концентраций пенициллина. По полученным точкам строят калибровочный график для определения антибиотической активности неизвестного раствора пенициллина. Порядок выполнения работы Часть1 1. В стерильной водопроводной воде приготовить густую суспензию тест-культуры Bacillus subtilis. По 1 мл суспензии внести в 2 стерильные пустые чашки Петри. После этого чашки залить предварительно расплавленным и остуженным до 50ºС мясо-пептонным агаром (МПА). Чашки Петри осторожно перемешать круговыми движениями по столу и оставить до застывания. 2. На поверхность застывшей среды первой чашки разложить блочки, вырезанные из участков агаризованной среды с наиболее интенсивным ростом Saccharopolyspora erythrea. Блочки следует вырезать пробочным сверлом, обожжённым в пламени горелки. 3. Положить на поверхность второй чашки Петри с тест-культурой стерильные диски фильтровальной бумаги, пропитанные раствором пенициллина различной концентрации. 4. Поместить чашки в термостат при 30ºС Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. После прорастания тест-культуры отметить наличие стерильных зон вокруг агаровых блочков с Saccharopolyspora erythrea. 2. Измерить диаметры стерильных зон подавления роста вокруг бумажных дисков, смоченных раствором пенициллина. 3. Построить калибровочную кривую для определения концентрации пенициллина. Содержание отчета 1. Дата проведения опыта. 2. Название метода определения активности антибиотиков 89 3. Название продуцента антибиотика и тест-культуры. 4. Наличие и размер диаметра стерильных зон. 5. Калибровочный график для определения концентраций пенициллина. Контрольные вопросы 1. Дайте определение антибиотиков. 2. Назовите основные черты производства антибиотиков (состав среды, условия аэрации, асептичность). 3. На какой стадии роста продуцента идет интенсивный синтез антибиотика? 4. В чем сущность и преимущество микробиологического метода определения антибиотической активности? 5. На каком свойстве антибиотиков основан метод стерильных зон? 6. Что такое тест-культура? 7. В каких единицах выражается антибиотическая активность? Работа 11. Определение активности фермента амилазы Теоретическое введение Ферменты широко используются в различных областях практической деятельности человека как биологические катализаторы. Источниками ферментов могут быть животные, растения и микроорганизмы. Микроорганизмы в качестве продуцентов ферментов представляют особый интерес, поскольку их обмен веществ обладает большой интенсивностью, к тому же многие микробы могут расти на различных дешевых субстратах. Ферменты представляют собой белки с молекулярной массой от 15 тыс. до 1 млн. Одним из важнейших преимуществ ферментов как биологических катализаторов является их специфичность по отношению к субстратам. Большинство ферментов действуют на ограниченную группу соединений, а многие из них обладают почти абсолютной специфичностью к одному субстрату, т.е. один фермент катализирует только одну реакцию. Вторым важным преимуществом ферментов является 90 высокая скорость и эффективность действия в мягких физиологических условиях (отсутствие повышенного давления и температуры, физиологические значения рН). Ферменты разделяются на 6 классов согласно реакциям, которые они катализируют (табл. 6). Таблица 6. Классификация ферментов №№ классов 1 2 3 4 5 6 Наименование классов Оксидоредуктазы Трансферазы Гидролазы Лиазы Изомеразы Лигазы (синтетазы) Катализируемые реакции Окисление – восстановление Переносы групп Гидролиз Удаление групп, освобождающих двойные связи. Добавление групп к двойным связям Изомеризация Присоединение двух молекул, связанное с гидролизом АТФ или подобного трифосфата Многие микроорганизмы образуют ферменты, которые выделяются в культуральную среду. Это в основном гидролитические ферменты, расщепляющие биополимеры клетки – белки, целлюлозу, крахмал, жиры и другие нерастворимые в воде соединения. Поскольку их не нужно выделять из клетки, они используются на практике чаще всего. К таким гидролитическим ферментам относится фермент амилаза, катализирующая гидролиз крахмала. Этот фермент могут вырабатывать плесневые грибы и бактерии. Амилаза относится к ферментам группы гидролаз, ускоряющих реакции расщепления органических соединений при участии воды: R1R2 + HOH R1H + R2OH Крахмал, являющийся субстратом для действия амилазы, состоит из двух видов высокомолекулярных соединений – амилозы, составленной линейно расположенными цепями из остатков 91 глюкозы, и амилопектина, состоящего из ветвящихся цепей остатков глюкозы (рис. 23). В молекулах амилозы глюкоза соединяется между собой α-1,4-гликозидными связями, т.е. кислород соединяет 1 и 4 атомы углерода. В молекулах амилопектина связи между молекулами глюкозы осуществляются между 1 и 6 атомами углерода. Такие связи называются α-1,6-гликозидными связями. Амилаза расщепляет крахмал по кислородным мостикам, соединяющим молекулы глюкозы. Под действием амилазы из крахмала образуется в основном сбраживаемый дрожжами сахар мальтоза, состоящая из двух остатков глюкозы, поэтому процесс этот называется осахариванием крахмала. Он является важной 92 стадией производства пива и этилового спирта из крахмалистых сред, так как дрожжи – основной продуцент в пивоварении и производстве спирта – не имеют этого фермента. Крахмал получают из картофеля или кукурузы. Крахмалы разного происхождения значительно различаются по разветвленности цепей, степени полимеризации и некоторым другим свойствам. В качестве промежуточных продуктов при гидролизе крахмала образуются вещества разной молекулярной массы, называемые декстринами. На первых стадиях гидролиза получаются декстрины, мало отличающиеся от крахмала по размерам молекулы и по свойствам. С йодом они дают сначала синее, потом фиолетовое окрашивание. По мере дальнейшего гидролиза молекулярная масса декстринов снижается, и от йода они начинают окрашиваться в темно-бурый, затем в красноватый цвет и, наконец, перестают реагировать с йодом. Скорость расщепления крахмала до неокрашиваемых йодом декстринов и является критерием для определения амилолитической способности препарата. Препараты грибной амилазы находят широкое применение везде, где требуется провести гидролиз полисахаридов – например, для осахаривания крахмала картофеля или муки в спиртовой промышленности; пивоварении используется амилаза плесневого гриба Aspergillus oryzae. Плесневые грибы и очищенные ферментные препараты амилазы используются и в других отраслях промышленности: хлебопекарной, крахмалопаточной, текстильной и в сельском хозяйстве. Для получения грибной амилазы применяется несколько видов плесневого гриба Aspergillus oryzae. Выращивание гриба производится поверхностным способом в кюветах, на пшеничных отрубях, или глубинным способом – в ферментерах. В качестве ферментного препарата используется или высушенный гриб, содержащий активную амилазу, или выделенный из гриба очищенный фермент, содержащий, однако, какое-то количество посторонних примесей. Комплекс ферментов амилолитического действия получают при помощи культуры Bacillus subtilis. Это аэробные, 93 грамположительные, подвижные, спорообразующие палочки. Bacillus subtilis культивируют как методом поверхностного выращивания на отрубях, так и в жидких средах с кукурузной мукой в глубинных условиях. Практическая часть Цель работы – определить амилолитическую активность бактериального фермента амилосубтилина. Выделить фермент в абсолютно чистом виде из анализируемого материала и определить его количество – очень сложная задача, требующая большого опыта и времени. Удобнее всего определять количество фермента по активности воздействия его на соответствующий субстрат. Активность амилазы определяется обычно по количеству крахмала, расщепляемого до неокрашивающихся йодом осколков (декстринов) за единицу времени. Порядок выполнения работы 1. Приготовить раствор фермента. Навеску фермента амилазы (0,03–0,05 г) поместить в колбочку на 100 мл и залить 5 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 15 мл дистиллированной воды. После полного растворения фермента 2 мл раствора взять для определения активности фермента. 2. Приготовить раствор крахмала. В другую колбу поместить 25 мл 1% раствора крахмала и добавить 23 мл воды. 3. Раствор крахмала с водой нагреть на водяной бане до 31 – 32оС. 4. Определить амилолитическую способность (А.С.) препарата. Для этого выполнить следующие процедуры. 4.1. В лунки белой фарфоровой пластинки капнуть по одной капле рабочего раствора йода. 4.2. К подогретому раствору крахмала добавить 2 мл раствора фермента (общий объем должен быть 50 мл). 4.3. Отметить время. 4.4. Смесь снова поместить в баню с температурой 30 0,2оС; через каждую минуту от момента 94 прибавления ферментного раствора из колбочки отбирать по одной капле жидкости и на фарфоровой пластинке соединять с одной каплей рабочего раствора йода. Реакция расщепления окончена, когда йод перестанет давать окрашивание с опытной жидкостью. 4.5. Точно отметить время конца реакции. 5. Рассчитать амилолитическую способность (А.С.) препарата по следующей формуле: А.С.= 0,25 60 единиц, где аб 0,25 – количество крахмала в г, которое находится в 25 мл раствора,. а – количество фермента в 2 мл пробы, г, б – время расщепления крахмала до неокрашивающихся йодом продуктов, мин, 60 – пересчет на один час. Единица амилолитической способности (А.С.) выражается количеством крахмала в граммах, который расщепляется до неокрашиваемых декстринов за 1 час при 30оС одним граммом фермента. Содержание отчета 1. Название фермента. 2. Условия проведения реакции. 3. Расчет амилолитической способности фермента. Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Основные свойства и классификация ферментов. К какой группе ферментов относится амилаза? Механизм расщепления крахмала под действием амилазы. На чем основан метод определения амилазы? Что такое единица амилолитической способности? Какие микроорганизмы являются продуцентами амилазы? Где применяются препараты амилазы? 95 ТЕМА 7. Использование процессов брожения в биотехнологии Основной задачей технической микробиологии является изучение биохимических процессов, вызываемых различными микроорганизмами, и использование их в промышленности для получения многих ценных продуктов. Важнейшими биохимическими процессами, которые проводятся микроорганизмами, являются различные виды брожения – спиртовое, молочнокислое, ацетонобутиловое и др. Брожением называют анаэробные процессы расщепления органических соединений с запасанием энергии в виде АТФ, в которых эти органические соединения сами служат донорами и акцепторами электронов. Поскольку брожение протекает без участия молекулярного кислорода или других полностью окисленных неорганических соединений, все окислительновосстановительные реакции при разложении субстрата происходят за счет таких его превращений, при которых одна часть молекулы субстрата окисляется, а другая восстанавливается. На окислительных этапах этого процесса происходит освобождение части свободной энергии и запасание ее в виде АТФ. В процессе брожения происходит расщепление углеродного скелета молекулы субстрата. Круг органических соединений, которые могут сбраживаться, довольно широк. Это углеводы, спирты, органические кислоты, пурины, пиримидины. Продуктами брожений являются различные органические кислоты (молочная, масляная, пропионовая), спирты (этиловый, бутиловый), ацетон, а также CO2 и H2. Обычно в процессе брожения образуется несколько продуктов. В зависимости от того, какой основной продукт накапливается в среде, различают молочнокислое, спиртовое, маслянокислое и другие виды брожений. Многие виды брожений имеют большое практическое значение как в природе, так и в практической деятельности человека. 96 Работа 12. Изучение развития и биохимической деятельности дрожжей рода Saccharomyces Теоретическое введение Спиртовое брожение лежит в основе многих отраслей промышленности. Большую часть этилового спирта (53 %) в нашей стране используют для технических целей – в производстве синтетического каучука, для синтеза различных веществ, как растворитель, а 47 % на изготовление напитков и медицинские нужды. В связи с истощением углеводородного сырья спиртовое брожение приобретает особое значение для получения биотоплива из возобновляемого растительного сырья. Спиртовое брожение осуществляется многими видами дрожжей, реже – некоторых бактерий (Zymomonas mobilis) и мукоровыми грибами. Наибольшее промышленное значение имеют дрожжи из рода Saccharomyces, которые чрезвычайно широко и издавна используются человеком. В производстве пива, вина, спирта и в хлебопечении применяются различные штаммы и расы двух видов рода Saccharomyces – S. cerevisiae и S. vini. Спиртовое брожение – это анаэробный процесс разложения углеводов с образованием этилового спирта и углекислого газа. Сначала разложение глюкозы идет по схеме гликолиза, в результате образуется пировиноградная кислота. При декарбоксилировании пировиноградной кислоты образуется ацетальдегид, в результате гидрогенизации которого образуется этиловый спирт по уравнению: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 117 кДж В процессе спиртового брожения в среде могут накапливаться различные высшие спирты, которые называют сивушными маслами. В состав сивушных масел входят изоамиловый, амиловый и изобутиловый спирты. Ранее спирт получали из крахмалсодержащих пищевых продуктов. В настоящее время разработана технология получения этилового спирта из сахарсодержащего и целлюлозосодержащего сырья. 97 В лабораторных условиях брожение осуществляется в водной среде, содержащей необходимые для роста и размножения дрожжей источники углерода, азота, фосфора, магния, калия, кальция, микроэлементы, содержащиеся в водопроводной воде, и источник витаминов. Состав синтетической среды, г/л: Глюкоза – 60,0 (NH4)2SO4 – 4,0 KH2PO4 – 1,0 KCl – 0,15 MgSO4· 7H2 – 0,20 CaCl2(безводн.) – 0,05 Дрожжевая вода – 0,5% (по сухим веществам) рН среды – 6,0. В этой среде источником углерода служит глюкоза. Источник азота – сульфат аммония. Источник фосфора – однозамещенный фосфорнокислый калий. Источником витаминов в данной среде служит дрожжевая вода, приготовленная из пекарских или пивных дрожжей. Для того чтобы убедиться, соответствуют ли биохимические процессы, осуществляемые дрожжами рода Saccharomyces на среде с глюкозой в анаэробных условиях, уравнению реакции спиртового брожения, составляют баланс спиртового брожения в молях. Баланс спиртового брожения составляется на основе данных о количестве потребленной глюкозы и образовавшихся продуктов брожения: спирта и углекислого газа. Прежде всего, необходимо из общего количества использованной дрожжами глюкозы вычесть глюкозу, пошедшую на формирование биомассы, чтобы определить, сколько глюкозы сброжено. Определив концентрацию спирта в среде и количество выделенной углекислоты, пересчитывают все данные в моли и убеждаются, что из 1 моля сброженной глюкозы образовалось 2 моля спирта и 2 моля углекислоты. Кроме того, составляют углеродный баланс процесса использования глюкозы дрожжами. Углеродный баланс должен показать, что количество углерода потребленной глюкозы 98 равняется количеству углерода, содержащегося в обнаруженных продуктах брожения: спирте, углекислом газе и биомассе дрожжей. В процессе роста и размножения дрожжей, осуществляющих спиртовое брожение, в среде происходят еще некоторые биохимические изменения, которые должны быть отмечены в эксперименте. Из среды потребляется азот и фосфор, в чем следует убедиться, проводя количественный анализ азота и фосфора в культуральной жидкости. Очень важно отметить рН среды. рН-отрицательный логарифм концентрации водородных ионов имеет очень большое значение для жизнедеятельности микробов. Шкала значений рН от 0 до 14. Когда рН<7, среда кислая, при рН=7 – среда нейтральная, при рН>7 – щелочная. Оптимум рН для разных групп микроорганизмов различный. Дрожжи рода Saccharomyces хорошо развиваются в диапазоне рН 4,0–6,0. При росте микроорганизмов рН среды заметно сдвигается в связи с выделением продуктов обмена (кислых или щелочных), а также в силу других причин. В процессе спиртового брожения при росте сахаромицетов на среде приведенного выше состава рН среды сдвигается в кислую сторону, главным образом, в связи с освобождением большого количества иона SO4-2 из сульфата аммония (ион аммония потребляется как источник азота весьма активно, а ион SO4-2 потребляется дрожжами в незначительном количестве). Строгий контроль за рН среды в производстве необходим в связи с тем, что оптимальный рост производственных штаммов микробов возможен лишь в довольно узком интервале рН. Контроль за рН проводится с помощью индикаторной бумаги или рН-метра. Практическая часть Цель работы – изучение биохимической деятельности дрожжей рода Saccharomyces в анаэробных условиях. 99 Опыт по изучению биохимической деятельности дрожжей рода Saccharomyces проводится с одним из следующих штаммов дрожжей: Saccharomyces vini Kachurii, Saccharomyces cerevisiae раса МДЗ, Saccharomyces cerevisiae раса XII. Все перечисленные штаммы имеют производственное значение. Saccharomyces vini Kachurii применяется при производстве вин; Saccharomyces cerevisiae расы МДЗ и XII широко используется в хлебопечении, эти дрожжи производятся как пекарские дрожжи в заводских масштабах. Посевная суспензия готовится с разведением в стерильной водопроводной воде: обожженной в пламени горелки петлей подхватывается немного биомассы исходной культуры и переносится в пробирку с водой. После тщательного перемешивания производится засев 1 мл посевной суспензии в опытную колбу. Опыт ставится в колбе на 100 мл с 50 мл среды приведенного выше состава. После засева ватная пробка заменяется затвором с концентрированной серной кислотой. Затвор дает возможность углекислому газу улетучиваться через прорезь в резиновом наконечнике затвора и одновременно обеспечивает поглощение испаряющейся воды и стерильность процесса (рис. 24). Приборы подписываются и помещаются в термостат на 30 о С. Брожение продолжается несколько суток. В ходе опыта (в начале и в конце) ведутся наблюдения за морфологией дрожжей (микроскопирование посеянных и выращенных дрожжей), изучаются культуральные признаки (характер роста на твердой и жидкой среде), делается высев на чистоту культуры. 100 Выполняя работу, студенты должны определить: исходное количество глюкозы в начале опыта, конечное количество глюкозы в конце опыта, рН среды в начале опыта, рН среды в конце опыта, количество образовавшегося спирта, количество выделившейся углекислоты, остаточное количество азота в среде, остаточное количество фосфора в среде, исходную концентрацию биомассы (по сухому весу), конечную концентрацию биомассы (по сухому весу). Порядок выполнения работы Часть I (выполняется на первом занятии) 101 1. Приготовить посевную суспензию дрожжей в стерильной водопроводной воде (берется одна из следующих культур Saccharomyces vini Kachurii, Saccharomyces cerevisiae раса МДЗ, Saccharomyces cerevisiae раса XII). 2. Засеять опытную колбу 1 мл посевной суспензии. 3. Ватную пробку колбы заменить резиновой пробкой с затвором, заполненным концентрированной серной кислотой (очень осторожно!). 4. Прибор взвесить на полуаналитических весах с точностью до сотых грамма. 5. На каждой колбе с затвором надписать название культуры, начальный вес прибора, фамилию студента, поставившего опыт, и дату. 6. В посевной суспензии определить исходную биомассу дрожжей нефелометрическим методом. 7. Посевную суспензию просмотреть под микроскопом. Необходимо зарисовать и описать микроскопическую картину, отмечая: преобладающую форму клеток (овальные, округлые, удлиненные, эллипсовидные и т.д.); клетки одиночные или соединены в кустики или веточки из 5–20 клеток характер почкования (по одной или несколько почек у почкующихся клеток в поле зрения микроскопа). 8. В стерильной среде того же состава, что и опытная, определить начальное значение рН и исходное количество глюкозы. Часть II (выполняется на следующем занятии) 1. Взвесить прибор на полуаналитических весах с точностью до сотых грамма. 2. Отцентрифугировать культуральную жидкость 15 мин при 6000 об/мин. Центрифугат слить в пробирку с резиновой пробкой, а осадок количественно перенести в мерную колбу на 50 мл для определения урожая дрожжей. 3. Определить урожай дрожжей нефелометрическим методом. 4. Определить рН в центрифугате потенциометрически. 102 5. Определить количество спирта в центрифугате флотационным методом. 6. Просмотреть дрожжи из опытной колбы под микроскопом: а) описать форму, размер клеток, наличие или отсутствие псевдомицелия, размер вакуолей, состояние протоплазмы; зарисовать микроскопическую картину; б) отметить накопление гликогена (окраска раствором Люголя); в) определить число живых и мертвых клеток (окраска метиленовой синью). 7. Составить углеродный баланс. 8. Составить баланс спиртового брожения в молях. Часть III (выполняется на следующем занятии) 1. Определить остаточное количество глюкозы. 2. Определить количество остаточного азота в центрифугате. 3. Определить количество фосфора в центрифугате. 4. Результаты анализов ввести в таблицу 7. Таблица 7. Изменение состава среды по основным компонентам развития в ней дрожжевой культуры ВозрН Содержание в раст культукультуралькуль- ральной жидкости туры ной глюспирта (сутжид- козы ки) кости г/л г/л М/л Сброженная глюкоза г/л М/л Вес Выделив- Конценпри- шаяся угле- трация бора кислота биомасс ы г г/л М/л гСБ/л Методы анализа 1. Изучение морфологических свойств культуры В процессе роста и развития дрожжи, как и любые микроорганизмы, меняют свои морфолого-физиологические свойства. В молодом возрасте клетки активно размножаются, большинство дрожжевых клеток почкуется, протоплазма клеток гомогенная, вакуолей не видно или они мелкие. Клетки в 103 подавляющем большинстве жизнеспособны. По мере истощения питательной среды и накопления в ней продуктов обмена происходит замедление роста микроорганизмов, активность размножения падает, почкующихся клеток становится все меньше. В старых клетках увеличиваются размеры вакуолей и откладываются запасные вещества (гликоген, жир). Многие клетки погибают. Физиологическое состояние культуры часто определяется соотношением живых и мертвых клеток. Если клетки в подавляющем большинстве живые – культура активная, может нормально развиваться, если много мертвых клеток – культура старая, отмирающая, или на нее воздействовали неблагоприятные внешние факторы. Для изучения морфологических свойств культуры в конце опыта готовится микроскопический препарат. При рассматривании его отмечается форма клеток, характер почкования, размер вакуолей, наличие или отсутствие псевдомицелия (вытянутых в длину клеток, соединенных по 5–20 веточек). Микроскопическая картина зарисовывается. Для определения гликогена в клетках исследуемой культуры проводится окраска препарата раствором Люголя. Гликоген окрашивается раствором Люголя (J2 + KJ) в красно-бурый цвет. Окраска проводится таким же способом, что и окраска метиленовой синью. 2. Определение количества углекислого газа, выделившегося в процессе брожения Количество выделившегося углекислого газа определяют по разности в весе прибора в начале и в конце опыта. При заполнении таблицы необходимо сделать пересчет в г/л, имея в виду, что рабочий объем опытной колбы равен 50 мл. Потеря в весе прибора за время опыта вызвана тем, что углекислый газ удаляется через прорезь в резиновой трубке затвора. Проводя взвешивание, необходимо помнить о концентрированной серной кислоте в затворе и соблюдать осторожность в работе. 104 3. Количественное определение спирта в культуральной жидкости флотационным методом Метод основан на зависимости, существующей между удельным весом спиртового раствора, концентрацией спирта и температурой раствора. Особенностью флотационного метода является применение поплавка, который приходит в состояние безразличного плавания (флотации) при полном погружении в жидкость, имеющую удельный вес равный удельному весу поплавка при данной температуре раствора. Ход определения Отобрать пипеткой 25 мл исследуемой культуральной жидкости и перенести в отгонную колбу. Сюда же добавить 80 мл дистиллированной воды и несколько кристалликов фенолфталеина. Осторожно прилить раствор щелочи до появления ярко-розового окрашивания. Отгонную колбу закрыть пробкой с насадкой и присоединить к холодильнику Либиха. Нагревать на электроплитке. Перегнанную жидкость собрать в мерную колбу на 25 мл точно до метки и затем перелить в стаканчик флотационной измерительной установки. В жидкость погрузить термометр и один из поплавков, входящих в набор. Если поплавок тонет, т.е. его плотность больше плотности раствора, то его флотация достигается охлаждением раствора. Если поплавок всплывает, то плотность жидкости понижается нагреванием. Во время нагревания или охлаждения жидкость тщательно перемешивать. Добившись флотации поплавка в растворе, зафиксировать показания термометра. К каждому поплавку прилагается таблица, с помощью которой по температуре флотации поплавка в растворе находится концентрация спирта в исследуемом растворе, выраженная в объемных процентах. Количество спирта (в граммах), содержащееся в 1 л жидкости, рассчитывается по формуле: Х А d 10 , где Х – количество спирта в граммах, содержащееся в 1 л жидкости, 105 A – определенная по таблице концентрация спирта в объемных процентах, d – удельный вес абсолютного спирта при температуре 20оС, равный 0,7894. 4. Фотометрический (колориметрический) метод количественного определения веществ При помощи этого метода можно определять концентрацию окрашенных веществ в растворах. Интенсивность окраски раствора зависит от концентрации растворенного вещества. Окрашенные растворы обладают способностью поглощать свет. Интенсивность светопоглощения выражают величиной D lg Jo , где J1 D – оптическая плотность раствора, Jo – интенсивность входящего в раствор светового потока, J1 – интенсивность ослабленного светопоглощением светового потока. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют на приборах с фотоэлементами – фотоэлектроколориметрах. Принцип работы этих приборов заключается в том, что световой поток, прошедший через кювету с раствором или растворителем, попадает на фотоэлемент, который преобразует световую энергию в электрическую, а последняя измеряется гальванометром. Измерительные шкалы гальванометра градуированы по оптической плотности (D) и по коэффициенту светопропускания (τ). Зависимость между этими величинами выражается уравнением D lg 1 При определении оптической плотности растворов на фотоэлектроколориметрах применяют светофильтры, выделяющие из белого света определенную спектральную область. Обычно применяют светофильтр, дающий возможность выделить участок с такой длиной волны, который соответствует максимуму (λMax) 106 поглощения определяемого вещества. При этом чувствительность значительно повышается. Для определения концентрации окрашенного вещества в растворе предварительно строят калибровочную кривую по данным оптической плотности эталонных растворов. Фотометрический метод количественного определения веществ является чувствительным и быстрым и в известных случаях дает возможность автоматизировать контроль производства. С помощью этого метода в данном практикуме определяется количественное содержание глюкозы и фосфорной кислоты. Порядок работы на фотоколориметре 1. Включить прибор в сеть, поставить рычаг включения на положение «переменный ток». 2. Дать прибору прогреться в течение 10 мин. 3. Ввести в световой луч при соответствующем светофильтре кювету с раствором сравнения и при помощи ручки грубой и тонкой настройки подвести стрелку гальванометра в нулевое положение. 4. Вместо раствора сравнения в световой луч ввести кювету с исследуемым раствором или суспензией. Оптическую плотность определяют по отклонению стрелки гальванометра и отсчет ведут по верхней логарифмической шкале. 5. Определение глюкозы по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) 2,3,5-трифенилтетразолий восстанавливается до трифенилформазана, который растворяясь в органических растворителях, окрашивает раствор редуцирующих углеводов в вишнево-красный цвет. Интенсивность окрашивания зависит от содержания редуцирующих сахаров в пробе. Ход определения Анализируемый раствор должен иметь нейтральную реакцию, поэтому кислые пробы осторожно нейтрализуют сухим NaHCO3 по лакмусу, не допуская сдвига в щелочную сторону. 107 К 2 мл анализируемой пробы, содержащей 20–80 мкг редуцирующего углевода, добавляют 1 мл 0,3%-ного раствора ТТХ и 1 мл 2 н. раствора NaOH. Пробирки со смесью помещают в кипящую водяную баню точно на 3 мин, затем немедленно подкисляют смесь 1 мл раствора 2,1 н. уксусной кислоты и охлаждают, опустив пробирки в сосуд с холодной водой. После этого содержимое пробирок количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, доводят до метки этанолом или изопропанолом, тщательно перемешивают и определяют оптическую плотность растворов при длине волны 485 нм. Рабочее расстояние кюветы 0,3 см. В качестве контроля используют аналогично обработанную смесь с 2 мл воды. Содержание редуцирующих веществ в объеме анализируемой пробы и в 1 л культуральной жидкости рассчитывают, используя калибровочную кривую, построенную по D-глюкозе. Построение калибровочной кривой по глюкозе Готовят раствор, 1 мл которого содержит 100 мкг глюкозы, для чего взвешивают на аналитических весах 10 мг глюкозы и растворяют в 100 мл дистиллированной воды в мерной колбе. Затем из исходного раствора готовят, как указано ниже, растворы с содержанием глюкозы от 20 до 80 мкг/мл. Таблица 8. Приготовление стандартных растворов глюкозы Показатели Объем исходного раствора, мл Объем дистиллированной воды Содержание глюкозы в стандартных растворах, мкг/мл 1 2,0 8,0 20 2 3,0 7,0 30 Номера пробирок 3 4 5 6 4,0 5,0 6,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 40 50 60 70 7 8,0 2,0 80 Со стандартными растворами проводят определения по изложенной выше методике. Результаты вносят в таблицу 9. 108 Таблица 9. Оптическая плотность стандартных растворов глюкозы, обработанных ТТХ Показатели Содержание глюкозы в стандартных растворах, мкг/мл 1 20 2 30 Номера пробирок 3 4 5 6 40 50 60 70 7 80 Показания ФЭК Исходя из полученных данных, строят калибровочную кривую: на горизонтальной оси откладывают значения концентрации глюкозы (мкг/мл), на вертикальной – показания оптической плотности. 6. Фотометрический (колориметрический) метод количественного определения фосфора (в пересчете на Р2О5) Фосфорная и молибденовая кислоты реагируют с образованием фосфоромолибденовой кислоты, которая в присутствии восстанавливающих веществ (например, гидрохинона) образует соединения, окрашенные в синий цвет – «молибденовую синь». Реакция возможна в сильнокислой среде. Интенсивность окраски полученных растворов пропорциональна содержанию фосфора в исходном растворе. Реактивы. 1. 1% раствор гидрохинона. 2. 20% раствор сульфита натрия. 3. 2,5% раствор молибденовокислого аммония в 3 н растворе серной кислоты. Ход определения 1 мл исследуемого раствора пипеткой перенести в пробирку, добавить 9 мл дистиллированной воды и хорошо перемешать. 1 мл разведенного раствора поместить в чистую сухую пробирку, добавить 1 мл 2,5% раствора молибденовокислого аммония, 1 мл 1% раствора гидрохинона и 2 мл 20% раствора сульфита натрия. Перемешать и оставить в темноте. Через 5 минут измерить оптическую плотность окрашенного в синий цвет раствора 109 на фотоколориметре, применяя светофильтр с λMax = 720 мкм. Контрольный раствор готовят смешиванием 1мл дистиллированной воды, 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 1 мл раствора гидрохинона и 2 мл раствора натрия. Концентрацию Р2О5 определить по калибровочному графику, учитывая разведение исходного раствора. Кривую строят по данным оптической плотности эталонных растворов, содержащих от 10 до 100 мг Р2О5.. 7. Количественное определение аммонийного азота В среде азот содержится в виде соли (NH4)2SO4. Окись магния, как щелочной агент, в водной среде вытесняет аммоний из аммониевых солей: MgO + H2O = Mg(OH)2 Mg(OH)2 + (NH4)2SO4 = MgSO4 +2NH4OH При нагревании гидрат окиси аммония разлагается: 2NH4OH 2NH3 + H2O Выделяющийся аммиак отгоняют с водяным паром в определенный объем титрованной серной кислоты 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4. Определив при помощи обратного титрования едким натрием количество серной кислоты, связанной аммиаком, рассчитывают содержание азота в исследуемом растворе. Реактивы. 1. Окись магния в порошке. 2. 0,1 н раствор H2SO4 . 3. 0,1 н раствор NаOH. 4. Смешанный индикатор (спиртовой раствор метиленовой сини и метилового красного). Ход определения 1. 10 мл центрифугата перенести пипеткой в отгонную колбу на 500 мл. Сюда же прибавить 0,1–0,3 г порошка окиси магния и 200 мл дистиллированной воды. 110 2. В приемную коническую колбу на 200 мл налить 20 мл титрованного раствора 0,1 н серной кислоты и 4–5 капель смешанного индикатора. 3. Отгонную колбу закрыть пробкой с насадкой и присоединить к холодильнику. Конец аллонжа в первые 5 минут отгонки погружен в кислоту. Отгонную колбу нагреть и вести перегонку до тех пор, пока стекающая по аллонжу жидкость не перестанет показывать щелочную реакцию по красной лакмусовой бумаге. 4. По окончании перегонки конец аллонжа смыть дистиллированной водой в приемную колбу. Содержимое приемной колбы титровать 0,1 н раствором едкого натра до перехода окраски из сиреневой в зеленую. Расчет содержания азота ведется по формуле: А (а к1 в к2 )0,0014 1000 , где v А – содержание азота в г/л а – количество 0,1 н H2SO4 в мл к1 – поправка 0,1 н раствора H2SO4 в – количество 0,1 н NаOH в мл, пошедшего на титрование к2 – поправка 0,1 н раствора NаOH 0,0014 – количество азота в граммах, соответствующее 1 мл 0,1 н H2SO4. Составление углеродного баланса Служащий источником углерода углевод (глюкоза) используется в обмене веществ по двум путям – в энергетическом обмене и в конструктивном: 111 Конструктивный обмен (Образование клеточного вещества: белков, жиров, углеводов и т.п.) Глюкоза Энергетический обмен (Образование С2Н5ОН + СО2 + энергия) Для составления углеродного баланса процесса использования глюкозы необходимо рассчитать количество углерода в потребленной глюкозе и образовавшихся за счет глюкозы продуктах – биомассе дрожжей, спирте и углекислом газе. Пример расчета. Исходное количество глюкозы – 60 г/л, конечное количество глюкозы – 6 г/л. Следовательно, потреблено 60 – 6 = 54 г/л глюкозы. Молярная масса глюкозы 180. В грамм-молекуле глюкозы – 72 г углерода. 180 г глюкозы – 72 г С 54 г глюкозы – Х г С Х 54 72 21г С 180 Таким образом, потреблено на энергетический и конструктивный обмен 21 г углерода глюкозы. В конце опыта сухой вес биомассы достиг 3 г/л. Углерод составляет 50 % сухого веса биомассы. То есть в накопленной биомассе содержится 1,5 г углерода. В ходе брожения всего выделилось 22г углекислоты на литр среды. Молярная масса углекислоты 44. 44 г СО2 – 12 г С 22 г СО2 – Х г С Х 22 12 6г С 44 Следовательно, в выделенной углекислоте содержатся 6 г углерода. 112 В процессе брожения образовалось 23 г этилового спирта на литр среды. Молярная масса спирта 46. В грамм-молекуле спирта 24 г С. 46 г спирта – 24 г С 23 г спирта – Х г С Х 23 24 12гС 46 То есть в 23 г спирта содержится 12 г углерода. На основании приведенных вычислений можно составить углеродный баланс процесса: 21 г глюкозы 12 г С спирта + 6 г С углекислоты + 1,5 г С биомассы или 21г потребленной глюкозы 19,5 г С продуктов энергетического и конструктивного обмена. Некоторое превышение количества потребленного углерода над накоплением связано с недостаточной точностью анализов или с образованием небольшого количества неучтенных в опыте продуктов обмена, например органических кислот. Баланс спиртового брожения в молях Как было сказано, глюкоза используется дрожжами в конструктивном и энергетическом обмене. Накопление биомассы – конструктивный обмен, спиртовое брожение – энергетический обмен. Для составления баланса спиртового брожения в молях необходимо, прежде всего, вычислить количество глюкозы, пошедшей на спиртовое брожение. Пример расчета. В конце опыта накопилась биомасса дрожжей в количестве 3 г СБ/л. Так как углерод составляет 50% сухого вещества биомассы дрожжей, то в ней содержится 1,5 г углерода. Молярная масса глюкозы 180. В грамм-молекуле глюкозы 6 х 12 = 72 г С. В 180 г глюкозы – 72 г углерода Х – 1,5 г углерода 113 Х 180 1,5 3,75г г люкозы 72 Таким образом, на конструктивный обмен пошло 3,75 г глюкозы. Если исходное количество глюкозы – 60 г/л, а конечное – 6 г/л, то на спиртовое брожение израсходовано 60 – 6 – 6,75 = 50, 25 г глюкозы. Чтобы выразить это количество в молях, нужно разделить его на молярную массу глюкозы: 50,25 0,27М 180 То есть на спиртовое брожение пошло 0,27 М глюкозы. В 1 л спирта накоплено 23 г этанола. Выражаем это количество в молях, разделив его на молярную массу спирта: 23 0,5М 46 В ходе процесса выделилось 22 г углекислоты на 1 литр среды. В молях количество выделившейся углекислоты составляет 22 0,5М 44 Очевидно, что баланс спиртового брожения в данном случае представляется в следующем виде: 0,27 М глюкозы = 0,5 М спирта + 0,5 М СО2 или, приведя к общему знаменателю 1М глюкозы = 1,85 М спирта + 1,85 М СО2 Содержание отчета Отчет по работе 12 представляется отдельно в форме научной статьи по следующему плану: 1. Введение (с указанием актуальности и цели работы). 2. Экспериментальная часть. 2.1. Объект и методы исследования. 2.2. Результаты и обсуждение результатов. 3. Выводы. 4. Использованная литература. 114 Контрольные вопросы 1. Практическое использование дрожжей рода Saccharomyces. 2. Реакция спиртового брожения. 3. Пути использования глюкозы дрожжами, осуществляющими реакцию спиртового брожения. 4. Состав среды, на которой развиваются дрожжи при брожении (источник углерода, азота, фосфора; что служит источником витаминов). 5. Понятие о рН; в каких пределах рН дрожжи развиваются лучше; способы определения рН. 6. Сущность фотометрического метода определения глюкозы. 7. Методы определения урожая дрожжей. 8. Сущность определения спирта флотационным методом. 9. Принцип составления баланса спиртового брожения в молях. 10. Принцип составления углеродного баланса процесса использования глюкозы дрожжами. 11. Сущность метода определения минерального азота. 12. Сущность метода определения фосфора. Работа 13. Молочнокислое брожение Теоретическое введение Молочнокислым брожением называется процесс разложения углеводов молочнокислыми бактериями с образованием преимущественно молочной кислоты. C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 73 кДж Молочная кислота Молочнокислые бактерии – это неподвижные неспорообразующие палочковидные или кокковидные микроорганизмы. Все молочнокислые бактерии – факультативные анаэробы. Они очень требовательны к составу питательных сред, которые должны включать витамины группы В и большой набор аминокислот. Молочнокислые бактерии образуют большое количество молочной кислоты из сахара, что приводит к снижению рН среды, в которой они росли. В то же время они обладают высокой устойчивостью к кислоте, и это дает им возможность 115 успешно конкурировать с большинством других бактерий в средах, богатых питательными веществами, и предотвращает развитие большинства других микроорганизмов. Конкурирующие организмы почти полностью устраняются вследствие накопления молочной кислоты, образующейся в результате молочнокислого брожения. По характеру брожения различают две группы молочнокислых бактерий: гомоферментативные и гетероферментативные бактерии. Гомоферментативные бактерии образуют молочную кислоту в качестве почти единственного продукта брожения углеводов. Гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют наряду с молочной кислотой значительные количества других продуктов, например уксусную и янтарную кислоты, этиловый спирт, углекислый газ и водород, ароматические вещества (диацетил, эфиры) и другие. Размножение молочнокислых бактерий способствует сохранению пищевых продуктов; кроме того, они образуют соединения, влияющие на вкусовые качества пищи. Молочнокислым бактериям принадлежит главная роль в осуществлении процессов, используемых с давних времен для получения различных кисломолочных продуктов, в процессах соления и квашения овощей, силосования кормов. Известно много национальных кисломолочных продуктов (кефир, кумыс, йогурт и др.), для приготовления которых используют коровье, кобылье, овечье, козье, верблюжье молоко, а в качестве закваски – естественно возникшие и сохраняемые закваски молочнокислых бактерий и дрожжей. Большую роль молочнокислые бактерии играют также в приготовлении сыров и сливочного масла. Молочнокислые бактерии также участвуют в квашении овощей. В мелко нарезанные овощи добавляют 2–3% поваренной соли и создают условия, исключающие свободный доступ воздуха. Начинается спонтанное молочнокислое брожение. При молочнокислом брожении такого рода субстратом брожения служат присутствующие в растительных продуктах сахара. Аналогичный процесс протекает при силосовании кормов: растительную массу плотно загружают в силосные башни, чтобы повысить питательные 116 свойства среды, добавляют мелассу и подкисляют. В этих условиях также протекает спонтанное молочнокислое брожение. Возбудители гомоферментативного брожения 1. Lactococcus lactis – клетки сферические или овальные величиной от 0,5–1,2×0,5–1,5 мкм, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек. Грамположительны, спор не образует. Оптимальная температура развития 30– 35ОС. Молоко свертывается через 10–12 часов, образуя ровный, плотный сгусток. Предельная кислотность молока 110–120ОТ. Сбраживает моносахариды, лактозу и мальтозу. 2. Lactococcus cremoris отличается от L.lactis тем, что его клетки располагаются в виде длинных цепочек. Он лучше развивается при температуре 25–30ОС. В молоке образует ровный, плотный сгусток, который при разбивании имеет сметанообразную консистенцию. Предельная кислотность 110–115ОТ. При культивировании в условиях пониженной температуры (15–20ОС) образует повышенное количество летучих кислот (уксусной, янтарной и др.). Этот стрептококк применяется в молочной промышленности для изготовления кислосливочного масла и сыров. 3. Streptococcus thermophilus. Клетки располагаются в виде цепочек кокков различной длины. Лучше развивается при повышенной температуре 40–45ОС. Предельная кислотность 110–115ОТ. Применяется при получении йогурта и швейцарского сыра. 4. Lactobacillus bulgaricum – неподвижная, грамположительная, крупная палочка (4–5мкм в длину) с закругленными концами. Располагается в виде отдельных клеток и небольших цепочек. Оптимум роста 40–45ОС. Предельная кислотность 200–300ОТ. Применяется при получении йогурта. 5. Lactobacillus acidophilum – неподвижные грамположительные палочки длиной 4–5мкм. Оптимум роста 37ОС, предельная кислотность – 200–250ОТ. Применяется для производства ацидофилина. 117 6. Lactobacillus delbrueckii – термофильная палочка, выращивается при температуре 45–50ОС и применяется для получения молочной кислоты. Возбудители гетероферментативного брожения Наиболее известными представителями считаются кокковидная бактерия Leuconostoc mesenteroides, бифидобактерия Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus plantarum. 1. Leuconostoc mesenteroides – клетки сферические или несколько вытянутые, иногда в цепочках. Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие. Распространены на растениях, в молочных и других пищевых продуктах. На средах с сахарозой образует внеклеточный полисахарид декстран, который используется в качестве молекулярных сит. 2. Bifidobacterium bifidum – грамположительная неспорообразующая палочка неправильной формы, клетки обычно несколько изогнутые, булавовидные и часто разветвленные. Расположение клеток одиночное, парами, vобразное. Анаэроб. Палочка обнаружена в ротовой полости и кишечнике. Применяется для получения препаратов, нормализующих микрофлору кишечника (напр., бифидумбактерин). 3. Lactobacillus plantarum – грамположительная палочка, обычно правильной формы; сбраживает продукты растительного происхождения. Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. Они встречаются на листьях, стеблях, цветах, плодах, семенах и на корнях растений. Количество их колеблется от единиц до нескольких десятков тысяч на 1 грамме зеленой массы растений. Растения и почва являются источниками, из которых молочнокислые бактерии попадают в молоко и другие продукты. Практическая часть Цель работы – получение накопительной культуры молочнокислых бактерий и изучение морфологии полученных микробов на фиксированных препаратах. 118 Для проведения занятий нужно иметь: бифидок, ацидофилин, простоквашу, молоко 1% жирности в колбах по 50мл, 1% спиртовой раствор фенолфталеина, 0.1н раствор едкого натра, пипетки на 1мл, бюретку для титрования. Лучшей питательной средой для молочнокислых бактерий является цельное или обезжиренное молоко. Свежее молоко содержит некоторое количество молочной кислоты, которая создает начальную кислотность молока. Кислотность молока обычно выражают в градусах Тернера (ОТ ). Перед постановкой опыта необходимо установить исходную кислотность молока, используемого в качестве питательной среды. Порядок выполнения работы Часть 1 1. Определить кислотность молока по Тернеру. Кислотность определяют методом титрования молока 0.1 н раствором едкого натра при индикаторе фенолфталеине. Для титрования в колбу наливают 10мл молока, разбавляют двойным объемом дистиллированной воды и прибавляют 2–3 капли раствора фенолфталеина. Смесь перемешивают и титруют из бюретки 0.1 н раствором NaOH до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 2 минут. Количество щёлочи, пошедшее на нейтрализацию 10 мл молока, умножают на 10 (для расчета на 100 мл молока). Полученная величина показывает кислотность молока в градусах Тернера. Градусы Тернера показывают количество мл 0.1 н раствора NaOH, пошедшее на нейтрализацию кислотности 100 мл молока. 1 градус Тернера соответствует 9 мг молочной кислоты. 2. Поставить накопительную культуру молочнокислых бактерий. В колбу емкостью 100 мл наливают 50 мл пастеризованного (стерильного) молока 1% после определения начальной кислотности. К молоку добавляют 5 мл биокефира, ацидофилина 119 или простокваши. Колбы закрывают ватными пробками, помещают в термостат с соответствующей температурой 10–12 часов. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) При гомоферментативном брожении в колбе образуется плотный сгусток молока. После образования сгустка изучают морфологию бактерий и определяют количество молочной кислоты, накопившейся в пробе. 1. Определить конечную кислотность молока. Количество молочной кислоты, накопившейся в молоке, определяют по ранее описанной методике. Для анализа берут 1мл скисшего молока, добавляют 20 мл воды и фенолфталеина. Результат титрования умножают на 100. Из полученного остатка вычитают исходную кислотность. Остаток показывает кислотность в градусах Тернера, образовавшуюся в результате деятельности бактерий. По этой кислотности рассчитывают количество накопившейся молочной кислоты, зная, что 1ОТ равен 9 мг кислоты. Например: исходная кислотность 22ОТ, а конечная – 180ОТ. Следовательно, бактериями накоплено: 180 – 22 =158 Т, или 189 9 = 1422 мг молочной кислоты на 100 мл молока. 2. Приготовить фиксированный препарат молочнокислых бактерий. Для этого на чистое предметное стекло петлей наносят каплю скисшего молока, смешивают ее с каплей воды и готовят мазок. Мазок высушивают, фиксируют спиртом или в пламени горелки. Наносят на 3–5 минут раствор метиленовой сини, промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом. Препарат рассматривают с иммерсионным объективом и зарисовывают. 3. Провести качественную реакцию на молочную кислоту. Из качественных реакций на молочную кислоту специфической реакцией является перевод молочной кислоты в уксусный альдегид. Для проведения качественной пробы на молочную кислоту кислое молоко отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. Для исследования берут фильтрат. Определение уксусного альдегида 120 К 10 мл фильтрата прибавляют 1 мл 10%-ного раствора серной кислоты. Смесь нагревают до кипения и добавляют к ней несколько капель 2%-ного раствора КМnO4. В этих условиях происходит окисление молочной кислоты и образование уксусного альдегида. Реакция протекает следующим образом: 2KМnO4+ 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 + 3H2O + 5O (1) 5CH3CHOHCOOH + 5O = 5CH3CHO + 5CO2 + 5H2O (2) Молочная кислота Уксусный альдегид Уксусный альдегид обнаруживается по реакции с аммиачным раствором азотнокислого серебра. Для этого горлышко колбы или пробирки закрывают фильтровальной бумагой, смоченной 10%-ным аммиачным раствором азотнокислого серебра. При нагревании смеси уксусный альдегид улетучивается и, взаимодействуя с аммиачным раствором AgNO3, вызывает его разложение. Фильтровальная бумага чернеет. Содержание отчета 1.Название используемой закваски молочнокислых бактерий. 2. Название и рисунок фиксированного препарата. 3. Количество накопленной молочной кислоты. 4. Описание результата качественной реакции на молочную кислоту. Контрольные вопросы Что такое молочнокислое брожение? Практическое использование молочнокислых бактерий. Назовите виды молочнокислого брожения. Какие микроорганизмы вызывают гомоферментативное брожение? 5. Где используются процессы гетероферментативного брожения? 6. Как определить кислотность молока по Тернеру? 7. Опишите качественную реакцию на молочную кислоту. 1. 2. 3. 4. ТЕМА 8. Закономерности роста и развития микроорганизмов 121 Понятие «микробный рост» означает увеличение числа клеток микроорганизмов. Под ростом отдельной бактериальной клетки понимают увеличение ее длины и последующее деление на две дочерние клетки. У почкующихся клеток возрастание их числа также происходит в результате почкования. Процесс культивирования микроорганизмов в условиях несменяемой среды называется периодическим. Культура, внесенная в питательную среду, проходит несколько стадий развития. Если отобразить рост культуры на графике, отложив по оси абсцисс время, а по оси ординат количество клеток или массу микроорганизмов, то можно проследить фазы роста, показанные на рис. 25. В первые часы после засева происходит адаптация микроорганизмов к среде, и размножения клеток не наблюдается. Этот период называется лагфазой. При благоприятных условиях и использовании молодой культуры для засева эта фаза может быть очень короткой. Длительность лагфазы увеличивается, если посевной материал был выращен на более богатой среде. 122 Далее следует фаза интенсивного размножения клеток, которая называется экспоненциальной или логарифмической. В течение этой фазы рост клеток и их суммарной биомассы описывается зависимостью Õ2 X1 e τ2, ч; (1) где Х1 и Х2 – масса микроорганизмов в момент времени τ1 и е – основание натуральных логарифмов; μ – удельная скорость роста микроорганизмов, ч – 1; Δτ = τ2-τ1. Для экспоненциальной фазы роста μ сохраняет практически постоянное значение. Удельную скорость роста можно определить из соотношения (1), представив уравнениями (2) и (3): ln Х 2 ln Х 1 или (2) 2,3(lg Х 2 lg Х 1 ) (3) Удельная скорость роста μ показывает прирост единицы биомассы за малый промежуток времени, отнесенный к текущей концентрации биомассы: dХ Х d (4) Удельная скорость роста μ характерна для каждого вида микроорганизма, то есть является физиологической 123 характеристикой микробной культуры. У быстрорастущих культур μ лежит в пределах 0,5–2 ч – 1. Дополнительным показателем роста культуры микробов в периодическом процессе является величина, называемая временем генерации. Время генерации g – это промежуток времени между двумя делениями клетки, т.е. время удвоения массы микроорганизмов. Для промежутка Δτ, равного времени удвоения Х2=2Х1 и тогда, с привлечением соотношения (1), получаем g ln 2; g ln 2 0,693 , ч (5) У быстрорастущих культур время генерации лежит в пределах 0,3–1,5 часов. При развитии микроорганизмов меняются условия среды: уменьшается концентрация питательных веществ, накапливаются продукты обмена. Эти факторы приводят к замедлению роста микроорганизмов, и культура переходит в фазу замедления роста. За фазой замедления роста следует стационарная, в которой в результате исчерпания питательных веществ и накопления продуктов жизнедеятельности некоторые клетки перестают размножаться и отмирают, при этом количество образующихся и отмирающих клеток становится равным. Далее отмирание клеток начинает преобладать над размножением, и концентрация их в среде падает – это фаза отмирания. Работа 14. Определение удельной скорости роста дрожжей при периодическом культивировании Цель работы: определение удельной скорости роста дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae при периодическом культивировании. Для культивирования микроорганизмов используется изображенная на рис. 26 лабораторная установка с ферментером, полный объем которого 1 л, а рабочий – 0,4 л. Ферментер снабжен мешалкой, 124 которая приводится во вращение от двигателя постоянного тока через магнитную муфту. Скорость вращения вала мешалки изменяется от 0 до 2500 об/мин. Подача воздуха производится микрокомпрессором через барботер. Расход воздуха составляет 1,2 л/л мин. Для поддержания температуры в аппарате служит термостат U-10, подключенный к змеевиковому холодильнику ферментера. На верхней крышке имеется патрубок для ввода среды и нейтрализующего агента. Для выращивания дрожжей используется среда следующего состава, г/л: глюкоза – 30,0 (NH4)2SO4 – 4,0 KH2PO4 – 1,0 KCl – 0,15 MgSO4•7H2O – 0,2 дрожжевая вода – 0,5% (по с.в.) рН – 6,0. Поддержание рН осуществляется добавками 10%-ного раствора гидроокиси калия. В ходе выполнения работы студенты проводят определение концентрации биомассы двумя способами: с помощью нефелометра и методом подсчета клеток в камере Горяева. С использованием полученных данных проводится расчет удельной скорости роста и времени генерации. Составляется таблица, включающая следующие данные: время отбора пробы, число оборотов мешалки ферментера, интенсивность аэрации, рН среды, температура среды в ферментере, концентрация биомассы, продолжительность опыта, удельная скорость роста и времени генерации. Число оборотов мешалки определяется тахометром. Сульфитное число, характеризующее интенсивность аэрации для данного ферментера, определяется по прилагаемому графику с учетом числа оборотов. Определение рН среды производится на рНметре потенциометрическим методом. 125 Таблица 10. Экспериментальные биомассы Saccharomyces cerevisiae. ВреЧисло мя оборотов заме- мешалки, ра об/мин 126 Интенсивность аэрации, гО2/л мин рН данные Количество биомассы г/л кл/мл по ∆τ, ч выращиванию t, C O μ, ч-1 g, ч Порядок выполнения работы 1. Определить концентрацию дрожжей двумя способами. Для этого из ферментера в стаканчик отбирают 5 мл суспензии. Отмечают время отбора. Суспензию разбавляют в 5–10 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и на фотоэлектроколориметре (ФЭК) определяют величину оптической плотности суспензии, после чего по оптической плотности с помощью графика определяют концентрацию биомассы. При расчете концентрации необходимо учитывать меру разведения. В этой же пробе определяют концентрацию биомассы методом подсчета клеток в камере Горяева. Каждые 30 мин проводят повторное определение концентрации дрожжей. 2. Измерить скорость вращения вала мешалки тахометром. 3. Определить интенсивность аэрации, характеризуемую сульфитным числом, по графику после замера числа оборотов мешалки. 4. Отметить показания термометра в ферментере. 5. Измерить величину рН в пробе. 6. Заполнить таблицу 10 экспериментальными данными. 7. Вычислить значения удельной скорости роста и времени генерации дрожжей. Содержание отчета 1. Схема экспериментальной установки. 2. Расчет удельной скорости роста и времени генерации дрожжей. 3. Экспериментальные данные, оформленные в виде таблицы 10. Контрольные вопросы 1. Какие фазы роста наблюдаются при периодическом выращивании микроорганизмов? 2. Что такое удельная скорость роста? Как можно практически определить удельную скорость роста и время генерации? 127 ТЕМА 9. Биотрансформация Биотрансформация – это процесс превращения микроорганизмами органических веществ в соединения, структура которых изменяется незначительно по сравнению со структурой исходных веществ. В отличие от процессов биосинтеза или брожения, в которых участвует большое количество ферментов, в микробиологической трансформации обычно работает один или несколько ферментов, катализирующих окисление, декарбоксилирование, метилирование или какую-либо другую реакцию. Подбор культур микроорганизмов для биотрансформации определенных соединений по заданному типу реакций осуществляется эмпирическим путем. Однако существуют определенные группы организмов, которые можно использовать для проведения необходимых для конкретной цели трансформаций. Например, для окисления оксигруппы полиолов можно использовать уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans, для окисления аминогруппы в нитрогруппы – Streptomyces, для дезаминирования – дрожжи, для гидроксилирования стероидов – грибы и т.д. Существуют специальные альбомы культур, применяемых для микробиологической трансформации. Методы, применяемые для биотрансформации можно разделить на группы: 1) трансформация с использованием растущей культуры в периодических условиях; 2) использование неразмножающихся клеток; 3) трансформация спорами; 4) применение клеток, высушенных с применением воздуха или ацетона; 5) трансформация при помощи иммобилизованных клеток или ферментов. Биотрансформацию используют для получения аскорбиновой кислоты: микробиологическая стадия получения аскорбиновой кислоты осуществляется уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans, которые окисляют D-сорбит в L-сорбозу. 128 Для получения стероидных препаратов (преднизолона, гидрокортизона и др.) также активно используется метод биотрансформации. Методы биотрансформации приобретают важное значение для получения новых форм антибиотиков, к которым микроорганизмы еще не приобрели устойчивость. Так, широко применяют модификацию полусинтетических пенициллинов, основной частью молекул которых является 6аминопенициллиновая кислота (6-АПК). Путем биотрансформации 6-АПК получают различные новые пенициллины с широким спектром биологических свойств. К большим преимуществам биотрансформации можно отнести высокий выход продукта – 90–100% от использованного субстрата. Работа 15. Биотрансформация глицерина в дигидроксиацетон уксуснокислыми бактериями Теоретическое введение Одним из примеров окислительной реакции трансформации является трансформация глицерина в дигидроксиацетон (ДГОА), которая осуществляется уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans. ДГОА применяется в фармацевтической, косметической и других отраслях народного хозяйства. Процесс могут проводить как растущие, так и неразмножающиеся клетки бактерий. В последнем случае предварительно выращенную биомассу помещают в среду с глицерином, не содержащую источника азота и витаминов. При этом скорость биотрансформации глицерина неразмножающимися клетками сравнима со скоростью трансформации растущими клетками. Окисление глицерина в дигидроксиацетон осуществляется ферментом глицеролдегидрогеназой в соответствии с уравнением: 129 CH2OH 2 CHOH + O2 CH2OH G. oxydans СH2OH 2 C = O + 2H2O + QкДж CH2OH Чтобы провести трансформацию глицерина неразмножающимися клетками, вначале необходимо нарастить достаточное количество бактерий на питательной среде. Среда для наращивания содержит глицерин в качестве источника углерода и энергии и дрожжевую воду в качестве источника азота и витаминов, а также монокалийфосфат. В лабораторных условиях биомассу наращивают в колбах при встряхивании на качалке в течение 36–40 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин, промывают водой и хранят в холодильнике при температуре 0–4ОС. Процесс трансформации неразмножающимися клетками проводят в среде, содержащей только водный раствор глицерина и монокалийфосфата. Использование такой среды значительно упрощает процесс выделения целевого продукта ДГОА в кристаллическом виде. В процессе трансформации однажды выращенную биомассы можно использовать многократно с отделением клеток после каждого цикла окисления центрифугированием или посредством мембранной технологии. Для проведения непрерывного процесса получения ДГОА также можно использовать мембранную технологию для возвращения бактерий в ферментер или иммобилизацию бактерий на различных носителях (полиакриламидный гель, каррагинан, гидрат окиси титана и др.) Однако скорость трансформации при иммобилизации невелика изза ухудшения снабжения кислородом в геле. Главным фактором регуляции окислительной активности бактерий при трансформации глицерина в ДГОА является концентрация растворенного кислорода. Для неразмножающейся культуры удельная скорость потребления кислорода qo2 = qp + mo2, где - стехиометрический коэффициент, г O2/ г ДГОА; 130 mo2 – коэффициент поддержания жизнедеятельности по кислороду, г O2/ г СБ ч qp – удельная скорость образования ДГОА, г ДГOА / г СБ ч. Удельная скорость образования ДГОА вычисляется по формуле: qp = (Р2 - Р1)/ x, где Р – концентрация ДГОА, г/л; – время, ч; х – концентрация биомассы, г СБ/л. Практическая часть Цели работы: 1. Изучение биотрансформации на примере получения ДГОА из глицерина неразмножающимися клетками Gluconobacter oxydans. 2. Определение зависимости удельной скорости образования продукта (qp) от интенсивности аэрации. Работа проводится на лабораторной установке по определению удельной скорости роста дрожжей. (Работа №14.) Порядок выполнения работы 1. Приготовить 500 мл среды для окисления следующего состава: глицерин – 60 г/л KH2PO4 – 2 г/л. 2. В лабораторный ферментер залить 300 мл приготовленной среды, заранее выращенную и отмытую биомассу бактерий и 3–4 капли пеногасителя. 3. Включить систему термостатирования для поддержания температуры 28–30 оС. 4. Установить режим перемешивания 500 об/мин, пользуясь тахометром. 5. Включить компрессор для подачи воздуха в ферментер. 6. Через 3–5 минут работы ферментера отобрать пробу и определить в ней концентрацию ДГОА фотометрическим способом и концентрацию биомассы нефелометрическим способом. 131 7. Через 1 час продолжения работы ферментера отобрать вторую пробу и снова, выполнив анализы по п. 6, определить концентрации ДГОА и биомассы по сухому весу. 8. Увеличить скорость перемешивания до 1000 об/мин. 9. Через 1 час продолжения работы ферментера отобрать третью пробу и снова, выполнив анализы по п. 6, определить концентрации ДГОА и биомассы по сухому весу. 10. Увеличить скорость перемешивания до 1500 об/мин. 11. Через 1 час продолжения работы ферментера отобрать четвертую пробу и снова, выполнив анализы по п. 6, определить концентрации ДГОА и биомассы по сухому весу. 12. По калибровочному графику определить интенсивность аэрации для выбранных режимов перемешивания. 13. По полученным данным анализов ДГОА и биомассы вычислить удельные скорости образования ДГОА при трех режимах перемешивания. 14. Построить график зависимости удельной скорости образования продукта при окислении глицерина в ДГОА от интенсивности перемешивания. Определение ДГОА 1. Сделать разведение пробы в 50, 100 или 200 раз. 2. Приготовить смесь 0,2%-ного раствора трифенилтетразолийхлорида (ТТХ) со щелочью (3Н раствор NaOH) в соотношении 1:1. 3. В чистую сухую пробирку поместить 0,5 мл разведенной пробы и добавить 1 мл смеси ТТХ + NaOH. Поставить в темное место на 15 мин. 4. Через 15 мин в пробирку добавить 0,5 мл 3H раствора HСl и 3 мл ацетона. 5. Определить оптическую плотность раствора на ФЭК КФК-2. 6. Рассчитать количество ДГОА по калибровочному графику, учитывая разведение. 132 Таблица 11. Экспериментальные данные процесса биотрансформации глицерина в ДГОА №№ Вре- , t oC pH Кон- Кон- СкоИнтенпро- мя ч цен- цент- рость сивность бы отботрация рация пере- аэрации, ра био- ДГОА меши- г О2/л ч промассы , г/л вания, бы г СБ/л об/мин Удельная скорость образования продукта qp, гДГОА / гСБч 500 1000 1500 Содержание отчета 1. Экспериментальные данные, оформленные в виде таблицы 11. 2. График зависимости удельной скорости образования продукта от интенсивности аэрации. Контрольные вопросы 1. Что такое биотрансформация? 2. Напишите формулу реакции окисления глицерина в ДГОА. 3. Как определить удельную скорость образования ДГОА? 4. От каких факторов зависит удельная скорость потребления кислорода при окислении глицерина неразмножающимися бактериями? ТЕМА 10. Биогеотехнология металлов В последние десятилетия интенсивно развивается новое направление биотехнологии – биогеотехнология. Биогеотехнология – наука об извлечении металлов из руд, концентратов, горных пород и растворов под действием 133 микроорганизмов и их метаболитов. Основными направлениями биогеотехнологии являются следующие. 1. Биогидрометаллургия, или бактериальное выщелачивание металлов из бедных руд: меди, цинка, урана, золота и других ценных металлов. 2. Обогащение руд. 3. Биосорбция металлов из растворов. Бактериальное выщелачивание Методы биогеотехнологии используются для извлечения из руд широкого круга ценных металлов: меди, урана, марганца, золота, серебра, платины, цинка, никеля, кадмия и др. При окислении металлов происходит переход их из закисной в окисную форму или из металлической формы в ионную (например, при выщелачивании золотосодержащей руды). Это приводит к образованию растворимых продуктов, содержащих целевой металл. Такой же эффект достигается микробным окислением серы, которая является компонентом сульфидных соединений металлов. Все более широкое распространение в гидрометаллургии получают бактериальные процессы в связи с истощением месторождений цветных металлов, в первую очередь меди, а также в связи с растущей необходимостью борьбы с загрязнением окружающей среды. Реальную возможность очистки промышленных сточных вод от тяжелых металлов представляет биосорбция металлов из растворов с помощью бактерий или их метаболитов. Методы извлечения меди из пород, содержащих минералы, путем обработки их кислыми растворами использовались уже много веков. Однако лишь в 1950-е гг. выяснилось, что в получении металлов из минералов решающую роль играют бактерии. В 1947 г. американские микробиологи Колмер и Хинкл выделили из рудничных вод неизвестную бактерию Thiobacillus ferrooxidans. Этот организм окислял Fe2+ и серу содержащие соединения. Вскоре оказалось, что он участвует и в переводе меди из рудных минералов в раствор. Сейчас известны и другие микроорганизмы, активно участвующие в извлечении металлов из минералов. 134 В настоящее время бактериальное выщелачивание используется для добычи меди и урана в промышленных масштабах во многих странах (США, Канада, Австралия, Испания и др.) В нашей стране эти исследования проводятся под руководством Г.А. Каравайко (чл.-корр РАН). Использование микроорганизмов в гидрометаллургии обладает следующими преимуществами. 1. Возможность использования горных пород с низким содержанием ценных металлов. 2. Возможность использования сложных по составу руд и концентратов, которые не поддаются переработке традиционными способами. 3. Охрана окружающей среды – возможность полной очистки стоков от тяжелых металлов. В бактериальном выщелачивании участвуют следующие микроорганизмы (рис. 27). 1. Thiobacillus ferrooxidans – наиболее изученный микроорганизм; клетки мелкие, грамотрицательные, палочковидные, у некоторых видов подвижные за счет полярного жгутика; облигатный аэроб; растет при температуре от 10 до 30ОС. 2. Leptospirillum ferrooxidans – мелкие клетки в форме вибрионов или спиральные; грамотрицательные, подвижные за счет полярного жгутика; облигатные хемолитотрофы, использующие Fe2+ как источник энергии; аэроб; ацидофил; некоторые штаммы умеренные – термофилы. 3. Sulfolobus – крайне неправильные лопастные кокки, обычно одиночные; диаметр клеток 0,8–2,0 мкм; жгутики отсутствуют; облигатный аэроб; диапазон рН 1–6; термофил (температура роста 55–87ОС); относится к архебактериям; представители этого рода играют важную роль в выщелачивании минералов при повышенной температуре. Обогащение руд Обогащение руд основано на применении сульфатредуцирующих бактерий, которые образуют сульфиды металлов, что позволяет полнее извлекать металлы из руд. При этом 135 руда обогащается в отношении благородного металла по мере удаления оксида менее ценного металла – примеси. Биосорбция металлов Горнорудная промышленность все шире применяет новые физико-химические технологии для очистки сточных вод, но часто эти технологии оказываются дорогостоящими и неэффективными. Биологические методы могут быть более экономичными и эффективными. Некоторые промышленные предприятия широко используют биологические методы для удаления из рудничных сточных вод примесей неорганических ионов. Применяемые системы обычно представляют собой большие отстойники или проточные пруды с медленным течением, в которых растут водоросли и микроорганизмы. Эти организмы накапливают растворенные металлы или образуют продукты, переводящие примеси в нерастворимую форму. Микроорганизмы способны накапливать металлы в больших концентрациях и содержат структурные компоненты, которые могут избирательно связывать специфические ионы. Работа 16. Окисление неорганических соединений железа хемолитоавтотрофными бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans Теоретическое введение Во многих процессах биогеотехнологии основными продуцентами являются хемолитоавтотрофные микроорганизмы. Хемолитоавтотрофы – микроорганизмы, использующие в качестве источника энергии реакции окисления неорганических веществ, а в качестве источника углерода – углекислый газ из атмосферы. Роль бактерий в окислении Fe2+, S0 и сульфидных минералов В окислении Fe2+, сульфидных минералов и серы принимают участие, главным образом, бактерии родов Acidithiobacillus (прежнее название – Thiobacillus) и Leptospirillum, а также археи р. Sulfolobus. Особое значение имеют ацидофильные бактерии. 136 137 В результате деятельности этих бактерий при низких значениях рН металлы переходят в раствор и могут быть извлечены из него. Типичным местом обитания ацидофильных железобактерий являются кислые рудничные воды, стоки из-под отвалов горнометаллургических предприятий, кислые гидротермы. Эти бактерии встречаются везде, где сульфидные минералы или элементарная сера приходят в контакт с атмосферой и водой, а температурные условия позволяют развиваться живым организмам. Поэтому ацидофильные тионовые бактерии легко можно выделить из рудничных вод. Они хорошо растут на средах с Fe2+ и сульфидными минералами. При развитии бактерий жидкие среды сначала прозрачные приобретают янтарный оттенок, переходящий по мере развития культуры в красно-коричневый от образования окисного железа. Окисление Fe2+ Закисное железо – наиболее легкоокисляемый субстрат для Acidithiobacillus ferrooxidans и ряда других бактерий. Реакция окисления протекает по схеме: 4 Fe2+ + О2 + 4 Н+ бактерии 4 Fe3+ + 2Н20 + Q 38 кДж/моль Эта реакция очень важна для выщелачивания металлов, так как позволяет получить сильный окислитель сульфидных минералов Fe3+, накапливать биомассу бактерий и создавать высокий окислительно-восстановительный потенциал среды. Роль бактерий и химических процессов в окислении сульфидных минералов и выщелачивании металлов может быть показана на примере окисления пирита (FeS2): 2 FeS2 + 15/2 О2 + Н2О 3+ хим. FeS2 + 2 Fe 2+ 2 Fe + 1/2 О2 + 2 Н+ S0 + Н2О + 3/2 О2 S + 6 Fe + 4 Н2О 3+ Fe2 (SО4)3 + Н2 SО4 0 3 Fe + 2 S 2+ 0 бакт. бакт. хим. бакт. 2 Fe3+ + Н2О Н2 SО4 6 Fe3+ + SО4 2- + 8 Н+ Поскольку в выщелачивании металлов основную роль играют ацидофильные хемолитотрофные тиобациллы, к которым 138 принадлежит хорошо изученный вид Acidithiobacillus ferrooxidans, в данной лабораторной работе используются бактерии именно этого вида. Механизм окисления Fe2+ в дыхательной цепи хорошо изучен у Acidithiobacillus ferrooxidans. Дыхательная цепь этих бактерий содержит все типы ферментов-переносчиков, характерных для дыхательной системы аэробных хемоорганотрофных прокариот, но участок цепи, связанный с получением энергии очень короток. Окисление Fe2+ происходит на внешней стороне цитоплазматической мембраны: в цитоплазму через мембрану железо не проникает. Акцептором электронов от Fe2+ является особый медьсодержащий растворимый белок-рустициан, локализованный, вероятно, в периплазматическом пространстве. Практическая часть Цели работы 1. Изучение влияния аэрации на скорость окисления железа бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans. 2. Изучение влияния рН среды на динамику окисления железа Acidithiobacillus ferrooxidans. Порядок выполнения работы Часть 1 1. Приготовить питательную среду следующим образом. Для культивирования Acidithiobacillus ferrooxidans среду готовят смешиванием стерильных растворов I и II. Раствор I имеет следующий состав (г): (NH4)2SO4 – 3,0 KH2PO4 – 0,5 KCl – 0,1 MgSO4 · 7H2O – 0,5 Ca (NO3)2 – 0,01 Вода дистилл. – 300 мл. Раствор II содержит (г): FeSO4 · 2H2O – 44,2 139 10 н H2SO4 – 1 мл Вода дистилл. – 700 мл Растворы I и II стерилизуют отдельно, перед посевом бактерий их смешивают и доводят значения рН в разных вариантах от 3,5 до 1,5 с интервалом в 0,5 с помощью 10% раствора H2SO4. 2. Произвести засев подготовленной среды посевной культурой Acidithiobacillus ferrooxidans Для изучения влияния аэрации опыт проводят в двух режимах: в стационарном и при культивировании на качалке. При культивировании на качалке среду разливают в качалочные колбы по 100 мл. Посевной материал вносят в количестве 10% (по объему). Для культивирования в стационарном режиме среду разливают в колбы объемом 250 мл по 50 мл и вносят посевной материал в количестве 10% (5 мл). 3. Засеянные качалочные колбы надписать и установить на качалку; колбы для стационарного культивирования надписать и поместить в термостат при 28–30 ОС. 4. Ежедневно отбирать пробы по 5 мл и сохранять их в холодильнике до следующего занятия. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. Определить количество образовавшегося Fe3+ комплексонометрическим титрованием. 2. Заполнить таблицу 12 экспериментальными данными. 3. Построить график зависимости окисление железа бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans от величины рН и аэрации. Комплексонометрический метод определения железа Метод основан на способности комплексона III при рН 1,0– 1,5 образовывать с ионом Fe3+ малодиссоциированный комплекс. В качестве индикатора используют сульфосалициловую кислоту, которая в сильнокислой среде образует с ионом железа растворимое соединение лилово-красного цвета. Реактивы: 1. Соляная кислота (1:1). 140 2. Сульфосалициловая кислота (20% раствор). 3. Трилон Б (4,653 г в 500 мл дистилированной воды). 4. Перекись водорода (пергидроль). Ход определения Налить в коническую колбу на 250 мл 50 мл дистиллированной воды и поместить туда 1 мл пробы, добавить 1 мл раствора соляной кислоты и 1 мл сульфосалициловой кислоты. Смесь нагреть до 80ОС (до появления первых пузырьков). Горячий, окрашенный в лиловокрасный цвет раствор медленно титруют комплексоном III (трилоном Б) при тщательном перемешивании. В точке эквивалентности лилово-красная окраска переходит в лимонножелтую, характерную для комплексоната железа. Интенсивность окраски зависит от содержания железа. Если железа много, окраска в конце титрования приобретает желто-зеленый цвет. Чтобы желтозеленая окраска не была слишком интенсивной и не мешала титрованию, раствор не должен содержать более 100 мг Fe2O3 в 100 мл раствора. При малых количествах железа окраска получается светло-желтой. Для точного установления точки эквивалентности рекомендуется сравнивать окраску титруемого раствора с окраской перетитрованного раствора. При добавлении к светло-желтому раствору 1–2 капель перекиси водорода окисное железо восстанавливается в закисное. Раствор снова становится лиловым, если в пробе присутствуют ионы Fe2+. В этом случае снова повторяют титрование трилоном Б. Расчет ведут по формуле: CFe3+ = V трилона Б, мл х 1,4, г/л Результаты анализов занести в таблицу и построить график по данным всей группы. 141 Таблица 12. Влияние рН на окисление железа бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans рН Fe3+ Трилон Б, Fe3+, мл г/л Σ Трилон Б, мл г/л Fe2+ Трилон Б, мл Fe2+, г/л 1,5 2,0 2,5 3,0 Данные по влиянию аэрации на окисление железа бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans оформляют подобным образом. Контрольные вопросы 1. Что такое биогеотехнология? 2. Что такое хемолитоавтотрофные бактерии? Назовите представителей этих бактерий. 3. Дайте характеристику бактерий Acidithiobacillus ferrooxidans. 4. Какова роль бактерий и химических процессов в окислении пирита (FeS2)? 142 РАЗДЕЛ III. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ В настоящее время важнейшим направлением микробиологии можно считать экологическую микробиологию. Это – область науки о микроорганизмах, приспособленных к определенной природной или искусственно созданной среде. С нею тесно связан раздел микробиологии, занимающийся изучением влияния факторов внешней среды на микроорганизмы. Он включает в себя не только изучение экологии отдельных их видов, но и анализ среды и ее изменения под действием микробных сообществ. Экологическая микробиология бурно развивается с 70-х годов 20 в. С 90-х годов в экологической микробиологии стали применяться методы молекулярной биологии и генной инженерии. Методы молекулярной биологии позволяют изучать состав и динамику микробных сообществ, не выделяя их в чистую культуру. Оказалось, что число выделенных традиционными способами видов микроорганизмов составляет всего 0,1 % от их общего количества. Огромное множество неизученных видов микробов безусловно откроет возможности создания новых биотехнологических процессов. Методы генной инженерии стали применяться для получения генетически измененных штаммов с целью борьбы с загрязнением окружающей среды. С проблемой восстановления окружающей среды, загрязненных вследствие антропогенного влияния связана значительная часть исследований в экологической микробиологии. Тема 11. Участие микроорганизмов в глобальных биогеохимических циклах Микроорганизмы имеют исключительное значение для существования жизни на нашей планете. Они катализируют уникальные и важнейшие реакции живого мира: расщепляют мертвую биомассу, участвуют в процессе фотосинтеза и в глобальных циклах элементов (углерода, азота, серы, фосфора, 143 кальция и др.). Без этих реакций жизнь на Земле никогда бы не возникла или прекратилась бы очень скоро. Основным циклом в системе биогеохимических циклов является круговорот органического углерода и связанные с ним циклы кислорода и углекислого газа. Связь между этими циклами следует из уравнения, описывающего фотосинтез (слева направо) и дыхание (в обратном направлении). CO2 + H2O [CH2O]n + O2 Фотосинтез Дыхание В цикле органического углерода первичными продуцентами являются фототрофные оксигенные организмы (цианобактерии, водоросли, растения) и в небольшой степени – хемоавтотрофы. Основными деструкторами являются органотрофные организмы – аэробные и анаэробные. Конечным продуктом деструкции служат CO2, который возвращается в атмосферу. Первыми деструкторами природных биополимеров (белков, липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот) являются такие микроорганизмы, которые синтезируют гидролитические ферменты. В аэробных условиях к таким микроорганизмам относятся грибы, некоторые грамположительные бактерии, в том числе актиномицеты. В анаэробных условиях – это только бактерии, в основном, клостридии. В аэробных условиях происходит полное окисление биополимеров до углекислого газа и воды. В анаэробных условиях образуются жирные кислоты, спирты и молекулярный водород, которые используются вторичными анаэробами (сульфатредуцирующими, денитрифицирующими и др. бактериями). Синтез биомассы требует участия, кроме углерода и воды, других биогенных элементов, прежде всего азота. Ведущая роль в процессах трансформации азотсодержащих соединений принадлежит микроорганизмам. Биогеохимический цикл азота состоит их 4 этапов: азотфиксация, аммонификация, нитрификация, денитрификация. Все они целиком определяются деятельностью бактерий. В задачах практикума рассматриваются только 144 азотфиксирующие микроорганизмы. бактерии и целлюлозолитические Работа 17. Получение накопительной культуры свободноживущих азотфиксирующих бактерий Теоретическое введение Азот относится к четырем биогенным элементам (С, Н, О, N), составляющим основу живого вещества. Однако подавляющая масса азота в биосфере представлена химически инертным молекулярным азотом атмосферы. Поэтому, несмотря на то, что молекулярный азот составляет около 80% земной атмосферы, большинство организмов не могут использовать его непосредственно. Питание всех растений и животных, а также большей части микроорганизмов зависит от источников связанного, или фиксированного азота. Связанный азот в форме аммиака, нитрата и органических соединений часто находится в недостатке и в почве и в воде, что ограничивает развитие живых организмов. Связывание азота атмосферы (азотфиксация) – главное звено в круговороте азота в природе, поскольку именно этот процесс лимитирует все остальные звенья превращения азота. В настоящее время установлено, что больше 90% общей фиксации азота составляет биологическая фиксация азота микроорганизмами. Этот уникальный процесс осуществляется только прокариотными клетками. Процесс связывания свободного азота катализируется ферментом нитрогеназой и происходит с затратой энергии АТФ в соответствии с уравнением N2 + 8eˉ + 8H+ + АТФ 2NH3 + H2 + АДФ + Фн Азотфиксирующие бактерии принадлежат к двум группам: 1) свободноживущие бактерии; 2) бактерии, живущие в симбиозе с растениями, чаще с бобовыми. Наиболее активными азотфиксаторами среди симбиотических бактерий являются бактерии p.Rhizobium, внедряющиеся в корневые волоски бобовых растений и 145 развивающиеся в образованных на корнях клубеньках, где и происходит фиксация азота. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии распространены повсеместно и встречаются среди самых разных таксономических групп: среди анаэробных клостридий, фотосинтезирующих анаэробов, цианобактерий, спирилл, псевдомонад и др. Способность бактерий усваивать молекулярный азот была обнаружена впервые С.Н.Виноградским на примере выделенных из почвы бактерий, названных им в честь Л. Пастера Clostridium pasteurianum. Clostridium pasteurianum – облигатно анаэробные крупные споровые палочки. В молодом возрасте они подвижны. Позднее клетки теряют жгутики и запасают крахмалоподобное питательное вещество – гранулезу. Это вещество синеет при воздействии раствором йода в йодистом калии (раствор Люголя). На поздней стадии развития форма клетки меняется: она расширяется в середине или на конце клетки в результате образования споры (рис.28). Clostridium pasteurianum живет за счет сбраживания сахаров с образованием масляной и уксусной кислот и газов СО2 и Н2. Наиболее хорошо изученным среди свободноживущих аэробных азотфиксирующих является азотобактер. Наиболее хорошо изученным среди аэробных азотфиксирующих бактерий является р. Azotobacter. Azotobacter chroococcum – наиболее распространенный вид. Форма клеток представляет собой кокки, соединенные парами или более крупными группами и окружены большой слизистой капсулой (рис.28). С возрастом они образуют темнокоричневый пигмент. Внутри клеток накапливается большое количество запасного питательного вещества – в виде поли-β-оксимасляной кислоты. В результате этого при рассмотрении под микроскопом неокрашенных препаратов клетки имеют зеленоватый оттенок. Активность азотфиксации до 20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества. 146 Практическая часть Цель работы – получение накопительной культуры свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов и изучение морфологии аэробных и анаэробных азотфиксаторов. Для обнаружения азотфиксирующих организмов в природных средах используют метод получения накопительных культур на элективной среде, в которой отсутствует источник азота. В частности, используется среда Эшби, г/л: Маннит (или глюкоза) – 20,0 K2HPO4 – 0,2 MgSO4 – 0,2 NaCl – 0,2 K2SO4 – 0,1 CaCO3 – 5,0, pH среды 6,0 – 6,5 Питательную среду по 30 мл, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100 – 150 мл и вносят комочек почвы (1/2 чайной ложки), закрывают ватными пробками и термостатируют при 28 – 30 ОС. На 5 – 6 сутки на поверхности образуется бурая пленка, при микроскопировании которой обнаруживаются клетки азотобактера в виде кокков и диплококков. Некоторые клетки покрыты слизистой капсулой. Элективными условиями для азотобактера, способного фиксировать азот атмосферы являются аэрация, отсутствие в 147 питательной среде азота и присутствие в среде фосфора и кальция, к которым требователен азотобактер. В некоторых случаях наблюдается вспенивание жидкости в колбе и появление запаха масляной кислоты, что указывает на развитие в среде на дне колбы в анаэробных условиях бактерий Clostridium pasteurianum. Для изучения морфологии микроорганизмов готовят два препарата: один из пленки с поверхности среды для выделения азотобактера (фиксированный препарат, негативно окрашенный тушью). Микроскопируют с объективом 100х; второй препарат готовят из нижних слоев жидкости для выявления клостридий. Готовят живой препарат с добавлением раствора Люголя (реактив, окрашивающий гранулезу). Микроскопируют с объективом 40х. В местах скопления гранулезы просматриваются бурые или голубовато-синие включения. В местах утолщения клетки можно заметить овальное тельце – спору, сильно преломляющее свет. Спора не окрашивается раствором Люголя. Порядок выполнения работы 1. Получить накопительную культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов. Описать характер роста. 2. Приготовить фиксированный препарат из образовавшейся пленки, негативно окрашенной тушью. Микроскопировать с объективом 100х. Зарисовать. 3. Приготовить со дна накопительной культуры живой препарат, окрашенный раствором Люголя. Микроскопировать с объективом 40х. Зарисовать. 4. Провести качественную реакцию с хлорным железом на присутствие масляной кислоты. Описать результат реакции. 5. Провести качественную реакцию образования масляноэтилового эфира на присутствие масляной кислоты. Описать результат реакции. Качественные реакции на масляную кислоту 1. Реакция с хлорным железом. 148 Образование масляной кислоты в среде обнаруживают по реакции с хлорным железом. 5 мл жидкой среды из накопительной культуры переносят в пробирку, добавляют 2 мл 5% раствора хлорнокислого железа и нагревают до кипения. Образующейся раствор маслянокислого железа придает пробе красно-коричневый цвет. 2. Реакция образования масляно-этилового эфира. К 5 мл культуральной жидкости прибавляют 0,5 мл 96О этилового спирта и 1 мл концентрированной серной кислоты. Смесь перемешивают и немного нагревают. Образующийся масляноэтиловый эфир определяется по характерному запаху, напоминающему запах ананаса. Реакция идет по уравнению: СН3СН2СН2СОООН + СН3СН2ОН Масляная кислота Этанол СН3СН2СН2СОООСН2СН3 + Н2О Масляноэтиловый эфир Содержание отчета 1. Описание культуральных признаков накопительной культуры азотфиксирующих бактерий. 2. Рисунки препаратов азотфиксирующих бактерий. 3. Описание качественных реакций на масляную кислоту. Контрольные вопросы 1. Что такое азотфиксация? Дать уравнение реакции. 2. Экологическое значение азотфиксации в круговороте веществ. 3. Какие микроорганизмы осуществляют азотфиксацию? 4. Как получить накопительную культуру азотфиксирующих бактерий? Работа 18. Микроорганизмы, разлагающие целлюлозу в аэробных и анаэробных условиях Наиболее распространенным углеродным соединением в природе является целлюлоза. Целлюлоза (клетчатка) представляет собой сложный полисахарид (С6 Н10 О5)n, являющийся главным элементом растительных клеток. К этой же группе веществ 149 относятся гемицеллюлозы и лигнин, являющиеся компонентами межклеточного вещества. Громадное количество целлюлозы в виде растительных остатков и отходов попадает в почву и водоемы, где подвергается биологическому расщеплению. Глобальная роль микробов в этом процессе заключается в том, что ни животные, ни растения, как правило, не способны разлагать целлюлозу. Разложение целлюлозы – это сложный, комплексный процесс, происходящий при участии сообщества микроорганизмов. Эти процессы происходят в природе в разных условиях аэрации, температуры и рН среды. Анаэробное разложение целлюлозы В анаэробных условиях под влиянием комплекса целлюлолитических ферментов целлюлоза гидролизуется с образованием целлобиозы и глюкозы. Целлобиоза (дисахарид) под действием фермента целлобиазы переходит в глюкозу (1), которая подвергается дальнейшим превращениям по типу маслянокислого брожения с образованием масляной, уксусной, янтарной, молочной и муравьиной кислот, водорода, углекислого газа, иногда этилового спирта (2). Процесс последовательного расщепления целлюлозы можно выразить следующими уравнениями: (С6 Н10 О5)n + n . Н2 О n . С6 Н12 О6 (1) С6 Н12 О6 CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + CO2 + Q кДж Масляная кислота Уксусная кислота (2) Возбудителями анаэробного разложения целлюлозы являются мезофильные и термофильные бактерии, относящиеся в своем большинстве к роду Clostridium. Cl. cellulosae Omelianskii, Подвижные, грамположительные палочки длиной от 4 до 8 мкм, диаметром около 0,5 мкм. В старых культурах полочки сильно удлиняются и имеют вид тонких нитей. На конце клетки образуется шаровидная спора, значительно превосходящая по ширине клетку. Такая клетка со спорой похожа на барабанную палочку. 150 Cl. thermocellum представляет собой прямые или слегка изогнутые палочки с округлой спорой на конце. По Граму не окрашивается. Оптимум роста при t 55 – 56 ОС, рН 7,0 – 7,2. При сбраживании целлюлозы накапливают сахара, уксусную кислоту, этиловый спирт, Н2, СО2. Целлюлозолитические анаэробные микроорганизмы распространены повсеместно. Они всегда обнаруживаются в почвах, особенно окультуренных, удобренных органическими удобрениями, в воде, в иле прудов и других водоемах, в рубце жвачных животных. Практическая часть Цель работы – получение накопительной культуры анаэробных целлюлозолитических бактерий и изучение морфологии анаэробных бактерий, сбраживающих целлюлозу. Для выделения из почвы возбудителей анаэробного разложения целлюлозы используют питательную среду Омелянского следующего состава: мясо-пептонный бульон – 300 мл; вода водопроводная – 700 мл; (NH4)2 HPO4 – 1,0 г; К2 НРО4 – 1,0 г; MgSO4 – 0,5 г; NaCl – 1,0 г; CaCO3 – 2,0 г; FeSO4 – 2 капли 1% раствора. Среду стерилизуют в автоклаве при 1 ати в течениие 30 мин. Небольшие колбы наливают на ⅔ питательной средой. Добавляют к ней 0,5 – 1 г исследуемой почвы. Содержимое кипятят 5 мин для уничтожения бесспоровых форм микроорганизмов. После кипячения в колбу кладут несколько полосок стерильной фильтровальной бумаги. Доливают стерильной питательной средой доверху и закрывают пробкой с газоотводной трубкой или затвором. Свободный конец трубки помещают в сосуд с водой. Прибор помещают в термостат при температуре 30 – 35 ОС. По мере развития брожения фильтровальная бумага желтеет и 151 покрывается слизью. Через 1,5 – 2 недели полоски фильтровальной бумаги полностью распадаются на отдельные волокна. По истечении указанного срока среду микроскопируют. Готовят фиксированный препарат, окрашивают его фуксином и исследуют. Возбудители анаэробного разложения целлюлозы имеют вид слегка изогнутых длинных палочек с крупной спорой на конце. Аэробное разложение целлюлозы Большое количество целлюлозы находится на поверхностных, хорошо аэрируемых слоях почвы. Здесь она разлагается аэробными микроорганизмами, вовлекаясь в общий круговорот углерода в природе. Общая схема аэробного разложения целлюлозы сводится к тому, что под влиянием комплекса целлюлозолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, происходит гидролиз целлюлозы до сахаров и высокомолекулярных органических кислот (уроновых). Уроновые кислоты играют важную роль в образовании плодородного слоя почвы – гумуса. В присутствии молекулярного кислорода, сахара превращаются в оксикислоты. Оксикислоты, в свою очередь полностью окисляются до углекислого газа и воды. (С6Н10О5)n + Н2О + О2 целлюлоза R – СНОНСООН + О2 СО2 + Н2О + Q кДж Особенно много аэробных микробов, разлагающих целлюлозу, содержится в окультуренных пахотных почвах, удобренных навозом. В процессе разложения целлюлозы участвуют разнообразные бактерии: миксобактерии, некоторые представители неспоровых и споровых бактерий, актиномицеты. Среди них ведущая роль принадлежит миксобактериям. Клетки миксобактерий – грамотрицательные бактерии, образующие плодовые тела и устойчивые к высушиванию миксоспоры. Клетки относительно крупные (0,6-1,2 х 2-10) мкм, часто окрашенные в желтый, оранжевый или красный цвет за счет каротиноидов. Миксобактерии обладают скользящим движением, которое возможно только на твердом субстрате. Многие миксобактерии имеют сложный цикл развития. Он состоит в том, что с возрастом клетки утолщаются и превращаются в более или 152 менее крупные овальные или сферические покоящиеся клетки – миксоспоры, которые устойчивее к неблагоприятным воздействиям, чем вегетативные клетки, но менее устойчивые, чем эндоспоры бактерий. У ряда представителей миксобактерий миксоспоры бывают собраны в группы (спорангиоли), включающие до нескольких десятков клеток, погруженных в слизь. Скопления спорангиолей образуют ложные плодовые тела, часто видимые невооруженным взглядом. Миксобактерии, разрушающие целлюлозу, обнаруживаются в основном среди родов Polyangium и Sorangium. Род Polyangium образует спорангиоли очень крупные (80-400 мкм). Род Sorangium образует спорангиоли довольно мелкие (20-30мкм). Кроме миксобактерий в почвах часто встречаются разлагающие целлюлозу виды родов Cytophaga, Sporocytophaga и Cellvibrio (рис.29). Род Cytophaga – грамотрицательные палочки, обладающие скользящим движением. Виды этого рода часто имеют клетки с заостренными концами, миксоспоры не образуют. Род Sporocytophaga – грамотрицательные гибкие палочки с округлыми концами, также обладающие скользящим движением. Образуют покоящуюся стадию – микроцисту. Род Cellvibrio – грамотрицательные, мелкие, изогнутые, подвижные клетки, с одним жгутиком, не образующие эндоспор. В кислых лесных почвах главная роль в превращении целлюлозы принадлежит грибам (p. Trichoderma, p. Aspergillus, Fusarium и др.). Практическая часть Цель работы – получить накопительную культуру возбудителей аэробного разложения целлюлозы и изучить морфологические особенности аэробных целлюлозоразрушающих бактерий. 153 Порядок выполнения работы Для постановки накопительной культуры возбудителей аэробного разложения целлюлозы лучшей считается минеральная среда Гетчинсона (рН 7,2 – 7,3): NaNO3 – 2,5 K2 HPO4 – 1,0 CaCl2 . 6H2 O – 0,1 MgSO4 . 7H2 O – 0,3 NaCl – 0,1 Fe Cl3 . 6H2 O – 0,01 H2 Oдистил. – 1000 мл В колбу емкостью 150 – 200 мл наливают тонким слоем (не выше 1 см) питательную среду, вносят в нее 0,5 – 1,0 г почвы и немного мела ( на кончике шпателя). На дно колбы опускают сложенный конусом складчатый фильтр широкой стороной вниз. Вместо конических фильтров можно пользоваться сложенной в «гармошку» фильтровальной бумагой, положенной на дно колбы. 154 Колбы закрывают ватной пробкой и ставят в термостат с температурой 25 – 26 ОС на 10 – 14 суток. Энергичное разрушение бумаги происходит на границе жидкости, где диффузия кислорода и питательных солей в фильтровальную бумагу обеспечивает микроорганизмам наилучшие условия питания и дыхания. Бумага в этом месте покрывается желтоватыми или оранжевыми пятнами за счет развития пигментных бактерий, становится ослизненной и расползается на волоконца; конус оседает на дно колбы. По указанным изменениям судят о процессе разложения целлюлозы. Для микроскопического изучения берут бактериологический петлей немного слизи, покрывающей бумагу, или кусочек разложившейся фильтровальной бумаги. Растирают ее на предметном стекле в капле питательной среды, взятой из колбы. Готовят мазок, окрашивают фуксином и исследуют под микроскопом. При микроскопии могут быть обнаружены грибы и их споры. Наиболее активными разрушителями целлюлозы являются бактерии. Cytophaga: Размер клеток (4 – 6 0,5 мкм). Окрашивают фильтровальную бумагу в оранжевый цвет. Cellvibrio: Размер клеток (2 – 4 0,5 мкм). На фильтровальной бумаге они образуют желтый или зеленый пигмент. Sorangium и Polyangium: палочки с закругленными концами, образуют миксоспоры, спорангиоли и плодовые тела. Содержание отчета 1. Описание культуральных признаков накопительной культуры аэробных микроорганизмов, разлагающих целлюлозу. 2. Рисунки возбудителей разложения целлюлозы. Контрольные вопросы 1. Каким образом происходит аэробное разложение целлюлозы? 2. Какие микроорганизмы вызывают аэробное разложение целлюлозы? 155 3. Как получить накопительную культуру возбудителей аэробного разложения целлюлозы? 4. Какими визуальными признаками характеризуется процессы разложения целлюлозы? Тема 12. Биотехнологическая защита окружающей среды Утилизация разнообразных органических отходов, жидких стоков различных отраслей промышленности, сельского хозяйства, бытовой деятельности человека является злободневной и острой проблемой. Для этого необходимо создавать новые технологии, способные улавливать, перерабатывать, утилизировать загрязнители или токсические вещества, уменьшая, смягчая или предотвращая нежелательное воздействие на окружающую среду. Вклад в решение этой проблемы биотехнологических методов трудно переоценить. Большую роль в очистке воздуха, воды и рекультивации земли играют микроорганизмы – деструкторы пестицидов, поверхностно-активных веществ, нефтяных загрязнителей, ксенобиотиков и т.д. Работа 19. Утилизация целлюлозы в анаэробных условиях методом биоконверсии Теоретическая часть Ежегодный прирост растительной биомассы в мире составляет 2х10¹¹ т, примерно 40% от этого количества приходится на целлюлозу. Помимо растительной биомассы целлюлоза находится в большом количестве во многих промышленных и сельскохозяйственных отходах: опилках и стружках древесины, соломе и ботве сельскохозяйственных культур, лузге и отрубях зерновых культур, отходах текстильной отрасли, различных отходах целлюлозно-бумажного производства, макулатуре. Часто промышленные отходы содержат вредные для окружающей среды примеси и, попадая в почву и водоемы, отравляют их. Растительная биомасса (а также отходы сельского хозяйства) помимо целлюлозы содержат большое количество лигнина - вещества, препятствующего её разложению и, тем самым, обуславливающего длительность гниения биомассы. Это, в свою 156 очередь, создает также неблагоприятную экологическую ситуацию. Решить проблему утилизации целлюлозосодержащих отходов мог бы процесс прямой бактериальной биоконверсии, в ходе которого целлюлоза трансформируется в полезные продукты, например, в уксусную кислоту и этиловый спирт. Целлюлоза - один из наиболее распространенных полимеров в природе. Её макромолекулы представляют собой цепи линейно расположенных моносахаров со степенью полимеризации до нескольких тысяч. В зависимости от набора сахаров, составляющих полимерные цепи, различают целлюлозу и гемицеллюлозу: целлюлоза - полимер глюкозы; гемицеллюлоза - разветвленный полимер галактозы, маннозы, ксилозы, арабинозы, глюкозы и уроновых кислот. В ходе биоконверсии бактерии выделяют целлюлолитические экзоферменты, гидролизирующие (расщепляющие) макромолекулы целлюлозы и гемицеллюлозы до моносахаров, которые затем сбраживаются другой группой ферментов - эндоферментов: Выход того или иного продукта зависит от количества и активности фермента, катализирующего данную реакцию в параллельных путях сбраживания пирувата, что, в свою очередь, обуславливается физиологическими особенностями культуры микроорганизма: для бактерий Clostridium thermocellum: С6Н12О6 + 0,5 Н2О → С2Н5ОН + 1,5 СО2 + 0,5 СН3СООН + глюкоза этанол уксусная кислота + 0,5 С2Н4(ОН)СООН + Н2 молочная кислота для бактерий Thermoanaerobacter ethanolicus: С6Н12О6 + 0,1 Н2О→1,8 С2Н5ОН + 0,1 СН3СООН + 1,9 СО2 + 0,2 Н2 Таким образом, процесс биоконверсии состоит из одной стадии, совмещающей предварительный ферментативный гидролиз целлюлозы и сбраживание сахаров до целевых продуктов (рис. 30). Это качество выгодно отличает метод биоконверсии от других и делает его абсолютно экологически чистым, так как не 157 используются экологически опасные гидролизные реагенты (кислоты, щелочи) и не требуются капитальные затраты на отдельную стадию ферментативного гидролиза. Процесс биоконверсии целлюлозосодержащего сырья осуществляется анаэробными термофильными бактериями. Использование анаэробных организмов позволяет снизить капитальные затраты за счет отсутствия аэрации среды и меньшей интенсивности перемешивания. Термофильность бактерий О (оптимальная температура развития 50 – 70 С) обуславливает более мягкие требования к стерильности среды и субстрата. В результате деполимеризации целлюлозы и гемицеллюлозы в культуральной среде образуется целый набор сахаров. Для более полного потребления этих сахаров целесообразно использовать в качестве рабочей культуры бактерий не чистую культуру продуцента, а смешанную культуру (состоящую из нескольких видов микроорганизмов).Это объясняется тем, что разные виды бактерий способны усваивать разные углеводы в качестве источника углерода. Предложенная для работы смешанная культура состоит из целлюлозолитических бактерий (Clostridium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobium broсkii). Практическая часть Цель работы – ознакомление студентов с процессом разложения целлюлозы в этанол и органические кислоты в анаэробных условиях методом прямой биоконверсии термофильными бактериями. Культивирование анаэробных микроорганизмов проводят в 158 специальных колбах, имеющих герметичные пробки с отводными трубками для сбора газообразных продуктов брожения (СО2). Трубку соединяют с U-образным манометром, заполненным концентрированной серной кислотой, что позволяет измерить избыточное давление в колбе (рис. 31), создаваемое газообразными продуктами. Для культивирования бактерий используют синтетическую 159 питательную среду с pH 7.0 - 7.2 следующего состава (г/л): КН2РО4 – 1,5; К2НРО4 – 2,9; (NH4)2SO4 – 1,3; CaCl2 – 1,5; MgSO4 – 1,22; FeSO4 – 1,25 10-6; Резазурин – 2,0 10-6; Цистеин-HCl – 0,5; дрожжевой экстракт – 2,0; целлюлоза (фильтровальная бумага) – 10,0 (1%вес). Резазурин и цистеин-HCl – восстанавливающие агенты; их добавляют в большинство сред, предназначенных для культивирования анаэробов, чтобы снизить окислительновосстановительный потенциал среды. Перед засевом среду кипятят для удаления растворенного кислорода. Засеянные колбы инкубируют при температуре 60˚С в термостате без перемешивания в течения 7-10 суток. По истечении этого времени оценивают интенсивность разложения целлюлозы по разности ее массы в начале и в конце эксперимента; прирост биомассы оценивают по изменению оптической плотности среды (при длине волны λ=540 нм). Образование продуктов биоконверсии определяют по изменению рН среды и оксидиметрическим методом: при реакции образца культуральной жидкости с концентрированной серной кислотой и водным раствором бихромата калия наличие зеленоголубой окраски свидетельствует о присутствии этанола и органических кислот. По окончании культивирования проводят микрокопирование образцов культуральной жидкости с целью оценки морфологических особенностей бактерий, осуществляющих конверсию целлюлозы. 160 Порядок выполнения работы Часть 1 1. Взвесить полоски фильтровальной бумаги. 2. Положить полоски бумаги в колбу, залить прокипяченной питательной средой. 3. Отфильтровать через бумагу 4 мл питательной среды. 4. Измерить рН среды. 5. Измерить оптическую плотность среды против дистиллированной воды при λ=540 нм на фотоэлектроколориметре. 6. В пробирку с 1 мл концентрированной серной кислоты и 0.2 мл раствора бихромата калия добавить 1 мл отфильтрованной питательной среды. Отметить окраску раствора. 7. Засеять прогретую колбу культурой; объем засевного материала 10-20% от рабочего объема колбы. 8. Закрыть колбы специальной пробкой с U-образным манометром, поставить в термостат на неделю. Часть 2 (выполняется на следующем занятии) 1. Взвесить бумажный фильтр. 161 2. Содержимое колбы взболтать и отфильтровать через бумажный фильтр. Фильтр с осадком поместить в термостат до полного высыхания. 3. Отфильтровать через бумагу 4 мл культурной жидкости. 4. Измерить рН культурной жидкости. 5. Измерить оптическую плотность культурной жидкости против дистиллированной воды при λ=540 нм на фотоэлектроколориметре. 6. В пробирку с 1 мл концентрированной серной кислоты и 0.2 мл раствора бихромата калия добавить 1 мл отфильтрованной культуральной жидкости. Отметить окраску раствора. 7. Взвесить бумажный фильтр с осадком. 8. Рассчитать вес осадка по разности масс фильтра до и после фильтрования. 9. Рассчитать степень конверсии целлюлозы как отношение разности начального и конечного ее веса к начальному, выраженное в процентах: ∆S=((Mн-Mк)/Mн)х100% 10. Аналогично рассчитать относительный прирост биомассы ∆D по оптической плотности. 11. Приготовить препарат и промикроскопировать. Зарисовать микроскопическую картину, указав увеличение микроскопа. Содержание отчета 1. Дата проведения опыта. 2. Название лабораторной работы. 3. Описание условий проведения опыта (температура, среда, время культивирования, название и характеристика культуры). 4. Рисунок прибора для анаэробного культивирования. 5. Название и краткое описание аналитического метода, запись результатов в таблице. 6. Рисунок с указанием увеличения микроскопа. 7. Результаты опыта занести в таблицу 14. 162 Таблица 14. Данные опыта по биоконверсии целлюлозы рН среды Оптическая плотность среды, D ΔD, Масса ΔS, % целлюлозы % Оксиметрический метод (цвет) S, г нач. конеч. нач. конеч. нач. конеч. нач. конеч. Контрольные вопросы 1.Что такое целлюлоза и гемицеллюлоза? 2. В чем состоит экологическое значение утилизации целлюлозы? 3. Что такое биоконверсия? Как происходит этот процесс? 3. Какие продукты образуются в результате биоконверсии? 5. Какие преимущества у процесса прямой биоконверсии? 6. Какими физиологическими особенностями обладают микроорганизмы, осуществляющие процесс биоконверсии целлюлозы? 7. Какие группы бактерий входят в состав рабочей смешанной культуры? 8. Какими микроорганизмами осуществляется процесс биоконверсии (названия)? 9. Как осуществляется анаэробное культивирование? Особые правила по технике безопасности при выполнении работы 19 В работе используется концентрированная серная кислота. Работы с ней вести крайне осторожно, избегать попадания кислоты на одежду и кожу. При разливе кислоту необходимо засыпать большим количеством соды и затем несколько раз смыть водой. При попадании кислоты на кожу надо немедленно смыть большим количеством воды. Эксперимент ведется при повышенной температуре (60ОС). Поэтому при работе с термостатом необходимо соблюдать осторожность, пользоваться полотенцем или прихваткой во 163 избежание ожога. При проведении эксперимента необходимо четко выполнять правила работы с живыми микроорганизмами, не допуская заражения культуры, а также ее попадания в организм. Анаэробные бактерии могут быть патогенны для человека. Работа 20. Использование нефтеокисляющих микроорганизмов для защиты окружающей среды Теоретическое введение Нарушение технологий добычи, переработки и транспортировки нефти и нефтепродуктов приводит к загрязнению грунтов, почв, а также грунтовых вод и поверхностей водоемов. Нефть и нефтепродукты, благодаря высокой адсорбирующей способности почвы длительное время сохраняются в ней, изменяя ее физико-химические и биологические свойства. Нефтяное загрязнение подавляет микробиологические и биохимические процессы: вызывает изменение структуры биоценозов, активности и направленности почвообразовательных процессов. Восстановление плодородия почвы после воздействия нефтепродуктов в естественных условиях длится десятки лет, а загрязнение грунтовых вод может сохраняться сотни лет. Изучение и разработка экологически безвредных приемов ускорения деградации нефтепродуктов в почве и грунтах является важной задачей в реализации проблемы рекультивации техногенно нарушенных земель. По общему представлению, нефть – это сложная смесь углеводородных и гетерогенных соединений, образовавшихся из исходного органического вещества, захороненного в осадочных породах. В образовании нефти, в процессах ее изменения и разрушения в литосфере бактериологический фактор имеет первостепенное значение. Существует большое количество природных микроорганизмов, которые потребляют нефтепродукты в качестве источника углерода, окисляют токсичные соединения до СО2 и Н2О, а также преобразовывают их в гумусоподобные вещества. 164 Микроорганизмы, потребляющие углеводороды, распространены повсеместно в почве, стоячей воде, разлагающихся веществах и т.д. Там, где почва беспрестанно загрязняется нефтью, эти организмы находят благоприятные условия для своего развития. Продукты микробиологического окисления углеводородов изменяются в зависимости от строения углеводородов, вида микробов, условий культивирования микробов и фазы развития процесса. В большинстве случаев в результате образуются различные продукты, из которых ни один не является главным конечным продуктом реакции. Практически можно считать, что микробы воздействуют на углеводороды тремя различными путями: 1) они могут слегка изменять их, превращая углеводороды в другие аналогичные и простые соединения; 2) они могут значительно изменять их, превращая в углеродные скелеты бесчисленных органических соединений, составляющих клетки; 3) они могут полностью окислять их до СО2 и Н2О. Организмы, участвующие в последнем процессе, являются наиболее эффективными в том смысле, что получают всю энергию, высвобождающуюся вследствие полного окисления соединений. Скорость окисления углеводородов такими культурами бактерий обычно стимулируется аэрацией. Механизм окисления углеводородов микроорганизмами. В первичном воздействии на углеводородную цепь участвует кислород. Без молекулярного кислорода углеводороды не окисляются. Расщепление их происходит путем терминального окисления при участии фермента монооксигеназы (алканоксигеназы) и последующего β-окисления жирных кислот до ацетил-СоА: Парафин + О2 + НАД . Н2 Алифатический спирт + НАД + Н2О Углеводородоокисляющие бактерии играют важную роль в круговороте углерода на Земле. Их воздействию подвергается большое количество различных углеводородов и углеводородных смесей, и до сих пор еще не обнаружен углеводород, устойчивый к такому воздействию. 165 Углеводороды с длинной цепью используются очень многими бактериями. По мере удлинения цепи парафинов растет число видов, способных использовать эти соединения. Многие псевдомонады окисляют углеводороды настолько полно, что накопления промежуточных продуктов не происходит. Только у Acinetobacter продукты окисления выделяются в среду, а у Nocardia накапливаются в клетке. Характер продуктов зависит от природы субстрата. Дрожжевые клетки тоже активно окисляют различные фракции углеводородов. Особенно активно развиваются на углеводородах два вида дрожжей – Candida lipolytica и C. tropicalis. C. lipolytica окисляет все высшие гомологи углеводородов, начиная с С15 – соединений. Известно, что дрожжевые организмы широко распространены в природе. Особенно большие количества их распространены и найдены в почвах, немало в речной и морской воде. Дрожжи постоянно встречаются на растениях в составе микрофлоры корней, на листьях, цветах, плодах и семенах. Концентрация углеводородов в среде для выращивания дрожжей в опытных и опытно-промышленных условиях составляет 1 – 5 %. Присутствие больших количеств углеводородов в среде ингибирует рост дрожжей, т.к. неметаболизированные или частично метаболизированные углеводороды блокируют ферменты окисления. Большое влияние на интенсивность роста дрожжей оказывает поверхность контактирования клеток с углеводородами. Одну из причин уменьшения выхода биомассы при увеличении концентрации углеводорода в среде видят в уменьшении поверхности контакта между клеткой и каплей углеводорода, поскольку чем меньше углеводородов в среде, тем они лучше в ней диспергированы и тем больше общая поверхность углеводородов. ГосНИИсинтезбелок накопил огромную коллекцию нефтеокисляющих штаммов. На основе наиболее перспективных штаммов разработан препарат «Олеоворин», который имеет несколько модификаций для различных условий применения: рН 3,0 – 8,5, tО 10 – 43 ОС, содержание солей – до 10%. 166 Он может применяться в различных почвенноклиматических условиях. В ходе лабораторного тестирования на нефти, мазуте и жидких н-парафинах «Олеоворин» показал существенно лучшие результаты, чем известные препараты «Даворойл» и «Путидойл». «Олеоворин» состоит из двух нетоксичных непатогенных штаммов Acinetobacter oleovorum (штаммы ВСБ-712, ВСБ-568), выделенных из природного биоценоза. Биопрепарат способен окислять различные типы углеводородного сырья в достаточно широком диапазоне температур (от 15 до 42оС). Препарат представляет собой мелкодисперсный порошок желтоватого цвета до 10% влажности. Для обработки готовится водная рабочая суспензия с концентрацией порошка 1 – 10 г/л. Активация суспензии проводится раствором питательных солей, в качестве которых используются минеральные удобрения. Дозировка зависит от степени загрязнения объекта очистки. В результате проведенных исследований было показано, что процесс очистки от нефтезагрязнений по технологии Олеоворин грунтов различной природы протекает достаточно эффективно. Олеоворин способствует биодеструкции практически всех компонентов нефтезагрязнителей как в жидкой фазе, так и в грунтах и в почвах. Верхний предел концентраций нефтезагрязнений, при которых применение препарата возможно с той или иной степени эффективности может составлять до 10 – 15% (масс), однако, наиболее целесообразно применение предложенной технологии в тех случаях, когда суммарная концентрация нефтепродуктов не превышает 15- 25 г на 1 кг грунта. Помимо применения препарата «Олеворин» для очистки нефтезагрязнений в почвах, существует несколько методов введения специальных культур микроорганизмов в очистные сооружения, например, введение суспензии микроорганизмов в активный ил аэротенков, использование микроорганизмов, иммобилизованных на носителях. Применение иммобилизованных микроорганизмов позволяет предотвратить их вымывание из очистных сооружений, получить высокую концентрацию микроорганизмов на стадии биологической очистки сточных вод. 167 Практическая часть Цель работы – изучение способности углеводородокисляющих дрожжей утилизировать нефть. Порядок выполнения работы Для проведения данной работы используется культура дрожжей Candida tropicalis. Состав среды для углеводородокисляющих дрожжей, (г/л): (NH4)H2PO4 - 10,0 K2HPO4 - 8,0 MgSO4 - 0,7 Микроэлементы, (мг/л): FeSO4 . 7H2O – 12,5 MnSO4 . 5H2O – 12,5 ZnSO4 . 7H2O – 12,5 CuSO4 . 5H2O – 3,0 Нижневартовская нефть – 1 % рН 5,5 – 5,0 В качалочные колбы объемом 750 мл помещают по 100 мл среды, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Засев производят смывом: 1 пробирка с культурой C. tropicalis на 100 мл среды. Засеянные колбы помещают на качалку на 5 суток. В конце опыта измеряют рН, описывают изменения, произошедшие в культуральной жидкости по сравнению с контрольной колбой. При микроскопировании отмечают наличие почкующихся клеток и уменьшение количества капель не утилизированной нефти в препарате по сравнению с контролем. Микроскопическую картину зарисовывают. Содержание отчета 1. 2. 3. 4. 168 Название культуры. Состав среды. Описание культуральных признаков. Микроскопическая картина. Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. В каких процессах биологической очистки участвуют нефтеокисляющие микроорганизмы? Какие микроорганизмы особенно активно разлагают углеводороды? Механизм окисления углеводородов. Почему нефть не подвергается микробному разложению в нефтяных месторождениях? Работа 21. Выращивание базидиальных грибов на молочной сыворотке Характеристика молочной сыворотки При производстве молочных продуктов (сыра, творога, казеина) в процессе получения белкового сгустка из молока выделяется жидкая фаза, называемая молочной сывороткой. В сыворотку переходит 50% сухих веществ молока. Состав молочной сыворотки варьирует в зависимости от качества исходного сырья, вида готового продукта, способа отделения белка (сквашивание, обработка ферментами или кислотами). Основным источником углерода в молочной сыворотке является молочный сахар лактоза – дисахарид, состоящий из двух остатков гексоз: D-глюкозы и D-галактозы. Помимо лактозы в молочной сыворотке в небольших количествах содержатся и другие сахара: арабиноза, лактулоза, глюкоза, галактоза и полисахарид амилоид. Азотистые вещества сыворотки представлены белковыми и небелковыми органическими соединениями. На 90% белки молочной сыворотки состоят из альбуминов и глобулинов. Основной белок молока – казеин не полностью переходит в молочную сыворотку, а только его γ-фракция. В сывороточных белках присутствуют все незаменимые аминокислоты и ряд органических кислот: молочная, уксусная, пропионовая, лимонная и др. Минеральные вещества сыворотки содержат органические и неорганические соли калия, натрия, магния, кальция. Всего в молочной сыворотке присутствуют более 30 различных макро- и 169 микроэлементов, больше, чем в любом другом естественном субстрате. В сыворотку переходит основная часть водорастворимых витаминов и часть жирорастворимых. Состав творожной молочной сыворотки Название соединений Сухие вещества Лактоза Белок Жир Минеральные соединения (зола) % содержания 6,5 – 6,6 4,8 0,4 – 1,0 0,05 – 0,4 0,5 – 0,7 Молочная сыворотка – нестойкое соединение, которое необходимо немедленно использовать, либо законсервировать пастеризацией или сушкой. По статистическим данным, 48 % – 88 % получаемой во всем мире сыворотки идет на корм скоту, 7% - 53% – на пищевые цели. Однако, до сих пор значительное количество сыворотки сливается в канализацию. При этом возникают проблемы охраны окружающей среды из-за высокой биологической активности сыворотки и низкой утилизируемости лактозы в обычных очистных сооружениях. Очистка 1 м3 сточных вод с высоким содержанием сыворотки приравнивается к очистке 400 м3 типичных промышленных стоков. Известны различные способы использования молочной сыворотки: сушка, получение лактозы, изготовление напитков и т.д. Менее всего изучено применение сыворотки для выращивания микроорганизмов. Микроорганизмы – продуценты белка, утилизирующие молочную сыворотку Наибольшее распространение в качестве продуцентов белка на молочной сыворотке получили дрожжи. Например, Kluyveromyces fragilis, Candida utilis, Candida pseudotropicalis и другие. На молочной сыворотке можно выращивать поверхностным и глубинным способом грибы, например, Penicillium roquerfortii, Geotrichium candidum (Oidium lactis), Rhizopus oligosporus, Morchella и др. Известны способы получения кормового белка на основе смешанной культуры грибов и молочнокислых бактерий. 170 Большой круг продуцентов не способен усваивать молочный сахар из-за отсутствия фермента β-галактозидазы, расщепляющей лактозу на моносахара. Из всех способов биологической переработки сыворотки наибольший интерес вызывают способы, позволяющие получить пищевой продукт с использованием штаммов микроорганизмов, не нуждающихся в предварительном гидролизе лактозы и сводящих, таким образом к минимуму экологическую нагрузку производства. Базидиальные грибы обладают способностью синтезировать β-галактозидазу, нетребовательны к источнику азота, неаллергенны, экологически безопасны. С другой стороны, современная пищевая промышленность нуждается в новых добавках, которые могут одновременно повышать биологическую и питательную ценность продуктов, улучшать их структуру и консистенцию и оказывать при регулярном применении оздоровительное действие. Одним из наиболее предпочтительных для этой цели объектов биотехнологии являются съедобные базидиальные грибы: 1. Pleurotus ostreatus (вешенка устричная), которая давно используется в пищу и 2. Trametes pubescens, который известен как лекарственный гриб. Из мицелия и плодовых тел этого гриба экстрагируют связанные с белками полисахариды, которые обладают противоопухолевой и иммунномодулирующей активностью. После отделения биомассы фильтрат может служить сырьем для выделения внеклеточных ферментов. Практическая часть Цель работы – изучить влияние различных источников азота на накопление биомассы базидиального гриба Trametes pubescens при выращивании на молочной сыворотке. Порядок выполнения работы Культуры базидиомицетов хранят на скошенном агаризованном сусле в пробирках при температуре 4оС с периодическими пересевами каждые 6 месяцев. Культуры выращивают методом глубинного культивирования в колбах 171 Эрленмейера объемом 750 мл с объемом среды 100 – 150 мл на круговой качалке при 200 об/мин, температуре 28 ОС. Величина рН среды после стерилизации 5,5 – 5,8. Посевной материал выращивают на среде следующего состава, г/л: глюкоза – 20,0; NH4NO3 – 2,8; мочевина – 0,7; KH2PO4 – 0,6; K2HPO4 – 0,6; MgSO4 ·7H2O – 0,5; ZnSO4 – 0,05; CuSO4 ·5H2O – 0,04; кукурузный экстракт – 10,0 мл; вода водопроводная. Стерилизация – 0,5 ати в течение 40 мин. Опыт проводят на среде следующего состава, г/л: молочная сыворотка сухая обезжиренная – 60,0; кукурузный экстракт – 10.0 мл; вода водопроводная. В качестве источников азота разные бригады студентов используют следующие источники азота: мочевину, сульфат аммония (NH4)2SO4 или нитрат калия KNO3. Посевной материал вносят в количестве 10%, пользуясь стерильным цилиндром. Выращивание производят в течение 6 – 7 суток на круговой качалке при температуре 28 – 30 ОС. В конце опыта биомассу отделяют фильтрованием через воронку Бюхнера через два слоя фильтровальной бумаги с последующим промыванием дистиллированной водой. Высушивают при температуре 105 ОС и взвешивают с точностью до второго знака. Содержание отчета 1. 2. 3. 4. Название культуры. Состав среды. Описание культуральных признаков. Таблица и гистограмма «Влияние источников азота на рост биомассы Trametes pubescens». Контрольные вопросы 1. Характеристика молочной сыворотки как субстрата для выращивания микроорганизмов. 2. Способы использования молочной сыворотки. 3. Преимущества базидиальных грибов для утилизации молочной сыворотки. 172 Литература 1. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 2. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И.Нетрусова. М.:Academia, 2005. 3. Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (малый практикум). М.: МГУ, 1971. 4. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ, 1991. 5. Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. Изд. 9-е. М.: Мир, 1997. 6. Современная микробиология / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 7. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. М.: Мир, 1979. 8. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высшая школа, 1989. 9. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Academia, 2003. 10. Экология микроорганизмов / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Academia, 2004. 11. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. М.: Университет «Книжный дом», 2001. 12. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2003. 13. Биотехнология. Принципы и применения / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М.: Мир, 1988. 14. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию. М.: Пищевая промышленность, 1978. 15. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. 173 Источники рисунков 1. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1976. 2. Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (малый практикум). М.: МГУ, 1971. 3. Шапкин В.А. и др. Практикум по зоологии беспозвоночных. М.: Academia, 2003. 4. Горбунова Н.П. и др. Малый практикум по низшим растениям. М.: Высшая школа, 1976. 5. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Academia, 2003. 6. Лукомская К.А. Микробиология с основами вирусологии. М.: Просвещение, 1987. 7. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высшая школа, 1989. 174 ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие Общие правила работы в микробиологической лаборатории РАЗДЕЛ I. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Тема 1. Морфология микроорганизмов и методы ее изучения Работа 1. Микроскопическое изучение бактерий Работа 2. Микроскопическое изучение эукариотных микроорганизмов Работа 3. Методы изучения морфологии микроорганизмов Тема 2. Культивирование микроорганизмов: принципы составления питательных сред; методы стерилизации; методы посевов и пересевов микроорганизмов; условия культивирования микроорганизмов в зависимости от отношения к кислотности среды, кислороду, температуре Работа 4. Техника микробиологических посевов Тема 3. Методы количественного учета микроорганизмов Тема 4. Микробиологические методы исследования объектов окружающей среды Работа 5. Исследование микрофлоры воздуха Работа 6. Исследование микрофлоры воды Работа 7. Исследование микрофлоры почвы РАЗДЕЛ II. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Тема 5. Получение органических кислот Работа 8. Получение лимонной кислоты в культуре плесневого гриба Aspergillus niger Работа 9. Получение пищевой уксусной кислоты при окислении этилового спирта уксуснокислыми бактериями Тема 6. Получение биологически активных веществ микробных клеток 3 4 7 7 12 19 27 34 46 54 57 57 60 64 74 75 76 81 84 175 Работа 10. Изучение антибиотической активности микроорганизмов 84 Работа 11. Определение активности фермента амилазы 90 Тема 7. Использование процессов брожения в биотехнологии 96 Работа 12. Изучение развития и биохимической деятельности дрожжей рода Saccharomyces 97 Работа 13. Молочнокислое брожение 115 Тема 8. Закономерности роста и развития микроорганизмов 121 Работа 14. Определение удельной скорости роста дрожжей при периодическом культивировании 124 Тема 9. Биотрансформация 128 Работа 15. Биотрансформация глицерина в дигидроксиацетон уксуснокислыми бактериями 129 Тема 10. Биогеотехнология металлов 133 Работа 16. Окисление неорганических соединений железа хемолитоавтотрофными бактериями Thiobacillus ferrooxidans 136 РАЗДЕЛ III. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 143 Тема 11. Участие микроорганизмов в глобальных биогеохимических циклах 143 Работа 17. Получение накопительной культуры свободноживущих азотфиксирующих бактерий 145 Работа 18. Микроорганизмы, разлагающие целлюлозу в аэробных и анаэробных условиях 149 Тема 12. Биотехнологическая защита окружающей среды 156 Работа 19. Утилизация целлюлозы в анаэробных условиях методом биоконверсии 156 Работа 20. Использование нефтеокисляющих микроорганизмов для защиты окружающей среды 164 Работа 21. Выращивание базидиальных грибов на молочной сыворотке 169 Литература 173 Источники рисунков 173 176
