Влияние препарата «Граноцит» на мезенхимальные стволовые

Экспериментальныеи клиническиеисследования
Влияниепрепарата«Граноцит»на мезенхимальныестволовые клетки
костногомозгапри моделированиивторичногоиммунодефицита
с помощью циклофосфанав эксперименте
Байков А.Н.1, ШаховВ.П.2, ШелгаевН.Ю.3, СеребряковаВ.А.1
Effectof Granotsitpreparationon mesenchymalbone marrowstemcells
in experimentalmodelof secondaryimmunedeficiencywiththeaid
of cyclophosphan
BaikovA.N.,ShakhovV.P.,ShelgaevN.Yu.,Serebryakova V.A.
Сибирскийгосударственныймедицинскийуниверситет,г. Томск
Медицинскаяпромышленнаякомпания«Электропульс»,г. Томск
3
Челябинскийобластнойкожно-венерологическийдиспансер,г. Челябинск
1
2
 БайковА.Н., ШаховВ.П., ШелгаевН.Ю., СеребряковаВ.А.
Проведеныопытына 60 мышахлинииBalb /c обоегополамассой18—2 1 г. Всеманипуляции, эвтаназия(эфиром)осуществлялись
в рамках утвержденныхправил проведенияработ с использованиемэкспериментальныхживотных. Мышейраспределилина четыре
группыпо 15 животных. В первойсерииосуществляливведениефизиологическогораствора, во второй— циклофосфана, в третьей—
препарата«Граноцит» (рекомбинантныйгранулоцитарныйколониестимулирующийфактор),в четвертой— циклофосфанаи препарата
«Граноцит». Исследовалиобщееколичестволейкоцитовв крови, клеточностькостногомозга, содержаниягранулоцитарномакрофагаль
ных колониеобразующихклетоки мезенхимальныхпрекурсоровс помощьюкультурытканиin vitro. Установлено, что препарат «Граноцит» обладаетспособностьюстимулироватьмиелопоэз(прямоеспецифическоедействие)и мезенхимопоэз(непрямое, опосредованное
действие)в норме. Привведениицитостатикаисследуемыйцитокиноказываетпротекторноедействиепоотношениюкакк миелоидным,
таки мезенхимальнымпрекурсорамкостногомозга.
Ключевые слова: мезенхимальныестволовыеклетки, мезенхимопоэз, иммунодефициты, гранулоцитарныйколониестимулирующийфактор.
Experiments with 60 male and female mice of Balb/c line with mass of 18—21 g have been carried out. All manipulations, including ether
euthanasia, were performed within the framework of approved rules for experiments with experimental animals. The mice were divided into four
groups each of 15 animals. The groups were injected with physiological salt solution (first group), cycliphosphan (second group), Granotsit
preparation (recombinant granulocytic colony-stimulating factor) (third group), and cycliphosphan in Granotsit preparation (fourth group). We have
studied the total number of leucocytes in blood, bone marrow cellularity, content of granulocytic- macrophage colony-forming cells and
mesenchymal precursors with the aid of tissue culture in vitro. It has been found that the Granotsit preparation can stimulate myelopoiesis (direct
specific action) and mesenchymopoiesis (indirect action) in norm. When a cytostatic agent, the studied cytokine has a protective action on both
myeloid and mesenchymal precursors of bone marrow.
Key words: mesenchymal stem cells, mesenchym opoiesis, immune defficiency, granulocytic colony-stimulating factor.
УДК616.419-013.395:615.37:616.15].08
Введение
Вторичныеиммунодефициты(ВИД)у детейи взрослых
встречаютсягораздочаще, чем первичные. ПатогенезВИД
сложени разнообразен, они могут вызыватьсяразличными
факторами: вирусными и бактериальными инфекциями,
влиянием цитостатиков, гормонов, действием ионизирующейрадиации, стресса, злокачественныминовообразовани-
ями, патологиейобмена веществ, беременностьюи т.п. [1,
4, 9]. Часто мишеньювыступаютплюрипотентныегемопоэтические стволовыеклетки (ПГСК), из которых образуются
как миелоидные, эритроидные, мегакариоцитарные, так и
лимфоидныеэлементы[7]. Процессыпролиферациии дифференцировки ПГСК контролируются гемопоэзиндуцирующим микроокружением (ГИМ) [6, 7]. В построении ГИМ
Бюллетеньсибирскоймедицины,№ 3,2008
5
БайковА.Н.,ШаховВ.П.,ШелгаевН.Ю.,СеребряковаВ.А.
большую роль играют мезенхимальные стволовые клетки
(МСК)[7, 11]. ПоражениеМСКприводитк поломкеструктуры
и функции ГИМ. В результате этого процесса может
произойтинарушениепродукциикак лимфоидных, так и миелоидныхклетокс последующимразвитиемВИД.
В настоящеевремяпрактическиотсутствуютпатогенетическиобоснованныеметодыкоррекцииповрежденийсостороныМСКи ГИМ.Всвязис этимбольшойинтереспредставляют
работы, связанныес использованиемцитокинов, в частности
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ
- ),
прилечениимиелодепрессорныхсостояний, вызванныхоблучением, действиемцитостатиковпри лечениионкологических
заболеваний [3, 12]. Однако большинство исследований
направлено на изучение протекторного действия Г-КСФ на
стволовыеклеткибелогоросткакрови. В них не определяли
способностьданногоцитокинарегулироватьморфофункциональные свойства МСК. О потенциальной возможности
действия Г-КСФ на мезенхимопоэз свидетельствует тот
факт, что его введение приводит к мобилизации МСК из
костногомозгав кровь[3]. Темнеменеевопросо том, обладает ли данный фактор способностью активировать МСК
костногомозгаприразвитииВИД, остаетсяоткрытым.
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение изменений, происходящих со стороны пула
МСКкостногомозгапримоделированиивторичныхиммунодефицитных состояний с помощью цитостатика — циклофосфана.
Материали методы
Опытыбылипроведенына 60 мышахлинииBalb /c обоего
пола массой 18—21 г в осеннезимний
период, в утренние
часы для уменьшениявлияниясуточныхи сезонныхколебаний. Передначаломисследованийвсеживотныепроходили2недельныйкарантин. Содержаниемышей, все манипуляции,
эвтаназия (эфиром)осуществлялисьв рамках утвержденных
правилпроведенияработс использованиемэкспериментальныхживотных.
Животныхраспределялипоследующимсериям:1-я группа (контрольная)— мыши, получавшиев течение 4 сут физиологическийраствор (15 животных); 2-я — животные, которым подкожно вводили препарат «Граноцит» («Aventis
Pharma Specialites for Nycomed», Франция)(рекомбинантный
человеческийГ-КСФ)в дозе 10 мкг/кгмассытелав течение
4 сут (15 особей);3-я — мышис ВИД, вызваннымоднократным внутрибрюшинным введением циклофосфана (ОАО
«Биохимик», Россия)в дозе 100 мг/кгмассытела (15 животных);4-я — животные,получившиеоднократнуюинтраперито6
Влияние препарата«Граноцит»…
неальную инъекцию циклофосфана в дозе 100 мг/кг массы
тела с последующимподкожнымвведениемпрепарата «Граноцит» в дозе 10 мкг/кг массы тела в течение 4 сут (15
мышей).На каждуюточкуприходилосьпо 3 животныхв каждойсерииэкспериментов.
Дозыциклофосфана(ЦФ)и граноцитабылиподобраны
на основаниипредварительныхисследованийи данныхлитературы[3, 7].
Общееколичестволейкоцитовв периферическойкрови
и клеточность костного мозга определяли по описанному
Е.Д. Гольдбергоми соавт. меланжерномуметоду в камере
Горяева[2].
Жизнеспособностьклеток исследовалис помощьюметода включенияв клетки 0,1%- го растворатрипановогосинего на 200 кариоцитахв камере Горяева («Sigma », США)
[2].
Культивирование гранулоцитарномакрофагальных
колониеобразующихединиц(ГМКОЕ
- )(клетокпредшественни
ков миелопоэза) производили по методу T.R . Bradley ,
D . Metcalf [10] в модификацииВ.П. Шаховаи соавт. [8]. Клетки костного мозга вымывали из бедренной кости 1—2 мл
средыMcCoy ’s 5A («Sigma », США)в асептическихусловиях.
Материал ресуспендировали и осторожно наслаивали на
3 мл растворагистопака(«Sigma ») (р = 1,077 г/мл),налитого
в стерильную центрифужнуюпробирку. Клетки подвергали
градиентномуцентрифугированиюпри 1 500 об/минв течение 30 мин. Образовавшеесяинтерфазное кольцо, состоящееиз мононуклеаров, собиралии ещедваразацентрифугировалив средеMcCoy ’s 5A для очисткиот гистопака. Количество жизнеспособных клеток доводили до 5 ⋅ 10 5/мл в
полной питательной среде, содержащей 20% эмбриональной телячьейсыворотки (ЭТС)(«Sigma »), 78,7% среды DI MEM , 1% 100 × раствора пенициллина, стрептомицина и Lглютамина («Sigma »), 5 ⋅ 10 –5 моль 2-меркаптоэтанола («Mer ck », Германия), 10 мкг/лрекомбинантногочеловеческогогранулоцитарного колониестимулирующего фактора (препарат
«Граноцит»). Затем добавляли 0,3%-й раствор бактоагара
(«Difco », США), охлажденный до 40 °С. Материал быстро
перемешивали и разливали в 12-луночные плоскодонные
планшетыфирмы« Costar » по 0,5 мл. Послегелификацииагара в каждую ячейку добавляли 0,5 мл полной среды. Затем
планшетыпомещалив СО2-инкубатор (СО2 5%, 37 °С, влажность100%). Через6—7 сутматериализвлекалии с помощью
инвертоскопа « Opton » (Германия) подсчитывали число образовавшихсяГМКОЕ
- , клеточныхагрегатов,содержащихболее 50 кариоцитов. В контрольнойсерииГ-КСФв культуруне
добавляли.
Бюллетеньсибирскоймедицины,¹3,2008
Экспериментальныеи клиническиеисследования
Мезенхимальныестволовые клетки костного мозга исследовалипо методуА.Я. Фриденштейнаи Е.А. Лурие [6, 8]
с некоторымимодификациями. Так, 1 мл полной питательной средыс помощьюшприцаиз бедреннойкостивымывали клеткикостногомозга, ресуспендировалинальду. Полная
питательнаясредасодержала10% ЭТС(«Sigma »), 90% среды
D -MEM с низкимсодержаниемглюкозы, 200 ммольL-глютамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина
(все реактивы фирмы « Sigma »). Конечную концентрацию
жизнеспособныхкариоцитов доводили до 1 ⋅ 10 6 /мл, разливали в культуральныефлаконыфирмы « Falcon » по 5 мл и
помещалив СО2 -инкубатор(СО2 5%, 37 °С, влажность100%).
Через3 сутнеадгезирующиеклеткиудалялии заменяли5 мл
полнойкультуральнойсредыновойпорцией.Спустяеще5 сут
про-
изводили смену культуральной среды. На 12—14- е сут
подсчитывали число образовавшихся клонов — клеточных
агрегатов, содержащих более 50 клеток. Часть материала
окрашивали после фиксации метанолом азурII- эозином для
определения морфологии клеток (НовицкийВ.В. и соавт.,
2004).
Для
изучения
прямого
действия
Г-КСФна МСКв полнуюкультуральнуюсредуна 3-и сутпосле
удалениянеадгезирующихклеток добавлялипрепарат «Граноцит» вдозах0, 50, 100, 150, 200 мкг/л.
Статистическую обработку осуществляли с помощью
критерия Манна—Уитни, определяли выборочное среднее
значениеХ, ошибкусреднегоm, уровеньзначимостиpu, используяпрограммуStatistica 6.
Результаты и обсуждение
В результатепроведенныхисследованийбылоустановлено, что введение циклофосфана приводит к угнетению
миело-и мезенхимопоэза,снижениюобщегоколичествамиелокариоцитов, ГМКОЕи
МСКв костноммозгеи развитию
лейкопениив периферическойкрови. Этифактысвидетельствуют о том, что под действием цитостатика у животных
формируетсявторичныйиммунодефицит(табл. 1, 2).
Введение Г-КСФ в течение 4 сут сопровождается выраженнойстимуляциейбелогоросткакровикак на уровнегранулоцитарномакрофагальныхпрекурсоров
,таки кариоцитовв
костном мозге и периферической крови, что согласуется с
даннымидругихавторов[3, 12].
Таблица 1
Содержаниелейкоцитовв периферическойкрови,ОКК,ГМ-КОЕ и МСК в костноммозгемышейлинииBalb/c послевведенияпрепарата
«Граноцит»(Г-КСФ),циклофосфана,циклофосфанаи препарата«Граноцит»(Х ± m)
Показатель
Лейкоциты,⋅ 10 9/л:
Г-КСФ
ЦФ
Г-КСФи ЦФ
ОКК, 10 6:
набедро+ Г-КСФ
набедро+ ЦФ
набедро+ Г-КСФ+ ЦФ
ГМКОЕ
, ⋅ 10 5:
набедро+ Г-КСФ
набедро+ ЦФ
набедро+ Г-КСФ+ ЦФ
МСК, ⋅ 10 6:
набедро+ Г-КСФ
набедро+ ЦФ
набедро+ Г-КСФ+ ЦФ
* pu < 0,05.
Контрольнаягруппаживотных, без
примененияГ-КСФ
1-е сут
4-е сут
6-е сут
10-е сут
14-е сут
12,81 ± 0,30
12,81 ± 0,30
12,81 ± 0,30
12 ,73 ± 0,20
7,79 ± 2,33
5,55 ± 1,91*
15 ,85 ± 0,41*
3,57 ± 0,21*
15 ,83 ± 0,45*
20,17 ± 0,45*
6,00 ± 0,43*
10 ,59 ± 1,35
16 ,15 ± 1,14*
7,63 ± 0,23*
11 ,27 ± 0,75
11 ,90 ± 1,60
10 ,88 ± 0,91
11 ,10 ± 0,71
19,53 ± 0,51
19,53 ± 0,51
19,53 ± 0,51
19 ,77 ± 0,35
4,12 ± 0,33*
10 ,92 ± 0,33*
22,65 ± 0,33*
6,00 ± 0,44*
15 ,57 ± 3,95
24,00 ± 1,22*
6,83 ± 0,59*
17 ,17 ± 0,75
23,91 ± 0,53*
10 ,11 ± 0,63*
16 ,93 ± 2,15
21 ,10 ± 1,00
15 ,30 ± 2,50
18 ,30 ± 0,71
35,11 ± 2,62
35,15 ± 2,68
35,15 ± 2,60
39,18 ± 3,35
11 ,19 ± 3,15*
13 ,77 ± 3,63*
65,89 ± 2,93*
16 ,37 ± 2,69*
27,95 ± 3,05
46,25 ± 2,53*
17 ,93 ± 1,85*
31 ,57 ± 1,14
34,81 ± 1,75
27,53 ± 5,93
30,33 ± 2,79
36,73 ± 2,21
30,31 ± 1,41
37,90 ± 3,30
11,44 ± 0,65
11,45 ± 0,68
11,41 ± 0,61
9,93 ± 1,57
10 ,81 ± 0,55
9,59 ± 0,37
14 ,35 ± 0,37*
9,74 ± 0,50*
8,40 ± 2,46
15 ,15 ± 0,59*
7,83 ± 0,41*
10 ,68 ± 0,93
13 ,35 ± 1,37
9,40 ± 0,53*
12 ,00 ± 0,69
12 ,91 ± 0,31
10 ,71 ± 0,50
10 ,50 ± 0,31
Таблица 2
Бюллетеньсибирскоймедицины,¹3, 2008
7
БайковА.Н.,ШаховВ.П.,ШелгаевН.Ю.,СеребряковаВ.А.
Количество колоний,выросшихиз мезенхимальныхстволовых клеток костногомозгаинтактныхмышейлинииBalb/c при добавлении
к культуреin vitroпрепарата«Граноцит»(Г-КСФ) (Х ± m)
Граноцит,мкг/мл
0
50
100
150
200
МСК
11,41
10,93
12,17
10,85
11,53
pu
± 0,61
± 0,69
± 0,75
± 0,89
± 0,75
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
П р и м е ч а н ие. pu определялипо отношениюк культуреМСКбез
добавленияпрепарата«Граноцит».
Интересно, что данный цитокин оказывает влияние не
только на костномозговой пул миелоидныхклетокпредше
ственников,но и мезенхимальныестволовыеклетки, длякоторых, согласно общепринятым взглядам, он не является
специфическимцитокином(см.табл. 1) [7, 8].
При этом установлено, что Г-КСФ оказываетсвое стимулирующеевлияниенамезенхимопоэзнепрямо, а опосредованно, так как добавлениеего непосредственнов культуру тканиin vitroне приводитк усилениюростамезенхимальныхколоний(табл.2). Возможно,чтоданныйэффектсвязан
с тем, чточастьМСКпривведенииГ-КСФпокидаеткостный
мозг [3]. При этом образовавшиесясвободные «ниши» для
мезенхимальныхстволовыхклетокчерезцитокиновуюсеть,
интегрины, адгезины, элементы экстрацеллюлярного матрикса и другие факторы стимулируют образование новых
МСК. Не исключено, чтов данномпроцессемогутпринимать
участиеи другиемеханизмы, напримераутокринныеи (или)
паракринные[3, 5].
Обнаружено, что препарат «Граноцит» обладает
способностьюне толькокорригироватьнарушениясо стороны лейкопоэзапримоделированииВИДс помощьюциклофосфана, но и нормализовать уровень ГМКОЕ
и МСК в
костноммозгеначинаяс 4-х сут опыта (см.табл. 1). В свою
очередь, репарация поврежденных МСК может сопровождаться реконструкцией гемопоэзиндуцирующего микроокружения, которое, как известно, страдаетпри действиицитостатиков [6, 7]. Восстановление ГИМ, очевидно, должно
Влияние препарата«Граноцит»…
способствовать регенерации ГМКОЕ
через элементы экстрацеллюлярногоматриксакостногомозга.
Таким образом, в результате проведенныхисследований было установлено, что препарат «Граноцит» (рекомбинантныйГ-КСФ)обладаетспособностьюстимулироватьмиелопоэз(прямоеспецифическоедействие)и мезенхимопоэз
(непрямое, опосредованное действие) у здоровых животных. ПривведениицитостатикаГ-КСФоказываетпротекторное действие как на миелоидные, так и мезенхимальные
клеткипред
шественникикостногомозга.
Литература
1. ВолковА.Г., ТрофименкоС.Л. Клинические проявления вторичного иммунодефицита при заболеваниях ЛОРорга
- нов: Руководстводляврачей.Элиста:Джангар,2007. 176 с.
2. ГольдбергЕ.Д.,ДыгайА.М.,ШаховВ.П. Методыкультурытканив гематологии.Томск: ТГУ, 1992.
3. КозловВ.А. Гранулоцитарныйколониестимулирующийфактор:
физиологическаяактивность, патофизиологическиеи терапевтическиепроблемы//Цитокиныи воспаление. 2004. Т. 3. № 2.
С. 3—15.
4. МашковскийМ.Д. Лекарственные средства. Минск: Беларусь,
1987. Т. 2. С. 384—387.
5. СимбирцевА.С. Цитокины: классификация и биологические
функции//Цитокиныи воспаление.2004. Т. 3. № 2. С. 16—22.
6. ФриденштейнА.Я., Лурие Е.А. Клеточные основы кроветворногомикроокружения.М.: Медицина,1980. 213 с.
7. ЧертковИ.Л.,ФриденштейнА.Я. Клеточные основы кроветворногомикроокружения.М.: Медицина,1977. 272 с.
8. ШаховВ.П., ХлусовИ.А., ДамбаевГ.Ц. и др. Введениев методыкультурыклеток, биоинженерииорганови тканей/ Отв. ред.
В.В. Новицкий. Томск: STT , 2004. 386 с.
9. ШиринскийВ.С., СтаростинаН.М.,СенниковаЮ.А., Малышева О.А. Проблемы диагностики и классификации вторичных
иммунодефицитов // Аллергология и иммунология. 2000. Т. 1.
№1. С. 62—70.
10. BradleyT.R., MetcalfD. // J. Exp. Biol . Med . Sci . 1966. V . 44.
P . 287—300.
11. CongetP., Gordon S. Phenotypical and functional properties of hu man bone marrow mesenchymal progenitor cells //J. Cell. Physiol.
1999. №181. P. 67—73.
12. MetcalfD. The hemopoietic colony stimulating factors. Amsterdam ,
Elsevier . 1977. 420 p.
Сведенияоб авторах
А.Н.Байков — д-р мед. наук, профессор,директорЦНИЛСибГМУ(г. Томск).
В.П. Шахов— д-р мед. наук, профессор, медицинскаяпромышленнаякомпания«Электропульс» (г. Томск).
Н.Ю.Шелгаев— врач, Челябинскийобластнойкожновенерологическийдиспансер
(г. Челябинск).
В.А. Серебрякова— канд. мед. наук, докторанткафедрыпатофизиологииСибГМУ(г. Томск).
Для корреспонденции
Байков АлександрНиколаевич, тел. (3822) 52-73-99.
8
Бюллетеньсибирскоймедицины,¹3,2008
Поступилав редакцию19.06.2007 г.