Грузинский аграрный университет Грузинский аграрный
advertisement
ANNALS OF AGRARIAN SCIENCE, vol. 9, no. 4, 2011 ИЗВЕСТИЯ АГРАРНОЙ НАУКИ, Том 9, Ном. 4, 2011 -----------------------------------------------------------------------------------------------VETERINARY SCIENCE AND ANIMAL HUSBANDRY ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИЯ ВЛИЯНИЕ ТОКСИГЕННЫХ КЛОСТРИДИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭШЕРИХИЙ И СТАФИЛОКОККОВ Д.В. Начкебия, К.Д. Начкебия, Э.Д. Начкебия Грузинский аграрный университет Аллея Давида Агмашенебели, 13км,Тбилиси, 0131, Грузия; Nachkebia.1937@agruni.edu.ge Поступила в редакцию: 12.01.11; одобрена к печати: 29.06.11 Патогенные клостридии видов Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei путем конъюгации способны передавать эшерихиям и стафилококкам токсигенные свойства, гемолитическую активность, антигенные детерминанты, ферментносахаролитические свойства, резистентность к антибиотикам. Выявлена взаимозависимость в передаче этих свойств и возможность независимой раздельной и одновременной передачи названных признаков. Ассоциированное выращивание токсигенных анаэробов с авирулентными штаммами эшерихий с последующим селекционированием патогенных особей – рекомбинантов, через организм белых мышей, позволяет изолировать трансконъюганты с более выраженными токсигенными свойствами. При совместном замораживании токсигенных клостридий с авитрулентными эшерихиями и стафилококками патогенные свойства не передавались, но сообщалась гемолитическая активность и устойчивость к антибиотикам. ВВЕДЕНИЕ Значительный экономический ущерб наносят желудочно-кишечные заболевания, вызванные патогенными эшерихиями, клостридиями и стафилококками. Вопрос профилактики эшерихиозов, клостридиозов, стафилококкозов особо остро встал в настоящее время как среди людей, так и среди животных. В природе циркулирует множество вирулентных серогрупп эшерихий, патогенность которых нельзя объяснить одним только понижением резистентности людей и животных или пассированием эшерихий через восприимчивый организм. Если учесть, что в желудочно-кишечном тракте человека и животных наряду с кишечной палочкой присутствуют анаэробные микроорганизмы, то при определенных условиях между ними происходит обмен генетическим материалом и передача патогенных свойств. 2 Хотя биологические свойства клостридий, эшерихий и стафилококков хорошо изучены, механизмы возникновения колиинфекций недостаточно вскрыты, отсутствуют данные о влиянии токсигенных анаэробов на патогенные и другие свойства эшерихий и стафилококков. Изучение этих вопросов позволило раскрыть механизм этиологии эшерихиозов, разработать средства профилактики и лечения колибактериоза, выяснить внехромосомную наследственность между клостридиями, эшерихиями и стафилококками, установить возможность существования передачи различных свойств – патогенности, гемолитической активности, антигенных детерминант, ферментативной способности, резистентности к антибиотикам от токсигенных клостридий (Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei) к эшерихиям и стафилококкам с помощью конъюгации, трансформации и способом совместного замораживания бактериальной смеси. В естественных средах обитания бактерии разных видов находятся в ассоциации и постоянно контактируют между собой. В результате такого контакта они обмениваются генетическим материалом и приобретают различные свойства: патогенные, гемолитические, антигенные, ферментативные, резистентность к антибиотикам и др. Сами клостридии сравнительно редко вызывают видоспецифические болезни, несмотря на их постоянное присутствие в кишечном тракте человека и животных, что можно объяснить сдерживанием их размножения антагонистической микрофлорой, или же наличием иммунизирующей субинфекции. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ В опытах по конъюгации были использованы культуры клостридий, эшерихий и стафилококков. Штаммы Cl.perfringens A28, A49, B216, B(LD–1), C219, D47, D211, D213, D218; Cl.septicum A2, A59, A103, A113; Cl.oedematiens A79 и Cl.chauvoei B1 использовали в качестве доноров. Реципиентами были штаммы E.coli К12, М1, 0111, 0119; стафилококки, выделенные из объектов внешней среды, и штамм №209. Эти штаммы также были использованы для выявления антигенных связей, а рекомбинанты, полученные при скрещивании клостридий с эшерихиями, – для изготовления вакцин. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Нами показана возможность передачи устойчивости к стрептомицину от анаэробных микроорганизмов – Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei к E.coli с помощью конъюгации. Исходная устойчивость к стрептомицину донорских штаммов была свыше 150 Ед/мл, у реципиентов E.coli К12 и 0111 не выше 0,3 Ед/мл. Приобретенная устойчивость штаммов E.coli превышала исходную в 66,6 раза. Выход рекомбинантов составил в среднем 4·10 –7 [1]. Кроме резистентности к стрептомицину от Cl.chauvoei В1 к E.coli передавалась гемолитическая активность с частотой встречаемости 1,5·10 –7, а от Cl.perfringens В216 и Cl.septicum А59 вместе с указанными свойствами и способность синтеза энтеротоксина [2,3]. 3 Опыты по передаче гемолитических, патогенных и антигенных свойств от Cl.perfringens (штаммы: A28, A49, B216, B(LD–1), C219, D47, D211, D213, D218) к E.coli (штаммы: К12, М1, 0111, 0119) показали, что все штаммы анаэробных микроорганизмов (только D47 не передавал Ent-фактор так, как был авирулентным) передавали Hly-фактор, Ent-фактор, антигенные и ферментативные свойства. Количество рекомбинантов с фактором Hly было выше, чем с фактором Ent, т.е. не все рекомбинанты с приобретенным гемолитическим свойством были токсигенными, что касается переноса антигенных детерминант, то оно было несколько выше, чем сообщение фактора-Ent, но ниже, чем передача способности синтеза гемолизина. Прямой зависимости между токсигенностью и гемолитической активностью не наблюдали, и эти свойства передавались как два независимых явления [4]. В нашей работе передача Hly-фактора не сопровождалась переносом антигенных свойств. Эти последние передавались одновременно с сообщением Entфактора. Объясняется это тем, что антигенные свойства преимущественно связаны с токсигенностью культур, как и иммуногенные, хотя потеря вирулентных свойств у E.coli не всегда сопровождается потерей серогрупповой принадлежности [4]. При изучении ферментативных свойств культур доноров, реципиентов и рекомбинантов было замечено, что отдельные культуры рекомбинантов по сравнению с исходными родительскими штаммами реципиентов E.coli К12, М1, 0119, 0111 сбраживали инозит, рафинозу, маннозу, т.е. те углероды, которые ферментировались исходными культурами доноров – Cl.perfringens типов A28, B216, C219, D211. Ускорение сбраживания молока у рекомбинантов по сравнению с донорскими штаммами токсигенных анаэробов (4–6 часов) не произошло, оно осталось на уровне свойственном исходным родительским штаммами реципиентов – 24–36 часов [3, 5]. Штаммы Cl.septicum А2, А59, А103, А113 передавали штаммам E.coli К12, М1, 0119, 0111 патогенные гемолитические, антигенные и ферментативные свойства [2]. Культуры рекомбинантов, которые одновременно с гемолитической активностью приобретали вирулентные свойства, убивали белых мышей в течение 48–72 часов. Не все рекомбинанты с приобретенным фактором оказывались вирулентными, некоторая часть этих культур не вызывала гибель подопытных животных. Следовательно, как и в опытах с штаммами Cl.perfringens, эти два признака клеткам E.coli передавались как два независимых явления. Частота образования рекомбинантов с фактором Ent была ниже нежели с гемолитическими [4]. Культуры рекомбинантов, которым была сообщена вирулентность, проявляли агглютинабильность в иммунной сыворотке Cl.septicum А59. Агглютинация убитых нагреванием культур протекала в довольно высоких титрах – 1:300–1:450, тогда как в той же сыворотке культуры реципиентов реагировали в разведениях не превышающих 1:5. В нормальной кроличьей сыворотке агглютинация отсутствовала как у рекомбинантов, так и реципиентов, что подтверждало одновременный перенос фактора патогенности и антигенных детерминант от Cl.perfringens и E.coli. С живыми антигенами в РА наибольшее разведение сыворотки отмечено в пределах 1:200–1:300, что несколько превышало таковую с штаммами Cl.perfringens, 4 объясняется это тем, что Cl.septicum, в отличие от Cl.perfringens, имеет жгутиковый Н-антиген, и для получения гипериммунной сыворотки к Cl.septicum А59 использовали ОН-антиген [6]. В реакции нейтрализации гипериммунная сыворотка к Cl.septicum А59 нейтрализовала культуры рекомбинантов E.coli, что также свидетельствовало о специфичности иммунной сыворотки против Cl.septicum А59 к культурам рекомбинантов, полученных скрещиванием штаммов Cl.septicum с штаммами E.coli. Те же рекомбинанты приобретали способность ферментировать отдельные вещества, сбраживание которых было свойственно штаммам донора. Так, например, культуры реципиентов E.coli не сбраживающие инозит, салицин, ленулезу и не разжижающие желатин, после скрещивания с штаммами Cl.septicum становились активными в отношении этих веществ [7]. От Cl.oedematiens А79 и Cl.chauvoei В1 также осуществлялся перенос вирулентных свойств реципиентным штаммам E.coli. У зараженных внутрибрюшинно белых мышей срок гибели наступал на 3–4 сутки и был удлинен на 1–1,5 сутки по сравнению с рекомбинантами, полученными от скрещивания с Cl.perfringens и Cl.septicum [5]. Так же как и с Cl.septicum в гипериммунной сыворотке против Cl.chauvoei В1 соответствующие рекомбинанты, убитые нагреванием, агглютинировались в титрах от 1:300 до 1:400. Агглютинабельность гомологичных рекомбинантов в гипериммунной сыворотке против Cl.oedematiens А79 выражалась в титрах от 1:350 до 1:450. С живыми антигенами рекомбинантов, титр агглютининов против Cl.chauvoei В1 в среднем был равен 1:280, против Cl.oedematiens А79 – 1:320. В контроле исходные культуры реципиентов агглютинировались в разведении не выше 1:5. Те же сыворотки нейтрализовали гомологичные культуры рекомбинантов [8]. Сыворотка против Cl.chauvoei В1 защищала белых мышей от гибели зараженных рекомбинантами с тех скрещиваемых пар, в которых донорами были штаммы данного вида (В1, В11), но не предохраняла животных, зараженных трансконъюгантами от кроссов, донором которых был Cl.oedematiens А79, и наоборот, сыворотка к Cl.oedematiens защищала белых мышей, зараженных рекомбинантами, полученными с кроссов, где донором был использован гомологичный штамм – Cl.oedematiens А79. Та же сыворотка не предохраняла от гибели белых мышей, зараженных трансконъюгантами с кроссов, в которых донорами были взяты штаммы Cl.chauvoei. Несмотря на то, что в реакции агглютинации наблюдалась антигенная связь между рекомбинантами, полученными с кроссов, где донорами были штаммы Cl.chauvoei и Cl.oedematiens, гомологичные к ним сыворотки не защищали животных при перекрестном заражении, эти сыворотки взаимно не предохраняли инфицированных белых мышей, зараженных трансконъюгантами, полученными от разных видов доноров – Cl.chauvoei и Cl.oedematiens [2-4, 7,9]. Известно, что Cl.chauvoei и Cl.oedematiens не отличаются ферментативной активностью, и все же штаммы Cl.chauvoei сообщали реципиентам E.coli (К12, М1) способность сбраживания левулезы, а Cl.oedematiens А79 - свойство сбраживания глицерина [5]. 5 Постоянное контактирование различных видов микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте человека и животных, а также в объектах внешней среды обусловливает их взаимодействие, которое выражается в приобретении или утрате ими некоторых биологических свойств. Взаимодействие эшерихий с другими видами микроорганизмов, в том числе и с клостридиями, способствует появлению все новых и новых серогрупп кишечной палочки, которое имеет тенденцию к дальнейшему возрастанию. Наблюдающиеся в природе антигенные связи между различными видами и родами микроорганизмов не просто случайное совпадение, а результат их взаимодействия, когда происходит перенос различных детерминант, в том числе антигенных. В доказательство сказанного, выделенные нами эпизоотические штаммы E.coli принадлежащие к серогруппам 0125, 09, 0101, 0119, 0128, 0124, 0111, 026, 08 обнаруживали антигенные связи с токсигенными анаэробами Cl.perfringens типов A28, B216, C219, D211, Cl.septicum А59, Cl.oedematiens А79, Cl.chauvoei В1 [6]. Из 134 живых антигенов E.coli 88 агглютинировались сывороткой Cl.perfringens типов A, B, C, D в разведении 1:20, 1:40, 1:50 с сывороткой Cl.septicum 1:20, 1:40 – 16, с Cl.oedematiens 1:20 – 3, с Cl.chauvoei 1:20 – 9 [6]. С гретыми антигенами положительные реакции были получены с разведениями сывороток: Cl.perfringens типов A, B, C, D – 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:250 - у 98 штаммов; Cl.septicum 1:20, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200 - у 14; Cl.oedematiens – 1:20, 1:50, 1:100 - у 7; Cl.chauvoei – 1:20, 1:50, 1:100 - у 14 [6]. Данные реакции агглютинации позволяют говорить об антигенной связи между различными серогруппами эпизоотических штаммов E.coli и клостридиями. Известно, что в ассоциации одни виды микроорганизмов усиливают или снижают вирулентность другого вида. Подобное действие отмечено между кишечной палочкой и Cl.perfringens, причем снижается токсигенность последнего. Белые мыши, зараженные ассоциированно выращенной смесью культур доноров и реципиентов (доноры: Cl.perfringens A28, A49, B216, B(LD–1), C219, D211, D213, D218; Cl.septicum А2, А59, А103, А113; Cl.chauvoei В1, В11; Cl.oedematiens А79. Реципиенты: E.coli К12, М1), погибали на вторые, третьи сутки; выделенные из организма павших мышей селекционированные по вирулентным свойством рекомбинанты E.coli приобретали дополнительно гемолитическую активность и антигенность. Гипериммунные сыворотки от соответствующих доноров агглютинировали клетки рекомбинантов E.coli в пробирочной РА в разведениях 1:200, 1:300, 1:400, тогда как исходные культуры реципиентов (E.coli К12, М1) агглютинировались до разведения сывороток 1:5 [6]. При последовательных пересевах рекомбинантов с факторами Ent и Hly на МПБ с интервалом в 2–3 дня и последующим высевом на глюкозо-кровяной агар, Hly-фактор часто элиминировался, но сохранялся фактор Ent, следовательно эти два признака передавались независимо друг от друга, и элиминация фактора Hly не влияла на приобретенные вирулентные свойства рекомбинантов. Сыворотки, полученные гипериммунизацией кроликов анавакцинами рекомбинантов E.coli, агглютинировали антигены соответствующих донорных штаммов токсигенных анаэробов. Предельный титр положительной РА токсигенных анаэробов с сыворотками против рекомбинантов был 1:300–1:400. Контрольные 6 сыворотки, полученные иммунизацией кроликов антигенами исходных реципиентных культур (E.coli К12, М1), не агглютинировали культуры доноров. Они агглютинировали гомологичные антигены в разведениях 1:20–1:50. Перенос фактора вирулентности сопровождался также сообщением антигенных свойств [9]. Одни виды микроорганизмов усиливают или подавляют рост других видов, синергизм и антагонизм широко распространенное явление в микробном мире. Синергетическое и антагонистическое действия проявляются при ассоциированном нахождении их в среде обитания. Антагонистическое действие микроорганизмов связано с выработкой ими антибиотикоподобных веществ – бактериоцимов. Известны бактериоцимы, продуцируемые кишечной палочкой (колицины), Cl.perfringens (велхицины), Cl.botulinum (ботицины), холерным вибрионом (вибриоцины), возбудителем чумы (пестицины) и др. При совместном выращивании клостридий с эшерихиями имело место подавление роста анаэробных микроорганизмов со стороны E.coli, особенно в жидких питательных средах. Если в свежий МППБ одновременно внести инокуляты суточных культур анаэробов и эшерихий, то в первые три часа оба представителя размножаются удовлетворительно (E.coli интенсивнее), но по прошествии 6–12–18– 24–25 часов рост анаэробов полностью подавляется и они постепенно элиминируются из смешанной культуральной среды. Если к активно растущей на МППБ культуре E.coli добавить инокулят анаэробов, также с МППБ в логарифмической фазе роста, то размножение клостридий полностью подавляется. При одновременном высеве клостридий и эшерихий на пластинчатой среде, подавления роста анаэробов со стороны E.coli не наблюдали. Не было отмечено также подавление роста культур E.coli со стороны анаэробных микроорганизмов. На пластинчатой среде E.coli подавляет рост клостридий в том случае, если они будут высеены раньше на определенное время, достаточное для роста кишечной палочки и выделения ею в среду антагонистического вещества (колицинов), которое диффундируя в питательный агар, подавляет рост анаэробов. В чашках Петри с глюкозокровяным агаром около линии роста E.coli отсутствовал рост штаммов клостридий, при этом зона задержки роста была у Cl.perfringens A218 – 15 мм, B216 – 17 мм, D213 – 13 мм, у Cl.chauvoei В1 – 24 мм, В16 – 22 мм, у Cl.septicum А103 – 16 мм, А59 – 18 мм, А2 – 21 мм. В зоне задержки роста, однако, появлялись единичные (3–4) резистентные к колицинам колонии, которые в последующих пересевах сохраняли обнаруженную устойчивость [2-5,9]. Синтез гемолизина от токсигенных клостридий передавался также стафилококкам. Причем все штаммы доноров Cl.perfringens A28, B216, D211; Cl.septicum А59; Cl.oedematiens А79; Cl.chauvoei В1 сообщали Hly-фактор [10]. Из 46 штаммов стафилококков, испытанных в качестве реципиентов, способными воспринимать гемолитическую активность оказались 14. Рекомбинанты стафилококков с приобретенным Hly-фактором при подкожном заражении в дозе 1 мл с концентрацией 2·109 м.т./мл не вызывали гибель подопытных животных, при внутрибрюшинном введении мыши погибали от доз 0,8 и 1,0 мл в течение 3–4–5 суток. Отмеченная вирулентность была свойственна для всех рекомбинантов с сообщенным Hly-фактором, т.е. передавалась как 7 гемолитическая активность, так и вирулентность, которая по силе значительно уступала исходным культурам доноров [10]. Частота встречаемости рекомбинантов по Hly-фактору, была в среднем 5·10–8. Перенос отдельных детерминант от клостридий к стафилококкам и эшерихиям, кроме конъюгационного мостика, осуществляется путем непосредственного контакта клеток и слияния клеточных стенок [10]. Результаты воздействия различных факторов на клостридий показали, что многие свойства данных микроорганизмов управляемы. Путем продолжительного пассирования клостридий с различными концентрациями стрептомицина были получены варианты со сниженной ферментативной активностью и лишенные вирулентности, а также изменившие свою морфологию. Низкие температуры порядка –700С при воздействии на культуры токсигенных клостридий в логарифмической фазе роста вызывали глубокие изменения, вплоть до лишения вирулентности. Это можно объяснить тем, что молодые клетки не подготовлены к образованию спор и при быстром замораживании происходит нарушение целостности клеточной оболочки, элиминация плазмид и деструктивные процессы в хромосомальной ДНК. Более стабильная утрата вирулентности достигалась при комбинированном воздействии низкой температуры и стрептомицина. Сравнение иммуногенных свойств авирулентных вариантов Cl.perfringens и Cl.septicum с их исходными культурами показало, что животные, привитые вакцинами из авирулентных культур, значительно уступали по силе напряженности иммунитета животным, привитым вакциной от исходных родительских штаммов Cl.perfringens A28, B266, D211, С219; Cl.septicum А103, А113. Даже живые культуры авирулентных вариантов указанных штаммов клостридий не обладали иммуногенными свойствами. Это объясняется тем, что иммуногенность у анаэробных микроорганизмов связана с синтезом экзотоксина. Известно, что замораживание ведет к частичному или полному повреждению клеточной стенки бактерий. Степень пораженности зависит от режима замораживания и состава среды, в которой суспензированы микробные клетки. При замораживании сравнительно щадящей способностью обладают белковые и углеводные среды (МПБ, МППБ, среда с сахарозой). Бактерии в большей степени повреждаются и погибают в 0,15 М растворе NaCl. Это связано с тем, что белки и углеводы в определенной степени предупреждают кристаллизацию связанной воды бактериальной клетки. Влияют на выживаемость также длительность замораживания и уровень температуры. При минус двух-четырех градусах выживаемость бактерий выше, нежели при –700С. Патогенные клостридии и стафилококки, подвергшиеся замораживанию при –700С, при высеве на плотные питательные среды вырастали в R-формы колонии – плоские, шероховатые, с зазубренными, изрезанными краями. При этом токсигенные анаэробы и S.aureus №209 теряли вирулентность, но гемолитические свойства сохранялись. Те же культуры, замороженные при –40С в растворе 0,15 М NaCl, также давали R-формы, вирулентность была ослаблена, но не утрачена, гемолитический фактор не элиминировался. Указанные культуры, замороженные при –4 0С на МПБ, МППБ и на среде с 20% сахарозы, в большинстве своем на 8 пластинчатых средах имели колонии S- формы, вирулентность понижалась незначительно, гемолитическая активность сохранялась [11]. Такое явление связано с тем, что при более низких минусовых температурах клеточная стенка бактерий разрушается сильнее и чаще утрачиваются те плазмиды, которые локализованы в цитоплазме автономно, в том числе те, которые кодируют синтез энтеротоксина. Белковые и углеводные среды в этих условиях являются более щадящими. При совместном замораживании токсигенных анаэробов с авирулентными эшерихиями и стафилококками было замечено, что вирулентные свойства не передаются, но переносится резистентность к стрептомицину и гемолитическая активность, причем strr передается с большей частотой, нежели Hly-фактор. Объясняется это тем, что фактор Ent, переносимый в вирулентные клетки эшерихий и стафилококков, там не удержатся в силу нарушения целостности бактериальной оболочки. При переносе же strr и Hly-фактора они сравнительно реже элиминируются, возможно из-за более глубинной локализации в цитоплазме и удалении от цитоплазматической мембраны и клеточной стенки или же интеграции с хромосомальной ДНК [12]. Удлинение срока замораживания резко сокращает число жизнеспособных клеток, но и в этом случае рекомбинанты по обоим указанным маркерам образуются пропорционально убиванию жизнеспособных клеток. Известно, что многие виды микроорганизмов находятся в ассоциации как в полостях организма, так и во внутренних органах, в мышцах и лимфатических узлах здоровых животных, чаще они относятся к авирулентным вариантам, но встречаются и патогенные расы. Выделенные нами из внутренних органов и лимфатических узлов здоровых животных микроорганизмы чаще относились к авирулентным клостридиям, эшерихиям и стафилококкам. Ясно, что они заносятся во внутренние органы и лимфатические узлы током крови из желудочно-кишечного тракта. Но здесь интересно другое, из кишечного тракта вирулентных особей клостридий, эшерихий и стафилококков выделяются в большем количестве, чем из внутренних органов и лимфатических узлов. Причиной по всей вероятности является то, что в процессе миграции по кровеносным сосудам эти микроорганизмы теряют присущую им вирулентность вследствие воздействия на них факторов естественной защиты организма, содержащихся в сыворотке крови. И здесь следует добавить, что под воздействием защитных сил организма из тела бактерий элиминируется плазмидная ДНК, детерминирующая синтез энтеротоксина. При скрещивании авирулентных клостридий, эшерихий и стафилококков, изолированных из внутренних органов и лимфатических узлов здоровых животных, с эталонными токсигенными штаммами Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei удавалась передача Ent-фактора. Кроме этого, эшерихий и стафилококки приобретали устойчивость к стрептомицину и гемолитическую активность [13]. Передаваемая к стафилококкам вирулентность была выражена слабо – белые мыши, зараженные внутрибрюшинно дозой 1 мл с концентрацией м.т. 2·109, заболевали, но оставались живы. Рекомбинанты стафилококков по некротическим свойствам также уступали соответствующим донорам. Низкая степень реализации вирулентных 9 свойств рекомбинантными клетками стафилококков объясняется особенностями белкового синтеза; по-видимому, ферментная система цитоплазмы данного вида, неспособна включить одну из необходимых аминокислот в состав экзотоксина [14]. Различные виды микроорганизмов, способные к рекомбинации, можно изолировать из многих объектов внешней среды. Воздух животноводческих помещений всегда содержит то или иное количество микроорганизмов, которое в определенной степени влияет на санитарное благополучие хозяйства. Не исключена возможность осуществления рекомбинационных процессов (передача Ent-фактора) между микроорганизмами, адсорбированными в капельках жидкости, находящихся в воздухе во взвешенном состоянии, при вдыхании этих капелек возможно инфицирование организма. Предположить подобное позволяет то, что выделенные из воздуха животноводческих и птицеводческих помещений изоляты эшерихий и стафилококков воспринимали факторы Ent, Hly и резистентность к стрептомицину от токсигенных анаэробов также изолированных из воздуха и использованных в качестве доноров. Так например, из 99 изолятов E.coli, выделенных из воздуха, с Cl.perfringens А28 скрещивались 67, в том числе 37 сообщалась только резистентность к стрептомицину, 19 – резистентность к стрептомицину и гемолитическая активность, 11 – резистентность к стрептомицину, гемолитическая активность и синтез энтеротоксинов, от Cl.perfringens В216 21 изолятам передавалась резистентность к стрептомицину, 11 – strr и Hly-фактор, 7 изолятам все три признака – strr факторы Hly и Ent. От Cl.septicum А59 strr передавалась 9 изолятам, strr и Hlyфактор – 5; strr, Hly и Ent-факторы – 3. Из 90 изолятов стафилококков от Cl.perfringens А28 воспринимали strr – 26; strr и Hly-фактор – 21; strr, Hly и Entфакторы – 7; от Cl.perfringens В216 strr – 17; strr и Hly-фактор – 11, strr, Hly и Entфакторы – 5; от Cl.septicum А59 strr – 14; strr и Hly-фактор – 3; strr, Hly и Ent-факторы – 1 [15]. Известна антигенная взаимосвязь между далеко стоящими на токсономической лестнице микроорганизмами, выделенными из разных объектов внешней среды. Из 180 проб комбинированного корма было выделено 62 изолята клостридий, 17 – гемолитических эшерихий т 97 – стафилококков (St.aureus – 86, St.albus – 11). Из них наиболее вирулентные культуры реагировали положительно в РА с гипериммунными кроличьими сыворотками против токсигенных анаэробов. Самый большой процент реагирующих изолятов эшерихий и стафилококков приходился на гипериммунные сыворотки против Cl.perfringens – 76, из них с сывороткой типа А – 31, типа В – 22, типа С – 7, типа Д – 11, типа Е – 5 с сывороткой против Cl.septicum реагировало 9% выделенных изолятов, с сывороткой против Cl.oedematiens столько же, с сывороткой против Cl.chauvoei 6%. Безусловно, это свидетельствует о широком распространении ассоциантов в разных объектах и обмене между ними разными маркерами, в том числе и антигенными детерминантами [16]. Остро стоит вопрос профилактики желудочно-кишечных заболеваний, вызванных токсигенными анаэробами, эшерихиями и стафилококками. В этом отношении сравнительно лучше обстоит дело с профилактикой и лечением клостридиозов. Что касается эшерихиозов, то несмотря на многочисленные исследования в этом направлении и предложения различных средств, проблема все 10 же остается нерешенной. Одной из главных причин можно считать наличие множества серогрупп, которое имеет тенденцию к увеличению, и вполне понятно, что все серогруппы включить в состав вакцины невозможно и не эффективно. Заболевание могут вызвать те серогруппы, которые не входят в состав вакцины, следовательно, не будет достигнута цель – формирование колострального иммунитета у нарождающегося молодняка против колибактериоза. То же самое можно сказать и о лечении больного молодняка, ибо противоколибактериозные сыворотки имеют те же недостатки. Штаммы E.coli, подобранные для изготовления вакцин или предназначенные для гипериммунизации, как правило, по патогенным свойствам являются нестабильными, поскольку в процессе хранения, освежения и т.д. теряют те плазмиды, которые реализуют синтез энтеротоксина, главного иммуногенного фактора клетки. Хоть и ведутся сейчас многочисленные работы по созданию вакцин с наличием адгезивных антигенов, но и они не дают пока обнадеживающих результатов. Однако надо признать тот факт, что в механизме вирулентности эшерихий заложена реализация свойств, детерминированных в различных плазмидах, перенесенные в клетки E.coli в процессе их взаимодействия с другими видами микроорганизмов, в том числе с токсигенными клостридиями. В наших опытах культуры рекомбинантов E.coli с переданным Ent-фактором от токсигенных анаэробов использованных в качестве живых вакцин в субинфицирующих дозах на белых мышах против возбудителей колибактериоза и анаэробных инфекций, обладали хорошо выраженными иммуногенными свойствами. Вакцинированные белые мыши при контрольном заражении вирулентными культурами клостридий и E.coli оставались живы, что свидетельствовало о сообщении реципиентным штаммам E.coli (К12, М1) вирулентных свойств от анаэробных микроорганизмов. Иммунизация тем же способом беременных самок белых мышей защищала родившихся мышат от гибели при заражении их per os вирулентными культурами E.coli и, следовательно, обеспечивала у новорожденных формирование колострального иммунитета. Моновакцины, приготовленные из культур рекомбинантов E.coli К12 с переданным Ent-фактором от токсигенных анаэробов, обладали иммуногенными свойствами и предохраняли животных (белые мыши, морские свинки) от гибели при заражении соответствующими исходными эталонными штаммами доноров (Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei). Вакцина из исходного реципиентного штамма E.coli К12 иммуногенными свойствами не обладала ни к одному из использованных донорских штаммов. Поливалентная вакцина, полученная путем смешивания в равных объемах моновакцин рекомбинантов E.coli, также защищала животных от гибели, причем как от токсигенных донорских штаммов анаэробных микроорганизмов, так и от вирулентных серогрупп E.coli. Эта же вакцина способствовала формированию колострального иммунитета у телят и поросят, родившихся от вакцинированных стельных коров и супоросных свиноматок [17,18]. Сыворотка, полученная гипериммунизацией кроликов и бычков вышеуказанным полиантигеном, обладала лечебным эффектом против 11 колибактериоза новорожденных телят и поросят. Пероральная дача препарата была более эффективной по сравнению с парентеральной. Может показаться странным, каким образом факторы патогенности клостридий, переданные авирулентным штаммам E.coli, могут оказать специфическое лечебное и профилактическое действие. Смысл же заключается в том, что вирулентность энтеропатогенных эшерихий в большинстве своем обусловлена их взаимодействием с токсигенными анаэробами, находясь с ними в ассоциации как в организме животных, так и во внешней среде. Передача патогенных свойств между указанными ассоциантами осуществляется в основном конъюгацией, в меньшей степени – трансформацией, не исключено также наличие трансдукции, хотя этим способом нам не удалось осуществить наведение каких-дибо свойств. Вместе с фактором патогенности от клостридий к эшерихиям передаются и антигенные свойства, определяющие их серогрупповую принадлежность, которая имеет тенденцию ко все большему увеличению, ибо контакты между этими двумя группами микроорганизмов постоянно осуществляются, и появление новых и новых сероваров вполне реально. Антигенные связи, обнаруженные нами между клостридиями и эшерихиями, особенно их вирулентными представителями, свидетельствуют в пользу сказанного [18]. Если факторы патогенности клостридий, перенесенные в авирулентные клетки E.coli, заодно сообщают и иммуногенные свойства, обеспечивающие защиту животных от колибактериоза, то закономерным было допустить, что те же токсигенные клостридии могли быть успешно использованы в качестве антигенов для изготовления вакцины и получения лечебной гипериммунной сыворотки. Такое допущение оказалось правильным. Вакцины, приготовленные из эталонных штаммов клостридий (Cl. perfringens A28, B216, C219, D211; Cl.septicum A59; Cl.oedematiens A79; Cl.chauvoei B1) защищали новорожденных животных от колибактериоза, обеспечивая в их организме формирование колострального иммунитета, через молозиво вакцинированных стельных коров и супоросных свиноматок [18]. Эталонные штаммы клостридий для изготовления вакцины были подобраны по принципу возможной частоты контакта их с эшерихиями в кишечном тракте животных или в объектах внешней среды. Определить частоту контакта позволило обнаруженное нами наличие антигенной связи между указанными выше видами клостридий и эпизоотическими вирулентными изолятами E.coli. Частота встречаемости антигенной связи, как правило, всегда была выше с Cl.perfringens. Поскольку микроорганизмы группы perfringens более широко распространены в природе, это позволяет им входить в более частый контакт с эшерихиями. Сказанное справедливо и в отношении других видов микроорганизмов – стафилококков, стрепкококков, хотя по степени силы сообщенной вирулентности и выраженности антигенной связи они уступали эшерихиям [18]. Полученные нами результаты по вопросам влияния токсигенных анаэробов на вирулентные и другие свойства эшерихий и стафилококков, позволят глубже раскрыть механизм появления все новых и новых вирулентных серогрупп E.coli, стафилококков с Ent и Hly-факторами, могут способствовать более основательному 12 изучению внутриклеточных процессов, протекающих после включения в них новых детерминант, направленных на получение штаммов с полезными свойствами, способствоывть раскрытию механизма взаимодействия разных видов микроорганизмов в ассоциации в естественных средах их обитания и на этой основе появлению патогенных вариантов. На основе проведенных исследований раскрывается механизм возникновения тяжелых кишечных заболеваний, токсико-септических инфекций у новорожденных, колиэнтеритов молодняка, пищевых отравлений и др. Установленные факты передачи токсигенности эшерихиям и стафилококкам от патогенных клостридий внесут коренные изменения в вопросы диагностики, лечения и профилактики колиинфекций и стафилококкозов; внесут ясность в внехромосомной наследственности эшерихий, стафилококков и клостридий, тем самым открывая широкие возможности генетического моделирования при решении теоретических проблем молекулярной биологии. Результаты исследований изменяют имеющиеся до сих пор представления о вирулентности эшерихий и стафилококков и дают совершенно новое направление исследованиям в области инфекционной патологии и генетики у этих микроорганизмов. ВЫВОДЫ 1. Патогенные клостридии видов Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens и Cl.chauvoei путем конъюгации способны передавать эшерихиям, стафилококкам патогенные свойства, гемолитическую активность, антигенные детерминанты и ферментативную активность. 2. Установлена способность иммуносывороток, полученных гипериммунизацией кроликов антигенами Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens и Cl.chauvoei, нейтрализовать культуры рекомбинантов эшерихий, с переданной вирулентностью от соответствующих доноров – клостридий. 3. Все четыре вида токсигенных анаэробов, использованные в качестве доноров, при конъюгации способны передавать реципиентным штаммам эшерихий устойчивость к стрептомицину. 4. При совместном выращивании культур донора (клостридий) и реципиента (эшерихий) в жидкой питательной среде в результате антагонистического действия эшерихий, происходит постепенная элиминация из культуральной среды клеток донора. 5. Ассоциированное выращивание токсигенных анаэробов с авирулентными штаммами E.coli с последующим селекционированием патогенных особей – рекомбинантов через организм белых мышей позволяет изолировать трансконъюганты с более выраженными токсигенными свойствами. 6. При совместном замораживании токсигенных клостридий с авирулентными эшерихиями и стафилококками патогенные свойства не передавались, но сообщалась гемолитическая активность и устойчивость к стрептомицину. 7. Стафилококки и эшерихии при ассоциированном инкубировании с токсигенными анаэробами в 0,15 М растворе NaCl приобретают гемолитические 13 свойства, а также вирулентность, но в значительно меньшей степени, чем у соответствующих доноров. 8. У эпизоотических штаммов E.coli, принадлежащих к различным серогруппам и выделенных от больных и павших от колибактериоза животных, обнаружена антигенная связь с токсигенными анаэробами – Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei. 9. Вакцина, приготовленная из культур трансконъюгантов E.coli с сообщенной токсигенностью от анаэробов, обладает иммуногенными свойствами и предохраняет животных от гибели при заражении токсигенными культурами анаэробов и эшерихий. 10. Сыворотка, полученная гипериммунизацией животных антигенами трансконъюгантов E.coli, обладает защитным и нейтрализующим свойством в отношении токсигенных штаммов анаэробов и эшерихий. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Начкебия Д.В. Передача устойчивости к стрептомицину от Cl.chauvoei к E.coli // Сб. трудов ГЗВУИИ, т.8, Тбилиси, 1989? c/84-86; Nachkebia J.V. Transmission Stability to Streptomycin from Cl.chauvoei to E.coli // Works of GZVI, vol.8, Tbilisi, 1989, pp. 84-86. 2. Начкебия Д.В., Начкебия Э.Д., Начкебия К.Д. Причинная обусловленность патогенности эшерихий, связанная с совместным обитанием их с токсигенными клостридиями (сообщение второе) // Известия аграрной науки, том 3, № 2, 2005, c. 143-146. Nachkebia J.V., Nachkebia E.J., Nachkebia K.J. Casual Conditionality of Pathogenic Escherichia, Connected to their Joint Inhabitation with Toxigenic Clostridias (Information Second) // Annals of Agrarian Science, vol 3, No 2, 2005, pp. 143-146. 3. Начкебия Д.В., Начкебия Э.Д., Начкебия К.Д. Причинная обусловленность патогенности эшерихий, связанная с совместным обитанием их с токсигенными клостридиями (сообщение третье) // Известия аграрной науки, том 3, № 3, 2005, c. 195-197. Nachkebia J.V., Nachkebia E.J., Nachkebia K.J. Casual Conditionality of Pathogenic Escherichia, Connected to their Joint Inhabitation with Toxigenic Clostridias (Information Third) // Annals of Agrarian Science, vol 3, No 3, 2005, pp. 195-197. 4. Начкебия Д.В., Начкебия Э.Д., Начкебия К.Д. Причинная обусловленность патогенности эшерихий, связанная с совместным обитанием их с токсигенными клостридиями (сообщение первое) // Изв. аграрной науки, 4, 2004, c. 93-96. Nachkebia J.V., Nachkebia E.J., Nachkebia K.J. Casual Conditionality of Pathogenic Escherichia, Connected to their Joint Inhabitation with Toxigenic Clostridias (Information First) // Annals of Agrarian Science, 4, 2004, pp. 93-96. 5. Начкебия Д.В., Начкебия Э.Д., Начкебия К.Д. Причинная обусловленность патогенности эшерихий, связанная с совместным обитанием их с токсигенными клостридиями (сообщение четвертое) // Известия аграрной науки, том 3, № 4, 2005, c.118-123. Nachkebia J.V., Nachkebia E.J., Nachkebia K.J. Casual Conditionality of Pathogenic Escherichia, Connected to their Joint Inhabitation with Toxigenic Clostridias (Information Fourth) // Annals of Agrarian Science, vol 3, No 4, 2005, pp. 118-123. 6. Начкебия Д., Шаматава Т., Начкебия Э. Превентивная активность сыворотки, полученной гипериммунизацией животных смесью рекомбинантов E.coli К–12 // Сб. 14 трудов Груз. зооветеринарного ин-та, т. ІХ, ч. ІІ, 2002, с. 99-104. Nachkebia J., Shamatava T., Nachkebia E. Preventive Activity of Serum, Received by the hyperimmunization of Animal Mix-recombinants E.coli K–12 // Collection of Works of Georgian Zooveterinary Institute, vol. IX, part II, Tbilisi, 2002, pp. 99-104 (in Georgian). 7. Nachkebia J.V., Nachkebia E.J., Nachkebia K.J. Tumor Growth Induced in White Mice with Protoplasts and Lisates of Toxigenic Clostridia and Clostridial Recombiants of Escherichia // Annals of Agrarian Science, vol.5, No 1, 2007, pp.129-131. 8. Начкебия Д., Шаматава Т., Капанадзе К. Антигенная активность клостридиальных рекомбинантов E.coli // Сб. трудов аграрного ун-та, т. ХV, Тбилиси, 2002, c. 303-305. Nachkebia J., Shamatava T., Kapanadze K. Antigenic Activity of Clostridium Recombinants E.coli // Collection of Works of Agrarian University, vol. XV, Tbilisi, 2002, pp. 303-305. 9. Начкебия Д., Зазашвилим Н. Иммуногенная активность вакцин, изготовленных из культур рекомбинантов E.coli // Интеллект, 2 (25), 2006, с. 295-299. Nachkebia J., Zazanashvili N. Immunogenic Activity of Vaccine, Prepared from the Cultures of Recombinants E.coli // Intellect, 2 (25), 2006, pp. 295-299 (in Georgian). 10. Начкебия Д., Курашвили Т., Шаматава Т. Конъюгация токсигенных анаэробов со стафилококками, выделенными из органов убойных животных // Тр. Грузинского гос. аграрного ун-та, т.IX, 2000, c. 263-268. Nachkebia J., Kurashvili T., Shamatava T. Conjugation of Toxigenic Anaerobes with Staphylococcuses, Isolated from the Organs of Slaughtered Animals // Works of Georgian State Agrarian University, vol. IX, 2000, pp. 263-268 (in Georgian). 11. Начкебия Д., Начкебия Э. Способность бактерий к выживанию при различных условиях замораживания // Межгосударственный науч. сб. трудов, ч. ІІ, Тбилиси, 1997., c. 133-136. Nachkebia J., Nachkebia E. Ability of Survival of Bacteria During the Different Conditions of Freezing // Intergovernmental Scientific Collection of Works, part II, Tbilisi, 1997, pp. 133-136 (in Georgian). 12. Начкебия Д., Начкебия Э. Совместное замораживание клостридий с эшерихиями и стафилококками // Межгосударственный науч. сб. трудов, ч. ІІ, Тбилиси, 1997, c. 75-78. Nachkebia J., Nachkebia E. Combined Freezing of Clostridias Together with Escherichias and Staphylococcuses // Intergovernmental Scientific Collection of Works, part II, Tbilisi, 1997, c.75-78 (in Georgian). 13. Начкебия Д. Передача Hly фактора от клостридий к стафилококкам // Сб. трудов ГЗВУИИ, т.8, Тбилиси, 1989, c. 42-43. Nachkebia J. The Transfer of Hly Factor from Clostridia to Staphylococcus // Works of GZVI, vol.8, Tbilisi, 1989, pp. 42-43 (in Georgian). 14. Начкебия Д.В., Парцвания Б.В. Патогенные клостридии в паренхиматозных органах клинически здоровых убойных животных // Тр. Груз. СХИ, т. 103, в. 41, Тбилиси, 1978, c. 23-31. Nachkebia J., Partsvania B.V. Pathogenic Clostridias in Parenchymatous Organs of Clinically Healthy Slaughtered Animals // Works of GSAU, vol. 103, Tbilisi, 1978, pp. 23-31. 15. Начкебия Д., Начкебия Э., Самхарадзе Б. Способность к рекомбинации микроорганизмов, выделенных из воздуха // Мат. конф. Груз. зооветеринарного инта, Тбилиси, 1995, c.295-297. Nachkebia J., Nachkebia E., Samkharadze B. Ability of 15 Microorganisms, Isolated from the Air, to Recombination // Materials of the Conference of Georgia Zooveterinary Institute, Tbilisi, 1995, pp. 295-297 (in Georgian). 16. Начкебия Д. Способность штаммов эшерихий, стафилококков и клостридий, выделенных из комбинированного корма, к агглютинации с гипериммунными сыворотками токсигенных анаэробов // Матер. научной конференции ГЗВУИИ, Тбилиси, 1994, c. 322-324. Nachkebia J. Ability of Strains of Escherichias, Staphylococcuses and Clostridias, Isolated from the Recombinant Food, to the Agglutination with the Hyperimmunogenic Serum of Toxigenic Anaerobes // Materials of Scientific Conference of GZVI, Tbilisi, 1994, pp. 322-324 (in Georgian). 17. Nachkebia J.V., Nachkebia E.J., Nachkebia K.J. Toxigenic Clostridia as a Causal Factor of Escherichia Patogencity // Annals of Agrarian Science, vol. 4, № 2, 2006. 18. Начкебия Д.В. Влияние токсигенных анаэробов на биологические свойства эшерихий и стафилококков // Автореф. дис. . . . докт. вет. наук, Тбилиси, 1992, 53 с. Nachkebia J.V. Influence of Toxigenic Anaerobes on Biological Properties of Escherichia and Staphylococcuses // Autoref. of dis. of Dr. of Veterinary Sci., Tbilisi, 1992, 53 pp. INFLUENCE OF TOXIGENIC CLOSTRIDIA CLOSTRIDIA ON BIOLOGICAL PROPERTIES OF ESCHERICHIA AND STAPHYLOCOCCUSES J. V. Nachkebia, K. J. Nachkebia, E. J.Nachkebia Pathogenic clostridia of Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.oedematiens, Cl.chauvoei kinds, by the conjugation are capable to transfer to the escherichia and staphylococcuses the toxigenic properties, haemolytic activity, antigene determinants, ferment-saccharolytic properties, resistance to antibiotics. Independence in transfer of these properties and possibility of independent separation and simultaneous transfer of the named signs have been revealed. Associated growth of toxigenic anaerobes with avirulent of escherichia with the following selection of pathogenic species-recombinants through the body of white mice, gives us the possibility to isolate the trans-conjugants which have the expressed severe toxigenic properties. During the combined freezing of toxigenic clostridia with the avirulent escherichia and staphylococcuses, the pathogenic properties were not transferred, but the haemolytic activity and resistance to the antibiotics were revealed.
