МФТИ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ к практическим занятиям по генетической инженерии

Междисциплинарный центр фундаментальных исследований
МФТИ
Московский Физико-Технический Институт
УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ
к практическим занятиям
по генетической инженерии
Москва 2014
УДК 577.21
ББК 28.0; 28.4
Составили: д.б.н. Манухов И.В., Коноплева М.Н., Екимов Л., Баженов С.
Учебное пособие к практическим занятиям по генетической инженерии. – Черноголовка. – Редакционно-издательский отдел ИПХФ
РАН. 2014. Табл. 5, рис. 2, 24 с.
Рекомендовано в качестве учебного пособия к практическим занятиям
для студентов МФТИ, обучающихся по курсам «Молекулярная биология»
и «Генетическая инженерия».
© МФТИ, 2014
Введение
Настоящее учебное пособие ставит своей целью ознакомление
с важнейшими принципами и методами экспериментальной генетической инженерии. Оно составлено коллективом лаборатории
молекулярной генетики Междисциплинарного центра фундаментальных исследований МФТИ на основе работы со студентами 6 и 7
семестров обучения, проходящих обучение на курсах «Молекулярная биология» и «Генетическая инженерия».
Учебное пособие написано с учётом современных методов исследования, включает в себя следующие разделы:
1.
2.
3.
4.
5.
Подготовка оборудования и реактивов к работе.
Разработка схемы клонирования.
Манипуляции с ДНК in vitro (лат. в стекле).
Работа с бактериями.
Анализ полученных конструкций.
В каждом разделе студенты самостоятельно выполняют работу,
представляющую собой часть общей цели практикума – клонирование фрагментов чужеродной ДНК в клетках Escherichia coli. На
лекциях, которые проводятся параллельно практической работе,
разбираются теоретические вопросы выполняемых заданий.
С первых дней практикума обращается внимание на приобретение студентами навыков самостоятельной работы в научно-исследовательской лаборатории: умению рассчитывать концентрации
необходимых растворов, приготовление растворов, а также освоению необходимых методов исследования.
Систематическое освоение программы практикума, а также лекционных курсов обеспечивает фундаментальную теоретическую и
практическую подготовку студентов, которая позволит им впоследствии самостоятельно работать в лабораториях молекулярнобиологического и генетического профиля.
3
РАЗДЕЛ ПЕРВЫЙ.
Подготовка оборудования и реактивов к работе
1.1. Ознакомление с оборудованием.
Калибровка измерительных приборов
Перед началом выполнения задач практикума следует согласно
инструкциям производителей проверить работоспособность оборудования (табл. 1), применяемого в генно-инженерных исследованиях.
Таблица 1
Оборудование, применяемое в генно-инженерных работа
Прибор
Пример
Весы 0,1 г – 4000 г
Ohaus AV4101
Весы 0,1 мг – 200 г
Ohaus AV264
pH-метр
pH-410 Аквилон
Ламинар
Ламинарный шкаф II класса защиты БАВп-01–«Ламинар-С» 1,5
Люминометр
Immunotech,LM-01t
Шейкер-инкубатор.
New Brunswick Excella E24
Термостат суховоздушный
ТС-80М-2
Пипетка автоматическая до 1 мл
Gilson
Пипетка автоматическая до 200 мкл Ленпипет
Пипетка автоматическая до 20 мкл
HTL
Пипетка автоматическая до 2,5 мкл
Eppendorf
Холодильная установка
Мешалка
4
Двухкамерная, температура 10±4°С
и -18±5°С
Мешалка магнитная с подогревом
ПЭ-398
Продолжение табл. 1
Прибор
Пример
Центрифуга
Eppendorf 5418
Микроцентрифуга - вортекс
ТЭТА-2 Биоком
Амплификатор
MC-2+ ДНК-Технология
Твёрдотельный термостат
«Гном» ДНК-Технология
Камера для горизонтального электSE-1 Хеликон
рофореза
Камера для вертикального электроVE-10 Хеликон
фореза
Источник питания
PS-400 ДНК-Технология
СВЧ-печь
Камера объёмом 28-30 л
Трансиллюминатор
Трансиллюминатор УВТ-1
Компьютер. Монитор
Стандартный офисный вариант
Следует откалибровать согласно инструкции производителя
следующее оборудование:
1. весы;
2. pH-метр;
3. пипетки автоматические.
1.2. Приготовление рабочих растворов и сред
При приготовлении буферов и растворов соблюдайте следующие правила:
1. Готовьте все растворы на бидистиллированной деионизованной воде.
2. По возможности стерилизуйте все растворы автоклавированием или фильтрованием через 0,22-мкм фильтр.
Для выполнения задач практикума следует приготовить необходимые растворы. Методика приготовления приведена в табл. 2.
5
Таблица 2
Однокомпонентные растворы
Растворы
Метод
1M Трис-HCl, pH8,0 Растворить 121,1 г триса
в 80 мл Н2О, добавить 42
мл концентрированной
(конц.) HCl.
Остудить раствор до
комнатной температуры
перед окончательным
доведением pH.
Довести pH до 8,0 титрованием конц. HCl.
Довести объём раствора
до 1 литра.
0,5M ЭДТА, pH 8,0
5 М NaСl
1 M MgСl2
3 M ацетат натрия,
рН 5,2
2-меркаптоэтанол
(ВМЕ)
6
Примечания
1. Раствор стерилизовать
автоклавированием.
2. Приблизительное
количество конц. HCl
для приготовления
растворов 1M Трис-HCl
другого pH:
pH 7,4 – 70 мл
pH 7,6 – 60 мл
pH 8,0 – 42 мл
3. Титровать, перемешивая раствор магнитной
мешалкой.
Добавить 186,1 г двух1. Раствор стерилизовать
замещенной соли
автоклавированием.
ЭДТА.2Н2О к 800 мл Н2О. 2. Динатриевая соль
Интенсивно размешать на ЭДТА не растворится до
магнитной мешалке. До- тех пор, пока рН расведите рН до 8,0, добав- твора не будет доведен
ляя NaOH (приблизитель- добавлением NaOH
ное количество - 20 г.).
приблизительно до 8,0.
Растворить 292,2 г NaСl Раствор стерилизовать
в 800 мл Н2О. Довести
автоклавированием.
объем до 1 л.
Растворить 203,3 г
MgСl2 чрезвычайно гигMgСl2.6Н2О в 800 мл Н2О. роскопичен. Хранить в
Довести объем до 1 л.
плотно закрытом сосуде.
Растворить 408,1 г ацетата 1. Раствор стерилизовать
натрия.3Н2О в 800 мл
автоклавированием.
Н2О. Довести рН до 5,2
ледяной уксусной кислотой. Довести объем до 1 л.
Выпускается в виде 14,4 1. Не автоклавировать
М раствора.
ВМЕ и растворы, содержащие ВМЕ.
2. Хранить при 4°С.
Продолжение табл. 2
Растворы
10% додецилсульфат натрия (SDS)
или лаурилсульфат
натрия
Метод
Растворить 100 г SDS в
900 мл Н2О. Нагреть до
68°С для ускорения растворения. Довести рН до
7,2 добавлением нескольких капель конц. HCl.
Довести объем до 1 л.
7,5 М ацетат аммо- Растворить 577,5 г ацетата
ния
аммония.4Н2О в 800 мл
Н2О. Довести объем до 1 л.
Бромистый этидий, Растворить 0,1 г бромис1 мг/мл
того этидия в 100 мл Н2О.
Размешать до полного
растворения на магнитной мешалке.
Примечания
1. С SDS работать в вытяжном шкафу.
2. SDS стерилизовать нет
необходимости.
Стерилизовать фильтрованием.
Сильный мутаген. Взвешивать в перчатках и
маске под тягой.
Хранить в темной склянке при 4°С.
Приготовить питательные микробиологические среды и антибиотики.
Жидкая микробиологическая среда LB (Luria-Bertani):
1. Добавить на 1 л:
 Бакто-триптон 10 г;
 Бакто-дрожжевой экстракт 5 г;
 NaСl 10 г.
2. Довести рН до 7,5 с помощью NaOH.
3. Тщательно перемешать.
4. Разаликвотить 0,5 л в стеклянные пробирки по 5 и 10 мл.
5. Стерилизовать автоклавированием.
Приготовить агаризованную микробиологическую среду LB (LA):
в оставшиеся 0,5 л жидкой среды LB, перед автоклавированием добавить бакто-агар 1,5% (7,5 г на 0,5 л).
Приготовить антибиотик (конц. раствор).
Ампициллин:
1 г натриевой соли ампициллина растворить в 10 мл Н2О.
Рабочая концентрация 200-400 мкг/мл.
7
Приготовить 1% агарозный гель для электрофореза:
взвесить 1 г агарозы, добавить 100 мл 1х ТАЕ, нагреть в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. Охладить смесь до
50°С. Добавить к раствору агарозы 20 мкл бромистого этидия и осторожно перемешать, избегая появления в геле пузырьков воздуха.
Приготовить конц. буфер ТАЕ (трис, ацетат, ЭДТА) для агарозного гель-электрофореза:
на 1 л 50х ТАЕ:
трис – 242 г;
ледяная уксусная кислота – 57 мл;
0,5 М ЭДТА, pH8,0 – 100 мл;
Н2О до 1 л.
Хранить при комнатной температуре на столе (NT) в чистой посуде. Для получения рабочей концентрации 50х буфер разводят в
дистиллированной воде в соотношении 1:50.
Приготовить 1х буфер ТЕ:
на 100 мл:
1 M Трис-HCl, pH 8,0 – 1 мл;
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 – 200 мкл;
Н2О до 100 мл.
Приготовить 6х буфер для нанесения проб:
0,025 % бромфеноловый синий, 30 % глицерин.
Приготовить I-й плазмидный раствор (табл. 3). Хранить при +4°С.
Опционально: перед использованием добавить лизоцим до 5 мг/мл.
Таблица 3
I-й плазмидный раствор
Реактив 8
Конц.
Сток
Глюкоза
50 мM
2M
Трис-НCl, pH 8.0
ЭДТА
H2O
25 мM
10 мM
1,0 M
0,5 M
На 100 мл
2,5 мл
2,825 г
2,5 мл
2,0 мл
93 мл
Приготовить II-й плазмидный раствор (табл. 4) непосредственно перед использованием.
Таблица 4
II-й плазмидный раствор
Реактив NaOH
SDS
Конц.
Сток
На 1 мл
0,2 Н
1Н
0,2 мл
1%
10 %
0,1 мл
H2O
0,7 мл
РАЗДЕЛ ВТОРОЙ.
Разработка схемы клонирования
2.1. Схема клонирования
Схема клонирования разрабатывается согласно решениям семинарского занятия и должна содержать следующую информацию:
1. источник клонируемого фрагмента (РНК, плазмидная или
хромосомная ДНК, синтез in vitro);
2. реципиент для клонируемого фрагмента ДНК;
3. векторная система;
4. ферменты, применяемые в процессе клонирования;
5. стадии клонирования со ссылками на применяемые методы;
6. последовательность или карта целевой конструкции (промежуточных конструкций, при необходимости).
2.2. Дизайн праймеров для ПЦР
При использовании метода полимеразной цепной реакции
(ПЦР) в схеме клонирования указываются праймеры и матричная
последовательность с плечами по 100-200 н.п. (нуклеотидных пар).
Для праймеров указывается название, температура отжига и информация о местоположении в приведённой последовательности.
9
Праймеры подбираются с помощью любого программного обеспечения и интернет ресурсов, позволяющих рассчитать:
1. температуру отжига;
2. наличие вторичных структур, закрывающих 3'-конец праймера;
3. неспецифическое праймирование на матрице.
Температуру отжига желательно подобрать в пределах 55-65°С.
Желательно избегать вторичных структур, закрывающих 3'-конец тремя и более спаренными нуклеотидами, и неспецифического
праймирования.
РАЗДЕЛ ТРЕТИЙ.
Манипуляции с ДНК in vitro
3.1. Постановка ПЦР
Приготовить смесь для ПЦР (табл. 5).
Таблица 5
Состав смеси ПЦР
Компонент Конц.
Сток
100 мкл
1х
10х
10 мкл
2 мM MgCl2
2,5 мM
25 мM
10 мкл
0,2 мM смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)
0,2 мM
10 мM
2 мкл
Буфер
Праймеры №1 и №2
по 0,1 мкM
10 мкM
по 1 мкл
Полимераза
0,05 ед./мкл
5 ед./мкл
1 мкл
Матрица
1 мкл
Буфер для внесения
1х
5х
20 мкл
H2O
до 100 мкл
При использовании амплификаторов с неподогревающейся
крышкой добавить в пробирку с готовой смесью каплю минерального масла. Масло должно полностью прикрыть поверхность ПЦРсмеси.
10
Установить программу для ПЦР на амплификаторе:
I. T горячего старта =95°C, 4';
II. 25-30 циклов:
Tденатурации=94°C, 10'';
Tотжига=(определяется праймерами), 30'';
Tэлонгации=72 °C (определяется длиной амплифицируемого
фрагмента);
III. T=72°C, 45';
IV. T хранения=4°C.
3.2. Контроль результатов ПЦР
методом электрофореза в агарозном геле
Провести электрофорез продуктов ПЦР при напряжении
10-12 В/см:
1. электрофорезную кювету залить теплым 1% агарозным гелем
толщиной 0,4 см. Вертикально вставить гребенку. Дать агарозе застыть, затем осторожно удалить гребенку. Кювету с гелем
поместить в электрофорезную камеру, заполненную 1х ТАЕ
вровень с поверхностью агарозного геля;
2. если ПЦР-смесь не содержит красители, продукты ПЦР необходимо подготовить к электрофорезу, для этого смешать их с
буфером для нанесения в соотношении 5:1;
3. осторожно внести в лунки агарозного геля исследуемую ДНК;
4. для сопоставления размера и количества образца внести в
гель весовой маркер ДНК;
5. посмотреть гель в ультрафиолетовом (УФ) свете на трансиллюминаторе.
6. Сфотографировать или зарисовать результаты.
3.3. Элюция фрагмента ДНК из геля
Для проведения элюции поставить препаративный гель-электрофорез как описано выше, но толщину геля сделать 1 см, а гребёнку взять
с большими зубцами. Для гребёнки C101 (10 зубцов) в камере SE-1 (Хеликон) объём вносимого образца составляет до 20 мкл на лунку.
11
Продукты ПЦР соответствующего, ожидаемого размера элюировать из агарозного геля:
1. разместив гель на чистом стекле на трансиллюминаторе, вырезать перед элюируемой полосой ДНК, тонкую лунку (в полтора раза шире, чем элюируемая полоса), убрать лишние куски агарозы;
2. чтобы убрать лишние фрагменты с большим молекулярным
весом вырезать лунку в геле после элюируемой полосы;
3. переместить гель в форезную камеру, расположить камеру на
трансиллюминаторе;
4. наложить фитили из фильтровальной бумаги (рис. 1);
5. электрофорезную камеру и лунку, вырезанную после
элюируемой полосы, заполнить 1 х TAE;
6. тонкую лунку, вырезанную перед элюируемой полосой,
заполнить 5 х TAE;
7. вогнать ДНК в лунку при 35-45 В/см (2-5 мин), контролировать вхождение полосы в лунку периодически
включая УФ;
8. когда ДНК войдёт из геля в лунку с 5х ТАЕ, собрать раствор ДНК из лунки;
9. концентрировать методом переосаждения ДНК этанолом.
Рис. 1. Схема расположения лунок и фитилей для электроэлюции
12
Метод переосаждения ДНК этанолом:
1. добавить 1/10V 3M AcONa к раствору ДНК;
2. добавить 2,5 V этанола, смешать;
3. -20°С 10 минут.
4. осадить на центрифуге в течение 5 мин при максимальных
оборотах (об.);
5. супернатант слить, не потеряв осадок ДНК;
6. осаженную ДНК промыть 70% этанолом;
7. осадок высушить и растворить в 25-50 мкл воды или TE.
8. хранить при -20°С;
3.4. Контроль результатов элюции методом электрофореза
в агарозном геле
1. Подготовить элюированную и переосажденную ДНК к электрофорезу, смешать 5 мкл ДНК с 1 мкл буфера для внесения
в гель;
2. для оценки концентрации образца внести в гель весовой маркер ДНК известной концентрации;
3. провести электрофорез в агарозном геле;
4. посмотреть гель на трансиллюминаторе и сфотографировать
или зарисовать;
5. оценить концентрацию полученной ДНК, сопоставив интенсивности свечения исследуемого фрагмента ДНК и соответствующего по интенсивности флуоресценции фрагмента маркерной ДНК.
3.5. Лигирование
Лигирование элюированного и переосажденного фрагмента
ДНК производится с плазмидным вектором.
При клонировании ПЦР продуктов, полученных с помощью
термостабильной полимеразы удобно пользоваться Т-вектором
(линеаризованная плазмида, с навешанными Т-нуклеотидами на
3'-концы).
13
Состав смеси:
элюированный фрагмент – ДНК 5-500 нг;
5х лигазный буфер* – 2 мкл;
вектор – 5-500 нг;
T4-ДНК-лигаза – 5 ед. (единиц активности);
Н2О до 10 мкл.
Идеальным соотношением вектора и клонируемого фрагмента
считается 1:3. Концентрация клонируемого фрагмента, должна быть
примерно 0,5 пмоль на 10 мкл смеси. Если размер фрагмента ДНК составляет 500 н.п., то 0,5 пмоль этой ДНК соответствуют 100 нг.
Смесь выдержать 1 ч при NT или ночь при +4°С.
Хранить при -20°С несколько дней.
РАЗДЕЛ ЧЕТВЁРТЫЙ.
Работа с бактериями
4.1. Посев и культивирование бактерий E. coli
Посев и культивирование бактерий E. сoli можно осуществлять
в жидких и агаризованных средах.
Приготовить чашки Петри со средой LA и ампициллином:
1. расплавить среду LA на водяной бане или в микроволновой
печи;
2. остудить среду LA до 65°С;
3. внести по 20-25 мл среды LA в чашки Петри 90 мм;
4. добавить ампициллин конечной концентрацией 200-400 мкг/
мл, тщательно размешать;
5. дать затвердеть среде, выдержав чашки в стерильном боксе
под УФ 30-60 мин.
6. Чашки Петри со средой, замотанные парафильмом, хранить
при +4°С.
Пересев бактерий на чашки Петри с агаризованной средой осуществляется прокаленной, остуженной петлей (при пересеве с чаш*
14
Лигазный буфер поставляется производителем в комплекте с лигазой.
ки Петри) или простерилизованным стеклянным шпателем (при
пересеве из жидкой культуры). При пересеве из жидкой культуры
материал в объеме 10-50 мкл переносят на чашку стерильной пипеткой. Шпатель окунают в этанол и поджигают, для каждого посева
промывка этанолом осуществляется 2-3 раза. Шпатель остужается
об агаризованную среду на чашке. Затем посевная культура втирается шпателем досуха в агаризованную среду.
Посев бактерий в пробирки с жидкой средой по 5-10 мл осуществляется в ламинарном шкафу прокаленной, остуженной петлей (при пересеве с чашки Петри) или стерильной пипеткой (при
пересеве из жидкой культуры). Культивирование на шейкере-инкубаторе проводить при 200 об./мин при 37°С.
4.2. Трансформация E .coli плазмидной ДНК
При клонировании в векторы, позволяющие проводить сине-белую селекцию, следует использовать для трансформации штаммы
типа E .coli TG1.
Метод кальциевой трансформации:
1. рост культуры бактериальных клеток E. coli до OD=0,2;
2. центрифугирование (ЦФ) 1 мин и удаление надосадка*;
3. добавление 1 мл 0,1 М CaCl2;
4. ЦФ и удаление надосадка;
5. добавление 0,1 мл 0,1 М CaCl2 и 5 мкл лигазной смеси;
6. 1 ч на льду;
7. 2' 42°С;
8. добавление 1 мл LB среды;
9. 30' 37°С.
Смесь высеять на чашку с ампициллином (200 мкг/мл).
При клонировании в вектор, позволяющий проводить синебелую селекцию колоний, добавить в чашки 1 мМ IPTG, 20 мкг/мл
X-Gal.
*
При трансформации центрифугирования проводятся при 10 000 об./мин.
15
РАЗДЕЛ ПЯТЫЙ.
Анализ полученных конструкций
5.1. Анализ клонов по фенотипу
Наличие плазмиды в клетках E. coli определяется ростом на среде с добавлением антибиотика (ампициллин).
Наличие вставки целевого фрагмента в векторе, позволяющем
проводить сине-белую селекцию колоний (например, вектора серии
pUC), определяется по цвету колоний: синие – нет вставки, белые –
есть вставка.
5.2. Анализ клонов методом ПЦР
Чтобы определить наличие вставки при А/Т-клонировании ПЦРфрагментов, следует поставить ПЦР с внешними универсальными
праймерами (uniDir и uniRev), ожигающимися на векторе (рис. 2).
Для определения ориентации вставки (гена) по отношению к промотору следует использовать один внешний праймер и один внутренний, из тех, по которым, амплифицировался клонируемый фрагмент.
При использовании внешнего праймера uniDir и внутреннего
праймера Dirin клонируемый ген будет расположен под Plac промотором (в случае векторов серии pUC, в т.ч. pTZ57R).
Рис. 2. Схема расположения внутренних (Dirin и Revin) и внешних (uniDir
и uniRev) праймеров на Т-векторе. Plac – промотор лактозного оперона
16
5.3. Выделение плазмидной ДНК
1. Растить культуру бактериальных клеток в LB в течение ночи
при 37°С, 200-300 об./мин;
2. 1,5 мл ночной культуры поместить в 1.7 мл пробирку, ЦФ 30'',
удалить супернатант;
3. повторить п.2. ещё 2 раза;
4. ЦФ* 10'' дополнительно, убрать остатки среды;
5. ресуспендировать осадок в 200 мкл I-го плазмидного раствора, встряхнуть на вортексе 5'';
6. добавить 400 мкл II-го плазмидного раствора, перевернуть
пробирку 5-10 раз;
7. выдержать при 0°С, не более 5';
8. добавить 300 мкл холодного 7,5М AcONH4, ~ 5 раз перевернуть;
9. 0°С, 5';
10. ЦФ NT, 5';
11. супернатант, содержащий плазмидную ДНК, перенести в
чистую пробирку;
12. добавить 0,6 V изопропанола (500 мкл), смешать;
13. NT, 10';
14. ЦФ NT, 10', удалить супер;
15. ЦФ NT, 15'', сбросить остатки изопропанола (не подсушивать);
Если ДНК нужна только при контроле методом гельэлектрофореза или трансформации, то можно переходить к п. 21. При необходимости получить более чистый препарат (например для клонирования генов) перейти к п.16.
16. + 100 мкл 2М AcONH4, вортекс 20'';
17. NT, 5;
18. ЦФ NT, 5', перенести супер в пробирку со 300 мкл этанола;
19. NT, 10';
20. ЦФ NT, 10';
21. промыть осадок 70% этанолом (~ 200мкл), подсушить;
22. растворить в 50 мкл (H20 или TE).
* При выделении плазмидной ДНК центрифугирование проводится при 10 000 об./мин.
17
5.4. Проверка конструкций методом рестрикцонного анализа
Количество выделенной плазмидной ДНК проверить с помощью
агарозного гель электрофореза. Имейте в виду, что линейный размер плазмидной ДНК не совпадает с весовыми маркерами, так как в
суперскрученной форме кольцевая ДНК имеет более высокую подвижность в агарозном геле. Стандартная картина дорожки с плазмидной ДНК будет содержать три полосы: суперскрученную ДНК,
релаксированную ДНК, с которой совпадает димер суперскрученной ДНК, и третью полосу – релаксированный димер. В некоторых
случаях могут наблюдаться тетрамеры и т.д.
Методом рестрикционного анализа можно оценить наличие и
размер вставки, а также ориентацию вставки, если известны сайты
рестрикции внутри клонированного фрагмента.
Провести рестрикцию плазмидной ДНК в смеси объёмом
10 мкл:
эндонуклеаза рестрикции – 1-10 ед.;
ДНК – до 1 мкг*;
10х рестрикционный буфер – 1 мкл;
Н2О – до 10 мкл;
Инкубировать 1 час при 37°С**;
Нанести на гель рестрикцированные образцы, контрольные образцы (не рестрикцированные), весовой маркер.
Оценить результаты рестрикции методом агарозного гель-электрофореза.
* Обратите внимание, что на трансиллюминаторе в геле, прокрашенном EtBr,
пороговая чувствительность для человеческого глаза составляет 5-10 нг ДНК. Т.е.
надо рассчитать, чтобы в полосе с наименьшим фрагментом, который Вы вознамерились увидеть, было хотя бы 10-20 нг.
** В зависимости от используемой эндонуклеазы рестрикции состав рестрикционного буфера и температура инкубации может изменяться.
18
Список задач практических занятий
На практических занятиях семестровых курсов «Молекулярная биология» и «Генетическая инженерия» решаются следующие
задачи:
1
Ознакомление с оборудованием, применяющимся в генно-инженерных работах. Калибровка измерительных приборов.
Приготовление растворов для выделения ДНК и проведения агароз2 ного гель-электрофореза.
Приготовление микробиологических сред для Escherichia coli.
Подбор праймеров для ПЦР-клонирования.
3 Постановка ПЦР.
Контроль результатов ПЦР методом агарозного гель-электрофореза.
Элюция фрагмента ДНК из геля.
4 Контроль результатов элюции методом агарозного гель-электрофореза. Лигирование.
5
Основы работы с бактериями на примере E. coli.
Трансформация E. coli.
Анализ клонов по фенотипу и методом ПЦР.
6 Выделение плазмидной ДНК.
Проверка конструкций методом рестрикционного анализа.
19
Список сокращений и обозначений
ВМЕ - 2-меркаптоэтанол
ДНК - дезоксирибонуклеиновя кислот
РНК - рибонуклеиновая кислота
dNTP - смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
ед. - активная единица
конц. - концентрированный
об. - обороты
табл. - таблица
н.п. - нуклеотидные пары
УФ - ультрафиолет
ЦФ - центрифугирование
СВЧ-печь - микроволновая печь
NT - комнатная температура, на столе (англ. normal temperature)
OD - оптическая плотность (англ. optical density)
V - объем (англ. volume)
LB - микробиологическая среда (Luria-Bertani)
LA - агаризованная микробиологическая среда LB
SDS - додецилсульфат (англ. sodium dodecyl sulfate,) или лаурилсульфат натрия
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
TE - буфер, содержащий Трис и ЭДТА
TAE - трис-ацетатный буфер, содержащий трис, ускусную кислоту и ЭДТА (англ. Tris-acetate-EDTA)
ИПТГ - изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид
Трис – 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол (трис(гидроксиметил)аминометана)
А – аденин
Т - тимин
EtBr – 3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид (бромистый этидий)
X-gal – 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
20
Список литературы
Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Издательство: Мир. 1984
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition).
Sambrook J., Russell D.W. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2000.
Гены. Льюин Б. 2011 Стр. 896 Издательство: БИНОМ. Лаборатория знаний
Генетика с основами селекции. Инге-Вечтомов С.Г.
Издательство Н-Л Санкт-Петербург 2010 г. 719 стр.
Генетическая инженерия. Щелкунов С.Н.
Сибирское университетское издательство, 2008 г. 514 стр.
Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка.
Спирин А.С. Москва «Высшая школа», 1986.
Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот
В.И. Агол, А.А. Богданов, В.А. Гвоздев, А.И. Грагеров, А.М. Колчинский,
А.Д. Мирзабеков, В.Г. Никифоров. Москва «Высшая школа», 1990.
Молекулярная биология. Структура и функции белков: Учебник
Степанов В.М. Издательство: МГУ, 2005.
Молекулярная биология клетки. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М.,
Роберте К., Уотсон Дж. Издательство: Мир. 1994
21
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение ...................................................................................................................... 3
Раздел первый. Подготовка оборудования и реактивов к работе ................ 4
1.1. Ознакомление с оборудованием. Калибровка измерительных
приборов ............................................................................................................... 4
1.2. Приготовление рабочих растворов и сред ............................................ 5
Раздел второй. Разработка схемы клонирования ............................................. 9
2.1. Схема клонирования .................................................................................. 9
2.2. Дизайн праймеров для ПЦР ..................................................................... 9
Раздел третий. Манипуляции с ДНК in vitro....................................................10
3.1. Постановка ПЦР ........................................................................................10
3.2. Контроль результатов ПЦР методом электрофореза
в агарозном геле ................................................................................................11
3.3. Элюция фрагмента ДНК из геля ............................................................11
3.4. Контроль результатов элюции методом электрофореза
в агарозном геле ................................................................................................13
3.5. Лигирование ...............................................................................................13
Раздел четвёртый. Работа с бактериями............................................................14
4.1. Посев и культивирование бактерий E.coli...........................................14
4.2. Трансформация E.coli плазмидной ДНК .............................................15
Раздел пятый. Анализ полученных конструкций ...........................................16
5.1. Анализ клонов по фенотипу ...................................................................16
5.2. Анализ клонов методом ПЦР .................................................................16
5.3. Выделение плазмидной ДНК ..................................................................17
5.4. Проверка конструкций методом рестрикционного анализа..........18
Список задач практических занятий .................................................................19
Список сокращений и обозначений ...................................................................20
Список литературы ................................................................................................21
22
23
24