Базидиальные грибы для технологий биоремедиации почв
advertisement
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н. БАХА РАН Лаборатория Молекулярных основ биотрансформаций Базидиальные грибы для технологий биоремедиации почв Работа подготовлена при финансовой поддержке Соглашения #8111 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы Техногенное загрязнение биосферы Транспортировка Добыча Транспортировка Переработка Источники загрязняющих веществ продукты хозяйственной деятельности человека (промышленность, сельское хозяйство, транспорт) •ПАУ •Диоксины средства фармацевтики вещества бытовой химии (моющие средства, вещества для борьбы с паразитами, парфюмерия) •Радионуклиды •Пентахлорфенол •Тяжелые металлы •Галогенированные углеводороды •Креозот • ДДТ •Бифенилы •Фенолы •Гетероциклические соединения Преимущества биологической рекультивации • • • • Биологические агенты наиболее устойчивы к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды, связанных с географическими особенностями регионов использования Возможность использовать аборигенную микрофлору Биологическая очистка возможна в естественных условиях и в искусственных сооружениях Биологические подходы более дешевые и безопасные по сравнению с механическими и физико-химическими методами [Gomez M.J. at all, 2007] • • • Микроорганизмы обладают широкими способностями для трансформации ксенобиотиков, в частности один штамм может использоваться против большого числа поллютантов Биологическая очистка подразумевает практически полное разложение органических веществ Возможность сразу использовать земли в сельхоз работах после очистки Проблемы биологической рекультивации •Поддержание оптимальной температуры •Необходимость аэрации •Большая продолжительность •Необходимость проведения предварительного поиска эффективных биологических агентов • Проблемы колонизации Организмы, используемые при биорекультивации Биологические агенты Бактерии Грибы Грамотрицательные: •Pseudomonas •Sphingomonas •Burkholderia •Alcaligenes •Acinetobacter •Flavobacterium Грамположительные: •Arthrobacter •Nocardia •Rhodococcus •Bacillus Базидиомицеты: •Phanerochaete •Trametes •Phlebia •Antrodia •Schizophyllum Аскомицеты: •Penicillium •Aspergillus •Trichoderma •Fusarium Растения Покрытосеменные: •Populus populus •Festuca rubra Базидиальные грибы Базидиомицеты — высшие грибы с многоклеточным мицелием. К ним относятся около 30 тыс. видов (микроскопические грибы и грибы с крупными плодовыми телами), многочисленные почвенные сапрофиты — хорошо всем известные шляпочные грибы (например, шампиньоны, навозники). К базидиомицетам относятся и микоризообразующие шляпочные грибы, которые успешно развиваются только в тесном контакте с корнями древесных растений Основная функция в экосистемах: разложение органических веществ Преимущество использования базидиомицетов •Грибы продуцируют широкий спектр внеклеточных ферментов •Широкая субстратная специфичность внеклеточных ферментов оксидоредуктазного профиля •Возможность увеличения круга деградируемых субстратов с помощью редокс-медиаторов •Устойчивость грибов к стрессам, вызываемым основными группами экотоксикантов •Высокая эффективность разложения труднодеградируемых субстратов Лигнолитическая система: ферменты • Лигнинпероксидаза (ЛП) • Mn-пероксидаза (MnП) • Лакказа • Phanerochaete chrysosporium • Phlebia radiata • Trametes (Coriolus) versicolor • Mn-пероксидаза • Лакказа • Panus tigrinus • Dichomitus squalenes • Rigidoporus lignosus • Лигнинпероксидаза • Лакказа • Phlebia ochraceofulva • Polyporus pinsitus • Pleurotus florida • Лигнинпероксидаза • Bjerkandera adusta Лигнолитические ферменты: функции в биосфере • • • • • • Деградация лигнина Генерирование перекиси водорода Формирование пигментов Участие в патогенезе Синтез гуминоподобных веществ Детоксификация Пример 1: биодеградация нафталина действие оксигеназных ферментов Т.А. Егорова Основы биотехнологии: уч. Пособие 4-е изд., - М.: Издательский центр «Академия», 2008. – 208с. Пример 2: Полимеризация галогенфенолов Действие внеклеточных пероксидаз OH Cl Cl Cl Cl Cl Cl OH Cl Cl Cl Cl Cl OH HO O HO A) Cl OH OH Cl Cl Cl Cl B) Cl Cl OCH3 Cl OCH3 OCH3 OCH3 O Cl C) OCH3 OH Cl Cl Cl Cl D) Cl Cl OH Cl Cl Cl Cl E) O Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl O OCH3 Cl Cl O OCH3 Cl O Cl O Cl OCH3 OCH3 OCH3 Cl Cl Cl Cl A-C – реакции протекают под действием Лигнинпероксидазы D – реакция протекает под действием Пероксидазы хрена E – реакция протекает под действием Mn-пероксидазы OCH3 Cl James A. Field. Biodegradation of chlorinated compounds by white rot fungi. Dehalogenation: Microbial Processes and Environmental Applications, pages 159-204 Edited by M.M. Häggblom and I.D. Bossert, Kluwer Academic Publishers, 2003 Пример 3: Деградация 4,4-дихлорбифенила Грибом белой гнили Phanerochaete chrysosporium OH Cl Cl Cl OCH3 Cl Cl Cl OCH3 OH Cl Cl Cl Cl OH COOCH2 COOH CHO CH2OH Cl Cl Cl Cl Ichiro Kamei . Riichiro Kogura . Ryuichiro Kondo Metabolism of 4,4′-dichlorobiphenyl by white-rot fungi Phanerochaete chrysosporium and Phanerochaete sp. MZ142 Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 566–575 Пример 4: Деградация 2,4 Д Гриб белой гнили Dichomitus squalens HO CH2OOH O Cl 2,4дихлорфенокси уксусная к-а 2,4-дихлорфенол OH Cl Cl O OH O CH2OH Cl коньюгация с рибозой Cl Cl O Cl 2-хлорбинзохинон-1,4 CO2 O Reddy GVB, Joshi DK & Gold MH (1997) Degradation of chlorophenoxyacetic acids by the lignin-degrading fungus Dichomitus squalens. Microbiology-(UK) 143:2353-2360 Пример 5: Деградация фенантрена Грибом белой гнили Phanerochaete chrysosporium H OH O 1. H 2. OH 3. 4. 2 1 OH 3 O OH COOH COOH O 5. 6. 4 5 6 Фенантрен Образование эпосида Действие фермента эпоксидгидролазы частичное восстановление кольца Б Окисление кольца Б с образованием одифинольной структуры, являющейся типичным сайтом атаки лакказ Окисление о-дифинол лакказами до офенантродихинона Раскрытие кольца Б с образованием 2,2карбоксибифенила S. B. Pointing Feasibility of bioremediation by white-rot fungi Appl Microbiol Biotechnol (2001) 57:20–33 Пример 6: Разложение синтетических полимеров Представители Полимеры Phanerochaete сhrysosporium Pleurotus sajor caju Polyporus versicolor Поливинилхлорид Pycnoporus cinnabarinus Поливиниловый спирт Phanerochaete сhrysosporium Trametes versicolor Нейлон Resinicium bicolor Резина Практического применения пока не имеет Очистка загрязненных почв с помощью базидиомицетов •Очистка почв, загрязненных ксенобиотиками: ПАУ – Полициклические ароматические углеводороды Антрацен Пирен Фенантрен Пат. 8801255 WO.№ US19860899000 Process for the degradation of coal tar constituents by white rot fungi 1988 ПХБ – полихлорбифенилы Нитроароматические соединения Пат. 6107079 US. № Kulkarni K., Chaudhari A. US19970939464 Microbial remediation of Degradation of nitro-aromatic compounds: polychlorinated biphenyl an overview. // J. Environ mixtures in soil using Manage, 2007,V.85, Phanerochaete P.496–512 chrysosporium in nutrient rich, non-ligninolytic conditions 2000 Очистка загрязненных почв с помощью базидиомицетов •Очистка почв, загрязненных нефтяными углеводородами Пат. 6268206 US; № US19990417571 Bioremediation, detoxication and plant-growth enhancing compositions and methods of making and using such compositions 2001 •Очистка почв, загрязненных тяжелыми металлами Pl Cu Hg Zn Co Sn Cd Baldrian P. Interactions of heavy metals with white-rot fungi. // Enzyme and Microbial Technology – 2003 – V.32 – P.78–91 Проблемы использования базидиомицетов Проблемы Возможные пути решения Относительно высокая стоимость некоторых ферментов (например, лакказа) Разработка новых способов получения ферментов Неудовлетворительная колонизация нестерильной почвы Предварительная обработка субстрата Использование эндогенных штаммов Инокуляция загрязненной почвы с использованием носителя Предварительная обработка субстрата Деградация ксенобиотиков в ряде случаев только до промежуточных метаболитов Тщательный подбор штаммов Угнетение роста грибов некоторыми тяжелыми металлами Использование устойчивых видов Инокуляция загрязненной почвы с использованием носителя Использование непосредственно ферментов Низкая биодоступность ксенобиотиков в почве Внесение неионных ПАВ Ограниченное число видов, разлагающих определенные ксенобиотики (например, ПХБ) Поиск новых штаммов путем выделения из загрязненных субстратов Скрининг Этапы скрининга Возможные пути решения I Выделение штамма в чистую культуру II Идентификация штамма: изучение культуральноморфологических характеристик для определения их таксономической принадлежности с последующей верификацией путем определения нуклеотидной последовательности ITS регионов III Оценка лигнолитической активности ферментов IV Plait test: обесцвечивание полифенольных красителей: азур А-Б, Poly R V Spot test: обесцвечивание полифенольных красителей: азур А-Б Этап I: поиск и выделение штамма в чистую культуру Поиск штамма Посев на селективные среды Экспедиции Культивирование Этап II: идентификация штамма Изучение морфологии Определение нуклеотидных последовательностей Световая микроскопия Генетические методы анализа Этап III: оценка лигнолитической активности ферментов Культивирование на различных средах Оценка ферментативных активностей • пероксидаза • Mn-пероксидаза • лакказа • лигнин-пероксидаза • арил-алкогольоксидаза • целобиоздегидрогеназа • галактозокзидаза Этап III: оценка лигнолитической активности ферментов Анализ продукции лакказы методом тестирования на чашках Субстрат – АБТС (2,2’азинобис-(3- этилтиазолин6-сульфона ) Высокоактивные продуценты лакказ образуют в этих условиях зеленый ореол вокруг колоний. Этап IV: тест на чашках Петри с Азуром Б Сусло агар T. maxima LE-BIN 0275 T. gibbosa LE-BIN1911 Глюкоза - пептон Глюкоза – пептон +Cu2+ Этап V: обесцвечивание полифенольных красителей Оценка окислительно-востановительного потенциала лигналитического комплекса грибов Контроль Гриб 1 Гриб 2 Гриб 3 Гриб 4 По изменению окраски, производят оценку лигналитического потенциала Основные выводы • Базидиальные грибы – перспективные биологические агенты для ремедиации загрязненных почв • Деградационный потенциал базидиальных грибов обусловлен, главным образом, продуцируемыми ими экстрацеллюлярными оксидазами • Актуальной задачей является поиск штаммов, обладающих высоким деградационным потенциалом Контрольные вопросы • Перечислите основные преимущества биологической рекультивации • Назовите основные проблемы биологической рекультивации • Какие организмы можно использовать в качестве биологических агентов для рекультивации? • Перечислите преимущества базидиальных грибов как биологических агентов • Назовите основные ферменты лигнолитического комплекса • Перечислите основные этапы скрининга штаммов, перспективных для использования в целях ремедиации • Как проводят идентификацию штаммов? • Какие вы знаете тесты для оценки лигнолитического потенциала? Спасибо за внимание!
