Инструкция (0.31Мб)

клетки
и
лизируют
эритроциты
добавлением
фиксирующего/лизирующего реагента. После отмывки от
остатков эритроцитов, клеточную ДНК метят пропидий
иодидом. Окрашивание клеточной ДНК помогает отделить
лейкоциты от дебриса и скопления бактерий при анализе.
4. Предостережения
Кат.№ ED7040
 Только для исследований
 В качестве антикоагулянта при заборе крови следует
использовать только гепарин. ЭДТА и цитрат Na
искажают результат.
 Образцы крови необходимо обработать в течение 8
часов с момента сбора.
 Необходимо ежедневно проверять работу проточного
цитофлуориметра с использованием специального
калибровочного материала (флуоресцентных частиц).
 Не используйте реагенты с истекшим сроком годности.
 Избегайте контаминации реагентов.
 Образцы крови являются потенциально инфицированным
материалом и с ними следует обращаться должным
образом.
 Избегайте контакта образца с кожей, глазами и
слизистыми
IngoFlowEx® Kit
(100 тестов)
1. Назначение
ENGLISH
Набор IngoFlowEx® Kit предназначен для количественной
оценки фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов
человека с использованием флуоресцентно меченых E.coli в
образцах гепаринизированной цельной крови методом
проточной цитофлуориметрии.
2.
Введение
Способность к фагоцитозу является характерной
особенностью
так
называемых
профессиональных
фагоцитов (нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов,
моноцитов и макрофагов). Процесс включает в себя
связывание инородных частиц, например бактерий, с
рецепторами клеточной поверхности и захвате частиц
фагоцитарной клеткой. Дифференциация связанного и
интернализованного материала достигается с помощью
трипанового синего красителя, который подавляет
флуоресценцию свободных и поверхностно-связанных
бактерий. Опсонизация бактерий, то есть покрытие их
белками плазмы, опсонинами (C3b, антитела), облегчает
связывание и захват. Бактерии, используемые в тесте, были
преопсонизированы АТ человеческой плазмы, таким
образом, наличие опсонинов в исследуемом образце крови
не оказывает решающего влияния на результаты.
4. Реагенты, поставляемые в наборе
 ED7040-1 E.coli-FITC (готово к использованию) – флакон
из темного стекла, содержит 1 мл суспензии
флуоресцентно меченых опсонизированых бактерий
E.coli, штамм К-12, содержимое флакона рассчитано на
100 исследований.
 ED7040-2 Гасящий раствор (готово к использованию) –
флакон, содержащий 20 мл буферного раствора
трипанового синего, темно-синяя жидкость, содержимое
флакона рассчитано на 200 исследований.
 ED7040-3
Лизирующий
раствор
(10-кратный
концентрированный раствор) - флакон, содержащий 60
мл
10-кратного
концентрированного
раствора
фиксирующего/лизирующего
агента,
прозрачная
жидкость, содержимое флакона рассчитано для
подготовки 600 мл рабочего раствора (1-кратного),
достаточного для 200 исследований.
 ED7040-4
Промывочный
буфер
(25-кратный
концентрированный раствор) - флакон, содержащий 80
мл
концентрированного
промывочного
буфера,
содержимое флакона рассчитано для подготовки 2 литров
рабочего раствора (1-кратного), достаточного для 222
исследований.
 ED7040-5
ДНК-красящий
реагент
(готово
к
использованию) - янтарный флакон, содержащий 60 мл
раствора пропидий иодида, розоватая жидкость,
содержимое флакона рассчитано на 200 исследований.
3. Принцип
Этот тест основан на измерении интенсивности
флуоресценции фагоцитов, поглотивших FITC-меченые
E.coli. Образец гепаринизированной крови смешивают с
флуоресцентно мечеными E.coli и смесь инкубируют при
37°С. Одновременно с каждой реакцией с E.coli проводится
контроль посредством материала без E.coli, который
используется для оценки границы дискриминации между
фагоцитирующими и не фагоцитирующими клетками.
Гасящий раствор добавляют в конце инкубационного
периода, чтобы подавить флуоресценцию свободных
бактерий. После промывки трипановым синим, фиксируют
1/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7040_RU_131210
6. Необходимые материалы











Кол-во
образцов
крови
Деионизированная вода (dH2O), из расчёта 0,6 л на
один набор;
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ), примерно 2 литра;
Пробирки 5 мл, 12 х 75 мм;
Штатив для пробирок;
Центрифуга;
Автоматические пипетки;
Вортекс;
Термостат или водяная баня (370С);
Контейнер со льдом (кубики льда или измельченный
лед) подходящий для штатива с пробирками;
Проточный цитофлуориметр, оснащенный синим
лазером с длиной волны 488 нм и детекторами
флуоресцентных сигналов с длинами волн 525 нм
(FITC-канал) и 617 нм (PE-канал);
Цилиндры и стеклянные флаконы для приготовления
промывочного буфера и лизирующего раствора.
10
100
1. Внесите по 50 мкл каждого исследуемого образца крови в
пробирки Е и С;
2. Поместите пробирки на лёд и охлаждайте на льду в
течение 10 минут;
3. Добавьте 10 мкл E.coli-FITC в пробирки, предназначенные
для реакции с E.coli (Е), перемешайте на вортексе и верните
пробирки на лёд;
4. Не добавляйте ничего в контрольные пробирки (С);
5. Перенесите все пробирки (в том числе контрольные) в
термостат (или водяную баню) на 37°C;
6. Инкубируйте в течение 30 минут (сократить время
инкубации до 10 минут при использовании водяной бани);
7. Поместите пробирки обратно на лед и дайте им остыть в
течение 1-2 минут;
8. Добавьте 100 мкл предварительно охлажденного гасящего
раствора во все пробирки и хорошо перемешайте;
9. Добавьте 3 мл предварительно охлажденного рабочего
раствора промывочного буфера и центрифугируйте пробирки
в течение 5 мин при 200×g при комнатной температуре;
10. Удалите супернатант аспирацией в контейнер с
соответствующим дезинфицирующим средством, оставив
около 50 мкл остаточного объема;
11. Повторите отмывку (шаги 9 и 10);
12 . Ресуспензируйте осадок в остаточном объеме рабочего
раствора промывочного буфера;
13. Добавьте 2 мл рабочего лизирующего раствора
(комнатной температуры) и инкубируйте 20 минут при
комнатной температуре в темноте;
14. Центрифугируйте в течение 5 мин при 200хg при
комнатной температуре;
Разведите 25-кратный концентрат промывочного буфера
раствором ФСБ до рабочей концентрации в чистой
стеклянной емкости. Охладите готовый раствор до 2-8°С.
Нанесите на тару с готовым раствором дату разведения.
Готовый рабочий раствор промывочного буфера можно
хранить при температуре 2-8°С до 4 недель. Для удобства,
используйте таблицу объемов:
192
1920
200
2000
40
400
Подготовьте по две пробирки для каждого тестируемого
образца крови:
- Пробирка для реакции с E.coli (E);
- Пробирка для контрольной реакции без E.coli (С)
Промывочный буфер
10
100
36
360
Охладите рабочий раствор промывочного буфера до 2-8°С.
Доведите рабочий лизирующий раствор до комнатной
температуры.
Поместите штатив для пробирок в контейнер со льдом.
Поместите флаконы с E.coli-FITC, гасящим раствором и ДНКкрасящим реагентом на лёд.
8.1 Подготовка реагентов перед исследованием
Конечный
объём (мл)
Конечный
объём (мл)
8.2 Процедура
8. Процедура исследования
Объём ФСБ
(мл)
Объём
Перед использованием тщательно перемешайте содержимое
флакона на вортексе.
Все компоненты набора IngoFlowEx® Kit необходимо хранить
в темном месте при 2-8 0С. Сроки годности реагентов
указаны на флаконах реагентов и коробке.
Объём
25-кратного
промывочного
буфера (мл)
8
80
dH2O (мл)
E.coli-FITC
7. Условия хранения
Кол-во
образцов
крови
Объём
10-кратного
лизирующего
раствора (мл)
4
40
Лизирующий раствор
Разведите 10-кратный концентрат лизирующего раствора
деионизированной водой до рабочей концентрации в чистой
стеклянной емкости. Нанесите на тару с готовым раствором
дату разведения. Готовый рабочий раствор лизирующего
раствора можно хранить при температуре 2-8°С до 4 недель.
Для удобства, используйте таблицу объемов:
2/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7040_RU_131210
15. Удалите супернатант аспирацией в контейнер с
соответствующим дезинфицирующим средством, оставив
около 50 мкл остаточного объема;
16. Отмойте клетки в 3 мл предварительно охлажденного
рабочего раствора промывочного буфера и центрифугируйте
в течение 5 мин при 200×g при комнатной температуре;
17. Удалите супернатант аспирацией в контейнер с
соответствующим дезинфицирующим средством, оставив
около 50 мкл остаточного объема;
18. Ресуспензируйте в 300 мкл ДНК-красящего реагента и
инкубируйте 10 минут на льду, в темноте;
19. Проведите измерение на проточном цитометре в
течение 2 часов после добавления ДНК-красящего
реагента.
10. Интерпретация результатов и ожидаемые значения
Существуют два основных параметра: 1) процент клеток,
поглотивших E.coli (фагоцитарная активность); 2) средний
показатель
интенсивности
флуоресценции
клеток,
фагоцитировавших E.coli, который соответствует числу
поглощенных бактерий в клетке (индекс фагоцитоза). В
следующей таблице приведены средние значения
фагоцитарной активности, рассчитанные по данным,
полученным при измерении образцов крови доноров.
% Фагоцитирующих клеток
(среднее +/- 2SD)
91 (83-100)
82 (72-94)
Субпопуляция клеток
Гранулоциты
Моноциты
11. Рабочие характеристики
9. Анализ на проточном цитометре
Воспроизводимость
определяли
путем
измерения
фагоцитарной активности в четырех параллельных реакциях
на образцах крови доноров. Вариабельность выражена в
виде среднего коэффициента вариации данных измерений.
Настройка цитометра перед первым сбором
(Опционально)
Цветовую компенсацию можно настроить с помощью
процедуры анализа образца крови только с флуоресцентной
E.coli (без внесения гасящего раствора и окрашивания ДНК),
образца крови только с гасящим раствором (без внесения
E.coli и окрашивания ДНК) и образца крови с ДНК-красящим
реагентом (без снесения E.coli и гасящего раствора).
Используйте вышеуказанные измерения для настройки
цитометра.
% фагоцитирующих
гранулоцитов
% фагоцитирующих
моноцитов
Анализ образцов
Установите гейт по каналу PE и соберите достаточное
количество (10 000) PE-ярких событий. Данный гейт
исключает дебрис и скопления бактерий из дальнейшего
анализа (рис.1). Визуализируйте собранные события на
точечном графике «боковое светорассеяние (SSC) против
прямого светорассеяния (FSC)» и выделите регионы по
популяциям гранулоцитов и моноцитов (рис.2). Отобразите
выбранные популяции на гистограммах флуоресценции
FITC. Используйте контрольные пробирки (С) для
определения границ позитивности. Установленные границы
позитивности, как правило, применимы для всех собираемых
образцов. Определите процент позитивных событий
(фагоцитарная активность) (рис. 3А и 3В) и среднюю
интенсивность флуоресценции позитивных событий
(фагоцитарный индекс).
12.
Диапазон значений
фагоцитарной
активности
испытуемых образцов
(MIN-MAX)
Средний CV (%)
83,2-97,1
1,8
73,2-91,0
4,8
Ограничения метода
 Воспроизводимость анализа сильно зависит от точности
пробоподготовки (время инкубации, температурный
режим, пипетирование).
 Проточный цитометр может давать ложные результаты,
если устройство не было откалибровано и не
обслуживается должным образом.
http://www.exbio.cz//diagnostics
3/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7040_RU_131210
13. Пример данных
Рис.1 Гейт по ядросодержащим клеткам, для исключения
дебриса и скоплений бактерий из дальнейшего анализа.
Рис.2 Гейтирование Гранулоцитов и моноцитов.
Рис.3А Гистограмма наложений гранулоцитарной
субпопуляции
Рис.3В Гистограмма наложений моноцитарной
субпопуляции
4/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7040_RU_131210
14. Литература
M. O’Gorman. Clinical evaluation of Myeloid and Monocytic Cell
functions in Manual of Molecular and Clinical Laboratory
Immunology edited by B. Detrick, 7th edition, AMS Press 2006,
Page 272-280.
15. Расшифровка символов
Каталожный номер
Идентификатор производителя
Температурный режим хранения
Код партии
Срок годности
16. Производитель
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: orders@exbio.cz
http://www.exbio.cz
5/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7040_RU_131210