Серологические реакции в вирусологии

Серологические
реакции в
вирусологии
Методы
иммуноанализа
1
• Все серологические реакции
различаются только по способу
выявления образовавшегося
комплекса
[Аг + Ат]
2
Индикация комплекса [Аг + Ат]
•
•
•
•
•
В РДП – это полоса преципитации
В РТГА – это «пуговка»
В РНГА – это «зонтик»
В РСК – это гемолиз эритроцитов
В РН – это отсутствие изменений в
живой системе
• В РИФ – свечение
• В ИФА – изменение окраски
субстратной смеси
• И т.д.
3
• В РИФ и ИФА для выявления
образовавшихся иммунных
комплексов [антиген-антитело]
используется метка, с которой
предварительно связывается
узнающий компонент (антиген или
антитело).
4
Антигены
• Слово антиген — представляет собой
сокращение английского словосочетания
antibody generation, что в переводе
означает «выработка антител».
• Антигены — это вещества, которые
стимулируют иммунную систему
организма к синтезу против них антител.
• К антигенам относятся в первую очередь
органические полимеры (белки, пептиды,
полисахариды), а также ряд других
веществ.
5
В иммуноферментных
тест-системах используются
антигены различной природы:
• — натуральные вещества;
• — рекомбинантные белки;
• — синтетические пептиды.
6
Антитела
• Антитела — иммуноглобулины —
содержатся в глобулиновой фракции
крови. Антитела циркулируют в
кровяном русле и секретируются
клетками слизистых оболочек. Они
представляют собой довольно
крупные белки с молекулярной
массой от 150 до 190 кДа.
• Обозначаются иммуноглобулины
сочетанием двух латинских букв
7
«Ig».
8
9
• Антитела, как и многие другие белки
организма, обладают
видоспецифичностью, то есть
пептидная последовательность
молекулы иммуноглобулинов,
например, IgG одного вида животных
отличается от таковой другого вида.
• Видоспецифичность антител обусловливает тот факт, что и сами антитела могут
служить антигенами. Это происходит
при искусственном введении их в
10
организм другого вида.
• Необходимо отметить, что против
иммуноглобулинов разных классов
образуются антитела разной
специфичности.
• Например, антитела против IgG
человека не распознают IgM, и
наоборот.
11
моноклональные антитела
• Искусственное слияние опухолевой
клетки (В-лимфоцита) и одной
специально отобранной
антителопродуцирующей клетки
иммунизированного животного
(мыши) позволило получить так
называемую гибридому, которая
обладает беспредельной потенцией
к делению и способностью
продуцировать антитела строго
определенной специфичности.
12
моноклональные антитела
• Получаемые по данной технологии
молекулы иммуноглобулинов
идентичны друг другу как по
строению, так и по специфичности и
носят название моноклональные
антитела.
• Такая одинаковость обусловлена
тем, что антитела вырабатываются
клетками, у которых один общий
13
предшественник.
моноклональные антитела имеют
следующие основные преимущества
перед поликлональными
• полная стандартизация препарата
антител;
• высокая специфичность;
• свободный выбор антигенных
детерминант, к которым
образуются антитела.
14
В диагностических тестсистемах в качестве
узнающих и ловушечных
применяются
антитела класса IgG.
15
Реакция антиген-антитело
• В результате реакции
взаимодействия антигена с
антителом происходит
формирование иммунохимического
комплекса. Необходимым условием
успешного проведения анализа
является полнота связывания
реагентов.
16
Реакция антиген-антитело
• Характеристика антител,
определяющая прочность связывания
Fab -фрагмента антитела с антигенной
детерминантой, получила название
аффинности.
17
Реакция антиген-антитело
• Поскольку антитела и антигены чаще
всего поливалентны, то есть одно
антитело может связываться с
несколькими антигенами и наоборот,
то для суммарной характеристики
степени их связывания используют
термин авидность.
18
Основные принципы методов
иммуноанализа
• Реакция взаимодействия антигена с
антителом как основа присутствует во всех
методах иммуноанализа.
• Однако, в зависимости от того, какой из
этих реагентов является определяемым
веществом, а другой — узнающим, от
соотношения их количества, а также от
характера взаимодействия стандартного и
определяемого агентов,
иммуноаналитические методы различаются
по принципу связывания.
19
Как проводится
исследование методом ИФА
• В основе иммуноферментного анализа
лежит иммунная реакция антигена с
антителом,а присоединение к
антителам ферментной метки
позволяет учитывать результат реакции
антиген-антитело по появлению
ферментативной активности или по
изменению ее уровня. В упрощенном
виде механизм реакции можно
представить следующим образом:
20
Конкурентный и ингибиторный ИФА
21
Сендвич-метод
22
23
Виды меток, используемых в
иммуноанализе
• 1) нерастворимые частицы (например, эритроциты,
латексные гранулы, частицы графита);
• 2) соли металлов и красителей (например, золото,
Luminous Red G);
• 3) радионуклиды (например, 125I, тритий — 3Н);
• 4) вещества, рассеивающие электроны;
• 5) бактериофаги;
• 6) флуоресцентные красители;
• 7) хемилюминесцентные и биолюминесцентные
вещества;
• 8) липосомы;
• 9) простетические группы;
• 11) субстраты ферментов;
• 12) модуляторы ферментов;
24
• 13) ферменты.
25
Прямой твердофазный ИФА
26
27
Непрямой «сендвич»-ИФА
28
Твердофазный ИФА (сендвичвариант)
29
30
31
32
• С внесением на твердую фазу
хромоген-субстратного раствора
начинается ферментативная
реакция, результаты которой
определенным образом
регистрируются.
33
• Таким образом, в
иммуноферментном анализе кроме
антигенов и антител используются
следующие компоненты: твердая
фаза, ферментная метка и субстрат.
34
35
Иммунный комплекс, связанный
стекловолоконной матрицей
36
• Схема хода
типичной
реакции
ИФАМ
37
Иммунокомб
38
39
Ферменты и субстраты в ИФА
Конъюгирующи
й реагент
Конъюгирующи
й реагент
Конъюгирующий
реагент
Конъюгирующий
реагент
Пероксидаза
хрена
Хрен (Armoracia
rusticana)
О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД,
492 нм)
Глутаральдегид
Мета-периодат
натрия
N-сукцинимидил3
(2пиридилдитио)
пропионат
5-аминосалициловая
кислота (450 нм),
диаминобензидин, одианизидин.
Dгалактозидаза
E. Coli
О-нитрофенил-β-Dгалактозид (420 нм)
Метамалеимидобензол-Nгидроксисукцинимид
ный эфир
β-Щелочная
фосфотаза
E. Coli,
слизистая
кишечника
теленка
Р-нитрофенилфосфат
(405 нм), 5-Бром-4хлоро-3-индолил
фосфат
Глутаральдегид
40
В зависимости от того, какие антигены
используются, все иммуноферментные
тест-системы для выявления антител
подразделяются на:
•
•
•
Лизатные — в которых используется смесь
нативных антигенов (лизированный или
обработанный ультразвуком возбудитель
инфекции, полученный в культуре);
Рекомбинантные — в которых используются
полученные генно-инженерным способом белкианалоги определенных белковых антигенов
возбудителя;
Пептидные — использующие химически
синтезированные фрагменты белков.
41