ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
М. Искандеров,
канд. вет. наук,
А. Фёдоров,
канд. биол. наук,
М. Альбертян,
д-р вет. наук,
ВИЭВ им. Я. Р. Коваленко
В системе противобруцеллезных мероприятий большое значение имеет диагностика. Только на основе
полноценных исследований возможно выявление и локализация очагов инфекции, определение ее распространения, оздоровление неблагополучных хозяйств, пополнение или формирование стад.
В настоящее время для этого используют
клинические, бактериологические, серологические и аллергические методы. Для выявления
ДНК бруцелл в биологическом материале применяют молекулярно-генетическую диагностику, а клиническая имеет только вспомогательное
значение. Массовые аборты у крупного и мелкого рогатого скота, хромота и бурситы у коров,
орхиты и эпидидимиты у баранов, воспаления и
абсцессы холки у лошадей и другие характерные
признаки дают основания лишь к подозрению
на бруцеллез, но могут быть вызваны и другими причинами. В частности, аборты у крупного
и мелкого рогатого скота нередко обусловлены
иерсиниозной, паратифозной или кампилобактериозной инфекциями, неправильным содержанием и кормлением животных и другими
факторами.
Бактериологической диагностике подлежит
патматериал от животных с клиническими признаками бруцеллезной инфекции. Результат исследования предполагает индикацию и идентификацию возбудителя, которые определяются
бактериоскопическим, бактериологическим и
биологическим методами.
При бактериоскопическом исследовании бруцеллы обнаруживают в желудке и других органах абортированного плода, некротических
участках плацент, вагинальных истечениях и
содержимом абсцессов, вымени, бурситов и др.
Мазки окрашиваются по Граму, Стампу, Козлов-
28
скому или Шуляку-Шину. Этот метод особенно
ценен при исследовании абортированного плода
или плаценты, когда требуется быстрее поставить диагноз, а также при поступлении обеззараженного или разложившегося материала.
Выделение культуры бруцелл – самый объективный метод для подтверждения бруцеллеза и
в ряде случаев единственный способ определения этиологии патологического процесса. Неоспоримое доказательство бруцеллеза – выделение бруцелл из патматериала, но их отсутствие
в бактериологических посевах еще не означает
отсутствия самого заболевания.
Биологический метод (биопроба) необходим
в тех случаях, когда материал загрязнен посторонней микрофлорой или концентрация возбудителя незначительна. Результат считается положительным, если зараженные лабораторные
животные начинают реагировать на бруцеллез
серологически с титром антител 1:10 и выше.
Для получения культуры возбудителя дополнительно проводят бактериологическое исследование.
Для серологического анализа применяют
реакции агглютинации в пробирках (РА), связывания комплемента (РСК) или длительного
связывания комплемента (РДСК), реакцию иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном
(РИД), пластинчатую реакцию агглютинации с
розбенгал антигеном – розбенгал пробу (РБП),
кольцевую реакцию с молоком (КР) и др.
ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ • 04 • 2011
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
РА, предложенная Райтом и Симплом в
1897 г., до настоящего времени считается одним
из основных диагностических методов. Ведь агглютинины, как правило, появляются в крови в
ранние сроки после заражения. Уровень антител, выявляемых в РА, подвержен значительным
колебаниям в зависимости от стадии инфекционного процесса.
РСК – достоверный, но более трудоемкий
метод серологической диагностики бруцеллеза – позволяет обнаруживать как ранние, так и
хронические формы заболевания. Комплементсвязывающие антитела появляются в сыворотке
крови животных позже, чем агглютинины, но
сохраняются дольше.
РДСК – модификация РСК – проводится в
условиях пониженной температуры (4–10 °С)
и в некоторых случаях более чувствительна и
специфична. В свежих очагах бруцеллеза крупного рогатого скота сыворотка крови может не
реагировать в РА и РСК, а в РДСК даст положительный результат.
При усовершенствовании РА в пробирках
была предложена, как казалось вначале, более
специфичная, чувствительная, экономичная по
времени постановки и средствам пластинчатая
РА на стекле. Однако при исследовании длительно хранившихся проб сыворотки крови в
пластинчатой РА появлялись неспецифические
реакции.
Одна из модификаций пластинчатой РА – реакция агглютинации с антигеном, окрашенным
бенгальским розовым и суспендированным в
забуференном физиологическом растворе с рН
3,65. Неспецифические агглютинины при низкой величине рН теряют активность, а специфические полностью сохраняют ее.
Пластинчатая реакция агглютинации с плазмой крови и окрашенным антигеном разработана в США. Ее модификация с сывороткой крови,
розбенгал пластинчатый тест или РБП предложена английскими исследователями. В настоящее время она нашла широкое применение при
диагностике бруцеллеза как специфическая, быстрая и простая реакция, по чувствительности
не уступающая и даже несколько превосходящая РА, РСК и РДСК. Однако результаты РБП
позволяют судить только о наличии специфических антител в сыворотке крови, исключая количественную оценку.
04 • 2011 • ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
КР – быстрый, легкий и довольно точный метод для определения бруцеллеза. По некоторым
данным, КР с молоком сравним с суммарными
результатами исследований в РА и РСК и даже
превосходит реакцию агглютинации, но ограничен применением только в дойных стадах.
Эффективно комплексное использование аллергического и серологических методов.
Аллергическая диагностика основана на выявлении специфических изменений реактивности организма к возбудителю. Этот метод с
использованием бруцеллина ВИЭВ широко применяли для исследования бруцеллеза крупного
рогатого скота (1969–1970 гг.), а сейчас – и свиней. Бруцеллин ВИЭВ изготавливается из штамма В. abortus В-1, находящегося в RS-форме, и
вызывает аллергическую реакцию у животных,
инфицированных как типичными, так и измененными формами бруцелл.
В ветеринарной практике для диагностики
бруцеллеза используют и реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (РИД). Этот метод с растворимым поли-В антигеном позволяет дифференцировать больных бруцеллезом от привитых
животных и инфицированных возбудителями,
имеющими антигенное родство с бруцеллами.
В. М. Чекишев с соавторами получили О-ПС
антиген для РИД с несколько иными свойствами. Производственное испытание с О-ПС антигеном ИЭВСиДВ показало, что реакция уступает по чувствительности классическим РА и
РСК, но дает возможность оценивать благополучие хозяйств, в которых животные многократно иммунизированы противобруцеллезными вакцинами.
Разработаны и с положительными результатами апробированы и другие реакции: Кумбса – для определения неполных антител (РК),
преципитации (РП), иммунофлюоресценции
(РИФ), непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА). И это далеко не
полный список методик.
В последнее время в ветеринарную практику
внедряют молекулярно-генетическую диагностику, определяющую ДНК бактерий в биологическом материале. Это высокочувствительные,
специфичные, достаточно простые и быстрые
для получения результата методы. Один из
них – ПЦР – все чаще применяется для исследования инфекционных болезней, выявляет ДНК
29
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
из патматериала, содержащего менее 100 клеток
бруцелл.
Использование метода ДНК. ДНК гибридизации показало, что бактерии рода Brucella – компактная, хорошо обособленная группа микроорганизмов. Уровень гомологии ДНК очень высокий, составляет 90–100 % независимо от степени диссоциации.
Ученые обсуждают и такое предложение:
на основе гомологии ДНК бруцелл объединить
все их виды в один – В. melitensis и рассматривать как биовары. Однако Г. Ф. Коромыслов и
С. К. Артюшин сообщают о различиях в профиле фрагментов ДНК при анализе рестрикционным методом (ПДРФ), основанным на применении эндонуклеаз.
Исследование ДНК бруцелл с помощью ПДРФ
выявляет межвидовые и даже межштаммовые
различия. Молекулярно-генетическая идентификация ДНК разных видов бруцелл в значительной степени разрешает проблему диагностики
бруцеллеза, в том числе и прижизненную.
Из серологических методов, не вошедших в
Наставление по диагностике бруцеллеза в нашей стране, следует отметить РНГА. Изучение
ее специфичности и чувствительности при бруцеллезе людей, крупного рогатого скота, овец и
лабораторных животных показало значительное
превосходство над РА, РСК, реакцией Хеддельсона и др. РНГА была предложена и для дифференциации реакций у больных бруцеллезом и
вакцинированных животных.
Одна из модификаций РНГА – реакция нейтрализации антител (РНАТ), которая применяется как ускоренный метод индикации возбудителей многих инфекционных заболеваний.
РНАТ основана на том, что вследствие образования комплекса антител с гомологичным антигеном сыворотка утрачивает способность агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные
этим антигеном. Диагностическое значение
РНАТ при различных инфекциях высоко оценено многими исследователями.
Широко известна высокая чувствительность
и специфичность иммуноферментного анализа
(ИФА). Стабильность реагентов (до двух лет),
простота метода регистрации результатов, возможность автоматизации и применения в стационарных и передвижных лабораториях обусловливает целесообразность использования
30
ИФА при диагностике инфекционных болезней.
С помощью ИФА можно выявлять отдельные
классы и субклассы противобруцеллезных антител (IgM, IgGi, IgG2). Сравнение титров IgM
и IgG позволяет разграничивать острую и хроническую формы болезни, а также дифференцировать бруцеллез от иерсиниоза, вызванного
Y. enterocolitica.
Многие методы диагностики бруцеллеза
(РИФ, РБП, ИФА, РНГА, РСКК и др.) предлагали как универсальные, позволяющие обходиться только одной реакцией, результаты которой
совпадают с суммарными данными РА, РСК и
РДСК. Однако на практике это не оправдалось,
потому что патогенез бруцеллеза характеризуется волнообразным течением, что отражает и
старое название болезни – ундулирующая лихорадка. После внедрения возбудителя заболевание чаще развивается в острой форме, потом
сменяется хронической и латентной с временными обострениями. Значимость серологических и
аллергических методов неоднозначна в разные
периоды. В острый, сразу после заражения, в
сыворотке крови появляются агглютинирующие антитела преимущественно IgM-класса,
которые сменяются комплементсвязывающими,
в основном IgG-класса, выявляемыми в РСК и
РДСК. Одновременно у больных животных развивается сенсибилизация к гомологичному антигену, что показывает аллергическая реакция
на бруцеллин.
РСК и аллергическая реакция на бруцеллин
более стабильны и сохраняются дольше РА, которая в поздние сроки заболевания периодически появляется и исчезает, особенно при обострении латентной формы бруцеллеза. Метод
его провокации введением антигенов, в том числе неагглютиногенных, способствует более полному выявлению больных животных. По этой
причине все предложенные методы диагностики применяются в комплексе. В связи с неодинаковой чувствительностью и специфичностью,
а также стадией инфекционного процесса каждый конкретный метод в отдельности выявляет
разное количество положительно реагирующих
животных.
Некоторые методики (РДСК, РИФ, ИФА,
РНГА, РНАТ и др.) позволяют обнаруживать не
только антитела в сыворотке крови, но и антигены бруцелл в патматериале, а также дифферен-
ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ • 04 • 2011
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
цировать реакции у больных и вакцинированных животных (РНГА, РИД).
Иммунологические реакции при бруцеллезе
(особенно серологические) показывают главным образом иммунологическую реактивность
организма и не отражают степени его невосприимчивости. Следовательно, все перечисленные методики не могут быть использованы для
изучения напряженности и длительности иммунитета, тем более что наметилась тенденция
разработки слабоагглютиногенных и неагглютиногенных вакцин.
Бруцеллез – одно из немногих заболеваний с таким богатым арсеналом диагностики.
Однако при выявлении больных животных и
оздоровлении неблагополучного стада сказы-
вается несовпадение интересов ветеринарных
и хозяйственных служб. Сдерживает энтузиазм
специалистов и само разнообразие методов, которые периодически то внедряются, то отменяются. Так, аллергический метод, применявшийся раньше практически на всех видах животных,
сейчас используется только на свиньях. Примерно то же происходит и с РБП.
Все это снижает доверие практиков к предлагаемым решениям, осложняет толкование
результатов исследований, особенно на фоне
использования агглютиногенных вакцин. Есть
надежда, что молекулярно-генетическая диагностика бруцеллеза, которая в последнее время
внедряется в ветеринарную практику, позволит
избавиться от этих проблем.
Коротко о важном
ЭКСПЕРТЫ ООН ПОМОГУТ СЕВЕРНОЙ КОРЕЕ СПРАВИТЬСЯ С ЯЩУРОМ
Группа экспертов ООН и Всемирной организации здоровья животных помогает Северной Корее погасить вспышку ящура у свиней и рогатого скота, сообщает «Радио ООН».
Эта болезнь обычно поражает также коз, овец, бизонов и легко передается от одного животного к
другому. Хотя ящур не представляет прямой угрозы для человека, он способен лишить фермеров дохода. Ведь больных животных нельзя использовать для полевых работ, не подлежат продаже и молочные
продукты зараженных коров, овец и коз. Группа международных экспертов проведет оценку ситуации и
даст рекомендации о том, как сдержать распространение заболевания и предотвратить возникновение
новых вспышек ящура.
ЗАРАЖЕННОЕ МЯСО ИЗ ГЕРМАНИИ МОЖЕТ ПОПАСТЬ В РОССИЮ
В настоящее время санитарная служба России ждет от немецких специалистов результатов расследования заражения мяса диоксином, сообщает «Русская служба новостей».
«Нас интересуют данные о результатах расследования: где находятся изготовленные на основе технических масел и контаминированные диоксином корма; объемы забракованной животноводческой продукции; уничтожена ли она; причины, по которым до сих пор не открыты животноводческие фермы», –
сказал глава Роспотребнадзора Г. Онищенко.
По его словам, соответствующее письмо направлено в Министерство сельского хозяйства Германии,
однако немецкие службы тянут с ответом. «ЕС также не в состоянии дать ответы на наши вопросы. Все
это выглядит как двойные стандарты на фоне постоянных претензий к российской стороне по поводу
нашей системы обеспечения безопасности пищевой продукции», – заявил Г. Онищенко.
«Нас все это волнует из-за опасности возникновения криминальных схем попадания этой продукции
на российский рынок», – сообщил он.
Ранее Россия ввела запрет на ввоз свиней из Германии. В корма мог попасть диоксин.
Агентство «АгроФакт»
04 • 2011 • ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
31