2.2.2.1. Пробоподготовка для выявления клеточных
advertisement
2.2.2.1. Пробоподготовка для выявления клеточных маркеров. Пробоподготовка для выявления поверхностных маркеров лейкоцитов в большинстве случаев была осуществлена методом окрашивание-лизис-отмывка после соответствующей маркировки пробирок: Окрашивание. В пробирки был внесен объем периферической крови, содержащий примерно 1-2 х106 лейкоцитов и соответствующие моноклональные флюорохром-конъюгированные мышиные античеловеческие антитела в объеме 5-20мкл/1-2 х106 клеток. После аккуратного перемешивания (vortex 10 сек.) клетки были инкубированы в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре (18-20ºС). Лизис. В каждую пробирку было внесено 1,5 мл лизирующего раствора. После аккуратного перемешивания (vortex 10 сек.) клетки были инкубированы в течение 10-12 минут в темноте при комнатной температуре (18-20ºС). Отмывка. После центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости в пробирки было внесено по 1 мл буфера (FacsFlow) и клетки аккуратно ресуспензированы (vortex 10 сек). После повторного центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости клетки были аккуратно ресуспензированы (vortex 10 сек) в 1 мл FacsFlow, после чего образец был готов к анализу. При необходимости отсрочить анализ на 2-24 часа была осуществлена фиксация образца за счет ресуспензирования клеток не в FacsFlow, а в фиксирующем растворе. При работе с клеточной суспензией, в которой по определению отсутствовали полученная эритроциты в спинномозговая (например, результате жидкость) из суспензия градиентного протокола мононуклеаров, центрифугирования, пробоподготовки была исключена процедура лизиса с последующей отмывкой. При необходимости одновременного выявления поверхностных и внутриклеточных маркеров при выполнении протокола окрашивание- лизис-отмывка на этапе окрашивания были внесены антитела только к антигенам поверхностной мембраны (например, CD10, CD19, CD34). После инкубации была проведена фиксация с помощью раствора CellFIX в течение 10 мин при комнатной температуре (18-20ºС) в темноте и дальнейшая пробоподготовка была осуществлена по протоколу пермеабилизация-внутриклеточное окрашивание-отмывка: Пермеабилизация: в каждую пробирку был внесен пермеабилизирующий раствор в объеме 800 мкл. После аккуратного перемешивания (vortex 10 сек.) клетки были инкубированы в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре (18-20ºС). После центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости в пробирки было внесено по 1 мл FacsFlow, в котором клетки были аккуратно ресуспензированы (vortex 10 сек.). После повторного центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости клетки были аккуратно ресуспензированы (vortex) в небольшом объеме FacsFlow. Внутриклеточное окрашивание: в пробирки были внесены антитела для выявления внутриклеточных маркеров (Tdt, cyCD3, легкие цепи иммуноглобулинов) и соответствующие изотипические контроли. После аккуратного перемешивания (vortex 10 сек.) клетки были инкубированы в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре (18-20ºС). Отмывка: После центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости в пробирки было внесено по 1 мл буфера FacsFlow и клетки аккуратно ресуспензированы (vortex). После повторного центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости клетки были аккуратно ресуспензированы (vortex) в 1 мл FacsFlow, после чего образец был готов к анализу. Пробоподготовка для выявления гемопоэтических стволовых клеток в периферической и пуповинной крови, костном мозге и продукте цитафереза была осуществлена по методу окрашивание-лизис-отмывка после маркировки пробирок (CD45/CD14, изотипический контроль, CD45/CD34 и CD45/7-AAD). Для учета результатов нами был модифицирован протокол ISHAGE (International Society of Hemotherapy and Graft Engeenering): • для точного определения области негативных событий включены изотипические контроли; • для анализа жизнеспособности фракции мононуклеаров использован 7AAD, флюоресценция которого учитывается по третьему каналу. Для исключения наложения спектров флюоресценции при анализе двух малоклеточных популяций (гемопоэтические стволовые клетки и нежизнеспособные клетки) 7AAD был использован нами не в качестве третьего компонента сочетания CD45 и CD34, а в сочетании CD45/7AAD, что позволяло безошибочно определять жизнеспособность фракции мононуклеаров в любом биологическом материале, вне зависимости от количества ГСК. Для исключения возможности изменения антигенной экспрессии во время пробоподготовки нами не было проведено никаких вариантов очистки или криоконсервирования клеток до проведения процедуры окрашивания, за исключением особо оговоренных случаев. Окрашивание. В пробирки был внесен объем биологического материала, содержавший не менее 2-3х106/мл клеток и специфические антитела из расчета 20мкл/2х106 клеток. Для исключения мертвых клеток был внесен 7-AAD из расчета 5мкл на 1х106 клеток. Инкубация 30 минут при +4ºС в темноте. Лизис. В каждую пробирку (за исключением продукта цитафереза) было внесено 1,5 мл лизирующего раствора. После аккуратного перемешивания (vortex 10 сек.) клетки были инкубированы в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Отмывка. После центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости в пробирки к окрашенным клеткам было внесено по 1 мл FacsFlow, а затем клетки были аккуратно ресуспензированы (vortex). После повторного центрифугирования (5 мин, 300 g) и удаления надосадочной жидкости клетки были аккуратно ресуспензированы (vortex) в 1 мл FacsFlow, после чего образец был готов к анализу. При работе с клеточной суспензией, в которой по определению отсутствовали эритроциты (например, продукт цитафереза) из протокола пробоподготовки была исключена процедура лизиса и отмывки.
