Новотоцкая-Власова Ксения Александровна
advertisement
Федеральное государственное учреждение науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук На правах рукописи Новотоцкая-Власова Ксения Александровна ХОЛОДОАКТИВНЫЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ПСИХРОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ОСАДКОВ 03.02.03 – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор геологоминералогических наук Д.А. Гиличинский; кандидат химических наук Л.Е. Петровская Пущино - 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................ 6 ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................. 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 12 ГЛАВА 1 КРИОБИОСФЕРА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ..................................................................................... 12 1.1 ВЕЧНАЯ МЕРЗЛОТА И КРИОПЭГИ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ, СТРОЕНИЕ, ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ....................................................................................... 12 1.2 БИОРАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ПОРОД ...................... 13 1.3 БИОРАЗНООБРАЗИЕ ПРОКАРИОТ В КРИОПЭГАХ .............................................. 16 1.4 ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА PSYCHROBACTER ...................................................... 21 ГЛАВА 2 АДАПТАЦИЯ ПРОКАРИОТ К НИЗКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ ................................................................................................................................. 26 2.1 ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ БАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К ТЕМПЕРАТУРЕ.. 26 2.2 МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ ..................................... 27 2.2.1 Изменение структуры и функций компонентов мембраны ............. 28 2.2.2 Синтез белков теплового шока ........................................................... 30 2.2.3 Белки холодового шока ......................................................................... 31 2.2.4 Криопротекторы: белки и органические осмолиты ......................... 32 2.2.5 Холодоактивные белки ......................................................................... 34 2.2.6 Анализ геномов и протеомов психрофилов......................................... 35 ГЛАВА 3 ХОЛОДОАКТИВНЫЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ 37 3.1 ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ .......................................................................................................... 37 3.2 КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПАЗ................................................... 42 3.3 ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ХОЛОДОАКТИВНЫХ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ .......................................................................................................... 46 2 3.4 ПРОДУЦЕНТЫ ХОЛОДОАКТИВНЫХ ЛИПАЗ ...................................................... 48 3.5 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ................................................ 51 3.6 ПРИМЕНЕНИЕ ХОЛОДОАКТИВНЫХ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИИ .................................................................................................. 52 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ................................................................ 55 ГЛАВА 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ....................... 55 4.1 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................. 55 4.2 РАЙОНЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................... 56 4.3 МАТЕРИАЛЫ ................................................................................................... 58 4.3.1 Штаммы Escherichia coli, вектор и среды для культивирования E.coli ................................................................................................................. 58 4.3.2 Олигонуклеотиды .................................................................................. 58 4.4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА .................................................. 59 4.4.1 Оценка общей численности микроорганизмов ................................... 59 4.4.2 Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий.......................................................................................................... 60 4.4.3 Микроскопические методы исследования .......................................... 61 4.4.4 Культивирование P. cryohalolentis ...................................................... 61 4.4.5 Определение липолитической активности ........................................ 61 4.5 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ............................................................................................. 63 4.5.1 Выделение геномной ДНК ..................................................................... 63 4.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ................................................. 63 4.5.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16SрРНК и филогенетический анализ .............................................................................. 64 4.6 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ............................................................. 64 4.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ................................................. 64 4.6.2 Рестрикция ............................................................................................ 65 3 4.6.3 Электрофорез ДНК ............................................................................... 65 4.6.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей .............................. 65 4.6.5 Лигирование ........................................................................................... 65 4.6.6 Трансформация клеток E. coli ............................................................. 65 4.6.7 ПЦР-анализ клонов ................................................................................ 66 4.6.8 Выделение плазмидной ДНК из E. coli................................................. 66 4.6.9 Секвенирование ДНК............................................................................. 66 4.6.10 Конструирование экспрессионных векторов ................................... 66 4.7 БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................. 68 4.7.1 Денатурирующий электрофорез белков в ДСН–ПААГ ..................... 68 4.7.2 Оптимизация экспрессии в E.coli рекомбинантных белков ............. 69 4.7.3 Выращивание рекомбинантных штаммов E.coli .............................. 69 4.7.4 Выделение рекомбинантных белков EstPc, Lip1Pc, ND1-ND5, LifPcd23 и LifPcd62 из клеток E. coli .......................................................... 70 4.7.5 Получение рекомбинантного белка Lip2Pc ........................................ 71 4.7.6 Рефолдинг рекомбинантного белка Lip2Pc ........................................ 71 4.7.7 Очистка рекомбинантного белка Lip2Pc ........................................... 72 4.7.8 Определение концентрации белка ....................................................... 72 4.7.9 Определение липолитической активности рекомбинантных белков .......................................................................................................................... 73 4.7.10 Характеристика свойств рекомбинантных белков........................ 73 ГЛАВА 5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................ 74 5.1 КРИОПЭГИ КАК ИСТОЧНИК ПРОДУЦЕНТОВ ХОЛОДОАКТИВНЫХ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ........................................................................... 74 5.1.1 Микробиологическая характеристика исследуемых криопэгов ...... 74 5.1.2 Скрининг на наличие липолитической активности у выделенных микроорганизмов ............................................................................................ 77 5.1.3 Морфологический и филогенетический анализ культур, давших положительный результат на липолитический скрининг ........................ 80 4 5.2 ЛИПОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА P.CRYOHALOLENTIS .......................................... 86 5.2.1 Изучение липолитической активности P. cryohalolentis в зависимости от стадии роста культуры и температуры культивирования............................................................................................. 87 5.2.2 Моделирование липолитической системы P.cryohalolentis .............. 90 5.3 ХОЛОДОАКТИВНЫЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ P. CRYOHALOLENTIS ....... 95 5.3.1 Получение и характеристика EstPc .................................................... 95 5.3.2 Получение и характеристика Lip1Pc................................................ 108 5.3.3 Получение и характеристика Lip2Pc................................................ 123 5.3.4. Сравнение свойств липолитических ферментов P. cryohalolentis и гомологичных белков .................................................................................... 138 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................. 146 ВЫВОДЫ ............................................................................................................ 149 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 150 5 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфат OD560 - оптическая плотность (при длине волны 560нм) OD595 - оптическая плотность (при длине волны 595 нм) а.о. - аминокислотный остаток ДМСО - диметилсульфоксид ДМФА - N,N-диметилформаамид ДСН - додецилсульфат натрия ед.а. - единица активности ИПТГ - изопропил–β–D–тиогалактозид кДа - килоДальтон М. м. - молекулярная масса о.е. - оптическая единица ОРС – открытая рамка считывания п-нитрофенилбутират - п-НФБ п-нитрофенилдеканоат - п-НФД п-нитрофенилдодеканоат - п-НФДД п-нитрофенилмиристат - п-НФМ п-нитрофенилпальмитат - п-НФП ПААГ - полиакриламидный гель ФМСФ - фенилметилсульфонил фторид п.н. - пар нуклеотидов ПСА - персульфат аммония ПЦР - полимеразная цепная реакция СП - сигнальная последовательность ТЕМЕД - N,N,N,N–тетраметилэтилендиамид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭФ - электрофорез 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Вечная мерзлота представляет собой грунты и осадочные породы, находящиеся по меньшей мере два года при температуре 0°С и ниже. В общей сложности она занимает около 26% поверхности Земли и более 50% территории России. Для этой среды характерны уникальные условия, в частности, отрицательная в течение геологически длительных периодов температура, низкая активность воды, слабая доступность органических веществ, минимальная скорость диффузии и длительное воздействие гаммарадиации от минералов вмещающих пород (Gilichinsky, 2002). Сотрудниками лаборатории криологии почв ИФХБПП РАН установлено, что вечномерзлые отложения Арктики и Антарктики содержат значительное количество микроорганизмов, проявляющих метаболическую активность при температурах до -17°С (Rivkina et al., 2000). В ходе многочисленных проведенных исследований были выделены и описаны многие микроорганизмы – бактерии, в том числе актиномицеты и цианобактерии, зеленые водоросли, археи, дрожжи и микромицеты, протисты, выживающие при длительном хранении в вечномерзлых грунтах (Карасев и др., 1998; Вайнштейн и др., 1995; Vishnivetskaya et al., 2001 Rivkina et al., 2007; Golubev,1998; Ozerskaya et al., 2004; Шатилович и др., 2010 и др.). В частности, из вечномерзлых отложений различного возраста выделены и описаны бактерии Exiguobacterium sibiricum (Rodrigues et al., 2006), Psychrobacter arcticus и P. cryohalolentis (Bakermans et al., 2006), P. muriicola (Щербакова и др., 2009), Celerinatantimonas yamalensis, Clostridium algoriphilum, Methanobacterium arcticum (Shcherbakova et al., 2005; 2011; 2013), M. veterum (Krivushin et al., 2010), которые сохранили жизнеспособность и обладали способностью к росту в широком диапазоне температур (от -5 до +40°С) после криоконсервации на протяжении геологического времени до 3-х миллионов лет. В результате секвенирования геномов бактерий P. arcticus и P. cryohalolentis, а также последующего 7 транскриптомного и протеомного анализа установлено наличие различных механизмов адаптации к низкотемпературным условиям существования, включая изменение текучести мембран за счет повышения доли ненасыщенных жирных кислот в липидах, увеличение синтеза осмолитов и веществ с антиоксидантной активностью. Показано, что при относительно низких и высоких температурах (-2.5 и +39°С) наблюдается значительное изменение профилей экспрессии генов этих микроорганизмов, по сравнению с их метаболизмом в температурном диапазоне 10-28°С (Bakermans et al., 2003, 2004, 2007, 2008; Bergholz et al., 2009). Для выяснения механизмов выживаемости микроорганизмов в вечномерзлых породах необходимо установить, каким образом их клетки обеспечивают активный метаболизм и размножение в широком температурном диапазоне, а также поддержание жизнедеятельности при длительном нахождении при отрицательных температурах. Решение этой фундаментальной проблемы на молекулярном уровне способствует углубленному пониманию механизмов адаптации микроорганизмов к условиям вечной мерзлоты, а также определению возможных пространственных и временных границ существования жизни не только на Земле, но и на других планетах и космических телах криогенного типа. Функционирование всех основных систем жизнеобеспечения клетки связано с активностью белковых молекул. Для поддержания клеточного метаболизма при длительном нахождении микроорганизмов в многолетнемерзлых отложениях их белки, и в первую очередь, ферменты, должны обладать структурными и функциональными особенностями, позволяющими им сохранять активность в условиях отрицательной температуры и ограниченного количества свободной воды (Scherer and Neuhaus, 2006). С другой стороны, способность к росту при повышении температуры среды также должна обеспечиваться белками, проявляющими активность в соответствующих условиях. Учитывая вышесказанное, основной целью данной работы являлся поиск специфических особенностей 8 ферментов микроорганизмов из вечной мерзлоты, обеспечивающих их адаптацию к экстремальным условиям существования, на примере липолитических ферментов. Цель и задачи исследования Целью нашей работы было получение и изучение холодоактивных липаз из микроорганизмов, выделенных из экосистем многолетнемерзлых отложений. Для достижения цели решались следующие задачи: 1. Выявление жизнеспособных бактерий в составе микробных сообществ низкотемпературных рассолов (криопэгов), обладающих липолитической активностью и создание коллекции психрофильных и галофильных микроорганизмов, обладающих липолитической активностью. 2. Изучение морфологических характеристик выделенных штаммов, определение их таксономического положения. 3. Поиск в геноме P. cryohalolentis K5T генов белков-гомологов липаз родственных микроорганизмов, амплификация этих генов, клонирование их и экспрессия в E. coli 4. Очистка и характеристика целевых белков. Научная новизна работы Впервые проведена оценка наличия липолитической активности у микроорганизмов, выделенных из отрицательнотемпературных рассолов (криопэгов) в вечной мерзлоте. Выделены и частично охарактеризованы чистые культуры бактерий, обладающих липолитической активностью. Впервые выделены и изучены липолитические ферменты психроактивной бактерии P. cryohalolentis K5T, выделенной из арктического криопэга. Показано, что выделенные липолитические ферменты EstPc, Lip1Pc и Lip2Pc являются холодоактивными и обладают рядом уникальных свойств. 9 Практическое значение Полученные липолитические ферменты могут быть использованы в пищевой промышленности, в легкой промышленности, в тонком химическом синтезе и при биоремедиации сточных вод и почв. Обычно продуцентами холодоактивных ферментов являются микроорганизмы - психрофилы, чей температурный оптимум лежит ниже 15ºС. Исследователи этих ферментов часто сталкиваются с проблемой их нестабильности при более высоких температурах. Результаты наших исследований показали, что ферменты EstPc и Lip2Pc обладают не только высокой активностью при низких температурах, но и повышенной термостабильностью при относительно высоких температурах, что делает их перспективными для применения в различных областях промышленности. Апробация работы Основные положения работы доложены на Международной конференция по мерзлотной микробиологии MicroPermWorkshop (Потсдам, Германия, 2010), 15-ой, 17-ой Пущинских конференциях молодых ученых «Биология-наука 21-го века» (2011, 2013), Всероссийских Молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011, 2012), Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Новосибирск, 2011), Всероссийском симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной конференции "EarthCryology: XXICentury" (Пущино, 2013), 10-ом международном конгрессе "Extremophiles" (СанктПетербург, 2014), а также на ежегодных отчетах научных лабораторий ИФХиБПП РАН (2010-2014). 10 Публикации По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК - 2, в зарубежных рецензируемых журналах - 2, патент на изобретение РФ - 1 и 14 тезисов международных конференций. Структура и объем работы Диссертация изложена на 171 странице и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 283 ссылок, содержит 30 таблицы и 42 рисунка. 11 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1 КРИОБИОСФЕРА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 1.1 Вечная мерзлота и криопэги: определение, строение, физикохимические условия Вечной мерзлотой называют грунты, находящиеся, по меньшей мере, 2 года при температуре 0оС и ниже (Permafrost Subcommittee 1988, p.63). В общей сложности вечная мерзлота занимает около 26% поверхности Земли, охватывая широким поясом север Евразии и Северной Америки, где достигает мощности от 700 до 1000 метров, также встречается на свободных ото льда прибрежных территориях Антарктиды и в высокогорных районах. Вся совокупность вечномерзлых пород называется криосферой, или криолитосферой. Температура в вечномерзлых почвах Арктики варьирует от 0 до -17оС, в то время как в Антарктике от -18 до -27 оС. Возраст как Арктической так и Антарктической мерзлоты варьирует в интервале от нескольких тысяч до нескольких миллионов лет. (Gilichinsky, 2002; Gilichinsky and Rivkina, 2011). Внутри вечномерзлых грунтов существуют различные относительно обособленные структуры . Например, талики - массив талых пород внутри мерзлой толщи, грунтовый лед - все типы льда внутри вечной мерзлоты, а также криопэги - высокоминерализованные подземные воды с постоянной отрицательной температурой (Рис. 1). Криопэги представляют собой незамерзшие грунты и линзы свободной воды, находящиеся в толще многолетнемерзлых пород и характеризующиеся постоянно отрицательной температурой и высокой соленостью. Эти образования широко распространены в Арктике. Происхождение криопэгов связано с промерзанием отложений морского генезиса различного возраста. Накопление донных осадков сопровождалось процессами метанообразования. 12 Оно происходило в условиях похолодания, шло в сублиторальной зоне моря на малых глубинах при низкой солености и положительных температурах, близких к нулю. После регрессии Полярного океана донные осадки, насыщенные водой и метаном, перешли в субаэральное состояние и промерзли. Начальный этап эпикриогенеза сопровождался миграцией и отжатием воды и газа фронтом промерзания сверху к низам горизонта. Затем шло вымораживание воды и солей из осадков, повышение минерализации остаточного раствора. Постепенно формировались локальные линзы, содержащие отрицательнотемпературный рассол - криопэги. Впоследствии горизонт морских отложений перекрыли терригенные осадки, формировавшиеся в суровом климате (Рис.1). Гидрохимический анализ криопэгов, образующихся в породах с морским типом засоления, позволяет восстановить температуру их формирования (Фотиев, 1997, 2009). Эти расчеты показали, что криогенная метаморфизация пород и подземных вод происходила при температуре ниже современных температур вмещающих пород. Рис. 1 Схема строения структур многолетнемерзлых пород, модифицировано по Jansson and Taş, 2014. 1.2 Биоразнообразие бактерий многолетнемерзлых пород Интенсивное изучение многолетнемерзлых пород показало наличие в них жизнеспособной микрофлоры. Было установлено, что микроорганизмы, обнаруженные в многолетнемерзлых отложениях, не привнесены извне, а 13 находятся в них in situ. Возраст микроорганизмов соответствует продолжительности мерзлого состояния отложений. Наиболее древние клетки были обнаружены в многолетнемерзлых отложениях на северовостоке Сибири (2-3 млн. лет) при температуре пород -10...-12oC (Shi et al. 1997). Общее количество бактерий, определенное путем прямого счета под микроскопом составило 105-106 для проб антарктических грунтов (Cowan et al., 2002; Gilichinsky et al., 2007), 107 для проб арктических грунтов Канады (Steven et al., 2008) и 103-108 кл/г для проб арктических грунтов Сибири (Gilichinsky et al., 2008). Количество жизнеспособных бактерий, определенное главным образом чашечным методом при посеве на богатые среды, варьировало от 0 до 106 кл/г. Среди бактерий, выделенных из образцов вечномерзлых грунтов Колымской низменности, наиболее часто встречались коринеформные (85%) и коккоидные (5%) формы, среди которых доминировали бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Micrococcus, Deinococcus, Brevibacterium и Streptomyces. Неспорообразующие грамотрицательные палочки (12%) в большинстве своем были представлены родами Pseudomonas и Flavobacterium (Gilichinsky et al., 2008; Steven et al., 2006). В образцах позднеплейстоценового (1.8–3 млн. лет) возраста доминировали актиномицеты, принадлежащие к родам Arthrobacter,Kocuria, Aureobacterium, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardioides, Streptomyces и Propionibacterium (Карасев и др., 1998). Использование селективных питательных сред также позволило выделить сульфатвосстанавливающую бактерию Desulfotomaculum sp.(Вайнштейн и др., 1995), в последствие описанную как Desulfosporosinus hippei (Vatsurina et al., 2008), нитрифицирующие бактерии родов Nitrosospira, Nitrosovibrio и Nitrobacter (Соина и др., 1991), пурпурную несерную фотосинтезирующую бактерию рода Rhodopseudomonas (Бурашникова и Гоготов, 1994) и спорообразующие бактерии рода Bacillus 14 (Кузьмин и др., 1996). Мезофильные актиномицеты и родственные им грамположительные бактерии преобладали в замороженных позднеплиоценовых образцах Колымской низменности. Исследование физиологических, морфологических и хемотаксономических свойств показало, что бактерии относятся к родам Arthrobacter, Kocuria, Aureobacterium, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardioides, Streptomyces. Анаэробные бактерии были идентифицированы как Propionibacterium sp. Изучение фенотипических характеристик пигментированных бактерий, выделенных из образцов вечной мерзлоты и определенных как представители рода Brevibacterium, показало, что три выделенных штамма представляли три новых вида рода Brevibacterium (Гавриш и др., 2004). Клеточная стенка штаммов содержала маннитолтейхоевую кислоту с ранее неизвестной структурой (Potehina et al., 2003). Исследования филогенетического разнообразия, как современных мерзлотных почв, значительное так и многолетнемерзлых микробное разнообразие. отложений, Филогенетический выявили анализ клонированных 16S рРНК последовательностей, выделенных из мерзлотных почв и многолетнемерзлых пород, позволил исследователям выявить микроорганизмы, которые были отнесены к родам Arthrobacter, Micrococcus, Brevibacterium, Streptomyces, Cellulomonas, Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas, Myxococcus, Bacillus, Rhodococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium, Chloroflexus, Nitrospina, Prosthecobacter, Flexibacter, Hyphomicrobium, Bradyrhizobium, Rhodoferax, Sphingomonas, Lepthotrix, Azospirillum, Blastochloris, Caulobacter, Oxalobacter, Rhodocyclus, Xantomonas, Methylosinus, Comamonas, Methylomonas, Desulfuromonas, Rhubrobacter, Brevibacillus (Spirina et. al., 2003; Trotsenko and Khmelenina, 2005). 15 1.3 Биоразнообразие прокариот в криопэгах Колымская низменность Впервые микробным разнообразием криопэгов заинтересовались в конце ХХ века. Общая численность микроорганизмов в криопэгах, определенная методом прямого счета, составляла в образцах Колымской низменности 107 кл/мл, что соответствует обычным природным водным местообитаниям и общей численности микроорганизмов в мерзлых породах (Vorobyova et al., 1997). Позднее, методом предельных разведений было показано, что численность микроорганизмов в криопэгах Колымской низменности составляет 102 - 104 кл/мл, в то время как в окружающих породах 103 – 108 кл/г (Gilichinsky микроорганизмов et al., 2005). Численность метаногенов, (гетеротрофов, анаэробных ацетогенов групп и сульфатредукторов) в криопэгах находилась в пределах от десятков кл/мл (ацетогены) до 2106 кл/мл (сульфатредукторы). Максимальная численность отмечалась при температуре культивирования 5С, а при 18С она падала на 1-3 порядка (Табл. 1), что, в целом, указывает на психрофильный характер анаэробного сообщества (Гиличинский и др., 2003). Численность культивируемых аэробных бактерий, 80-95% которых были представлены грамположительными непигментированными палочками и кокками, колебалась в криопэгах от сотен до сотен тысяч клеток в 1 мл воды (Табл. 2), а во вмещающих морских отложениях составляла 102-103 кл/г породы. 16 Таблица 1. Численность анаэробных жизнеспособных прокариот различных физиологических групп в образцах криопэгов (Гиличинский и др., 2003; Печерицына и др., 2007). № скважины, минерализация образца, г/л 14/99, 163.0 15/99, 156.0 21, 9.3 Минерализация, среды, г/л Численность микроорганизмов при различных температурах (оС) культивирования, кл/мл Анаэробные СВБ** Ацетогены Метаногены Общий счет* гетеротрофы 5-6 15-18 5-6 15-18 5-6 15-18 5-6 15-18 5 100 5 100 2.3-6.6×107 5 40 8.2x108 2.3-6.6×107 Колымская низменность 2×102 2×102 2×106 0 0 2×106 2×102 0 2×105 0 0 2×106 Полуостров Варандей 105 105 102 3 2 5х10 10 10 Полуостров Ямал 2x103 2x105 0 Устье р. Ярояха, 50 4.2x107 56,2 80 3.2x106 2x104 2x105 Пойма р. Ярояха, 77,2 18 8.2x108 2x10 2x108 Бованенковское газовое месторождение, 14,6 * - методом окрашивания с DAPI; **- сульфатвосстанавливающие бактерии 17 2×102 2×101 2×103 0 10 0 1×102 0 0 10 0 0 1×102 0 0 0 0 0 0 0 10 50 0 0 0 0 10 0 10 0 10 0 2x102 2x102 0 2x103 2x103 2x10 2x10 2x10 0 2x104 2x103 0 10 0 0 Таблица 2. Численность аэробных гетеротрофных прокариот в образцах криопэгов (Гиличинский и др., 2003; Печерицына и др., 2007). № скважины Минерализация образца г/л Общий счет, кл/мл 7 14/99 15/99 16/99 17/99 163 156 121 153 10 107 107 107 3 10 21 25 11 6 9 19 3,5×108 3,5×108 8,2×108 3,5×108 Жизнеспособные культивируемые микроорганизмы при различных температурах (оС) культивирования, кл/мл -2 5 20 37 Колымская низменность 5×104 9×102 2×104 0 Варандейский полуостров н.о. н.о. 6,3×105 н.о. 18 6×105 6×104 5×105 1×102 2×106 8×103 7×104 7×101 7×105 2,1×106 3,5×107 4,5×106 9,7×105 8×105 4×107 2,4×106 н.о. 4,3×104 1,5×104 5,5×105 1,1×103 Результатом изучения анаэробных процессов в криопэгах на Колымской низменности явилось выделение анаэробных штаммов 14D1 и 14F Clostridium sp. и двух аэробных штаммов1pS и 2pS, относящихся к роду Psychrobacter. Штамм 2pS обладал оптимальной температурой роста в диапазоне температур 16-18оС с оптимумом рН 6,5-7,5 и оптимум NaCl для роста составил 3-8 г/л. Филогенетический анализ позволил описать штамм 2pST как новый вид ‗Psychrobacter muriicola’ sp. nov. (Щербакова и др., 2009). Исследование клостридиальных штаммов методами полифазной таксономии позволило описать новый вид бактерий Clostridium algoriphilum с типовым штаммом 14D1T, являющийся спорообразующим облигатным психрофилом, способным расти на средах, богатых сахаридами и дисахаридами в температурном диапазоне от -5 до 20оС с оптимумом роста при 5-6°С (Shcherbakova, et. al., 2005). В пробах колымских криопэгов Карин Бакерманс с соавторами обнаружила 17 филотипов бактерий, близкородственных родам Psychrobacter, Arthrobacter, Frigoribacterium, Subterricola, Microbacterium, Rhodococcus, Erwinia, Paenibacillus и Bacillus (Bakermans et al., 2003). Штаммы родов Psychrobacter, Frigoribacterium, Paenibacillus и Rhodococcus ранее часто выделяли из арктической и антарктической морской воды (Brambilla et al., 2001; Christner et al., 2001; Mergaert et al., 2001). В дальнейшем штамм К5Т, выделенный из криопэга Колымской низменности, был описан как Psychrobacter cryohalolentis sp. nov. (Bakermans et al., 2006). Варандейский полуостров В отличие низменности от высокоминерализованных криопэги Варандейского криопэгов Колымской полуострова являются распресненными. В ходе изучения микробных сообществ Варандейского полуострова было показано, что численность аэробных гетеротрофных бактерий, определенная с использованием универсальной среды 5/5, варьировала от 19 десятков тысяч до десятков миллионов клеток в 1 мл (Табл. 2) в зависимости от температуры инкубации (Печерицына, 2007). Численность микроорганизмов из рассолов Варандейского полуострова, определенная путем прямого счета, составила 3,5×108кл/мл и это значение на порядок выше, чем в криопэгах Колымской низменности (Печерицына и др., 2007). Как и в случае с аэробами, количество жизнеспособных анаэробных бактерий, определенное при 5оС, практически не отличалось от количества, определенного при 20оС (Табл. 1). Сульфатредукторы были представлены сотнями клеток в 1 мл образца, метаногены - десятками. Ацетогенных бактерий выявлено не было. Учет на средах с повышенным содержанием NaCl показал присутствие галотолерантных представителей соответствующих групп бактерий в количестве, на порядок меньшем, чем количество бактерий, полученное при посеве на пресные среды (Табл. 1). Из криопэга Варандейского сульфатвосстанавливающая бактерия полуострова штамм B15T, была клетки выделена которой представляли собой грамотрицательные подвижные вибрионы (Pecheritsyna et al., 2012). Штамм содержал бисульфитредуктазу и рос при температуре от 2 до 28оC (оптимум 24оC), не требовал NaCl для роста. Новая бактерия использовала Н2, лактат, формиат, этанол, пируват и холин как доноры электронов и сульфат, сульфит, тиосульфат, So, диметилсульфоксид и Fe(III) в качестве акцепторов электронов. Данные филогенетического анализа гена 16S рРНК и уровень ДНК-ДНК гибридизации с ближайшим родственным организмом Desulfovibrio idahonensis CY1T позволили убедительно доказать, что новая бактерия представляет собой новый психротолерантный вид рода Desulfovibrio D. arcticus с типовым видом В15Т. Таким образом, микробиологический анализ высокоминерализованных криопэгов Колымской низменности и распресненных криопэгов Варандейского полуострова показал, что обитателями этих экосистем являются психрофильные галотолерантные сообщества. В первом случае 20 преобладали анаэробные микроорганизмы, а во втором – основную часть популяции представляли аэробы. Эти различия, возможно, связаны с полной изолированностью Колымских криопэгов от влияния внешних факторов в течение геологического времени, в то время как в молодые Варандейские криопэги с пресными поверхностными водами периодически поступает кислород. 1.4 Характеристика рода Psychrobacter Бактерии рода Psychrobacter являются группой микроорганизмов, часто выделяемой из холодных местообитаний, в том числе из криопэгов (Bakermans et al., 2006; Щербакова и др., 2009). Для многих видов этого рода показано наличие липолитических ферментов, включая холодоактивные (Kulakova et al., 2004; Chen et al., 2011 и др.) Поэтому представители этого рода являются перспективной группой психроактивных бактерий для обнаружения и изучения липолитических ферментов. Этот род объединяет грамотрицательные, неподвижные, строго аэробные, хемоорганотрофные, преимущественно психротолерантные и галотолерантные, неподвижные грамотрицательные кокки и коккобациллы (Bowman, 2006), выделенные из разнообразных источников – от ледников до клинических образцов. В последнее время этот род наиболее интенсивно пополнился новыми видами, благодаря использованию филогенетического анализа по гену 16S рРНК. Исследования разнообразных экониш продемонстрировали, что бактерии Psychrobacter sp. является эволюционно успешной группой, обладающей высоким адаптационным потенциалом. Таксономия и филогения. Первый вид рода, Psychrobacter immobilis, был описан в 1986 (Juni and Heym, 1986) на основе группы штаммов, морфологически похожих на Moraxella и Acinetobacter. Эти штаммы, выделенные из морской воды, чешуи и жабр рыб, были сгруппированы на основании фенотипических признаков и взаимной компетентности к генетичеcкой трансформации. К настоящему времени род включает 35 видов, объединенных на основе данных филогенетического анализа и общности 21 физиолого-биохимических признаков. Филогенетическое расположение этих видов внутри рода представлено на Рис. 2. Некоторые виды встречаются в парах, например, P. submarinus и P. marincola, обладают очень схожими последовательностями генов 16S рРНК и, таким образом, их сравнение, может представлять только предварительное заключение о таксономическом статусе внутри рода. Род Psychrobacter на основе данных анализа гена 16S рРНК был отнесен к семейству Moraxellaceae в рамках класса γProteobacteria (Bowman, 2002). Виды Psychrobacter характеризуются содержанием Г+Ц пар в ДНК от 41 до 51 мол.%, что сближает его с другими родами семейства Moraxellaceae. К общим фенотипическим признакам, отличающим род Psychrobacter от близких родов Moraxella и Acinetobacter, относятся такие диагностические признаки, как положительный тест на оксидазу, способность к росту при 4С и в присутствии 6% NaCl, а также преимущественная распространенность в морских местообитаниях. Представители рода Psychrobacter образуют белые или кремовые, гладкие округлые колонии с ровным краем и маслянистой консистенцией (Bowman, 2006). Размеры клеток колеблются в пределах 0,4-2,0 мкм в длину и 0,4-1,6 мкм в толщину. Покоящихся форм не образуют. Большинство видов не использует такие сложные субстраты, как полисахариды и белки. Некоторые штаммы P. jeotgali, P. phenilpiruvicus и P. pulmonis требуют для роста стимулирующие добавки (дрожжевой экстракт, лошадиная сыворотка). Представители рода обычно не используют углеводы, наиболее часто используемыми субстратами являются органические кислоты и аминокислоты. Бактерии Psychrobacter sp. часто проявляют значительную липазную активность (Bowman et al., 1996; Arpigny et al., 1997;Yumoto et al., 2003; Kulakova et al., 2004; Zeng et al., 2004; Chen et al., 2011; Xuezheng et al., 2010; Zhang et al., 2007). Также они способны утилизировать некоторые субстраты, не используемые большинством грамотрицательных бактерий. Так P. urativorans (Bowman et al., 1996) и другие виды, выделенные из 22 орнитогенных почв, способны утилизировать мочевую кислоту в качестве единственного источника углерода, азота и энергии. Виды Psychrobacter sp. отличаются способностью расти при низких температурах и толерантностью к широкому диапазону солености среды. Некоторые виды являются галофильными или их рост стимулируется ионами натрия, другие могут расти без добавления соли. Эти фенотипические характеристики, наряду с данными анализа гена 16S рРНК и ДНК-ДНК гибридизации, позволяют дифференцировать виды внутри рода. Все представители рода являются нейтрофилами с ростом при рН 6,0 – 8,0. Хемотаксономия. Для липидных профилей видов рода Psychrobacter характерны мононенасыщенные жирные кислоты: пальмитиновая кислота (С16:1∆7с), гептадеценовая кислота (С17:1∆8c) и олеиновая кислота (С18:1∆9c). Олеиновая кислота может служить хемотаксономическим маркером рода. Преобладание мононенасыщенных жирных кислот (до 85%), вероятно, служит адаптацией к росту при низких температурах (Russel and Hamamoto, 1998; Щербакова и др., 2009). Среди других жирных кислот чаще всего обнаруживают октадекановую (С18:0) и 3-гидроксидодекановую (С12:0 3OH). Psychrobacter sp. из многолетнемерзлых отложений. Как было сказано выше, многие Psychrobacter spp. выделены из морских местообитаний с постоянно низкой температурой. В 2001-2002 гг. были обнаружены первые представители этого рода в многолетнемерзлых отложениях (Vishnevetskaya et al., 2006) и криопэгах российской Арктики (Gilichinsky et al., 2003; Гиличинский и др., 2003). Позднее выделенные из вечномерзлых отложений Сибири штаммы были описаны в качестве типовых штаммов новых видов P. cryohalolentis, P. arcticus (Bakermans et al., 2006) и ‗P. muriicola’ (Щербакова и др., 2009). В Таблице 3 представлены физиологические и биохимические характеристики арктических видов психробактеров. Следует отметить, что все бактерии могут расти при отрицательной температуре культивирования и не растут при температуре 23 выше 35оС. P. cryohalolentis P. arcticus и ‗P.muriicola’, не сбраживают глюкозу и ряд углеводов и не образуют из них кислоты. Psychrobacter frigidicola ACAM304T (AJ609556) Psychrobacter immobilis A351T (U39399) 75 70 Psychrobacter adeliensis SJ14T (NR_117634) Psychrobacter glacincola ACAM483T (AJ312213) Psychrobacter cibarius JG-219T (AY639871) Psychrobacter urativorans ACAM534T (AJ609555) Psychrobacter arcticus 273-4T (AY444822) Psychrobacter luti NF11T (AJ430828) 55 Psychrobacter okhotskensis MD17T (AB094794) 97 53 Psychrobacter fozii NF23T (AJ430827) Psychrobacter cryohalolentis K5T (AY660685) Psychrobacter aquimaris SW-210T (AY722804) Psychrobacter piscatorii T-3-2T (AB453700) 59 84 62 Psychrobacter proteolyticus 116T (AJ272303) ‗Psychrobacter muriincola‘ 2pST (AF517755) 86 Psychrobacter nivimaris 88/2-7T (AJ313425) Psychrobacter maritimus Pi2-20T (AJ609272) Psychrobacter namhaensis SW-242T (AY722805) Psychrobacter alimentarius JG-100T (AY513645) Psychrobacter aquaticus CMS 56T (AJ584833) 60 100 Psychrobacter vallis CMS39T (AJ584832) T 100 Psychrobacter faecalis Iso-46 (AJ421528) Psychrobacter pulmonis S-606T (AJ437696) Psychrobacter fulvigenes KC40T (AB438958) Psychrobacter jeotgali YKJ-103T (AF441201) 99 66 Psychrobacter salsus DD48T (AJ539104) Psychrobacter marincola DSM 14160T (AJ309941) 95 Psychrobacter submarines DSM 14161T (AJ309940) Psychrobacter aestuarii SC35T (EU939718) 76 Psychrobacter pacificensis NIBH P2K6T (AB016057) Psychrobacter celer SW-238T (AY842259) Psychrobacter phenylpyruvicus 2863T (U46144) Psychrobacter lutiphocae IMMIB L-1110T (FM165580) 50 75 99 Psychrobacter arenosus R7T (AJ609273) Psychrobacter sanguinis 13983T (HM212668) 0.005 Рис. 2 Филогенетическое древо рода Psychrobacter, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Длина масштабной линейки: 0.5 замен на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Дендрограмма построена с 24 использованием метода поиска ближайших соседей (―neibour-joining‖). Данные ―bootstrap‖-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. Таблица 3. Фенотипические характеристики видов рода Psychrobacter, выделенных из экосистем Арктики (Bakermans et al., 2006; Щербакова и др., 2009). Характеристика Температура роста: Диапазон Оптимум Толерантность к 100 г/л NaCl Образование кислотыиз углеводова Гидролиз Tween 80 Ферментативные активности: Кислая фосфатаза Щелочная фосфатаза Уреаза Эстераза (С4) Липаза (С14) Лейцин ариламидаза Утилизируемые субстраты: ‘P.m uriicola’2pS T VKM В-2270 P. cryohalolentis K5T VKM B-2378 P. arcticus 273-4T VKM B-2377 -2 - 35 16-18 +в -10 - 30 22 + -10-28 22 + - - - + - + + + V + + + + + + + + + + -. + Цитрат + + Ацетат + + + L-малат + L-гистидин + + L-пролин + + + L-аланин + + L-гидроксипролин v+ ГЦ состав, мол.% 46.0 42.3 42.7 а Все таксоны были оксидазо- и каталазоположительными, не образовывали индол и Н2S, не гидролизовали крахмал, не содержали лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу. вСокращения: + реакция положительная; V+ реакция положительная для 1189% штаммов, но реакция типового штамма положительная; V- реакция отрицательная для 1189% штаммов, но реакция типового штамма отрицательная; - реакция отрицательная. К настоящему моменту секвенированы, с помощью современных систем секвенирования, таких как Illumina, 14 полных геномов бактерий, относящихся к роду Psychrobacter, 4 из них опубликовано (Табл. 4). Геномный и протеомный анализ P. arcticus и P. cryohalolentis показали, что геномы этих бактерий адаптированы к холоду. В том числе были продемонстрированы изменения в синтезе пептидогликанов, энергетическом 25 метаболизме, углеводном обмене, синтезе нуклеотидов и др. (Bergholz et al., 2009). Так же было показано увеличение синтеза белков холодового шока и экспрессия генов холодоиндуцибельных белков (Bakermans et al., 2007). Таблица 4. Полные геномы бактерий рода Psychrobacter. Микроорганизм Размер Количество ОРС Ссылка генома, Мб P. cryohalolentis, K5T 3,1 2907 P. arcticus, 273-4T 2,6 2120 hhttp://www.ncbi.nlm.nih. gov/nuccore/CP000323.1 Ayala-Del-Rio et al., 2010 3,0 2385 http://www.ncbi.nlm.nih.g Psychrobacter sp., штамм PRwf-1 Psychrobacter ov/nuccore/CP000713.1 sp., 3,1 2682 Che et al., 2013 штамм G ГЛАВА 2 АДАПТАЦИЯ ПРОКАРИОТ К НИЗКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ 2.1 Физиологические группы бактерий по отношению к температуре Согласно наиболее распространенной классификации (Morita, 1975), психрофильными считаются те бактерии, для которых оптимум температуры не превышает 15С, а верхний предел роста не превышает 20С. Психротолерантными (психроактивными, психротрофными, факультативнопсихрофильными) принято считать бактерии, способные к росту как при низких температурах (ниже 20ºС), так и при более высоких. Однако это определение имеет очевидный недостаток. Как правило, микроорганизмы, с одной стороны, ведут себя как термодинамические единицы, и увеличение температуры ведет к увеличению скорости роста. С другой стороны, они также являются биологическими единицами, и метаболические этапы, чувствительные к температуре, могут ухудшать функционирование некоторых путей при более высокой температуре. Так, было показано, что хотя скорость роста многих адаптированных к холоду 26 бактерий возрастала с увеличением температуры культивирования от 5 до 25оС, но при этом уменьшалось количество жизнеспособных бактерий, продукция экзоферментов, синтез белка, а проницаемость мембраны увеличивалась. Эти факты подчеркивают, что использование единственного параметра – удельной скорости роста для определения оптимальной температуры является недостаточным (Feller and Gerday, 2003). Поэтому некоторые авторы считают, что правильнее определять психрофилов как организмы, способные к росту при температуре 5º и ниже, в отличие от мезофилов с температурным оптимумом 37ºС (Neidhardt et al., 1990). Другие авторы предлагают использовать термины «эвритермный» и «стенотермный» для организмов, которые способны расти в широком и узком диапазоне температур соответственно. Согласно этой классификации, истинные или облигатные психрофилы могут рассматриваться как стенотермные, а психротрофные или психротолерантные - как эвритермные (Feller and Gerday, 2003). 2.2 Механизмы адаптации к низкой температуре Большинство бактерий, живущих в природных экосистемах, подвержены резким изменениям условий окружающей среды. Так, бактерии, обитающие в почвах, испытывают не только колебания температуры (от -50 до +25°С для микроорганизмов, обитающих в почвах Антарктиды), но также низкую доступность воды, питательных веществ и радиационное излучение от вмещающих пород. Другим примером являются глубоководные морские микроорганизмы, которые подвержены воздействию постоянных низких температур, не испытывая их резких колебаний. Поэтому совокупность клеточных реакций, необходимых для адаптации психротолерантных микроорганизмов универсальной, к а резкому различается снижению для температуры, различных не является экологических групп психротрофов (Casanueva et al., 2010). Некоторые из них приведены ниже. 27 2.2.1 Изменение структуры и функций компонентов мембраны Поскольку именно оболочка клетки подвергается в первую очередь воздействию изменений окружающей среды, резонно предполагать в ней наличие сенсоров для восприятия низкой температуры. Современная гипотеза сводится к тому, что ригидификация наружной мембраны, происходящая при снижении температуры, затрагивает структуру заякоренных в ней белков, меняя их функцию (Los et al., 1993). Липидный бислой мембраны (за исключением некоторых термофильных архей с монослойной мембраной) в функциональном состоянии находится в жидкокристаллической фазе. Снижение температуры приводит к переходу липидного бислоя в фазу геля, что сопровождается уменьшением активности мембрансвязанных ферментов, снижением скорости латеральной диффузии периферических и образованием кластеров интегральных белков мембраны (Chattopadhyay, 2006). Температура, при которой совершается фазовый переход, зависит от нескольких факторов, важнейшим из которых является состав жирных кислот липидов. 2.2.1.1 Роль изменения жирнокислотного состава липидов мембраны Многие прокариоты приспособились изменять состав жирных кислот липидов таким образом, чтобы вязкость мембраны не увеличивалась при понижении температуры окружающей среды. Эта способность называется гомовискозной адаптацией (Becker et al., 1996). Состав жирных кислот липидов влияет на плотность их упаковки, от которого, в свою очередь, зависит температура фазового перехода. Чем выше плотность упаковки, тем выше температура фазового перехода, и наоборот. Поэтому при адаптации к холоду имеют значение изменения жирнокислотного состава, которые направлены на снижение плотности упаковки «хвостов» фосфолипидов в бислое мембран. Известно несколько таких механизмов. Это введение двойной связи специфической десатуразой, укорочение, разветвление цепи жирной кислоты, а также изменение 28 соотношений жирных кислот с цис- и транс-конформацией двойной связи, с помощью цис-транс изомеразы, изо- и антеизо-разветвлением (Suutari and Laasko, 1994). Так, повышение синтеза ненасыщенных жирных кислот при пониженных температурах наблюдали у грамположительных бактерий (Micrococcus roseus) и у грамотрицательных (Sphingobacterium antarcticus) (Chattopadhyay and Jagannadham, 2001). Роль десатуразы для роста антарктических цианобактерий при низких температурах была показана в работе Чинталапати и других (Chintalapati et al., 2004). Уменьшение способности к текучести клеточной мембраны при увеличении насыщенных транс-изомеров жирных кислот было показано на антарктическом штамме Pseudomonas syringae (Kiran et al., 2005). Ген, кодирующий цис-транс изомеразу, экспрессируется конститутивно независимо от температуры культивирования, что предполагает посттранскриптомную регуляцию уровня синтеза цис-транс изомеразы (Kiran et al., 2005). При культивировании P. syringae при пониженных температурах было также показано, что повышение количества жирных гидроксикислот в липополисахаридах приводило к увеличению текучести мембраны (Kumar et al., 2002). Размер и заряд полярных групп липидов также влияет на плотность упаковки глицерофосфолипидов и, таким образом, на текучесть мембраны. Эти изменения приводят к снижению плотности упаковки компонентов мембраны, что было показано для B. caldotenax (Hasegawa et al., 1980). 2.2.1.2 Роль каротиноидов Исследования in vitro показали, что каротиноидные пигменты взаимодействуют с мембраной клетки и увеличивают ее жесткость (Jagannadham et al., 1991, 1996, 2000; Chattopadhyay et al., 1997). Многие антарктические бактерии содержат в мембране пигменты каротиноидной природы. Известно, что полярные каротиноиды уменьшают текучесть мембраны, за счет связывания липидов и увеличения их ригидности (Subczynski et al., 1992). Это натолкнуло исследователей на мысль об их возможной роли в поддержании текучести мембраны. И действительно, для 29 антарктических изолятов S. antarcticus и M. roseus показано, что соотношение различных каротиноидов мембраны зависит от температуры культивирования: при низкой температуре возрастало содержание полярных пигментов каротиноидов с одновременным уменьшением неполярных (Chattopadhyay, 2006). Поэтому предполагается, что синтез жирных кислот направленных на повышение текучести мембраны и полярных каротиноидов уменьшающих ее являются двумя уравновешивающими процессами (Chattopadhyay, 2006). 2.2.2 Синтез белков теплового шока Белки теплового шока (HSP) представляют собой группу широко распространенных в организмах белков, защищающих их от теплового стресса, однако некоторые из них способствуют выживанию бактерий при низких температурах. Показано, что к увеличению выживаемости клеток E. coli при хранении при температуре -80°С приводит прогрев перед этим суспензии клеток при 42° С в течение 30 мин.Установлено, что при таком прогреве индуцируется синтез некоторых HSP-белков (Chow and Tang, 1998). При переносе цианобактерии Synecoccus sp. PCC 7942 с 37 в 25°С уровень HSP-белка Clp B увеличивался в 5-6 раз. Рост и фотосинтетическая активность мутанта, лишенного этого белка, значительно снижались (Porankiewicz and Clarke, 1997). Аналогичные результаты были получены для белка Htp G, являющегося прокариотическим гомологом хорошо известного белка теплового шока Hsp 90 (Hossain and Nakamoto, 2002). Ранее с помощью сайтнаправленного мутагенеза было показано, что этот белок необходим Synecoccus sp. PCC 7942 при культивировании при 45°С. Мутантный штамм, лишенный HtpG, прекращал рост после 20 часов культивирования при температуре 16°C, а дикий тип при этом сохранял медленный рост (Hossain and Nakamoto, 2002). При изменении температуры культивирования с 30 до 16°С, фотосинтетическая активность штаммов снижалась в случае дикого штамма на 20, а в случае мутанта более чем на 20%. У дикого типа 30 активность в течение 5 суток оставалась на том же уровне (80%), а у мутанта продолжала снижаться. С помощью Вестерн-блоттинга была показана высокая индукция Htp G при культивировании при 16°С у дикого штамма и его отсутствие у мутантного варианта. Отсюда следует, что и Clp B и Htp G играют значительную роль в способности к акклиматизации Synechococcus sp., PCC 7942 при пониженных температурах. Индукция некоторых молекулярных шаперонов (Hsc B, Hsc 25, триггер-фактор) повышается при снижении температуры (Yamanaka, 1999; Kawahara et al., 2000). Индукция Hsc 66, гомолога белка теплового шока HSP 70, синтезируемого в E.coli, вызывается не только тепловым, но и холодовым шоком (Lelivelt and Kawula, 1995). Таким образом, белки теплового шока играют важную роль в адаптации бактерий к холоду. Это не удивительно, так как белки теплового шока индуцируются не только при повышении температуры, но и при других стрессовых факторах. Многие белки теплового шока являются шаперонами, стабилизирующими белки в правильной конформации при различном стрессе. Они также помогают рефолдингу белков и их растворению в случае агрегации. Все это необходимо не только в случае теплового, но и холодового шока. 2.2.3 Белки холодового шока Холодовой шок – это действие, которое оказывает на клетку резкое снижение температуры. Ответом на холодовой шок называется сумма клеточных реакций, необходимых для эффективной адаптации к снижению температуры окружающей среды (Weber and Marahiel, 2003). В отличие от теплового шока, этот ответ запускается только при резком снижении температуры и отсутствует при воздействии других стрессовых факторов. Наиболее подробно ответ на холодовой шок исследован у бактерии E. coli (Thieringer et al., 1998), в том числе с помощью протеомных и геномных исследований. Показано, что к белкам холодового шока относятся небольшие по размеру (около 70 аминокислотных остатков) консервативные белки, имеющие домен связывания с нуклеиновыми кислотами. Гены, кодирующие 31 белки холодового шока, идентифицированы у различных психрофильных, мезофильных, термофильных и даже гипертермофильных бактерий, включая такие как Thermotoga и Aquifex, что говорит о древнем происхождении этой группы белков (Graumann and Marahiel, 1998). Белки, синтезируемые исключительно в психрофильных микроорганизмах в ответ на понижение температуры, были названы Cap (cold acclimation proteins). Белки холодового шока, идентифицированные в E. coli, включали гистоподобные белки, субъединицу ДНК - гиразы, РНК связывающие белки, факторы транскрипции, триггер-фактор и др. Один из основных белков холодового шока CspA выполняет в клетках E. coli функции активатора транскрипции и РНК-шаперона. Гомологи гена, кодирующего белок, обнаружены в геноме нескольких антарктических бактерий (Chattopadhyay, 2006). Но роль белков холодового шока в адаптации психрофильных микроорганизмов к низким температурам требует дальнейшего детального изучения. 2.2.4 Криопротекторы: белки и органические осмолиты Органические осмолиты - это низкомолекулярные органические вещества. Наиболее распространенными являются многоатомные спирты, полиамины, сахара, аминокислоты и их производные. Предполагается, что они действуют как «химические шапероны», стабилизируя нативную структуру белков и предотвращая их агрегацию или денатурацию. Накопление осмолитов в цитоплазме ведет к увеличению ее вязкости, уменьшению скорости диффузии и снижению точки замерзания (Weber and Marahiel, 2003). Антифризные белки (АБ) - разнообразная по структуре группа белков, которые способны снижать точку замерзания воды в клетке, связываясь с кристаллами льда и замедляя их рост (Gilbert et al., 2004). Впервые высокомолекулярные антифризные соединения в крови некоторых рыб Арктики обнаружены Шоландером и его сотрудниками (Scholander et al., 1957). Дальнейшие исследования показали, что эти антифризные соединения имеют белковую природу (De Vries and Wohlschlag, 32 1969). Сейчас известно, что AFPs, выделенные из различных источников, значительно различаются по структуре и активности. Согласно современным представлениям, AFPs по эффективности действия можно разделить на три группы: 1. ―Очень слабые‖ AFPs, основная функция которых заключается в ингибировании рекристаллизации, вследствие их чрезвычайно слабой термогистерезисной активности. К представителям этой группы относится белки некоторых растений (Huang and Duman., 2002; Pudney et al., 2003; Smallwood et al., 1999). 2. Умеренно активные AFPs. К этой группе относится большинство известных AFPs I–III типов и антифризные гликопротеиды рыб, бактерий и т.д. Подробная характеристика представителей этой многочисленной группы представлена в обзоре, посвященном распространению антифризных белков в природе (Гулевский и Релина, 2009). 3. Гиперактивные AFPs, к которым относят AFP камбалы, некоторые AFPs бактерий и насекомых. Впервые присутствие белка, приводящего к термальному гистерезису (TH), в бактериях была продемонстрирована Думаном и Олсеном (Duman and Olsen, 1993), а штамм Moraxella sp. стал первым продуцентом AFP (Yamashita et al., 2002). С тех пор антифризная активность была обнаружена в целом ряде бактерий, значительная часть которых представляет собой антарктические изоляты, что прямо указывает на роль AFPs в холодовой адаптации бактерий. Клонированы и охарактеризованы антифризные белки были из Flavobacteriaceae (Raymond et al., 2008), Colwellia (Raymond et al., 2007), Marinomonas primoryensis (Gilbert et al., 2005) и Pseudomonas putida (Xu et al., 1998; Kawahara et al.,2001). Антифризные белки также обнаружены у Flavobacterium xanthum (Kawahara et al., 2007), Chryseobacterium (Walker et al., 2006), Micrococcus cryophilus и Rhodococcus erythropolis (Duman and Olsen, 1993). Среди исследованных культивируемых бактерий из антарктических озер только 19 из 866 штаммов (2.1%) обладали антифризной 33 активностью, причем из 19 изолятов 18 принадлежали к γ-протеобактериям и только 1 - к α-протеобактериям (Gilbert et al., 2004). Обнаружение AFPs с высокой активностью в клетках бактерий различных физиологических групп указывает на существенную роль этих белков в адаптации к низким температурам. 2.2.5 Холодоактивные белки Одной из главных проблем, с которой сталкиваются микроорганизмы в холодных местах обитания, является поддержание скорости ферментативных реакций. Это достигается за счет так называемых холодоактивных ферментов, способных осуществлять катализ при низких температурах (Feller and Gerday, 2003). К настоящему времени выделено и охарактеризовано большое число ферментов психрофильных и психротрофных микроорганизмов. Это ферменты, относящиеся к разным семействам, среди них: ДНК-зависимая РНК-полимеразы, рибонуклеазы, щелочные фосфатазы, α-амилазы, β-галактозидазы, аминопептидазы, липазы и др. (D'Amico et al., 2002). Известно, что реакции, катализируемые ими, характеризуются меньшими значениями энергии активации (∆G). Еще более важным является то, что такие реакции происходят с небольшим изменением энтальпии (∆Н), что показывает меньшую зависимость активности холодоактивных ферментов от температуры. Это достигается за счет того, что при активации разрывается меньше взаимодействий, зависящих от энтальпии (Somero, 1995; Lonhienne et al., 2000). Сравнение аминокислотых последовательностей одних и тех же белков, но выделенных из мезофильных и психрофильных микроорганизмов позволило установить структурные особенности холодоактивных белков. Так в белках, активных при низких температурах, по сравнению с мезофильными, уменьшено количество остатков аргинина и пролина, уменьшено соотношение Arg/Arg+Lys, снижено число гидрофобных остатков и дисульфидных мостиков, а число полярных остатков повышено (D‘Amico 34 et al., 2002). Более подробно особенности структуры холодоактивных ферментов описаны в разделе 3.3. 2.2.6 Анализ геномов и протеомов психрофилов Современное представление о молекулярных способах адаптации микроорганизмов к существованию в условиях пониженной температуры формируется на основе анализа 1) геномных последовательностей отдельных психрофильных микроорганизмов, протеомного анализа психрофилов. а также 2) метагеномного и 3) К настоящему времени установлены полные геномные последовательности 30 психроактивных микроорганизмов. Некоторые из них представлены в Таблице 4. Также доступен существенный объем данных метагеномного анализа геномных последовательностей, полученных из различных холодных местообитаний (Casanueva et al., 2010). Функциональный скрининг этих библиотек позволил идентифицировать несколько генов, кодирующих липазы, эстеразы и целлюлазы, адаптированные к низким температурам (Jeon et al., 2009; Berlemont et al., 2009). На основе метагеномного анализа установлено, что ферменты, адаптированные к низким температурам, содержат меньше остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, аргинина и пролина. Они также содержат меньше гидрофобных аминокислот и внутримолекулярных ионных связей. Все эти особенности направлены на увеличение конформационной энтропии. Метагеномный анализ образцов выявил большое количество генов, ледникового происхождения ответственных за синтез криопротекторов, таких как глицин, бетаин, холин, саркозин и глютамат. Обнаружены также гены, продукты которых обеспечивают эластичность мембраны. К ним относятся гены, кодирующие ферменты, ответственные за синтез ненасыщенных жирных кислот, а также десатуразу, осуществляющую превращение насыщенных жирных кислот в ненасыщенные (Simon et al., 2009). 35 Анализ особенностей аминокислотного состава белков психрофилов показал результаты, сходные с полученными для метагеномного анализа. У психроактивных микроорганизмов повышен уровень неионных полярных аминокислот (преимущественно глутамина и треонина), и понижено содержание гидрофобных аминокислот, например, лейцина в белках. Белки психрофильных архей содержат больше глутамина, треонина и гидрофобных остатков аминокислот в участках, контактирующих со средой (Methe et al., 2005). Эти факты подтверждают гипотезу, что повышенная конформационная гибкость и пониженная термостабильность способствуют адаптации ферментов к низким температурам. Повышенная растворимость кислорода при низких температурах увеличивает риск повреждения ДНК свободными радикалами. Для защиты от него Colwellia psychrerythraea имеет три копии гена каталазы. Этот микроорганизм содержит также гены двух разных супероксиддисмутаз, одну из которых, содержащую никель, ранее не обнаруживали в протеобактериях. Геном Desulfotalia psychrophila содержит гены, кодирующие каталазу и супероксиддисмутазу, микроорганизм обычно также имеет отсутствующие гены в рубреритрина анаэробах. и Этот рубредоксин оксидоредуктазы в качестве запасной системы защиты от окислительного стресса (Rabus et al., 2004). Протеомный анализ выявил у психрофилов большое количество генов, экспрессия которых индуцируется при низких температурах. К примеру, у Methanococcoides burtonii белки, адаптированные к холоду, участвуют в репликации ДНК и делении клетки, в РНК-полимеразном комплексе, в формировании вторичной структуры белков, в метаногенезе, транспозиции генов и сигнализации (Goodchild et al., 2004). Данные геномных, метагеномных и протеомных анализов позволяют утверждать, что способность микроорганизмов к существованию при низких температурах основана не на уникальном наборе каких-то особенных генов, а на общем изменении всего генома и состава аминокислот (Methe et al., 2005). 36 ГЛАВА 3 ХОЛОДОАКТИВНЫЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ 3.1 Основные свойства и биологические функции липолитических ферментов Липидоразлагающие ферменты не только играют важную роль в метаболизме организмов, но и являются привлекательным объектом биотехнологии из-за потенциальной возможности их применения для синтеза новых соединений, которые могут быть использованы в пищевой, фармацевтической и химической промышленности (Gupta et al., 2004). Липолитические ферменты, принадлежащие к классу гидролаз, участвуют в реакциях расщепления сложноэфирной связи в липидах и других органических соединениях, а так же способны гидролизовать неэфирные связи (Buchholz et al., 2005; Sterner, 1999). На данный момент эстеразы делят на 84 класса по рекомендации Комитета по номенклатуре (Nomenclature Committe of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)) в соответствии с видом связи и субстрата, участвующих в реакции гидролиза. Гидролазы карбоксильных эфиров, расщепляющие ацилглицеролы с образованием глицерина и жирных кислот, называются липазами (Gupta et al., 2004; Testa and Mayer, 2003). Липазы встречаются в тканях животных, растений, а также у микроорганизмов, включая грибы, бактерии и археи (Bornscheuer, 2002; Hasan et al., 2006). Для большинства все физиологические функции до конца не ясны, но основная их функция - участие в трансформации липидов (Pandey et al., 1999). Микробные липазы обладают широкой субстратной специфичностью, что обеспечивает продуцирующие их микроорганизмы питательными веществами из различных источников (Bornscheuer, 2002; Gunstone, 1999; Sharma et al., 2001). Некоторые липазы также участвуют в преобразовании мембранных липидов, в клеточной сигнализации, в контролируемой деградации внутриклеточных вакуолей, в цитолизе (Schmid 37 and Verger, 1998; Titball, 1998), в детоксикации биоцидов и загрязняющих веществ (Khalameyzer et al., 1999; Margesin et al., 2003), а также в патогенезе, выступая в качестве факторов вирулентности (Jaeger et al., 1994;Stehr et al., 2003). Были разработаны различные критерии, чтобы отличать триацилглицерол-липазы или настоящие липазы (ТЛ, КФ 3.1.1.3) от карбоксилэстераз или эстераз (КЭ, КФ 3.1.1.1). Однако субстратная специфичность является в настоящее время основным критерием их дифференциации (Bornscheuer, 2002; Fojan et al., 2000; Testa and Mayer, 2003). Настоящие липазы способны утилизировать длинноцепочечные ацилглицеролы и другие эфиры, в то время как эстеразы утилизируют ацилглицеролы и эфиры с короткой длиной цепи (Bornscheuer, 2002). Нет строгого определения коротких и длинных субстратов, но эфиры с длиной ацильной цепи ≥10 атомов углерода считаются субстратами липаз, при этом в качестве стандарта активности используется триолеин. Эфиры с длиной ацильной цепи <10 атомов углерода считаются субстратами эстераз, и в качестве стандарта используется трибутирин (Jaeger et al., 1999; Fojan et al., 2000). Большинство липаз способны гидролизовать субстраты для эстераз, а некоторые эстеразы гидролизуют субстраты с длинной углеводородной цепью (Fojan et al., 2000; Jaeger et al., 1999). Липазы обладают способностью катализировать огромное число разнообразных реакций. Они катализируют гидролиз ацилглицеролов и других эфиров: простых эфиров, фосфолипидов, ацилгликозидов и др., а также катализируют обратную реакцию синтеза эфиров, перенос ацильных групп в том числе интер- и трансэтерификацию ацилглицеролов, спиртов, эфиров, гликозидов и аминов (Bornscheuer, 2002; Ferrer et al., 2000; Gupta et al., 2004; Hedfors et al., 2010; Schmidt-Dannert, 1999; Zhang et al. 2011). Липазы проводят эти реакции с высокой хемо-, регио- и энантиоселективностью, которые могут быть различны для реакций гидролиза, синтеза или переноса ацильных групп (Gotor-Fernández et al., 38 2006; Gunstone, 1999; Reetz, 2002). Количество липаз, охарактеризованных за последнее десятилетие, огромно, в том числе многие из них были исследованы с помощью рентгеновской кристаллографии и методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (Angkawidjaja et al., 2010; Breg et al., 1995; Chen et al., 2009; Fojan et al., 2000; Sibille et al., 2006). Согласно полученным данным, почти все липазы, даже имеющие низкое сходство аминокислотных последовательностей, обладают сходной пространственной структурой (Jaeger et al.,1999; Widmann et al., 2010). Эти ферменты принадлежат к обширному суперсемейству альфа/бета-гидролаз, молекулы которых характеризуются наличием центрального домена, имеющего структуру альфа/бета-сэндвича. Центральный домен включает бета-слой, образованный 5-11 бета-тяжами и фланкированный с обеих сторон альфа-спиралями (Ollis et al., 1992). Каноническая структура обычно содержит 8 бета-тяжей, второй из которых антипараллелен остальным (Рис. 3А) (Carr and Ollis, 2009; Ollis et al., 1992; Van Pouderoyen et al., 2001). Доступ к активному центру у ферментов данного семейства часто экранируется мобильной «крышкой» (lid или cap), положение которой может определять активную или неактивную конформацию фермента (Lotti et al., 1994). «Крышка » может состоять из одной или двух альфа-спиралей или образовываться петлей, в которой гидрофобная часть направлена в сторону активного центра, а гидрофильная экспонируется наружу (Cygler and Schrag, 1997; Ericsson et al., 2008; Grochulski et al., 1994; Miled et al., 2003). «Крышка» закрывает активный сайт фермента в отсутствие субстрата и сдвигается за счет структурных изменений, давая доступ субстрату и растворителю к активному центру фермента (Gao et. al., 2011; Secundo et al., 2006). Но существуют исключения. Так, панкреатическая липаза морской свинки не имеет «крышки» в своей структуре (Cygler and Schrag., 1999; Jaeger et al., 1999; Verger, 1997). 39 Наиболее консервативной особенностью альфа/бета гидролазного фолда является наличие «нуклеофильного локтя» ‒ гамма-поворота с нуклеофилом (Nu) на вершине. Конфигурация этого поворота требует наличия остатков с небольшими боковыми группами, например, глицина, в положениях Nu-2, Nu+2, Nu+3, что позволяет им располагаться на небольшом расстоянии от субстрата и участвовать в формировании так называемой оксианионной полости. Данный участок, стабилизирующий отрицательно заряженное переходное состояние в процессе гидролиза, обычно образуется двумя атомами азота основной цепи, один из которых принадлежит остатку, следующему за нуклеофилом (Nu+1), а второй располагается между бета-тяжем 3 и альфа-спиралью 1. Каталитические остатки карбоксила и гистидина чаще всего расположены в петлях, следующих за бета7- и бета8-тяжами соответственно. Связывание субстрата в большинстве случаев происходит в кэп-домене, расположенном над каталитической триадой. Базовая архитектура фолда модифицируется в различных белках при помощи инсерций, не изменяющих общую структуру и каталитический механизм. Чаще всего удлиняются петли после участков бета3, бета4, бета6, бета7 или бета8 (Nardini and Dijkstra, 1999). Инсерции, длина которых может варьировать от нескольких аминокислотных остатков до целого домена, оказывают влияние на геометрию и микроокружение активного сайта, что в свою очередь создает потрясающее разнообразие субстратной специфичности и других свойств членов семейства. Активный центр альфа/бета гидролаз содержит остатки, образующие каталитическую триаду: нуклеофил (серин, цистеин или аспартат), карбоксил (аспартат или глутамат) и остаток гистидина, всегда расположенные в таком порядке (Рис.3В) (Jaeger et al., 1999; Ollis et al., 1992). Установлено, что в липазах нуклеофилом всегда является серин, в то время как карбоксилом может быть как аспартат, так и глютамат (Bornscheuer, 2002; Cai et al., 2004; Jaeger et al., 1999; Østerlund et al., 1997). Нуклеофил серин расположен в 40 консервативном участке аминокислотной последовательности пентапептида Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (Cai et al., 2004; Ollis et al., 1992). Активный сайт липаз содержит карман связывания жирных кислот, ответственный за размещение ацильной цепи сложных эфиров. Существуют и дополнительные карманы связывания для ацильных цепей других субстратов, таких как триацилглицеролы (ТАГ), предназначенные для удержания субстрата вблизи активного центра в процессе катализа (Jaeger et al., 1999). Рис. 3 А) Схематическое изображение канонического альфа/бета гидролазного фолда. Цифрами (1-8) обозначены бета-тяжи, буквами (A-E) обозначены фланкирующие их альфа-спирали, звездочками обозначены каталитические остатки. В) Пространственная структура карбоксилэстеразы Archeoglobus fulgidus. Показаны каталитические остатки Ser160, His285 и Asp255. Из (Tutino et al., 2010). 41 3.2 Классификация бактериальных липаз Классификация ферментов основана как на их субстратной специфичности, так и на сходстве аминокислотных последовательностей. В первом случае требуется, чтобы ферменты были проанализированы в схожих условиях с похожими субстратами. Это сложно, так как в различных лабораториях используется большое количество разных субстратов и методов для определения их активности. Повышение доступности информации в открытых базах данных позволяет проводить сравнение аминокислотных последовательностей белков, которое дает более четкое представление о сходстве и эволюционных взаимоотношениях между липазами. Таким образом, классификации, основанные на сравнении сходства последовательностей, наиболее часто используются в настоящее время, хотя и имеют некоторые ограничения. Сходство последовательностей не всегда может быть связано с ферментативными свойствами липаз, такими как субстратная специфичность, стереоселективность, рН и температурный оптимумы и т.д. Кроме того, некоторые липазы демонстрируют значительное сходство последовательностей с другими нелиполитическими ферментами, что затрудняет интерпретацию данных (Bornscheuer, 2002). Наиболее широко употребляемую классификацию разработали Arpigny и Jaeger (1999). Они разделили бактериальные липазы на 8 семейств, базируясь на консервативных мотивах в аминокислотных последовательностях и на биологических свойствах 53 липаз/эстераз. В дальнейшем была предложена более подробная классификация, включающая разделение семейства I на 6-7 подсемейств (Jaeger and Eggert, 2002; Nthangeni et al., 2001). Семейство I включает в себя липазы грамотрицательных и грамположительных бактерий, большинство из которых относится к настоящим липазам (ТЛ). Подсемейства I.1, I.2 и I.3 включают в себя настоящие липазы с молекулярной массой 30-32 кДа из Pseudomonas sp. и других грамотрицательных бактерий. Липазы подсемейств I.1 и I.2 имеют 42 сигнальную последовательность и секретируются с использованием системы секреции II типа (Sec-Xcp система). Для стабилизации их активного сайта требуется наличие двух остатков аспарагиновой кислоты в сайте связывания Ca2+, а для их фолдинга и секреции необходимы белки Lif и Dsb соответственно. Установлено, что Lif-белки или фолдазы обычно кодируются тем же опероном, что и соответствующая липаза. Они представляют собой уникальное семейство белков, имеющих очень небольшое сходство с белками других классов (Rosenau et al., 2004). На данный момент эти белки разделены на 4 семейства. Семейство I объединяет Lif-белки из Pseudomonas aeruginosa, P. mendocina, P. wisconsinensis и P. alcaligenes; семейство II включает в себя Lif-белки из Burkhordelia cepacia, B.glumae, P. fragi, Xylella fastidosa и Ralstonia metallidurans; семейство III Lif-белки из Acinetobacter calcoaceticus, а Lif-белки из Pseudomonas sp. штамм KFCC10818, Vibrio cholerae и V. vulnificus объединяют в отдельное семейство IV из-за их значительных отличий от других Lif-белков. Показано, что все фолдазы обладают сходной вторичной структурой, состоящей на 70% из α-спиралей и на 30% из других элементов. Наличие рядом с N-концом трансмембранного гидрофобного участка также характерно для всех фолдаз. Установлено, что этот участок отвечает за заякоривание Lif во внутренней мембране и экспонирование их в периплазматическое пространство. Укороченные с N-конца фолдазы сохраняют способность к фолдингу липаз in vitro, что указывает на то, что мембранный якорь не играет роль в фолдинге. В то время как делеционные с C-конца варианты ее утрачивали, демонстрируя, что необходимые для фолдинга липаз участки расположены в С-домене. Было также показано, что C-домен отвечает не только за фолдинг, но и за липазоспецифичность фолдаз и что только Lif и липазы близкородственных организмов могут взаимодействовать между собой. Фолдазы относятся к стерическим шаперонам, то есть к шаперонам, отвечающим за стерическую конформацию 43 их целевых белков и помогающим липазам преодолеть энергетический барьер при переходе липазы из неактивной в активную форму. Так же предполагают, что фолдазы участвуют в секреции липаз. Многие функции шаперонов Lif еще не изучены (Rosenau et al., 2004). Липолитические ферменты подсемейства I.3 не имеют сигнальной последовательности на N-конце и остатков цистеина и секретируются по I пути (ABC система) (Arpigny and Jaeger, 1999). Подсемейства I.4 и I.5 включают в себя секретируемые липазы бактерий родов Bacillus и Geobacillus. У этих липаз в консервативном пентапептиде, содержащем серин из каталитической триады, обычно глицин заменен на аланин (Ala-Xaa-Ser-Xaa-Gly). К подсемейству I.4 относятся липазы из мезофильных видов Bacillus. Это самые маленькие из известных липаз (~20 кДа), имеющие очень небольшое сходство аминокислотных последовательностей с липазами других Bacillus. Липазы термо- и алкалофильных видов Geobacillus имеют молекулярную массу около 45 кДа и максимальную активность при pH 9.0 и температуре 65°C (Arpigny and Jaeger, 1999; Jaeger and Eggert, 2002). Подсемейство I.6 объединяет липазы Staphylococcus, большие ферменты около 75 кДа, секретируемые в виде предшественников. Пропептид (~260 остатков) - внутримолекулярный шаперон, облегчающий фолдинг и секрецию липазы, отщепляется во внеклеточном пространстве специфической протеазой с образованием зрелого белка (~400 остатков). Известно, что липаза из S. hyicus обладает также значительной фосфолипазной активностью, что является уникальной особенностью для ТЛ (Arpigny and Jaeger, 1999). Подсемейство I.7 включает в себя очень схожие между собой липазы из Propionibacter acnes (339 остатков) и из Streptomyces cinnamoneus (275остатков). Их центральный домен (50−150 остатков) имеет 50% сходство с липазами из подсемейства I.2 и маленькими липазами Bacillus subtilis, принадлежащие подсемейству I.4 (Arpigny and Jaeger, 1999). 44 Ферменты, относящиеся к семейству II (GDSL семейство), не содержат консервативный пентапептид Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly. Вместо этого у них присутствует мотив Gly-Asp-Ser-(Leu) или GDS(L), содержащий серин из активного центра, который располагается гораздо ближе к N-концу, чем у других липаз. К этому семейству относится необычная эстераза из Streptomyces scabies, имеющая каталитическую диаду (Arpigny and Jaeger, 1999). Семейство включает III в себя внеклеточные липазы из психрофильных видов Moraxella sp. и нескольких Streptomyces sp. Семейство IV называется семейством гормончувствительной липазы (HSL) из-за сходства фрагментов аминокислотных последовательностей входящих в него белков с последовательностями гормончувствительных липаз млекопитающих. Предполагалось, что эти сходные последовательности ответственны за адаптацию к холоду, однако это семейство включает в себя также липазы из мезофильных и термофильных бактерий (Arpigny and Jaeger, 1999; Bornscheuer, 2002). Ферменты, принадлежащие к V семейству, также выделены из психрофильных и мезофильных бактерий. Их аминокислотные последовательности на 20-25% сходны с последовательностями других нелиполитических бактериальных ферментов, имеющих α/β – гидролазный фолд и каталитическую триаду: эпоксидных гидролаз, дегалогеназ и галопероксидаз. Ферменты карбоксилэстеразы (М. семейства VI м. 23-26 кДа), самые - маленькие обнаруживающие сходство аминокислотных последовательностей с лизофосфолипазами эукариот (около 40%) (Arpigny and Jaeger, 1999). VII семейство включает в себя эстеразы большого размера (50-65 ацетилхолинэстеразами кДа), и родственные кишечными с эукариотическими и печеночными карбоксилэстеразами.VIII семейство образовано всего тремя ферментами размером около 380 аминокислотных остатков, имеющими сильное сходство с некоторыми β – лактамазами класса С. У двух из них каталитический гистидин не следует после консервативного мотива 45 Gly-Xaa-Ser-Ala-Gly, который располагается ближе к С-концу белка, что отличает эти белки от других липаз/эстераз (Arpigny and Jaeger, 1999; Bornscheuer, 2002). 3.3 Особенности структуры холодоактивных липолитических ферментов Известно, что реакции, катализируемые холодоактивными ферментами, характеризуются меньшими значениями энергии активации (∆G). Еще более важным является то, что такие реакции происходят с небольшим изменением энтальпии (∆Н), что показывает меньшую зависимость активности холодоактивных ферментов от температуры. Это достигается за счет того, что при активации разрывается меньше взаимодействий, зависящих от энтальпии (Somero, 1995; Lonhienne et al., 2000). Поскольку эти взаимодействия вносят существенный вклад в конформацию активного центра, из этого следует, что активный центр холодоактивных ферментов должен быть менее стабильным и, как следствие, более термолабильным, чем у мезофильных ферментов. Действительно, характерной чертой холодоактивных ферментов является то, что константа скорости их инактивации на несколько порядков выше, чем у мезофильных гомологов. Кроме того, психрофильные ферменты инактивируются при температурах, которые намного ниже, чем температура их денатурации, что также указывает на наличие нестабильного активного центра или промежуточных продуктов катализа (D‘Amico et al, 2003; Collins et al, 2003). Этот факт иллюстрирует основную мысль в концепции активности психрофильных ферментов: локализованное увеличение пластичности молекулы в каталитическом центре ответственно за высокую, но термочувствительную активность (Fields and Somero, 1998). Холодоактивные липолитические ферменты обладают структурными особенностями, подтверждающими этот тезис. Было установлено, что эти особенности включают в себя увеличение молекулярной подвижности и усиление взаимодействия с молекулами растворителя. При помощи методов FTIR и молекулярной динамики было показано, что подвижность петли, 46 расположенной по соседству с активным центром холодоактивной эстеразы Pseudoalteromonas haloplanktis, играет ключевую роль в функционировании фермента (Aurilia et al., 2009). Молекулярное моделирование холодоактивной липазы P. immobilis позволило обнаружить наличие ряда специфических особенностей, включая пониженное содержание остатков пролина, уменьшение соотношения Arg/Arg+Lys, уменьшение размера гидрофобной сердцевины белка, взаимодействий числа (Arpigny солевых and мостиков Jaeger, 1999). и ион-дипольных Увеличение числа экспонированных заряженных остатков и сокращение числа дисульфидных мостиков характерны также для холодоактивной липазы P. fragi (Alquati et al., 2002). При этом только немногие из остатков аргинина участвуют в формировании солевых мостиков, а большая часть экспонирована на поверхности белка. Петлевые участки этого белка содержат меньше остатков пролина по сравнению с гомологами из мезофильных организмов. Важными структурными факторами, обеспечивающими адаптацию к низкотемпературным условиям, считается также увеличение числа и кластеризация остатков глицина, обеспечивающих локальную подвижность; снижение числа ионных пар и ослабление заряд-дипольных взаимодействий в α-спиралях (Georlette et al., 2004; Gomes and Steiner, 2004). Замена остатка глицина на пролин вблизи активного центра эстеразы Psychrobacter sp.Ant300 при помощи сайт-направленного мутагенеза привела к сдвигу ее субстратной специфичности и повышению термостабильности (Kulakova et al., 2004). Замена остатка серина в составе «крышки» липазы P. fragi глицином сопровождалась дестабилизацией белка (Santarossa et al., 2005). Пространственная структура ряда холодоактивных липаз установлена с помощью метода рентгеноструктурного анализа (Aghajari et al., 1998). Показано, что при сохранении общей с мезофильными гомологами конфигурации молекулы для белков психрофилов характерно наличие более гибкой структуры, обусловленной повышением экспонированности гидрофобных участков, уменьшением гидрофобной сердцевины молекулы, 47 ослаблением внутримолекулярных связей (Georlette et al., 2004; D‘Amico et al., 2002). Так, при сравнении пространственных структур холодоактивной липазы М37 Photobacterium lipolyticum и гомологичной липазы Rhizomucor miehei (RML) обнаружилось, что участок М37, расположенный непосредственно под «крышкой», содержит уникальную полость большого размера, которая может разместить одну из спиралей при связывании субстрата (Jung et al., 2008). Размер оксианионной полости этого фермента также оказался значительно больше. Такие особенности данной липазы, по мнению авторов, могут облегчать латеральную подвижность «крышки» и последующий гидролиз субстрата, что объясняет низкую энергию активации и высокую активность при низких температурах. 3.4 Продуценты холодоактивных липаз Холодоактивные липазы широко распространены у микроорганизмов, выживающих при температурах около 5ºС. Несмотря на то, что существует много продуцентов липаз, только из нескольких бактерий и грибов были выделены холодоактивные липазы (Joseph, 2006). В таблице приведены примеры некоторых известных психрофильных и психротрофных бактерий – продуцентов липаз (Табл. 5). Микробные ферменты зачастую более удобны, чем ферменты, полученные из растений или животных из-за их большего разнообразия, более высоких выходов, простоты генетических манипуляций, независимости роста от сезонных колебаний и возможности выращивания микроорганизмов на недорогих микробиологических средах. Микробные ферменты также часто более стабильны, чем соответствующие энзимы, полученные из животных или растений, а их производство более выгодно и безопасно (Wiseman, 1995). Психрофильные и психротрофные бактерии - продуценты липаз в основном были выделены из местообитаний приуроченных к Южному и Северному полюсам Земли, где температура колеблется около 0°C. Другим потенциальным источником холодоактивных липаз являлись глубоководные морские бактерии. Например, бактерии следующих родов были выделены и 48 охарактеризованы как потенциальные продуценты холодоактивных липаз: Aeromonas sp. (Lee et al., 2003); Pseudoalteromonas sp. и Psychrobacter sp. (Zeng et al., 2004); Photobacterium lipolyticum (Ryu et al., 2006). Психрофильные микроорганизмы, продуцирующие липазы, были также выделены из почв и ледников высокогорных районов (Joseph, 2006). Потенциальным источником липазопродуцирующих микрорганизмов являются холодильные установки для хранения продуктов. Бактерии родов P. fragi (Aoyama et al., 1988; Alquati et al., 2002), P. fluorescens (Dieckelmann et al.,1998) and Serratia marcences (Abdou, 2003), обладающие липолитической активностью были изолированы из замороженных продуктов. В отличие от бактериальных известно только несколько грибных холодоактивных липаз (Табл. 6), продуцируемых Candida antarctica, Candida lipolytica, Geotrichum candidum и Pencillium roqueforti (Alford and Pierce, 1961). Было показано, что плесневые липолитические грибы Rhizopus sp. и Mucor sp. являются причиной порчи молока и других молочных продуктов (Coenen et al., 1997). Из приведенных выше примеров видно, что основными полученными и изученными продуцентами холодоактивных ферментов являются микроорганизмы - психрофилы, чей температурный оптимум лежит ниже 15ºС. Исследователи этих ферментов часто сталкиваются с проблемой их нестабильности при более высоких температурах. В то время как микроорганизмы из вечной мерзлоты, в том числе из криопэгов (Gilichinsky et al., 2005), в большинстве своем относятся к психротрофам, чей температурный оптимум лежит выше 15ºС. Это делает их потенциальными продуцентами более перспективных холодоактивных ферментов, предположительно обладающих повышенной стабильностью и активностью в более широком температурном диапазоне. 49 Таблица 5. Бактерии- продуценты холодоактивных липаз (адапт. Joseph et al., 2007). Организм Acinetobacter sp. strain No. 6 Acinetobacter sp. strain No. O16 Источник выделения Тундровая почва Сибири н/о Achromobacter lipolyticum Aeromonas sp. strain No. LPB 4 Aeromonas hydrophila н/о Морские осадки Морские воды Bacillus sphaericus MTCC 7526 Ледник Ганготри (Западные Гималаи) Microbacterium phyllosphaerae MTCC 7530 Организм Moraxella sp. Moraxella sp. TA144 Photobacterium lipolyticum M37 Pseudoalteromonas sp. wp27 Pseudoalteromonas sp. Psychrobacter sp. Vibrio sp. Pseudomonas sp. strain KB700A Pseudomonas sp. B11-1 Pseudomonas sp. P38 Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fragi strain No. IFO 3458 Pseudomonas fragi strain No. IFO 12049 Psychrobacter sp. wp37 Psychrobacter okhotskensis Psychrobacter sp. Ant300 Psychrobacter immobilis B10 Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis н/о – не определялось. Источник выделения Антарктида Антарктида Морские воды Глубоководные морские осадки Воды Антарктиды Ссылка Feller et al., 1990 Feller et al., 1991 Ryu et al., 2006 Zeng et al., 2004 Giudice et al., 2006 Подпочвенные осадки Почва Аляски н/о Охлажденное молоко Rashid et al., 2001 Choo et al., 1998 Tan et al., 1996 Dieckelmann et al., 1998 Andersson et al., 1980 Preuss et al., 2001 Alquati et al., 2002 Охлажденная пища Pseudomonas fluorescens strain Ссылка Suzuki et al., 2001 Breuli and Kushner, 1975 Khan et al., 1967 Lee et al., 2003 Pemberton et al., 1997 Joseph, 2006 Охлажденная плацента человека BCCMTM/ LMG2191T н/о Глубоководные морские осадки Морское побережье Антарктида Антарктида Сырое молоко н/о Замороженная рыба 50 Aoyama et al., 1988 Zeng et al., 2004 Yumoto et al., 2003 Kulakova et al., 2004 Arpigny et al., 1997 Abdou et al., 2003 Alford and Pierce, 1961 Joseph et al., 2006 Таблица 6. Грибы-продуценты холодоактивных липаз. Организм Источник выделения Ссылка Aspergillus nidulans н/о Mayordomo et al., 2000 Candida antarctica Антарктида Patkaretal., 1993 Candida lipolytica Замороженная пища Alford and Pierce, 1961 Geotrichum candidum Замороженная пища Alford and Pierce, 1961 Penicillium roqueforti Замороженная пища Alford and Pierce, 1961 Rhisopus sp. Замороженная пища Coenen et al., 1997 Mucorsp. Замороженная пища Coenen et al., 1997 В частности, для очистки рекомбинантных белков, содержащих гексагистидиновую последовательность, широко применяется метод металлоаффинной хроматографии на носителе с иммобилизованными ионами металлов (никеля, кобальта и других). 3.5 Методы определения активности липаз Определение липолитической активности затруднено в связи с тем, что липазы, являясь водорастворимыми ферментами, взаимодействуют с нерастворимыми в воде субстратами (Kanchana et al., 2011; Redondo et al., 1995; Verger, 1997). По этой причине такие факторы, как концентрация субстрата на межфазовой поверхности и присутствие детергентов, должны учитываться при расчете активности и кинетики липаз. Было описано много методов определения липазной активности (Beisson et al., 2000; Pencreach et al., 2002; Wahler and Reymond, 2001). Эти методы отличаются способами растворения субстрата, выбором маркера и системами детекции, что затрудняет сравнение полученных результатов (Beisson et al., 2000). Многие методики не подходят для неочищенных препаратов или для большого числа образцов. Поэтому методы, основанные на использовании хромогенных или флюорогенных субстратов, получили широкое распространение как наиболее простые и дешевые (Wahler and Reymond, 2001). К наиболее известным методам определения липазной активности относятся качественный чашечный метод, основанный на детектировании 51 различными способами (с помощью рН индикаторов или флюорофоров) образования жирных кислот из жирнокислотных субстратов, добавленных в агаризованную среду, и количественный метод, основанный на детекции паранитрофенола с помощью УФ-спектрометрии, высвобождаемого липазами при утилизации синтетических субстратов - п-нитрофениловых эфиров жирных кислот (Gupta et al., 2003). 3.6 Применение холодоактивных липолитических ферментов в биотехнологии Различные возможности применения холодоактивных липаз основаны на их способности эффективно катализировать реакции при низких температурах. Эти холодоактивные ферменты могут быть использованы в широком спектре биотехнологических производств (Табл. 7), поэтому можно ожидать, что доля холодоактивных липаз на рынке индустриальных ферментов будет увеличиваться. Области их применения включают производство стиральных порошков, пищевую промышленность (производство сыров, хлебобулочных изделий и т.д.), биоремедиацию и молекулярно- биологические исследования (Feller et al., 1996). Холодоактивные липазы, обладая низкой термостабильностью, могут быть инактивированы при относительно невысокой температуре. Это свойство может быть использовано, например, в пищевой промышленности, при этом производимый продукт не будет повреждаться высокой температурой (Margesin et al., 2002). Холодоактивные липазы могли бы быть хорошей альтернативой мезофильным ферментам в пивоварении, виноделии, при производстве сыров и кормовых добавок животным (Collins et al., 2002). Так же их можно было бы использовать в производстве рыбных продуктов, в парфюмерии и при синтезе оптически активных сложных эфиров (Cavicchioli and Siddiqui, 2004). 52 Таблица 7. Применение холодоактивных липаз в биотехнологии (адапт. Joseph et al., 2007). Область Цель применения применения Медицина и Синтез арилалифатических гликолипидов фармацевтика Ссылка Otto et al., 2000 Этилэстерификация докозагексаеновой Shimada et al., 2001 кислоты до этилдокозагесаеноата Синтез цитронеллола лаурата из цитронеллола Ganapati et al., 2005 и лауриновой кислоты Тонкий химический синтез Синтез оптически активных сложных эфиров Anderson et al., 1998 Синтез сложных эфиров, получение перкислот Zhang et al., 2003 Органический синтез хиральных соединений Gerday et al., 2000 Синтез бутилкаприлата в среде н-гептана Tan et al., 1996 Синтез бутиллактата путем Pirozzi et al., 2004 трансэстерефикации Синтез амидов Slotema et al., 2003 Пищевая Полимеризация белков и желирование мяса Cavicchioli et al., промышленность рыбы, улучшение пищевой текстуры, 2002 улучшение вкуса продуктов Получение жирных кислот и Jaeger and Eggert, интерэстерификация жиров 2002 Бытовая химия Добавки в пятновыводители и стиральные Gerday et al., 2000 порошки Производство α-бутилгликозидлактата путем Bousquet et al., трансэстерификации 1999 Производство Получение биотоплива из рафинированного Watanabe et al., топлива соевого масла 2002 Синтез липазакатализированного биотоплива Chang et al., 2004 Применение экологии Таким в Очистка сточных вод масложировых комбинатов Биоремедиация Очистка от углеводородных, масляных и жировых загрязнений образом, местообитанием микроорганизмов. вечная множества мерзлота, включая Ramteke et al., 2005 Suzuki et al., 2001 Margesin et al., 2002 криопэги, жизнеспособных служит психротрофных Адаптированные к холоду микроорганизмы обладают различными механизмами выживания в условиях низкой температуры, которые включают в себя изменения в структуре и функционировании клеточной мембраны, трансляционного аппарата и ДНК, синтез криопротекторов, таких как антифризные белки и органические осмолиты и 53 др. Способность успешно существовать в холодных местообитаниях определяется в том численаличием холодоактивных ферментов, способных осуществлять катализ при низких температурах, в том числе липолитических. Холодоактивные липолитические ферменты обладают рядом структурных особенностей, отличающих их от мезофильных ферментов и обеспечивающих их способность эффективно катализировать реакции при низких температурах, что имеет большое значение для биотехнологии. 54 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1 Объекты исследования Объектами исследования являлись образцы арктических криопэгов. Методика стерильного отбора проб при колонковом бурении мерзлых пород станком УКБ-12/25 детально отработана (Гиличинский и др., 1989; Shietal., 1997). Отбор проб воды из скважин, вскрывающих криопэги, осуществляли с помощью гидрохимического батометра ПЭ 1105 в предварительно стерилизованные бутыли объемом 500 мл. Отобранные пробы хранились при -10оС до начала анализов. Основные характеристики исследуемых образцов криопэгов приведены в Таблице 8. Для амплификациигенов холодоактивных липолитических ферментов использовали штамм Psychrobacter cryohalolentis K5T, VKM B-2378T предоставленный Всероссийской Коллекцией Микроорганизмов. Таблица 8. Основные характеристики исследуемых образцов криопэгов. Место Глубиотбора на, м Полуостров Ямал Устье 1 5 р. Ярояха пойма р. 2 Ярояха, 7,5 скв.1, Бованенков ское 3 газовое 120 месторожде ние Полуостров Аляска № 4 Мыс Барроу 50 Колымская низменность район о. 5 Якутское, 25 скв. 15/99 район о. 6 Якутское, 40 скв. 15/99 Возраст, тыс. лет Минерализация, г/л Температура, °С рН Голоцен, 5-7 56,2 -2 - -4 7,5 Голоцен, 5-7 77,2 -2 - -4 7,4 Средний Плейстоцен, 100-120 14,6 -2 - -4 7,9 Поздний Плейстоцен, 30 70 -9 н/о 156,9 -9 - 12 7,3 160 -9 - -12 7,3 Средний Плейстоцен, 100-120 Средний Плейстоцен, 100-120 55 4.2 Районы исследования Полуостров Ямал. Бованенковское газовое месторождение ( 70°29′00″ с. ш., 68°00′00″ в.д.) расположено на западе центрального Ямала (бассейны рек Надояха и Мордыяха) в области сплошного распространения многолетнемерзлых, которые залегают сразу под сезонно-талым слоем. До глубин 220-310 м мерзлую толщу повсеместно подстилает горизонт переохлажденных засоленных пород. В устье р. Ярояха на глубинах от 5 до 120 м в многолетнемерзлых толщах встречаются криопэги (Рис. 4). Среднегодовая температура мерзлых толщ колеблется от (-2) до (-4)оС. Образец воды №3 (Табл. 8) из криопэгов Бованенковского газового месторождения, отобранный с глубины 120 м, характеризовался преобладанием хлоридов, ионов магния и калия. Другие исследуемые криопэги этой территории (образцы № 1, 2) характеризовались преобладанием ионов натрия и хлора. Полуостров Аляска. Проба №4 (Табл. 8) отобрана с глубины 50 м из криопэга в районе North Meadow Lake, (71°18'64'' с.ш., 156°39'3'' з.д.), мыс. Барроу (Аляска) (Рис. 4) рядом с Чукотским морем (Kenji, 2004). Минерализация проб криопэгов составляла около 70 г/л и характеризовалась хлоридно-натриевым засолением, температура вмещающих пород была -9оС Колымская низменность. Криопэги тундровой зоны Колымской низменности были обнаружены в районе озера Якутское (69 o50‘с.ш., 159o30‘в.д.) и приурочены к морскому горизонту мощностью 20 м, выделяемому в Коньковскую свиту конца Среднего Плейстоцена (Рис. 4). Отложения свиты характеризовались хлоридно-натриевым засолением. Ярусное залегание, разное гидростатическое давление и различная минерализация криопэгов указывали на их линзовидное распространение. Морской горизонт, позднеплейстоценовый включающий синкриогенный линзы криопэгов, венчал озерно-аллювиальный ледовый комплекс. В нем присутствовали полигонально-жильные льды, наличие которых доказывало, что ни ледовый комплекс, ни подстилающий его 56 горизонт морских отложений впоследствии не протаивали. Пробы воды из криопэгов № 5, 6 (Табл. 8) отобраны в районе озера Якутское (69°509 с.ш., 159°309 в.д.) в тундровой зоне Колымской низменности рядом с ВосточноСибирским морем. Температура вмещающих пород -9°С. Общая минерализация исследуемых криопэгов Колымской низменности составила 120-160 г/л. Рассол характеризовался хлоридно-натриевым засолением и слабощелочным рН. 4 1, 2, 3 а. б. 5, 6 в. Рис. 4 Географическое расположение криопэгов, отобранных для исследований: а) на полуострове Ямал; б) на полуострове Аляска; в) на Колымской низменности, республика Саха-Якутия. 57 4.3 Материалы 4.3.1 Штаммы Escherichia coli, вектор и среды для культивирования E.coli В работе использовали следующие штаммы E.coli: BL21(DE3) (―Novagen‖, СШA): F– ompT hsdSB (rB–, mB–) gal dcm (DE3) и XL-1 Blue (―Stratagene‖, США): recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. Для клонирования был использован вектор pET-32a(+) (―Novagen‖, США). Для культивирования штаммов E. coli использовали жидкую и агаризованную среду Луриа-Бертани (LB), содержащую (г/л): дрожжевой экстракт (―Difco‖, США) – 5,0; бакто-триптон (Difco) – 10,0; NaCl– 10,0. Для приготовления твердой среды добавляли 1,5% агара. При необходимости в среду LB добавляли ампициллин 100 мкг/мл. 4.3.2 Олигонуклеотиды Для секвенирования гена 16SрРНК использовали универсальные бактериальные праймеры: BACT 8-27F 5'-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3'; 1510-1492R 5'-(A/C)G(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3' Для получения рекомбинантных белков использовали следующие праймеры: T7prom 5‘-TAATACGACTCACTATAGGG-3‘; T7term 5‘-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3‘; EstPcF 5‘-ATAATACATATGATAAATACCACCCAAAAGATTATTC-3‘; EstPcR 5‘- ACATGTCGACGTTCTTTAACCCTTCACGAAAC-3‘; Lip1PcF 5‘-ATAATACATATGTCTAACTCAACAGTACTATC-3‘; Lip1PcR 58 5‘- ACATGTCGACAGCGCTCAATAGCGCCCTTG-3‘; ND1F 5‘-ATATACATATGGATATAGATGAGAGTGCTT-3‘; ND2F 5‘-ATATACATATGACCAACTATCAACCGCAT-3‘; ND3F 5‘-ATATACATATGCATGTTGATGCCCATCTGC-3‘; ND4F 5‘-ATATACATATGAATAGCAAGCTAAAAACGCCTT-3‘; ND5F 5‘-AGCAAGCTAATCAGTTGGCAAGATAGAACG-3‘; ND5R 5‘-TGCCAACTGATTAGCTTGCTATTGACTGCAAG-3‘; Lip2PcF 5'- ATCATACATATGGCTGGACAGTATTATAACTG-3'; Lip2PcR 5'- ACATCTCGAGTAAATTAGCTTTTTTCAAGCGATTG-3'; LifPcd23F 5'-ATCATACATATGATTATTTGGTGGTTTAAGCC-3'; LifPcd62F 5'-ATCATACATAYGAGCCAAAAATCGAATC-3'; LifPcR 5'- ACATCTCGAGATTTGTATCGGCAGCTTTCTG-3'. Олигонуклеотиды были синтезированы фирмой "Евроген", Москва, Россия. 4.4 Микробиологические методы анализа 4.4.1 Оценка общей численности микроорганизмов Общую численность микроорганизмов изучали методом флуоресцентной микроскопии (Axiostar Plus, Zeiss, 100х Plan-NEOFLUAR, масляная иммерсия), окрашивая препараты красителем Акридином оранжевым (Звягинцев, 1991). Пробы воды из криопэгов стерильно отбирали по 0,5 мл в микропробирки и встряхивали на вортексе в течение 30 сек. Пробы разводили фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1:2. Смесь в количестве 10 мкл наносили на обезжиренные предметные стекла в трех повторностях. Препаратам давали высохнуть при комнатной температуре и фиксировали в пламени горелки. В темной комнате поверх подсушенной 59 пробы наносили раствор Акридина оранжевого в фосфатном буфере (рН 7,4) и выдерживали 5 минут. Избыток красителя удаляли промывкой препарата стерильной водой в течение 10 минут. Счет микроорганизмов проводили с помощью сетки Гаженко, просчитывая в 10-ти полях зрения палочковидные, кокковидные и прочие формы. Общее количество микроорганизмов вычисляли по формуле: Х= (N×S)/(d×Vf×Ag), где Х - количество клеток микроорганизмов в 1 мл, N - количество подсчитанных клеток, At- всѐ поле зрения (мм2 или мкм2), Ag - поле зрения в одной клетке (мм2 или мкм2), Vf- объем разведенного образца, d - фактор разведения (Vфин/Vобразца). Для учета численности аэробных культивируемых микроорганизмов в криопэгах производили высев оригинальных образцов на чашки Петри с агаризованными средами R2A или 1/2 TSB (Difco) (см. раздел 4.4.2), содержащие различные концентрации NaCl (100, 150, 200 или 250г/л). Подсчет колоний производили на 14-ые сутки инкубирования (4°С) и 10-ые сутки инкубирования (25°С). 4.4.2 Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий С целью выделения аэробных галофильных микроорганизмов использовали метод накопительного культивирования на стандартных питательных средах R2A (Difco), содержащей (г/л): протеозный пептон - 0,5; казаминовые кислоты - 0,5; бакто-декстрозу- 0,5; растворимый крахмал - 0,5; пируват натрия - 0,5;KH2PO4- 0,3; MgSO4- 0,05, и, предварительно разбавленный в соотношении 1:2 триптиказо-соевый бульон - ТSB (Difco), содержащий (г/л) бактотриптон - 8,5; бактериальный соевый экстракт - 1,5; бакто-декстрозу- 1,25; NaCl- 2,5; KH2PO4- 1,25; NaCl- 100 или 150 г/л. 60 Культивирование осуществляли в течение 3-х недель при температурах 4оС и 25°С с принудительной аэрацией на качалке. Для получения чистых культур производили посев методом серийных разведений на агаризованные питательные среды (R2A+100 г/л NaCl и 1/2 TSB+100 г/л NaCl). Для учета численности жизнеспособных бактерий производили прямой высев из образцов на агаризованные питательные среды R2A и 1/2 TSB, с добавлением NaCl до конечной концентрации 100, 150, 200 или 250 г/л. Выделение чистых культур проводили посевом штрихом на скошенный агар из отдельно выросших колоний на соответствующие среды. 4.4.3 Микроскопические методы исследования Морфологию клеток выделенных штаммов микроорганизмов изучали методами световой и флуоресцентной микроскопии (Axiostar Plus, Zeiss) при увеличении х100. Линейные размеры определяли с помощью линейки объект-микрометра с учетом увеличения микроскопа и фотоувеличителя. Грам-принадлежность определяли у суточных культур бактериальных штаммов с помощью 3% раствора КОН (Добровольская и др., 1989). 4.4.4 Культивирование P. cryohalolentis Культивирование P. cryohalolentis штамм К5Т осуществляли в жидкой и агаризованной среде. Жидкая среда содержала 1/2TSB и 20 г/л NaCl, культуру инкубировали в качалочных колбах (рабочий объем среды 200 мл) при 220 об/мин и температуре 23ºC. О росте судили по изменению оптической плотности OD560, которую определяли на спектрофотометре Genesis 2 (―Thermoelectron‖, США). Культуру инкубировали до достижения стационарной фазы роста. Твердая среда содержала 1/2 TSB (Difco), 15 г/л бактоагара (―Difco‖) и 20 г/л NaCl. 4.4.5 Определение липолитической активности Определение наличия липолитической активности у штаммов чистых культур рабочей коллекции микроорганизмов, выделенных из криопэгов, и штамма К5Т проводили на чашках Петри со средами АСР и АСТ. Агаризованная среда с родамином В (АСР) содержала 1/2 TSB (Difco), 15 г/л 61 бактоагара (―Difco‖), 20 г/л NaCl, 10 мл/л оливкового масла и 10 мг/л родамина B (―Panreac‖, Испания). Агаризованная среда с трибутирином (АСТ) содержала 1/2 TSB (―Difco‖), 15 г/л бактоагара (―Difco‖), 20 г/л NaCl, 10 мл/л трибутирина (―HiMedia Labs‖, Индия). Культуры засевали штрихом, после чего чашки Петри инкубировали при температуре 25ºC или 4 и 25ºC для штамма К5Т. О наличии липолитической активности у выделенных культур судили по появлению вокруг штриха гало на чашках с АСТ и по появлению флюоресцирующего окрашивания штриха на чашках с АСР (Hasan et al., 2009). Для определения липолитической активности штамма К5Т в зависимости от фазы роста отбирали по 2 мл культуральной жидкости и центрифугировали 5 мин при 7000 об/мин. Супернатант использовали для определения внеклеточной липолитической активности. Осадок промывали дважды в буфере: 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl и суспендировали в буфере: 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 М мочевина, 1% Тритон Х-100 для получения фракции растворимых клеточных белков. После инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин суспензию центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин и определяли внутриклеточную липолитическую активность в супернатанте. Внеклеточную и внутриклеточную активности определяли, используя п-НФБ или п-НФП ("Sigma", США) в качестве субстрата (Kulakova et al., 2004). К реакционной смеси объемом 1 мл, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,5% Тритона Х-100 и 0,25 мМ п-НФБ или 0,1 мМ п-НФП добавляли аликвоту супернатанта 850 мл, смесь инкубировали 15 мин при 25ºС и реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10% ДСН. По 200 мкл реакционной смеси раскапывали в лунки 96луночного планшета ("Costar", США). Измеряли величину абсорбции при 415 нм на ридере Model 680 ("BioRad", США). За единицу липазной активности принимали количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль паранитрофенола за 1 мин. 62 4.5 Молекулярно-генетические методы, использованные для изучения микроорганизмов 4.5.1 Выделение геномной ДНК Для экстракции ДНК из клеток микроорганизмов использовали коммерческий набор «The UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit» (―MoBio‖, USA). Процедуру выделения проводили согласно рекомендациям производителя. 4.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Амплификацию последовательностей генов 16S рРНК, выделенных штаммов, осуществляли с использованием коммерческого набора реактивов «Encyclo PCR kit» ("Евроген", Россия) и универсальных бактериальных праймеров BACT8-27F и 1510-1492R (Weisburg, 1991). Реакцию амплификации проводили в реакционном объеме 25 мкл, содержащем 0,5 нг ДНК матрицы; 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов; 50 пМ каждого из праймеров; 2,5 мкл10Х Encyclo буфер; 0,5 мкл 50X смесь полимераз Encyclo. Режим ПЦР: денатурация матрицы 1 мин, 95С; денатурация 45 сек, 95С; отжиг 45 сек, 54С; элонгация 1 мин, 72С; количество циклов 30; финальная элонгация 7 мин 72С. Амплификацию проводили в амплификаторе «Eppendorf Mastercycler personal» ("Eppendorf", Германия). Продукты ПЦР-реакций анализировали в 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий, в 1х ТАЕ-буфере при 6-8V/см. Для гельдокументирования использовали системуE-Box-1500/20М ("Vilber Lourmat", Франция). Выделение ПЦР-продукта из геля проводили, используя коммерческий набор «QIAquick PCR Purification Kit» ("QIAGEN", Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. 63 4.5.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16SрРНК и филогенетический анализ Нуклеотидные последовательности 16S рРНК генов выделенных из криопэгов микроорганизмов определяли в компаниях «Синтол» и «Евроген» (Москва, Россия). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с таковыми в базах данных RDP (http://rdp.cme.msu.edu) и GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), где получали данные о близкородственных штаммах и процент идентичности. Последовательности отбирали и выравнивали вручную с помощью программы CLUSTAL Х (Thompson et al., 1997). На основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S rRNA с использованием пакета программ MEGA 6 (Tamura et al., 2013) была построена филогенетическая дендрограмма с применением методов поиска ближайших соседей (―neibour-joining) (Saitou & Nei, 1987) и ―minimum evolution‖ (Rzhetsky & Nei 1992). 4.6 Молекулярно-генетические методы, использованные для получения рекомбинантных белков 4.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Культуру P.cryohalolentis К5Т выращивали в течение ночи на агаризованной среде, описанной в разделе 4.4.4. 20 мкл полученной биомассы суспендировали в 50 мкл буфера для Taq-полимеразы (75 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 20 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Твин 20) и разрушали в течение 15 мин прогреванием на кипящей водяной бане. После центрифугирования 5 мин при 13000 об/мин 5 мкл полученного супернатанта добавляли в реакционную смесь для ПЦР объемом 50 мкл, содержащую: 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов; 50 пМ каждого из праймеров; 2,5 ед. а. термостабильной PfuДНК–полимеразы ("Fermentas", Литва); 0,5 ед. а. термостабильной TaqДНК–полимеразы ("Fermentas", Литва); 5мкл 10хбуфера для PfuДНК полимеразы с 2 мМ MgCl2 ("Fermentas", Литва). Реакцию начинали со стадии предварительной денатурации ДНК при 96С в течение 5 64 мин; затем выполняли 25-30 циклов амплификации, состоящих из денатурации при 95С в течение 45 сек, отжига в течение 45 сек при температуре, рассчитанной по формуле Tотж(С) = ((количество A/T)*2С+(количество G/C)*4С))– 10С, и элонгации при 72С. Время элонгации выбирали из расчета 1 мин на каждые 1000 нуклеотидов. По окончанию 25-30 циклов делали достройку концов при 72С в течение 10 минут. Для проведения ПЦР использовали амплификатор Mastercycler ("Eppendorf", Германия). 4.6.2 Рестрикция Проводили рестрикцию при помощи эндонуклеаз рестрикции ("Fermentas", Литва) в условиях, рекомендованных поставщиком фермента. 4.6.3 Электрофорез ДНК Фрагменты ДНК разделяли в 1%-ном агарозном геле в буфере ТАЕ при напряженности электрического поля 12 В/см. 4.6.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей При ультрафиолетовом освещении из агарозного геля вырезали скальпелем полосу, соответствующую нужному фрагменту. Выделение ДНК из геля проводили согласно инструкции к набору по очистке ДНК ―MinElute Gel Extraction Kit‖ (―QIAGEN‖, США). 4.6.5 Лигирование Проводили реакции лигирования, используя ДНК лигазу фага Т4 ("Fermentas", Литва) в условиях, рекомендованных поставщиком фермента. 4.6.6 Трансформация клеток E. coli Компетентные клетки (100 мкл) размораживали в ледяной бане. 5 мкл лигазной смеси добавляли в размороженные клетки и инкубировали во льду в течение 30 мин. Затем пробирки помещали на 40 сек в водяную баню с температурой 42С, быстро переносили в лед, и инкубировали еще в течение 5 мин. К клеткам добавляли 800 мкл среды LB, инкубировали 60 мин при 65 37С и высевали на чашки Петри, содержащие агаризованную среду LB и ампициллин. 4.6.7 ПЦР-анализ клонов Наличие вставки и ее ориентацию в плазмидном векторе определяли при помощи ПЦР. Для этого клетки отдельных колоний, выросших на селективной агаризованной среде, отбирали касанием стерильного наконечника и суспендировали в 20 мкл реакционной смеси. Один из праймеров был комплементарен последовательности вставки, другой – вектора. Реакционная смесь содержала 2 мкл 10х-кратного буфера для Taq ДНК-полимеразы ("Fermentas", Литва) 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, 2 мМ MgCl2 20 пМ каждого из праймеров, 1 ед.а. Taq полимеразы. Продукты реакции разделяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. 4.6.8 Выделение плазмидной ДНК из E. coli Для выделения плазмидной ДНК из клеток E. coli использовали набор ―QIAprep Spin Miniprep Kit‖ (―QIAGEN‖, США), следуя инструкции фирмыпроизводителя. 4.6.9 Секвенирование ДНК Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили в Центре коллективного пользования ―Геном‖ (ИМБ РАН) на автоматическом секвенаторе ABI3100 ("Applied Biosystems", США). 4.6.10 Конструирование экспрессионных векторов Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pEstPc. Для амплификации гена estPc проводили ПЦР в присутствии праймеров EstPcF и EstPcR в режиме, описанном в разделе 4.6.1. 10 мкг ПЦР-продукта обрабатывали рестриктазами NdeI и SalI, фрагмент длиной 869 п.о. выделяли из 1% агарозного геля. 1 мкг полученного фрагмента и 0,2 мкг плазмидного вектора pET32a(+), линеаризованного обработкой рестриктазамиNdeI и XhoI, лигировали в течение 4 ч при 12С в 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ Трис-HCl (pH 7,8), 10 мМ MgCl2,10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ 66 аденозинтрифосфата и 3 ед.а. Т4 ДНК-лигазы ("Fermentas", Литва). 5 мкл лигазной смеси использовали для трансформации как описано в 4.6.6. Нуклеотидную последовательность вставки в отобранных при помощи ПЦР-анализа клонах подтверждали секвенированием. В результате получали целевую плазмидную ДНК pEstPc. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pLip1Pc. Амплификацию гена lip1Pc проводили с использованием праймеров Lip1PcF и Lip1PcR в режиме, описанном в разделе 4.6.1. Полученный ПЦР-фрагмент длиной 1452 п.о. обрабатывали совместно рестриктазами NdeI и SalI, выделяли из 1% агарозы и клонировали в вектор, полученный путем расщепления плазмиды pET32a рестриктазами NdeI и XhoI и выделения большого фрагмента. Конструирование экспрессионных векторов pND1, pND2, pND3, pND4 и pND5. Для конструирования генов делеционных мутантов ND1-ND4 проводили ПЦР на матрице плазмидной ДНК pLip1Pc с использованием праймеров ND1F-ND4F в комбинации с обратным праймером T7term. Реакционная смесь содержала буфер для Pfu ДНК-полимеразы с 2 мМ MgSO4, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 50 пмоль каждого из праймеров, 10 нг ДНК-матрицы и 2,5 ед.а. Pfu ДНКполимеразы ("Fermentas", Литва). Режим ПЦР был рассчитан в соответствии с описанием в разделе 4.6.1. Для конструирования мутанта ND5 использовался двухступенчатый SOE-ПЦР (ПЦР с перекрывающимися расширениями или сращивание перекрывающимися расширениями, (Horton et al., 1989)) c праймерами ND5F и ND5R в качестве мутагенных и T7prom и T7term в качестве фланкирующих. Условия ПЦР были те же, что и в случае конструирования генов мутантов ND1-ND4. На следующем этапе фрагменты были объединены в реакции ПЦР с праймерами T7prom и Т7term. Обработку и клонирование полученных генов проводили, как описано выше для гена полноразмерного белка. 67 Конструирование экспрессионных векторов pLip2Pc, LifPcd28 и LifPcd62. Амплификацию генов lip2Pc, lifPcd28 и lifPcd62 проводили с использованием праймеров Lip2PcF и Lip2PcR для гена lip2Pc, LifPcd28F/ LifPcd62F и LifPcR для генов lifPcd28 и lifPcd62, соответственно. ПЦР проводили в режиме, описанном в разделе 4.6.1. Полученные ПЦР-продукты, имеющие размер 1056, 1047 и 927 п.о. для генов lip2Pc, lifPcd28 и lifPcd62, соответственно, обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI и клонировали в вектор pET32a(+) как описано выше. 4.7 Биохимические методы исследования 4.7.1 Денатурирующий электрофорез белков в ДСН–ПААГ Электрофорез (ЭФ) белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в камере Mini ProteanIII («BioRad», США). Раствор для разделяющего геля содержал (из расчета на 1 гель): раствор акриламид-бис-акриламид («Serva», Германия) 40%- 1,3 мл; 1,5 М Трис-HCl буфер рН 8,8 – 1 мл; 10% раствор ДСН (вес/объем)– 40 мкл; ddH2O – 1,8 мл; 10% ПСА (в/об) («Serva», Германия) – 40 мкл; TEMED («Fluka»,Германия) – 2 мкл. Раствор для концентрирующего геля содержал: раствор акриламид-бис-акриаламид 40%200 мкл; 0,5 М Трис-HCl, pH 6,8 – 0,5 мл; 10% раствор ДСН (в/о)– 20 мкл ddH2O – 1,3 мл; 10% ПСА (в/об) («Serva», Германия) – 10 мкл; TEMED («Fluka», Германия) – 2 мкл. К пробам добавляли буфер для нанесения (0,5 М Трис-HCl, pH 6,8 – 2,5 мл; глицерин – 2 мл; 10% раствор ДСН (в/об)– 3 мл; 14 М меркаптоэтанол - 0,3 мл; ddH2O – 2,2 мл; 1% красителя бромфенолового синего в соотношении 1:4 (об/об) и прогревали при 95оС в течение 3 минуты. Электродный буфер содержал: глицин – 144 г; ТрисHCl – 30 г; ДСН – 10 г; ddH2O до 1 л, рН – 8,3). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 200 В. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 10% изопропанола (об/об), 10% уксусной кислоты (об/об) и 80% ddH2O (об/об) при постоянном покачивании в течение 30 мин. После фиксации гели промывали водой и окрашивали раствором Кумасси (100 мл): 10 мл изопропанола, 10 мл уксусной кислоты, 0,25 г кумасси 68 бриллиантовый синий R-250, 80 мл ddH2O при помешивании в течение 50 мин. Затем промытые водой гели заливали раствором (об/об): 10% изопропанола, 10% уксусной кислоты и 80% ddH2O) для удаления несвязанного с белком красителя. После отмывки красителя гели сканировали с разрешением 600 dpi и проводили математическую обработку результатов с помощью программы ScionImage (Scion Corporation, США). 4.7.2 Оптимизация экспрессии в E.coli рекомбинантных белков Для оптимизации концентрации ИПТГ и времени индукции клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные pEstPc, pLip1Pc или pLip2Pc, выращивали в 5 мл LB бульона при 37ºC, 250 об/мин в течение 10 часов. Инокулят (1%, об/об) переносили в 5 мл LB и продолжали культивирование в тех же условиях. После достижения OD560 = 0,8 экспрессию генов индуцировали добавлением ИПТГ в различной концентрации (0,05; 0,1; 0,2 мМ) и продолжали культивирование при 27ºC в течение 2-4 часов. Для оптимизации температуры выращивания клетки после индукции инкубировали при разных температурах (27 и 37ºC) в течение 4 часов. Уровень экспрессии рекомбинантных белков анализировали электрофорезом в 13%-ном ДСН-ПААГ. 4.7.3 Выращивание рекомбинантных штаммов E.coli Культуры клеток E. coli BL21(DE3), содержащие рекомбинантные плазмиды pEstPc, pLip1Pc, pND1-pND5, pLip2Pc или pLifPc, выращивали в колбах Эрленмейера (200 мл культуры на колбу объемом 1л) в среде LB при температуре 37С и 250 оборотах в минуту на качалке ―Inova‖ (―New Brunswick‖, США) до достижения значения оптической плотности ОD560 ~0,8. На этой стадии проводили индукцию 0,1 мМ ИПТГ. После инкубации при 27ºC и 200 об/мин в течение 4 часов клетки осаждали в центрифуге Avanti J-301 ("Beckman Coulter", США) в течение 15 мин при 7000 об/мин и 4ºC. 69 4.7.4 Выделение рекомбинантных белков EstPc, Lip1Pc, ND1-ND5, LifPcd23 и LifPcd62 из клеток E. coli Культуру клеток, выращенную в 200 мл среды LB, центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин. Для выделения использовали буферы, описанные в Таблице 9. Осадок суспендировали в 10 мл лизис–буфера и клетки разрушали обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе Branson Sonifier 450 ("Branson", Мексика), не допуская нагрева выше 10°С. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 17000 об/мин на центрифуге Avanti J-301 ("Beckman Coulter", США). Выделение и очистку рекомбинантных полипептидов из супернатанта клеток после озвучивания проводили с помощью Ni-аффинной хроматографии на колонке Ni-Sepharose Fast Flow ("GE Healthcare", США) объемом 2 мл, уравновешенной буфером А. Колонку со связавшимся белком тщательно отмывали буфером В (20 мл). Рекомбинантные белки элюировали буфером C. Объединенные фракции, содержащие очищенный белок и имеющие по данным белкового электрофореза чистоту более 90%, диализовали против буфера D и стерилизовали. Для выделения рекомбинантного белка EstPc использовали буферную систему: лизис-буфер, буфер А, буфер В, буфер С и буфер D. Для Lip1Pc использовалась та же буферная система, как и в случае EstPc, за исключением: буфера A, B, C, D содержали 10 мМ β–меркаптоэтанола и буфер D был 50 мМ HEPES pH 7,5, 10 мМ β–меркаптоэтанол. Для мутантных белков ND1-ND5 использовалась та же буферная система, как и для липазы Lip1Pc. Шапероны LifPcd23 и LifPcd62 выделяли в буферной системе для EstPc. 70 Таблица 9. Буферы, использованные для получения рекомбинантных белков. Название буфера Лизис - буфер Буфер А Буфер B Буфер С Буфер D Буфер E Буфер F Буфер G Состав буфера; рН 8,0 50 мМ Трис–HCl, 0,2 М NaCl, 10 мМ имидазол 50 мМ Трис–HCl, 0,2 М NaCl, 10 мМ имидазол 20 мМ Трис–HCl, 0,4М NaCl, 20 мМ имидазол 20 мМ Трис–HCl, 0,2 М NaCl,300 мМ имидазол 20 мМ Трис–HCl, 50 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2 50 мМ Трис–HCl, 0,2 М NaCl,1 мМ ЭДТА,0,25% Тритон Х-100 20 мМ Трис–HCl, 0,2 М NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 8 М мочевина 50 мМ Трис–HCl, 5 мМ CaCl2 4.7.5 Получение рекомбинантного белка Lip2Pc Культуру клеток, выращенную в 200 мл среды LB, центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин. Для выделения использовали буферы, описанные в Таблице 9. Осадок клеток суспендировали в 10 мл лизис–буфера и разрушали обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе Branson Sonifier 450 ("Branson", Мексика), не допуская нагрева выше 10°С. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 17000 об/мин. Осадок промывали 3-кратно буфером Е и растворяли в буфере F при 37°С в течение 60 минут, при постоянном встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин в центрифуге Eppendorf 5415R ("Eppendorf", Германия). Для последующего рефолдинга использовали полученный супернатант. 4.7.6 Рефолдинг рекомбинантного белка Lip2Pc Оптимизацию условий рефолдинга проводили в следующих условиях: к 5 мкл денатурированной липазы (4 мг/мл) добавляли 200 мкл буфера G (Табл. 9), содержащего различные добавки, анализ проводили в 96-луночном планшете ("Deltalab", Испания). После 24 часов инкубации при температуре 4ºС раствор центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин в центрифуге Jouan GR 412 ("Jouan", Великобритания) и для определения липазной активности использовали супернатант, а в качестве субстрата п-НФД ("Sigma" США). 71 При оптимизации условий рефолдинга исследовали влияние следующих параметров: добавка компонентов (NaCl, CaCl2, глицерин, Тритон X-100, мочевина), различные варианты шаперонов (LifPcd28 и LifPcd62) и изменение соотношения липаза:шаперон (1:1 или 1:2, в/в). Для препаративного рефолдинга 1 мл денатурированной липазы (4 мг/мл) добавляли в 40 мл буфера следующего состава (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ CaCl2, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 200 мм NaCl, 1,5 M мочевина, 0,01% мМ Тритон X-100, 45% глицерин, рН 8.0) в присутствии очищенного шаперона LifPcd62 (0,2 мг/мл). После 24 часов инкубации при температуре 4ºС раствор центрифугировали 20 мин при 17000 об/мин и супернатант концентрировали с использованием набора для ультрацентрифугирования Амикон (10 кДа) ("Millipore", Франция). 4.7.7 Очистка рекомбинантного белка Lip2Pc Буферы, использованные для очистки Lip2Pc, описаны в Таблице 9. Супернатант, полученный после рефолдинга, наносили на колонку NiSepharose Fast Flow ("GE Healthcare", США) объемом 2 мл, уравновешенную буфером А. Собирали проскок, в котором находился белок Lip2Pc, частично очищенный от LifPcd62. Раствор стерилизовали и использовали для определения активности Lip2Pc с помощью п-НФД в качестве субстрата. Колонку со связавшимся белком LifPcd62 отмывали буфером В (20 мл). Белок LifPcd62 элюировали буфером C. 4.7.8 Определение концентрации белка Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976) с использованием красителя Protein Assay Kit ("BioRad", США) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. 72 4.7.9 Определение липолитической активности рекомбинантных белков Активность рекомбинантых белков определяли, используя п-НФБ ("Sigma", США) в качестве субстрата (Kulakova et al., 2004). К реакционной смеси объемом 1 мл, содержащей 50мМ Трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,5% Тритон Х-100, 0,25 мМ п-НФБ добавляли аликвоту 5 мкл (~1 мкг) очищенного белка, смесь инкубировали 15 мин при 25ºС, реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10% ДСН. По 200 мкл реакционной смеси раскапывали в лунки 96-луночного планшета ("Costar", США). Измеряли величину абсорбции при 415 нм на ридере Model680 ("BioRad", США). За единицу липазной активности принимали количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль п-нитрофенола за 1 мин. Удельную активность определяли как количество единиц липазной активности на 1 мг белка. 4.7.10 Характеристика свойств рекомбинантных белков Аналитическую гель-фильтрацию проводили на колонке Superdex 7510/300GL ("GE Healthcare", США) со скоростью 0,4 мл/мин в 100 мМ ТрисHCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl. Активность белков в зависимости от температуры определяли в диапазоне температур (5-80ºС). Реакционную смесь без белка и субстрата инкубировали 10 мин при указанных температурах и 15 мин после добавления белка и субстрата, после чего измеряли активность как описано выше. Термостабильность белков при температурах от -20º до 95ºС определяли по остаточной активности, измеренной в стандартных условиях после инкубирования белков при указанных температурах. Для определения рН оптимума активности белков использовали следующие буферы: 50 мМ Кфосфатный буфер (pH 5,6 – 8,0), 50 мМ Трис-HCl (8,0 – 9,5) и Na-боратный буфер (рН 9,3 – 10,0). Влияние соли на активность белков изучали при добавлении в реакционную смесь NaCl в различных концентрациях (01,75M). Влияние различных катионов (Zn2+, Ca2+, Ni2+, Cu2+, Co2+, Mg2+ и 73 Mn2+) и других добавок (ФМСФ, ЭДТА) в концентрации 1 мМ на активность белков измеряли по остаточной активности после инкубирования белков при 5ºC в течение 30 мин с указанными добавками. Устойчивость белков к детергентам определяли после их инкубирования в течение 30 мин при 5ºC в присутствии 0,05 или 0,5% (об/об) различных детергентов (ДСН, Тритон X100, Твин 20 и CHAPS). Влияние различных органических растворителей (метанол, этанол, ацетонитрил, ДМСО, ДМФА) на активность белков измеряли по остаточной активности после инкубирования их 30 мин при 5ºC в растворе, содержащем 5 или 10% (об/об) указанных растворителей. Субстратную специфичность рекомбинантных белков определяли с использованием в качестве субстратап-нитрофениловых эфиров карбоновых кислот с различной длиной углеводородной цепи от С2 до С16 ("Sigma", США). Глава 5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 5.1 Криопэги как источник продуцентов холодоактивных липолитических ферментов С целью обнаружения продуцентов холодоактивных липолитических ферментов в образцах криопэгов Колымской низменности, п-ова Ямал и Аляски (Табл.8) нами были использованы как традиционный микробиологический подход, включающий выделение в чистую культуру отдельных представителей микробных сообществ, обладающих желаемой активностью, так и генноинженерные и биоинформационные методы. В результате применения этих подходов из образцов криопэгов выделены и частично охарактеризованы культуры аэробных галофильных микроорганизмов – продуцентов липолитических ферментов. 5.1.1 Микробиологическая характеристика исследуемых криопэгов Изучение микробных сообществ аэробных психрофильно-галофильных микроорганизмов проводили на образцах географической локализации (Табл. 8). 74 криопэгов, различной Таблица 10. Результаты прямого количественного учета микроорганизмов методом эпифлуоресцентного анализа. № 1 2 3 4 5 6 Название образца Лайда в районе устья р. Ярояха, криопэг Река Ярояха, скв.1, криопэг Газовое месторождение Бованенковское, ГП-1, скважина 65 П, криопэг Аляска, криопэг Колыма, криопэг, скв. I 15/99 Колыма, криопэг, скв. II 15/99 Методом прямого Глубина, м Минерализация, NaCl г/л Количество, кл/мл 5 58 1.3×106 7,5 70 1,6×106 120 31 2,1×106 50 70 1,2×104 40 160 1,6×106 50 160 1,8×106 счета было показано, что содержание микроорганизмов в образцах арктических криопэгов составляло 1,3-2,1×106 кл/мл, а наименьшее количество клеток было выявлено в образце криопэга Аляски, где было обнаружено 104 кл/мл (Табл. 10). Это может быть связано с тем, что вмещающие многолетнемерзлые породы Колымской низменности и п-ова Ямал представляют собой взвесь рассола и грунтовых частиц с адсорбированными на них клетками, а на Аляске горизонт, содержащий криопэги, перекрыт пластовым льдом, грунтовых частиц в самом рассоле немного, и пробы выглядят прозрачными. Для того, чтобы привести результаты к одному стандарту, мы использовали стандартные питательные среды ½ TSB и R2A, варьируя лишь концентрацию соли. В результате проведенного накопительного культивирования проб воды из криопэгов при 4 и 25°С на жидких питательных средах с содержанием NaCl 100 и 150 г/л, что заведомо выше концентрации соли в оригинальных образцах, их последующего высева на агаризованные среды с теми же концентрациями NaCl, а также высева оригинальных образцов на агаризованные среды с содержанием NaCl 100, 150, 200 и 250 г/л было выделено около 140 штаммов аэробных галофильных 75 микроорганизмов. Однако больше половины штаммов галофильных бактерий было утрачено из-за их неспособности давать рост при пересевах. Как видно из таблицы 11, скорость появления бактериальных колоний на плотных питательных средах варьировала в зависимости от концентрации NaCl в питательной среде (Табл. 11). Полученные результаты указывают на наличие у выявленных бактериальных сообществ черт галофильности. В ходе эксперимента не было выявлено роста при 4 оС, но микроорганизмы, выросшие при 25оС, росли при 4оС, причем скорость их роста с понижением температуры значительно замедлялась. Таблица 11. Скорость появления первых колоний при инкубировании оригинальных проб на твердых питательных средах с конечной концентрацией NaCl 100, 150 и 200 при температуре 25оС. № 1 2 3 4 Место отбора Лайда в районе устья р. Ярояха, криопэг Река Ярояха, скв.1, криопэг ГМ Бов., ГП-1, скважина 65 П, криопэг Мыс Барроу, Аляска, криопэг Условное Обозначение Lya Содержание NaCl в образце, г/л 58 YaCP 70 BCP 31 Al 70 5 Колыма, криопэг, скв. I 15/99 Kol-I 160 6 Колыма, криопэг, скв. II 15/99 Kol-II 160 76 Содержание NaCl в среде, г/л Сутки 100 150 200 3-7 3-7 10 250 10-14 100 150 200 250 100 150 200 3-7 3-7 10 10-15 5-10 7-10 10-20 250 15-20 100 150 200 250 100 150 200 250 100 150 200 250 3-5 3-5 5-10 15-21 3-5 5-7 10 нет роста 3-5 5-7 15 20 Так, рост микроорганизмов на среде с концентрацией NaCl 250 г/л не был обнаружен лишь в одном из образцов криопэга Колымской низменности (№5). Наименьшей скоростью появления колоний при росте на всех используемых концентрациях соли в питательной среде, характеризовалось микробное сообщество из образца №3, характеризующегося наибольшей глубиной залегания. Микроорганизмы, высеянные из образца №4 (Аляска), характеризовались наиболее ранним ростом на среде с минимальной концентрацией соли и наиболее поздним – на среде с максимальной концентрацией. 5.1.2 Скрининг на наличие липолитической активности у выделенных микроорганизмов Для выявления среди выделенных штаммов микроорганизмов с липолитической активностью изучали рост бактерий на средах, где в качестве субстрата использовали трибутирин (среда АСТ), обладающий С4 углеводородным скелетом, или оливковое масло, которое в основном (до 70%) состоит из олеиновой кислоты, имеющей С18 - углеводородный скелет (среда АСР). Для оценки влияния NaCl на активность ферментов реакцию проводили как в присутствии в среде соли, так и без нее. О наличиилипазной активности судили по образованию флюоресцирующего окрашивания на среде с оливковым масло и родамином В и появлению областей гидролиза на среде с трибутирином (Рис. 5 а и б). 77 а б Рис. 5 Рост микроорганизмов на питательной среде, содержащей оливковое масло с родамином Б (а) или трибутирин (б). Стрелками обозначены свечение в УФ (а) и зона гидролиза (б), указывающие на наличие липолитической активности. Результаты экспериментов приведены в таблице 12. Было показано, что липазной активностью обладают 20 штаммов из 44, причем 8 из них проявили способность утилизировать в качестве субстрата как трибутирин так и оливковое масло. Среди исследованных культур 5 штаммов были способны проявлять липазную активность только на трибутирине (среда АСТ), а 7 штаммов - только на оливковом масле. Эти результаты свидетельствуют о том, что выделенные микроорганизмы обладают различным набором липолитических ферментов и способны утилизировать субстраты с различной длиной углеводородной цепи. При этом нами не было выявлено корреляции между наличием липолитической активности у микроорганизма и повышенным содержанием NaCl в среде для скрининга. Наибольшее число штаммов, обладающих липолитической активностью, было выделено из криопэгов образцов №4 (Аляска) и №2 (п-ов Ямал). 78 Таблица 12. Результаты скрининга на липолитическую активность штаммов, выделенных из криопэгов. Название штамма Среда АСТ Среда АСТ+NaCl (100 г/л) Среда АСР Среда АСР+NaCl (100 г/л) Образец №1 (п-ов Ямал) LYa-R2 - - - - LYa-R3 - - - - LYa-T5 - + + - LYa-R6(2) - - - - LYa-R6(1) - - - - LYa-R7 - - - - LYa-R25 - - - - LYa-T1 - - - - LYa-T10 - - + - LYa-T8 - - - - Образец №2 (п-ов Ямал) YaCP-T44 + + + - YaCP-T29 + + + - YaCP-T40 + + - - YaCP-T10 - - - - YaCP-T37 - - - - YaCP-T38 - + + - YaCP-R4 - + + - YaCP-T2 - + - - YaCP-T24 + + - - YaCP-T23 - - - - YaCP-T20 + - - + YaCP-T21 + - + - YaCP-R1(2) - - - - - - - - YaCP-T22 Образец №3 (п-ов Ямал) BCP-T1 + + - - BCP-R1 - - - - Образец №4 (Аляска) Al-T10 - - - - Al-T14 - - - - 79 Название штамма Среда АСТ Среда АСТ+NaCl (100 г/л) Среда АСР Среда АСР+NaCl (100 г/л) Al-T6 - - - - Al-T3f - + + - Al-T1 - - - - Al-T12 - - - - Al-T17 - - + + Al-T9 - + + + Al-T13 + + - - Al-T15 - - + + Al-T7 - - - + Al-T21 - - - - AL-R1 - - + + Образцы № 5,6 (Колымская низменность) I-15-99-R2 - - - - II-15-99-R1 - - + - II-15-99-R3 - - - - II-15-99-R4 - - - - II-15-99-R2 - - - - 5.1.3 Морфологический и филогенетический анализ культур, давших положительный результат на липолитический скрининг Для культур, давших положительный результат при скрининге, были проведены микроскопические исследования и описание колоний. Морфологически, выделенные культуры представляли собой палочки разной длины и микрококки. Колонии были, в основном, однородными и пигментированными (Табл. 13). 80 Таблица 13. Морфологическое разнообразие галофильных микроорганизмов, выделенных из криопэгов Колымской низменности, п-ова Ямал и Аляски. № образца 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Название культуры Морфология LYa-T10 короткие палочки LYa-Т5 палочки YaCP-T2 округлые палочки YaCP-T20 микрококки YaCP-T29 микрококки YaCP-T38 палочки YaCP-T40 микрококки YaCP-T44 Палочки YaCP-R4 палочки YaCP-T24 длинные палочки YaCP-T21 микрококки Размер клетки, мкм Описание колоний округлые, гладкие, выпуклые, глянцевые, бежевые, край ровный, 1,3×1,0 структура однородная, d=1-3 мм ярко-оранжевые, глянцевые, 1,0 × округлые, гладкие, выпуклые, 0,3-0,5 край ровный, структура однородная, d=1 мм темно-бежевые, глянцевые, 0,8×1,0 округлые, гладкие, выпуклые, почти прозрачные, край кровный, d=5мм. лимонные, глянцевые, округлые, 1,0 гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1 мм светло-лимонные, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, 1,0 край ровный, структура однородная, d=1-3 мм ярко-оранжевые, глянцевые, 1,0×0,3округлые, гладкие, выпуклые, 0,5 край ровный, структура однородная, d=1 мм ярко-красные, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, край 0,5-0,8 ровный, структура однородная, d=1-3 мм светло-оранжевые, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, край 0,3×1,0 ровный, структура однородная d=1-3 мм ярко-оранжевые, глянцевые, 1,0 х 0,3- округлые, гладкие, выпуклые, край 0,5 ровный, структура однородная, d=1 мм грязно-белые, ризоидные, 1,0 ×8,0- морщинистые, выпуклые, тусклые, 15,0 край бахромчатый, структура неоднородная, d=2-5 мм округлые, гладкие, выпуклые, глянцевые, красно-оранжевые, край 1,0 ровный, структура однородная, d=15мм 81 № образца 3 Название культуры Морфология Размер клетки, мкм BCP-T1 микрококки 0,5-0,8 4 AL-R1 микрококки 1,0 4 Al-T3f микрококки 1,0 4 Al-T7 микрококки 1,0 4 Al-T9 микрококки 1,0 4 Al-T13 микрококки 1,0 4 Al-T17 микрококки 1,0 -2,0 4 Al-T15 микрококки 1,0 6 II-15-99-R1 палочки 0,5×1,5 Следующим этапом работы Описание колоний округлые, гладкие, выпуклые, глянцевые, ярко-оранжевые или ярко-красные, край ровный, структура однородная, d=1-3 мм лимонные, тусклые, округлые, гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1 мм округлые, гладкие, глянцевые, флуоресцирующие, лимонные, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1-2 мм ярко-красные, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1-3 мм грязно-кремовые, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная. d=1-3 мм лимонные, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1-3 мм глянцевые, лимонные, округлые, гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1-3 мм лимонные, глянцевые, округлые, гладкие, выпуклые, край ровный, структура однородная, d=1 мм округлые, гладкие, выпуклые, матовые, оранжевые, край ровный, структура однородная, d<1 мм стало определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, выделенных культур, путем прямого секвенирования фрагментов ДНК, полученных в реакции ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров. Полученные нуклеотидные последовательности длиной от 399 до 1473 п.о. сравнили с последовательностями, имеющимися в базах данных RDP и GenBank с использованием программы BLAST (Табл. 14). Филогенетический принадлежат к двум анализ филумам: показал, что Firmicutes и выделенные штаммы Actinobacteria. Филум Actinobacteria представляли 7 штаммов (из образцов № 1, 2 и 6), 82 принадлежащих к роду Brevibacterium; 2 штамма (из образцов № 2 и 3) относились к роду Dietzia, 8 штаммов - к роду Citricoccus (из образцов № 2 и 4) и 1 штамм - к роду Kocuria (из образца №2). Филум Firmicutes был представлен 1 штаммом (из образца №4), относящемуся к роду Lacticigenium и 1 штаммом – к роду Bacillus (из образца №2). Таблица 14. Филогенетическое разнообразие галотолерантных микроорганизмов, выделенных из криопэгов Колымской низменности, п-ова Ямал и Аляски. № образца 1 (Ямал) 1 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 2 (Ямал) 3 (Ямал) 4 (Аляска) 4 (Аляска) 4 (Аляска) 4 (Аляска) 4 (Аляска) 4 (Аляска) Название культуры Длина секвенированного фрагмента гена 16S рРНК, п.н. LYa-T10 1433 LYa-Т5 1473 YaCP-T2 399 YaCP-T20 551 YaCP-T29 1425 YaCP-T38 1444 YaCP-T40 1414 YaCP-T44 1453 YaCP-R4 1417 YaCP-T24 557 Bacillus pumilus (JX847120) 94 YaCP-T21 479 Kocuria sp.(KF840239) 92 BCP-T1 1422 Dietzia maris KF923451 99 AL-R1 415 Citricoccus sp. AB272821 99 Al-T3f 747 Al-T7 1467 Al-T9 1414 Al-T13 913 Al-T17 913 Ближайший гомолог в GenBank Brevibacterium sp., EF612292 Brevibacterium sp. EF612292 Brevibacterium sp. JF970576 Citricoccus muralis KF306363 Citricoccus muralis KF306363 Brevibacterium sp. EF612292 Dietzia maris KF923451 Brevibacterium sp. JF970576 Brevibacterium sp. (EF612292) Citrococcus muralis KF306363 Lacticigenium naphtae NR_041685 Citricoccus nitrophenolicus NR_117546 Citricoccus nitrophenolicus NR_117546 Citricoccus nitrophenolicus NR_117546.1 83 % сходства 98 98 97 99 99 98 100 99 98 99 99 99 100 99 № образца 4 (Аляска) 6 (Колыма) Название культуры Длина секвенированного фрагмента гена 16S рРНК, п.н. Ближайший гомолог в GenBank % сходства Al-T15 335 Citricoccus sp. АВ272821 98 II-15-99-R1 673 Brevibacterium sp. JF970576 98 В результате работы получена коллекция из 20 штаммов чистых культур микроорганизмов, обладающих липолитической активностью. Большую часть коллекции составляют представители актинобактериальных семейств Dietziaceae, Micrococcaceae (роды Citricoccus и Kocuria) и Brevibacteriaceae (род Brevibacterium). Из филогенетической дендрограммы (Рис. 6), построенной с использованием почти полных последовательностей генов 16S рРНК, видно, что штаммы LJa-T10, JaCP-T38 и LJa-T5 представляют один вид рода Brevibacterium, близкий галофильному виду B. marinus, выделенному из морской воды (Lee, 2008). Другой штамм JaCP-T44, также изолированный из криопэга Ямала, генетически близок B. antiquum, типовой штамм которого VKM Ac-2118T выделен из плейстоценовых многолетнемерзлых отложений Колымской низменности (Гавриш и др., 2004). Для двух из семи штаммов, представляющих род были Citricoccus, получены почти полные последовательности генов 16S рРНК. Штамм JaCP-T29 оказался близок виду Citricoccus muralis, а штамм Al-T9 - виду C. nitrophenolicus. Род Dietzia был представлен двумя штаммами, близкими между собой и виду D. maris. Следует отметить, что все известные представители этого рода характеризуются устойчивостью к содержанию до 7-10% NaCl (Gharibzahedi et al., 2014). Наиболее интересным из выделенных бактерий филума Firmicutes оказался штамм Al-T7, генетически близкий единственному виду L. naphtae рода Lacticigenium семейства Carnobacteriaceae. Это факультативно- анаэробные галофильные бактерии, устойчивые к 17% NaCl, основным продуктом метаболизма которых является лактат (Iino et al., 2009). 84 96 JaCP-T29 Citrococcus muralis 4-0T (AJ344143) 91 59 Citricoccus alkalitolerans YIM 70010T (AY376164) 80 Citricoccus nitrophenolicus PNP1T (GU797177) 99 Al-T9 Citricoccus parietis 02-Je-010T (FM992367) 100 Citricoccus zhacaiensis FS24T (EU305672) 87 Micrococcus luteus ATCC 4698T (AJ536198) 86 61 Micrococcus terreus V3M1T (FJ423763) Brevibacterium marinum HFW-26T (AM421807) LJa-T10 100 100 JaCP-T38 LJa-T5 Brevibacterium casei ATCC 35513T (AJ251418) 80 JaCP-T44 61 98 78 Brevibacterium antiquum JCM 13317T (AY243344) Dietzia alimentaria 72T (GQ368824) Dietzia psychralcaliphila ILA-1T (AB049630) 100 98 78 Dietzia schimae YIM 65001T (EU375845) BCP-T1 Dietzia maris ATCC 35013T (X79290) 100 Al-T7 Lacticigenium naphtae MIC1-18T (AB430339) Alkalibacterium pelagium T143-1-1T (AB294166) 100 100 Alkalibacterium psychrotolerans IDR2-2T (AB125938) 0.02 Рис. 6 Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК некоторых штаммов, выделенных из арктических криопэгов. Длина масштабной линейки: 2 замены на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей (―neibour-joining‖). Данные ―bootstrap‖-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. Другой штамм - грамположительная бактерия штамм YaCP-T24наиболее близка была к виду Bacillus pumilus, споры которой, чрезвычайно устойчивы к стрессовым факторам окружающей среды, таким как УФизлучение, высыхание и воздействие окислителей (Link et al., 2004). Штаммы 85 этого вида характеризуются также высокой солеустойчивостью. Ранее была охарактеризована липаза одного из штаммов этого вида (Kim et al., 2002). Анализ литературы показал, что при скрининге на наличие липолитической активности образцов арктических почв и осадков также были обнаруженыпродуценты холодоактивных липаз, относящиеся к филумам Actinobacteria и Bacilli, но большинство исследованных авторами продуцентов принадлежало к грам-отрицательным бактериям, относящимся к филумам Bacteroidetes и Proteobacteria (Srinivas et al., 2009; Rasol et al., 2014). Как видно из Таблицы 5, большинство известных продуцентов холодоактивных липаз относятся к грам-отрицательным бактериям филума Proteobacteria, в том числе к классу Gammaproteobacteria, например, к родам Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Psychrobacter spp и др. (см. Табл. 5). Многие исследователи этих липаз сталкиваются с их нестабильностью под влиянием различных факторов (температура, добавление солей и детергентов и др.) (Joseph et al., 2007; Kulakova et al., 2004). Поэтому полученная нами коллекция грам-положительных галофильных психроактивных бактерий является потенциальным источником более перспективных липолитических холодоактивных ферментов, предположительно, обладающих повышенной стабильностью к различным факторам. Результаты работы показали, что наиболее перспективными для выделения продуцентов липолитических ферментов являются криопэги Ямала и Аляски (Табл. 12). Дальнейшие исследования позволят изучить филогенетические свойства выделенных галотолерантных и галофильных бактерий, обладающих липазной активностью, и установить их таксономическое положение. 5.2 Липолитическая система P.cryohalolentis P. cryohalolentis штамм K5T был выделен из криопэга в вечной мерзлоте Арктики (Bakermans et al., 2006). Подробная физиологобиохимическая характеристика штамма K5T представлена в Табл. 3. Клетки этой аэробной бактерии представляли 86 собой грамотрицательные, неподвижные, непигментированные, неспорообразующие коккобацилы размером 0,9-1,3 мкм в длину и 0,5-0,8 мкм в ширину. P.cryohalolentis образовывал гладкие матовые круглые колонии диаметром 2 мм. Хотя оптимальный рост наблюдался при температуре 22оС, штамм K5T мог осуществлять метаболические реакции при отрицательных температурах до – -10оС. NaCl был необязателен для роста, но рост не ингибировался присутствием соли до 1,7 М NaCl. В качестве единственного источника углерода и энергии штамм использовал цитрат, лактат, ацетат и Lглутаминовую кислоту. Основные жирные кислоты клеточной стенки являются С18:1ω7c и С16:1ω7с. Биохимические тесты показали положительные результаты на щелочную фосфатазу, эстеразу (С4), эстеразу липазу (С8), липазу (С14), лейцинариламидазу и нафтол-AS-BI-фосфогидролазу. 5.2.1 Изучение липолитической активности P. cryohalolentis в зависимости от стадии роста культуры и температуры культивирования Для подтверждения наличия липолитической активности у P. cryohalolentis культуру высевали на агаризованную среду с родамином В и оливковым маслом (среда АСР) или с трибутирином (среда АСТ) и инкубировали при температурах 4 и 25°С. Образование флюоресцирующего окрашивания на среде с родамином В (Рис. 7 а и б) и появление областей гидролиза на среде с трибутирином (Рис. 8 а и б) указывали на наличие липаз у этого организма. При инкубировании при 4°С зона гидролиза и интенсивность окрашивания в УФ была больше. Это свидетельствует о потенциальном наличии именно холодоактивных ферментов у организма. 87 а б Рис. 7 Колонии P.cryohalolentis на среде с родамином В и оливковым маслом в УФ свете: а – выращенные при 4°C, б – выращенные при 25°C. Стрелкой обозначено желтое свечение, указывающее на липолитическую активность. а б Рис. 8 Колонии P.cryohalolentis на среде с трибутирином: а – выращенные при 4°C, б – выращенные при 25°C. Стрелкой обозначены зоны гидролиза. Мы изучили зависимость липолитической активности P. cryohalolentis от стадии роста культуры. Активность измеряли в супернатантах и клеточных экстрактах. Было подтверждено наличие как внеклеточной, так и внутриклеточной липазной активности у P. cryohalolentis (Рис. 9). При этом внутриклеточная активность была выше внеклеточной, что может указывать на наличие у P. cryohalolentis в основном внутриклеточных липолитических ферментов. Мы показали, что как эстеразная, так и липазная внеклеточные активности снижались стационарную фазу роста, в то после перехода культуры в время как эстеразная внутриклеточная оставалась на постоянном уровне. 88 16 7 14 6 12 5 10 4 8 3 6 2 4 1 2 0 0 0 5 10 15 20 25 30 Удельная липазная активность, ед.а./мг белка OD 560 8 Время культивирования, часы Рис. 9 Зависимость липазной активности от стадии роста P. cryohalolentis. ▬●▬ - кривая роста P. cryohalolentis. ▬■▬ - внутриклеточная эстеразная активность с п-НФБ. ▬▲▬ - внеклеточная эстеразная активность с п-НФБ. ▬х▬ - внеклеточная липазная активность с п-НФП. Схожие результаты были получены при изучении липолитической системы Acinetobacter calcoaceticus BD413 (Kok et al., 1993). Внутриклеточная эстеразная активность этого микроорганизма возрастала при переходе в стационарную фазу роста и оставалась неизменной при дальнейшем культивировании. В то же время внеклеточная липазная активность после 16-ти кратного скачка вверх при переходе из экспоненциальной стадии роста в стационарную при прекращении роста культуры резко снижалась. Напротив, внутриклеточная эстеразная активность A. calcoaceticus RAG-1 и Acinetobacter sp. 016, снижалась в стационарной фазе роста, а внеклеточная возрастала (Shabtai and Gutnick, 1985), (Breuil and Kushner, 1975). Внеклеточная липазная активность P. cryohalolentis равномерно нарастала в экспоненциальной фазе роста и также снижалась в стационарной, в отличие от A. calcoaceticus BD413, чья липазная активность резко падала при прекращении роста культуры (Kok et al., 1993). 89 Сходный результат был получен для Staphylococcus warneri M (Yokoi et al., 2012). 5.2.2 Моделирование липолитической системы P.cryohalolentis Наличие полной геномной последовательности P.cryohalolentis K5T в базах данных [http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?gn:T00350] позволило нам осуществить идентификацию и последующее клонирование генов потенциальных липолитических ферментов этого микроорганизма. Как было указано выше, липолитические ферменты относятся к семейству α/β гидролаз.12 генов P. cryohalolentis были аннотированы как последовательности, кодирующие белки, относящиеся к данному семейству (Табл. 15). Все обнаруженные потенциальные липолитические ферменты P. cryohalolentis преимущественно состоят примерно из 300 а.о., за исключением Pcryo_2458, включающего 483 а.о. Мы провели поиск в геноме P. cryohalolentis гомологов известных липаз/эстераз родственных бактерий для последующего выбора генов для клонирования. Таблица 15. Белки P. cryohalolentis, относящиеся к семейству α/β гидролаз. Число Название Последовательность белка гена Pcryo_0023 аминокислотных остатков MLLKRLGLATLLSFSVVGCTTAPNTLAINTTQKIIQYERSKSDLTTQSFTLSSGDKIV 315 YAENGNVAGEPLLLVHGFGGNKDNFTRIARQLENYNLIIPDLLGFGDSSKPMAAD YHSEAQATRLHELLQAKGLASSIHVGGNSMGGAISVAYAAKYPKEVKSLWLIDSA GFWSAGVPKSLESATLENNPLLVDKKEDFYAMYDFVMSKPPYIPKSVKAVFAQER IANKALESKILAQIVEDNVEQRAKVITEYNIPTLVVWGEEDKVIKPETVTLIKEIIPQS QVITMPKIGHVPMIEAVKDTANDYKAFREGLKN Pcryo_0089 MEAYTNRINLAGRQARYYDLQQLGSANQTDYKRAPAHFYGGNSFTVGTYTPLLN ELAASFELSSLALRGYWYDKPQARRLTREQDAEMLIEFLEKTQDKPVVGIGHSQG ATATAIAAAQRPELFSELYLIEPVTFTKKQARIYNLLPRQFLLSQEPFKSTVTKQTT WASIQEYFDHLREQRAYQRISDINLKTFATQNLSTNNDGSYTLLFSPEQELANYFG APHIDAALKKLSCPYTLITGKPTLFINPKVRKQWHKFVPDSSIISLPEYGHLLPMEAP EICAQIINEHYQSNK 90 295 Число Название Последовательность белка гена Pcryo_0443 аминокислотных остатков MTLKPSLRAVLTPSAFLPSLGAIVTGALLMTMQATSAQAAGQYYNCANADGCQL 351 VSSQYFTSDHTKTKYPVVLAHGMAGFTKMFGLVDYFYGIPETLMSGGSQVYTTKT SSFNNSEIRGEQLLQKIKTISAISGSPKVNLLGHSQGGIDIRYVAGVAPEYVASVTAI GSPEQGSKTADAVMQTLSEDSLATQAVSVFFQLFGGVTDVGSGTSPTELNKQEAW NTAVALSTDGAAKFNAKFPAAMPTSYCGQPTGTEANGIKYYSFSGVGQITNGLDP SDYMLALTGTSFDNDPNDGLVSACSSRLGYVIRDDYRMNHLDSANQLLGLTAWG QPDPKTLYRDQVNRLKKANL Pcryo_0726 MSNNEQITSSDNTHYLHHTFFEPSHSDTVISATLLIVHGMAEHSGRYADVAQFLAD 310 HGIAVATYDQLGHGKTVKSAKDLGFFGEEHPVQSLLKDVIVMADSLKARHPNVPH FVMGHSMGSFIVRNVLKHHARNFTGAILMGTADANPLIKVLLPINKLLTKAAPKKP NTLFANVMNKVLNSKLNNRISSSKFAWLSENPAAVEAYEADPLTGFDFTNNGFMT LFTLMNAGLHKNWAMTIAKDFPMLLISGENDPIGDMGRGIRNIANRLDRQHFDHV SVQLYPHMRHEPLHEQNKEQVYQDILGWINSNT Pcryo_0751 MPMIHVNDIDIYYEDSAPNDKQKPIMVFAHGLLWNTRMFDNQVEYFKAGYRCIAF 270 DFRGQGQSEITKSGYDMETLTEDTLALLDALDIQQCHFLGLSMGGFVAQRIALKRP ELLLSLTLLETSADPEDPKNVPQYRKLIKAIRWLGMKRVSQKVMPIMFGSSFLADK SRKTDRREWLSMLQSNRKGGVIKATTGVIERSATYDQLSDIKTPTLIIVGDEDVATP YAKAERMHFAIAGSKLVVIKGAGHTATVEEPEQVNKAINKFLVNFI Pcryo_0934 MPNINVNGTTLVYSDQGPKDAPVLVMCHSLFFDQTMFAHQTEYFSKTIRIVSYDLR 266 DQGQSSRSDLKSVDMDTHTDDAIALIEALNLAPCFFAGNSMGGFIALRLAARRPDL LKGCIVLGSSGELEYKLSDFSPLIDGVNAQGTEPFIDTLMYIMFGDDYLADASRASE REYWRDHMLKLGPDIARSAHGVIHRTGVLDELKDCKVPMLILAGEQDHAYEVPLS HNIAQTVADSQMFVIPKAGHSVALEQPKIVNEYISDFISEHS Pcryo_1199 MTEKNNIDNAAKLPDSSDSSSSYPTPEWQKFGEHLWDASDLSEHLYQAMIDIGDGI 345 ELCVEAGGNPNHPPLLMIMGLGSQMIFWPNHFIKRLIDAGFFVIRFDNRDIGLSSKV QIDGLPRISQLKMMMRLQTGLSNKGAQVAYNLTDMAEDTARLIKALQLGKTHLL GASMGGMIAQIVAARYPSLVQRMALMFTTTNRAFLKPPKPRQLYTLINRPESHSER DIVRHSVWFMKTVGTPGHVNVRMVRDIAKIRYQRNFHPLGTVQQLNAILASGSISR FSKQVKAPTIVLHGSADGLIPASQGRVVAKTIPNAKFHLIEGMAHDIPEYYQPYMV DLISNHLLEK Pcryo_2196 MKALNNDVQRPKVGMSKLVRVGVTTALAVGSIALATQQAQALSALAIVNGITSN 316 GGIGVSKDILYGDEPLQDLDIYYPKPLAQAMKTNTTIKQDYPMVVFVHGGSWESG SKEEYAFVGQSLAQAGYVTAVINYRKAPEHVYPDYVEDTAQAIAWSYKNAKRFH ANPERFAVVGHSAGAFNAVAAVANEDFLKPYGIKPKDITAVIGIAGPYSYDFRKFS SVTAFAADATPDEVMPDRQIKGQQPPYLLLTAEKDKVVYATNTIKMTQALKAAG VTVQTSEIAGASHATSIGAMAPPLRWVNDVRAQVLSYLDKTFK Pcryo_2203 MLTENLKFVSTKDNVQIAIWHIFDSEKQQYLSDSSTHKAQNIFLTHGTFSDKKTCL RIAEYLAILGHHCYIMEWRGHGASSASKDKFNFETIATYDFAATFDYLCHQLNLDN LHCVTHSGGGIGLIMFLIQNPDYIDKINSISLFACQAYGAALHPINRVKIFIAKYLNR LSGYIPAQKLKLGPVNESYHTMKQWYDWNLQQNFHSSFIKQGDTNKSNVNKNRA THILADPEPFDYRQHMPKITIPIYAISAKGDQFISPTLGCRALFNNFNNHANIFREYSL SNGNLDDYTHSRILNSRHAAKEIWPTVAAWIDKHSD 91 319 Число Название Последовательность белка гена аминокислотных остатков Pcryo_2266 MHYLMKRNLIKLPANYQLKTIDIALTDGTLLPVSVIGNGKPMLLLHAYGMDTREF 322 LPFILPLVGNYAFYLPHLRGFGAAKDIKLTQFDFVRQYADDISIVIEQICLARNIESLP VAAISMGAQVMWAYFERYGSARVSRYLNIDQSPAIHNQPDWQGGLFGTRQQEVF DIFHEVIDKTLPYADIKSFTHLPFALKRRATDVERLFSLLSVNRTRSKAFIQVMTYK NDPKLALYEHSIWHHKMRCLQAYLTLPYDFRGAIEQVTIPVVNLIGGRSKLYNAK WQQKVTQMLPNATEVVLPRSGHAVPMDEPIGFYKVLKSFLET Pcryo_2267 MPYVKVATQNEQPVELYYEIQGTGKPVVLIHGWPLSGRAWESQLPALVEAGYQVI 278 TYDRRGFGKSSQPWNGYDYDTLAQDLKALMDELDLTNATIVGFSMGGGEVARYL GKYGSERVSKTVLASAVPPYLYKADDNPEGGLEKQDIQEFLDGVSGDRIAFLNDFT KQFFTPKDGTLLVSKPLRLYNRDIAAFASAKASYDCVKAFSYTDFRDDLKAFDVP NLVIHGDADQIVPLEVSGQRSHEMIADSQLHIVEGGPHGINVTHAKEFNEALIAFLN S Pcryo_2458 MSNSTVLSVNTLLNKAVKTLNLMSFGQDKNPKSTDINISAEIMDIDESALQDSRED 483 KGLSIKEKILEHHLMTNYQPHLLHYAIKSFGCLPTPILESLIKCLDGPTSKQYLHVDA HLRLILAVNSKLKTPLQLIEMSELRKRFATDAVAMQAPKVWQQASDNLLSNLKQF HKKGDSAISWQDRTIANADDGDMTIRCYQNETSDNGFGFKKEQTSNPDETVLLFF HGGGFCIGDLNTHHEFCHAICEQTGWPVISVDYRLAPEHPAPAAVRDCISAYAWL AEHCEEFGALPSRIVLAGDSAGGGLSTLMAQQIITPNKEAWLDLGDEGQKTFDILQ GLPHPMAQMPLYPVTDIETDYPSWELYGEGLLLDHADVAIFDAACLENSPLPRQHI LTSPMLGDNRQVCPSYVVAAELDVLRDEAFAYADQLKSYGIAVQTHTVLGAPHG FIHFMSVHQRLGQETQHIITGFANFVREIIKTRALLSA Для поиска гомологов были использованы аминокислотные последовательности липазы 1 P. immobilis (Q02104, Arpigny et al., 1993), эстеразы PsyEst Psychrobacter sp. Ant300 (Q769C8, Kulakova et al., 2004), и липазы B. cepacia (P22088, Joergensen et al., 1991). В качестве гомологов этих белков в геноме P. cryohalolentis были идентифицированы кодирующие последовательности Pcryo_0023 (EstPc), Pcryo_2458 (Lip1Pc) и Pcryo_0443 (Lip2Pc) соответственно. На основании биохимической характеристики P. cryohalolentis можно было ожидать, что в его геноме содержатся последовательности, кодирующие как липазу (С14), так и эстеразу (С4). В геноме родственного вида P. arcticus присутствуют только нуклеотидные последовательности соответствующие эстеразе (С4) (Bakermans et al., 2006). Результаты наших исследований также подтверждали это, так как тесты с культивированием на средах с трибутирином (С4) и оливковым маслом (С18) P. cryohalolentis 92 давали положительный результат. С целью идентификации гена, кодирующего липазу P. cryohalolentis, был проведен поиск гомологов потенциальных липолитических ферментов P. cryohalolentis в геноме P. arcticus. Было обнаружено, что геном этого микроорганизма содержит кодирующую последовательность гомолога Pcryo_0023 (Psyc_1191). Последовательности, обладающие существенной гомологией с Pcryo_0443 и в Pcryo_2458, предполагать, нем что не были обнаружены. эти белки обладают Таким образом, способностью можно расщеплять триглицериды с длинной ацильной цепью, в то время как Pcryo_0023 является эстеразой. Исследование аминокислотных последовательностей целевых белков при помощи различных алгоритмов позволило обнаружить некоторые дополнительные особенности их строения. Так, c использованием программ SignalP и LipoP было идентифицировано наличие отщепляемых сигнальных последовательностей (СП) в молекулах Pcryo_0023 и Pcryo_0443. Обе эти последовательности включают N-концевой участок, содержащий положительно заряженные остатки (n), центральный гидрофобный участок (h) и C-концевую часть, включающую сайт узнавания сигнальной пептидазы (Рис. 10). При этом строение первой из них, имеющей длину 18 а.о., указывает на то, что белок Pcryo_0023 является липопротеином. Pcryo_0023 MLLKRLGLATLLSFSVVG↓CTTA ←n →←h →←c Pcryo_0443 → MTLKPSLRAVLTPSAFLPSLGAIVTGALLMTMQATSAQA↓AGQ ← n →← →←c h → Рис. 10 Структура отщепляемых сигнальных последовательностей белков Pcryo_0023 и Pcryo_0443. Стрелками обозначены предполагаемые участки отщепления. 93 Pcryo_0443 содержит сигнальную последовательность длиной 39 а.о. Длинные СП характерны также для гомологичных липаз, например, СП липазы B. cepacia состоит из 44 а.о., B. glumae – из 39. По сравнению с классическим устройством данная последовательность обладает увеличенным центральным участком. Предполагаемый сайт расщепления сигнальной пептидазой I соответствует консенсусной последовательности AX-A (Tuteja, 2005). Изучение строения соответствующего участка генома показало, что в 3‘ направлении от гена Pcryo_0443 располагается ген Pcryo_0444 (Рис. 11). Мы показали, что аминокислотная последовательность белка Pcryo_0444 гомологична последовательности шаперонов, например, белка LimA B. cepacia (P22089), которые обеспечивают приобретение липазами третичной структуры в периплазме бактериальных клеток и их секрецию в культуральную жидкость, как описано в разделе 3.2. Таким образом, можно предположить, что экспорт Pcryo_0443, как и гомологичных ферментов, осуществляется при участии шаперона Pcryo_0444. Рис. 11 Строение участка генома P. cryohalolentis, содержащего ген Pcryo_0443. В составе аминокислотной последовательности Pcryo_2458 не обнаружен участок, кодирующий отщепляемые СП. Кроме того, этот белок содержит 10 остатков цистеина, что характерно для цитоплазматических белков. Таким аминокислотных образом, результаты последовательностей предварительного Pcryo_0023 (EstPc), анализа Pcryo_0443 (Lip2Pc) и Pcryo_2458 (Lip1Pc) позволяют предположить, что Pcryo_2458 (Lip1Pc) локализован в цитоплазме клеток P. cryohalolentis, в то время как 94 Pcryo_0023 (EstPc) и Pcryo_0443 (Lip2Pc) являются секретируемыми белками. При этом первый из них может быть прикреплен к поверхности клеток при помощи липопротеинового сигнала, а второй секретируется в культуральную жидкость при участии специализированного шаперона Pcryo_0444 (LifPc) (Рис. 12). Рис. 12 Схема предполагаемой липолитической системы P.cryohalolentis (на основании биоинформационного анализа).CM – культуральная среда; OM – наружняя мембрана; PP – периплазма; IM – внутренняя мембрана; CP – цитоплазма; SS – СП; LPSS - липопротеиновый сигнал; LifPc – стерический шаперон фермента Lip2Pc; EstPc, Lip1Pc, Lip2Pc – липолитические ферменты P.cryohalolentis; Sec, Xcp – компоненты секреторной системы P. cryohalolentis. 5.3 Холодоактивные липолитические ферменты P. cryohalolentis 5.3.1 Получение и характеристика EstPc 5.3.1.1 Анализ аминокислотной последовательности EstPc Кодирующая последовательность EstPc была идентифицирована в геноме P. cryohalolentis K5T на основании гомологии с липазой P. immobilis (Arpigny et al., 1993). Степень сходства аминокислотных последовательностей этих двух белков составила 89 гомологичных и 78% идентичных остатков. Позже были опубликованы аминокислотные последовательности липаз, обнаруживающих более высокую степень идентичности с EstPc: Lip-1452 из Psychrobacter sp.G (98 и 97%) и LipX из 95 Psychrobacter sp. C 18 (90 и 79%) (Xuezheng et al., 2010; Chen et al., 2011) (Рис. 13). Ген estPc состоит из 948 п.о., кодирующих 315 аминокислотных остатков. Содержание GC пар в гене составляет 43,99%. Рассчитанные М. м. и изолектрическая точка составили 34562,7 Да и 6,55 соответственно. Известно, что многие штаммы Psychrobacter содержат в своем геноме гены липаз/эстераз, в том числе холодоактивных (Arpigny et al., 1993, 1995; Yumoto et al., 2003; Kulakova et al., 2004; Zhang et al., 2007, Chen et al., 2011). Филогенетический анализ показал, что некоторые из этих белков имеют схожие аминокислотные последовательности (Рис. 13) и вместе с EstPc принадлежат к семейству V липолитических ферментов (Arpigny and Jaeger, 1999). Для них характерно наличие дипептида HG в N-концевой части белка и мотива GXSXG, содержащего каталитический остаток серина (Рис. 13). У EstPc этот мотив окружен дополнительными остатками глицина, что, предположительно, может способствовать увеличению конформационной подвижности активного центра, характерному для холодоактивных белков. Соотношение числа остатков Lys к суммарному числу положительно заряженных остатков (Lys+Arg) в EstPc составляет 0,28, что также является характерным для холодоактивных белков (Borders et al., 1994). На основании структурной гомологии в составе EstPc было определено расположение аминокислотных остатков, образующих каталитическую триаду (S142, D264, H292) и оксианионную полость (F76, M143). При помощи программ SignalP и LipoP было показано наличие липопротеиновой сигнальной последовательности (СП) на N-конце белка и EstPc сайта узнавания сигнальной пептидазы между 18 и 19 аминокислотными остатками (VVG-CT). Другой возможный сайт узнавания был предсказан между 27 и 28 остатками (TLA-INT). Липопротеиновые СП широко распространены в бактериях. Они обычно включают положительно заряженный N-концевой участок, гидрофобную сердцевину и консенсусный участок "липобокс" (L,V, I)-(A, S, 96 T, G) –(G, A)-C, включающий сайт расщепления сигнальной пептидазой II между Gly/Ala и модифицированным остатком Cys (диглицеридцистеином) (Braun and Wu, 1993; Babu et al., 2006). Все эти особенности присутствуют в первичной структуре СП EstPc, что указывает на его липопротеиновую природу. Известно, что после отщепления сигнального пептида между Gly/Ala и модифицированным Cys (диглицеридцистеином) в процессе секреции белка, он может быть прикреплен к мембране. Точная локализация белка во внешней или внутренней мембране определяется аминокислотными остатками в N-концевой части белка, следующими за остатком цистеина в положениях+2, +3, +4). Если в позиции (+2) присутствует остаток аспарагиновой кислоты, то считается, что белок локализован во внутренней мембране, а если серин или другие аминокислотные остатки, то белок аккумулируется во внешней мембране (Seydel et al., 1999; Yamaguchi et al., 1988). У EstPc в положениях +2 and +3 обнаружены остатки Thr, что указывает на то, что белок ассоциирован с внешней мембраной P. cryohalolentis. Также с помощью программы PSIPRED v3.3 (Predict Secondary Structure) (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), была предсказана вторичная структура EstPc, включающая 32% -спиралей, 16,8% β-слоев и 51,2% неупорядоченной структуры (Рис. 14). Таким образом, EstPc, как и другие липолитические ферменты, относится к структурному семейству α/βгидролаз. Молекулы представителей этого семейства характеризуются наличием центрального домена, который включает β-слой, образованный 511 β-тяжами и фланкированный с обеих сторон α-спиралями (Ollis et al, 1992). Наличие значительной доли неупорядоченной структуры может свидетельствовать об адаптации пространственной структуры белка к активности при пониженных температурах (D‘Amico et al., 2003). 97 Рис. 13 Множественное выравнивание аминокислотной последовательности белка EstPc (0023) из P.cryohalolentis K5T и последовательностей липаз: D2XSH3, Psychrobacter sp. G; D4P8C9, Psychrobacter sp. C 18; P24640, 3 Moraxella sp.TA144; Q02104, P. immobilis; Q1M315, некультивируемая почвенная бактерия; Q2KTB5, Psychrobacter sp. 7195. Аминокислотные остатки, относящиеся к каталитической триаде, обозначены - ●, к оксианионной полости - ▲. 98 Рис 14 Потенциальная вторичная структура EstPc, предсказанная с помощью программы PSIPRED. 5.3.1.2 Экспрессия гена estPc в E.coli На первом этапе работы с использованием ген-специфических праймеров мы амплифицировали из геномной ДНК P.cryohalolentis K5T полноразмерный ген estPc. Он был клонирован в вектор для экспрессии на основе pET32а под контролем сильного регулируемого промотора Т7lac. При этом на 3‘-конце полученного гена располагалась последовательность, кодирующая гексагистидиновый фрагмент, для последующей очистки белка при помощи металлоаффинной хроматографии. Изучение экспрессии этого гена в клетках E.coli BL21(DE3) методом белкового электрофореза не обнаружило наличия белкового продукта соответствующей массы. Мы предположили, что вероятной причиной 99 отсутствия или крайне низкого уровня экспрессии полноразмерного гена estPc может быть его неправильная локализация в клетках E. coli. Возможно, система секреции E. coli некорректно распознает липопротеиновую сигнальную последовательность EstPc, что приводит к активации протеолитической системы клеток и расщеплению рекомбинантного белка. Для проверки этого предположения мы осуществили делецию 27 кодонов, соответствующих сигнальному пептиду. Клонирование укороченного гена, содержащего 867 п.о. в тот же плазмидный вектор привело к получению плазмиды pEstPc. Исследование лизата индуцированных клеток, трансформированных данной плазмидой, при помощи белкового электрофореза показало, что в них происходит эффективный синтез рекомбинантного белка с молекулярной массой 33 кДа (Рис. 15), что соответствует рассчитанной молекулярной массе зрелой эстеразы EstPc (32,985.6 Да) (Рис. 16, дорожки 3-12). Большинство известных липаз/эстераз Psychrobacter имеют сходную молекулярную массу (Chen et al., 2011; Zhang et al., 2007; Xuezheng et al., 2010). В процессе подбора оптимальных условий полученного штамма-продуцента было установлено, что культивирования максимальный уровень синтеза рекомбинантного белка EstPc наблюдался при выращивании культуры в течение 4 часов в присутствии 0,1 мМ ИПТГ при 27С (Рис. 15 дорожка 6). В этих условиях было проведено препаративное культивирование штамма-продуцента. Большая часть продукта экспрессии находилась во фракции растворимых клеточных белков, что вероятно указывает на наличие правильной конформации рекомбинантного белка. 100 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 Рис. 15 Подбор условий индукции EstPc. Электрофореграмма клеточного лизата штамма E. coli BL21(DE3), трансформированного pEstPc. М- маркеры молекулярного веса белков (кДа); 1 – общий клеточный белок из неиндуцированных клеток; 2-10 - общий клеточный белок из клеток E. coli после индукции при условиях: 2- 0,05 мМ ИПТГ, 2 часа, 27ºС; 3- 0,05 мМ ИПТГ, 4 часа, 27ºС; 4- 0,05 мМ ИПТГ, 4 часа, 37ºС; 5- 0,1 мМ ИПТГ, 2 часа, 27ºС; 6- 0,1 мМ ИПТГ, 4 часа, 27ºС; 7- 0,1 мМ ИПТГ, 4 часа, 37ºС; 8- 0,2 мМ ИПТГ, 2 часа, 27ºС; 9- 0,2 мМ ИПТГ, 4 часа, 27ºС; 10- 0,2 мМ ИПТГ, 4 часа, 37ºС. Стрелкой показано положение белка EstPc. 5.3.1.3 Очистка рекомбинантного EstPc Белок EstPc был очищен c помощью Ni-аффинной хроматографии. На колонку со смолой наносили супернатант, полученный после обработки биомассы клеток штамма-продуцента ультразвуком и центрифугирования. Объединенные фракции, содержащие рекомбинантный EstPc и имеющие электрофоретическую чистоту более 90% (Рис. 16 дорожки 4-8), диализовали для избавления от имидазола, после чего стерилизовали фильтрованием. При аналитической гель-фильтрации очищенного EstPc на колонке Superdex 7510/300GL ("GE Healthcare", США) время выхода белка составляло 28,7 мин, что соответствовало мономерной форме препарата (Рис. 17). 101 Рис. 16 Очистка белка EstPc с помощью Ni-аффинной хроматографии. Электрофореграмма фракций: 1 – фракции несвязавшихся с носителем белков; 2 – фракция белков, смытых 30 мМ имидазола; 3-12 –фракция белков, элюированных 300 мМ имидазола. М- маркеры молекулярного веса белков (кДа). Стрелкой показано положение белка EstPc. Рис. 17 Аналитическая гель-фильтрация очищенной эстеразы EstPc на колонке Superdex 75-10/300 GL. 5.3.1.4 Исследование ферментативной активности EstPc Липолитическую активность EstPc измеряли с использованием п-НФБ в качестве субстрата. Чистота белка после Ni-аффинной хроматографии по сравнению с грубым экстрактом клеток повысилась в 3,7 раза. Выход рекомбинантного белка с удельной активностью 8767 ед.а./мг белка составил около 30 мг из 1 л культуры. 102 Субстратная специфичность EstPc Для определения субстратной специфичности EstPc проводили реакцию в присутствии эфиров п-нитрофенила и жирных кислот с различной длиной углеводородной цепи (С2-С16). Максимальную относительную активность фермента наблюдали при использовании п-НФБ (С4) в качестве субстрата (100%), активность в отношении С8 составляла 72,8%, а при использовании п-НФП (С16) она не превышала 2% от максимальной (Рис. 18). Эти результаты позволяют утверждать, что полученный белок является эстеразой, а не липазой. Длина углеводородной цепи субстрата C16 C12 C10 C8 C4 C2 0 20 40 60 Относительная активность, % 80 100 120 Рис. 18 Специфичность EstPc по отношению к субстратам с разной длиной углеводородной цепи (C2, C4, C8, C10, C12 и C16). Активность с п-НФБ (С4) была принята за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Активность в зависимости от рН EstPc была активна в органических и неорганических буферах с различным рН, но максимум эстеразной активности наблюдался в буфере с рH 8,5 (Рис. 19). 103 120 Относительная активность, % 100 80 60 40 20 0 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 рН Рис. 19 Влияние различных буферов на активность белка EstPc. Фермент инкубировали в реакционной смеси, содержащей 0,25 мМ п-НФБ и буферы с различным рН, при 25ºC в течение 15 минут. Использованные буферы (конечная концентрация 50 мМ) К-фосфатный (▬▲▬pH 5,6–8,0) и Трис-HCl (▬■▬pH 8,0–9,5). Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. За 100% принимали активность в буфере Трис-HCl (pH 8,0). Активность и стабильность EstPc в зависимости от температуры Максимальная эстеразная активность EstPc наблюдалась при 35ºC. При этом активность EstPc при 5ºC и 10ºC составила 90,5 и 91,5% соответственно. При температурах выше оптимума активность белка резко снижалась и составляла 60% при 40ºC, а при 45ºC только 8% (Рис. 20). 120 Относительная активность, % 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Температура, 0С Рис. 20 Зависимость активности белка EstPc от температуры. Фермент инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 минут. Активность при 35ºС принимали за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. 104 Термостабильность рекомбинантной EstPc определяли после инкубирования белка при различных температурах (-20, 4, 20, 30, 40, 60, 80, 90ºC)в течение 1 часа, остаточную активность измеряли при 25ºC. Было показано, что EstPc обладает сравнению с другими повышенной холодоактивными термостабильностью липазами/эстеразами. по После инкубирования при 60 и 80ºC в течение 1 часа активность EstPc снижалась до 72 и 63% от начального значения. Инкубирование при 90ºC в течение 1 часа снижало активность более, чем на 70% (Рис. 21). 120 Остаточная активность, % 100 -20ºС 5ºС 20ºС 30ºС 40ºС 60ºС 80ºС 90ºС 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, мин Рис. 21 Термостабильность белка EstPc. Фермент инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) при различных температурах в течение 1 часа и измеряли остаточную активность после инкубации с 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 минут при 25ºС. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Активность до прогрева принималась за 100%. Влияние концентрации соли, ионов металлов, детергентов и органических растворителей на эстеразную активность EstPc Добавление NaCl в реакционную смесь резко увеличивало активность эстеразы (180% от активности в буфере без соли). Дальнейшее увеличение концентрации соли от 0,25 М до 1,75 М оказывало незначительное влияние на активность EstPc (Табл. 16). Нами также было исследовано влияние различных добавок на активность фермента. Известно, что ионы металлов и хелатирующие 105 соединения влияют на липазную активность (Chakraborty and Paulraj, 2009). Установлено, что эстеразная активность EstPc частично подавлялась ионами Mg2+ (остаточная активность 94%), Co2+ (93%), Ni2+ (74%),Cu2+ (49%), 2меркаптоэтанолом (69%) и полностью ингибировалась ионами Zn2+ и ФМСФ (остаточная активность с этими добавками составила 0,8 и 6,7% соответственно). Ион Mn2+ и ЭДТА оказывали стимулирующее воздействие на активность EstPc (113 и 134% остаточная активность соответственно), а ионы Ca2+ не влияли на нее (Табл. 17). Таблица 16. Влияние NaCl в различных концентрациях на эстеразную активность EstPc. NaCl, M Относительная активность, %* Нет 100,0 0,25 179,8±6,1 0,5 174,6±2,5 0,75 178,5±1,1 1,0 179,0±2,6 1,25 178,6±1,4 1,5 183,4±5,7 1,75 179,4±3,1 *EstPc (1мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные концентрации NaCl (0-1,75 М). Относительную активность измеряли в присутствии 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 минут при 25ºС. Представлены средние значения из трех опытов ± стандартное отклонение. Таблица 17. Влияние ионов металлов и различных добавок на эстеразную активность EstPc. Добавки (1мM) Относительная активность, %* Нет 100,0 MgCl2 94,1±0,9 NiCl2 74,1±1,3 CuCl2 49,4±2,5 CoCl2 93,2±4,6 ZnSO4 0,8±0,5 CaCl2 101,3±0,8 MnCl2 113,1±1,2 ЭДТА 134,6±2,3 ФМСФ 6,7±0,7 NaN3 121,2±3,4 2-меркаптоэтанол 68,7±2,3 * EstPc (1мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и добавки в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли в 106 присутствии 0,25 мМ п-НФБ при 25°C. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Присутствие неионных детергентов Тритона X-100, Твина-20 и CHAPS повышало эстеразную активность на 16-20%, в то время как ДСН полностью ингибировал ее (Табл. 18). Все использованные органические растворители в концентрации 5-10% снижали активность эстеразы в 1,5-3 раза, за исключением ДМСО, не влияющего на нее (Табл. 19). Таблица 18. Влияние детергентов на эстеразную активность EstPc. Относительная активность, %* Детергент Концентрация, % (об/об) 0,05 0,5 Нет 100,0 100,0 ТритонX-100 119,1±0,2 117,1±0.8 Твин 20 121,2±0,8 116,7±0.1 CHAPS 120,5±1,2 116,5±0,1 ДСН <0,5 <0,5 * EstPc (1мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные детергенты, в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли в присутствии 0,25 мМ п-НФБ при 25°C. Представлены средние значения из трех опытов ± стандартное отклонение. Таблица 19. Влияние органических растворителей на эстеразную активность EstPc. Относительная активность, %* Органический Концентрация, % (об/об) растворитель 5,0 10,0 Нет 100,0 100,0 Ацетонитрил 28,0±0,5 1,6±0,3 Этанол 88,3±1,2 60,0±0,6 Метанол 92,0±1,5 69,0±1,3 ДМСО 105,4±2,1 95,0±2,1 ДМФА 45,7±0,7 9,0±0,8 * EstPc (1мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные органические растворители в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли в присутствии 0,25 мМ п-НФБ при 25°C. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами была получена холодоактивная эстераза EstPc, имеющая удельную активность 107 больше 8000 ед. а./мг и обладающая высокой липолитической активностью при пониженных температурах и повышенной термостабильностью. 5.3.2 Получение и характеристика Lip1Pc 5.3.2.1 Анализ аминокислотной последовательности Lip1Pc Кодирующая последовательность Lip1Pc была идентифицирована в геноме P.cryohalolentis K5T на основании гомологии с эстеразой Psychrobacter sp. Ant300 (Kulakova et al., 2004). Степень сходства между этими двумя белками составляет 72% гомологичных и 61% идентичных остатков. В 2010 последовательность году липазы была опубликована из D2XSH4 аминокислотная Psychrobacter sp. G, обнаруживающая более высокую степень гомологии с Lip1Pc (99%), однако авторам не удалось добиться функциональной экспрессии этого белка в клетках E. coli (Xuezheng et al., 2010). Среди наиболее близких Lip1Pc белков можно отметить также холодоактивную липазу из Psychrobacter sp. 2-17 (Parra et al., 2008) и Lip2 из Moraxella (Feller et al., 1991) (Рис. 22). На основании гомологии с родственными белками было сделано предположение, что Lip1Pc принадлежит к семейству IV липолитических ферментов (семейству HSL; (Arpigny and Jaeger, 1999). Аминокислотные последовательности обнаруживают липаз и значительное каталитического домена эстераз, составляющих сходство с это семейство, последовательностью гормончувствительной липазы (HSL) млекопитающих (Langin et al., 1993) и присутствие характерных мотивов HGGGF и GDSAG, последний из которых включает в себя каталитический остаток серина. На основании гомологии аминокислотных последовательностей в молекуле Lip1Pc было предсказано расположение аминокислотных остатков, образующих каталитическую триаду (S299, D414, H444) и полость оксианиона (G228, A300) (Рис. 22). 108 Рис. 22 Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белка Lip1Pc (2458) и последовательностей гомологичных липаз/эстераз: D2XSH4, липаза Psychrobacter sp. G; 3004244A, эстераза Psychrobacter sp. Ant300; P24484, липаза 2 Moraxella sp.TA144; A6N2U6, липаза Psychrobacter sp. 2-17. Подчеркнуты последовательности аминокислотных остатков, характерные для липаз семейства HSL. Аминокислотные остатки, образующие каталитическую триаду, обозначены ●, полость оксианиона - ■. Продуцентами липаз, относящихся к семейству HSL , могут быть как термофильные микроорганизмы (Alicyclobacillus acidocaldarius, Archeoglobus fulgidus), так и мезофилы (E. coli, Alcaligenes eutrophus), и психрофилы 109 (Moraxella sp., P. immobilis) (Arpigny and Jaeger 1999). При этом адаптации микроорганизмов к росту при определенной температуре соответствуют определенные особенности аминокислотного состава липаз, относящихся к этому семейству. Сравнение аминокислотного состава Lip1Pc и представителей семейства, выделенных из более теплых местообитаний, подтвердило наличие указанных закономерностей, включая увеличение числа полярных остатков (S, T, N, Q, C), снижение содержание пролина, глутаминовой кислоты и аргинина по сравнению с брефелдином A из мезофильной бактерии B. и subtilis карбоксилэстеразы EST2 из термофильного микроорганизма A. acidocaldarius (Mandrich et al., 2004). Например, содержание остатков аспарагина в Lip1Pc составляет 3,9% по сравнению с 2,22 и 1,94% в брефелдине A и карбоксилэстеразе EST2 соответственно. Преобладание остатков лизина по сравнению с аргинином (4,8 против 3,1%) тоже является типичным свойством холодоактивных белков (Табл. 20). Таблица 20. Содержание (в %) некоторых аминокислотных остатков в последовательностях Lip1Pc, брефелдина A B. subtilis (BREFA) и карбоксилэстеразы EST2 A. acidocaldarius. Анализ проведен с помощью программы ProtParam. Аминокислота Lip1Pc BREFA EST2 R 3,1 7,5 5,16 N 3,9 2,22 1,94 C 2,1 0,55 0,32 Q 5,2 0,55 3,87 G 5,6 6,09 6,45 K 4,8 0,28 3,87 P 5,0 6,0 9,0 S 6,6 5,0 4,2 T 5,6 5,54 2,58 110 Анализ первичной структуры Lip1Pc с помощью программы SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) не обнаружил наличия сигнальной последовательности на N-конце этого белка.Предсказание вторичной структуры Lip1Pc с помощью программы PsiPred обнаружило типичное для представителей семейства α/β-гидролаз строение каталитического домена, включающего в себя восемь β-тяжей и девять α-спиралей. N-концевой домен белка длиной 177 а.о. включает десять α-спиральных участков (Рис. 29). 5.3.2.2 Экспрессия гена lip1Pc в E.coli Так как у белка Lip1Pc не было обнаружено наличия N-концевой сигнальной последовательности, полноразмерный ген lip1Pc был амплифицирован на матрице геномной ДНК P. cryohalolentis K5T с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и клонирован в экспрессионный вектор pET32a под контролем промотора Т7lac. Клонирование в этот вектор обеспечивало добавление к продукту экспрессии С-концевого гексагистидинового фрагмента. Для наработки рекомбинантного белка Lip1Pc полученной плазмидой трансформировали компетентные клетки штамма E.coli BL21(DE3). В процессе подбора оптимальных условий культивирования рекомбинантных штаммов было установлено, что максимальный уровень синтеза рекомбинантного белка Lip1Pc наблюдался при выращивании культуры в течение 4 часов в присутствии 0,1 мМ ИПТГ при 27С (Рис. 23, дорожка 6). После индукции уровень экспрессии полученного гена в клетках штамма BL21(DE3) достигал 10% общего клеточного белка. 111 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 Рис. 23 Подбор условий индукции Lip1Pc. Электрофореграмма клеточного лизата штамма E.coli BL21(DE3), трансформированного pLip1Pc. Ммаркеры молекулярного веса белков (кДа); 1 – общий клеточный белок из неиндуцированных клеток; 2-10 - общий клеточный белок после индукции при условиях: 2- 0,05 мМ ИПТГ, 2 часа, 27ºС; 3- 0,05 мМ ИПТГ, 4 часа, 27ºС; 4- 0,05 мМ ИПТГ, 4 часа, 37ºС; 5- 0,1 мМ ИПТГ, 2 часа, 27ºС; 6- 0,1 мМ ИПТГ, 4 часа, 27ºС; 7- 0,1 мМ ИПТГ, 4 часа, 37ºС; 8- 0,2 мМ ИПТГ, 2 часа, 27ºС; 9- 0,2 мМ ИПТГ, 4 часа, 27ºС; 10- 0,2 мМ ИПТГ, 4 часа, 37ºС. Стрелкой показано положение белкаLip1Pc. 5.3.2.3 Очистка рекомбинантного белка Lip1Pc Очистку белка проводили методом металло-аффинной хроматографии в нативных условиях. По результатам белкового электрофореза очищенный Lip1Pc представлен одиночной полосой с приблизительной молекулярной массой 54 кДа, что соответствует рассчитанной массе белка с гексагистидиновой последовательностью (54.6 кДа, Рис. 24 дорожки 5-8). Рис. 24 Очистка белка Lip1Pc с помощью Ni-аффинной хроматографии. Электрофореграмма фракций: 1 –фракция несвязавшихся с носителем белков; 2 – фракция белков, смытых 30 мМ имидазола; 3-8 – фракции белков, элюированных 300 мМ имидазола. М- маркеры молекулярного веса белков (кДа). Стрелкой показано положение белка Lip1Pc. 112 5.3.2.4 Исследование ферментативной активности Lip1Pc Липолитическую активность Lip1Pc измеряли с использованием п-НФБ в качестве субстрата. Благодаря высокому уровню экспрессии и хорошей растворимости белка Lip1Pc его очистка методом Ni-аффинной хроматографии позволила добиться повышения чистоты препарата по сравнению с клеточным экстрактом в 17 раз. Выход рекомбинантного белка составил около 25 мг из 1 л культуры с удельной активностью 1413 ед. а./ мг. Субстратная специфичность Lip1Pc Результаты определения субстратной специфичности выделенного фермента показали, что Lip1Pc может быть отнесен к липазам, поскольку лучше утилизирует субстраты со средней и длинной углеводородной цепью (C10 – 82% и C12 – 100% максимальной активности) по сравнению с субстратами с более короткой углеводородной цепью (C4 – 51,8% и C8 – Длина углеводородной цепи субстрата 67,5%) (Рис. 25). C16 C12 C10 C8 C4 C2 0 20 40 60 80 100 120 Относительная активность, % Рис. 25 Специфичность белка Lip1Pc по отношению к субстратам с разной длиной углеводородной цепи (C2, C4, C8, C10, C12 и C16). Активность с п-НФД была принята за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. 113 Активность в зависимости от рН Очищенная Lip1Pc была активна в органических и неорганических буферах с различными значениями рН (7,2-9,5), однако максимальная активность наблюдалась в Трис-HCl, рН 8,5 (Рис. 26). Относительная активность, % 120 100 80 60 40 20 0 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 рН Рис. 26 Влияние различных буферов на активность белка Lip1Pc. Фермент был инкубирован в смеси, содержащей 0,25 мМ п-НФБ и буферы с различным рН, при 25ºC в течение 15 минут. Использованные буферы (конечная концентрация 50 мМ) К-фосфатный (▬▲▬pH 6,1–8,0) и Трис-HCl (▬■▬pH 8,0–9,5). Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. За 100% принимали активность в буфере Трис-HCl (pH 8,0). Активность и стабильность Lip1Pc в зависимости от температуры Влияние температуры на активность полученного белка исследовали в диапазоне 5-50°C с использованием п-НФБ в качестве субстрата. Полученные результаты показали, что максимальная активность Lip1Pc наблюдается при 25ºC. При температурах 5-40ºC липазная активность составляла 60-95% от максимальной, однако она резко снижалась при повышении температуры выше 45ºC (Рис. 27). 114 Относительная активность, % 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Температура, 0С Рис. 27 Зависимость активности белка Lip1Pc от температуры. Фермент инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 мин. Активность при 25ºС была принята за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Термостабильность рекомбинантной Lip1Pc определяли после инкубирования белка при различных температурах в течение 45 мин (-20, 5, 10, 20, 30, 40 и 50ºC), затем измеряли остаточную активность при 25ºC. В результате проведенных исследований было установлено, что Lip1Pc обладает высокой стабильностью при температурах от -20ºC до +20ºC и быстро инактивируется при нагревании выше 40ºC (Рис. 28). Относительная активность, % 120 100 -20ºС 80 5ºС 10ºС 60 20ºС 30ºС 40 40ºС 50ºС 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время, мин Рис. 28 Термостабильность белка Lip1Pc. Фермент инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) при различных температурах в течение 45 минут и измеряли остаточную активность после инкубации в присутствии 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 минут при 25ºС. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Активность до прогрева принималась за 100%. 115 Влияние концентрации соли, ионов металлов, детергентов и органических растворителей на липазную активность Lip1Pc Изучение активности Lip1Pc в присутствии различных концентраций NaCl показало, что добавление соли вплоть до 1М не влияет на активность белка. Более высокие концентрации незначительно ингибируют его (на 10%) (Табл. 21). Активность фермента частично подавляется при наличии в реакционной смеси NaN3 и ионов Mg2+, Mn2+, Ca2+. Полная инактивация Lip1Pc достигается добавлением ионов Zn2+, Co2+, Ni2+, Cu2+ и ФМСФ, в то время как ЭДТА незначительно повышает его активность (Табл. 22). Присутствие неионных детергентов, таких как Тритон X-100, Твин-20 и CHAPS не влияет на активность Lip1Pc, однако добавление жесткого ионного детергента ДСН полностью ингибирует рекомбинантный белок (Табл. 23). Все исследованные органические растворители в концентрации 5 и 10% понижают активность Lip1Pc за исключением ДМСО, не оказывающего на нее влияния (Табл. 24). Таблица 21. Влияние NaCl в различных концентрациях на липазную активность Lip1Pc. Содержание NaCl, M Относительная активность,%* Нет 100,0 0,25 109,0±0,3 0,5 102,2±2,5 0,75 100,4±1,5 1,0 99,5±1,5 1,25 97,0±2,9 1,5 94,7±0,2 1,75 89,9±0,3 *Lip1Pc (1 мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные (0-1,75 М) концентрации NaCl. Относительную активность измеряли после инкубации с 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 минут при 25ºС. Представлены средние значения из трех опытов ± стандартное отклонение. 116 Таблица 22. Влияние ионов металлов и различных добавок на активность Lip1Pc. Добавки (1мM) Относительная активность, %* Нет 100 MgCl2 53 ± 1 NiCl2 8±1 CuCl2 2 ± 0,5 CoCl2 2 ±0,5 ZnSO4 <0,5 CaCl2 81 ± 1 MnCl2 49 ± 1 ЭДТА 104 ± 2 ФМСФ <0,5 NaN3 89 ± 3 * Lip1Pc (1 мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержавшей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и указанные добавки в течение 30 мин при 5ºС. Остаточную активность измеряли с 0,25 мМ п-НФБ при 25°С. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Таблица 23. Влияние различных детергентов на липазную активность Lip1Pc. Относительная активность, %* Детергент Концентрация, % (об/об) 0,05 0,5 Нет 100,0 100,0 ТритонX-100 105,8±1,3 100,3±1,6 Твин 20 104,4±2,7 100.9±0,9 CHAPS 105,7±0,9 106,7±1,0 ДСН <0,5 <0,5 * Lip1Pc (1 мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные детергенты в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли с 0,25 мМ п-НФБ при 25°C. Представлены средние значения из трех опытов ± стандартное отклонение. Таблица 24. Влияние органических растворителей на активность Lip1Pc. Относительная активность, %* Органический Концентрация, % (об/об) растворитель 5 10 Нет 100 100 Ацетонитрил 8,0 ± 0,5 <0,5 Этанол 72±1 31,8±0,6 Метанол 57± 2 27 ±1 ДМСО 101±2 99 ±2 ДМФА 2,5±0,7 <0,5 * Lip1Pc (1 мкг/мл) инкубировали в реакционной смеси, содержавшей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и указанные добавки в течение 30 мин при 5ºС. Остаточную активность измеряли с 0,25 мМ п-НФБ при 25°С. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. 117 5.3.2.5 Влияние укорочения N-концевого домена на субстратную специфичность, активность и термостабильность Lip1Pc В результате анализа аминокислотной последовательности Lip1Pc было обнаружено наличие в молекуле белка длинного (177 а.о.) N-концевого домена, имеющего преимущественно α-спиральную структуру (Рис. 29). Интересно отметить, что с помощью программы BLAST нам не удалось идентифицировать в гомологичные этому базах данных домену ни одного белка, последовательности. В содержащего молекулах представителей семейства α/β-гидролаз часто обнаруживается наличие структуры, называемой «крышка» (cap), которая образована N-концевыми αспиралями и определяет доступ субстрата к активному центру фермента (Nardini and Dijkstra, 1999; Mandrich et al., 2005). Гормончувствительная липаза человека также содержит длинный (320 а.о.) N-концевой домен, который участвует в межбелковых взаимодействиях (Shen et al., 1999). Для исследования структурной и функциональной роли N-концевого домена Lip1Pc мы сконструировали пять делеционных мутантов этого белка с последовательным укорочением N-конца в белках ND1-4 (ND1, Δ1-42; ND2, Δ1-70; ND3, Δ1-110; ND4, Δ1-122) и внутренней делецией 50 а.о. в ND5 (Δ127-176). При выборе N-концевых остатков мутантов ND1-4 мы основывались на расположении границ предполагаемых α-спиралей в составе N-концевого домена (Рис. 29). Положение делеции в мутанте ND5 было обусловлено отсутствием соответствующей аминокислотной последовательности в молекуле гомологичной эстеразы Psychrobacter sp. Ant300 (Рис. 22). Мы сравнили их свойства со свойствами полноразмерного фермента. Все мутантные варианты были получены и очищены, как описано в разделе 4.5.4. Установлено, что уровень экспрессии мутантных вариантов ND1, ND2, ND5 был сходный с Lip1Pc и достигал 10% общего клеточного белка. Уровень экспрессии белков ND3 и ND4 оказался существенно выше (до 40% общего клеточного белка), однако большая часть продуктов обнаруживалась 118 в составе телец включения (Рис 30а). Электрофоретическая подвижность мутантов ND1-5 соответствовала рассчитанным молекулярным массам (50,1; 46,9; 42,5; 41,1; 50 кДа соответственно) (Рис. 30б, дорожки 2-7). Рис. 29 Вторичная структура Lip1Pc, предсказанная программой PsiPred. Стрелками обозначено положение N-концевых остатков в белках ND1-4. Делеция ND5 обозначена серым прямоугольником. 119 М 1 2 3 4 5 6 66,2 45,0 35,0 25,0 М 7 а. 1 2 3 4 5 66,2 45,0 35,0 25,0 6 б. Рис. 30 Анализ уровня экспрессии и очистки Lip1Pc и его мутантов: а) 1 общий клеточный белок из неиндуцированных клеток; 2 - 7 - общий клеточный белок из индуцированных клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидами pLip1Pc (2), pND1 (3), pND2(4), pND3(5), pND4(6), pND5(7); б) белки очищенные с помощью Ni- аффинной хромотографии:1 – Lip1Pc;2 - ND1; 3 – ND2; 4– ND3; 5– ND4; 6– ND5. М маркеры молекулярного веса белков (кДа). В результате проведенных исследований установлено, что делеция первых 110 и 122 а.о. Lip1Pc, а также делеция участка длиной 50 а.о. (Δ127176) приводит к полному исчезновению липазной активности белков ND3, ND4 и ND5 и снижению удельной активности ND1 (896 ед. а./мг) и ND2 (1000 ед. а./мг) по сравнению с Lip1Pc (1413 ед. а./мг), что указывает на важную роль N-концевой последовательности в функциональной организации белка. Установлено, что по сравнению с Lip1Pc активность ND1 и ND2 при использовании п-НФП (С16) в качестве субстрата снижалась на 13 и 7% соответственно, однако оба мутанта показали увеличенную на 20% по сравнению с Lip1Pc активность по отношению к п-НФД (С10), то есть субстратная специфичность мутантных липаз стала более узкой в силу более выраженного предпочтения C10 и C12 по сравнению с C16 (Рис. 31). Это может быть связано с участием N-концевых последовательностей в формировании субстратного туннеля у ферментов, относящихся к семейству HSL и ограничением доступа к активному центру белка (Wei et al., 1999). Температурный оптимум активности ND1 составил 25°C, как и у исходного белка, а у ND2 он понизился до 20°C. По сравнению с Lip1Pc, диапазон температур, в котором активность белков составляла более 80% от максимальной, для мутантов несколько сузился (5-30°C для ND1 и 5-35°C 120 для ND2) (Рис. 32). При этом остаточная активность ND1 и ND2 после инкубации в течение 45 мин при 30°C оказалась повышена на 13 и 17% соответственно, а после инкубации при 40°C остаточная активность ND2 была на 43% выше, чем у Lip1Pc. Однако оба мутанта, так же как и исходный белок, практически полностью инактивировались после инкубации при 50°C (Рис. 33). Стабилизирующий эффект делеций, предположительно, является результатом более компактной конформации мутантов по сравнению с полноразмерным белком. Известно, что для холодоактивных ферментов характерно наличие гибкой пространственной экспонированности структуры, гидрофобных обусловленной остатков, повышением снижением числа стабилизирующих взаимодействий, протяженными петлями и другими факторами (Feller and Gerday, 1997). Следовательно, термостабильность таких белков может быть увеличена путем изменения участков аминокислотной последовательности, не влияющих на каталитические свойства (Gatti-Lafranconi et al., 2008). Данные, полученные при исследовании N-концевого субдомена эстеразы EST2 термофильного микроорганизма A. acidocaldarius, также указывают на его важную роль в определении термостабильности и температурного оптимума фермента (Mandrich et al., 2005). Делеции этого участка приводили к полной инактивации эстеразы EST2, а также холодоактивной липазы Psychrobacter sp. TA144 (De Santi et al., 2010). Данные, полученные нами при изучении мутантных вариантов липазы Lip1Pc подтверждают значение N-концевого домена белка для активности и термостабильности липаз семейства HSL. 121 Длина углеводородной цепи субстрата C16 C12 C10 ND2 C8 ND1 Lip1Pc C4 C2 0 20 40 60 80 100 120 Относительная активность, % Рис. 31 Специфичность белка Lip1Pc и его мутантов по отношению к субстрату. Ферменты инкубировали с субстратами с разной длиной углеводородной цепи (C2, C4, C8, C10, C12 и C16). Активность ND1 с п-НФД принята за 100%. Представлены средние значения из трех повторностей ± стандартное отклонение. Относительная активность, % 120 100 80 Lip1Pc 60 ND1 ND2 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Температура, 0C Рис. 32 Зависимость активности белков Lip1Pc, ND1 и ND2 от температуры. Ферменты инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 0,25 мМ п-НФБ в течение 15 мин. Активность при 25ºС (для Lip1Pc и ND1) и при 20ºC (для ND2) была принята за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. 122 120 Остаточная активность, % 100 80 Lip1Pc 60 ND1 ND2 40 20 0 30ºС 40ºС 50ºС Рис. 33 Термостабильность белков Lip1Pc, ND1 и ND2. Белки инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) при 30, 40 и 50ºC в течение 45 мин, остаточную активность измеряли с 0,25 мМ п-НФБ в качестве субстрата. Активность до прогрева принималась за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Таким образом, в данном разделе работы нами была получена холодоактивная липаза Lip1Pc, имеющая удельную активность около 1500 у.е./мг, обладающая высокой липолитической активностью при пониженных температурах и широкой результатеисследования субстратной свойств специфичностью. делеционных В мутантов продемонстрированаважность N-концевого домена Lip1Pc для активности и термостабильности белка. 5.3.3 Получение и характеристика Lip2Pc 5.3.3.1 Анализ аминокислотной последовательности и клонирование генов lip2Pc и lifPc На основании гомологии с последовательностями липолитических ферментов родственных микроорганизмов в геноме P. cryohalolentis было обнаружено существование оперона, кодирующего потенциальную липазу Lip2Pc и специфический шаперон LifPc (см. раздел 5.2.2). Объединение этих генов в составе оперона указывало на необходимость их координированной экспрессии, что характерно для других пар липаза-фолдаза (Rosenau et al., 2004). Аминокислотная последовательность Lip2Pc обнаруживала максимальное сходство (59% одинаковых остатков) с липазами из других 123 видов Psychrobacter липаза (ZP_08459952 15011http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/65121; Psychrobacter YP_001279868 sp. белок, относящийся к семейству α/β-гидролаз, из Psychrobacter sp. PRwf-1 (Рис. http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bgetgenome:T00541) Относительно высокое сходство с липазами 34). Pseudomonas (около 50% идентичных остатков с P. stutzeri, P. mendocina и P. aeruginosa PAO1) (Yan et al., 2008; YP_001188052 липаза P. mendocina, штамм ymp http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?genome:T00510; Chihara-Siomi et al., 1992) позволило отнести эту липазу к семейству I.1 (или abH15 - липазы Burkholderia) согласно классификации липолитических ферментов. На основании гомологии аминокислотные остатки, образующие каталитическую триаду, были идентифицированы как Ser144, Asp295 и His317. Оксианионовая полость, предположительно, образуется Met77 и Gln145 (Рис. 34). Анализ с помощью программы SignalP показал наличие сигнальной последовательности (СП) в молекуле Lip2Pc с сайтом отщепления между 39 и 40 аминокислотными остатками. На первом этапе работы с использованием ген-специфических праймеров мы амплифицировали из геномной ДНК P.cryohalolentis K5T полноразмерный ген lip2Pc. Исследование его экспрессии в клетках штамма BL21(DE3) показало, что при любых условиях индукции и концентрации ИПТГ Lip2Pc образует нерастворимые тела включения. На следующем этапе мы осуществили делецию 39 5‘-концевых кодонов гена lip2Pc, соответствующих сигнальному пептиду. Укороченный ген, содержащий 945 п.о., был клонирован в тот же плазмидный вектор, что и полноразмерный, и экспрессирован в клетках E.coli. Было показано, что укороченный белок Lip2Pc также образует нерастворимые тела включения независимо от условий культивирования штамма-продуцента. (Рис. 35). Поэтому для дальнейших экспериментов мы использовали зрелый Lip2Pc, чтобы избежать возможное негативное влияние неотщепленной сигнальной последовательности на процесс рефолдинга. 124 Анализ аминокислотной последовательности LifPc выявил меньшее сходство с известными липазспецифическими шаперонами из других микроорганизмов. Например, число идентичных остатков между LifPc и Lif из Psychrobater sp. PRwf-1 составляет только 44%, в то время как сходство соответствующих липаз - 59%. Основываясь на уровне гомологии аминокислотной последовательности, этот белок можно отнести к Семейству I Lif-белков, что подтверждается наличием консервативного мотива FDYFLSA (остатки 112-118) в последовательности LifPc. Анализ аминокислотной последовательности LifPc с помощью алгоритма TMMHM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) выявил наличие на N-конце белка потенциального трансмембранного сегмента (остатки 9-28), который, предположительно, служит для прикрепления шаперона к внутренней мембране клетки бактерий. Ранее было показано, что делеции этого сегмента, а также прилегающего участка, не влияют на функциональную активность шаперона (Quyen et al., 1999; El Khattabi et al., 2000). Считается, что наличие трансмембранного якоря удерживает шаперон от совместной секреции с липазой во внеклеточное пространство, а следующий за ним аланиномбогатый домен способствует увеличению расстояния от поверхности мембраны (Rosenau et al., 2004). С помощью ПЦР нами были получены три варианта гена lifPc, кодирующих полноразмерный шаперон, а также его укороченные варианты с делециями трансмембранного сегмента (Δ1-28) и прилегающего участка(Δ162) - lifPcd28 и lifPcd62. Эти гены были клонированы в вектор для экспрессии на основе pET32а, что обеспечило наличие на 3' - конце последовательности, кодирующей His-tag. 125 Рис.34 Множественное выравнивание аминокислотной последовательности белка Lip2Pc и последовательности гомологичных липаз: I4JIG4 липаза LipC P. stutzeri TS44; YP_001188052 липаза P. mendocina ymp; P26876 лактолипаза lipA P. aeruginosa ATCC 15692; ZP_08459952 липаза Psychrobacter sp. 1501; YP_001279868 белок, относящийся к семейству α/β-гидролаз, из Psychrobacter sp. PRwf-1. Аминокислотные остатки, образующие каталитическую триаду, обозначены ●, полость оксианиона - ■. 5.3.3.2 Экспрессия генов lip2Pc и lifPc в E.coli Для получения рекомбинантной липазы Lip2Pc клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой pET32a(+)/Lip2Pc и индуцировали добавлением ИПТГ. Анализ экспрессии гена lip2Pc с помощью белкового электрофореза биомассы клеток штамма-продуцента показал, что рекомбинантный белок с приблизительной молекулярной массой 33 кДа, соответствующей расчетной молекулярной массе зрелого полипептида Lip2Pc, синтезируется клетками на высоком уровне (Рис. 37, дорожка 2). Было показано, что при любых условиях индукции и концентрации ИПТГ Lip2Pc образует нерастворимые тела включения независимо от присутствия 126 сигнальной последовательности на N-конце белка (Рис 35). Схожие результаты были получены при гетерологической экспрессии других липаз Семейства I (Akbari et al., 2010; Quyen et al., 1999; Kim et al., 2008). Многочисленные исследования доказали, что правильный фолдинг ферментов этого класса как in vivo, так и in vitro зависит от присутствия специфического шаперона (Rosenau et al., 2004). Механизм взаимодействия липаза-шаперон изучен в настоящее время недостаточно полно. Установлено, что присутствие N-концевой сигнальной последовательности обеспечивает секрецию липаз Семейства I в периплазматическое пространство, где они приобретают конформацию, практически полностью совпадающую с нативной, однако остаются каталитически неактивными (El Khattabi et al., 2000). Липазоспецифическая фолдаза, закрепленная во внутренней мембране бактерий гидрофобным Nконцевым якорем, образует стабильный комплекс с соответствующей липазой и осуществляет ее правильный фолдинг, помогая преодолеть значительный энергетический барьер (El Khattabi et al., 2000). Как показало исследование кристаллической структуры комплекса липазы из B. glumae с ее шапероном, между ними существует область взаимодействия, состоящая в основном из неполярных остатков (Pauwels et al., 2006). После приобретения нативной конформации рефолдированная липаза секретируется во внешнюю среду с помощью Xcp-секреторного механизма (Filloux et al., 2004;). Первоначально нами был амплифицирован из геномной ДНК P. cryohalolentis K5T и клонирован ген полноразмерного шаперона LifPc. Исследование его экспрессии в клетках штамма BL21(DE3) показало, что рекомбинантный продукт представлен двумя формами, имеющими подвижность около 43 и 34 кДа (Рис. 36, дорожка 2). Первая из них соответствует полноразмерному белку, а вторая предположительно является продуктом протеолитического расщепления. На следующем этапе мы получили и использовали укороченные варианты шаперона LifPcd28 и LifPcd62 (40 и 36 кДа, соответственно). Оба белка были успешно 127 экспрессированы в клетках E. coli BL21(DE3) в присутствии 0,1 мМ ИПТГ при 27°C и очищены с помощью Ni-аффинной хроматографии (Рис. 37, дорожки 3 и 4). Пилотные эксперименты с обоими вариантами шаперона показали их одинаковую активность в процессе рефолдинга рекомбинантной липазы Lip2Pc, поэтому в дальнейших экспериментах использовался только белок LifPcd62. Согласно литературным данным, подобные укороченные шапероны были успешно использованы для ренатурации соответствующих липаз (Quyen et al., 1999; El Khattabi et al., 2000). В результате промывки тел включения детергентсодержащим буфером была достигнута высокая степень чистоты рекомбинантного белка Lip2Pc (Рис. 38 дорожка 1), который был затем растворен в буфере, содержащем 8 М мочевину и 10 мМ меркаптоэтанол, в концентрации 4 мг/мл. M 116,0 66,2 45,0 35,0 3 4 Lip2PcdS Lip2Pc 25,0 Рис. 35 Анализ растворимости полноразмерного и укороченного белков Lip2Pc: 1 - супернатант и 2- осадок индуцированных клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pLip2PcdS, после обработки ультразвуком; 3 – супернатант и 4 - осадок индуцированных клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pLip2Pc, после обработки ультразвуком; M - маркеры. Стрелками показано положение белков Lip2PcdS и Lip2Pc. 128 М 1 2 66,2 45,0 LifPc продукт протеолиза 35,0 25,0 Рис. 36 Экспрессия полноразмерного шаперона LifPc: 1 - общий клеточный белок из неиндуцированных клеток E. coli BL21(DE3); 2 - общий клеточный белок из клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pLifPc, после индукции. M - маркеры молекулярного веса белков (кДа). Стрелками показано положение белка LifPc и продукт протеолитического расщепления. 66,2 45,0 35,0 М 1 3 4 LifPcd28 Lip2Pc LifPcd62 25,0 18,4 Рис. 37 Экспрессия Lip2Pc и укороченных вариантов шаперона LifPc: 1 общий клеточный белок из неиндуцированных клеток E. coli BL21(DE3); 2-4 - общий клеточный белок из клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидами pLip2Pc (2), pLifPcd28 (3), pLifPcd62(4), после индукции. M маркеры молекулярного веса белков (кДа). Стрелками показано положение белков Lip2Pc, LifPcd28 и LifPcd62. 5.3.3.3 Рефолдинг in vitro рекомбинантной Lip2Pc Как показали многочисленные исследования, на эффективность рефолдинга денатурированной липазы влияют различные факторы (Quyen et al., 1999; Akbari et al., 2010; Yamaguchi et al., 2013). Поэтому для получения белка, обладающего высокой активностью, важно тщательно подобрать условия и состав буфера для рефолдинга. Эффективная экспрессия Lip2Pc и LifPc в клетках E. coli BL21(DE3) и разработка процедуры рефолдинга в 96луночном планшете позволили проанализировать влияние следующих параметров: концентрация липазы, весовое соотношение липаза/шаперон, 129 присутствие различных вариантов шаперона (LifPcd28 или LifPcd62), присутствие соли, детергентов, глицерина или мочевины (Табл. 26). Было показано, что принципиальное значение для эффективного рефолдинга Lip2Pc имеет добавление 45% глицерина в буфер для рефолдинга. В ряде исследований также было установлено повышение выхода активного фермента в результате рефолдинга в присутствии глицерина, даже в случаях отсутствия шаперонов в смеси (Quyen et al., 1999; ElKhattabi et al., 2000). Другими важными параметрами, влияющими на эффективность процесса рефолдинга, оказались присутствие мочевины и β-меркаптоэтанола. Оба этих компонента часто используются для увеличения выхода активного продукта при рефолдинге (Yamaguchi et al., 2013). Как показал анализ аминокислотной последовательности Lip2Pc, в ее составе присутствуют два остатка цистеина, предположительно участвующие в образовании дисульфидной связи. В исследованиях других авторов было показано наличие дисульфидных связей в гомологичных с Lip2Pc липазах, выделенных из B. glumae (El Khattabi et al., 2000) и P. aeruginosa (Liebeton et al., 2001). Установлено, что наличие этих связей не является необходимым для каталитической активности ферментов, однако оно повышает стабильность белка, особенно в денатурирующих условиях. Присутствие βмеркаптоэтанола может препятствовать образованию неправильно замкнутых связей и межмолекулярных агрегатов в белке при рефолдинге. Также как и в случае рефолдинга in vitro липазы P. aeruginosa (Shibata et al., 1998), наличие ионов кальция оказало позитивное влияние на эффективность рефолдинга Lip2Pc, предположительно благодаря стабилизации активной конформации белка. Резкое снижение активности Lip2Pc в присутствии ЭДТА (Табл. 28) явилось подтверждением этого предположения. Известно, что большинство холодоактивных липаз/эстераз инактивируется в присутствии ЭДТА (Choo et al., 1998; Chen et al., 2011; Kulakova et al., 2004). Добавление других компонентов имело небольшое влияние на выход белка при рефолдинге. Только добавление Тритона Х-100 130 привело к незначительному повышению выхода белка (на 7%), что может быть связано с его влиянием на агрегацию белковых молекул. Так как оба варианта шаперона продемонстрировали одинаковую активность (Табл. 26), для дальнейшего подбора условий использовали только LifPcd62. Было показано, что соотношение липаза:шаперон 1:2 повышает эффективность рефолдинга (на 9%), также как и снижение концентрации липазы с 200 мкг/мл до 100 мкг/мл (на 33%) (Табл. 26). В результате оптимизации условий рефолдинга и состава буфера нами был получен белок Lip2Pc с удельной активностью около 6900 ед. акт./мг. Выход белка составил около 75 мг из 1 л культуры. Для избавления от шаперона смесь после рефолдинга наносили на Ni-аффинную колонку и элюировали с помощью имидазолсодержащего буфера. В результате электрофоретического анализа установлено, что липаза оказывалась во фракции несвязанных с носителем белков, в то время как фракция элюированных белков содержала чистый шаперон LifPcd62 (Рис. 38 дорожки.4-5). Эти данные подтверждаются анализом липазной активности отдельных фракций (Табл. 25). Таким образом, мы показали, что укороченные варианты шаперона обладают специфической фолдазной активностью и способствуют приобретению липазой каталитически активного состояния. В ряде предыдущих исследований было показано, что липаза, полученная в процессе рефолдинга in vitro, по окончании процесса остается связанной в комплексе с Lif-шапероном, предположительно в силу отсутствия системы Xcp-секреции в клетках E. coli. Например, комплекс LipA и Lif из B. glumae мог быть разрушен только в присутствии 6 M мочевины или 1,2 M GuHCl (Pauwels and Van Gelder, 2008; Pauwels et al., 2012). Полученные нами результаты указывают на то, что комплекс Lip2Pc с LifPcd62, по-видимому, менее стабилен, что позволило провести частичную очистку липазы от фолдазы, имеющей His-tag, с помощью Ni-аффинной хроматографии. Небольшое количество 131 фолдазы, присутствующее в конечной фракции, не влияет на полученные результаты в силу отсутствия липолитической активности у шаперона. Таблица 25 Очистка рекомбинантной липазы Lip2Pc*. Общий белок (мг) Общая активность (ед. а.) Удельная активность (ед. а./мг) Клеточный лизат 10 <0,5 <0,5 Растворение тел включения 8 <0,5 <0,5 3,2 22000 6900 1,2 8400 7000 Стадия очистки Рефолдинг с фолдазой Фракция, несвязавшихся носителем белков при с Ni- аффинной хроматографии *Для очистки использовали 1г биомассы штамма-продуцента. Таблица 26 Влияние различных добавок на липолитическую активность Lip2Pc после рефолдинга. Удельная активность, ед.а./мг белка 0 0 0 4550 4650 5000 5300 Добавки Относительная активность, % Нет* LifPcd62, 0,2 мг/мл 45% глицерин 45% глицерин+LifPcd62, 0,1 мг/мл 91 45% глицерин+LifPcd28, 0,1 мг/мл 93 45% глицерин+LifPcd62, 0,2 мг/мл 100 45% глицерин+LifPcd62, 0,2 мг/мл+0,01% 107 Тритон X-100 45% глицерин+LifPcd62, 0,2 мг/мл+5 мМ β6000 121 меркаптоэтанол 45% глицерин+LifPcd62, 0,2 мг/мл+1,5 M 6200 125 мочевина 45% глицерин+LifPcd62, 0,2 мг/мл+200мМ NaCl 5100 103 45% глицерин+LifPcd62, 0,2 мг/мл+0,01% 6900 140 Тритон X-100+5 мМ β-меркаптоэтанол+1,5 M мочевина+200 мМ NaCl * РефолдингLip2Pc (0,1 мг/мл) проводился в буфере 50 мМ Трис-HCl pH 8.0, 5 мМ CaCl2. 132 М 1 2 3 4 5 66,2 45,0 35,0 25,0 18,0 Рис. 38 Анализ взаимодействия между Lip2Pc и специфическим шапероном LifPc: 1 – очищенная Lip2Pc (растворенные тела включения); 2 – очищенный с помощью Ni-аффинной хроматографии LifPcd62; 3 – смесь Lip2Pc и LifPcd62 (1:2) в буфере для рефолдинга; 4 – фракция, несвязавшихся с носителем белков после загрузки образца с дорожки 3 на Ni-сефарозную колонку;5 – элюция буфером, содержащим 300 мМ имидазола. M – маркеры молекулярного веса белков (кДа). 5.3.3.4 Исследование ферментативной активности Lip2Pc Субстратная специфичность Lip2Pc Проведенные исследования показали, что полученная рекомбинантная липаза Lip2Pc обладает широким спектром субстратной специфичности. Максимальная ферментативная активность Lip2Pc была обнаружена при использовании п-НФП (С16), при этом активность при использовании субстратов С8 и С4 составила 40 и 60%, соответственно (Рис. 39). Полученные результаты подтверждают правильность предварительного отнесения Lip2Pc к семейству I липаз (настоящие липазы), которые предпочитают длинноцепочечные субстраты. 133 Длина углеводородной цепи субстрата C16 C14 C12 C10 C8 C4 C2 0 20 40 60 80 100 120 140 Относительная активность, % Рис. 39 Специфичность белка Lip2Pc по отношению к субстрату. Фермент инкубировали с субстратами с разной длиной углеводородной цепи (C2, C4, C8, C10, C12, С14 и C16). Активность с п-НФД принята за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Активность в зависимости от рН Очищенная Lip2Pc была активна в буферах с различными значениями рН (6,7-10,0), однако максимум активности наблюдался в Трис-HCl, рН 9,0 (Рис. 40). 160 Относительная активность, % 140 120 100 80 60 40 20 0 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 pH Рис. 40 Влияние различных буферов на активность белка Lip2Pc. Фермент инкубировали в смеси, содержащей 0,1 мМ п-НФД и буферы с различным рН, при 25ºC в течение 15 минут. Активность в Трис-HCl (pH 8,0) была принята за 100%. Использованные буферы (конечная концентрация 50 мМ) К-фосфатный (▬■▬pH 6,1–8,0), Трис-HCl (▬●▬pH 8,0–9,5) и Na-боратный (▬▲▬pH 9,3–10,0). Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. 134 Активность и стабильность Lip2Pc в зависимости от температуры Влияние температуры на активность полученного белка исследовали в диапазоне 5-75°C с использованием п-НФД в качестве субстрата. Полученные результаты показали, что максимальная активность Lip2Pc наблюдается при 25ºC (Рис. 41). Относительная активность, % 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Температура, 0С Рис. 41 Зависимость активности белка Lip2Pc от температуры. Фермент инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 0,1 мМ п-НФД в течение 15 мин. Активность при 25ºС была принята за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Термостабильность рекомбинантной Lip2Pc определяли после инкубирования белка при различных температурах (-20, 0, 20, 40, 60, 70 и 80ºC) в течение 1 часа, затем измеряли остаточную активность при 25ºC. В результате проведенных исследований было установлено, что Lip2Pc обладает повышенной термостабильностью по сравнению с ранее описанными холодоактивными липазами/эстеразами, так как даже после инкубации в течение 1 часа при температуре 80°С белок сохранял 20% активности, а при более низких температурах активность белка сохранялась на уровне 60-100% от начальной (Рис. 42). 135 Остаточная активность, % 120 -20ºС 0ºС 100 10ºС 20ºС 80 30ºС 40ºС 60 50ºС 60ºС 40 70ºС 20 80ºС 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, мин Рис. 42 Термостабильность белка Lip2Pc. Lip2Pc инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0 при различных температурах в течение 1 часа. Остаточную активность измеряли с 0,25 мМ п-НФД в качестве субстрата. Остаточная активность после инкубации при 20, 0 и 20ºC составила 100%. Активность до прогрева принималась за 100%. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Влияние концентрации соли, ионов металлов, детергентов и органических растворителей на липазную активность Lip2Pc Изучение активности Lip2Pc в присутствии различных концентраций NaCl показало, что добавление соли до концентрации 1М повышает активность белка на 5-10%, но при дальнейшем повышении концентрации NaCl активность белка снижается (Табл. 27). Активность фермента частично подавляется при наличии в реакционной смеси NaN3, ФМСФ, ионов Mg2+, Ni2+, Co2+ и снижается в два раза при добавлении Cu2+ или Zn2+. Инактивация Lip2Pc более чем на 75%, достигается добавлением ЭДТА, а ионы Ca2+ и Mn2+ не влияют на активность (Табл. 28). Присутствие неионных детергентов ТритонаX-100 и Твина-20 снижает активность Lip2Pc более, чем на 70%. Детергенты CHAPS и ДСН в концентрации 0,05% повышают активность Lip2Pc на 20%, но более высокие концентрации ДСН (0,5%) полностью ингибировали белок (Табл. 29). Таблица 27 Влияние NaCl в различных концентрациях на липазную активность Lip2Pc. 136 Содержание NaCl, M Относительная активность, %* Нет 100,0 0,25 105,6±5,9 0,5 108,9±0,5 0,75 109,7±0,8 1,0 108,2±0,4 1,25 107±1,8 1,5 103,7±1,1 1,75 103,8±1,7 *Lip2Pc (1мкг) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные (0-1,75М) концентрации NaCl. Относительную активность измеряли после инкубации с 0,1 мМ п-НФД в течение 15 минут при 25ºС. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Таблица 28 Влияние ионов металлов и различных добавок на липазную активность Lip2Pc. Добавки (1мM) Относительная активность, %* Нет 100,0 MgCl2 91,4±1,9 NiCl2 93,7±1,5 CuCl2 55,7±2,1 CoCl2 97,8±2,8 ZnSO4 51,3±2,4 CaCl2 104,7±4,0 MnCl2 105,3±4,2 ЭДТА 22,8±1,7 ФМСФ 95,6±3,1 NaN3 85,0±6,9 * Lip2Pc (1мкг) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и добавки в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли с 0,1 мМ п-НФД при 25°C. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Все исследованные органические растворители в концентрации 10 и 30% не влияли на активность Lip2Pc, за исключением 30% ацетонитрила, который полностью инактивировал рекомбинантный фермент (Табл. 30). 137 Таблица 29 Влияние различных детергентов на липазную активность Lip2Pc. Относительная активность, %* Концентрация, % (об/об) 0,05 0,5 Нет 100,0 100,0 ТритонX-100 24,9±6,8 7,0±3,6 Твин 20 12,1±6,1 9,7±2,1 CHAPS 120,5±1,2 116,5±0,1 ДСН 118,5±1,3 2,2±1,0 * Lip2Pc (1мкг) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные детергенты в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли с 0,1 мМ п-НФД при 25°C. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Детергент Таблица 30 Влияние органических растворителей на липазную активность Lip2Pc. Относительная активность, (%)* Концентрация, % (об/об) 5 10 Нет 100,0 100,0 Ацетонитрил 101,6±0,7 1,6±1,0 Этанол 105,3±0,1 95,3±8,1 Метанол 107,3±2,0 108,4±0,3 ДМСО 107,3±2,2 116,9±3,4 ДМФА 103,0±1,0 101,2±1,3 * Lip2Pc (1мкг) инкубировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и различные органические растворители в течение 30 минут при 5ºС. Остаточную активность измеряли с 0,1 мМ п-НФД при 25°C. Представлены средние значения трех опытов ± стандартное отклонение. Органический растворитель В результате проведенных экспериментов нами разработан протокол эффективного рефолдинга липазы Lip2Pc в присутствии специфического шаперона. Получен препарат холодоактивной липазы Lip2Pc, с удельной активностью около 7000 ед. а./мг, высокой липолитической активностью при пониженных температурах и повышенной термостабильностью. 5.3.4. Сравнение свойств липолитических ферментов P. cryohalolentis и гомологичных белков Для оценки новизны полученных в работе результатов проведено сравнение свойств изученных белков между собой и с гомологичными липолитическими ферментами. 138 5.3.4.1 Субстратная специфичность Исследование белка показало, EstPc что его максимальная относительная активность наблюдалась при использовании коротко- и среднецепочечных субстратов (С4 - 100% и С8 - 73%). Активность при использовании длинноцепочечных субстратов была минимальна (С12 - 8,3% и С16 - 2%). Эти результаты позволяют утверждать, что полученный белок является эстеразой, а не липазой, в отличие от высокогомологичной липазы LipX из Psychrobacter sp. C18 (90% сходства аминокислотных последовательностей) с максимумом активности по отношению к п-НФМ (С14) (Chen et al., 2011). Таким образом, субстратная специфичность ферментов, даже имеющих высокую степень гомологии аминокислотной последовательности, может существенно отличаться, что доказывает актуальность поиска и исследования новых вариантов белков из родственных видов бактерий. Результаты определения субстратной специфичности Lip1Pc показали, что этот фермент может быть отнесен к липазам, поскольку лучше утилизирует субстраты со средней и длинной углеводородной цепью (C10 – 82 и C12 – 100% максимальной активности) по сравнению с субстратами с более короткой углеводородной цепью (C4 – 51,8 и C8 – 67,5%). Это отличает Lip1Pc от гомологичных ей липаз/эстераз, т.к. PsyEst из Psychrobacter sp. Ant300 (Kulakova et al., 2004) и липаза 2 из Moraxella sp. TA144 (Feller et al., 1991) демонстрировали максимум активности с C4 субстратом, а MBP-липаза из Psychrobacter sp. 2-17 (Parra et al., 2008) - с C6. Lip2Pc обладает широким спектром субстратной специфичности. Максимальная ферментативная активность Lip2Pc была обнаружена при использовании п-НФП (С16), при этом активность при использовании субстратов С8 и С4 составила 40 и 60% соответственно. Полученные результаты подтверждают правильность предварительного отнесения Lip2Pc к семейству I липаз (настоящие липазы), которые длинноцепочечные субстраты (Arpigny and Jaeger, 1999). 139 предпочитают 5.3.4.2 Оптимальные значения рН активности Максимальные ферментативные активности EstPc, Lip1Pc и Lip2Pc наблюдали в буфере с рH 8.5-9.0. Аналогичные данные были получены и для других щелочных липаз/эстераз, выделенных из психротрофов, например, из Psychrobacter. sp. C 18 (Chen et al., 2011), Pseudomonas sp. штамм B11-1 (Choo et al., 1998), Acinetobacter baumannii BD5 (Park et al., 2009) и Psychrobacter sp. 7195 (Zhang et al., 2007). 5.3.4.3 Температурный оптимум активности Температурный оптимум активности EstPc составляет 35ºC. Аналогичный оптимум характерен также для липаз из A. baumannii BD5 (Park et al., 2009) и Pseudomonas sp. KB700A (Rashid et al., 2001). С другой стороны, родственные ферменты LipP из Pseudomonas sp. B11-1 (Choo et al., 1998) и Lip3 из Moraxella sp. TA144 (Feller et al., 1991) демонстрируют более высокий оптимум активности (45°С). При этом активность EstPc при 5ºC и 10ºC составила 90,5 и 91,5%, соответственно, в отличие от LipX, чья относительная активность при этих температурах была меньше 30% (Chen et al., 2011). Максимальная активность Lip1Pc наблюдается при 25ºC, температуре, типичной для многих холодоактивных ферментов (Parra et al 2008; Zhang et al., 2007). Такой же температурный оптимум был характерен для Lip2Pc, однако по сравнению с другими липазами этот фермент обладал более широким температурным диапазоном активности. Например, ее активность при 5 и 65ºC составила 80% от максимальной. В отличие от Lip2Pc, для EstPc и Lip1Pc, как и для большинства холодоактивных ферментов, характерно резкое снижение активности при повышении температуры. Так, при температуре 40°С активность EstPc составила 60, а при 45°С – 8% от максимальной. Активность Lip1Pc при 45°С составила 38, а при 50°С только 5% от максимума. Для многих ферментов психрофильных организмов установлено наличие холодовой инактивации – снижение активности при температуре 140 ниже определенного значения. Например, активность LipXи LipP при температурах 5-10°С оказалась менее 30% от максимальной (Chen et al., 2011; Choo et al., 1998). Однако EstPc, Lip1Pc и Lip2Pc продемонстрировали отсутствие холодовой активации при низких температурах. Так, ферментативная активность всех изученных нами белков при температуре ниже 10°С составила более 80% от максимальной. Следовательно, по сравнению с другими холодоактивными липолитическими ферментами, изученные в данной работе белки обладают активностью в более широком температурном диапазоне. Использование подобных ферментов может представлять собой один из адаптационных механизмов P. cryohalolentis, проявляющего способность к росту при температурах от −10 до 30 °C. Дальнейшее исследование свойств полученных ферментов будет представлять значительный интерес для понимания структурных механизмов температурной адаптации белков. 5.3.4.4 Термостабильность Согласно литературным данным, холодоактивные липазы отличаются низкой термостабильностью. Так, активность LipX снижалась до 30 и 20% после инкубации при 65 и 70ºC в течение 1 часа (Chen et al., 2011). Активность KB-Lip снижалась более чем на 70% при кратковременном прогреве при 60ºC (Rashid et al., 2001), а LipP после инкубации при 70ºC в течение 30 минут полностью инактивировалась (Choo et al., 1998). Подобное поведение характерно также для Lip1Pc. Этот фермент полностью инактивировался при нагревании в течение 15 минут при 50ºC, т.е. демонстрировал типичные для холодоактивных ферментов свойства. В отличие от Lip1Pc, EstPc и Lip2Pc обладали повышенной термостабильностью по сравнению с другими холодоактивными липазами/эстеразами. После инкубации в течение 1 часа при температуре 80°С белок Lip2Pc сохранял 20% активности, а при более низких температурах активность белка сохранялась на уровне 60-100% от начальной. 141 Активность EstPc снижалась более чем на 70% только после инкубирования при 90ºC в течение 1 часа. Как отмечалось выше (раздел 3.6), использование холодоактивных ферментов позволяет проводить реакции с меньшими энергозатратами и предотвращать разложение термолабильных компонентов. Низкая термостабильность холодоактивных ферментов может быть преимуществом, однако, чаще всего она представляет проблему для их промышленного использования. На основании полученных данных можно предполагать, что некоторые ферменты микроорганизмов из вечной мерзлоты, обладая высокой каталитической активностью при низких температурах, могут при этом сохранять относительную термостабильность, что делает актуальным их дальнейшее исследование и биотехнологическое применение. 5.3.4.5 Влияние NaCl Добавление соли в реакционную смесь по-разному влияло на активность изученных белков. Активность EstPc резко увеличивалась (180% от активности в буфере без соли), при этом дальнейшее увеличение концентрации соли от 0,25 до 1,75 М оказывало незначительное влияние на активность EstPc. Активность гомологичной липазы LipX также возрастала в присутствии NaCl (Chen et al., 2011), но не так значительно. Активность Lip1Pc в присутствии NaCl в концентрации до 1 М не изменялась. Более высокие концентрации незначительно ингибировали этот фермент (на 10%). Активность Lip2Pc в присутствии NaCl в концентрации до 1 М повышалась на 5-10%, но при дальнейшем повышении концентрации соли снижалась на 5%. Влияние концентрации NaCl на активность изученных белков можно объяснить их различной локализацией в клетках P. cryohalolentis, выделенного из местообитания с повышенной соленостью (13% NaCl). Известно, что галофильные микроорганизмы используют различные стратегии для поддержания жизнедеятельности в условиях повышенной концентрации NaCl. Одна из них, используемая ограниченным числом 142 галофилов, включает накопление ионов К+ и Cl– внутри клетки с целью сохранения осмотического баланса. Более распространенной является стратегия исключения солей из цитоплазмы и накопления органических веществ (глицерина, аминокислот и их производных, сахаров и других) для достижения той же цели (Oren, 2002). Таким образом, на основании данных об отсутствии зависимости каталитической активности Lip1Pc от концентрации NaCl можно предположить, что этот фермент локализован в цитоплазме P. cryohalolentis. Белки EstPc и Lip2Pc секретируются наружу и, вследствие этого, адаптированы к высоким концентрациям NaCl в окружающей среде. Эти предположения соответствуют выводам, сделанным ранее на основании анализа аминокислотных последовательностей целевых белков (Раздел 5.2.2). 5.3.4.6 Влияние солей металлов Известно, что ионы металлов и хелатирующие соединения оказывают существенное воздействие на свойства белков, в том числе на активность ферментов (Chakraborty and Paulraj, 2009). Ионы металлов модифицируют структуру полипептидов, необходимой для увеличивают осуществления стабильность биологической конформации, функции, и могут непосредственно принимать участие в процессе катализа. Нами было исследовано влияние различных ионов металлов, ЭДТА и других добавок на активность липолитических ферментов P.cryohalolentis. Наиболее часто в литературе упоминается роль Ca2+ в липазоиндуцированном катализе. Этот ион оказывает стабилизирующее влияние на структуру липаз B. glumae и S. huicus (El Khattabi et al., 2000; Simons et al., 1999), способствует конформационным перестройкам, сопровождающим открывание «крышки» липазы Pseudomonas sp. MIS38 (Cheng et al., 2012), а также повышает эффективность рефолдинга in vitro из денатурированного состояния липазы P. aeruginosa (Shibata et al., 1998).Также как и в случае рефолдинга in vitro липазы P. aeruginosa, наличие ионов кальция оказало позитивное влияние на эффективность рефолдинга Lip2Pc, вероятно 143 благодаря стабилизации активной конформации белка. Резкое снижение активности Lip2Pc в присутствии ЭДТА явилось подтверждением этого предположения. Известно, что большинство холодоактивных липаз/эстераз инактивируется в присутствии ЭДТА (Choo et al., 1998; Chen et al., 2011; Kulakova et al., 2004). Активность изученных ферментов в присутствии ионов Ca2+была различной. Активность EstPc не менялась в присутствии Ca2+, Lip1Pc инактивировался на 20%, а активность Lip2Pc возрастала на 5%. Добавление ЭДТА также оказывало различное действие на полученные ферменты. Активность EstPc повышалась в присутствии ЭДТА, в то время как LipX, LipA1 полностью инактивировались эти реагентом, а на активность LipPc его присутствие не влияло (Chen et al., 2011, Choo et al., 1998, Zhang et al., 2007). Активность Lip1Pc практически оставалась без изменения после добавления ЭДТА, в отличие от активности его гомолога PsyEst, которая полностью подавлялась ЭДТА (Kulakova et al., 2004). Как было сказано, выше активность Lip2Pc резко снижалась в присутствии ЭДТА. Установлено, что ионы Mg2+, Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+ в различной степени снижают активность всех изученных ферментов. Полученные результаты схожи с описанными для гомологичных белков так, например, ионы Zn2+ полностью ингибировали липазы LipX, LipP, LipA1 и PsyEst (Chen et al., 2011, Choo et al., 1998, Zhang et al., 2007, Kulakova et al., 2004). 5.3.4.7 Влияние детергентов и органических растворителей Нами изучено влияние различных детергентов и органических растворителей на активность EstPc, Lip1Pc и Lip2Pc. Стабильность белков в присутствии этих добавок оказалась различной. Тритон Х-100 и Твин 20 активировали EstPc, не влияли на Lip1Pc и полностью инактивировали Lip2Pc. CHAPS повышал активность ферментов EstPc и Lip2Pc или не влиял на нее (в случае Lip1Pc). Добавление более жесткого детергента ДСН в любой концентрации полностью ингибировало EstPc и Lip1Pc, а Lip2Pc был стабилен при концентрации ДСН 0,05, но полностью инактивировался при 144 добавлении 0,5% ДСН. Инактивация белков ДСН была продемонстрирована также для LipX, PK-12CS и AEST, в то время как активность LipA1 снижалась в его присутствии только на 20% (Chen et al., 2011; Jinwal et al., 2003; Suzuki et al., 2002, Zhang et al., 2007). Стабильность EstPc и Lip1Pc по отношению к органическим растворителям, кроме ДМСО, оказалась низкой. ДМФА, этанол и метанол снижали их активность 25-85%, а ацетонитрил полностью ее ингибировал. Lip2Pc был стабилен по отношению ко всем органическим растворителям в концентрации 5-10%, и только ацетонитрил в концентрации 10% полностью его ингибировал, в отличие от LipX и LipP, чья активность снижалась и в присутствии этанола той же концентрации (Chen et al., 2011; Choo et al., 1998). Полученные данные имеют существенное значение для оценки биотехнологического потенциала изучаемых ферментов, поскольку многие области использования липаз подразумевают присутствие детергентов и органических растворителей в реакционной смеси. В таких случаях важно представлять, насколько активность препарата может изменяться под влиянием этих добавок. Таким образом, в результате проделанной работы нами получены и охарактеризованы три липолитических фермента P.cryohalolentis – EstPc, Lip1Pc и Lip2Pc. Установлено, что EstPc является эстеразой с максимумом активности при использовании субстратов с короткой углеводородной цепью, а Lip1Pc и Lip2Pc – липазами, способными утилизировать длинноцепочечные субстраты. Щелочной рН (8,5-9,0) и температурный оптимумы (25-35°С) полученных белков характерны и для других изученных холодоактивных ферментов (Choo et al., 1998, Chen et al., 2010, Kulakova et al., 2004). Отличительными особенностями изученных белков EstPc, Lip1Pc и Lip2Pc были более широкий температурный диапазон активности и высокая активность при температурах, близких к 0°С. Белки EstPc и Lip2Pc продемонстрировали относительно высокую 145 термостабильность при температурах выше 60°С, нехарактерную для многих других холодоактивных белков (Choo et al., 1998, Chen et al., 2010, Kulakova et al., 2004, Zhang et al., 2007). Также показано, что полученные белки обладают различной стабильностью по отношению к ионам металлов, детергентам, органическим растворителям и другим добавкам. Наименее высокую стабильность обнаружил активность Lip1Pc, изученных веществ. которого Наиболее подавлялась стабильным большинством оказался Lip2Pc, продемонстрировавший способность сохранять активность в присутствии большинства добавок, в том числе в присутствии 0,05% ДСН и 5% ацетонитрила. На основании липолитические полученных ферменты охарактеризованные в данных P. данной можно cryohalolentis, работе, обладают утверждать, что полученные и специфическими свойствами, отличающими их от других представителей семейства и представляющими интерес как для исследований в области структуры и функции белковых молекул, так и для практического применения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что криопэги вечной мерзлоты содержат большое количество видов микроорганизмов, обладающих липолитической активностью в условиях пониженной температуры и высокой солености. Нами впервые создана коллекция психротолерантных галофильных микроорганизмов, выделенных из переохлажденных высокоминерализованных вод в толще вечной мерзлоты (криопэгов) Колымской низменности, Аляски и полуострова Ямал потенциальных продуцентов холодоактивных липолитических ферментов, и изучены их морфологические и физиолого-биохимические характеристики. Установлено, что выделенные микроорганизмы в основном представлены грамположительными Методом и грамотрицательными филогенетического секвенирования анализа последовательностей 146 с генов палочками и кокками. использованием данных 16S рРНК проведено определение таксономического положения выделенных микроорганизмов. Было показано, что полученные микроорганизмы принадлежат к двум основным филумам Actinobacteria (родам Brevibacterium, Citricoccus, Kocuria, и Dietzia) и Firmicutes (родам Lactigenium и Bacillus). Изучение липолитической активности выделенных микроорганизмов продемонстрировало наличие у них липолитических ферментов с различной субстратной специфичностью. Нами была подробно изучена липолитическая система P.cryohalolentis, выделенного ранее из криопэга Колымской низменности (Bakermans et al., 2006). Продемонстрировано наличие как внеклеточной, так и внутриклеточной липолитической активности у этого микроорганизма. При понижении температуры культивирования наблюдалось увеличение липолитической активности данного штамма, что позволило предположить наличие у P.cryohalolentis холодоактивных липолитических ферментов. На основании имеющихся данных полногеномного секвенирования с помощью методов биоинформатики смоделирована липолитическая система этого микроорганизма, включающая внутриклеточные и внеклеточные липолитические ферменты с различной субстратной специфичностью. Нами сконструированы эффективные системы экспрессии в клетках E. coli потенциальных холодоактивных липолитических ферментов P.cryohalolentis и разработаны методики их выделения и рефолдинга. Выделенные ферменты были подробно охарактеризованы. Установлено, что EstPc является относительно термостабильной эстеразой, обладающей высокой активностью при низких температурах, Lip1Pc - липазой, способной эффективно утилизировать при пониженных температурах субстраты с длиной углеводородной цепи С10-С12, а Lip2Pc - холодоактивным липолитическим ферментом, способным утилизировать субстраты с длиной углеводородной цепи С14-С16 и обладающим относительно высокой термостабильностью. 147 Исследование свойств данных белков подтвердило ранее сконструированную модель липолитической системы P.cryohalolentis и обнаружило наличие активности в широком температурном диапазоне и относительной термостабильности у двух полученных в работе липаз. Такие свойства существенно отличают эти ферменты от ранее изученных холодоактивных биокатализаторов и делают их интересными объектами для структурно-функциональных исследований и биотехнологического использования. Результаты работы позволяют утверждать, что криопэги Арктики являются перспективным источником для получения штаммов-продуцентов ферментов, в частности, обладающих липолитической активностью при низких температурах и повышенной солености. 148 ВЫВОДЫ 1. Создана и охарактеризована коллекция микроорганизмов из 20 штаммов, выделенных из криопэгов Колымской низменности, п-ова Ямал и Аляски - потенциальных продуцентов холодоактивных липолитических ферментов. 2. Установлено, что выделенные культуры принадлежат к двум основным филумам Actinobacteria (родам Brevibacterium, Citricoccus, Kocuria и Dietzia) и Firmicutes (родам Lactigenium и Bacillus). 3. С помощью методов биоинформатики в геноме P. cryohalolentis идентифицированы гены потенциальных липолитических ферментов. Проведены амплификация и клонирование трех генов (estPc, lip1Pc и lip2Pc), кодирующих холодоактивные липолитические ферменты P.cryohalolentis. 4. Сконструированы высокоэффективные системы экспрессии в E. coli генов estPc, lip1Pc, lip2Pc, а также липазоспецифического шаперона lifPc. Разработаны методики культивирования штаммов-продуцентов и очистки рекомбинантных белков. Разработана методика рефолдинга in vitro Lip2Pc с участием липазоспецифического шаперона LifPc. 5. Проведена функциональная характеристика полученных белков. Установлено, что EstPc обладает максимальной активностью в отношении короткоцепочечных субстратов (С4), в то время как для белков Lip1Pc, Lip2Pc показана высокая липолитическая активность в отношении субстратов с относительно длинной углеродной цепью (С 12С16). 6. Продемонстрировано наличие высокой липолитической активности при низких температурах у всех выделенных белков и относительно высокая термостабильность белков EstPc и Lip2Pc. 149 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Бурашникова Е.Н., Гоготов И.Н. Пурпурная несерная бактерия, выделенная из древней вечной мерзлоты на Колымской низменности// Микробиология. - 1994. - Т. 63. - C. 868-875. 2. Вайнштейн, М.Б., Гоготова, Г.И. и Хиппе, Х. Сульфатредуцирующая бактерия из вечной мерзлоты // Микробиология. - 1995. - Т. 64. - С. 514-518. 3. Гавриш Е. Ю., Краузова В. И., Потехина Н.В., Карасев С.Г., Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Коростелева Л.А., Евтушенко Л.И. Три новых вида бревибактерий-Brevibacterium antiquum sp. nov., Brevibacterium aurantiacum sp. nov. и Brevibacterium permense sp. nov. // Микробиология. - Т.73. - С. - 218-225. 4. Гиличинский Д.А., Ривкина Е.М., Щербакова В.А., Лауринавичюс К.С., Комаров И.А., Волков Н.Г. Криопэги и их обитатели – модель для астробиологии // Криосфера Земли. - 2003. - Т. VII. - № 3. - С. 73-84. 5. Гиличинский Д.А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д.Г. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны // Изв. АН СССР, Сер. геолог. - 1989. - T. 6. - С. 103-115. 6. Гулевский А.К., Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение II. Распространение в природе// Проблемы криобиологии. - 2009. - Т. 19. С.121-136. 7. Добровольская Т.Г., И.Н. Скворцов, Л.В. Лысак. Методы выделения и идентификации бактерий. - 1989. - C. 72. 8. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. 1991. - C. 303. 9. Карасев С.Г., Гурина Л.В., Гавриш Е.Ю., Аданин В.М., Гиличинский Д.А., Евтушенко Л.И. Жизнеспособные актинобактерии из древних вечномерзлых отложений Сибири // Криосфера Земли. 1998. - Т.II. - С. 69-75. 10. Кузьмин Н.П., Дуда В.И., Шершунов И.Н., Томашевский А.Ю., Лысенко А.М., Гиличинский Д.А. Бациллы из древних слоев почв сибирской вечной мерзлоты // Труды международной конференции ―Микробное разнообразие: текущая ситуация, стратегии сохранения и экологические аспекты‖. - 1996. - C.191-192. 11. Печерицына С.А., В.А. Щербакова, А.Л. Холодов, В.Н. Акимов, Т.Н. Абашина, Н.Е. Сузина и Е.М. Ривкина. Микробиологический анализ криопэгов Варандейского полуострова на побережье Баренцева моря // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - С. 694-701. 12. Соина В.С., Лебедева Е.В., Голышина О.В., Федородов-Давыдов Д.Г., Гиличинский Д.А. Нитрифицирующие бактерии из многолетнемерзлых отложений Колымской низменности // Микробиология. - 1991. - Т. 60. - С. 187-190. 1. 150 Фотиев С.М. Гидрохимический метод оценки палеотемпературы пород на Арктическом побережье // Криосфера Земли. - 1997. - Т.1. С.29-35. 14. Фотиев С.М. Криогенный метаморфизм пород и подземных вод // Академическое издательство «ГЕО». - 2009. - С.277. 15. Шатилович А.В., Л.А. Шмакова, С.В. Губин и Д.А. Гиличинский. Жизнеспособные простейшие в вечной мерзлоте Арктики // Криосфера Земли. - 2010. - Т.14. - С. 69-78. 16. Щербакова В., Н. Чувильская, Е. Ривкина, К.Лауринавичус, С. Суетин, С. Печерицина, А. Лысенко, Д. Гиличинский. Новая галотолерантная бактерия из криопэга в вечной мерзлоте: описание Psychrobacter muriicola sp. nov. // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - С. 98-105. 17. Abdou AM. Purification and partial characterization of psychrotrophic Serratia marcescens lipase // Journal of Dairy Science. - 2003. - V. 86. - P. 127–132. 18. Aghajari N., G. Feller, C. Gerday, Haser R. Structures of the psychrophilic Alteromonas haloplanctis О±-amylase give insights into cold adaptation at a molecular level // Structure. - 1998. - V. 6. - P. 1503-1516. 19. Akbari N., K. Khajeh, S. Rezaie, S. Mirdamadi, M. Shavandi, N. Ghaemi High-level expression of lipase in Escherichia coli and recovery of active recombinant enzyme through in vitro refolding // Protein Expres. Purif. - 2010. - V. 70. - P. 75-80. 20. Alford JA., Pierce DA. Lipolytic activity of microorganisms at low and intermediate temperatures. Activity of microbial lipases at temperatures below 0°C // J. Food Sci. - 1961. - V. 26. - P. 518-524. 21. Alquati C., De Gioia L., Santarossa G., Alberghina L., Fantucci P., Lotti M. The cold-active lipase of Pseudomonas fragi: Heterologous expression, biochemical characterization and molecular modeling // Eur. J. Biochem. - 2002. - V. 269. - P. 3321-3328. 22. Anderson E.M., Larsson K.M., Kirk O. One biocatalyst – many applications: the use of Candida antarctica B-lipase in organic synthesis // Biocatalysis Biotransform. - 1998. - V. 16. - P. 181-204. 23. Andersson R.E. Microbial lipolysis at low temperatures // Appl. Environ. Microbiol. - 1980. - V. 39. - P. 36-40. 24. Angkawidjaja C., Matsumura H., Koga Y., Takano K., Kanaya S. Xray crystallographic and MD simulation studies on the mechanism of interfacial activation of a family I.3 lipase with two lids // J. Mol. Biol. 2010. - V. 400. - P. 82–95. 25. Aoyama S., Yoshida N., Inouye S.. Cloning, sequencing and expression of the lipase gene from Pseudomonas fragi IFO-12049 in E. coli // FEBS Lett. - 1988. - V. 242. - P. 36–40. 26. Arpigny J., Feller G., Gerday C. Corrigendum to" Cloning, sequence and structural features of a lipase from the Antarctic facultative psychrophile 13. 151 Psychrobacter immobilis B10 // Biochim Biophys Acta. - V. 1171 - (1993) 1995. - P. 331-333: 103. 27. Arpigny J.L., Feller G., Gerday C. Cloning, sequence and structural features of a lipase from the Antarctic facultative psychrophile Psychrobacter immobilis B10 // Biochim Biophys Acta. - 1993. - V. 1171. P. 331-333. 28. Arpigny J.L., Jaeger K.E. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties // Biochem. J. - 1999. - V. 343. - P.177–183. 29. Arpigny J.L., Lamotte J., Gerday C. Molecular adaptation to cold of an Antarctic bacterial lipase // J. Mol. Catal. B Enzymol. - 1997. - V. 3. - P. 29-35. 30. AuriliaV., Rioux-Dubé J.F., Marabotti A., Pézolet M., D'Auria S. Structure and dynamics of cold-adapted enzymes as investigated by FT-IR spectroscopy and MD. The case of an esterase from Pseudoalteromonas haloplanktis // J. Phys. Chem. B. - 2009. - V. 113. - P. 7753-7761. 31. Ayala-del-Río H., P. Chain, J. Grzymski, M. Ponder, N. Ivanova, P. Bergholz, G. Bartolo, L. Hauser, M. Land and C. Bakermans. The genome sequence of Psychrobacter arcticus 273-4, a psychroactive Siberian permafrost bacterium, reveals mechanisms for adaptation to low-temperature growth // Appl. Environ. Microbiol. - 2010. - V. 76. - P. 2304-2312. 32. Babu M.M., Priya M.L., Selvan A.T., Madera M., Gough J., Aravind L. and Sankaran K. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins // J. Bacteriol. - 2006. - V. 188. - P. 2761-2773. 33. Bakermans C. and K. H. Nealson. Relationship of critical temperature to macromolecular synthesis and growth yield in Psychrobacter cryopegella // J Bacteriol. - 2004. - V. 186. - P. 2340-5. 34. Bakermans C., Ayala-del-Rho H.L., Ponder M.A., Vishnivetskaya T., Gilichinsky D., Thomashow M.F. and Tiedje J.M. Psychrobacter cryohalolentis sp. nov. and Psychrobacter arcticus sp. nov., isolated from Siberian permafrost // Int. J. Syst. Evol Bacteriol. - 2006. - V. 56. - P. 12851291. 35. Bakermans C., R.E. Sloup, D.G. Zarka, J.M. Tiedje and M.F. Thomashow. Development and use of genetic system to identify genes required for efficient low-temperature growth of Psychrobacter arcticus 273-4 // Extremophiles.- 2008. - V. 13. - P. 21-30. 36. Bakermans C., S.L. Tollaksen, C.S. Giometti, C. Wilkerson, J.M. Tiedje and M.F. Thomashow. Proteomic analysis of Psychrobacter cryohalolentis K5T during growth at subzero temperatures // Extremophiles. - 2007. - V. 11. - P. 343-54. 37. Bakermans C., Tsapin A., Souza‐Egipsy V., Gilichinsky D. and Nealson K. Reproduction and metabolism at− 10°C of bacteria isolated from Siberian permafrost // Environ. Microbiol. - 2003. - V. 5. - P. 321-326. 152 38. Becker W.M., Reece J.B. and M.F. Poenie. // The World of the Cell 3rd Ed. - Benjamin/Cummings, 1996. 39. Beisson F., A. Tiss, C. Riviere and R. Verger. Methods for lipase detection and assay: a critical review // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2000. V. 102. - P. 133-153. 40. Bergholz P.W., C. Bakermans and J.M. Tiedje. Psychrobacter arcticus 273-4 uses resource efficiency and molecular motion adaptations for subzero temperature growth // J. bacteriol. - 2009. - V. 191. - P. 2340. 41. Berlemont R., M. Delsaute, F. Angiono, G. Feller, M. Galleni and P. Power. Exploring the Antarctic soil metagenome as a source of novel coldadapted enzymes and genetic mobile elements // Revista Argentina de microbiologia. - 2011. - V. 43. - P. 94-103. 42. Borders C.L., Broadwater J.A., Bekeny P.A., Salmon J.E., Lee A.S., Eldridge A.M. and Pett V.B. A structural role for arginine in proteins: multiple hydrogen bonds to backbone carbonyl oxygens // Protein Sci. 1994. - V. 3 - P. 541-548. 43. Bornscheuer U.T. Microbial carboxyl esterases: classification, properties and application in biocatalysis // FEMS Microbiol. Rev. - 2002. V. 26. - P. 73–81. 44. Bousquet M.P., Willemot R.M., Monsan P., Boures E. Lipase catalyzed -butylglucoside lactate synthesis in organic solvent for dermocosmetic application // J. Biotechnol. - 1999. - V. 68. - P. 61. 45. Bowman J.P., Cavanagh J., Austin J.J. and Sanderson K. Novel Psychrobacter species from Antarctic ornithogenic soils // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1996. - V. 46. - P. 841-848. 46. Bowman J.P., Nichols S.S. and McMeekin T.A. Psychrobacter glacincola sp.nov., a halotolerant, psychrophilic bacterium isolated from Antarctic sea ice // System. Appl. Microbiol. - 1997. - V. 20. - P. 209-215. 47. Bowman, J. P. The genus Psychrobacter // In The Prokaryotes Ed M. Dworkin. - New York: Springer, 2005. - P. 920-930. 48. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – V. 72. – P. 248–254. 49. Brambilla E., H. Hippe, A. Hagelstein, B. J. Tindall and E. Stackebrandt. 16S RNA diversity of cultured and uncultured Prokaryotes of a mat sample from lake Fryxell, McMurdo Dry Valleys, Antarctica // Extremophiles. - 2001. - V. 5. - P. 23-33. 50. Braun V. and Wu H.C. Lipoproteins, structure, function, biosynthesis and models for protein export // In J.-M. Ghuysen and R.Hakenback (ed.), Bacterial cell wall. - Elsevier. Amsterdam, 1993. - V. 27 - P. 319-342. 51. Breg J.N., Sarda L., Cozzone P.J., Rugani N., Boelens R., Kaptein R. Solution structure of porcine pancreatic procolipase as determined from 1H homonuclear two-dimensional and three-dimensional NMR // Eur. J. Biochem. - 1995. - V. 227. - P. 663–672. 153 52. Breuil C., Kushner D.J. Lipase and esterase formation by psychrophilic and mesophilic Acinetobacter species // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21. - P. 423–433. 53. Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U.T. Enzymes in organic chemistry // In: Biocatalysts and enzyme technology. - Weinheim, 2005. - P. 127–131. 54. Cai Y.D., Zhou G.P., Jen C.H., Lin S.L., Chou K.C. Identify catalytic triads of serine hydrolases by support vector machines // J. Theor. Biol. 2004. - V. 228. - P. 551–557. 55. Carr P.D., Ollis D.L. α/β hydrolase fold: an update // Prot. Pep. Lett. 2009. - V. 16. - P. 1137–1148. 56. Casanueva A., M. Tuffin, C. Cary and D.A. Cowan. Molecular adaptations to psychrophily: the impact of omic technologies // Trends Microbiol. - 2010. - V.18. - P. 374-381. 57. Cavicchioli R., K. Siddiqui, Andrews D., Sowers K. Low-temperature extremophiles and their applications // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - V. 13. - P. 253-261. 58. Cavicchioli R., Siddiqui K. Cold adapted enzymes // In: A Pandey, C Webb, CR Soccol, C Larroche (eds) Enzyme Technology. - Asiatech Publishers. India, 2004. - P. 615-638. 59. Chakraborty K. and Paulraj R. Purification and biochemical characterization of an extracellular lipase from Pseudomonas fluorescens MTCC 2421 // J. Agric. Food Chem. - 2009. - V.57. - P. 3859-3866. 60. Chang H., Liao H., Lee C., Shieh C. Optimized synthesis of lipase catalyzed biodiesel by Novozym 435 // J. Chem. Tech. Biotech. - 2004. - V. 80. - P. 307 – 312. 61. Chattopadhyay M. and M. Jagannadham. Maintenance of membrane fluidity in Antarctic bacteria // Polar Biology. 2001. V. 24. P. 386-388. 62. Chattopadhyay M.K. Mechanism of bacterial adaptation to low temperature // J. Biosci. - 2006. - V. 31. - P. 157-165. 63. Chattopadhyay M.K., Jagannadham M.V., Vairamani M. and Shivaji S. Carotenoid pigments of an antarctic psychrotrophic bacterium Micrococcus roseus: temperature dependent biosynthesis, structure and interaction with synthetic membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V. 239. - P. 85-90. 64. Che S., L. Song, W. Song, M. Yang, G. Liu and Xuezheng L. Complete genome sequence of Antarctic bacterium Psychrobacter sp. strain G // Genome announcements. - 2013. - V. 1. - P. e00725-13. 65. Chen C.K., Lee G.C., Ko T.P., Guo R.T., Huang L.M., Liu H.J., Ho Y.F., Shaw J.F., Wang A.H. Structure of the alkalohyperthermophilic Archaeoglobus fulgidus lipase contains a unique C-terminal domain essential for long-chain substrate binding // J. Mol. Biol. - 2009. - V. 390. P. 672–685. 154 66. Chen R., Guo L., Dang H. Gene cloning, expression and characterization of a cold-adapted lipase from a psychrophilic deep-sea bacterium Psychrobacter sp. C18 // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - V. 27. - P. 431-441. 67. Cheng M., Angkawidjaja C., Koga Y. and Kanaya S. Requirement of Lid2 for interfacial activation of a Family I. 3 lipase with unique two lid structures // FEBS J. - 2012. - V. 279. - P. 3727-3737. 68. Chihara-Siomi M., Yoshikawa K., Oshima-Hirayama N., Yamamoto K., Sogabe Y., Nakatani T., Nishioka T., Oda J. Purification, molecular cloning, and expression of lipase from Pseudomonas aeruginosa // Arch. Biochem. Biophys. - 1992. - V. 296. - P. 505–513. 69. Chintalapati S., M.D. Kiran and S. Shivaji. Role of membrane lipid fatty acids in cold adaptation // Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-Grand, France). 2004. - V. 50. - P. 631-642. 70. Choo D.W., Kurihara T., Suzuki T., Soda K., Esaki N. A cold-adapted lipase on an Alaskan psychrotroph, Pseudomonas sp. strain B11-1: gene cloning and enzyme purification and characterization // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - V. 64. P. - 486-491. 71. Chow K.C. and Tung W.L. Overexpression of dna K/dna J and gro EL confers freeze tolerance to Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - V. 253. - P. 502–505. 72. Christner B.C., B.H. Kvitko II and J.N. Reeve. Molecular identification of bacteria and eukarya inhabiting an Antarctic cryoconite hole // Extremophiles. - 2003. - V. 7. - P. 177-183. 73. Coenen T.M., Aughton P., Verhagan H. Safety evaluation of lipase derived from Rhizopus oryzae: Summary of toxicological data//Food Chem. Toxicol. - 1997. - V. 35. - P. 315–22. 74. Collins T., Meuwis M.A., Gerday C. and Feller G. Activity, stability and flexibility in glycosidases adapted to extreme thermal environments // J. Mol. Biol. - 2003. - V. 328. - P. 419–428. 75. Collins T., Meuwis M.A., Stals I., Claeyssens M., Feller G., Gerday C. A novel Family 8 xylanase. functional and physicochemical characterization // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277. - P. 35133-35139. 76. Cowan D.A., Russell N., Mamais A., Sheppard D.M. Antarctic Dry Valley mineral soils contain unexpectedly high levels of microbial biomass // Extremophiles. - 2002. - V. 6. - P. 431–436. 77. Cygler M., Schrag J.D. Structure and conformational flexibility of Candida rugosa lipase // (BBA)-Mol. Cell Biol. Lipids. - 1999. - V. 1441. P. 205–214. 78. Cygler M., Schrag J.D. Structure as basis for understanding interfacial properties of lipases // Methods in Enzymol. - 1997. - V. 284. - P. 3–27. 79. D‘Amico S., Marx J.C., Gerday C. and Feller G. Activity–stability relationships in extremophilic enzymes // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. P. 7891–7896. 155 80. D'Amico S., P. Claverie, T. Collins, Georlette D., Gratia E., Hoyoux A., Meuwis MA., Feller G., Gerday C. Molecular basis of cold adaptation // Philosophical Transactions B. - 2002. - V. 357. - P. 917. 81. De Santi C., Tutino M.L., Mandrich L., Giuliani M., Parrilli E., Del Vecchio P., De Pascale D. The hormone-sensitive lipase from Psychrobacter sp. TA144: New insight in the structural/functional characterization // Biochimie. - 2010. - V. 92. - P. 949-957. 82. DeVries A.L. and Wohlschlag, D.E. Freezing resistance in some Antarctic fishes // Science. - 1969. - V. 163 - P.1073–1075. 83. Dieckelmann M., Johnson L.A., Beacham I.R. The diversity of lipases from psychrotrophic strains of Pseudomonas: A Novel Lipase from a highly lipolytic strain of Pseudomonas fluorescens // J. Appl. Microbiol. - 1998. V. 85. - P. 527–536. 84. Duman J.G. and T.M. Olsen. Thermal hysteresis protein activity in Bacteria, Fungi, and phylogenetically diverse plants // Cryobiol. - 1993. - V. 30. - P. 322-328 85. El Khattabi M., P. Van Gelder, W. Bitter, J. Tommassen. Role of the lipase-specific foldase of Burkholderia glumae as a steric chaperone // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275. - P. 26885-26891. 86. Ericsson D.J., Kasrayan A., Johansson P., Bergfors T., Sandström A.G., Bäckvall J.E., Mowbray S.L. X-ray structure of Candida antarctica lipase A shows a novel lid structure and a likely mode of interfacial activation // J. Mol. Biol. - 2008. - V. 376. - P. 109–119. 87. Feller G. and C. Gerday. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation // Nature Rev. Microbiol. - 2003. - V. 1. - P. 200-208. 88. Feller G. and C. Gerday. Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation // Cell. Mol. Life Sci. CMLS. - 1997. - V. 53 - P. 830-841. 89. Feller G., Narinx E., Arpigny J.L., Aittaleb M., Baise E., Geniot S., Gerday C. Enzymes from psychrophilic organisms // FEMS Microbiol. Rev. - 1996. - V. 18. - P. 189 -202. 90. Feller G., Thiry M., Arpigny J.L., Gerday C. Cloning and expression in Escherichia coli of three Lipase encoding genes from the psychrotrophic Antarctic strain Moraxella TA144 // Gene. - 1991. - V. 102. - P. 111–115. 91. Feller G., Thiry M., Arpigny J.L., Mergeay M. and Gerday C. Lipases from psychrotrophic antarctic bacteria // FEMS Microbial. Lett. - 1990. - V. 66. - P. 239-244. 92. Ferrer M., Angeles Cruces M., Plou F.J., Bernabé M., Ballesteros A. A simple procedure for the regioselective synthesis of fatty acid esters of maltose, leucrose, maltotriose and n-dodecyl maltosides // Tetrahedron. 2000. - V. 56. - P. 4053–4061. 93. Fields P.A. and Somero G.N. Hot spots in cold adaptation: localized increases in conformational flexibility in lactate dehydrogenase A4 orthologs of Antarctic notothenioid fishes // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1998. V. 95. - P. 11476–11481. 156 94. Filloux A. The underlying mechanisms of type II protein secretion // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - V.1694. - P. 163–179. 95. Fojan P., Jonson P.H., Petersen M.T., Petersen S.B. What distinguishes an esterase from a lipase: A novel structural approach // Biochimie. - 2000. - V. 82. - P. 1033–1041. 96. Ganapati D.Y., Piyush S.L. Lipase catalyzed transesterification of methyl acetoacetate with n-butanol // J. Mol. Cat. B Enzy. - 2005. - V.32. P. 107-113. 97. Gao B., Xu T., Lin J., Zhang L., Su E., Jiang Z., Wei D. Improving the catalytic activity of lipase LipK107 from Proteus sp. by site-directed mutagenesis in the lid domain based on computer simulation // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. - 2011. - V. 68. - P. 286–291. 98. Gatti-Lafranconi P., Caldarazzo S.M., Villa A., Alberghina L. and Lotti M. Unscrambling thermal stability and temperature adaptation in evolved variants of a cold-active lipase // FEBS letters. - 2008. -V. 582. - P. 2313-2318. 99. Georlette D., Blaise V., Collins T., D'Amico S., Gratia E., Hoyoux A., Marx J.C., Sonan G., Feller G., Gerday C. Some like it cold: biocatalysis at low temperatures //FEMS Microbiol. Rev. - 2004. - V. 28. - P. 25-42. 100. Gerday C., Aittaleb M., Bentahir M., Chessa J.P., Claverie P., Collins T., D'Amico S., Dumont J., Garsoux G., Georlette D., Hoyoux A., Lonhienne T., Meuwis M., Feller G. Cold adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology // Trend. Biotechnol. - 2000. - V. 18. - P. 103-107. 101. Gharibzahedi S.M.T., S.H. Razavi and S.M. Mousavi. Characterization of bacteria of the genus Dietzia: an updated review // Ann. Microbiol. - 2014. - V. 64. - P. 1-11. 102. Gilbert J., A. Peter, L. Davies and J. Laybourn‐Parry. A hyperactive, Ca2+‐dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium // FEMS Microbiol. Lett. - 2005. - V. 245. - P. 67-72. 103. Gilbert J.A., Hill P.J., Dodd C.E.R., and Laybourn-Parry J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria // Microbiol. - 2004. - V. 150. - P. 171-180. 104. Gilichinsky D. and E. Rivkina. Permafrost Microbiology // Encyclopedia of Geobiology. - 2011. - P. 726-732. 105. Gilichinsky D. Permafrost // In: Bitton G (ed) Encyclopedia of environmental microbiology. - Wiley, New York, 2002. - P. 2367–2385. 106. Gilichinsky D., E. Rivkina, C. Bakermans, V. Shcherbakova, L. Petrovskaya, S. Ozerskaya, N. Ivanushkina, G. Kochkina, K. Laurinavichuis and S. Pecheritsina. Biodiversity of cryopegs in permafrost // FEMS Microbiol. Ecol. - 2005. - V. 53. - P. 117-128. 107. Gilichinsky D., E. Rivkina, V. Shcherbakova, K. Laurinavichuis, and J. Tiedje. Supercooled water brines within permafrost —an unknown 157 ecological niche for microorganisms: A model for astrobiology // Astrobiol. - 2003. - V. 3. - P. 331-341. 108. Gilichinsky D., Vishnivetskaya T., Petrova M., Spirina E, Mamykin V. and Rivkina E. Bacteria in Permafrost // In Psychrophiles: From Biodiversity to Biotechnology. - 2008. - P. 83-102. 109. Gilichinsky D.A., G.S. Wilson, E.I. Friedman, C.P. Mckay, R.S. Sletten, E.M. Rivkina, T.A. Vishnivetskaya, L.G. Erokhina, N.E. Ivanushkina, G.A. Kochkina, V.A. Shcherbakova, V.S. Soina, E.V. Spirina, E.A. Vorobyova, D.G. Fyodorov-Davydov, B. Hallet, S.M.Ozerskaya, V.A. Sorokovikov, K.S. Laurinavichyus, A.V. Shatilovich, J.P. Chanton, V.E. Ostroumov and J.M. Tiedje. Microbial Populations in Antarctic Permafrost: biodiversity, state, age, and implication for astrobiology // Astrobiol. - 2007. - V. 7. - P. 326-341. 110. Giudice A., Michaud L., De Pascale D., De Domenico M., Di Prisco G., Fani R. and Bruni V. Lipolytic activity of Antarctic cold‐adapted marine bacteria (Terra Nova Bay, Ross Sea) // J. App. Microbiol. - 2006. - V. 101. P. 1039-1048. 111. Golubev W.I. New species of basidiomycetous yeasts, Rhodotorula creatinovora and R. yakutica, isolated from permafrost soils of EasternSiberian Arctic // Mykologiya i Phytopathologiya. - 1998. - V. 32. - P. 8-13. 112. Gomes J. and W. The biocatalytic potential of extremophiles and extremozymes // Food Technol. Biotechnol. - 2004. - V. 42. - P. 223-235. 113. Goodchild A., N.F.W. Saunders, H. Ertan, M. Raftery, M. Guilhaus, P.M.G. Curmi and R. Cavicchioli. A proteomic determination of cold adaptation in the Antarctic archaeon, Methanococcoides burtonii // Mol. Microbiol. - 2004. - V.53. - P. 309-321. 114. Gotor-Fernández V., Brieva R., Gotor V. Lipases: useful biocatalysts for the preparation of pharmaceuticals // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2006. - V. 40. - P. 111–120. 115. Graumann P.L. and Marahiel M.A. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain // Trends Biochem Sci. - 1998. - V. 23. - P. 286–290. 116. Grochulski P., Bouthillier F., Kazlauskas R.J., Serreqi A.N., Schrag J.D., Ziomek E., Cygler M. Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate binding site in Candida rugosa lipase // Biochem. - 1994. V. 33. - P. 3494–3500. 117. Gunstone F.D. Enzymes as biocatalysts in the modification of natural lipids // J. Sci. Food Agric. - 1999. - V. 79. - P. 1535–1549. 118. Gupta R., Gupta N., Rathi P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2004 - V. 64. - P. 763–781. 119. Gupta R., P. Rathi, N. Gupta and S. Bradoo. Lipase assays for conventional and molecular screening: an overview // Biotechnol.App. Biochem. - 2003. - V. 37. - P. 63-71. 158 120. Hasan F., A. Shah, Hameed A. Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review // Biotechnol. Adv. 2009. - V. 27. - P. 782-798. 121. Hasan F., Shah A.A., Hameed A. Industrial applications of microbial lipases // Enzyme and Microbial Technol. - 2006. - V. 39. - P. 235–251. 122. Hasegawa Y., Kawada N. and Nosho Y. Change in chemical composition of membrane of Bacillus caldotenax after shifting the growth temperature // Arch. Microbiol. - 1980. - V. 126. - P. 103-108. 123. Hedfors C., Hult K., Martinelle M. Lipase chemoselectivity towards alcohol and thiol acyl acceptors in a transacylation reaction // J. Mol. Catalysis B: Enzym. - 2010. - V. 66. - P. 120–123. 124. Hossain M. and H. Nakamoto. Htpg plays a role in cold acclimation in Cyanobacteria // Curr. Microbiol. - 2002. - V. 44. - P. 291-296. 125. Huang T. and J.G. Duman. Cloning and characterization of a thermal hysteresis (antifreeze) protein with DNA-binding activity from Winter Bittersweet Nightshade, Solanum dulcamara // Plant Mol. Biol. - 2002. - V. 48. - P. 339-350. 126. Iino T., Suzuki K., Harayama S. Lacticigenium naphtae gen. nov., sp. nov., a halotolerant and motile lactic acid bacterium isolated from crude oil // Int. J. Syst. Evolutionary Microbiol. - 2009. - V. 59. - P. 775-780. 127. Jaeger K.E., Dijkstra B.W., Reetz M.T. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases // Ann. Rev. Microbiol. - 1999. - V. 53. - P. 315–351. 128. Jaeger K.E., Eggert T. Lipases for biotechnology // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - V. 13. - P. 390–397. 129. Jaeger K.E., Ransac S., Dijkstra B.W., Colson C., Van Heuvel M., Misset O. Bacterial lipases // FEMS Microbiol. Rev. - 1994. - V. 15. - P. 9– 63. 130. Jagannadham M.V., Chattopadhyay M.K. and Shivaji S. The major carotenoid pigment of a psychrotrophic Micrococcus roseus strain: fluorescence properties of the pigment and its binding to membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1996 - V. 220. - P. 724-728. 131. Jagannadham M.V., Chattopadhyay M.K., Subbalakshmi C., Vairamani M., Narayanan K., Rao C.M. and Shivaji S. Carotenoids of an Antarctic psychrotolerant bacterium, Sphingobacterium antarcticus, and a mesophilic bacterium, Sphingobacterium multivorum //Arch. Microbiol. 2000. - V. 173. - P. 418-424. 132. Jagannadham M.V., Rao V.J. and Shivaji S., The major carotenoid pigment of a psychrotrophic Micrococcus roseus strain: purification, structure and interaction with synthetic membranes // J.Bacteriol. - 1991. V. 173. - P. 7911-7917. 133. Jansson J. and N. Taş. The Microbial Ecology of Permafrost // Nat. Rev. Microbiol. - 2014. - V. 494. - P. 40. 159 134. Jeon J.H., J.T. Kim, Y.J. Kim, H.K. Kim, H.S. Lee, S.G. Kang, S.J. Kim and J.H. Lee. Cloning and characterization of a new cold-active lipase from a deep-sea sediment metagenome // App. Microbiol. Biotechnol. 2009. - V. 81. - P. 865-874. 135. Jinwal U.K., Roy U., Chowdhury A.R., Bhaduri A.P. and Roy P.K. Purification and characterization of an alkaline lipase from a newly isolated Pseudomonas mendocina PK-12CS and chemoselective hydrolysis of fatty acid ester // Bioorg. Med. Chem. - 2003. - V. 11. - P. 1041-1046. 136. Joergensen S., K.W. Skov and B. Diderichsen. Cloning, sequence and expression of a lipase gene from Pseudomonas cepacia: lipase production in heterologous hosts requires two Pseudomonas genes // J. Bacteriol. - 1991. V. 173. - P. 559-567. 137. Joseph B, Ramteke P.W., Kumar P.A. Studies on the enhanced production of extracellular lipase by Staphylococcus epidermidis //J. Gen. Appl. Microbiol. - 2006. - V. 52. - P. 315-320. 138. Joseph B., Ramteke PW, Thomas G. and Shrivastava N. Standard review cold-active microbial lipases: A versatile tool for industrial applications // Biotechnol. Mol. Biol. Rev. - 2007. - V. 2. - P. 39-48. 139. Jung S.K., Jeong D.G., Lee M.S., Lee J.K., Kim H.K., Ryu S.E., Park B.C., Kim J.H., Kim S.J. Structural basis for the cold adaptation of psychrophilic M37 lipase from Photobacterium lipolyticum // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2008. - V. 71. - P. 476-484. 140. Juni E., Heym G.A. Psychrobacter immobilis gen. nov., sp. nov.: genomospecies composed of gram-negative, aerobic oxidase positive coccobacilli // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1986. - V. 36. - P. 388-392. 141. Kanchana R., Muraleedharan U.D., Raghukumar S. Alkaline lipase activity from the marine protists, thraustochytrids // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - V. 27. - P. 2125-2131. 142. Kawahara H., Koda N., Oshio M. and Obata H. A cold acclimation protein with refolding activity on frozen denatured enzymes // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2000. - V. 64. - P. 2668–2674. 143. Kawahara H., Li J., Griffith M. and Glick B.R. Relationship between antifreeze protein and freezing resistance in Pseudomonas putida GR12-2 // Curr Microbiol. - 2001. - V.43. - P. 365-370. 144. Kawahara, H., Iwanaka, Y., Higa, S. et al. A novel, intracellular antifreeze protein in an antarctic bacterium, Flavobacterium xanthum // Cryo Letters. - 2007. - V.28. - P.39-49. 145. Kenji Y., V. Romanovsky, N. Duxbury, J. Browna, A. Tsapin. The use of geophysical methods to discriminate between brine lavers and freshwater taliks in permafrost regions // J. Glaciol. Geocriol. - 2004. - V. 26. - P. 220-230. 146. Khalameyzer V., Fischer I., Bornscheuer U.T., Altenbuchner J. Screening, nucleotide sequence, and biochemical characterization of an 160 esterase from Pseudomonas fluorescens with high activity towards lactones // App. Env. Microbiol. - 1999. - V. 65. - P. 477–482. 147. Khan I.M., Dill C.W., Chandan R.C., Shahani K.M. Production and properties of the extracellular lipase of Achromobacter lipolyticum // Biochem. Biophys. Acta. - 1967. - V. 132. - P. 68-77. 148. Kim H.K., H.J. Choi, M.H. Kim, C.B. Sohn and TK. Oh. Expression and characterization of Ca2+ independent lipase from Bacillus pumilus B26 // Biochim. Biophys. Act. (BBA)-Mol. Cell Biol. Lipids. - 2002. - V. 1583. P. 205-212. 149. Kim S., I.H. Park, S.C. Lee, Y.S. Lee, C.M. Kim, S.C. Ahn, Y.L. Choi. Discovery of three novel lipase (lipA 1, lipA 2, and lipA 3) and lipasespecific chaperone (lipB) genes present in Acinetobacter sp. DYL129 // Appl. Microbiol. Biotech. - 2008. - V. 77. - P. 1041-1051. 150. Kiran M.D., Annapoorni S., Suzuki I., Murata N. and Shivaji S. Cistrans isomerase gene in psychrophilic Pseudomonas syringae is constitutively expressed during growth and under conditions of temperature and solvent stress // Extremophiles. - 2005. - V. 9. - P. 117–125. 151. Kok R.G., V.M. Christoffels, B. Vosman and K.J. Hellingwerf. Growth-phase-dependent expression of the lipolytic system of Acinetobacter calcoaceticus Bd413: cloning of a gene encoding one of the esterases // Microbiol. - 1993. - V.139. - P. 2329. 152. Krivushin K., Shcherbakova V., Petrovskaya L. and Rivkina E. Methanobacterium veterum sp. nov., from ancient Siberian permafrost // Int. J. Syst. Evolutionary Microbiol. - 2010. - V. 60. - P. 455-459. 153. Kulakova L., Galkina A., Nakayamab T., Nishinob T., Esakia N. Cold-active esterase from Psychrobacter sp. Ant300: gene cloning, characterization, and the effects of Gly Pro substitution near the active site on its catalytic activity and stability // Biochem. Biophys. Act. - 2004. - V. 1696. - P. 59– 65. 154. Kumar G.S., Jagannadham M.V. and Ray M.K. Low-temperature induced changes in composition and fluidity of lipopolysaccharides in the Antarctic psychrotrophic bacterium Pseudomonas syringae // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 6746–6749. 155. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685. 156. Langin D., Laurell H., Holst L.S., Belfrage P., Holm C. Gene organization and primary structure of human hormone-sensitive lipase: possible significance of a sequence homology with a lipase of Moraxella sp. TA144, an antarctic bacterium // Proceed. Nation. Acad. Sci. (PNAS). 1993. - V. 90. - P. 4897. 157. Lee H.K., Min J.A., Sung H.K., Won H.S., Byeong C.J. Purification and characterization of cold-active lipase from psychrotrophic Aeromonas sp. LPB 4 // J. Microbiol. - 2003. - V. 41. - P. 22-27. 161 158. Lee S.D. Brevibacterium marinum sp. nov., isolated from seawater //Int. J. Syst. Evolutionary Microbiol. - 2008. - V. 58. - P. 500-504. 159. Lelivelt M.J. and Kawula T.H. Hsc 66, an Hsp 70 homolog in Escherichia coli, is induced by cold shock but not by heat shock // J. Bacteriol. - 1995. - V. 177. - P. 4900–4907. 160. Liebeton K., A. Zacharias, K.E. Jaeger. Disulfide bond in Pseudomonas aeruginosa lipase stabilizes the structure but is not required for interaction with its foldase // J. Bacteriol. - 2001. - V. 183. - P. 597-603. 161. Link L., J. Sawyer, K. Venkateswaran, W. Nicholson. Extreme spore UV resistance of Bacillus pumilus isolates obtained from an ultraclean spacecraft assembly facility //Microb. Ecol. - 2004. - V. 47. - P. 159-163. 162. Lonhienne T., Gerday C. and Feller G. Psychrophilic enzymes: revisiting the thermodynamic parameters of activation may explain local flexibility // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - V.1543. - P. 1–10. 163. Los D., Horvath I., Vigh L. and Murata N. The temperature-dependent expression of the desaturase gene desA in Synechocystis PCC6803 // FEBS Lett. - 1993. - V.318. - P.57–60. 164. Lotti M., Tramontano A., Longhi S., Fusetti F., Brocca S., Pizzi E. and Alberghina L. Variability within the Candida rugosa lipases family // Protein Eng. - 1994. - V. 7. - P. 531-535. 165. Mandrich L., Merone L., Pezzullo M., Cipolla L., Nicotra F., Rossi M., Manco G. Role of the N terminus in enzyme activity, stability and specificity in thermophilic esterases belonging to the HSL family // J. Molecular Biol. - 2005. - V. 345. - P. 501-512. 166. Mandrich L., Pezzullo M., Del Vecchio P., Barone G., Rossi M., Manco G. Analysis of thermal adaptation in the HSL enzyme family // J. Molecular Biol. - 2004. - V. 335. - P. 357-369. 167. Margesin R. Cold-active enzymes as new tools in biotechnology // In Extremophiles. - EOLSS Publ. Oxford. UK, 2002. 168. Margesin R., Labbé D., Schinner F., Greer C.W., Whyte L.G. Characterization of hydrocarbon-degrading microbial populations in contaminated and pristine alpine soils // App. Env. Microbiol. - 2003. - V. 69. - P. 3085–3092. 169. Mayordomo I., Randez Gil F., Prieto J.A. Isolation, purification and characterization of a cold-active lipase from Aspergillus nidulans // J. Agric. Food Chem. - 2000. - V. 48. - P. 105-109. 170. Mergaert J., Verhelst A., Cnockaert M.C., Tan T.L. and Swings J. Characterization of facultative oligotrophic bacteria frompolar seas by analysis of their fatty acids and 16S rDNA sequences // Syst. Appl. Microbiol. - 2001. - V. 24. - P. 98–107 171. Methe B.A., Nelson K.E., Deming J., Momen B., Melamud E.,Zhang X., Moult J., Madupu R., Nelson W.C., Dodson R.J. The psychrophilic lifestyle as revealed by the genome sequence of Colwellia psychrerythraea 162 34H through genomic and proteomic analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. - V. 102. - P. 10913–10918. 172. Miled N., Bussetta C., De caro A., Rivière M., Berti L., Canaan S. Importance of the lid and cap domains for the catalytic activity of gastric lipases // Comparative Biochem. Physiol. Part B: Biochem. Mol. Biol. 2003. - V. 136. - P. 131–138. 173. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriol. Rev. - 1975. - V.39. P. 144-167. 174. Nardini M. and B.W. Dijkstra. α/β hydrolase fold enzymes: the family keeps growing // Curr. Opinion Struct. Biol. - 1999. - V. 9. - P. 732-737. 175. Neidfiardt F.C., J.L. Ingraham and M. Schaechter. Physiology of the bacterial cell 1st ed. - Sunderland. MA, 1990. - P. 506. 176. Nthangeni M.B., Patterton H.G., Van Tonder A., Vergeer W.P., Litthauer D. Over expression and properties of a purified recombinant Bacillus licheniformis lipase: a comparative report on Bacillus lipases // Enz. Microb. Technol. - 2001. - V. 28. - P. 705–712. 177. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B., Frolow F., Franken S.M., Harel M., Remington S.J., Silman I., Schrag J., Sussman J.L., Verschueren K.H., Goldman A. The α/β hydrolase fold // Protein Eng. 1992. - V. 5. - P. 197–211. 178. Oren A. Diversity of halophilic microorganisms: environments, phylogeny, physiology, and applications // J. Industrial Microb. Biotechnol. - 2002. - V. 28. - P. 56-63. 179. Østerlund T., Contreras J.A., Holm C. Identification of essential aspartic acid and histidine residues of hormone-sensitive lipase: apparent residues of the catalytic triad // FEBS Letters. - 1997. - V. 403. - P. 259–262. 180. Otto Y., Sawamoto T., Hasuo M. Tributyrin specifically induces a lipase with a preference for the sn-2 position of triglyceride in Geotrichum sp. F0401B // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2000. - V. 64. - P. 2497-2499. 181. Ozerskaya S., Ivanushkina N., Kochkina G., Fattakhova R. and Gilichinsky D. Mycelial fungi from cryopegs // Int. J. Astrobilogy. - 2004. V. 3. - P. 27-34. 182. Pandey A., Benjamin S., Soccol C.R., Nigam P., Krieger N., Soccol V.T. The realm of microbial lipases in biotechnology // Biotechnol. App. Biochem. - 1999. - V. 29. - P. 119–131. 183. Park I., Kim S., Lee Y.S., Lee S.C., Zhou Y., Kim C.M., Ahn S.C. and Choi Y.L. Gene cloning, purification, and characterization of a cold-adapted lipase produced by Acinetobacter baumannii BD5 // J Microbiol Biotechnol. - 2009. - V. 19. - P. 128–135. 184. Parra L., Reyes F., Acevedo J.P., Salazar O., Andrews B.A., Asenjo J.A. Cloning and fusion expression of a cold-active lipase from marine Antarctic origin // Enzyme Microb. Technol. - 2008. - V. 42. - P. 371-377. 185. Patkar S.A., Bjorking F., Zundel M., Schulein M., Svendsen A., Heldt Hansen H.P., Gonnsen E. Purification of two lipases from Candida 163 antarctica and their inhibition by various inhibitors // Ind. J. Chem. - 1993. V. 32. - P. 76-80. 186. Pauwels K., A. Lustig, L. Wyns, J. Tommassen, S. Jan Savvides, P. Van Gelder. Structure of a membrane-based steric chaperone in complex with its lipase substrate // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2006. - V. 13. - P. 374375. 187. Pauwels K., M.M. Sanchez del Pino, G. Feller, P. Van Gelder, Decoding the folding of Burkholderia glumae lipase: folding intermediates en route to kinetic stability // PLoS ONE. - 2012. - V. 7. - P. e36999. 188. Pauwels K., P. Van Gelder. Affinity-based isolation of a bacterial lipase through steric chaperone interactions // Protein Expres. Purif. - 2008. V. 59. - P. 342-348. 189. Pecheritsyna S.A., E.M. Rivkina, V.N. Akimov and V.A Shcherbakova. Desulfovibrio arcticus sp. nov., a psychrotolerant sulfatereducing bacterium from a cryopeg // Int. J. Syst. Evolutionary Microbiol. 2012. - V. 62. - P. 33-37. 190. Pemberton J.M., Stephen P.K., Radomir S. Secreted enzymes of Aeromonas // FEMS Microbiol. Lett. - 1997. - V. 152. - P. 1-10. 191. Pencreach G., Graille J., Pina M., Verger R. An ultraviolet spectrophotometric assay for measuring lipase activity using long-chain triacylglycerol from Aleurites fordii // Analyt. Biochem. - 2002. - V. 303. P. 17–23. 192. Permafrost Subcommittee Glossary of permafrost and related groundice terms. Associate Committee on Geotechnical Research, National Research Council of Canada, Ottawa. - 1988. 193. Pirozzi D., Greco G.J. Activity and stability of lipases in the synthesis of butyl lactate // Enzym. Microb. Technol. - 2004. - V. 34. - P. 94-100. 194. Porankiewicz J. and Clarke A.K. Induction of the heat shock protein Clp B affects cold acclimation in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 // J. Bacteriol. - 1997. - V. 179. - P. 5111–5117. 195. Potekhina N.V., Shashkov A.S., Evtushenko L.I., Gavrish E.Y., Senchenkova S.N., Stomakhin A.A., Usov A.I., Naumova I.B., Stackebrandt E.A novel mannitol teichoic acid with side phosphate groups of Brevibacterium sp. VKM Ac-2118 // FEBS. - 2003. - V. 270. - P. 4420 4425. 196. Preuss J., Kaiser I., Gehring U. Molecular characterization of a phosphatidylcholine - hydrolyzing phospholipase C // Eur. J. Biochem. 2001. - V. 268. - P. 5081-5091. 197. Pudney P.D., Buckley S.L., Sidebottom C.M. Twigg S.N., Sevilla M.P., Holt C.B., Roper D., Telford J.H., McArthur A.J., Lillford P.J. The physico-chemical characterization of a boiling stable antifreeze protein from a perennial grass (Lolium perenne) // Arch.Biochem. Biophys. - 2003. - V. 410. - P. 238–245. 164 198. Quyen D., C. Schmidt-Dannert, R. Schmid. High-level formation of active Pseudomonas cepacia lipase after heterologous expression of the encoding gene and its modified chaperone in Escherichia coli and rapid in vitro refolding // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. -P. 787–794. 199. Rabus R., A. Ruepp, T. Frickey, T. Rattei, B. Fartmann, M. Stark, M. Bauer, A. Zibat, T. Lombardot and I. Becker. The genome of Desulfotalea psychrophila, a sulfate‐reducing bacterium from permanently cold Arctic sediments // Environ. Microbiol. - 2004. - V. 6. - P. 887-902. 200. Ramteke P.W., Joseph B., Kuddus M. Extracellular lipases from anaerobic microorganisms of Antarctic // Ind. J. Biotech. - 2005. - V. 4. - P. 293-294. 201. Rashid N., Shimada Y., Ezaki S., Atomi H. and Imanaka T. Lowtemperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp. strain KB700A // App. Environ. Microbiol. - 2001. - V. 67. - P. 4064-4069. 202. Rasol R., A.R. Rashidah, R. Nazuha, S. Nur, J. Smykla, W.O. Maznah and S.A. Alias. Psychrotrophic lipase producers from Arctic soil and sediment samples // Polish J. Microbiol. - 2014. - V. 63. - P. 175. 203. Raymond J.A., Christner B.C., Schuster S.C. A bacterial ice-binding protein from the Vostok ice core // Extremophiles. - 2008. - V. 12 - P.713– 717. 204. Raymond J.A., Fritsen C., and Shen K. An ice-binding protein from an Antarctic sea ice bacterium // FEMS Microbiol Ecol. - 2007. - V. 61. - P. 214–221. 205. Redondo O., Herrero A., Bello J.F., Roig M.G., Calvo M.V., Plou F.J., Burguillo F.J. Comparative kinetic study of lipases A and B from Candida rugosa in the hydrolysis of lipid p-nitrophenyl esters in mixed micelles with Triton X-100 // Biochim. Biophys. Acta (BBA)-General Subjects. - 1995. - V. 1243. - P. 15–24. 206. Reetz M.T. Lipases as practical biocatalysts // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2002. - V. 6. - P. 145–150. 207. Rivkina E., Shcherbakova V., Laurinavichuis K., Petrovskaya L., Krivushin K., Kraev G., Pecheritsina S., and Gilichinsky D. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost // FEMS Microbiol Ecol. - 2007. - V.371. - P. 371-384. 208. Rivkina E.M., Friedmann E.I., McKay C.P., Gilichinsky D.A. Metabolic activity of permafrost bacteria below the freezing point // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - V. 66. - P. 3230-3233. 209. Rodrigues D., Goris J., Vishnivetskaya T., Gilichinsky D., Thomashow M. and Tiedje J. Characterization of Exiguobacterium isolates from the Siberian permafrost. Description of Exiguobacterium sibiricum sp. nov. // Extremophiles. - 2006. - V. 10. - P. 285-294. 210. Rosenau F., J. Tommassen, K.E. Jaeger. Lipase-specific foldases // Chembiochem. - 2004. - V. 5. - P. 152-161. 165 211. Russel N.J. and Hamamoto T. Psychrophiles. In: Horikoshi, K. and Grant, W.D., ed.: Extremophiles: Microbial life in extreme environments. Wiley, 1998. - P. 25–45. 212. Ryu H.S., Kim H.K., Choi W.C., Kim M.H., Park S.Y., Han N.S., Oh T.K., Lee J.K. New cold-adapted lipase from Photobacterium lipolyticum sp. nov. that is closely related to filamentous fungal lipases // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. - V. 70. - P. 321–326. 213. Rzhetsky A. and M. Nei. A simple method for estimating and testing minimum-evolution trees // Mol. Biol. Evol. - 1992. - V. 9. - P. 945-967. 214. Saitou N. and M. Nei. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. - 1987. - V.4. - P. 406-425. 215. Santarossa G., Lafranconi P.G., Alquati C., DeGioia L., Alberghina L., Fantucci P., Lotti M. Mutations in the "lid" region affect chain length specificity and thermostability of a Pseudomonas fragi lipase // FEBS Lett. 2005. - V. 579. - P. 2383-2386. 216. Scherer S. and K. Neuhaus. Life at low temperatures // In The Prokaryotes. - Springer, 2006. - P. 210-262. 217. Schmid R.D., Verger R. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications // Angewandte Chemie Int. Ed. - 1998. - V. 37. - P. 1608–1633. 218. Schmidt-Dannert C. Recombinant microbial lipases for biotechnological applications // Bioorg. Med. Chem. - 1999. - V. - 7. P. 2123–2130. 219. Scholander P.F., Van Dam L., Kanwisher J.W. Hammel H.T., Gordon M.S. Supercooling and osmoregulation in arctic fish // J.Cell.Comp.Physiol. - 1957. - V.49. - P.5–24. 220. Secundo F., Carrea G., Tarabiono C., Gatti-Lafranconi P., Brocca S., Lotti M., Jaeger K.E., Puls M., Eggert T. The lid is a structural and functional determinant of lipase activity and selectivity // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. - 2006. - V. - 39. - P. 166–170. 221. Seydel A., Gounon P. and Pugsley A.P. Testing the ‗+2 rule‘ for lipoprotein sorting in the Escherichia coli cell envelope with a new genetic selection // Mol. Microbiol. - 1999. - V. 34. - P. 810–821. 222. Shabtai Y. and Gutnick D. Exocellular esterase and emulsan release from the cell surface of Acinetobacter cakoaceticus RAG- 1 // J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 1176-1181. 223. Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C. Production, purification, characterization, and applications of lipases // Biotechnol. Adv. - 2001. - V. 19. - P. 627–662. 224. Shcherbakova V., Chuvilskaya N., Rivkina E., Demidov N., Uchaeva V., Suetin S., Suzina N. and Gilichinsky D. Celerinatantimonas yamalensis sp. nov., a cold-adapted diazotrophic bacterium from a cold permafrost brine. // Int.J. Syst. Evolutionary Microbiol. - 2013. - V. 63. - P. 4421-4427. 166 225. Shcherbakova V., E. Rivkina, K. Laurinavichuis, S. Pecheritsina and D. Gilichinsky. Physiological characteristics of bacteria isolated from water brines within permafrost // Int. J. Astrobiol. - 2004. - V. 3. - P. 37–43. 226. Shcherbakova V., Rivkina E., Pecheritsyna S., Laurinavichius K., Suzina N. and Gilichinsky D. Methanobacterium arcticum sp. nov., a methanogenic archaeon from holocene Arctic permafrost. // Int.J. Syst. Evolutionary Microbiol. - 2011. - V. 61. - P. 144-147. 227. Shcherbakova V.A., N.A. Chuvilskaya, E.M. Rivkina, S.A. Pecheritsyna, K.S. Laurinavichius, N.E. Suzina, G.A. Osipov, A.M. Lysenko, D.A. Gilichinsky, V.K. Akimenko. Novel psychrophilic anaerobic spore-forming bacterium from the overcooled water brine in permafrost: description Clostridium algoriphilum sp. nov. // Extremophiles. - 2005. - V. 9. - P. 239–246. 228. Shen W.J., Sridhar K., Bernlohr D.A., Kraemer F.B. Interaction of rat hormone-sensitive lipase with adipocyte lipid-binding protein // PNAS. 1999. - V. 96. - P. 5528. 229. Shi T., Reeves R.H., Gilichinsky D.A., Friedmann E.I. Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing. // Microbiol. Ecol. - 1997. - V.33. - P.169–179. 230. Shibata H., H. Kato, J. Oda. Calcium ion-dependent reactivation of a Pseudomonas lipase by its specific modulating protein, LipB // J. of Biochem. - 1998. - V. 123. - P. 136-141. 231. Shimada Y., Watanabe Y., Sugihara A., Baba T., Ooguri T., Moriyama S., Terai T., Tominaga Y. Ethyl esterification of docosahexaenoic acid in an organic solvent-free system with immobilized Candida antarctica lipase // J. Biosci. Bioeng. - 2001. - V. 92. - P. 19-23. 232. Sibille N., Favier A., Azuaga A.I., Ganshaw G., Bott R., Bonvin A.M., Boelens R., Van Nuland N.A. Comparative NMR study on the impact of point mutations on protein stability of Pseudomonas mendocina lipase // Protein Sci. - 2006. - V. 15. - P. 1915–1927. 233. Simon C., A. Wiezer, A. Strittmatter and R. Daniel. Phylogenetic diversity and metabolic potential revealed in a glacier ice metagenome // Appl. Environ. Microbiol. - 2009. - V. 75. - P. 7519–7526. 234. Simons J., Van Kampen M.D., Ubarretxena-Belandia I., Cox R.C., C.M. Alves dos Santos, M.R. Egmond and Verheij H.M. Identification of a calcium binding site in Staphylococcus hyicus lipase: generation of calciumindependent variants // Biochem. - 1999. - V. 38. - P. 2-10. 235. Slotema W.F., Sandoval G., Guieysse D., Straathof A.J.J., Marty A. Economically pertinent continuous amide formation by direct lipasecatalyzed amidation with ammonia // Biotechnol. Bioeng. - 2003. - V. 82. - P. 664 –669. 236. Smallwood M., Worrall D., Byass L., Ellias L., Ashford D., Doucet C., Holt C., Telford J., Lillford P. and Bowles D. Isolation and 167 characterization of a novel antifreeze protein from carrot (Daucus carota) // Biochem. J. - 1999. - V. 340. - P. 385–391. 237. Somero G.N. Proteins and temperature // Annu. Rev. Physiol. - 1995. - V. 57. - P. 43–68. 238. Spirina E., J. Cole, B. Chai, J. Tiedje, D. Gilichinsky. New high through put approach to study ancient microbial phylogenetic diversity in permafrost // Cryo. Sci. Programme. Abstract. - 2003. - V. 5. - P. EAE03-A01243. 239. Srinivas T., S. Nageswara Rao, P. Reddy, M. Pratibha, B. Sailaja, B. Kavya, K Hara Kishore, Z Begum, SM Singh and S Shivaji. Bacterial diversity and bioprospecting for cold-active lipases, amylases and proteases, from culturable bacteria of Kongsfjorden and Ny-Ålesund, Svalbard, Arctic // Curr. Microbiol. - 2009. - V. 59. - P. 537-547. 240. Stehr F., Kretschmar M., Kröger C., Hube B., Schäfer W. Microbial lipases as virulence factors // J. Mol. Cat. B: Enzy. - 2003. - V. 22. - P. 347– 355. 241. Sterner O. Metabolism of exogenous compounds in mammals–the principle conversions // In: Chem. Health Environ. Wiley-VCH Verlag GmbH and Company. KGaA. - Weinheim, 1999. - P. 155. 242. Steven B., Le´veille R., Pollard W., Whyte L. Microbial ecology and biodiversity in permafrost // Extremophiles. - 2006. - V.10. - P. 259–267. 243. Steven B., Pollard W., Greer C., Whyte L. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic // Environ. Microbiol. - 2008. - V. 10. - P. 3388-3403. 244. Subczynski W.K., Markowska E., Gruszecki W.I. and Sielewiesiuk J. Effect of polar carotenoids on dimyristoylphosphatidylcholine membranes: a spin-label study // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - V. 1105. - P. 97–108. 245. Suutari M. and Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaptation // Crit. Rev. Microbiol. - 1994. - V. 20. - P. 285–328. 246. Suzuki T, T. Nakayama, T. Kurihara, T. Nishino, N Esaki. Primary structure and catalytic properties of a cold-active esterase from a psychrotroph, Acinetobacter sp. strain No. 6. isolated from Siberian soil // Biosci. Biotech. Biochem. - 2002. - V. 66. - P. 1682-1690. 247. Suzuki T., Nakayama T., Kurihara T., Nishino T., Esaki N. Coldactive lipolytic activity of psychrotrophic Acinetobacter sp. strain no. 6 // J. Biosci. Bioeng. - 2001. - V. 92. - P. 144–148. 248. Tamura K., G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski and S. Kumar. Mega 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. //Mol. Biol. Evolution. - 2013. - V. - P. 2725-2729. 249. Tan S., Owusu A.R.K., Knapp J. Low temperature organic phase biocatalysis using cold-adapted lipase from psychrotrophic Pseudomonas P38 // Food Chem. - 1996. - V. 57. - P. 415-418. 250. Testa B., Mayer J.M. Classification, localization, and some physiological roles of hydrolytic enzymes // In: Hydrolysis in drug and 168 prodrug metabolism: chemistry, biochemistry, and enzymology. VHCA. Verlag Helvetica Chimica Acta AG. - Zurich, 2003. - P. 25–46. 251. Thieringer H.A., P.G. Jones and M. Inouye. Cold shock and adaptation // Bioessays. - 1998. - V. 20. - P. 49-57. 252. Thompson J.D., D.G. Higgins, and T.J. Gibson, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Research. - 1994. - V.22. - P. 4673-4680. 253. Titball R.W. Bacterial phospholipases // Symposium Series (Soc. Appl. Microbiol.). - 1998. - V. 27. - P. 127S–137S. 254. Trotsenko Y.A., Kmelenina V.N. Aerobic methanotrophic bacteria of cold ecosystems // FEMS Microbiol. Ecol. - 2005. - V. 53. - P. 125-131. 255. Tuteja R. Type I signal peptidase: an overview // Arch. Biochem. Biophys. - 2005. - V. 441. - P. 107-111. 256. Tutino L.M., Parrilli E., De Santi C., Giuliani M., Marino G., de Pascale D. Cold-adapted esterases and lipases: a biodiversity still underexploited // Curr. Chem. Biol. - 2010. - V. 4. - P. 74-83. 257. Van Pouderoyen G., Eggert T., Jaeger K.E., Dijkstra B.W.. The crystal structure of Bacillus subtilis lipase: a minimal α/β hydrolase fold enzyme // J. Mol. Biol. - 2001. - V. 309. - P. 215–226. 258. Vatsurina A., D. Badrutdinova, P. Schumann, S. Spring and M. Vainshtein. Desulfosporosinus hippei sp. nov., a mesophilic sulfate-reducing bacterium isolated from permafrost // Int. J.Syst.Evolutionary Microbiol. 2008. - V. 58. - P. 1228-1232. 259. Verger R. Interfacial activation of lipases: facts and artifacts // Trends Biotechnol. - 1997. - V. 15. - P. 32–38. 260. Vishnivetskaya T., Erokhina L., Spirina E., Shatilovich A., Vorobyova E.A., Gilichinsky D. Ancient viable green algae and cyanobacteria from permafrost // In: Algae and extreme environments, (Eds., Elster J., Seckbach J., Vincent W., Lhotsky O.). - Nova Hedwigia Beiheft, 2001. - V. 123. - P. 427-441. 261. Vishnivetskaya T., Kathariou S., McGrath J., Gilichinsky D.A., Tiedje J.M. Low-temperature recovery strategies for the isolation of bacteria from ancient permafrost sediments // Extremophiles. - 2000. - V.4. - P.165–173. 262. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Zalinova N., Mamukelashvili A., Gilichinsky D.A., Rivkina E., Vishnivetskaya T. The deep cold biosphere: facts and hypothesis // FEMS Microbiol Rev. - 1997. V.20. - P. 277–290. 263. Wahler D., Reymond J.L. Novel methods for biocatalyst screening // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2001. - V. 5. - P. 152–158. 264. Walker V.K., Palmer G.R., Voordouw G. Freeze-thaw tolerance and clues to the winter survival of a soil community // Appl Environ Microbiol. 2006. - V.72. - P.1784-1792. 169 265. Watanabe Y., Shimada Y., Sugihara A., Tominaga Y. Conversion of degummed soybean oil to biodiesel fuel with immobilized Candida antarctica lipase // J. Mol. Catal. B Enzy. - 2002. - V. 17. - P. 151-155. 266. Weber M.H.W. and Marahiel M.A. Coping with the cold: the cold shock response in the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. - 2002. - V.357. - P. 895–907. 267. Wei Y., Contreras J.A., Sheffield P., Osterlund T., Derewenda U., Kneusel R.E., Matern U., Holm C., Derewenda Z.S. Crystal structure of brefeldin A esterase, a bacterial homolog of the mammalian hormonesensitive lipase // Nat Struct Biol. - 1999. - V.6. - P. 340-345. 268. Weisburg W.G., S.M. Barns, D.A. Pelletier and D.J. Lane. 16s Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. - 1991. - V.173. - P. 697-703. 269. Widmann M., Juhl P.B., Pleiss J. Structural classification by the lipase engineering database: a case study of Candida antarctica lipase A // BMC Genomics. - 2010. - V. 11. - P. 123. 270. Wiseman A. Introduction to principles // In: A Wiseman (ed) Handbook of enzyme biotechnology. 3rd ed. - Padstow. Cornwall. UK, 1995. - P. 3–8. 271. Xu H., Griffith M., Patten C.L. and Glick B.R. Isolation and characterization of an antifreeze protein with ice nucleation activity from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2// Can. J.Microbiol. - 1998. - V. 44. - P.64-73. 272. Xuezheng L., Shuoshuo C., Guoying X., Shuai W., Ning D., Jihong S. Cloning and heterologous expression of two cold-active lipases from the Antarctic bacterium Psychrobacter sp. G // Polar Research. - 2010. - V. 29. P. 421–429. 273. Yamaguchi K., Yu F. and Inouye M. A single amino acid determinant of the membrane localization of lipoproteins in E. coli // Cell. - 1988. - V. 53. - P. 423–432. 274. Yamaguchi S., E. Yamamoto, T. Mannen, T. Nagamune. Protein refolding using chemical refolding additives // Biotechnol. J. - 2013. - V. 8. P. 17-31. 275. Yamanaka K. Cold shock response in Escherichia coli // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V. 1. - P.193–202. 276. Yamashita Y., Nakamura N., Omiya K., Nishikawa J., Kawahara H., Obata H. Identification of an antifreeze lipoprotein from Moraxella sp. of Antarctic origin // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2002. - V.66. - P. 239– 247. 277. Yan Y., Yang J., DouY., Chen M., Ping S., Peng J., Lu W., Zang W., Yao Z., Li H. Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501 // Proc. Nat. Acad. Sci. - 2008. - V. 105. - P. 7564-7569. 170 278. Yokoi K., A. Fujii, M. Kondo, Nishitani G., Ikeda M., Shimada T., Inagaki N., Yamakawa A., Taketo A., Kodaira K.I. Molecular properties and extracellular processing of the lipase of Staphylococcus warneri M // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2012. - V. 22. - P. 167-176. 279. Yumoto I., Hirota K., Sogabe Y., Nodasaka Y., Yokota Y. and Hoshino T. Psychrobacter okhotskensis sp. nov., a lipase-producing facultative psychrophile isolated from the coast of the Okhotsk Sea // Int. J. Syst. Evol Bacteriol. - 2003. - V. 53. - P. 1985-1989. 280. Zeng X., Xiao X., Wang P., Wang F. Screening and characterization of psychrotrophic lipolytic bacteria from deep sea sediments // J. Microbiol. Biotechnol. - 2004. - V. 14. - P. 952-958. 281. Zhang J., S. Lin, Zeng R. Cloning, expression, and characterization of a cold-adapted lipase gene from an antarctic deep-sea psychrotrophic bacterium, Psychrobacter sp 7195 // J Microbiol Biotechnol. - 2007. - V. 17. - P. 604-10. 282. Zhang K.P., Lai J.Q., Huang Z.L., Yang Z. Penicillium expansum lipase-catalyzed production of biodiesel in ionic liquids // Bioresource Technol. - 2011. - V. 102. - P. 2767–2772. 283. Zhang N., Suen W.C., Windsor W., Xiao L., Madison V., Zaks A. Improving tolerance of Candida antarctica lipase B towards irreversible thermal inactivation through directed evolution // Prot. Eng. - 2003. - V. 16. - P. 599–605. 171
