медленное замораживание/витрификация

Предлагаем вашему вниманию главу 8 модуля «Эмбриология».
Эта глава называется «Криоконсервация ооцитов и эмбрионов (медленное
замораживание/витрификация)»; в ней описываются основные принципы,
достоинства и недостатки замораживания и витрификации. Автор – Lisbet Van
Landuyt.
1
После изучения данной главы слушатель сможет: разбираться в основных
принципах криобиологии и в способах их применения в отношении
репродуктивных клеток (гамет), чтобы получить возможность
усовершенствовать используемые процедуры криоконсервации ооцитов и
эмбрионов. Кроме того, слушатель сможет понять, какие факторы влияют на
исход криоконсервации и обобщить сведения о современных методах
криоконсервации ооцитов и эмбрионов.
2
Отправная точка для развития методов криоконсервации человеческого
эмбриона появилась в начале семидесятых годов прошлого века в результате
уникального сотрудничества трех ученых. Этими учеными были David
Whittingham из Великобритании, Stanley Leibo и Peter Mazur из США. David
Whittingham ранее уже имел некоторый опыт криоконсервации мышиных
эмбрионов и опубликовал результаты своего исследования в 1969 году вместе
с Wales, и в 1971 году. Фундаментом для исследований Stanley Leibo и Peter
Mazur послужили возникшие в то время представления о замораживании
эмбрионов млекопитающих; полученные данные они опубликовали в ряде
статей в период с 1963 по 1972 годы. Результатом сотрудничества этих троих
ученых в 1972 году стало рождение живой мыши после оттаивания и переноса
мышиных эмбрионов, предварительно замороженных при температуре -196°C
и -269°C.
Независимо от этой работы Wilmut также добился успеха в замораживании
мышиных эмбрионов в 1972 году.
Работа, проведенная Wilmut, Whittingham, Leibo и Mazur, вскоре стала
образцом для криоконсервации – коровьих эмбрионов (сообщалось Wilmut и
соавт. в 1975 г.), крысиных эмбрионов (продемонстрировано Whittingham в
1975 г.), овечьих эмбрионов (сообщалось Willadsen и соавт. в 1976 г.) и
3
эмбрионов кролика (продемонстрировано Whittingham и соавт. в 1976 г.).
Что же касается криоконсервации человеческих эмбрионов, прорыв был сделан
в январе 1977 года, когда в Лондоне проводился симпозиум по теме
«Замораживание эмбрионов млекопитающих», организованный фондом СИБА.
Во время симпозиума Edwards, специализировавшийся на вопросах
эмбриологии человека, прочитал лекцию «Значимость сохранения
замороженных человеческих эмбрионов» (“The Relevance of the Frozen Storage
of Human Embryos”), где впервые обсуждалась оптимальная для хранения при
низких температурах стадия развития человеческого эмбриона в
преимплантационный период, и описывались криобиологические аспекты
дробящихся человеческих эмбрионов.
После этого симпозиума Edwards, Trounson и Zeilmaker независимо друг от
друга подготовили почву для развития криоконсервации человеческого
эмбриона при лечении бесплодия. Trounson с соавт. описали ранние стадии
развития, которые они изучали в своей лаборатории в 1983 году, и сообщили о
наступлении «первой» беременности после переноса криоконсервированных
человеческих эмбрионов. Однако беременность не продлилась долго.
Результаты исследования криоконсервации человеческого эмбриона,
проведенной в лаборатории Trounson, были затем опубликованы Trounson в
1984 году.
О первом случае рождения живого ребенка после переноса замороженных и
размороженных эмбрионов сообщил Zeilmaker в 1984 году. В 1985 г. Rall и Fahy
описали новый метод криоконсервации эмбрионов млекопитающих,
позволяющий избежать формирование кристаллов льда. Этот метод получил
название «витрификация» и был успешно опробован на 8-клеточных мышиных
эмбрионах. После успешного осуществления криоконсервации человеческих
эмбрионов в 1986 году Chen и соавт. опробовали криоконсервацию
человеческих ооцитов, однако с ограниченным успехом по причине наличия
чувствительного к охлаждению веретена деления в ооцитах, находящихся в
стадии второго деления мейоза.
Литература:
Whittingham D and Wales R (1969) Storage of two-cell mouse embryos in-vitro.
Australian Journal of Biological Sciences; 22(4): 1065–1068.
Whittingham D (1971) Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature;
233: 125–126.
Leibo S and Mazur P (1971) The role of cooling rates in low temperature
preservation. Cryobiology; 8: 447–452.
3
Leibo S et al. (1970) Effects of freezing on marrow stem cell suspensions:
interactions of cooling and warming rates in the presence of PVP, sucrose or glycerol.
Cryobiology; 6: 315–332.
Mazur P (1963). Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the
likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology; 47: 347–369.
Mazur P (1970) Cryobiology: the freezing of biological systems. Science; 168 : 939–
949.
Mazur P et al. (1969) Survival of hamster tissue-culture cells after freezing and
thawing. Cryobiology; 6: 1–9.
Mazur P et al. (1972) A two-factor hypothesis of freezing injury. Experimental Cell
Research; 71: 345–355.
Whittingham D et al. (1972) Survival of mouse embryos frozen to -196°C and -269°C.
Science; 178: 411-414.
Wilmut (1972) The effect of cooling rate, warming rate of cryoprotective agent, and
stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life
Sciences. Pt. 2: Biochemistry, general and molecular biology; 11(22): 1071–1079.
Whittingham D (1975) Survival of rat embryos after freezing and thawing. Journal of
Reproduction and Fertility; 43: 575–578.
Wilmut I et al. (1975) The effect on cow embryos of cooling to 20, 0 and -196°C.
Journal of Reproduction and Fertility; 45: 409–411.
Willadsen et al. (1976) Deep freezing of sheep embryos. Journal of Reproduction and
Fertility; 46: 151–154.
Whittingham D and Adams C (1976) Low temperature preservation of rabbit embryos.
Journal of Reproduction and Fertility; 47: 269–274.
Edwards R and Steptoe P (1977). The relevance of the frozen storage of human
embryos. In “The freezing of mammalian embryos”, Ciba Foundation Symposium 52,
Elsevier, Amsterdam, 235–244.
Trounson A (1984) In vitro fertilization and embryo preservation. In “In vitro
fertilization and embryo transfer”. Trounson A and Wood C (eds). Churchill
Livingstone, London, 111–130.
Trounson A and Mohr L (1983) Human pregnancy following cryopreservation, thawing
and transfer of an eight-cell embryo. Nature; 305: 707–709.
Zeilmaker G et al. (1984) Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed
embryos. Fertility and Sterility; 42: 293–296.
Rall W and Fahy G (1985) Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by
vitrification. Nature; 313: 573–575.
Chen C (1976) Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet; 1: 884–886.
3
Криоконсервация эмбрионов применяется в репродуктивной медицине самым
различным образом.
• Прежде всего, любой избыточный эмбрион может быть заморожен на
определенный период времени, который зависит от различных медицинских
и юридических (законодательных) факторов, сохраняя возможность
проведения второй попытки в случае, если первая имплантация прошла
неудачно (например, из-за недостаточного развития эндометрия). Как
следствие, эмбрионы могут быть перенесены в естественном цикле в
нескольких последовательных циклах. Кроме того, возможно уменьшение
количества циклов лечения с индукцией овуляции на одну пациентку.
• Во-вторых, криоконсервация особенно важна для упрощения
синхронизации циклов донора ооцитов и женщины-реципиента, которая
сама не способна производить ооциты нормального качества. Если бы не
было возможности криоконсервации эмбрионов, синхронизация
потенциального донора и реципиента была бы делом случая, как отметили
Devroey и соавт. в 1988 году.
• В-третьих, как продемонстрировали Wada с соавт. в 1992 году, в случаях,
когда после пункции фолликулов риск развития синдрома гиперстимуляции
яичников очень высок, замораживание всех эмбрионов, несомненно,
является вариантом выбора.
• В-четвертых, если по какой-либо особой медицинской или технической
4
причине перенос эмбрионов во время цикла получения ооцитов невозможен,
их можно заморозить и перенести в любом последующем цикле.
• И, наконец, криоконсервация является удачным вариантом для пациентов,
которые рискуют утратить овариальную функцию из-за лучевой или
химиотерапии.
Различные авторы сообщали о важности криоконсервации эмбрионов в
повседневной практике ВРТ. Криоконсервации придавали большое значение
как способу снижения частоты многоплодных родов после ВРТ (наглядно
продемонстрировано Tiitinen et al. в 2003 г., Schnorr et al. в 2001 г., Gerris et al. в
2003 г. и Kolibianakis et al. в 2004 г.), и как возможности повысить эффективность
ВРТ (как отмечали Kahn et al. в 1993 г., Wang et al. и Van Steirteghem et al. в 1994
г., Van Voorhis et al. в 1995г., Mandelbaum et al. в 1998 г., Tiitinen et al. в 2001 г. и
de Jong et al. в 2002 г.).
В некоторых странах криоконсервация эмбрионов запрещена по юридическим и
этическим причинам. В этих случаях единственным вариантом становится
замораживание ооцитов. Также замораживание ооцитов является отличным
способом сохранения фертильности (например, перед началом лечения рака).
Литература:
Devroey P et al. (1988) Embryo donation in patients with primary ovarian failure.
Human Reproduction; 3: 85–87.
Wada I et al. (1992) Outcome of treatment subsequent to the elective
cryopreservation of all embryos from women at risk of the ovarian stimulation
syndrome. Human Reproduction; 7: 962–966.
Tiitinen A et al. (2003) Impact of elective single transfer on the twin pregnancy rate.
Human Reproduction; 18: 1449–1453.
Schnorr J et al. (2001) Impact of a cryopreservation program on the multiple
pregnancy rate associated with assisted reproductive technologies. Fertility and
Sterility; 75: 147–151.
Gerris J (2003) Cryopreservation as a tool to reduce multiple birth. Reproductive
Biomedicine Online; 7: 286–294.
Kolibianakis E et al. (2003). Implantation potential and clinical impact of
cryopreservation – a review. Placenta; 24: S27–S33.
Kahn J et al. (1993) The efficacy and efficiency of an in-vitro fertilization programme
including embryo cryopreservation: a cohort study. Human Reproduction; 8(2): 247–
252.
Wang W et al. (1994) The contribution of embryo cryopreservation to in-vitro
fertilisation/ gamete intr-Fallopian transfer: 8 years experience. Human Reproduction;
4
9: 103–109.
Van Steirteghem A et al. (1994) Human embryo cryopreservation. In “Perspectives on
assisted reproduction”. Ares-Serono Symposia Series – Frontiers in Endocrinology,
vol. 4, Mori T, Aono T, Tominaga T, Hiroi T (eds): 475–480.
Van Voorhis B et al. (1995) The efficacy and cost effectiveness of embryo
cryopreservation compared with other assisted reproductive techniques. Fertility and
Sterility; 64: 647–650.
Mandelbaum J et al. (1998) Cryopreservation in human assisted reproduction is now
routine for embryos but remains a research procedure for oocytes. Human
Reproduction; 13 (Suppl 3): 161–174.
Tiitinen A et al. (2001) Elective single embryo transfer: the value of cryopreservation.
Human Reproduction: 16: 1140–1144.
De Jong D et al. (2002) The added value of embryo cryopreservation to cumulative
ongoing pregnancy rate per IVF treatment: is cryopreservation worth the effort?
Journal of Assisted Reproduction and Genetics; 19: 561–568.
4
Криоконсервация репродуктивных клеток или эмбрионов проводится для того,
чтобы остановить все биологические процессы в клетках. Эффективный
способ сделать это – подвергнуть клетки воздействию очень низких
температур, таких как температура жидкого азота (-196°C). При такой
температуре в клетке не может происходить ни один метаболический процесс.
Однако охлаждение клеток до очень низких температур не лишено риска.
Внутриклеточное пространство человеческих ооцитов и эмбрионов почти на
80% состоит из воды, так что воздействие на клетки очень низких температур
может спровоцировать образование оказывающих губительное действие
кристалликов льда, что неизбежно повредит клетки. Существуют два
различных метода, решающих проблему, связанную с наличием воды внутри
клеток – медленное замораживание и витрификация; оба они успешно
используются для криоконсервации ооцитов и эмбрионов.
5
Существуют два принципиально различных метода медленного
замораживания репродуктивных клеток:
1) медленное неравновесное замораживание и
2) медленное равновесное замораживание;
и два различных метода витрификации:
1) неравновесная витрификация и
2) равновесная витрификация.
Эти технологии схематически представлены на данном слайде и будут
подробно обсуждаться на следующих слайдах.
6
Во время медленного неравновесного замораживания температура клетки
сначала охлаждается с 37°C до 22°C (комнатная температура), и при этой
температуре к клетке добавляется криопротектор. После насыщения
криопротектором (КП) клетки, погруженной в основной солевой раствор, она
охлаждается до температуры -7°C, и в этот момент индуцируется образование
кристаллов льда во внеклеточном пространстве. Поскольку такие кристаллы
льда обычно состоят из чистой воды, а клетка погружена в физиологический
раствор, концентрация соли во внеклеточном пространстве возрастает и
повышается осмоляльность. В ответ на такое повышение осмоляльности
клетка начинает терять воду и сморщиваться.
То, что происходит дальше, будет зависеть от скорости охлаждения и от
размера клетки. Если регулируемая скорость охлаждения является достаточно
небольшой (для ооцитов и эмбрионов обычно 0,3°C/мин.), происходит падение
температуры и образование кристаллов льда во внеклеточном пространстве,
клетка будет реагировать на это постепенной потерей воды, что в свою
очередь приводит к сморщиванию клетки. Когда клетка охлаждается до
температуры, скажем, -30°C, она уже потеряла большую часть своей воды (т.е.
она достаточно обезвожена) так, что внутриклеточное пространство
отвердевает без образования внутриклеточных кристаллов льда,
оказывающих губительное действие. Тем не менее, когда клетку с
температурой -30°C погружают в жидкий азот, в ней будут находиться
7
микроскопические внутриклеточные кристаллики льда, которые являются
безвредными при условии, что клетка будет оттаивать очень быстро (>
300°C/мин), чтобы не допустить разрастания этих кристаллов льда до
размеров, которые могут нанести вред. После оттаивания до температуры 22°C
криопротектор разбавляется, до того как температура клетки вновь достигнет
37°C.
7
Первые шаги в процессе медленного равновесного замораживания
аналогичны шагам при медленном неравновесном замораживании. Клетка
сначала охлаждается с 37°C до 22°C (комнатная температура), т.е. до
температуры, при которой к клетке добавляется криопротектор. После
насыщения криопротектором (КП) клетки, погруженной в основной солевой
раствор, она охлаждается до температуры -7°C, в этой точке вызывается
образование кристаллов льда во внеклеточном пространстве. Поскольку такие
кристаллы льда обычно состоят из чистой воды и клетка погружена в
физиологический раствор, концентрация соли во внеклеточном пространстве
возрастает, и осмоляльность повышается. В ответ на такое повышение
осмоляльности клетка начинает терять воду и сморщиваться.
То, что происходит дальше, будет зависеть от скорости охлаждения и от
размера клетки. Если регулируемая скорость охлаждения является достаточно
небольшой (для ооцитов и эмбрионов обычно 0,3°C/мин.), происходит падение
температуры и образование кристаллов льда во внеклеточном пространстве,
клетка будет реагировать на это постепенной потерей воды. К моменту, когда
температура клетки достигает -80°C, она теряет всю способную
замораживаться воду и может быть помещена в жидкий азот без риска
образования внутриклеточных кристаллов льда. Когда погружение происходит
при температуре -80°C, клетки должны оттаивать медленно (< 25°C/мин) во
избежание осмотического шока. После оттаивания до температуры 22°C КП
8
разбавляется, до того как температура клетки вновь достигнет 37°C.
8
Большинство криобиологов считают, что начало современной криобиологии –
эры репродуктивных клеток – положило случайное открытие криопротекторных
свойств глицерина Polge и соавт. в 1949 году. Со времени этого значимого
открытия криопротекторы используются для обеспечения выживания живых
клеток при низких температурах.
Хотя механизмы, отвечающие за защиту во время криоконсервации,
полностью не ясны, все криопротекторы имеют ряд схожих свойств. Они
смешиваются с водой, они снижают точку замерзания водных растворов,
повышают вязкость водных растворов и уменьшают температуру
льдообразования в клетках или растворах, как отмечено Rall и соавт. в 1983
году.
Несмотря на вероятность успешного исхода, тем не менее, только некоторые
технологии криоконсервации приводят в результате к 100% выживанию клеток
после замораживания и оттаивания. Другими словами, криопротекторы – не
панацея, даже в тех случаях, когда используется оптимальная скорость
охлаждения и нагревания. По меньшей мере, часть проблемы заключается в
самих криопротекторах. Прежде всего, токсичность криопротекторов
ограничивает концентрацию вспомогательных веществ, которые могут
использоваться перед замораживанием, и, следовательно, ограничивает
9
криозащитную эффективность этих веществ. Кроме того, имеются основания
считать, что кроме преимуществ, которыми обладают криопротекторы, они
также могут играть непосредственную роль в развитии криоповреждений, как
сообщал Fahy в 1986 году.
Polge C, Smith A, Parkes A (1949) Revival of spermatozoa after virtrication and
dehydration at low temperatures. Nature, 164, 666.
Fahy G (1986) The relevance of cryoprotectant toxicity to cryobiology. Cryobiology
23, 1-13.
Rall W, Mazur P, McGrath J (1983) Depression of the ice-nucleation temperature of
rapidly cooled mouse embryos by glycerol and dimethylsofoxide. Biophys J 41, 1-12.
9
Криопротекторы можно разделить на две группы: проникающие и
непроникающие криопротекторы; оба вида успешно используются для
медленного замораживания и витрификации.
К группе проникающих криопротекторов относятся следующие вещества:
диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, пропиленгликоль (ПГ), этиленгликоль
(ЭГ) и метанол. В 1954 году Lovelock доказал, что все эти криопротекторы
способны проникать через мембраны ооцитов и эмбрионов, они
обеспечивают защиту как внутри, так и вокруг клеток.
К непроникающим криопротекторам, как сообщалось в 1986 году AshwoodSmith, относятся моносахариды, в частности, галактоза, дисахариды, такие как
сахароза и трегалоза, полисахариды (декстраны и гидроксиэтилированный
крахмал) и полимеры, такие как полиэтиленгликоль. Криозащитные качества
этой группы криопротекторов изучались рядом ученых. Franks с соавт. и Crowe
и соавт. опубликовали результаты своих исследований в 1977 и 1990 году,
соответственно, сообщая, что непроникающие криопротекторы защищают
клетки посредством дегидратации, стабилизации липидных биослоев и
белков, или за счет изменения свойств воды в непосредственной близости от
мембран. Когда ооциты или эмбрионы испытывают воздействие моно- или
дисахаридов, клетки реагируют осмотически потерей воды. Поскольку эти
10
криопротекторы не проникают сквозь мембраны, клетки остаются сжатыми до
тех пор, пока не произойдет уравновешивания.
Несколько переменных факторов обуславливают резистентность в отношении
химической токсичности и (или) осмотического шока, действию которых
подвергаются ооциты и эмбрионы при использовании проникающих или
непроникающих криопротекторов. В 1987 году Rall сообщал о том, что к этим
факторам относятся характеристики проницаемости клеточных мембран для
воды и криопротекторов, концентрация криопротекторных веществ и
температура воздействия.
Литература:
Lovelock J, (1954). The protective action of neutral solutes against haemolysis by
freezing and thawing. Biochem J 56, 265-270.
Ashwood-Smith, M.J. (1986) The cryopreservation of human embryos. Human
Reproduction 1, 319–332.
Franks F et al. (1977) Polymer cryoprotectants in the preservation of biological
structure. 1. Low temperature states of aqueous solutions of hydrophilic polymers. J
of Miscroscopy 110, 223-228.
Crowe J et al. (1990) Are freezing and dehydration the same vectors? A comparison
of modes of interaction of stabilising solutes with biomolecules. Cryobiology 27, 219231.
Rall W (1987) Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by
vitrification. Cryobiology 24, 387-402.
10
Для замораживания ооцитов и эмбрионов могут использоваться различные
емкости для хранения и различные среды.
К емкостям для хранения относятся стеклянные ампулы, пластиковые
флаконы и пластиковые соломинки. В настоящее время чаще всего
используются пластиковые соломинки. Они исключают возможность
перекрестного загрязнения, например, возможную передачу вирусов
замороженным эмбрионам через зараженный жидкий азот.
Для медленного равновесного замораживания в качестве криопротектора
обычно используется диметилсульфоксид.
Для медленного неравновесного замораживания в качестве криопротекторов в
основном используются глицерин, пропиленгликоль и диметилсульфоксид в
сочетании с сахарозой. Сахароза является непроникающим криопротектором;
она обезвоживает клетки до того, как начинается фактическое замораживание.
11
На этом слайде обобщены технические проблемы медленного
замораживания:
• Когда клетки охлаждаются медленно, их выживаемость зависит от скорости
охлаждения и/или нагревания.
• Необходимо избегать образования внеклеточных и внутриклеточных
кристаллов льда.
• Клетки могут погибнуть при охлаждении до ~0°C.
• Клетки могут пережить замораживание, но погибнуть от осмотического шока
при оттаивании.
• Для защиты клеток от ущерба, причиняемого криоконсервацией, могут
использоваться различные химические вещества, так называемые
криопротекторы.
• Как для медленного замораживания, так и для витрификации требуется
дорогостоящее оборудование, например программные замораживатели для
биологических объектов.
• Для выполнения криоконсервации может требоваться много времени (3–5
часов в зависимости от конечной точки медленного замораживания).
• Чтобы обеспечить воспроизводимые результаты, необходимы надежные
методы криоконсервации.
12
Этот слайд схематически описывает основные различия между равновесной и
неравновесной витрификацией. Для обоих методов витрификации основным
принципом является погружение клеток, насыщенных криопротектором,
непосредственно в жидкий азот.
Понятие «витрификация» относится к явлению, когда растворы переходят
непосредственно в стеклообразное состояние без формирования кристаллов
льда. Основные аспекты витрификации, также как и влияющие на
витрификацию факторы, подробно описали Fahy и соавт. в 1984 году и Rall в
1987 году.
В кратком изложении, витрификация имеет отношение к физическому
процессу, при котором концентрированные растворы криопротекторных
веществ при понижении температуры отвердевают без образования
кристаллов. В твердом состоянии сохраняется нормальное распределение
молекул и ионов, такое же, как в жидком состоянии, и оно может
рассматриваться как крайне вязкое твердое стеклообразное состояние.
Переход в стеклообразное состояние можно оценить такими методами, как
дифференциальная сканирующая калориметрия, рентгенодифракционный
метод и путем непосредственного визуального наблюдения.
13
Литература:
Fahy G et al. (1984) Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology 21,
407-426.
Rall W (1987) Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by
vitrification. Cryobiology 24, 387-402.
13
Существуют два важных для витрификации переменных фактора: скорость
охлаждения и нагревания и криопротекторы. Для витрификации,
происходящей с умеренной или низкой скоростью охлаждения (равновесная
витрификация), требуются очень высокие концентрации криопротекторов,
обычно в пределах от 6 до 7 М. Считается, что при таких концентрациях
криопротекторы являются химически и/или осмотически токсичными. Такую
осмотическую токсичность можно снизить за счет постепенного добавления
криопротекторов к клеткам или посредством использования осмотических
буферов для разбавления криопротекторов вне клеток. Химическую
токсичность криопротекторов можно снизить за счет:
добавления специальных средств для нейтрализации токсического действия;
использования криопротекторов с высокой стеклообразующей способностью;
использования смесей криопротекторов;
включения непроникающих криопротекторов типа сахаров или полимеров для
увеличения вязкости раствора и для ускорения процесса дегидратации до
замораживания;
повышения гидростатического давления на раствор или
понижения температуры воздействия.
Последнее, однако, по сообщениям Fahy и соавт. в 1984 году и Rall и соавт. в
14
1987 году, сильно воздействует на способность криопротектора к
проникновению в клетки, что делает обработку при более низких температурах
менее привлекательной. Таким образом, большинство попыток
витрифицировать эмбрионы было сосредоточено на повышении скоростей
охлаждения и нагревания и на удержании концентрации криопротекторов в
«приемлемых» пределах.
Такая неравновесная витрификация обычно совершается посредством:
уменьшения объема образца и/или использования особых систем-носителей;
использования смеси наименее токсичных криопротекторов, которая
осуществит переход в стекловидное состояние при достижимых скоростях
охлаждения и нагревания; и
минимизации степени как химической, так и осмотической токсичности во время
воздействия и удаления криопротекторов, как отмечали Lieberman и соавт. в
2002 году.
Литература:
Fahy G et al. (1984) Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology 21,
407-426.
Rall W (1987) Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by
vitrification. Cryobiology 24, 387-402.
Lieberman J et al. (2002) Potential importance of vitrification in reproductive
medicine. Biol Reprod 67, 1671-1680
14
Успех витрификации зависит от «достаточной» проникающей способности
проникающих криопротекторов и «достаточной» дегидратации под
воздействием непроникающих криопротекторных веществ во время
витрификации. Достаточная проникающая способность и достаточная степень
дегидратации непосредственно связаны со специфическими
характеристиками проницаемость ооцитов и эмбрионов для воды и
криопротекторных веществ агентов, и, следовательно, эти характеристики
должны учитываться при проведении процедуры витрификации.
Прежде всего, известно, что характеристики проницаемости ооцитов и
эмбрионов очень сильно зависят от температуры. Чем ниже температура, тем
ниже проницаемость клеточной мембраны для воды и криопротектора. Таким
образом, температура в лаборатории, где проводится процедура
витрификации, должна строго контролироваться и поддерживаться
неизменной на протяжении всего года для того, чтобы избежать вариаций в
исходе витрификации. Предпочтительно поддерживать температуру в
пределах 22–27 °C.
Во-вторых, характеристики проницаемости у различных ооцитов или
эмбрионов, полученных от одной или разных пациенток могут варьировать.
Следовательно, оптимальный период времени, необходимый для
15
проникновения криопротектора во время этапа уравновешивания, у различных
ооцитов и эмбрионов также может варьировать.
В-третьих, известно, что характеристики проницаемости мембраны ооцитов и
эмбрионов зависят от типа используемого криопротектора. Как наглядно
продемонстрировано в 2007 году Van den Abbeel, проницаемость мембраны для
глицерина меньше, чем для этиленгликоля или пропиленгликоля. Поэтому для
витрификации часто используются смеси криопротекторов с различной
проникающей способностью.
И наконец, известно, что проницаемость для воды и криопротекторов у ооцитов
меньше, чем, например, у зигот. Эмбрионы менее проницаемы для воды и
криопротекторов, чем бластоцисты. Следовательно, оптимальный интервал
времени для уравновешивания криопротекторов будет варьировать в
зависимости от стадии развития витрифицируемой клетки.
С учетом всего вышесказанного, стандартизировать процедуру витрификации
очень сложно, и ее результаты сильно зависят от профессионального уровня
сотрудников.
Ссылка:
Van den Abbeel E, Schneider U, Liu J, Agca Y, Critser JK, Van Steirtherghem A
(2007) Osmotic responses and tolerance limits to changes in external osmolalities,
and oolemma permeability characteristics, of human in vitro matured MII oocytes.
Human Reproduction 22, 1959-1972
15
Для витрификации репродуктивных клеток можно использовать несколько
имеющихся на рынке культуральных сред. Они включают в себя смесь
диметилсульфоксида, этиленгликоля и сахарозы и смесь пропиленгликоля,
этиленгликоля и сахарозы. Также можно использовать смесь глицерина,
этиленгликоля и сахарозы, особенно для витрификации бластоцист. Также
может использоваться этиленгликоль в сочетании с одной сахарозой. В
качестве заменителя сахарозы можно использовать трегалозу.
На рынке имеется несколько носителей для витрификации в очень малых
объемах. Некоторые из них являются открытыми, что подразумевает, что во
время этапа витрификации и во время хранения образец находится в
непосредственном контакте с жидким азотом. Другие носители являются
закрытыми. В таких устройствах контакт с жидким азотом невозможен.
16
В сравнении с медленным замораживанием витрификация имеет несколько
преимуществ.
Во-первых, исключается риск образования внеклеточных или внутриклеточных
кристаллов льда, которые могут повреждать клетку.
Во-вторых, во время витрификации клетки теряют воду или обезвоживаются
прежде, чем будут охлаждены. С другой стороны, при медленном
замораживании обезвоживание клетки запускается при инициации
внеклеточной кристаллизации (сидинге) в результате повышения
концентрации соли во внеклеточном пространстве. Такое повышение
концентрации соли называется «эффектом растворения» и, как известно,
является губительным для клеток. Во время витрификации такого
внеклеточного повышения концентрации соли не происходит, следовательно,
отсутствует риск возникновения «эффекта растворения».
В-третьих, во время медленного замораживания клетки медленно
охлаждаются до температуры -7°C. Поскольку мейотическое и митотическое
веретёна деления чувствительны к изменению температуры и особенно
чувствительны к охлаждению, замораживание этих структур может причинить
необратимый вред и может привести к анеуплоидии. При витрификации
17
охлаждение происходит очень быстро и, следовательно, возможный ущерб,
причиняемый охлаждением, практически исключается.
Последним преимуществом метода витрификации является его гибкость.
Витрификацию ооцитов или эмбрионов можно организовать в любое время дня,
когда ооциты или эмбрионы находятся в наилучшем состоянии.
17
Процедура медленного замораживания репродуктивных клеток обычно
начинается с выдерживания клетки в смеси из пропиленгликоля в
концентрации 1,5 моль/л и сахарозы в концентрации 0,1 моль/л в течение 10–
15 мин при температуре 22°C. После загрузки образца в емкости для хранения
(соломинка, ампула или флакон) клетки охлаждаются в программном
замораживателе для биологических объектов со скоростью 2°C/мин до
температуры -7°C. Когда температура достигнет -7°C, к емкости для хранения
(с находящимся внутри образцом) прикасаются охлажденным в жидком азоте
пинцетом, чтобы индуцировать образование внеклеточных кристаллов льда
(сидинг). После образец продолжают охлаждать со скоростью 0,3°C/мин до
температуры -30°C, при достижении которой образец погружают в жидкий азот.
После этого образцы хранятся в контейнерах, заполненных жидким азотом.
Для оттаивания образец извлекают из жидкого азота и помещают на рабочую
поверхность с ламинарным потоком воздуха, при температуре 22°C, на 40
секунд. После этого образец подогревается на теплой водяной бане при
температуре 37°C до полного исчезновения льда (~5 сек).
Затем при температуре 22°C выполняется поэтапное разбавление
криопротекторов. Сначала клетки выдерживаются 10 минут в растворе,
содержащем пропиленгликоль в концентрации 1 моль/л и сахарозу в
18
концентрации 0,2 моль/л, затем 10 минут в растворе, содержащим 0,5 моль/л
пропиленгликоля и 0,2 моль/л сахарозы, затем 5 минут в растворе, содержащем
0,2 моль/л сахарозы, 5 минут в растворе, содержащем 0,1 моль/л сахарозы и,
наконец, 5 минут в растворе без сахарозы. После этого клетки помещают в
культуральную среду до момента переноса пациентке.
18
При обычной процедуре витрификации на этапе уравновешивания клетки
насыщают криопротекторами. Клетки сначала помещают на 10–15 минут в
раствор, содержащий 7,5% этиленгликоля и 7,5% диметилсульфоксида. После
этапа уравновешивания в среде образцы помещают в емкости для хранения,
где находится менее 1 микролитра витрификационного раствора,
содержащего 15% этиленгликоля, 15% диметилсульфоксида и 0,5 моль/л
сахарозы, а затем витрифицируют в течение 90 секунд посредством
погружения ёмкости в жидкий азот. После этого емкости с клетками хранятся в
контейнерах, заполненных жидким азотом.
Для оттаивания емкости с образцами извлекают из жидкого азота
непосредственно в теплый раствор температурой 37°C, содержащий 1 моль/л
сахарозы, а затем выдерживают в течение 5 минут при температуре 22°C.
После этого образец на 5 минут переносят в раствор, содержащий 0,5 моль/л
сахарозы при 22°C. После выдерживания следующих 5 минут в растворе,
содержащем 0,2 мол/л сахарозы при температуре 22°C клетки на 5 минут
помещают в раствор без сахарозы при 22°C. После всего этого клетки
культивируются in vitro до момента переноса.
19
В этой главе описывались некоторые факторы, которые влияют на
выживаемость ооцитов, эмбрионов и бластоцист после медленного
замораживания. На этом слайде обобщена информация о технологии
медленного замораживания, представленной в данной главе.
За прошедшие пятьдесят лет было создано много соединений, способных
защитить клетки млекопитающих от повреждения при замораживании. В
случае с человеческими ооцитами и эмбрионами большинство клиник, за
редким исключением, используют в качестве криопротекторного раствора
пропиленгликоль в сочетании с сахарозой в низкой концентрации. Глицерин
является криопротектором выбора при замораживании бластоцист.
Эксперименты с клетками и эмбрионами различных животных показали, что к
эффективным криопротекторным веществам относятся глицерин,
этиленгликоль, пропиленгликоль, метанол, а также диметилсульфоксид.
Когда водные растворы замораживаются, вода выводится из них в виде льда.
Как следствие, концентрация растворенных веществ значительно возрастает,
по мере того, как вода выводится в виде кристаллов льда.
20
Количество образующегося льда зависит от температуры, от наличия
растворенных в водном растворе специфических веществ и от начальной
концентрации растворенных веществ. По мере понижения температуры
образуется все большее и большее количество льда, что повышает
концентрацию веществ, растворенных в незамороженной жидкости. По мере
дальнейшего понижения температуры концентрация продолжает возрастать,
вызывая, таким образом, постепенное сморщивание клетки.
Скорость охлаждения должна быть достаточно медленной (< 2°C/мин), чтобы
образование кристаллов льда во внеклеточном пространстве находилось в
постоянном равновесии с выведением воды из клетки.
Значительное внимание уделялось изучению результатов воздействия
температуры, при которой медленно охлажденные ооциты или эмбрионы
погружаются в жидкий азот. Одним словом, можно сделать вывод, что
медленное охлаждение может ограничиваться широким диапазоном температур
ниже нуля, от -30°C до -80°C, с одинаковыми окончательными результатами.
Подобно тому, как существуют оптимальные скорости охлаждения для
достижения максимальной выживаемости, так же существуют и оптимальные
скорости оттаивания. Обычно ооциты и эмбрионы, медленно охлажденные до
минусовых температур в диапазоне от -30°C до -40°C перед быстрым
охлаждением до -196°C, требуют умеренно быстрого нагревания со скоростью
200–350°C/мин для максимальной вероятности выживания. Ооциты и
эмбрионы, медленно охлажденные до -60°C или ниже, требуют медленного
оттаивания со скоростью 25°C/мин. или меньше.
20
Как было сформулировано Vajta в 2006 году, в криобиологии явление
витрификации используется для превращения в твердое состояние раствора,
содержащего образец и криопротектор, без образования кристаллов льда, а
затем для возврата его в жидкое состояние снова без образования льда. Тем
не менее, ни высокая концентрация криопротектора в растворе, ни
повышенная скорость охлаждения не являются обязательными условиями
витрификации. Надо признать, что высокое содержание криопротекторов и
высокая скорость охлаждения, среди прочих факторов, упрощают процесс
витрификации. Существует обратная зависимость между этими двумя
факторами: чем выше скорость охлаждения, тем ниже требуемая
концентрация криопротектора и наоборот.
Задача метода витрификации в ракурсе вспомогательных репродуктивных
технологий у человека – создать практический способ достижения высоких
скоростей охлаждения и нагревания и найти сочетание наименее опасных
криопротекторов в самых низких концентрациях, которое позволило бы
безопасно достичь витрифицированного состояния при данных условиях
охлаждения и нагревания. Самый простой способ добиться предпочитаемых
высоких скоростей охлаждения – уменьшить объем раствора, в котором
находится образец, и погрузить образец непосредственно в жидкий азот. С
учетом всего сказанного выше становится понятно, что успешная
витрификация ооцитов и эмбрионов напрямую зависит от уровня
21
профессионализма персонала, задействованного в процессе витрификации.
21
С момента разработки метода витрификации было проведено множество
исследований по сравнению витрификации с традиционной технологией
медленного замораживания. В 2009 году Varghese и соавтl. опубликовали
результаты своих исследований в области витрификации человеческих
эмбрионов и бластоцист, которые показали, что витрификация дает лучшие
результаты, чем обычное медленное замораживание. Витрификация
эмбрионов – заслуживающий внимания метод, и когда-нибудь он заменит
обычные технологии замораживания. Также Varghese и соавт. сделали
предположение о том, что витрификация, по всей видимости, является
надежным методом.
22
23
23
24
24