Проблемы и перспективы молекулярной диагностики опасных инфекционных болезней
advertisement
Проблемы и перспективы молекулярной диагностики опасных инфекционных болезней Кутырев В.В. ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Москва, 24 ноября 2010 г. Особо опасные инфекционные болезни Особо опасные инфекционные болезни - инфекции, возбудители которых относятся к I и II группам патогенности – всего около 105 видов микроорганизмов (бактерии, вирусы, грибы, хламидии) (СП 1.3.1285-03) ММСП (2005 г.) - «чрезвычайная ситуация в области общественного здравоохранения, имеющая международное значение» включает экстраординарное событие в результате международного распространения болезни… - переход от 3 (чума, холера, желтая лихорадка) к 14 инфекционным болезням Инфекционные болезни, которые могут привести к возникновению чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации - перечень включает 16 нозологических форм (СП 3.4.2318-08) Перечень инфекционных болезней, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории Инфекции ВОЗ - 14 Россия -16 СНГ-24 Таможенный союз24 Оспа Полиомиелит, полиовирусом Грипп, вируса вызванный диким новым подтипом вызванный ТОРС Холера Чума Желтая лихорадка КВГЛ (Марбург, Ласса, Эбола) Малярия Крымская геморрагическая лихорадка Лихорадка Западного Нила Лихорадка Денге Лихорадка Рифт-Валли Менингококковая болезнь Сибирская язва Бруцеллез Сап Мелиоидоз Эпидемический сыпной тиф Спонгиоформная энцефалопатия Инфекционные этиологии болезни невыясненной Туберкулез Лихорадки Хунин, Мачупо Другие Обязательные для уведомления ВОЗ Требующие оценки и принятия решения об уведомлении Требующие проведение мероприятий в рамках санитарной 1 2 3 4 ММСП (2005 г.) СП 3.4.2318 – 08 СанПиН "Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ" Положение о порядке осуществления госсанэпиднадзора, 28.05.2010 Актуальность проблемы особо опасных инфекционных болезней Возрастание риска возникновения чрезвычайных ситуаций эпидемиологического характера вследствие стихийных бедствий, техногенных катастроф, актов биологического терроризма Постоянная угроза завоза опасных инфекционных болезней из стран ближнего и дальнего зарубежья Сохранение эпидемического потенциала существующих природных очагов инфекционных болезней и расширение ареала инфекций Неуклонная тенденция появления новых и возвращения старых нозологических форм Эволюция возбудителей болезней, приводящая к возникновению высокопатогенных и полирезистентных щтаммов. Вспышки опасных инфекционных болезней в мире в 2009-2010 гг. Денге (завозные случаи) Полиомиелит Рифт-Валли (завозной случай) ЛЗН КГЛ ЛЗН Чума КГЛ Чума Холера Холера Чума Денге Холера Денге Чума Холера Ласса Желтая лихорадка Рифт-Валли Эбола Холера (страны Африки) Эпидемия холеры на Гаити 2010 г. Случаи завоза полиомиелита на территорию Российской Федерации из Таджикистана в 2010 г 2010 г - 14 случаев Завозные случаи холеры на территорию Российской Федерации в 1997-2010гг. 1997-2010 г 20 случаев завоза 202 больных и вибрионосителей Случаи завоза лихорадки Денге на территорию Российской Федерации в 2010 г. 2010 г. - 4 случая Bali Случаи завоза малярии на территорию Российской Федерации в 2007-2009 гг. 17 2007-2009 гг. - 311 случаев завоза Из них 58 - ближнее зарубежье, 246 – Африка, Индия Активность природных очагов чумы на территории Российской Федерации в 2000-2010гг. Казахстан Монголия • В период 2000-2010 гг. было выделено 1262 штамма чумного микроба в 8 природных очагах. • Эпизоотии чумы выявлены на площади 15694 кв.км. Китай Расширение ареала и эпидемические проявления КГЛ на территории Российской Федерации в 1999-2010гг. 1999-2010 гг. - 1392 случая Расширение ареала и эпидемические проявления ЛЗН на территории Российской Федерации в 1999-2010гг. 1999-2010 гг. - 1460 случаев Новые пути распространения особо опасных инфекционных болезней. Завоз и вспышки сибирской язвы в 2009-2010 гг. на путях распространения наркотиков: Шотландия - 47 заболевших (13 погибших) Англия – 4 заболевших (3 погибших) Германия - 2 заболевших (1 погибший) Результаты идентификации и молекулярного типирования выделенных штаммов B. anthracis Штамм B. Anthracis азиатского происхождения (Б.Восток, Афганистан). Природный штамм с обычными параметрами устойчивости к антибиотикам Е.В. Гаврилин, ВОЗ, Координатор лабораторных сетей, Биобезопасность и биозащита Обеспечение мониторинга и лабораторной диагностики инфекционных болезней в Российской Федерации Федеральный уровень Региональный уровень Территориальный уровень Применение методов молекулярно-генетического анализа в лабораториях разного уровня ПЦР ОТ-ПЦР NASBA Мультилокусная ПЦР Биочипы ПЦР в реальном времени xMapтехнология Лаборатории территориального уровня Индикация возбудителей опасных инфекционных болезней Лаборатории регионального уровня Идентификация возбудителей опасных инфекционных болезней Секвенирование MLST Рибопринтинг MLVA RFLP AFLP PFGE RAPD- RER- ERIC-PCR Лаборатории федерального уровня Верификация результатов диагностики, расширенная идентификация и молекулярное типирование патогенов Смена формата генодиагностических исследований в лабораториях территориального и регионального уровней ПЦР с учетом результатов методом электрофореза ПЦР на одну мишень ПЦР в режиме реального времени мультулокусная ПЦР Сокращение времени исследования до 2 ч Одновременная детекция возбудителя и получение информации о его эпидемической значимости Совершенствование молекулярной диагностики опасных инфекционных болезней в лабораториях территориального и регионального уровней с использованием зарегистрированных диагностических препаратов (реализация ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013)») Человеческий грипп, вызванный новым подтипом Тяжелый острый респираторный синдром Чума, холера, бруцеллез, сибирская язва, КГЛ Оспа Лихорадка Западного Нила Вирусные геморрагические лихорадки (Эбола, Ласса, Марбург) Туляремия, сап, мелиоидоз, Полиомиелит, вызванный диким полиовирусом, Желтая лихорадка, лихорадка Денге, лихорадка Долины Рифт, менингококковая болезнь, малярия Сертифицированные препараты На этапе регистрации Экспериментальные серии Национальные стандарты лабораторной диагностики опасных инфекционных болезней в соответствии с трехуровневой системой В 2010 г. – разработаны проекты стандартов по лабораторной диагностике в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней: • чумы, • холеры • сибирской язвы • туляремии В 2011 г. – должны быть разработаны проекты стандартов по лабораторной диагностике в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней: • бруцеллеза • лихорадки Западного Нила • Крымской геморрагической лихорадки и т.д. Использование методов молекулярно-генетического анализа в лабораториях разного уровня - индикация возбудителей, Лаборатории территориального - использование зарегистрированных диагностических препаратов уровня Лаборатории регионального уровня Лаборатории федерального уровня - индикация и идентификация возбудителей, - использование подтверждающих тестов - использование зарегистрированных диагностических препаратов - расширенная идентификация и молекулярное типирование возбудителей - использование верификационных тестов - использование зарегистрированных и экспериментальных серий диагностических препаратов Использование методов молекулярной диагностики в мобильных лабораториях Специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) Роспотребнадзора МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПЦР ПЦР-РВ БИОЧИПЫ (ДНК- и иммуно-) Уровень биологической безопасности – BSL-3 СЕКВЕНИРОВАНИЕ Направления совершенствования молекулярной диагностики опасных инфекционных болезней Одновременное обнаружение ряда микроорганизмов, вызывающих сходные клинические синдромы (острый респираторный синдром, синдром острого гастроэнтерита, синдром острой геморрагической лихорадки и др.) Определение резистентности возбудителя к антибактериальным препаратам Выявление патогена с одновременной его характеристикой по признакам важным для определения таксономического положения, вирулентности, эпидемической значимости и др. Определение жизнеспособности микроорганизмов (эпизоотологический мониторинг) Разработка алгоритма расшифровки вспышек заболеваний неясной этиологии на основе молекулярно-генетических подходов Вспышка заболевания неясной этиологии Многофакторный анализ (мультилокусная ПЦР, биочипы, x-Map) для выявления иммунологических и генетических маркеров возбудителей, вызывающих сходные клинические синдромы + Выделение культуры известных видов патогенных микроорганизмов - Выделение культуры неизвестных видов патогенных микроорганизмов секвенирование и д е н т и ф и к а ц и я Проблемы определения резистентности штаммов возбудителей опасных инфекционных болезней Определение резистентности штаммов возбудителей ООИ Изучение причин появления резистентных штаммов возбудителей ООИ Определение резистентности возбудителей ООИ экспресс методами Разработаны ПЦР на гены антибиотикоустойчивости (pIP1202, Tn5, Tn10) strA, strB, tetA, tetR, cat, npt и др. возбудителя чумы ПЦР-тест-системы, биочипы для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей ООИ Применение методов молекулярной диагностики опасных патогенов Расследование вспышек заболеваний природного или техногенного характера Геномная паспортизация штаммов микроорганизмов Мониторинг природных очагов опасных инфекционных болезней Определение эволюционных и филогенетических связей штаммов микроорганизмов Молекулярный мониторинг возбудителей особо опасных инфекционных болезней Типичный токсигенный штамм V.cholerae биовара Эльтор продуцирует холерный токсин эльтор типа Измененные варианты Измененный вариант V.cholerae биовара V.cholerae биовара Эльтор Эльтор: продуцирует холерный токсин ! начиная с 2001 г. классического типа ctxA вытеснили типичные штаммы V.cholerae биовара эльтор во ctxBEL многих странах Африки и Азии, включая Непал ctxA ! имеют высокий пандемический Class ctxB потенциал ctxA ! более вирулентны за счет повышенной ctxBClass продукции холерного токсина Типичный токсигенный штамм V.cholerae классического биовара продуцирует холерный токсин классического типа Геномная паспортизация штаммов микроорганизмов (биологический образец (штамм) + сиквенс) Государственная коллекция высокопатогенных бактерий Штаммы возбудителей I-II групп патогенности Полное секвенирование генома пиросеквенирование Фрагментарное секвенирование геномаMLST генетическая характеристика (последовательность) Национальная база данных«GeneBank» - генетических последовательностей возбудителей опасных инфекционных болезней Применение нанотехнологий в молекулярной диагностике инфекционных болезней • индикация разработка наночипов и наносенсоров для индикации возбудителей инфекций на молекулярном уровне • идентификация разработка биочипов на основе наноструктурных материалов для выявления ДНК возбудителей инфекций и проведения многофакторного анализа • молекулярное типирование разработка методов секвенирования на основе нанопор, масс-спектрометрия Обеспечение эпидемиологической безопасности при проведении массовых мероприятий и в местах массового скопления людей возникновения чрезвычайных ситуаций эпидемиологического характера вследствие актов биологического терроризма, техногенных катастроф разработка и внедрение автоматизированных систем биологического контроля окружающей среды Автоматические системы специфической индикации патогенных биологических агентов в воздухе Автоматическая система для забора проб воздуха на предмет обнаружения ПБА (8-10 ч) ЧУМА ОСПА ПЦР Пробоотборник воздуха Съемный фильтр СИБИРСКАЯ ЯЗВА БОТУЛОТОКСИН Мобильная лаборатория Biological Aerosol Sentry and Information System –BASIS (Lawrence Livermore National Laboratory and Los Alamos National Laboratory, США) Автоматическая система для отбора и исследования проб воздуха в автономном режиме (1 ч) 11 видов ПБА, в том числе: X-MAP ЧУМА ОСПА Забор воздуха Подготовка проб СИБИРСКАЯ ЯЗВА ПЦР-РВ Autonomous Pathogen Detection System – APDS (Lawrence Livermore National Laboratory, США) БОТУЛОТОКСИН и др. Задачи 1. Совершенствование трехуровневой системы мониторинга и лабораторной диагностики инфекционных болезней, внедрение национальных стандартов 2. Разработка и регистрация препаратов для проведения генной диагностики опасных инфекционных болезней в учреждениях территориального и регионального уровней 3. Гармонизация схем молекулярного типирования возбудителей опасных инфекционных болезней с современными требованиями и международными стандартами 4. Создание национальной базы данных«GeneBank» - генетических последовательностей возбудителей опасных инфекционных болезней на базе Государственных коллекций высокопатогенных микроорганизмов 5. Разработка мобильных и автономных постов контроля окружающей среды на основе современных диагностических технологий 6. Постоянный тренинг специалистов (подготовка и усовершенствование кадров) БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!