ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы «ВД» для выявления возбудителя вирусной диареи

ИНСТРУКЦИЯ
по применению тест-системы «ВД» для выявления возбудителя вирусной диареи
крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»
(организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)
Тест-система «ВД» (test-system «VD») для выявления возбудителя вирусной диареи
крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в
одном формате:
Формат FRT – для выявления возбудителя вирусной диареи крупного рогатого
скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени».
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1
Форматы и формы выпуска тест-системы.
Формат FRT
Тест-система «ВД» (test-system «VD») формат FRT, рассчитанная на проведение 50
анализов, включая контроли, выпускается в двух формах комплектации:
Форма 1 включает:
- «РИБО-сорб» вариант 50 – комплект реагентов для выделения РНК из клинического
материала;
- «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для проведения реакции
обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма 2 включает:
- «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для проведения реакции
обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию РНК, реакцию обратной транскрипции и амплификацию кДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения
реакции обратной
транскрипции и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо
использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 1 из 14
1.1
Комплект реагентов «РИБО-сорб» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор
1 флакон, 22,5 см3 (мл)
Раствор для отмывки 1
1 флакон, 20,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 3
1 флакон, 50,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 4
1 флакон, 20,0 см3 (мл)
Сорбент
1 пробирка, 1,25 см3 (мл)
РНК-буфер
5 пробирок по 0,5 см3 (мл)
1.2
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F состоит из следующих
компонентов:
ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT BVDV
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT
1 пробирка, 0,3 см3 (мл)
Полимераза (TaqF)
1 пробирка, 0,03 см3 (мл)
ТМ-Ревертаза (MMlv)
1 пробирка, 0,015 см3 (мл)
ПКО кДНК BVDV и STI
1 пробирка, 0,1 см3 (мл)
ДНК-буфер
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
RT-G-mix-2
1 пробирка, 0,015 см3 (мл)
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ОКО
1 пробирка, 1,6 см3 (мл)
ВКО STI-87-rec
5 пробирок по 0,12 см3 (мл)
Допускается другая фасовка, согласованная в установленном порядке.
2
Упаковка и маркировка
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с
указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке
(флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты упаковывают в отдельные
застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают)
этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект,
количества пробирок (флаконов) каждого компонента, количества препарата в каждой
пробирке (флаконе), номер серии комплекта, условия хранения, даты изготовления, срока
годности.
Комплекты для экстракции РНК (РИБО-сорб), проведения обратной транскрипции и
ПЦР вкладывают в картонную коробку (полиэтиленовый пакет). На каждую упаковку тестсистемы наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование предприятияизготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тестсистему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначения
ТУ/СТО, надпись «Для животных». В каждую упаковку вкладывают инструкцию по
применению тест-системы.
3
Транспортирование и хранение
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 оС до 8 С не более 5 суток.
При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Комплект реагентов «РИБО-сорб» хранить при температуре от 2 оС до 8 С. Комплект
реагентов «ПЦР-комплект» FRT-50 F (кроме ОТ-ПЦР-смеси-1-FRT BVDV, ОТ-ПЦРсмеси-2-FEP/FRT, полимеразы (TaqF), ТМ-Ревертазы (MMlv) и RT-G-mix-2) хранить при
температуре от 2 оС до 8 С. ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT BVDV, ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT,
полимеразу (TaqF), ТМ-Ревертазу (MMlv) и RT-G-mix-2 хранить при температуре от
минус 24 °С до минус 16 °С. Следует избегать длительного нахождения ОТ-ПЦР-смеcи-1FRT BVDV на свету.
4 Срок годности тест-системы - 12 месяцев с даты изготовления.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
5
В основе метода (ОТ-ПЦР) лежит получение кДНК специфического участка вируса
диареи КРС методом обратной транскрипции РНК и ее амплификация за счет
многократного повторения циклов денатурации кДНК в исследуемой пробе, отжига
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 2 из 14
специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и зондов, меченных
флуоресцентными красителями, и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью
фермента Taq-полимеразы. Исходным материалом для ОТ-ПЦР в данной тест-системе
служит РНК вируса, полученная из исследуемого материала.
Реакционная система включает две независимые системы для ОТ-ПЦР
(находящиеся в одной реакционной смеси), каждая из которых содержит праймеры и
меченый флуоресцентными красителями зонд. С помощью первой системы
идентифицируется последовательность кДНК вируса диареи КРС. Вторая представляет
собой систему внутреннего неконкурентного контроля (ВК).
III. ПОРЯДОК ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ
6
Тест-система предназначена для выявления РНК вируса диареи КРС (Bovine viral
diarrhea virus) в мазках из носа и с миндалин, в цельной крови, сыворотке и плазме крови,
фекалиях, паренхиматозных органах методом полимеразной цепной реакции с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
6.1
При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования
необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды,
руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
6.2
Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.
7
Отбор материала для исследования.
7.1
Для исследования используют следующий клинический материал:
7.2
Кровь для исследования отбирают в объеме не менее 0,5-1 мл в стерильные
пробирки с 3%-ным раствором ЭДТА из расчета 10:1 (или с цитратом натрия в
стандартной концентрации). Желательно использовать одноразовые системы взятия
крови. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Пробы цельной
крови используют для экстракции РНК без предварительной подготовки.
7.3
Для получения сыворотки забор крови проводят в пробирку без антикоагулянта.
7.4
Мазки со слизистой носоглотки и миндалин получают с помощью стерильного
зонда с ватными тампонами. После забора материала рабочую часть зонда с ватным
тампоном помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного
физиологического раствора или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или
отрезают для того, чтобы крышка пробирки плотно закрылась. Пробирку с раствором и
рабочей частью зонда закрывают.
7.5
Фекалии весом 5 г отбирают в стерильный пластиковый контейнер.
7.6
Из тканей и органов (миндалины, селезенка, легкие, печень и др.) вырезают
кусочки размером 1х1х1 (см) и помещают в стерильный контейнер. Лимфоузлы берут
целиком.
7.7
Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день,
сохраняя при температуре от 2 до 8 °С. Допускается хранение материала при температуре
не выше минус 16 °С в течение 7 дней, при температуре не выше минус 68 оС – длительно.
Возможно лишь однократное размораживание материала.
8
Подготовка исследуемого материала.
8.1
Кровь используется без предварительной подготовки. Для получения плазмы
пробирку с цельной кровью центрифугируют в течение 10 мин при 1000 g (если кровь
стояла при температуре от 2оС до 8 С более 1 ч после ее забора, то пробирку следует
аккуратно несколько раз перевернуть для равномерного перемешивания крови).
Переносят плазму в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с аэрозольным
барьером в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Для получения сыворотки пробирки с
кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования
сгустка. Затем центрифугируют при 800-1600 g в течение 10 мин при комнатной
температуре. Переносят сыворотку в количестве не менее 1 мл отдельными
наконечниками с аэрозольным барьером в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 3 из 14
8.2
Мазки со слизистой носоглотки и миндалин используются без предварительной
подготовки.
8.3
Пробы паренхиматозных органов и лимфоузлы гомогенизируют с
использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию
на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в
пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10 тыс об/мин в течение 30 с.
Надосадочную жидкость используют для экстракции РНК.
8.4
Из фекалий готовят 10-20% суспензию на стерильном физиологическом растворе.
Центрифугируют при 10-12 тыс. об/мин в течение 2 мин. Экстракцию РНК производят из
надосадочной жидкости по возможности сразу после центрифугирования.
9
9.1













IV. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА
ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных комнатах (зонах).
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
ЗОНА 1 – для экстракции РНК из исследуемого материала:
ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы»,
Россия, класс биологической безопасности II тип А).
твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25оС до 100 °С
(например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной
жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
микроцентрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин
(например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например «ТЭТА-2», «Биоком»,
Россия).
набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным
барьером до 100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например,
«Axygen», США).
одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
штативы для микропробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия)
и наконечников (например, «Axygen», США).
холодильник от 2оС до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 С.
отдельный халат и одноразовые перчатки из латекса.
комплект средств для обработки рабочего места.
9.2
ЗОНА 2 – для реакции обратной транскрипции, амплификации и гибридизационнофлуоресцентной детекции продуктов амплификации требуются:
 амплификатор («RotorGene» 3000/6000, «Corbett Research», Австралия или «iCycler
iQ» или «iQ5», «Bio-Rad», США).
 ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С»», «Ламинарные системы», Россия).
 набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным
барьером до 100 мкл и до 200 мкл (например, «Axygen», США).
 одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР объемом 0,2 мл (например,
«Axygen», США).
 штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,2 мл
(например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
 холодильник от 2оС до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 С.
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 4 из 14
 отдельный халат и одноразовые перчатки из латекса.
 емкость для сброса наконечников.
 комплект средств для обработки рабочего места.
10
10.1
Порядок работы.
ЭТАП 1 (зона №1). Экстракция РНК из исследуемого материала.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальные маркировки
«RNase-free», «DNase-free».
Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при
температуре от 2о С до 8° С) прогреть при температуре от 60оС до 65 °С до полного
растворения кристаллов.
Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл с
плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный контроль экстракции).
Внести в каждую пробирку по 450 мкл лизирующего раствора и по 10 мкл ВКО STI-87rec. Промаркировать пробирки.
В пробирки с лизирующим раствором и ВКО STI-87-rec внести по 100 мкл
исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером. Перемешать
пипетированием.
В пробирку отрицательного контроля (В–) экстракции внести 100 мкл ОКО.
Плотно закрытые пробы тщательно перемешать на вортексе и процентрифугировать
в течение 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней
поверхности крышки пробирки. Инкубировать при комнатной температуре от 3 до 5 мин.
Если в пробирках находятся взвешенные частицы (не растворившийся полностью
материал), центрифугировать при 10 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге и
перенести супернатант в другие пробирки.
Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным
наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на
вортексе, поставить в штатив на 1 мин, еще раз перемешать и оставить на 5 мин.
Процентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс об/мин в течение
30 с на микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель с
колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе
до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на
микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель с колбойловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Тщательно
ресуспендировать сорбент на вортексе. Проценрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на
микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель с колбойловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить отмывку раствором для отмывки 3.
Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4. Тщательно
ресуспендировать сорбент на вортексе, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на
микроцентрифуге. Полностью удалить супернатант из каждой пробирки отдельным
наконечником, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой.
Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 15 мин для подсушивания
сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки добавить по 50 мкл РНК-буфера, используя наконечники с аэрозольным
барьером, свободные от РНКаз.
Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 60 °С на 2-3 мин.
Перемешать на вортексе и процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах
микроцентрифуги (12-13 тыс об/мин) в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 5 из 14
РНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции.
Реакцию ОТ-ПЦР следует проводить сразу после получения РНК-пробы. Отбирать
раствор РНК для реакции нужно очень осторожно, не захватывая сорбент. Если сорбент
взмутился, необходимо осадить его на центрифуге.
Очищенная РНК может храниться до 4 часов при температуре от 2оС до 8 °С. Для
длительного хранения препарата необходимо отобрать раствор РНК, не захватывая
сорбент, перенести в стерильную пробирку и хранить в течение года при температуре не
выше минус 68 °С.
10.2 ЭТАП 2 (зона №2). Проведение ОТ-ПЦР и
амплификации.
Общий объем реакции - 25 мкл, объем РНК-пробы – 10 мкл.
детекции
продуктов
10.2.1 Подготовка пробирок для проведения ОТ-ПЦР.
Пробирку с ОТ-ПЦР-смесью-1-FRT BVDV разморозить, перемешать на вортексе
и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT
BVDV, ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT, полимеразу (TaqF), TM-Ревертазу (MMlv) и RT-Gmix-2 из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1-FRT BVDV

5 мкл ОТ-ПЦР-смеси-2-FEP/FRT

0,5 мкл полимеразы (TaqF)

0,25 мкл TM-Ревертазы (MMlv)

0,25 мкл RT-G-mix-2
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.
Используя наконечник с аэрозольным барьером, в подготовленные пробирки
добавить по 10 мкл РНК исследуемых образцов (необходимо избегать попадания
сорбента в реакционную смесь).
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль (К-) – вместо РНК-пробы внести в пробирку 10 мкл
РНК-буфера.
б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК BVDV
и STI.
Проведение реакции ПЦР и детекции продуктов амплификации с помощью приборов
«Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия) см. приложение
2.
Проведение реакции ПЦР и детекции продуктов амплификации с помощью приборов
«iQ5» и «iCycler iQ» («Bio-Rad», США) см. приложение 1.
V. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ
11
Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой
операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным
барьером. Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный
контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для
обеззараживания
биоматериалов
(например,
0,2%
раствор
натриевой
соли
дихлоризоциануровой кислоты).
12
Посуда (ступки и пестики), использованная для гомогенизации продуктов,
выдерживается в растворе дезинфицирующего средства (например, 5% растворе
хлорамина Б) в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в течение 30 мин,
моется водопроводной водой с поверхностно-активными моющими средствами и после
отмывания в проточной и деионизованной воде высушивается в сухожаровом шкафу в
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 6 из 14
течение 4 часов при температуре 180С. Металлические инструменты (скальпели,
ножницы, пинцеты) фламбируют, т.е. обрабатывают спиртом и обжигают в пламени
горелки.
13
Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, пластиковая и
стеклянная посуда, халаты, перчатки, а также все рабочие растворы должны быть строго
стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое. Оборудование,
материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.
14
Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР,
должны обязательно до начала и после окончания работ облучаться ультрафиолетовым
светом.
15
Тест-систему хранить в местах не доступных для детей.
Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 7 из 14
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
ПРОВЕДЕНИЕ ОТ-ПЦР И ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С
ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000 («Corbett
Research», Австралия).
 Поместить подготовленные для проведения ОТ-ПЦР пробирки в карусель
амплификатора «Rotor-Gene» (ячейки карусели пронумерованы, эти номера
используются в дальнейшем для программирования положения проб в
амплификаторе).
 Запрограммировать прибор.
А. Программирование амплификатора.
Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу RotorGene версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000 - программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7
(build 67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и
программного обеспечения, указаны в следующем порядке: для прибора «RotorGene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для
русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.
 Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.
 Выбрать тип ротора. Поставить отметку в окошке рядом с надписью «No Domed 0.2 ml
Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».
 Нажать кнопку «Next»/«Далее».
 Выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции - 25 мкл. Для
Rotor-Gene 6000 должно быть отмечено окошко «15 l oil layer volume»/«15 μL объем
масла/воска».
 Нажать кнопку «Next»/«Далее».
 В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».
 Задать следующие параметры эксперимента:
1. Hold/Удерж.темп-ры
50 °С - 30 мин
2. Hold/Удерж.темп-ры
95 °С - 15 мин
3. Cycling/Циклирование
95 °С - 10 с
60 °С - 20 с
72 °С - 10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз
4. Cycling2/Циклирование2
95 °С - 10 с
55 °С - 20 с - Детекция
72 °С - 10 с
Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз
Флуоресценцию измеряют при 55 °С на каналах FAM/Green, JOE/Yellow.
Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».
 В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня
сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise
Acquiring»/«Опт. Детек-мых», выбрать функцию «Perform Calibration Before 1st
Acquisition»/«Perform
Optimisation
Before
1st
Acquisition»/«Выполнить
оптимизацию при 1-м шаге детекции». Для обоих каналов установить параметры
Min Reading/Миним. Сигнал – 5Fl и Max Reading/Максим. Сигнал – 10Fl. Окно
закрыть, нажав кнопку «Close»/«Закрыть».
 Нажать кнопку «Next»/«Далее», запустить амплификацию кнопкой «Start
run»/«Старт».
 Дать название эксперименту и сохранить его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 8 из 14
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо
запрограммировать положение пробирок в карусели. Для этого надо использовать кнопку
«Edit samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все
исследуемые образцы и контроли обозначить как Unknown/Образец.
Б1. Анализ результатов амплификации ВКО (канал FAM/Green):
 Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM»/«Cycling A.
Green», «Show»/«Показать».
 Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
 В меню основного окна «Quantitation analysis/Количественный анализ» должны
быть активированы кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope
Correct»/«Коррек. уклона».
 Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку
«Linear scale/Линейная шкала» в нижней части окна справа (если эта шкала активна
по умолчанию, вместо кнопки «Linear scale/Линейная шкала» видна кнопка «Log
scale/Лог.шкала»).
 В меню окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» установить
значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) – 10%.
 В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.05.
 В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты»)
появятся значения Ct.
Б2. Анализ результатов амплификации специфического участка кДНК вируса
диареи КРС (канал JOE/Yellow):
 Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE»/«Cycling A.
Yellow», «Show»/«Показать».
 Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
 В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должна быть
активирована кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррек.
уклона».
 Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку
Linear scale/Линейная шкала в нижней части окна справа (если эта шкала активна по
умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка «Log
scale/Лог.шкала»).
 В меню окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» установить
значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) – 10%.
 В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.1.
 В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты»)
появятся значения Ct.
В. Учет и интерпретация результатов.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией
(что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в
соответствующей графе в таблице результатов).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК
(см. таблицу 1).
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 9 из 14
Таблица 1
Оценка результатов анализа контрольных точек
Значение Ct по
Значение Ct по
Контролируемый
Контроли
каналу FAM/
каналу JOE/
этап анализа
Green
Yellow
В–
Экстракция РНК
< 28
Нет значений
К–
ПЦР
Нет значений
Нет значений
K+
ПЦР
< 28
< 28

Образец считают положительным на наличие РНК вируса диареи КРС, если
значение Ct на канале JOE/Yellow менее 33.

Образец считают отрицательным, если по каналу JOE/Yellow значение Ct
отсутствует, а по каналу FAM/Green определено значение Ct, не превышающее 31.
Результаты не подлежат учету в следующих случаях:
 Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР
может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о
других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо
провести ПЦР еще раз.
 Если значение Ct по каналу JOE/Yellow больше 33, а значение Ct по каналу
FAM/Green не превышает 31, требуется повторить ПЦР и считать результат
положительным в случае его повторения или получения значения Ct по каналу
JOE/Yellow менее 33.
 Если в образце отсутствует значение Ct как по каналу JOE/Yellow, так и по каналу
FAM/Green, или получено значение Сt больше 31, требуется повторное проведение
ПЦР и детекции. В случае если снова получен аналогичный результат, требуется
повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного
образца по каналу JOE/Yellow и для отрицательного контроля ПЦР (ДНК-буфер) на
любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В
этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется
повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации.
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 10 из 14
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ПРОВЕДЕНИЕ ОТ-ПЦР И ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С
ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ «iQ5» и «iCycler iQ» («Bio-Rad», США).
 Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в амплификатор.
 Запрограммировать прибор.
А. Программирование амплификатора.
 Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не
менее чем через 30 мин после включения оптической части прибора.
 Открыть программу iCycler.
 Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного
сигнала:
 Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля
Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в
режиме Whole Plate loading. В опции Select and load Fluorophores задать
измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и HEX.
Задать объем реакции (Sample Volume): 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap,
тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав
кнопку Save&Exit Plate Editing.
 Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup
модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему
расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне
Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение
флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить
схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением
«.pts») и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно
редактировать уже использованную ранее схему планшета; для этого в окне
Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с
расширением «.pts») и нажать кнопку Edit (справа). Отредактированный файл
нужно также сохранить перед использованием. Назначить использование данной
схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
 Задать программу амплификации.
Программа «BVDV»:
50 oC – 30 мин
95 oC – 15 мин
10 циклов: 95 oC – 10 с / 60 oC – 25 с /72 oC – 25 с
35 циклов: 95 oC – 10 с / 55 oC – 25 с (детекция) /72 oC – 25 с
детекция флуоресценции на 2-м шаге (55 °С) второго блока циклирования
 Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop
нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить
протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках
можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы
протоколов сохраняются в папке Users).
 Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit
Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры
амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне
справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2.
Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (BVDV.tmo) и нажав
кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках
можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library.
Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 11 из 14
кнопку Run with selected plate setup.
 Запустить выполнение выбранной программы «BVDV» с заданной схемой планшета.
 Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить
правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected
Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок
вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run,
дать название эксперименту (в этом файле будут автоматически сохранены
результаты данного эксперимента) и нажать OK.
 Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep
следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.
Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well
factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для
запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
 После окончания программы приступить к анализу результатов.
Б1. Анализ результатов амплификации ВКО (канал FAM).
 Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля
Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM.
При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted
Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии,
нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на
экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
 Для прибора «iCycler iQ» в модуле Library активировать окно View Post-Run Data.
В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyze
Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала
FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line
Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Threshold Cycle
Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический
расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto
Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы
установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой
левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице
результатов появятся значения Ct.
Б2. Анализ результатов амплификации специфического участка кДНК вируса
диареи КРС (канал HEX).
 Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу HEX, отключив кнопку
FAM. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line
Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень
пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши.
Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
 Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter
выбрать значок канала HEX-530. При этом должен быть выбран режим анализа
данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню
Threshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и
автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles
выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined.
Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при
нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В
таблице результатов появятся значения Ct.
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 12 из 14
В. Учет и интерпретация результатов.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией
(что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в
соответствующей графе в таблице результатов).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК
(см. таблицу 2).
Таблица 2
Оценка результатов анализа контрольных точек
Контролируемый
Значение Ct по
Значение Ct по
Контроли
этап анализа
каналу FAM
каналу HEX
В–
Экстракция РНК
< 28
Нет значений
К–
ПЦР
Нет значений
Нет значений
K+
ПЦР
< 28
< 28

Образец считают положительным на наличие РНК вируса диареи КРС, если
значение Ct на канале HEX менее 33.

Образец считают отрицательным, если по каналу HEX значение Ct отсутствует,
а по каналу FAM определено значение Ct, не превышающее 31.
Результаты не подлежат учету в следующих случаях:
 Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР
может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о
других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо
провести ПЦР еще раз.
 Если значение Ct по каналу HEX больше 33, а значение Ct по каналу FAM не
превышает 31, требуется повторить ПЦР и считать результат положительным в случае
его повторения или получения значения Ct по каналу HEX менее 33.
 Если в образце отсутствует значение Ct как по каналу HEX, так и по каналу FAM, или
получено значение Сt более 31, требуется повторное проведение ПЦР и детекции. В
случае если снова получен аналогичный результат, требуется повторить анализ
образца, начиная с этапа экстракции.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного
образца по каналу HEX и для отрицательного контроля ПЦР (ДНК-буфер) на любом из
каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае
результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить
анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника
контаминации.
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 13 из 14
Лист вносимых изменений
Редакция
25.02.10
Место внесения
изменений
По всему тексту
По всему тексту
19.03.10
14.04.10
29.04.10
Приложение 2
п. 9.2
р. Порядок отбора
и подготовки проб
Приложение 2
п. 2.2
п. 10.2
Приложение 1,
Приложение 2
(Учёт результатов)
2.1 Состав набора
09.06.10
04.08.10
По всему тексту
Приложение 1,
Приложение 2
(Учёт результатов)
2.1 Состав набора
Суть вносимых изменений
Исправлено название реагента ПЦР-смесь-1-FRT BVDV на
ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT BVDV
Исправлено название ПКО
Заменены реактивы в составе набора
Исправлены названия каналов детекции
Добавлено оборудование для Зоны 2
Исправлено название вируса
Исправлено название канала
Добавлено сокращение в мл
Исправлены ссылки на приложения
Уточнён канал детекции
Уточнено название сорбента (универсальный), изменен
объем ДНК-буфера
Изменения в соответствии с шаблоном
Изменено название канала (HEX вместо JOE)
Исправлено название реагента (Сорбент)
«Выделение» заменено на «Экстракция»
По тексту
30.01.13
VN
Общие положения
Нижний колонтитул
18.03.13
РЕ
По тексту
Отрицательный контроль экстракции заменен с «ОК» на «В–»
Удален регистрационный номер и печати
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
Вариант ПЦР-комплекта изменен с 50 FRT на FRT-50 F
Добавлены формы комплектации 1 и 2 и формат выпуска
FRT
Изменен каталожный номер VET-52-FRT(RG,iQ)-К вместо
каталожного номера VET-52-FRT(RG,iQ)
В названии реагента ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT BVDV название
возбудителя выделено курсивом: ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT
BVDV
В названии реагента ПКО кДНК BVDV и STI название
реагента выделено курсивом: ПКО кДНК BVDV и STI
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-52-FRT(RG,iQ)-К / Дата изменения: 18.03.13 / стр. 14 из 14