МИКРОБИОЛОГИЯ АДГЕЗИЯ БАКТЕРИЙ STAPHYLOCOCCUS

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2012
БИОЛОГИЯ
Вып. 1
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 574.24
АДГЕЗИЯ БАКТЕРИЙ STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS 33 ПРИ ДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ
Д. В. Ерошенко a , Л. М. Лемкина a , В. П. Коробов a , b
a
b
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; info@iegm.ru; (342)2446712
Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева,
15; biodean@psu.ru
Изучены первые этапы образования бактериями S. epidermidis 33 биопленок на поверхности
полистирола. Обнаружена зависимость накопления биомассы бактериальных пленок от физико-химических факторов среды инкубирования – температуры, уровня кислотности, гидродинамических воздействий, а также физиологического состояния сорбирующихся бактерий.
Ключевые слова: стафилококки; адгезия на поверхности полистирола; зависимость от времени, температуры и рН.
Клетки бактерий способны прикрепляться к разнообразным поверхностям с формированием на них
стойких к химическим и физическим воздействиям
биоплёнок. Это создает большие проблемы в медицинской практике, особенно при использовании имплантируемых устройств – катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца и др. [Wolcott, Ehrlich,
2008].
Становится всё более очевидным, что образование биопленок является одним из патогенетических механизмов формирования хронических инфекционных процессов. Показано, что одной из
основных причин полимер-ассоциированных инфекций являются бактерии вида Staphylococcus
epidermidis [Kwakman et al., 2006].
Процесс образования биопленок на поверхностях различных материалов может быть разделен
на два основных этапа: первичную обратимую адгезию на атакуемой поверхности и необратимую
колонизацию ими всей поверхности с формированием устойчивого матрикса в виде полноценной
пленки [Николаев, Плакунов, 2007; De Caryalho,
2012].
Поскольку адгезия бактериальных клеток на
субстратах является ключевым моментом формирования биопленок, детальные характеристики этого
процесса в настоящее время находятся в стадии интенсивного изучения для многих микроорганизмов.
По общему мнению, он зависит от множества факторов, в частности, от особенностей структуры и
свойств поверхностей бактериальных клеток, а
также от физико-химических параметров заселяе-
мых поверхностей. При этом важная роль отводится действию различных факторов окружающей среды [Klemm, Vejborg, Hancock, 2010].
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния гидродинамических условий, температуры и кислотности среды культивирования на связывание бактерий S. epidermidis 33 с поверхностью
полистирола.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовали штамм бактерий Staphylococcus epidermidis 33,
полученный из ГНИИСКМБП имени Л.А. Тарасевича. Выращивание бактерий проводили в колбах
на питательной среде Luria-Bertani (LB) при перемешивании на орбитальном шейкере Certomat IS
(Sartorius, Германия) при 150 об/мин и температуре 37°С.
Исследовали количественные показатели адгезии бактериальных клеток на поверхности полистироловых чашек Петри («Медполимер», СанктПетербург).
Бактерии S. epidermidis 33 экспоненциальной
(4 ч) и стационарной (16 ч) фаз роста планктонной
культуры осаждали при 3000 g в течение 10 мин на
центрифуге 5415R «Eppendorf», дважды промывали при тех же условиях физиологическим раствором, суспендировали в среде LB до оптической
плотности OD600 0.15, разводили в 10 раз в этой же
среде и вносили в полистироловые чашки Петри.
В предварительных экспериментах было установ-
© Ерошенко Д. В., Лемкина Л. М., Коробов В. П., 2012
29
30
Д. В. Ерошенко, Л. М. Лемкина, В. П. Коробов
лено, что использованная в настоящей работе подготовка бактериальных клеток, полученных на
разных фазах развития бактериальной популяции,
способствовала получению суспензии бактерий,
содержащих практически одинаковое количество
жизнеспособных клеток, равное 1.0–1.2 107
КОЕ/мл.
Для изучения зависимости адгезии бактерий от
времени и гидродинамических условий инкубацию
проводили в термостате или на шейкере в течение 30
или 120 мин. Оценку влияния на процесс адгезии
различных температур проводили после инкубации
чашек при 10, 25, 37 и 42°С в течение 30 мин. Для
изучения зависимости сорбции бактериальных клеток от кислотности среды исследования проводили
после внесения в инкубационную среду 0.1 М HCl
или 0.1 М NaOH до значений рН 4–8. По окончании
инкубации осторожным отсасыванием удаляли свободные, несвязавшиеся клетки и чашки трижды промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.2). Количество сорбированных клеток оценивали с помощью
микровизора μViso-103 («Ломо», Санкт-Петербург)
после окрашивания 0.1%-ным раствором кристалли-
ческого фиолетового, просматривая по 10 полей зрения в каждой чашке при увеличении 2500 раз. Учитывали число бактериальных клеток на площади видимого поля зрения, равной 0.004 мм2.
Степень гидрофобности поверхности бактериальных клеток экспоненциальной и стационарной
фаз роста, дважды отмытых в физиологическом
растворе, определяли с помощью BATH-теста в
двухфазной системе с гексадеканом [Rosenberg,
Gutnick, Rosenberg, 1980]
Статическую обработку полученных данных
проводили с помощью компьютерной программы
Excel 2003 (Microsoft Inc., 1999).
Результаты и обсуждение
Как следует из данных, представленных на
рис. 1, количество сорбированных клеток после
инкубации в течение 120 мин значительно возрастает по сравнению с инкубацией в течение 30 мин.
Эта тенденция присуща клеткам, полученным на
обеих исследованных фазах роста бактериальной
популяции.
Рис. 1. Адгезия клеток S. epidermidis 33 в разных гидродинамических условиях:
А – статические условия, Б – перемешивание 150 об/мин
При этом из морфологических исследований,
результаты которых представлены на рис. 2, следует, что при инкубации в течение 2 ч происходит
не столько увеличение числа адгезированных клеток, сколько размножение бактерий, прикрепившихся на первых этапах сорбции. По существу, к
этому моменту обнаруживаются небольшие кластеры размножающихся клеток, покрывающие
значительные участки атакованной поверхности.
Следует отметить, что и после 30 мин на поверхности чашек также присутствуют группы клеток, но они характеризуются значительно меньшими размерами, и часто включают в себя лишь
от 2 до 6 клеток.
При адгезии в условиях перемешивания
(рис. 3) наблюдается аналогичная динамика роста
численности сорбированных клеток, которая, однако, выражена в значительно меньшей степени.
Адгезия бактерий Staphylococcus epidermidis 33 …
Возможно, это связано с тем, что постоянное перемешивание разбивает крупные агломераты кле-
31
ток и сорбируются лишь клетки, обладающие наибольшими адгезионными свойствами.
Рис. 2. Клетки S. epidermidis 33 при адгезии в статических условиях:
1 – логарифмическая фаза роста, 30 мин; 2 – логарифмическая фаза роста, 120 мин; 3 – стационарная фаза
роста, 30 мин; 4– стационарная фаза роста, 120 мин
Рис. 3. Клетки S. epidermidis 33 при адгезии в условиях перемешивания:
1 – логарифмическая фаза роста, 30 мин; 2 – логарифмическая фаза роста, 120 мин; 3 – стационарная фаза
роста, 30 мин; 4– стационарная фаза роста, 120 мин
Изучение влияния температуры окружающей
среды на процессы сорбции исследованных бактерий показало (рис. 4), что они практически одинаковы для «молодых» и «старых» клеток при низких температурах, при этом происходящие в этих
условиях изменения агрегатного состояния липидных компонентов бактерий при повышении температуры среды от 10 до 30°С приводило к практически одинаковому линейному возрастанию
сорбции обеих групп клеток на полистироловой
поверхности. Однако при дальнейшем повышении
температуры культивирования до 42°С наблюдалось резкое увеличение адгезии клеток лог-фазы и
лишь небольшое превышение этого показателя для
клеток стационарной фазы.
Интересные данные были получены при изучении влияния на процесс адгезии клеток кислотности среды культивирования. Как видно из данных,
представленных на рис. 5, изменение рН среды от
слабокислых (рН 4) до слабощелочных (рН 8) зна-
32
Д. В. Ерошенко, Л. М. Лемкина, В. П. Коробов
чений кислотности не оказывало какого-либо
влияния на сорбцию бактерий стационарной фазы,
в то время как для клеток логарифмической фазы
роста было характерно постепенное увеличение
числа сорбированных клеток с максимумом в слабощелочной зоне.
пленкообразования патогенными штаммами бактерий.
Рис. 5. Адгезия бактериальных клеток
S. epidermidis 33 при изменении рН среды
Рис. 4. Влияние температуры на адгезию
бактериальных клеток S. epidermidis 33
Как показало исследование гидрофобных
свойств поверхности бактериальных клеток методом адгезии к гексадекану, клетки S. epidermidis 33
обладают достаточно высоким уровнем гидрофобности. Причем степень гидрофобности их поверхности в значительной степени зависит от фазы
роста культуры. Для бактерий стационарной фазы
роста этот показатель приближается к 80%, в то
время как клетки логарифмической фазы роста являются менее гидрофобными, со степенью гидрофобности, близкой к 55%. Учитывая эти данные,
необходимо отметить, что повышение адгезии
клеток лог-фазы, возможно, обусловлено изменением диссоциации каких-либо заряженных группировок при возрастании рН среды с одновременным изменением заряда поверхностных структур
бактерий, что оказывает влияние на интенсивность
электростатического взаимодействия поверхностей клеток и полистирола.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о высокой чувствительности первых
этапов формирования бактериальных пленок к
внешним факторам.
Это открывает перспективы направленной регуляции бактериальной адгезии с использованием
соединений, меняющих интенсивность и направление сорбции бактерий на различных поверхностях, что может быть использовано как для усиления действия пробиотиков, так и для подавления
Работа поддержана грантами Президента РФ
«Ведущие научные школы» НШ-5589.2012.4,
РФФИ № 10-04-96086-р_урал_а, 11-04-96025р_урал_а, Программ Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» № 12-П-4-1002 и
УрО РАН № 12-У-4-1033, 11-10-14-НАБ.
Библиографический список
Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биоплёнка – «город
микробов» и аналог многоклеточного организма
// Микробиол. 2007. Т. 76, № 2. С. 149–163.
De Caryalho C.C. Biofilms: new ideas for an old problem // Recent Pat. Biotechnol. 2012. № 6. P. 6–12.
Klemm P., Vejborg R.M., Hancock V. Prevention of
bacterial adhesion // Appl. Microbiol. Biotechnol.
2010. Vol. 88. P. 451–459.
Kwakman PHS et al. Treatment and prevention of Staphylococcus epidermidis experimental biomaterialassociated infection by bactericidal peptide 2 // Antimicrob. Agents Chemother. 2006. Vol. 50. P.
3977–3983.
Rosenberg M., Gutnick D., Rosenberg E. Adherence of
bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell-surface hydrophobicity // FEMS Microbiology Letters. 1980. Vol. 9. I. 1. P. 29–33.
Wolcott R.D., Ehrlich G.D. Biofilms and chronic infection // JAMA. 2008. Vol. 299. P. 2682–2684.
Поступила в редакцию 05.03.2012
Адгезия бактерий Staphylococcus epidermidis 33 …
33
Adhesion of bacteria Staphylococcus epidermidis 33 during the effects of some
physicochemical environmental factors
D. V. Eroshenko, PhD-student; info@iegm.ru
L. M. Lemkina, candidate of medicine, senior scientist; l.lemkina@iegm.ru
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; 13, Goleva
str., Perm, Russia, 614081
V. P. Korobov, candidate of medicine, associate professor, head of laboratory
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia,614990
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; 13, Goleva
str., Perm, Russia, 614081; korobov@iegm.ru; (342)2446712
The first stages of biofilms formation by bacteria S. epidermidis 33 on the polystyrene surface were studied.
The dependence of biomass accumulation of bacterial films on the physicochemical environmental factors – the
temperature, acidity, hydrodynamic conditions, as well as on the physiological state of adsorbed bacteria was
discovered.
Key words: staphylococci; adhesion on polystyrene surface; dependence on time, temperature, pH.
Ерошенко Дарья Владимировна, аспирант
Лемкина Лариса Марковна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов»
Коробов Владимир Павлович, кандидат медицинских наук, доцент, зав. лабораторией
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов»