МЕХАНИЗМЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АДГЕЗИИ

Чистый барьер
Тим Сэндл
Зав. отделения по микробиологии
«БиоПродактз Лаборатори», Ltd
МЕХАНИЗМЫ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ АДГЕЗИИ
Опубликовано по материалам сайта
www.ivtnetwork.com
Введение
Явление бактериальной адгезии имеет большое значение
для любого специалиста, работающего в фармацевтической
отрасли и отрасли здравоохранения. Это связано с тем, что
многие процессы направлены на устранение бактерий, например, из трубопровода или с поверхностей внутри чистых помещений, посредством очистки и дезинфекции.
Адгезия бактерий к поверхностям зависит от таких факторов как поверхностный заряд, поверхностная энергия и специфических свойств полимеров в отношении бактерий (таких,
которые способствуют образованию биопленки). Механизм
адгезии бактерий к поверхностям или внутри микробиологического сообщества очень важен для фармацевтических
микробиологов. Например, механизм сцепления с поверхностью учитывается при проведении операций очистки и дезинфекции; также имеет значение и механизм адгезионного
взаимодействия (иначе сцепления) между самими бактериями,
образующими биопленку внутри трубопроводов системы водоснабжения, или сцепления бактерий с веществами, входящими в состав лекарственного средства. Вне фармацевтической
отрасли сцепление бактерий с клетками человека играет немаловажную роль в таких сферах как стоматология и пересадка тканей, а также при использовании медицинских имплантатов, капельниц, дренажных систем, стентов и катетеров.
Данная работа представляет собой вводное описание
механизмов бактериальной адгезии, а также содержит пояснение того, почему эта информация имеет столь важное
значение для проведения процессов очистки и дезинфекции
и обслуживания систем водоснабжения. Работа носит образовательный характер, поскольку содержащаяся в ней информация была получена путем анализа литературы в соответствующей области.
Принципы адгезии
Бактериальная адгезия является следствием баланса
физико-химических взаимодействий, проявляющихся во
взаимодействии сил притяжения или отталкивания бактерий
и поверхностей [1]. Понимание свойств адгезии имеет большое значение; в целом, бактерии предпочитают рост на поверхности (сидячая форма) существованию в водной среде
в планктонной форме.
Процесс адгезии бактерий к поверхности состоит из трех
этапов: перенос бактерий на поверхность, начальная адгезия (иногда также называемая «биологическим сцеплением»)
и колонизация. Что касается первого этапа, то большинство
бактерий, особенно в условиях чистых помещений фармацевтической отрасли, переносятся воздушными потоками.
В результате воздействия силы притяжения, конвекции, рассеивания либо собственного активного движения клетка,
находящаяся в окружающей среде, в определенный момент
54
оседает на поверхность, вступая с ней в контакт. Сцепление
клетки с поверхностью может носить как обратимый (временный), так и необратимый (постоянный) характер.
Обратимое сцепление представляет собой физическое
явление, неспецифическое и случайное, длительность которого может не превышать нескольких десятых долей секунды.
В зависимости от типа поверхности в процесс сцепления могут
быть вовлечены различные силы притяжения, хотя наиболее
распространенными являются химические (как правило, это
силы малого радиуса действия: связь Ван-дер-Ваальса, водородная связь, гидрофобное взаимодействие и т.д.) и электростатические. Обратимое сцепление бактерий с поверхностью
зависит от сил притяжения или отталкивания между слоем
ионов, окружающих бактерию, и зарядом поверхности. Следовательно, если поверхность имеет положительный заряд,
а бактерия – отрицательный, то бактерия легко может притягиваться поверхностью [2]. Основная гипотеза, описывающая
механизм обратимого сцепления (иначе адгезионного взаимодействия), носит название DLVO (первые буквы фамилий разработавших ее ученых – Derjaguin и Landau, Verwey и Overbeek)
[3]. Данная теория используется для описания фактического
Рис. 1. Графическое изображение процесса образования
биопленки
На рисунке 1 изображены следующие этапы образования биологической пленки на поверхности:
1. Попадание отдельных клеток на поверхность (первоначальная
фиксация или сцепление).
2. Выделение полимерных веществ (EPS-еxtrapolymeric substances), продуцируемых клеткой, после чего сцепление
становится необратимым.
3. Рост колонии.
4. Формирование и рост биопленки.
5. Выделение биопленкой отдельных клеток.
ЧИСТЫЕ ПОМЕЩЕНИЯ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ
Чистый барьер
Рис. 2. Поверхностная биопленка – увеличенный снимок
биопленки, образованной железобактерией с поверхности
трубопровода
взаимодействия между клеткой и поверхностью в качестве
баланса между двумя факторами: VA, являющимся результатом взаимодействия сил Ван-дер-Ваальса (как правило, притягивающим), и VR–отталкивающим фактором, являющимся
результатом перекрытия двойных электрических слоев клетки
и поверхности. Альтернативной является термодинамическая
теория. В ее основе лежит аналогичный физико-химический
подход, однако, данная теория учитывает различные притягивающие и отталкивающие взаимодействия, в том числе
сил Ван-дер-Ваальса, электростатических или дипольных сил.
В соответствии с теорией все эти силы рассматриваются
в совокупности и выражаются в виде свободной энергии
(термодинамического взаимодействия).
При необратимом сцеплении бактерия сначала адсорбируется на поверхности, после чего клетка уже активно удерживается на поверхности благодаря метаболической деятельности. Данный процесс зависит от времени, поэтому адгезия
к поверхности может быть временно обратимой или необратимой.
Необратимая бактериальная адгезия является следствием
межмолекулярных взаимодействий малого радиуса действия,
например: образования водородной, ионной и ковалентной
связи, взаимодействий со структурами внеклеточного матрикса, а также секреций. Клетка выделяет вещество, представляющее собой полисахарид и называемое гликокаликсом
(слизеобразный матрикс, состоящий из гидратированных полимерных субстанций). Благодаря этому веществу бактерия
удерживается на поверхности и происходит формирование
биопленки [4]. «Гликокаликс» является общим термином, относящимся к любому внеклеточному полимерному материалу
(гликопротеину), вырабатываемому некоторыми бактериями,
эпителием и другими клетками [5].
Биологическое сцепление по этому типу протекает относительно медленно [5]. На этот процесс влияют разнообразные
факторы, в том числе тип бактерии, размер бактериальной
популяции в окружающей среде, продолжительность фазы
роста колонии. Характеристики роста зависят от окружающей
среды, в том числе от температуры раствора, pH среды, концентрации электролитов, а также доступности питательных
веществ. Сила сцепления бактерии с поверхностью зависит
от заряда поверхности и продолжительности контакта.
В целом, грамотрицательные бактерии легче образуют
биопленку из-за большого количества EPS и липополисаха-
56
ридов (LPS). Это особенно важно для систем водоснабжения,
поскольку грамотрицательные бактерии составляют бóльшую
часть популяций бактерий, обитающих в водной среде [6]. Следует иметь в виду, что не все бактерии являются слизеобразующими. Не образующие слизь бактериальные штаммы хуже
связываются с поверхностью и в некоторых случаях не являются патогенными [7, 8].
Согласно результатам последних исследований бактерии,
находящиеся внутри биопленки, способны прибегать к довольно сложным формам обмена информацией. Структура
биопленки представляет собой идеальную среду для обмена
генами и межклеточного взаимодействия. Обмен сигналами
между клетками обозначается термином «чувство кворума»
(«quorum sensing») и играет важную роль в синтезе фактора
вирулентности, дифференцировке клеток биопленки, а также
присоединении и отделении клеток [9].
После формирования биопленки в ней образуется микроскопическая полость, в которой поддерживается благоприятная для выживания бактерий среда, а сами бактерии защищены от негативного воздействия окружающей среды, например,
от потоков жидкости, изменений уровня кислотности или температуры. Основная проблема, связанная с биопленкой, состоит в том, что со временем к ней присоединяется бóльшая
часть микроорганизмов. В результате сидячие бактерии,
образующие биопленку, всегда превышают своей численностью планктонные (двигающиеся) бактерии аналогичных
систем в 1 000–10 000 раз и являются доминирующей популяцией экосистемы [10]. Поэтому так важно избегать образования биопленки внутри фармацевтического оборудования.
Сцепление бактерий с поверхностью зависит от разных
факторов – поверхностного натяжения (которое может изменяться в зависимости от наличия либо отсутствия на поверхности мыла или иных поверхностно активных средств), деформации бактериальных клеток, а также от неравномерности
распределения электрических зарядов (например, в случае,
если часть поверхности имеет только отрицательный заряд)
[11]. Что касается поверхностного натяжения, то, согласно
наблюдениям, бактерии активнее перемещаются с одной
влажной поверхности на другую, чем с влажной поверхности
на сухую [12]. Состояние поверхности, вернее ее гладкость,
также влияет на сцепление с ней бактерий. В ходе некоторых
исследований были обнаружены различия в уровнях зараженности пористых и плотных материалов. Уровень зараженности
пористых материалов был выше [13]. Еще одним фактором,
влияющим на сцепление бактерий с поверхностью, является
ее композиционный состав. Так, активность сцепления с металооксидными покрытиями стабильно выше, чем с поверхностями из стекла без покрытия.
Более того, на сцепление бактерий с поверхностью также
влияют характеристики окружающей среды, такие как температура, время воздействия, концентрация бактерий, присутствие антибиотиков, а также параметры потоков. В случае
системы водоснабжения значение имеет и такой фактор как
скорость потока, поскольку быстрый поток воды осложняет
сцепление бактериальных клеток с поверхностью.
Немаловажным фактором является тип бактерии. С поверхностью из одного и того же материала различные виды
и штаммы бактерий могут связываться с разной степенью
активности из-за различия их физико-химических характеристик. Как правило, бактерии с гидрофобными свойствами предпочитают поверхности из гидрофобных материалов,
а бактерии с гидрофильными свойствами активнее связываются с поверхностями из гидрофильных материалов. Следует упомянуть и такой фактор как заряд поверхности бак-
ЧИСТЫЕ ПОМЕЩЕНИЯ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ
Чистый барьер
терии. Бактерии в водной суспензии почти всегда имеют
отрицательный заряд, однако, в целом, заряд поверхности
бактерии зависит от ее вида, среды роста, уровня кислотности,
ионной силы буфера, а также возраста бактерии и структуры
ее поверхности.
Некоторые бактерии, например Escherichia coli, удерживаются на поверхности с помощью нитевидных придатков, называемых пилями. В случае систем водоснабжения при прочном
сцеплении пилей с поверхностью поток воды даже высокой
скорости проходит сквозь пили, что затрудняет удаление биопленки. Другие бактерии вырабатывают адгезины [14] – поверхностные белки, способствующие сцеплению бактерии
с другими клетками или поверхностями.
Основным методом исследования бактериальной адгезии
является метод атомно-силовой микроскопии (AFM-atomic
force microscopy), позволяющий изучить связывание бактерий
на атомном, нано- и микроуровне [15]. Данный метод, предоставляющий возможность более глубокого изучения такого
явления как адгезия, тем не менее, практически бесполезен
для фармацевтической отрасли. С точки зрения фармацевтического производства основной задачей является предупреждение образования биопленки. Ниже представлены пути
решения данной задачи в контексте очистки чистых помещений и систем водоснабжения.
Очистка и дезинфекция
Эффективность очистки и дезинфекции частично зависит
от характера бактериальной адгезии. Обратимое сцепление
облегчает вышеупомянутые процессы, в то время как необратимое – наоборот, требует более тщательной очистки и дезинфекции. Дезинфицирующие средства более эффективны
в отношении суспендированных бактерий, поэтому перед
дезинфекцией проводится предварительная обработка поверхности с помощью чистящих средств в комплексе с механическим воздействием. Важно помнить следующее: за
исключением случаев применения комплексного дезинфицирующего/чистящего средства, эффективная дезинфекция
поверхности невозможна без ее предварительной очистки,
поскольку органические остаточные вещества могут снизить
активность дезинфицирующего средства, а загрязнения будут
препятствовать проникновению средства к клеткам бактерий. Механизм действия чистящих средств, как правило, заключается в проникновении внутрь загрязнения и снижении
его поверхностного натяжения (удерживающего загрязнение
на поверхности), что облегчает удаление загрязнения (иными
словами, чистящее средство повышает «смачиваемость»
водой, т.е. способность воды «прилипать» к загрязнениям
и смачивать их) [16]. Большинство чистящих средств являются
синтетическими поверхностно-активными веществами.
Поверхностно-активные вещества способствуют удалению частиц с поверхностей благодаря наличию капиллярного
эффекта или электростатических сил (большинство веществ
содержат ионы с противоположными зарядами – это приводит
к тому, что микроорганизмы начинают отталкивать друг друга).
В результате взаимного отталкивания микроорганизмы
отделяются от поверхности и смешивается с жидкостью.
Суспендированные микроорганизмы легче удаляются с поверхностей при промывании чистящим средством (или последующим промывании водой) и легче поддаются уничтожению
при дезинфекции.
Если применения чистящего средства недостаточно для
удаления загрязнения, то большинство бактерий не будут уничтожены при последующей дезинфекции, поскольку микроколонии бактерий будут защищены гликокаликсом, образующим
№ 1 (49) ЯНВАРЬ — МАРТ 2014
Рис. 3. Микроорганизм, образующий биопленку – электронная
микрофотография. На фотографии представлена биопленка
на сосудистом протезе, состоящая из Staphylococcus aureus
защитный слой слизи. Ситуация дополнительно усложняется
по мере роста сообщества бактерий и их слияния, поскольку
это приводит к образованию более толстой биопленки, что
еще больше затрудняет проникновение дезинфицирующего
средства.
Таким образом, микроорганизмы в планктонной форме
легче поддаются уничтожению по сравнению с микроорганизмами в сидячей форме (планктонные бактерии представляют
собой взвешенные в среде организмы, а сидячие дислоцируются на поверхностях) [17].
Система водоснабжения
Бактериальная адгезия является очень актуальной проблемой для систем водоснабжения. В системах водораспределения бактериальная адгезия приводит к образованию
биопленки и последующему загрязнению воды, снижению
эстетического качества питьевой воды, увеличению скорости коррозии трубопровода и снижению уровня микробиологической безопасности благодаря повышению вероятности
выживания патогенных микроорганизмов [18]. Появление
биомассы на поверхности мембраны для фильтра приводит
к его засорению, что негативно сказывается на эффективности систем очистки сточных вод, использующих мембранную
фильтрацию [19]. В случае образования биомассы внутри
трубопровода, очистить от нее трубопровод бывает затруднительно. Кроме того, это приводит к повышению содержания
в воде микроорганизмов до уровня, превышающего фармакопейный уровень действия.
В случае систем водоснабжения степень смачивания поверхности называется «гидрофобностью». Проведенные недавно исследования показали, что гидрофобность твердых
поверхностей влияет на активность сцепления с ними бактерий. Большинство бактерий и иных микроорганизмов имеют
множество различных механизмов сцепления с поверхностью
[20]. Вторым важнейшим фактором, определяющим активность
сцепления, является электростатический заряд поверхности.
Общепринятые нормы фармацевтического проектирования часто предполагают применение технологий, направленных на предупреждение сцепления микроорганизмов
с поверхностью [21]. Минимизации условий образования
биопленки способствуют увеличение скорости потока, выбор
правильного угла для стока воды, отсутствие застойных участков трубопровода, а также организация программы рутинной
57
санитарной обработки, предусматривающей промывку горячей водой (70–80°C), озонирование или обработку трубопровода дезинфицирующим средством.
Вывод
Данная работа содержит описание различных механизмов бактериальной адгезии, а также их пояснение. Представленный обзор свидетельствует о высоком значении адгезии,
особенно необратимой, для систем водоснабжения, а также
для очистки и дезинфекции фармацевтического предприятия.
Характеристики сцепления бактерий с поверхностью должны
быть хорошо известны и понятны как фармацевтическим
микробиологам, так и всему персоналу, ответственному за
уровень качества.
Справочная литература
1. M.C. van Loosdrecht, J. M. C., Lyklema, J. W., Norde, W., G. Schraa, G,. & and
A.J. Zehnder, A. J. “The role of bacterial cell wall hydrophobicity in adhesion,”. Applied Environmental Microbiology 53, 1893-7, (1987).
2. R. Montville, and D.W. Schaffner, “Inoculum Size Influences Bacterial
Cross Contamination between Surfaces,” Applied and Environmental
Microbiology 69 (12), 7188-7193, 2003.
3. S. Bhattacharjee, M. Elimelech, M. Borkovec,, "DLVO interaction between colloidal particles: Beyond Derjaguins approximation," Croatica
Chimca Acta 71, 883-903, 2003.
4. J. Wingender, T.R. Neu, and H.C. Flemming, “What are bacterial extracellular polymeric substances?” In: Microbial Extracellular Polymeric Substances (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1999) pp. 1-19.
5. G. Lear and G.D. Lewis, GD (editor), Microbial Biofilms: Current Research
and Applications. Caister Academic Press (2012).
6. H.Y. An, and R.J. Friedman, “Concise review of mechanisms of bacterial adhesion to biomaterial surfaces,” Journal of Biomedical Materials
Research: Applied Biomaterials 43, 338-48, 1998.
7. P.F. Laharrague, J.X. Corberand, G. Fillola, B.J. Gleizes, A.M. Fontanilles,
and E. Gyrard, “In vitro effect of the slime of Pseudomonas aeruginosa
on the function of human polymorphonuclear neutrophils,” Infect.
Immun. 44, 760-762, 1984.
8. A.S. McNeish, P. Turner, J. Fleming, and N. Evans, “Mucosal adherence
of human enteropathogenic Escherichia coli,” The Lancet 306 (7942),
946-948, 1975.
9. E. Drenkard, “Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa
biofilms,” Microbes and Infections 5, 1213-9 (2003).
10. J.W. Costerton, G.G. Geesev, and K.J. Cheng, “How bacteria stick,” Scientific American 238, 86-95, 1978.
11. M.A. Assanta, “The war against invasive bacteria that stick to surfaces,”
Food Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Foods,
Canada, available at: http://sci.agr.ca/crda/pubs/art4_e.htm (accessed 15th May 2012).
12. S.A. Sattar, S. Springthorpe, S. Mani, M. Gallant M, R.C. Nair, E. Scott,
and J. Kain, “Transfer of bacteria from fabrics to hands and other fabrics: development and application of a quantitative method using Staphylococcus aureus as a model,” Journal of Applied Microbiology 90 (6),
962-970(9), 2001.
13. T.R. Scheuerman, A.K. Camper, M.A. Hamilton, “Effects of substratum
topography on bacterial adhesion,” Journal Colloid Interface Science
208, 23-33, 1998.
14. l. Coutte, S. Alonso, N. Reveneau, E. Willery, B. Quatannens, C. Locht,
and F. Jacob-Dubuisson, (2003). "Role of adhesin release for mucosal
colonization by a bacterial pathogen," Journal of Experimental Medicine
197 (6), 735–42, 2003.
15. Y. Roiter and S. Minko, "AFM single molecule experiments at the solidliquid interface: in situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte
chains," Journal of the American Chemical Society 127 (45), 15688–9,
2005.
16. E. Bessems, “The effect of practical conditions on the efficacy of disinfectants,” International Biodeterioration and Biodegradation 41, 177–
183, 1998.
17. R.J. Farn, Chemistry and technology of surfactants, London: John Wiley
& Sons, 2006.
18. S.L. Percival, and J.T. Walker, “Potable water and biofilms: a review of
the public health implications,” Biofouling 42, 99–115, 1999.
19. J.A. Redman, S.L. Walker, and M. Elimelech, “Bacterial adhesion and
transport in porous media: role of the secondary energy minimum,”
Environmental Science Technology, 38 (6), 1777–1785, 2004.
20. R.J. Doyle, “Contribution of the hydrophobic effect to microbial infection,” Microbes and Infection 2, 391-400, 2000.
21. M. Thouvenin, V. Langlois, R. Briandet, J.Y. Langlois, P.H. Gurerrin,
P.P. Peron, D. Haras, and K. Vallee-Rehel, “Study of erodable paint properties involved in antifouling activity,” Biofouling 19, 177–186, 2003. 
ЧИСТЫЕ ПОМЕЩЕНИЯ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ