ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи ЕРОШЕНКО Дарья Владимировна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент Коробов В. П. Пермь – 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 5 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................................................................. 10 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................ 11 1.1. Микробные биопленки ...................................................................................... 11 1.1.1. Образование биопленок ................................................................................. 12 1.1.2. Структура биопленок ..................................................................................... 14 1.1.3. Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции.............................. 16 1.2. Бактерии рода Staphylococcus ........................................................................... 18 1.1.1. Бактерии вида S. epidermidis .......................................................................... 19 1.2.2. Роль S. epidermidis в БАИ............................................................................... 20 1.3. Факторы, влияющие на первые этапы образования биопленок...................... 21 1.3.1. Окружающая среда......................................................................................... 21 1.3.2. Поверхность материала.................................................................................. 24 1.3.3. Характеристики бактериальной клетки ........................................................ 27 1.3.4. Белки сыворотки и тканей человека.............................................................. 32 1.4. Антибактериальные пептиды............................................................................ 36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................... 39 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................... 39 2.1. Бактериальные штаммы и среды....................................................................... 39 2.2. Культивирование и подготовка бактерий S. epidermidis ................................. 42 2.3. Определение количества колониеобразующих единиц................................... 42 2.4. Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина .............................................................. 42 2.5. Определение минимальной подавляющей концентрации............................... 42 2.6. Определение дзета-потенциала бактериальных клеток................................... 43 2.7. Выделение полной геномной ДНК ................................................................... 44 2.8. Предобработка поверхности полистирола плазмой, сывороточными белками и катионными пептидами .......................................................................................... 44 3 2.9. Определение гидрофобности поверхностей бактериальных клеток и полистирола................................................................................................................ 44 2.10. Предобработка бактериальных клеток гидролитическими ферментами и антибактериальными пептидами............................................................................... 45 2.11. Определение адгезионной способности бактериальных клеток ..................... 46 2.12. Определение биопленкообразующей способности бактерий ......................... 47 2.13. Изучение действия ферментов и антибактериальных соединений на суточные биопленки ................................................................................................................... 48 2.14. Атомно-силовая микроскопия........................................................................... 49 2.15. Получение и анализ фильтратов среды с ранних этапов образования биопленок ................................................................................................................... 49 2.16. Статистика.......................................................................................................... 50 ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS.................................................................................... 51 ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА АДГЕЗИЮ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS.................................................................................... 56 4.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от гидродинамических условий культивирования ........................................................................................................ 56 4.2. Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis............................................................................................................... 58 4.3. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от кислотности среды ............. 60 4.4. Влияние осмолярности среды на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis............................................................................................................... 61 4.5. Адгезия и образование биопленок бактериями S. epidermidis при внесении в среду глюкозы ............................................................................................................ 65 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ, МЕНЯЮЩИХ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ, НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS........................................................... 67 5.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от содержания в среде ионов двухвалентных металлов ........................................................................................... 67 4 5.2. Влияние ЭДТА на адгезию и развитие биопленок бактериями S. epidermidis71 5.3. Действие детергентов на адгезию бактерий S. epidermidis.............................. 73 5.4. Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis .......................................................................................... 74 5.5. Действие мембранотропных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis........................................................................ 77 5.6. Действие гидролитических ферментов, периодата натрия и ДНК на адгезию и формирование биопленок бактериями S. epidermidis ........................................... 78 5.7. Действие гидролитических ферментов и периодата натрия на сформированные биопленки бактерий S. epidermidis .............................................. 85 ГЛАВА 6. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ S. EPIDERMIDIS........................ 89 6.1. Действие линезолида на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis............................................................................................................... 89 6.2. Действие антибактериальных пептидов на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis .......................................................................................... 90 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS В ПРИСУТСТВИИ КОМПОНЕНТОВ КРОВИ ......................................................... 100 ГЛАВА 8. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS....................................................................................................... 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................ 110 ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 117 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Смена парадигмы в микробиологии, обусловленная пониманием выдающейся роли организованных микробных сообществ – бактериальных пленок – в формировании и функционировании всей биоты нашей планеты, определяет возрастающий интерес исследователей к процессам образования, персистенции и распространения этих особых живых структур. В настоящее время уровень инфекционных заболеваний, в развитии которых формирование биопленок является главным патогенетическим событием, достигает 80% (Hidron et al., 2008). Характерной особенностью возбудителей этого вида патологических состояний является их высокая устойчивость к широко используемым в практике антибиотикам (Gill et al., 2005). Бактерии рода Staphylococcus, в частности S. epidermidis, являются нормальными представителями микрофлоры кожи и слизистых человека и животных, составляя 65–90% от общей микрофлоры (Дерябин, 2000). Однако, способность стафилококков к образованию биопленок может приводить к возникновению осложнений, вплоть до летальных исходов, при заболеваниях, связанных с использованием долговременных медицинских устройств – внутрисосудистых и уретральных катетеров, контактных линз и различных полимерных и металлических трансплантатов. Обладая тропностью к различным материалам, коагулазонегативные стафилококки становятся возбудителями внутрибольничных инфекций, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом (Vuong and Otto, 2002). В связи с этим, изучение механизмов колонизации различных поверхностей и, в частности, первых этапов этого процесса, а также поиск путей предотвращения формирования бактериальных пленок имеют существенное значение для разработки стратегий предупреждения формирования биопленок как сапрофитных, так и патогенных бактерий. Несмотря на большое количество работ, характеризующих роль бактерий S. epidermidis в развитии имплантат-ассоциированных инфекций, механизмы адгезии и формирования биопленок стафилококками до сих пор остаются 6 изученными недостаточно (Otto, 2012). В связи с этим, получение новых данных о процессах бактериальной колонизации может значительно углубить понимание механизмов заселения стафилококками полимерных поверхностей и явиться основой для разработки эффективных способов предупреждения и борьбы с инфекциями, обусловленными формированием биопленок этими бактериями. Цель настоящей работы – изучение чувствительности первых этапов процессов образования биопленок бактерий S. epidermidis к факторам внешней среды и ряду антибактериальным соединениям. Основные задачи исследования: 1. Изучить влияние (гидродинамические физико-химических условия, температура, параметров рН, внешней осмолярность среды среды, концентрация глюкозы) на адгезию бактерий S. epidermidis к поверхностям полистирола и стекла. 2. Оценить роль катионов ряда биоактивных металлов (кальция, магния, цинка и марганца) в процессах адгезии и первых этапах образования биопленок бактериями S. epidermidis. 3. Охарактеризовать действие факторов, влияющих на свойства поверхностных структур бактериальных клеток (детергенты, мембранотропные соединения и гидролитические ферменты), на сорбционную активность и формирование биопленок бактериями S. epidermidis на поверхностях полистирола. 4. Исследовать влияние антибиотических соединений (линезолида и низкомолекулярных катионных пептидов) на адгезию бактерий S. epidermidis. 5. Оценить роль белковых компонентов крови в процессах колонизации поверхностей полистирола бактериями S. epidermidis. 6. Проанализировать возможность функционирования механизмов регуляции процессов адгезии бактерий S. epidermidis. Научная новизна Впервые показано, что повышение осмолярности среды вызывает одинаковое снижение численности сорбирующихся бактерий вида S. epidermidis на 7 гидрофобной и гидрофильной поверхностях. Установлено значение Δψ- и ΔрНкомпонент мембранного потенциала бактерий S. epidermidis в процессах их сорбции и формирования биопленок. Выявлено видоспецифическое стимулирующее действие внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis. Обнаружена возможность предупреждения формирования биопленок бактериями S. epidermidis, в том числе их антибиотикоустойчивыми штаммами, внесением в среду культивирования низкомолекулярных катионных пептидов. Получены важные временные характеристики ингибирующего эффекта низкомолекулярных пептидов варнерина и хоминина на развитие биопленок бактерий S. epidermidis. Оригинальными являются результаты исследований, показавших, что адгезия бактерий S. epidermidis сопровождается выделением во внешнюю среду соединений, по-видимому, обладающих ауторегуляторными функциями. Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты расширяют представления об особенностях адгезии и первых этапов образования биопленок бактериями S. epidermidis как при изменении физико-химических параметров внешней среды, так и под действием факторов, влияющих на поверхностные структуры бактериальных клеток. Ингибирующее действие низкомолекулярных антибактериальных пептидов на процессы адгезии и первые этапы формирования биопленок стафилококков свидетельствуют о перспективах использования этих соединений для обработки поверхностей медицинских замещающих устройств с целью предупреждения формирования на их поверхностях биопленок коагулазонегативных стафилококков. Положения, выносимые на защиту 1. Динамика связывания бактерий S. epidermidis с поверхностями атакуемых материалов существенно зависит от изменения физико-химических параметров внешней среды – гидродинамических условий, температуры, рН, осмолярности среды, концентрации энергетического субстрата. 2. Изменение физико-химических характеристик поверхности бактерий S. epidermidis под действием факторов внешней среды – катионов биоактивных 8 металлов, детергентов, ионофоров, ферментов – оказывает существенное влияние на их адгезию к гидрофобной поверхности полистирола. 3. Низкомолекулярные вызывают катионные пептиды семейства лантибиотиков снижение адгезии бактерий S. epidermidis, значительное способствующее выраженному ингибированию первых этапов образования ими биопленок на поверхностях полистирола. 4. Обработка поверхностей полистирола белковыми компонентами крови приводит к существенным, определяемым природой белков, изменениям сорбции на них бактерий S. epidermidis. 5. Адгезия бактерий S. epidermidis сопровождается выделением в среду низкомолекулярных соединений, по-видимому, участвующих в регуляции начальных этапов колонизации бактериями атакуемой поверхности этого материала. Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на I Всероссийской с международным участием школеконференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; VIII Молодежной школеконференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2012; 5th Congress of European Microbiologists, FEMS, Leipzig, 2013; VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «СимбиозРоссия», Иркутск, 2013; 18-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века», Пущино, 2014; III International Conference on Antimicrobial Research, Madrid, 2014. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Объем и структура работы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста и включают 20 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит 227 источников, в том числе 16 отечественных и 211 зарубежных. 9 Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-96025р_урал_а, 12-04-01431-а и 14-04-00687), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-41002) и грантом Министерства образования и науки Пермского края «Международные исследовательские группы» (С-26/632). Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора. 10 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АМП – антимикробный пептид БАИ – биоматериал-ассоциированные инфекции БСА – бычий сывороточный альбумин ДНК – дезоксирибонуклеионовая кислота ДНК КРС – ДНК из селезенки крупного рогатого скота КНС – коагулазонегативные стафилококки КОЕ– колониеобразующая единица МПК – минимальная подавляющая концентрация ФБ – натрий-фосфатный буфер Фг – фибриноген Фн – фибронектин ЭДТА – этилендиаминтетраацетат экзДНК – внеклеточная ДНК Aap – ассоциированный с накоплением белок Bhp – Bap-гомологичный белок CCCP – карбонил-цианид-m-хлорфенилгидразон IgG – иммуноглобулин G LB – среда Лурия-Бертани MSCRAMMs – компоненты микробной поверхности, узнающие адгезивные молекулы матрикса OD570 – оптическая плотность при длине волны 570 нм OD600 – оптическая плотность при длине волны 600 нм PIA – полисахаридный межклеточный адгезин QS – система «quorum sensing» Ra – средняя шероховатость Rz – средняя разница в высоте SDS – додецилсульфат натрия 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Микробные биопленки На протяжении значительного периода времени микроорганизмы характеризовались как одноклеточные формы жизни – свободноплавающие планктонные клетки, что оказало неоспоримое влияние на развитие метода «чистых культур» и понимание микробной физиологии (Davey, O’Toole, 2000). Однако, с развитием методов микроскопии и молекулярно-генетических методик стало возможным прямое наблюдение огромного разнообразия микроскопических обитателей природных ниш, подтвердившее, что большинство бактерий существуют в этих условиях не в планктонном состоянии, а в виде прикрепленных к поверхностям упорядоченных сообществ – биопленок (Costerton et al., 1978). С исторической точки зрения, открытие микробных биопленок можно связать с Антонием Ван Левенгуком, который в XVII веке, используя простой микроскоп, первым наблюдал микроорганизмы, выделенные из собственного зубного налета. Значительно позднее, в середине XX века, было обнаружено, что рост и жизнедеятельность бактерий существенно усиливаются при наличии поверхностей, к которым бактерии могут прикрепляться, и что число микроорганизмов на этих поверхностях значительно выше, чем в окружающей их среде (Zobell, 1943). А в 1978 г. Costerton с соавт. уже постулировали общую теорию господства биопленок (Costerton et al., 1978). В настоящее время признано, что в естественной среде более чем 99% всех бактерий существуют в виде биопленок (Hall-Stoodley and Stoodley, 2009). Это наводит на мысль о существенном преимуществе иммобилизованных на поверхностях бактериальных клеток перед планктонными. По-видимому, это связано с тем, что прикрепленные к поверхности бактерии находятся в более благоприятной среде с позиции защиты от внешних неблагоприятных факторов (Davey and O’Toole, 2000). Действительно, бактерии, находящиеся в биопленке, отличаются от растущих в планктоне как физиологически, так и по фенотипу (Hall-Stoodley et al., 2004). Главные фенотипические изменения в них связаны со 12 специфической транскрипцией генов, изменением скорости роста, дыхания, потребления кислорода, уровня электрон-транспортной активности, синтеза внеклеточных полимеров, активности потребления субстратов и резистентности к антибиотическим факторам (Wilson, 2001; Donlan, 2002). Действительно, показано, что иммобилизованные в биопленках бактерии до 1000 раз более устойчивы к антибиотикам и факторам иммунной защиты хозяина по сравнению со свободно живущими клетками (Ceri et al., 1999). В настоящее время биопленки могут быть определены как сообщества бактерий, которые необратимо прикреплены к биотической или абиотической поверхностям и заключены в межклеточный полимерный матрикс (Costerson et al., 1999). Этот матрикс преимущественно включает в себя такие внеклеточные полимерные вещества, как полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие соединения, которые синтезируются клеточными элементами и экспортируются на их поверхность и в окружающую среду, заполняя прилегающее межклеточное пространство (Davey, O’Toole, 2000). 1.1.1. Образование биопленок Образование биопленок включают в себя две основные функциональные фазы: первичную адгезию с адаптацией бактерий к поверхности и формирование многослойных клеточных слоев и кластеров, обусловленное продукцией внеклеточного полимерного матрикса (O’Toole et al., 2000). На начальной стадии бактериальной колонизации клетки приближаются к поверхности настолько близко, что их подвижность снижается, и возникают кратковременные контакты с поверхностью. В этот период первичная адгезия микроорганизмов в значительной степени определяется физико-химическими свойствами поверхностей как бактериальных клеток, так и атакуемого материала (von Eiff et al., 2002). Главными действующими силами на этом этапе являются силы Ван-дер-Ваальса, уровень гидрофобности клеточной поверхности (Oliveira et al., 2001), величина заряда сорбирующихся клеток (van Loosdrecht et al., 1990), а так же гидрофобность, заряд, шероховатость и химический состав поверхности атакуемого материала (An and Friedman, 2000). 13 Гидрофобность клеточной поверхности и первичная адгезия бактерий, во многом, зависят от присутствия бактериальных поверхностно-ассоциированных белков (von Eiff et al., 2002). Однако, в природе бактерии чаще прикрепляются, не непосредственно к субстрату, а к слою адсорбированных на его поверхности молекул, так называемой «кондиционной пленке». В этом случае, прикрепление бактериальных клеток, в основном, зависит от специфических взаимодействий бактериальных адгезинов с их комплементарными рецепторами, находящимися на поверхности атакуемого субстрата. Такие особые белковые молекулы известны как компоненты микробной поверхности, узнающие адгезивные молекулы матрикса (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs) (Patti et al., 1994). Одним из примеров такого типа поверхностных белков, взаимодействующих с матричными белками поверхностных структур, может служить Fbe – фибриноген-связывающий белок Staphylococcus epidermidis, локализованный на поверхности клеточной стенки (Vuong and Otto, 2002). При завершении этапа первичной адгезии к поверхности материала в иммобилизованных бактериях активируются процессы деления и размножения с формированием микроколонии, создающих многослойные клеточные кластеры. В этом процессе принимают участие межклеточные адгезины и синтезируемые внеклеточные полимерные матричные молекулы, включающие белки и полисахариды. С увеличением бактериальной популяции клетки начинают продуцировать химические сигналы, с помощью которых, через системы «quorum sensing» (QS) контактируют с другими бактериальными клетками. Установлено, что данные механизмы способны регулировать широкий спектр физиологических процессов (Ильина и др., 2006), в том числе, активировать гены, ответственные за продукцию экзополисахаридов (Costerson et al., 1999). Продолжающийся рост прикрепленных микроорганизмов приводит к образованию бактериальных агрегатов, погруженных в экзополимерный матрикс, характерный для зрелых биопленок (Wilson, 2001). Под воздействием сильных механических и гидродинамических усилий, а так же регуляции по механизму QS зрелые биопленки могут вступать в процесс 14 диссеминации с высвобождением в окружающее пространство отдельных клеток или их кластеров. В дальнейшем отделившиеся фрагменты могут колонизировать другой район субстрата с образованием новых микроколоний или диссеминировать в пространстве и формировать очаги образования биопленок на отдаленных от локализации первоначальной пленки субстратах (Chmielewski and Frank, 2003). Протяженность процесса образования биопленок стафилококками, стрептококками и псевдомонадами чаще всего составляет около 2-4 дней и распределяется по основным этапам следующим образом: планктонные бактерии сорбируются на абиотической поверхности в течение нескольких минут (Frank, 2001); в течение последующих 2–4 ч образуются прочно соединенные микроколонии; в течение 6–12 часов с момента прикрепления к субстрату активируется продукция внеклеточных полисахаридов, и вместе с ней, появляется устойчивость к неблагоприятным условиям среды; затем в течение 2-4 дней в зависимости от вида бактерий и условий роста зрелые колонии биоплёнки, проходят процесс созревания и диссеминации от поверхности с высвобождением планктонных бактерий (Афиногенова и Даровская, 2011). 1.1.2. Структура биопленок С помощью современных видов микроскопии, таких как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, а так же молекулярных и электрохимических методов высокого разрешения были исследованы структурная организация и функции сообщества биопленок. Исходя из современных данных, зрелые биопленки представляют собой высокогетерогенное организованное сообщество, структура которого представляет микроколонии бактериальных клеток, заключенные в разделенный водными каналами внеклеточный полимерный матрикс (Donlan and Costerton, 2002). В основном, всем типам биопленок присущи некоторые универсальные структурные атрибуты, но, несмотря на это, каждое микробное сообщество уникально (Tolker-Nielsen and Molin, 2000). В зависимости от свойств поверхности, доступности питательных веществ, состава и уровня гетерогенности микробного сообщества и 15 гидродинамики структура биопленок может колебаться от модели плотной биопленки до рыхлой мозаичной модели, структура которой представляет собой сложную организацию, включающую грибоподобные агрегаты, разделенные водными пространствами (Николаев и Плакунов, 2007). Последний тип структуры обычно рассматривается как типичная архитектура биопленок (Costerton, 1995), характерная для сообществ, образованных при низких концентрациях питательных веществ, высоком сдвигающем усилии потока и отсутствии механических, абразивных и сжимающих сил (Wilson, 2001). Считается, что вода является главным компонентом матрикса биопленки, на долю которого приходится до 97% (Zhang et al., 1998). Тогда как содержание бактерий составляет 10–50% от общего объема биопленки (Costerton, 1995). Количество внеклеточных полимерных веществ колеблется в пределах 50–90% от общего количества органического углерода в биопленках (Flemming et al., 2000). Кроме полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот или фосфолипидов в матриксе биопленок также могут быть обнаружены другие неклеточные материалы, такие как кристаллы минеральных соединений или компоненты крови, присутствие которых зависит от окружающей среды, в которой развивалось это сообщество (Donlan, 2002). Водные каналы, которые отделяют погруженные в матрикс микроколонии, необходимы для поддержания жизнеспособности биопленки, так как они, представляя собой по сути сосуды, доставляют питательные вещества глубоко внутрь сложных сообществ (Stoodley et al., 2002), позволяя обмениваться продуктами метаболизма в слоях жидкостей (Costerton, 1995). Гидродинамический поток жидкостей над и внутри биопленок также может содействовать отделению от поверхности небольших фрагментов с живыми клетками, которые могут переноситься потоком жидкости и откладываться где-то в другом месте для дальнейшей колонизации поверхности во внутренней среде макроорганизма (Dunne, 2002). В биопленках клетки обмениваются информацией с помощью сигналов, так называемой системы QS, которые являются молекулами особых соединений, 16 способными регулировать экспрессию генов, чувствительных к плотности клеток (Kong et al., 2006). Сигнальные молекулы QS грамположительных бактерий чаще всего являются пептидами, сравнимыми с феромонами и гормонами, которые управляют клеточным делением, и, кроме того, уровнем плотности популяции биопленки, а так же продукцией экзополимерного матрикса (Donlan and Costerton, 2002; Kong et al., 2006). Сложный уровень структурной организации объясняет поразительную метаболическую эффективность микробных биопленок. 1.1.3. Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции Бактериальная рассматривается адгезия как к поверхности основополагающий медицинских механизм устройств возникновения внутрибольничных инфекций, т.е. инфекций, которые не были диагностированы на момент госпитализации пациента. Основными медицинскими имплантатами, которые подвергаются опасности инфицирования, являются внутривенные (центральные венозные катетеры); сердечнососудистые (сердечные клапаны, коронарные шунты); нейрохирургические (шунты желудочков, имплантируемые неврологические стимуляторы); ортопедические (артропротезы, устройства фиксации переломов); офтальмологические (большинство контактных линз) и стоматологические (зубные протезы) (von Eiff et al., 2005). Следует отметить, что поверхность катетеров, таких как центральный венозный катетер, внутривенный или мочевой катетеры, наиболее благоприятна для образования биопленок (Davey and O’Toole, 2000). Действительно, биоматериал-ассоциированные инфекции (БАИ), и, в частности, связанные с введением центрального венозного катетера, являются основной причиной развития бактериемии у госпитализированных пациентов (Elliott, 1993). При этом главным источником микробного инфицирования является место введения этих устройств в кожу, откуда бактерии мигрируют по внутрикожному пути на наружную поверхность катетера, приводя к последовательной внешней колонизации катетера или сепсису (Worthington et al., 2000). Таким образом, бактериальное обсеменение медицинских имплантатов способствует образованию на их поверхностях биопленок, которые обладают выраженной устойчивостью к факторам иммунной защиты хозяина (von Eiff et al., 17 1999) и антибиотикам (Donlan and Costerton, 2002). Повышение устойчивости бактерий в биопленках к химико-терапевтическим факторам является результатом высокой фильтрующей способностью биоплёнок (Чеботарь и др., 2012), а также увеличения числа резистентность фенотипических бактериальных изменений, клеток в среде которые обеспечивают биопленки, и индукции инактивирующих антибиотики ферментов (Gilbert et al., 1997). Многочисленные исследования биопленок показали, что основными микроорганизмами, имплантируемых ответственными устройствах за являются образование дрожжи биопленок (Candida на species), грамположительные (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans) и грамотрицательные (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) бактерии (Табл. 1) (Davey and O’Toole, 2000). Таблица 1 Заболевания или осложнения, обусловленные бактериальным инфицированием медицинских замещающих устройств Заболевание/ осложнение Эндокардит сердечных клапанов Кератиты (воспаление роговицы) Имплантат Обнаруженный микроорганизм Протезы клапанов S. epidermidis, S. sanguis Контактные линзы P. aeruginosa, S. epidermidis Сепсис, деструкция устройства Внутривенные катетеры Искусственное сердце Бактериурия Мочевые катетеры Сепсис, деструкция устройства Суставные протезы S. epidermidis, S. aureus Пневмония Эндотрахеальные трубки Деструкция протеза Голосовые протезы P. aeruginosa, E. coli, S. epidermidis, S. aureus Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Сепсис, эндокардит S. epidermidis, S. aureus P. aeruginosa, S. epidermidis, S. aureus E. coli, P. aeruginosa, E. faecalis, Proteus mirabilis 18 Выявлено, что в течение последних 20 лет у 6–14 % пациентов, помещенных в общий госпиталь, развиваются внутрибольничные инфекции (Vazquez-Aragon et al., 2003). В целом, до 65% всех нозокомиальных инфекций являются следствием развития и функционирования биопленок (Романова и Гинзбург, 2011). Данный факт позволяет рассматривать инфекции, связанные с образованием и функционированием биопленок, как основную причину заболеваемости и смертности. Кроме того, часто единственным выходом из таких состояний является хирургическое удаление инфицированных имплантированных устройств, которое, к сожалению, сопровождается дополнительными затратами материальных и человеческих ресурсов (Vinh and Embil, 2005; Wilson, 2001). 1.2. Бактерии рода Staphylococcus Бактерии рода Staphylococcus представляют собой грамположительные кокки, 0,5 – 1,5 мкм в диаметре и имеют низкое (около 33-40%) содержание Г+Ц в ДНК (Дерябин, 2000). Они чаще всего соединены в кластеры, которые напоминают гроздь винограда, но также могут встречаться в виде одиночных клеток или пар. Родовое имя Staphylococcus пришло из Греции (staphyle и kokkos), что означает «гроздь винограда», так как под микроскопом окрашенные по Граму бактерии очень часто напоминают такую же картину (Хоулт и др., 1997). Впервые стафилококки были выделены Розенбахом (Rosenbach, 1884), который описал две пигментированные колонии и предложил соответствующую номенклатуру: Staphylococcus aureus (желтые) и Staphylococcus albus (белые). Стафилококки являются факультативными анаэробами, энергетика роста которых обеспечивается аэробным дыханием либо путем анаэробного расщепления углеводов, конечным продуктом которого является молочная кислота (Хоулт и др., 1997; Götz et al., 2006). Характерной особенностью стафилококков является окружающая клеточную мембрану мощная клеточная стенка, содержащая до 60 слоев пептидогликана, а так же тейхоевые и липотейхоевые кислоты (Дерябин, 2000). Каталазный тест очень важен для различия стрептококков (каталазанегативные) от стафилококков, которые являются сильными продуцентами каталазы. Важной характеристикой этих 19 бактерий является высокая устойчивость к дегидратации (Хоулт и др., 1997), особенно когда они связаны с органическими субстратами, такими как кровь, гной и тканевые жидкости. В зависимости от способности к продукции коагулазы, внеклеточного фермента, превращающего фибриноген в фибрин и вызывающего свертывание крови, стафилококки подразделяются на коагулазоположительные и коагулазонегативные. К первой группе относятся 5 видов стафилококков, среди которых самым известным является S. aureus, тогда как большинство представителей рода Staphylococcus относятся ко второй группе (Vuong and Otto, 2002). Эти бактерии являются привычными обитателями кожных покровов, слизистых дыхательных путей, кишечника и влагалища. Так же они известны под названием пиогенные кокки, т.е. производящие гной кокки, и в определенных условиях вызывающие различные гноеродные заболевания у людей, включая абсцессы, карбункулы, фолликулиты, синдром ошпаренной кожи (Дерябин, 2000). К настоящему времени описано 42 вида бактерий, входящих в род Staphylococcus (Ghebremedhin et al., 2008), но S. aureus и S. epidermidis являются одними из наиболее значимых во взаимодействиях с человеком (Дерябин, 2000). Это связано с тем, что до 30% здоровых людей являются носителями S. aureus, который наиболее часто колонизирует слизистые оболочки носа (DeLeo et al., 2010). Обычно носительство протекает бессимптомно, но в случае ослабления иммунитета S. aureus способен вызвать гнойно-воспалительные процессы практически всех тканей (Lowy, 1998). Представители вида S. epidermidis так же обычно являются частью нормальной флоры кожи здоровых людей, но с ними связано большое число БАИ (Otto, 2009). 1.1.1. Бактерии вида S. epidermidis Вид S. epidermidis коагулазонегативных является наиболее стафилококков значительным (КНС) и представителем составляет самый распространенный вид, главными нишами обитания которого является кожа и слизистые человека и животных, представляя важную часть нормальной 20 микрофлоры – содержание всех стафилококков, выделенных из этих источников, составляет 65–90% от общей микрофлоры (Дерябин, 2000). Как уже упоминалось выше, с точки зрения диагностики КНС отличаются от S. aureus по отсутствию продукции коагулазы (Vuong and Otto, 2002). Кроме того, КНС можно разделить на 2 группы в соответствии с их устойчивостью или чувствительностью к действию новобиоцина (von Eiff et al., 2002; Дерябин, 2000). Вызываемая КНС бактериемия протекает, в основном, относительно легко и при соответствующем лечении быстро проходит. Вместе с тем имеются данные о смертельных исходах, в частности, у пациентов с ослабленным иммунитетом, а так же в случаях, когда инфекция вызвана несколькими вирулентными штаммами (Otto, 2009). 1.2.2. Роль S. epidermidis в БАИ В последние годы становится очевидным, что бактерии S. epidermidis являются одной из главных причин внутрибольничных БАИ (von Eiff et al., 2002; Hidron et al., 2008). Следовательно, штаммы S. epidermidis живут и как комменсалы, и как патогены, создавая стратегии для того, чтобы преобразовать госпитальную среду обитания в новую для себя экологическую нишу (Ziebuhr et al., 2006). Согласно последним данным, коагулазонегативные стафилококки занимают первое место среди инфекций кровотока, связанных с центральными венозными катетерами (20,5%), второе место среди хирургических инфекций (11,7%) и третье место среди всех инфекций (11,4%) (Sievert et al., 2013). Кроме БАИ бактерии S. epidermidis также ответственны за эндокардит клапанов у новорожденных пациентов (Nishizaki et al., 2013). Стафилококковые инфекции обычно развиваются при длительной госпитализации, а также у пациентов с ослабленным иммунитетом из-за приема иммунносупрессирующих препаратов или недоношенных детей (Ziebuhr et al., 2006). В отличие от S. aureus, которые вызывают острые инфекции, бактерии вида S. epidermidis в основном, являются этиологическими факторами хронических инфекций, которые длятся от месяца до года после введения протеза (Wilson and Devine, 2003). Важно отметить выраженную устойчивость и способность к 21 рецидивам инфекций S. epidermidis и проявление выраженной патогенности при проникновении во внутренние среды (Gill et al., 2005). Как уже было отмечено выше, развитие стафилококковых инфекции при заселении постоянных медицинских устройств включает два главных этапа: адгезию клеток S. epidermidis к поверхности биоматериала и аккумуляцию на ней клеток с образованием биопленок. Хотя второй этап является наиболее значимым на патогенетическом этапе возникающей стафилококковой инфекции (Batzilla et al., 2006), поиск путей предотвращения развития инфекции на этапе сорбции клеток к поверхности кажется более перспективным. 1.3. Факторы, влияющие на первые этапы образования биопленок 1.3.1. Окружающая среда Бактериальная адгезия определяется физико-химическими свойствами прикрепляющихся клеток, субстрата и окружающей среды (von Eiff et al., 2002). Большая часть факторов среды, такие как её состав (Hussain et al., 1992), гидродинамические условия (Neu and Marshall, 1990), температура (Fitzpatrick et al., 2005; Silva Meira da et al., 2012), время контакта, концентрация бактерий или присутствие антибиотиков и дезинфектантов (Cerca et al., 2005a; Стрелкова и др, 2012) могут влиять на бактериальную адгезию. Так, известно, что рост биопленок некоторых штаммов КНС индуцировался введением в среду инкубации глюкозы (Mack et al., 1992; Rachid et al., 2000), тогда как мальтоза, лактоза, глюкоза и сахароза ингибировали адгезию S. aureus к эритроцитам (Фалова, 2011). Возможно, такой механизм стимуляции адгезии и последующего развития биопленок S. epidermidis связан с антиоксидантным действием глюкозы (Aiassa et al., 2012). В проточных условиях показатели потока являются важным фактором в прикреплении бактерий к твердой поверхности (Stepanović et al., 2001). Адгезия бактерий оптимальна при сдвигающем усилии в пределах 60–80 дин/см2, но также возможна при силе сдвига до 1300 дин/см2 (An and Friedman, 2000). Сдвигающие усилия в пределах 0–100 дин/см2 лежат в области физиологических значений и встречаются в кровеносной системе человека (Goldsmith and Turitto, 1986). 22 Показано, что сдвигающее усилие в 18,2 дин/см2 не влияет на адгезию бактерий S. epidermidis к полиэтилену в фосфатном буфере (Wang et al., 1993), тогда как кинетика адгезии S. aureus к коллагену зависит от усилий сдвига в пределах от 0 до 15 дин/см2 (Li et al., 2000). Разнообразные исследования адгезии бактерий S. epidermidis и S. aureus показали зависимость этого процесса от температуры. Повышение температуры до 42°С стимулирует связывание бактерий S. epidermidis с поверхностью полистирола и последующее образование биопленок (Rachid et al., 2000). В то же время существуют данные, свидетельствующие о том, что понижение температуры среды до 30°С оказывает такой же стимулирующий эффект (Fitzpatrick et al., 2005). Повышение ионной силы раствора усиливает адгезию бактерий по сравнению с исходной при концентрации соли менее 0,1 M NaCl (Gordon and Millero, 1984). Однако, при более высоких значениях возможна вариабельность последствий. Так, повышение осмолярности среды путем добавления NaCl до 0,85 М способствует адгезии биопленко-отрицательного штамма S. epidermidis 220 на поверхности полистирола (Rachid et al., 2000). В то же время, есть данные о том, что 0,776 M NaCl в 10 раз снижает адгезию бактерий S. epidermidis RP62A, известных как продуцента полисахиридного межклеточного адгезина (PIA) (Stewart et al., 2013). Возможно, эти противоречивые данные отражают физикохимические особенности поверхности клеток указанных штаммов стафилококков. Содержание CO2 в среде (Hussain et al., 1992), как и кислотность (рН) среды культивирования также влияют на бактериальную адгезию. При снижении значений рН до 5,0 и 6,0 адгезия S. epidermidis, в основном, ниже, чем при рН 7,0 (Dunne Jr and Burd, 1992). Щелочные значения рН снижают как образование биопленок S. epidermidis, так и степень гидрофобности бактериальной поверхности (Nostro et al., 2012). Показано, что присутствие ионов железа стимулирует адгезию S. aureus (Lin et al., 2012). В то же время, ионы кальция оказывают противоположный эффект, вызывая зависимое от концентрации снижение образование биопленок S. aureus 23 (Shukla and Rao, 2013). Наличие в среде ионов магния и кальция в концентрации до 128 мМ существенно усиливает продукцию внеклеточных полимеров и образование биопленок 15 клиническими изолятами S. epidermidis, причем эффект ионов магния выражен в значительно большей степени (Dunne Jr and Burd, 1992). Показано, что содержание в среде высоких концентраций ЭДТА (до 40 мМ) приводит к снижению адгезии бактерий S. epidermidis (Dunne and Burd, 1992), Кроме того, присутствие в среде ЭДТА способно заметно снизить образование биопленок бактериями Listeria monocytogenes, не влияя на рост планктонных клеток, при этом внесение ионов двухвалентных металлов не восстанавливает прежний уровень биопленки, следовательно, действие ЭДТА основано не на хелатных свойствах этого соединения (Chang et al., 2012). Добавление в среду инкубации изопропанола и этанола индуцирует образование биопленок негативного по этому признаку штамма S. epidermidis (Chaieb et al., 2011; Rachid et al., 2000). Данный эффект был подтвержден для 18 из 37 клинических штаммов S. epidermidis, которые выявили повышение биопленкообразования в присутствии этих соединений (Knobloch et al., 2002). Перекись водорода и гидроксильные радикалы в концентрациях 0,5 и 0,05 мМ вызывают снижение адгезии E. coli, S. aureus, K. pneumoniae к эритроцитам на 7 – 17%. Одновременно с этим, выявлена стимуляция образования биопленок бактериями E. coli, S. aureus, K. pneumoniae на 11 – 40% активными формами кислорода (Бухарин и Сгибнев, 2012). В то же время показано, что перекись водорода в концентрации от 1 до 5% снижает образование биопленок. Однако, субингибиторные концентрации этого соединения (0,125 и 0,25%) стимулировали образование биопленок на поверхности полистирола бактериями штамма S. epidermidis S22, характеризующегося слабой способностью к формированию биопленок (Chaieb et al., 2011). Выявлено, что D-глюкозамин снижает адгезию S. epidermidis за счет опосредованного дозо-зависимого повышения в его присутствии концентрации активных форм кислорода (Aiassa et al., 2012). Внесение антибиотиков в среду инкубации также влияет на адгезию и размножение бактерий на атакованных поверхностях. Культивирование бактерий 24 S. epidermidis при субингибиторных (0,5хМПК) концентрациях цефазолина, клиндамицина и ванкомицина приводит к снижению адгезии на 30-80% (Pascual et al., 1986). Показано также, что субингибиторные концентрации ванкомицина, диклоксацилина и цефазолина способны ингибировать адгезию клеток КНС до 70% (Cerca et al., 2005a). Сублетальная доза ванкомицина уменьшает адгезию S. epidermidis в 10 раз (Stewart et al., 2013). Вместе с тем, имеются и противоположные данные, свидетельствующие о том, что субингибиторные концентрации эритромицина и тетрациклина повышают биопленкобразование S. epidermidis в 2,5 и 9 раз, соответственно (Rachid et al., 2000). Представленное выше позволяет считать, что факторы окружающей среды могут оказывать влияние на бактериальную адгезию либо путем изменения физико-химических взаимодействий между бактерий и поверхностью на первых этапах адгезии, либо изменяя поверхностные характеристики бактериальных клеток или материала. 1.3.2. Поверхность материала К факторам, которые могут влиять на адгезию бактерий к твердой поверхности, можно также отнести химический состав материала (Oga et al., 1993), поверхностный заряд (Hogt et al., 1985a), гидрофобность и свободную энергию поверхности (Oliveira et al., 2001), а также шероховатость поверхности (An et al., 1995). Согласно исследованиям Gristina с соавт. бактерии вида S. epidermidis предпочтительно прикрепляются к полимерным поверхностям, а микроорганизмы вида S. aureus – к металлическим (Gristina et al., 1987). Эти данные могут объяснить тот факт, что инфекции, вызываемые бактериями S. epidermidis, чаще всего ассоциированы с полимерными имплантатами, а бактерии вида S. aureus, обычно вызывают развитие БАИ, связанных с использованием металлических имплантатов. Выявлено, что гидроксиапатита была сравнению с поверхность наиболее поверхностями металлокерамики атакуемой нержавеющей бактериями стали, с добавлением S. epidermidis титана и титана по с 25 металлокерамическим покрытием (Oga, et al., 1993). Показано, что численность связывающихся с поверхностью металлов бактерий, зависит от типа металлических материалов (Shida et al., 2013). Обнаружено значительное количество соединений, покрытие которыми поверхностей различных материалов препятствует бактериальной адгезии. Например, использование детергентов (Bridgett et al., 1992), нестероидных противовоспалительных препаратов (Baveja et al., 2004; Flemming et al., 2000), а так же серебра (Marambio-Jones and Hoek, 2010) приводит к существенному снижению сорбции микробных клеток. Гидрофобность поверхности субстратов является одним из самых важных свойств, оказывающих влияние на процесс бактериальной адгезии (Wiencek and Fletcher, 1997). Действительно, показано, что гидрофильные материалы более устойчивы к бактериальной адгезии по сравнению гидрофобными (Cerca et al., 2005b; Hogt et al., 1985a). Возможно, это связано с тем, что в водных средах адгезия между гидрофобными поверхностями наиболее предпочтительна, так как они могут входить в наиболее близкий контакт путем слияния и удаления слоя воды между ними (Wuertz et al., 2008). Покрытие поверхности субстратов белками, снижающими гидрофобность, такими как бычий сывороточный альбумин (БСА), бычий гликопротеин или свободный от жирных кислот БСА, приводит к ингибированию бактериальной адгезии к «закрытой» поверхности (Fletcher and Marshall, 1982; Hogt et al., 1985a). Подобный эффект БСА проявляется на многих типах полимерных поверхностей (Brokke et al., 1991; Patel et al., 2007). Показано так же, что изменение гидрофобности поверхностей титановых материалов (An and Friedman, 2000) и полимеров (Bridgett et al., 1992) путем покрытия их полиэтиленоксидом приводит к сокращению адгезии бактерий S. epidermidis на 98 и 97%, соответственно. Гидрофобность поверхности материала оказывает большее влияние на бактериальную адгезию по сравнению с гидрофобностью самой бактериальной клетки, так как вне зависимости от значений собственной гидрофобности, адгезия бактерий S. epidermidis на поверхности гидрофобных материалов выше, чем на 26 гидрофильной поверхности стекла (Cerca et al., 2005b). Данный эффект сохраняется и при сдвигающих усилиях до 65 дин/см2 (Katsikogianni and Missirlis, 2004). Неровности поверхности материала обычно способствуют бактериальной адгезии и образованию биопленок (Scheuerman et al., 1998). Данный факт объясняется микровпадин, повышением которые как площади обеспечивают поверхности, более так и привлекательные количества места для колонизации (Katsikogianni and Missirlis, 2004). Однако, накопление бактерий в таких местах во многом зависит от размера бактерий и способа их деления. (Katainen et al., 2006). И хотя подчеркивается чрезвычайно важная связь между ранними этапами бактериальной адгезии и шероховатостью поверхности (Scheuerman et al., 1998), имеются данные, свидетельствующие о том, что зависимость между шероховатостью поверхности и бактериальной адгезией не всегда линейна (Boyd et al., 2002). Так, небольшие увеличения в шероховатости могут привести к большим изменениям в адгезии бактерий, в то время как большое увеличение шероховатости может и не оказывать значительного эффекта на прикрепление клеток. В то же время показано, что снижение шероховатости поверхности приводит к значительному увеличению числа сорбированных клеток (Mitik-Dineva et al., 2008). Кроме того, в опытах in vivo показано, что шероховатость поверхности ниже пороговой величины (Ra=200 нм) не влияла на бактериальную адгезию (Tang et al., 2009). В дополнение к этому на металлических пластинах было установлено, что средняя шероховатость менее 10 нм имеет ограниченное влияние на адгезию S. epidermidis (Shida et al., 2013). Тем не менее, несмотря на отрицание некоторыми авторами наличия корреляции между шероховатостью и бактериальной адгезией (Pereni et al., 2006), получены поверхности с субмикронной текстурой, способные противостоять связыванию с ними бактериальных клеток (Pogodin et al., 2013; Xu and Siedlecki, 2012a). 27 1.3.3. Характеристики бактериальной клетки Гидрофобность бактериальных клеток определяется архитектоникой поверхности их клеточных стенок, которая во многом отражает физиологическое состояние и условия обитания бактерий. Гидрофобность поверхности бактериальной клетки является важным физическим фактором, определяющим интенсивность адгезии, особенно когда поверхность субстрата обладает выраженными гидрофильными или гидрофобными свойствами. В основном, бактерии с гидрофобной поверхностью предпочитают материалы с такой же поверхностью, и наоборот, бактерии с выраженными обводненными внешними структурами предпочитают гидрофильные поверхности (Satou et al., 1988; Vacheethasanee et al., 1998). Интересно отметить, что, в целом, гидрофобные бактерии сорбируются в большей степени, чем гидрофильные бактерии (van Loosdrecht et al., 1987). Так же было показано, что гидрофобность бактерий S. epidermidis хорошо коррелирует с адгезией к полистиролу (Galliani et al., 1994). В случае же отделения клеток S. epidermidis с пониженной гидрофобностью с помощью обработки пепсином или экстракции водным раствором фенола, адгезия к фторэтиленпропилену заметно снижается или полностью сокращается (Pascual et al., 1986). Однако, следует отметить, что результаты исследований по влиянию степени гидрофобности поверхности бактериальной клетки на адгезию бактерий могут зависеть от особенностей методов проведения исследования, поскольку скорость сдвига или поверхностное натяжение жидкой фазы могут существенно влиять на этот эффект. Так, было показало, что степень гидрофобности бактерий имеет определяющее значение при низких (0 – 8 дин/см2) скоростях сдвига и в свободных от белка растворах (Vacheethasanee et al., 1998). Таким образом, при высоких скоростях сдвига или в других растворах влияние бактериальной гидрофобности проявляется в меньшей степени. Поверхностный заряд бактерий является другим важным физическим фактором, влияющим на взаимодействие бактерий с поверхностью. Однако, его 28 влияние ограничивается лишь первыми этапами бактериальной колонизации (Hogt et al., 1985a; Jucker et al., 1996). Известно, что в водных суспензиях большинство частиц обладает электрическим зарядом вследствие ионизации поверхностных групп. Этот поверхностный заряд привлекает из среды ионы с противоположным зарядом, формируя, тем самым, двойной электрический слой. Поверхностный заряд обычно характеризуется изоэлектрической точкой (Harden and Harris, 1953), электрокинетическим потенциалом (дзета-потенциалом) или электрофоретической подвижностью (Gilbert et al., 1991). Бактерии в водных суспензиях всегда заряжены отрицательно (Hogt et al., 1985a), при этом, несущие высокий поверхностный заряд, чаще всего имеют гидрофильную поверхность. Следует отметить, что и бактерии с гидрофобной поверхностью также могут иметь относительно высокий поверхностный заряд (Hogt et al., 1985a). Поверхностный заряд, так же как и гидрофобность, является видоспецифичным признаком, а так же зависит от среды роста, возраста бактериальной культуры и поверхностных структур клетки (Gilbert et al., 1991). Разнообразные поверхностно-ассоциированные макромолекулы, включая белки, являются активными участниками как первых этапов адгезии, так и последующего накопления клеток на атакованной ими поверхности (Sun et al., 2005). Белки клеточной стенки грамположительных бактерий составляют семейство поверхностных белков, которые напрямую взаимодействуют с белками хозяина (Navarre and Schneewind, 1999). Часто эти взаимодействия важны для бактериальной адгезии и защиты от иммунной системы хозяина. Кроме того, наиболее вероятно, что гидрофобность поверхности бактериальной клетки в большей степени определяется поверхностно-ассоциированными белками (Vadyvaloo and Otto, 2005), которые включают такие специфические адгезины, как поверхностные белки стафилококков «staphylococcal surface proteins» (SSP-1 и SSP-2) (Veenstra et al., 1996), основной аутолизин AtlE (Heilmann et al., 1997) и тейхоевые кислоты (Hussain et al., 2001) (Рисунок 1). 29 Основной аутолизин стафилококков AtlE – это белок с мол. массой 148 кДа, состоящий из двух бактериолитически активных доменов, обладающих амидазной (60 кДа) и глюкозаминидазной (52 кДа) активностями, который через гидрофобные взаимодействия помогает бактериям связываться непосредственно с полимерной поверхностью (Heilmann et al., 1997). Кроме того, этот белок так же способен участвовать на более поздних этапах взаимодействия бактерий с атакуемой поверхностью и развития биопленки, поскольку он так же обладает способностью к связыванию с витронектином – матричным белком хозяина (Heilmann et al., 1997). В дополнение к прямому действию на адгезию, AtlE обладает аутолитической активностью, благодаря которой происходит лизис части популяции бактерий, а высвобождающаяся внеклеточная ДНК (экзДНК) способствует образованию биопленок клетками оставшейся части популяции (Qin et al., 2007b). Рисунок 1. Схема механизмов адгезии, используемых бактериями S. epidermidis, на нативной и модифицированной белками полимерной поверхности (Mack et al., 2009). Fbe, SdrG – фибриноген-связывающий белок S. epidermidis, Embp – фибронектин-связывающий белок S. epidermidis, Aap – белок, связанный с накоплением, AtlE – аутолизин S. epidermidis, Aae – аутолизин/адгезин S. epidermidis, SSP-1 – поверхностный белок стафилококков, GehD – липаза S. epidermidis, SdrF – коллаген связывающий белок S. epidermidis, Teichoic acid – тейхоевые кислоты, PS/A – полисахарид/адгезин, eDNA – внеклеточная ДНК, Col – коллаген, Fg – фибриноген, Fn – фибронектин. Другие белки – SSP-1 и SSP-2 являются специфическими адгезинами с мол. массами, приблизительно, 280 и 250 кДа, соответственно. Они локализованы на 30 поверхностях бактериальных клеток в виде фимбриаподобных структур и способствуют взаимодействию S. epidermidis с нативной поверхностью биоматериалов, в частности, полистирола (Veenstra et al., 1996). Недавними исследованиями показано, что SSP-1 может быть связан с белком Aap, формирующим на поверхности бактерий S. epidermidis фибриллярные выросты, способствующие закреплению клеток на поверхности (Macintosh et al., 2009). В адгезии бактерий S. epidermidis так же могут принимать участие и тейхоевые кислоты – поверхностно-заряженные полимеры, которые составляют существенную часть клеточной стенки многих стафилококков (Потехина, 2006). Их роль в первичном прикреплении особенно ярко проявляется усилением адгезии бактерий S. epidermidis к иммобилизованному Фн (Hussain et al., 2001). Все поверхностные белки, способные связываться с компонентами матрикса хозяина, были определены как MSCRAMM (Patti et al., 1994). В большинстве случаев, MSCRAMM ковалентно связаны с клеточной стенкой бактерий (Patti et al., 1994) и способны связывать больше, чем один матричный компонент хозяина (Navarre and Schneewind, 1999). На поверхности бактерий S. epidermidis HB и NCTC11047 были обнаружены белки Fbe/SdrG и Embp с высоким сродством к фибриногену и фибронектину, соответственно (Hartford et al., 2001a; Williams et al., 2002). Гены, кодирующие белок Fbe/SdrG, часто встречаются у клинических бактериальных изолятов (Hartford et al., 2001a; Rohde et al., 2007). В связи с высокой вариабельностью экспрессии этих генов многие штаммы не обладают способность связывать фибриноген (Arrecubieta et al., 2007). Кроме того, в клинических изолятах S. epidermidis часто встречается гигантский белок Embp (Rohde et al., 2007) с мол. массой 1000 кДа (Williams et al., 2002). Показано, что связывание этого белка и фибронектина происходит через N-терминальный конец последнего (Jarvis and Bryers, 2005). Показано, что секретируемая бактериями S. epidermidis липаза GehD специфически связывается с коллагеном, тем самым способствуя прикреплению к коллаген-покрытым поверхностям (Bowden et al., 2002). Недавно было 31 обнаружено, что поверхностный белок бактерий S. epidermidis SdrF так же отвечает за специфическое связывание с коллагеном I типа (Arrecubieta et al., 2007). Однако, некоторые другие белки также важны для образования биопленок. Например, ассоциированный с накоплением белок (accumulation-associated protein, Aap) с мол. массой 140 кДа является необходимым для образования биопленок некоторыми штаммами S. epidermidis (Hussain et al., 1997). Кроме того, предполагается, что Aap играет роль в удерживании PIA на поверхности клетки S. epidermidis, так как мутанты по гену aap, продуцируют PIA, который слабо прикрепляется к поверхности бактерий (Hussain et al., 1997). В более поздних исследованиях (Rohde et al., 2005) предполагалось, что Aap с мол. массой 140 кДа является усеченной изоформой более крупного Aap с мол. массой 220 кДа, и что именно меньший белок участвует в аккумуляции биопленок независимо от PIA. Было показано, что это изменение размера белковой молекулы необходимо для образования биопленок, так как способность штамма S. epidermidis 1585 формировать биопленку появляется лишь при усеченной форме Aap, и это свойство терялось, когда экспрессировался полноразмерный Aap (Rohde et al., 2005). Продукция Aap часто встречается в клинических изолятах S. epidermidis (Rohde et al., 2004), однако, механизм, благодаря которому Aap служит связующим звеном в образовании биопленок, до сих пор не известен. При этом показано, что Aap может как секретироваться во внеклеточное пространство, так и накапливаться на клеточной стенке S. epidermidis (Sun et al., 2005). Предполагается, что другой белок – Bhp, заякоренный в клеточной стенке бактерий S. epidermidis и гомологичный белку Bap у S.aureus, тоже усиливает межклеточную адгезию во время образования биопленок бактериями S. epidermidis (Cucarella et al., 2001). Белок Bhp обнаруживается у 10-19% клинических изолятов S. epidermidis (Cucarella et al., 2001). Сходство последовательностей позволяет предположить, что bhp гены также вовлечены в образование биопленок клиническими изолятами S. epidermidis, как это показано для генов bap в животных изолятах S. aureus. Однако, механизм, благодаря 32 которому белки Bap и Bhp способствуют образованию биопленок, пока неизвестен (Vadyvaloo and Otto, 2005). В процессе образования биопленок стафилококков не последнюю роль играет и экзДНК, так как разрушение этого полимера под действием ДНКаза I типа вызывает снижение темпов формирование биопленок в момент образования, а также разрушает уже сформированные пленки (Izano et al., 2008; Tetz et al., 2009; Qin et al., 2007b). Кроме того, удаление внеклеточной ДНК с помощью обработки ДНКазой или отсутствие её вследствие мутации (∆atlE) значительно сокращает количество сорбированных клеток, находящихся в больших агрегатах (Das et al., 2010). В первичном прикреплении к немодифицированной поверхности силиконовых катетеров участвует капсульный полисахаридный адгезин PS/A, обнаруженный на поверхности бактерий S. epidermidis RP62A. Позднее было показано, что, по-видимому, он идентичен полисахаридному межклеточному адгезину (PIA) S. epidermidis (Sadovskaya et al., 2005) Первичное прикрепление запускает процесс межклеточной адгезии, во время которой бактерии начинают размножаться и создавать многослойные клеточные кластеры (von Eiff et al., 2002). Для большинства КНС ключевым фактором для адгезии и последующей аккумуляции биопленок является синтез полисахаридного межклеточного адгезина – PIA (McKenney et al., 1998). PIA представляется собой полимер N-ацетилглюкозамина, синтезируемый ферментами, закодированными в ica опероне, и ответственный за формирование связующего компонента биопленки (Mack, 1999). Продукция PIA и связанное с этим формирование биопленки зависит от различных факторов среды – уровня осмолярности, наличия глюкозы, этанола, аэрации, температуры и субингибиторных концентраций антибиотиков (Tormo et al., 2005). 1.3.4. Белки сыворотки и тканей человека В условиях in vivo непосредственное взаимодействие между бактериальной клеткой и свободной абиотической поверхностью играет минимальную роль, так как после контакта с кровью поверхностью субстрата почти мгновенно 33 покрывается белками сыворотки или тканей (Herrmann et al., 1988; Ishiguro et al., 2005). Эта «кондиционная пленка» способна изменять физико-химические свойства поверхности, влияющие на бактериальную адгезию (Fletcher, 1976). Известно, что белки крови и тканей (альбумин, фибронектин, фибриноген, ламинин, а так же денатурированный коллаген) способны усиливать или снижать бактериальную адгезию путем связывания с поверхностью субстрата или с бактериальной поверхностью (Brokke et al., 1991). Следует отметить, что большинство связей между бактериями и белками в гетерогенных системах являются специфическими лиганд-рецепторными взаимодействиями. Показано, что на покрытых плазмой крови поверхностях фторэтиленпропилена адгезия всех штаммов КНС была значительно ниже, чем на необработанных контрольных поверхностях (Hogt et al., 1985b). Pascual с соавт. впервые обнаружили, что прединкубация тефлоновых катетеров в сыворотке крови человека снижает адгезию S. epidermidis на 80–90% (Pascual et al., 1986). Значительное сокращение числа сорбированных клеток S. epidermidis в присутствии сыворотки или плазмы обнаруживается и на поверхностях полиуретана, причем подобное действие оказывает и прединкубация бактерий S. epidermidis в сыворотке (Ardehali et al., 2003). Предполагается, что такое ингибиторное действие сыворотки и плазмы, в основном, связано с взаимодействием с альбумином, в то время как антитела IgG и Фн оказывают значительно меньшее действие. Скорее всего, это связано, вопервых, с высоким содержанием альбумина в сыворотке крови (35–50г/л) (Грызунов, Добрецов, 1994), во-вторых, с тем, что при контакте поверхности субстрата с кровью, альбумин адсорбируется первым, затем он замещается IgG, которые в свою очередь, замещается Фн и высокомолекулярным киногеном. Данный процесс последовательной адсорбции и десорбции сывороточных белков крови на абиотической поверхности известен как Вромановский эффект (Vroman et al., 1980). Имеются сведения о том, что ингибирование бактериальной адгезии сывороткой крови в значительной степени связано с апо-трансферрином (Ardehali et al., 2003). 34 Получены многочисленные данные о том, что сам альбумин в чистом виде, адсорбированный на поверхности, оказывает заметный ингибирующий эффект на бактериальную адгезию к поверхности полимеров (Brokke et al., 1991; Fletcher and Marshall, 1982; Hogt et al., 1985a; Linnes et al., 2012; Pascual et al., 1986) и металлов (Kinnari et al., 2005). Кроме того, в условиях in vivo животные с имплантатами, покрытыми альбумином, имели более низкую скорость инфицирования (27 %), чем в случаях использования имплантатов без покрытия (62 %) (An et al., 1997). В связи с тем, что в опытах с 125 I-меченным альбумином показано, что клетки стафилококков не сорбируют этот белок (Brokke et al., 1991), считается, что механизм ингибиторного действия альбумина на бактериальную адгезию связан с изменением гидрофобности поверхности субстрата, что проявляется в снижении контактного угла смачивания полистирола (Fletcher, 1976) и фторэтиленпропилена (Hogt et al., 1985a) после адсорбции на них бычьего сывороточного альбумина (БСА). Первоначально фибронектин был описан как посредник адгезии эукариотических клеток к поверхностям и позднее была показана его способность связываться непосредственно с поверхностью бактериальных клеток S. aureus (Kuusela, 1978). Фн явно стимулирует адгезию S. aureus к поверхности субстратов (O’Neill et al., 2008; Vaudaux et al., 1984). Однако, существуют противоположные мнения относительно влияния Фн на адгезию S. epidermidis к поверхности медицинских материалов. Действительно, часть исследователей утверждает, что покрытие поверхности Фн стимулирует адгезию бактерий S. epidermidis (Herrmann et al., 1988; Hussain et al., 2001; Schroeder et al., 2008; Xu and Siedlecki, 2012b), в тоже время другие авторы сообщают о том, что предобработка поверхности Фн ведет к уменьшению количества сорбированных бактерий S. epidermidis или не оказывает существенного эффекта (Brokke et al., 1991; An et al., 1995; Galliani et al., 1994; Linnes et al., 2012). По-видимому, данная вариабельность результатов свидетельствуют о наличии специфического лигандрецепторного взаимодействия поверхностных белковых структур клеточной стенки стафилококков со связанным с поверхностями Фн. Этот факт был 35 подтвержден при обнаружении на поверхности бактерий S. epidermidis NCTC11047 белка Embp, обладающего высоким сродством связывания к Фн (Williams et al., 2002). Фибриноген (Фг) также является важным компонентом сыворотки крови, который участвует в бактериальной адгезии к биоматериалам и тканям хозяина. Показано, что адсорбированный Фг способствует адгезии бактерий, особенно стафилококков, к биоматериалам (Dickinson et al., 1997). Так, адсорбция Фг на на полиметилметакрилатных стеклах стимулировала адгезию всех использованных к работе штаммов S. aureus и нескольких штаммов КНС (Herrmann et al., 1988). При исследовании in vitro предобработка этим белком только бактериальных клеток или как бактерий, так и полиэтиленовых катетеров усиливала бактериальную адгезию. По предположению авторов, данный эффект возможен из-за наличия лигандов для Фг на поверхности клеток стафилококков (Brokke et al., 1991), которые, действительно, позднее были обнаружены и названы Fbe/SdrG (Hartford et al., 2001a). Однако, несмотря на то, что по данным ПЦР-анализа большая часть клинических изолятов S. epidermidis несет ген fbe (Hartford et al., 2001a; Rohde et al., 2007), наблюдается высокая гетерогенность адгезионной активности бактерий S. epidermidis в отношении Фг-покрытой поверхности (Arrecubieta et al., 2007). Данный факт может отражать разный уровень экспрессии белка Fbe бактериями различных штаммах или может свидетельствовать о том, что Fbe связывает лиганды, отличные от Фг, когда экспонирован на поверхности клетки. Другим важным фактором в функционировании сосудистых протезов и других имплантируемых устройств является коллаген, который так же может выступать матриксом для колонизации бактерий. В основном, присутствие коллагена имеет сходный с фибронектином эффект и проявляется в стимуляции адгезию S. aureus (Vaudaux et al., 1984). Позднее, у бактерий S. epidermidis была обнаружена липаза GehD и поверхностный белок SdrF, которые отвечают за специфическое связыванием с коллагеном (Bowden et al., 2002; Arrecubieta et al., 2007). 36 1.4. Антибактериальные пептиды Антимикробные иммунитета всех пептиды (АМП) многоклеточных являются организмов, а частью также врожденного продуцируются одноклеточными организмами для подавления ближайшего бактериального окружения (Guaní-Guerra et al., 2010). К настоящему моменту описано 2439 АМП, из них большая часть выделена из эукариотических организмов и лишь около 10% принадлежит к классу бактериальных бактериоцинов (The Antimicrobial Peptide Database). Хотя АМП составляют семейство очень гетерогенных по своей структуре и составу соединений, как правило, это небольшие пептиды из 12-50 аминокислот, с мол. массой до 5 кДа и со значительным содержанием катионных аминокислот, определяющих общий положительный заряд их молекул. В составе некоторых АМП обнаруживаются редкие аминокислоты, например, D-аланин, лантионин, дегидроаланин или дегидробутират (Guaní-Guerra et al., 2010). Суммарный положительный заряд позволяет молекулам АМП связываться с анионными группировками клеточных оболочек бактерий. Дальнейшее электростатическое взаимодействие пептидов с плазматическими мембранами приводит к формированию нерегулируемых каналов и пор, что в итоге приводит к гибели атакованных клеток (Shai, 1999). Среди существующих моделей действия антибактериальных пептидов есть и, так называемая, «ковровая» модель, в которой положительно заряженные молекулы пептидов сорбируются отрицательно заряженном листке молекулярный «ковер», внешнем который при мембраны насыщении бактерии, пептидами на образуя начинает разрываться на фрагменты (Wimley, 2010). Помимо этого, имеются данные, указывающие на способность пептидов облегчать поступление в бактериальные клетки различных биологически активных агентов, в частности, β-лактамов, ванкомицина и других антибиотиков, в результате чего при совместном применении значительно возрастает эффективность действия антибиотиков на патогенные бактерии, в том числе, и антибиотикорезистентные штаммы (Vivès et al., 2008). Кроме того, проникая в цитоплазму бактерий, антимикробные пептиды, будучи заряжены положительно, 37 связываются с клеточными полианионами (такими как ДНК и РНК), что также приводит к гибели бактериальных клеток (Sang and Blecha, 2008). Помимо выраженного антибактериального действия, катионные пептиды проявляют высокий аффинитет и нейтрализуют липополисахариды, предупреждая тем самым развитие токсического шока при септических состояниях (Giuliani et al., 2010). Таким образом, по формирующемуся мнению, катионные пептиды могут заменить традиционные антибиотики в качестве эффективных природных лечебных факторов (Vaara, 2009). Известно, что АМП проявляют свое литическое действие не только в отношении планктонных культур, но и способны разрушать уже сформировавшиеся биопленки, в частности, стафилококков (Sandiford, Upton, 2012). Кроме того, показано, что некоторые АМП оказываются особенно эффективными на начальном этапе образования биопленок. Так, кателицидин LL37 человека ингибирует адгезию и формирование биопленок S. epidermidis и способен существенно снижать биомассу уже образованных биопленок, хотя он и не относится непосредственно к группе АМП (Overhage et al., 2008). Выделенный из штамма S. epidermidis 224 эпидермицин NI01 эффективен в отношении формирующих биопленки штаммов S. aureus и S. epidermidis (Sandiford, Upton, 2012). Кроме того, особое внимание уделяется возможности подавления бактериального прикрепления и колонизации имплантатов за счет покрытия поверхностей перспективных, антимикробными рассматриваются агентами, среди которых, низкомолекулярные их в качестве катионные пептиды бактерий (Fontana et al., 2006). Показано, что низин способен адсорбироваться на полимерных поверхностях без снижения присущей ему антибактериальной активности, проявляя при этом бактерицидное действие на прикрепляющиеся к поверхности бактерии (Bower et al., 1998). В опытах in vitro установлено, что другие бактериальные АМП (Рер5 и эпидермин) при предобработке ими поверхностей силиконовых катетеров существенно замедляют образование биопленок S. epidermidis, а при действии пептидов на связавшиеся бактерии 38 количество жизнеспособных клеток значительно снижается (Fontana et al., 2006). Получены и другие данные об эффективности покрытия на основе АМП в предотвращении бактериальной адгезии на различных полимерных поверхностях (Costa et al., 2011; Rapsch et al., 2014), а так же на поверхностях титана и их производных (Yoshinari et al., 2010; Трахтенберг и др., 2013) Механизм действия АМП может быть связан не только с их бактерицидной активностью. Так, показано, что пептид LL-37, выделенный из лейкоцитов человека, ингибирует образование биопленок за счет влияния на гены, участвующие в процессах формирования биопленок (Overhage et al., 2008). Возможно, такой механизм связан с управлением, например, agr системой, способной активироваться короткими аутоиндукторными пептидами (Donlan, Costerton, 2002). Подобный эффект ингибирования образования биопленок бактерий S. epidermidis также обнаружен у АМП гепцидин 20, выделенного из гепатоцитов человека (Brancatisano et al., 2014). Таким образом, разнообразие механизмов действия катионных пептидов и способность убивать медленно растущие и покоящиеся клетки, которые преобладают в биопленках, а так же синергизм действия АМП с некоторыми антибиотиками делает их привлекательными соединениями в новых подходах к подавлению биопленок. 39 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Бактериальные штаммы и среды В качестве объектов исследований были использованы штаммы бактерий S. epidermidis GISK 33 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ГИСК им Л.А. Тарасевича, сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, г. Москва), а так же S. epidermidis ATCC®12228 и S. epidermidis ATCC®29887. Для оценки влияния неродственной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis использовали препарат, полученный из бактерий Propionibacterium acnes АС 1450 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Москва). Все использованные в экспериментах химические реагенты имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или о.с.ч. (Россия; «Difco», США; «Sigma-Aldrich», США). Бактерии культивировали на жидкой питательной среде Luria-Bertani – LB (Atlas, 1993), содержащей 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,64% KCl, рН 7,1–7,2. Для получения плотной среды LB к указанным компонентам добавляли 1,4% агара. Тестирование бактерий S. epidermidis на способность к секреции полисахаридного межклеточного адгезина (PIA) проводили на агаризованной среде LB с добавлением 0,08% индикатора Конго красный. Для выявления антибактериальной активности катионных пептидов варнерина и хоминина использовали среду LB, не содержащую KCl. Для изучения действия различных факторов среды на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis использовали полноценную или не содержащую KCl среду LB, с добавлением веществ, представленных в Таблице 2. В ряде экспериментов для изучения адгезии, несвязанной с ростом бактерий, в качестве среды использовали 10 мМ натрий-фосфатный буфер (ФБ) (рН 7,2) или изотонический раствор NaCl (0,9%, рН 7,0), а также 10-6 М растворы валиномицина и СССР в трис-HCl буфере (10 мМ, рН 7,2) с добавлением 50 мМ KCl и нигерицина в трис-HCl буфере (10 мМ, рН 6,0) с добавлением 50 мМ KCl. 40 Таблица 2 Перечень соединений, вносимых в среду LB, для изучения действия факторов среды на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Фактор Действующее вещество рН 0,1M HCl или 0,1M KOH Осмолярность среды Глюкоза Ионы металлов 7,0 и 8,0 Среда LB, не содержащая 40% водный раствор глюкозы 0,1; 0,2 и 0,5% 1M растворы MgCl2, CaCl2, ZnCl2, 0,05; 0,1; 0,5; Среда LB, не содержащая и MnCl2 1,0 и 2,5 мМ KCl, с добавлением воды 0,25; 0,5; 1,0; Среда LB с добавлением 5,0 и 10,0 мМ воды 0; 2; 5; 10 и Среда LB с добавлением 15% воды Этанол 96% этанол 3% водный раствор H2O2 0,004% Водные растворы тритона X-100, Детергенты Среда LB с рН 7,1–7,2 50; 100;150 мМ 1,0 М ЭДТА ный стресс pH 4,0; 5,0; 6,0; Контроль 0,5M NaCl и 0,5M KCl Хелатор Окислитель- Конечное содержание в среде додецилсульфата натрия (SDS) 0,1×МПК цетавлона (1хМПК) KCl, с добавлением воды Среда LB с добавлением воды Среда LB с добавлением воды Среда LB с добавлением воды Водные растворы нативного и Лизоцим инактивированного (10 мин на 1; 2,5; 5 и 10 Среда LB с добавлением водяной бане) лизоцима в воде мкг/мл воды (100 мкг/мл) Лизостафин Водный раствор лизостафина (1 мкг/мл) 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1 мкг/мл Среда LB с добавлением воды Растворы нативных и инактивированных (10 мин на Протеазы водяной бане) трипсина и протеазы 100 мкг/мл из Streptomyces griseus (2 мг/мл) Среда LB с добавлением ФБ (10 мМ, рН 8,0) в ФБ (рН 8,0) РНКаза Раствор РНКазы I типа (1 мг/мл) в ФБ 100 мкг/мл Среда LB с добавлением ФБ 41 Растворы нативной и инактивированной (15 мин на ДНКаза водяной бане) ДНКазы I типа (1 мг/мл) в трис-HCl буфере (10 мМ, Среда LB с добавлением 100 мкг/мл Трис-HCl (10мМ, рН 7,2) с конечным содержанием 5 мМ Mg2+ рН 7,2) с конечным содержанием 5 мМ Mg2+ Водные растворы ДНК из селезенки крупного рогатого скота (КРС) ДНК (5 мг/мл) или полной геномной ДНК, 5 мкг/мл Среда LB с добавлением воды выделенной из S. epidermidis или P. acnes Периодат 0,1 М водный раствор периодата натрия натрия Мембранотропные соединения Антибиотик Антибактериальные Среда LB с добавлением 10 мМ воды 1 мМ спиртовые растворы валиномицина, нигерицина и карбонил-цианид-m- Среда LB с добавлением 10-6 М 96% этанола хлорфенилгидразона (CCCP) Водный раствор линезолида 0,05 и 0,5 Среда LB с добавлением (2 мг/мл) мкг/мл воды Водные растворы низина, варнерина и хоминина* пептиды указано далее Среда LB с добавлением воды ______________________________ *Использованные в работе препараты низкомолекулярных катионных пептидов варнерина и хоминина были выделены в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (зав. лабораторией В.П. Коробов) (Коробов и др., 2010). В ряде экспериментов использовали донорскую плазму крови человека, бычий сывороточный альбумин (БСА) и фибронектин человека (Фн). Для получения плазмы цельную кровь здоровых доноров собирали в пробирки с ЭДТА («Improvacuter», центрифугированием Китай) и (3500хg, 5 форменные мин, 5415R, элементы крови отделяли «Eppendorf», Германия). Надосадочную жидкость использовали для приготовления 10 об.% раствора плазмы в 0,9% NaCl. Растворы БСА (5 мг/мл) и фибронектина (25 мкг/мл) готовили из лиофилизированных коммерческих препаратов в этом же растворе NaCl. 42 2.2. Культивирование и подготовка бактерий S. epidermidis Бактерии S. epidermidis переносили со скошенного LB-агара в жидкую питательную среду LB и культивировали в термостате при 37°С в течение 14– 16 ч, затем культуру пересевали в свежую среду LB и выращивали при 37°С на шейкере Certomax IS («Sartorius», Германия) с аэрацией (160 об/мин) до достижения бактериальной популяцией логарифмической или стационарной фаз роста, затем клетки осаждали на центрифуге 5415R («Eppendorf», Германия) в течение 5 мин при 12000хg, осадки дважды промывали 0,9% раствором NаCl, используя те же условия осаждения клеток, после чего суспендировали до содержания бактерий 108 КОЕ/мл в среде LB, если исследовали действие факторов в питательной среде, или в ФБ в случае дальнейших исследований в ФБ или 0,9% растворе NаCl. 2.3. Определение количества колониеобразующих единиц Количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) выявляли микрометодом точечных высевов последовательных десятикратных разведений бактериальных суспензий на агаризованную среду LB (Herigstad et al., 2001). 2.4. Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина Тестирование бактерий S. epidermidis на способность к секреции полисахаридного межклеточного адгезина (PIA) проводили с использованием среды с добавлением индикатора Конго красный (Freeman et al., 1989). Для постановки данного теста в чашки Петри вносили 15 мл агаризованной среды, содержащей 0,08% Конго красного. После затвердевания среды производили посев суточных культур стафилококков, выращенных на LB с добавлением 0,5% глюкозы. Инкубацию проводили в термостате в течение 24 ч при 37 °С, после чего фиксировали результат. 2.5. Определение минимальной подавляющей концентрации Минимальные подавляющие концентрации (МПК) ЭДТА, детергентов и линезолида для всех исследуемых штаммов определяли методом серийных разведений согласно МУК 4.2.1890-04. 43 Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа («Медполимер», Россия) вносили по 100 мкл среды LB, затем в первую лунку ряда вносили 100 мкл раствора исследуемого соединения и готовили серию двукратных разведений. Затем в каждую лунку вносили 10 мкл суспензии клеток исследуемого штамма S. epidermidis, содержащей 1×106 КОЕ/мл. Результаты оценивали через 16-18 ч культивирования при 37°С. В качестве МПК принимали самую низкую концентрацию препаратов, вызывающую полную задержку роста бактерий. МПК катионных пептидов (варнерина и хоминина) определяли указанным выше способом с последующим установлением содержания антибактериальных пептидов в образце путем сравнения МПК исследуемого препарата для бактерий S. epidermidis GISK 33 со значением МПК референс-образца с точно известным количеством антибактериального пептида. Количество пептида в референс-образце было установлено с помощью аминокислотного анализа очищенного гомогенного препарата варнерина и хоминина. * 2.6. Определение дзета-потенциала бактериальных клеток Дзета-потенциал бактерий S. epidermidis определяли на лазерном анализаторе размера частиц и дзета-потенциала Zetasizer NanoZS («Malvern», Великобритания) с программным обеспечением «ZetaSizer Software 6.20» («Malvern», Великобритания) методом динамического светорассеяния под углом 90° по изменению распределения частиц в электрическом поле. Для этого отмытые бактериальные клетки S. epidermidis непосредственно перед измерением суспендировали до содержания 107 КОЕ/мл в питательной среде LB без KCl, содержащей двухвалентные ионы кальция, магния, цинка или марганца в определенной концентрации и проводили измерения при 37°С в течение 30 мин. _________________________ *Исследования проведены научным руководителем работы В.П. Коробовым в лаборатории биохимии пептидов Абердинского университета (Абердин, Великобритания) 44 2.7. Выделение полной геномной ДНК Для оценки действия внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 использовали препараты полной геномной ДНК, выделенные из бактерий этого штамма и из бактерий P. acnes AC 1450. Для этого из ночных культур бактерий этих штаммов, выращенных на среде LB, выделяли полную геномную ДНК с применением набора «Bacterial Genomic DNA Miniperp Kit» («Axygen», США) по прописи фирмы-изготовителя. Количество полученной ДНК определяли по степени поглощения на спектрофотометре UV-1700 («Zhimadzu», Япония) при длине волны 260 нм. В качестве референс-образца использовали раствор препарата ДНК КРС. Затем полученные препараты ДНК вносили в питательную среду LB до одинаковой конечной концентрации и использовали в экспериментах. 2.8. Предобработка поверхности полистирола плазмой, сывороточными белками и катионными пептидами На поверхность полистироловых чашек Петри (диаметр 40 мм, «Медполимер», Россия) наносили по 2 мл подготовленных растворов плазмы крови человека (10 об.%), БСА (5 мг/мл), Фн (25 мкг/мл), варнерина (32 мкг/мл) или хоминина (32 мкг/мл). В качестве контролей использовали чашки, предобработанные 0,9% раствором NaCl. Предобработку поверхностей чашек Петри проводили в течение 60 мин при 37°С, затем жидкие среды удаляли аспирацией, чашки однократно промывали 2 мл ФБ (10 мМ, рН 7,2) и на поверхность чашек наносили бактериальные суспензии. 2.9. Определение гидрофобности поверхностей бактериальных клеток и полистирола Уровень гидрофобности поверхностей бактерий S. epidermidis определяли с помощью BATH-теста в двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg, et al., 1980). Для этого подготовленные бактериальные клетки ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl до OD600 0,3–0,5. Готовые суспензии (1,2 мл) вносили в фотометрические откалиброванные пробирки диаметром 10 мм, а затем на их поверхность аккуратно наслаивали по 0,2 мл гексадекана и измеряли оптическую 45 плотность водной фазы (А0) при 600 нм на спектрофотометре PD-303 («Apel», Япония). Затем пробирки выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре для насыщения, интенсивно перемешивали на вортексе («Biosan», Латвия) на максимальной скорости в течение 120 с и оставляли при комнатной температуре на 15 мин для полного расслаивания эмульсии, после чего снова измеряли оптическую плотность водной фазы (А1). В контрольные пробы вносили 0,9% раствор NaCl. Степень гидрофобности (Af, %) определяли по формуле (1): Af = ((A0 – A1)/A0)×100 (1) Определение уровня гидрофобности поверхностей полистирола проводили путем измерением краевого угла смачивания по модифицированному методу сидячей капли. На исследуемую поверхность наносили несколько капель дистиллированной воды объемом 10 мкл, затем в течение 60 с после контакта фотографировали профиль полученных капель, используя цифровую фотокамеру D90 («Nikon», Япония). После чего на полученных фотографиях c помощью программного обеспечения «GIMP 2.0» вручную измеряли радиус (r) и высоту (h) капли. Контактный угол (θ, °) вычисляли по формуле (2) (Yuan and Lee, 2013) θ =2×arctg(h/r) (2) 2.10. Предобработка бактериальных клеток гидролитическими ферментами и антибактериальными пептидами Отмытые клетки бактерий S. epidermidis 33 суспендировали в 0,9% растворе NaCl до 108 КОЕ/мл, осаждали на центрифуге (12000хg, 5 мин), затем осажденные клетки ресуспендировали в растворах трипсина (0,5 мг/мл), протеазы из Streptomyces griseus (0,5 мг/мл) или лизоцима (10 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 мин при 37° С. В случае предобработки варнерином (0,5 мкг/мл) инкубацию проводили в течение 60 мин при 37° С и перемешивании 160 об/мин. В контрольных образцы вносили 0,9% раствор NaCl или соответствующий буферный раствор без фермента. Затем клетки дважды промывали от ферментов с помощью 0,9% раствора NaCl и от варнерина, используя 0,5 М раствор NaCl или 10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,2). Полученные осадки ресуспендировали в 46 питательной среде LB до концентрации 107 КОЕ/мл и исследовали адгезионные свойства бактериальных клеток. 2.11. Определение адгезионной способности бактериальных клеток Для определения адгезии на поверхности полистирола подготовленные суспензии бактерий S. epidermidis логарифмической или стационарной фаз роста доводили до концентрации 107 КОЕ/мл в исследуемой среде. Полученные бактериальные суспензии вносили по 2 мл в полистироловые чашки Петри (диаметр 40 мм, «Медполимер», Россия) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С без перемешивания. После инкубации жидкую часть культур осторожно удаляли, а поверхности чашек трижды промывали ФБ для удаления планктонных бактерий. После высушивания в течение 30 мин при 37°С связавшиеся с поверхностью бактериальные клетки окрашивали раствором кристаллического фиолетового (0,1%) в течение 2 мин, отмывали от красителя деионизированной водой, высушивали на воздухе и подсчитывали их количество с помощью микровизора μViso-103 («Ломо», Россия), просматривая не менее 10 полей зрения при увеличении х2500. При изучении адгезии бактерий S. epidermidis на гидрофильной стеклянной поверхности использовали покровные стекла размером 24×24 мм2 («МиниМед», Россия), предварительно обезжиренные спиртово-эфирной смесью, прошедшие паровую стерилизацию (121°С, 60 мин) и помещенные горизонтально на дно стерильных стеклянных стаканов (диаметр 40 мм). Исследование динамики первых этапов образования биопленок проводили аналогично, изменяя время инкубации до 30, 60, 120 и 240 мин. В экспериментах по изучению зависимости адгезии бактерий от температуры инкубацию проводили в течение 30 мин при 3, 28, 37 и 42°С. Для исследования влияния гидродинамических условий на адгезию бактерий чашки с бактериальными суспензиями помещали на 30 мин в статические условия или на орбитальный шейкер («Biosan», Латвия) с частой вращения 150 об/мин. Для расчета сдвигающих усилий, происходящих в 47 полистироловой чашке Петри при инкубации на орбитальном шейкере, использовали формулу (3) (Ley et al., 1989) τmax=a×√(ρ×µ×(2π×f)3) (3) где а – орбитальный радиус вращения шейкера (2 см); ρ – плотность среды LB (1,000 г/см3); µ – динамическая вязкость среды LB при 37°С (0,0074 Пуаз) (Support Fluxion, 2013); f – частота вращения шейкера (2,5 с-1). Усилие сдвига в данных условиях (37°С, среда LB, 150 об/мин) составляло 10,7 дин/см2. В некоторых экспериментах проводили расчет время удвоения (t1/2, мин) численности адгезированных клеток по формуле (4) t1/2=ln(2)/k (4) где k – тангенс угла наклона прямой при построении графика зависимости ln (количество сорбированных клеток / поле зрения) от времени (мин). Оценку продолжительности действия антибактериальных пептидов на образование биопленок бактериями S. epidermidis проводили в питательной среде LB, содержащей варнерин или хоминин (в концентрации 1xМПК для каждого штамма). По истечении 30 мин адгезии в стандартных условиях планктонные клетки удаляли путем двукратной промывки ФБ (10 мМ, рН 7,2) или NaCl (0,5 М, рН 7,2), затем в каждую чашку Петри вносили по 2 мл свежей питательной среды LB и инкубировали статически при 37 °С в течение 0, 2, 4 и 5,5 ч. После чего определяли число сорбированных клеток методом прямого подсчета. 2.12. Определение биопленкообразующей способности бактерий Биопленки выращивали в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах («Медполимер», Россия). Бактериальные суспензии с концентрацией 107 КОЕ/мл вносили по 100 мкл в лунку. После инкубации при 37°С в статических условиях в течение 24 ч питательную среду осторожно удаляли аспирацией, лунки трижды промывали ФБ для удаления свободных планктонных бактерий и высушивали в течение 30 мин при 37°С в перевернутом виде. Полученные биопленки окрашивали раствором кристаллического фиолетового (0,1%) в течение 30 мин, а затем дважды отмывали от красителя деионизированной водой. Биомассу образованных биопленок определяли путем 48 измерения оптической плотности спиртовых экстрактов связавшегося красителя при 570 нм на планшетном спектофотометре Benchmark plus («Bio-Rad», США) (Stepanović et al., 2007). 2.13. Изучение действия ферментов и антибактериальных соединений на суточные биопленки Биопленки бактерий, предварительно сформированные в течение 24 ч по указанному выше методу, подвергали действию ферментов и антибактериальных соединений. Для этого после удаления планктонной культуры путем трехкратной промывки ФБ в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора фермента или антибактериального соединения в концентрации, указанной в Таблице 3, и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. В контрольные образцы вносили 0,9% раствор NaCl (рН 7,0) или соответствующий буферный раствор без фермента. Для удаления разрушенных частей биопленки лунки трижды промывали ФБ и высушивали в течение 30 мин при 37°С в перевернутом виде. Биомассу пленок после действия факторов оценивали по связыванию кристаллического фиолетового. Таблица 3 Перечень ферментов и антибактериальных соединений, использованных для обработки суточных биопленок бактерий S. epidermidis Действующее Растворитель Концентрация, мг/мл вещество Трипсин Трис-HCl (10 мМ, рН 7,4) 0,100 Протеиназа К ФБ (10 мМ, рН 7,5) 0,100 Трис-HCl (10мМ, рН 7,2) с ДНКаза I типа 0,100 содержанием ионов Mg2+ 5 мМ РНКаза I типа ФБ (10 мМ, рН 7,5) 0,100 Лизоцим Вода 0,010 Лизостафин Вода 0,002 NaIO4 Вода 10* Низин Вода 0,5 и 2 Варнерин Вода 0,5 и 2 Хоминин Вода 0,5 и 2 * концентрация указана в мМ 49 2.14. Атомно-силовая микроскопия Исследование поверхностей полистирола после предобработки их препаратами плазмы крови, БСА и Фн проводили на атомно-силовом микроскопе Dimension Icon («Veeco», США). Использовали зонды NSG01 («NT-MDT», Россия) с номинальным радиусом острия 10 нм и жесткостью кантилевера ~7 Н/м. Оценку результатов экспериментов проводили в режиме наномеханического картирования с наноиндентацией поверхности в каждой точке рельефа с частотой 2 кГц. Для каждой поверхности получали по три изображения размером 20х20 мкм2 с разрешением 512х512 точек в плоскости xy. В работе кроме рельефа анализировали так же карты адгезии зонда к поверхности. Обработку полученных изображений и данных проводили с помощью программного обеспечения «Nanoscope» («Bruker», США). 2.15. Получение и анализ фильтратов среды с ранних этапов образования биопленок Отмытые бактерии S. epidermidis суспендировали в питательной среде LB до концентрации 107 КОЕ/мл и наносили по 2 мл на полистироловую или стеклянную поверхность, затем инкубировали в статических условиях при 37°С в течение 0, 30, 60, 120 и 240 мин. По истечении заданного времени жидкую часть удаляли аспирацией и освобождали от клеток с помощью центрифугирования (12000×g, 5 мин, 4 °С), надосадочную жидкость стерилизовали фильтрованием (0,20 мкм, «Millipore», Германия) и использовали в дальнейших экспериментах в качестве среды инкубации. Для масс-спектрометрического анализа фильтраты среды получали описанным выше способом только в качестве среды инкубации использовали ФБ (10 мМ, рН 7,2) и изменяли время контакта бактерий S. epidermidis 33 и поверхности до 30 и 60 мин. Полученные стерильные фильтраты среды досуха высушивали на концентраторе Concentrator 5301 («Eppendorf», Германия), затем осадки растворяли в дистиллированной воде и проводили масс-спектрометрию полученных образцов методом MALDI-TOF. ** _________________________ ** Исследования проведены на базе Института биофизики микроорганизмов РАН, г. Пущино. 50 Оценку действия протеолитических ферментов на бесклеточные фильтраты проводили путем обработки сред, полученных после контакта бактерий S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола в течение 60 мин, растворами трипсина и протеиназы К (100 мкг/мл) при 37°С в течение 2 ч. В контрольные пробы вносили 10 мМ трис-HCl (pH 7,2). По истечении времени ферменты отделялись с помощью фильтрования через мембрану (10 кДа, «Sartorius», Германия). Полученные фильтраты использовали в дальнейших экспериментах в качестве среды инкубации. 2.16. Статистика Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программного обеспечения «Prism 6» («GraphPad Software Inc.», США) с использованием однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Все эксперименты проводили в трех–пятикратной повторности, при этом в каждом опыте использовали не менее двух параллелей. Достоверность полученных результатов оценивали при p<0,05. Данные в таблицах указаны как среднее ± стандартное отклонение, тогда как на графиках указано среднее ± доверительный интервал (95%). 51 ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS В качестве объекта исследования были использованы штаммы бактерий S. epidermidis GISK 33, ATCC®12228 и ATCC®29887. Штамм S. epidermidis ATCC®29887 был выбран как представитель метициллин-устойчивых S. epidermidis (Fang and Hedin, 2003). В связи с тем, что часть работы была посвящена изучению действия антибактериальных пептидов, штаммы S. epidermidis GISK 33 и ATCC®29887 были выбраны из-за их использования в качестве референсных штаммов при оценке действия пептидов (Fontana et al., 2006; Коробов и др., 2010). Исходя из задач настоящей работы, проведено изучение чувствительности штаммов к ряду использованных в работе веществ (Таблица 4). Таблица 4 МПК различных соединений в отношении использованных в работе штаммов Штамм S. epidermidis 33 S. epidermidis 12228 S. epidermidis 29887 Соединение ЭДТА, мМ 1,0 1,0 1,0 SDS, % 0,017 – – Цетавлон, % 3,6×10-5 – – Линезолид, мкг/мл Варнерин, мкг/мл Хоминин, мкг/мл 1,25 0,25 0,25 1,25 8 8 1,25 8 8 «–» – не определяли Установлено, что все использованные в экспериментах штаммы характеризовались близкой степенью гидрофобности в пределах 65,5–77,6% (Таблица 5). Таблица 5 Оценка интенсивности адгезии бактериальных клеток к углеводородам S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis Штамм 33 12228 29887 Уровень гидрофобности Af, % 65,5±16,0 75,8±11,5 77,6±9,1 52 Известно, что морфология колоний стафилококков, выращенных на агаре с индикатором Конго красным, существенно различается в зависимости от их способности (polysaccharide продуцировать intercellular межклеточный adhesin, PIA), полисахаридный способствующий матрикс образованию биопленок на твердых поверхностях (McKenney et al., 1998). Колонии бактерий, выделяющих полисахариды, приобретают при росте на данной среде черный цвет, могут иметь матовую или глянцевую поверхность (Freeman et al., 1989). В результате проведенных нами исследований было обнаружено, что колонии всех использованных в работе штаммов, выращенные на агаре с индикатором Конго красным, обладали красной окраской (Рисунок 2), что свидетельствовало об отсутствии PIA. В таком случае, согласно литературным данным, основным компонентом матрикса биопленок стафилококков, чаще всего, являются белковые соединения (Rohde et al., 2007). Рисунок 2. Детекция PIA на плотной среде с индикатором Конго красный при росте бактерий S. epidermidis 33, 12228 и 29887. Результаты исследования динамики формирования биопленок бактериями S. epidermidis на поверхностях полистирола представлены на Рисунке 3. Как видно из данных, все изученные бактериальные штаммы проявляли практически одинаковый характер формирования биопленок на поверхностях полистирола как в первые часы, так и по истечении суток культивирования. OD570 53 Рисунок 3. Динамика накопления биомассы S. epidermidis на поверхностях полистирола при её определении по связыванию генцианвиолета (А) и подсчетом количества адсорбированных клеток в поле зрения (Б). Увеличение количества клеток на поверхности полистироловых чашек по мере культивирования бактерий наглядно продемонстрировано на Рисунке 4. Через 30 мин после внесения бактерий в среду наблюдалось активное деление связанных с поверхностью бактерий, расположенных попарно или небольшими кластерами. Через 90 мин «освоения» бактериями поверхности заметно образование клеточных агрегатов, образованных неразошедшимися после деления клетками, а через 150 мин площадь колонизированной поверхности значительно увеличивается. Рисунок 4. Микрофотографии первых этапов развития биопленок бактериями S. epidermidis 33 (×1000, микровизор µViso – 103, «Ломо», Россия): 1 – 30 мин, 2 – 90 мин, 3 – 150 мин. Исследована зависимость динамики процесса адгезии бактерий S. epidermidis 33 к абиотическим поверхностям от функционального состояния бактериальных клеток (Рисунок 5). Показано, что количество сорбирующихся 54 клеток полученных из культуры в log-фазе вдвое превышает количество прикрепленных к поверхности бактерий стационарной фазы развития культуры. Рисунок 5. Динамика первых этапов образования биопленок на поверхности полистирола бактериями S. epidermidis 33, полученных с логарифмической (□) и стационарной (■) фазах роста планктонной культуры. Данный факт уже отмечался исследователями и, по-видимому, связан со способностью бактерий в ранней экспоненциальной фазе быстро изменять свойства клеточной поверхности в результате экспрессии генов, ответственных за образование биопленок (Hood and Zottola, 1997). Кроме того, в экспериментах показано, что клетки бактерий разных физиологических фаз роста отличаются по темпу удвоения числа адгезированных клеток на абиотической поверхности. Так, время удвоения для клеток log-фазы было значительно меньше, чем для клеток стационарной фазы, и составило 92±7 и 169±22 мин, соответственно. Известно, что неспецифическая обратимая адгезия к поверхностям материалов характерна как для живых, так и для мертвых бактериальных клеток (Paul, 1984; Kłodzińska et al., 2010). Для оценки различий в сорбции таких клеток была изучена адгезия живых и убитых кипячением бактерий штамма S. epidermidis 33, полученных с разных фаз роста планктонной культуры (Рисунок 6). В связи с тем, что количество сорбированных клеток логарифмической фазы роста в случае живых и убитых бактерий отличается практически в два раза, можно предположить, что клеток в этой фазе в течение 30 мин происходит не 55 только неспецифическое связывание, а последующий этап развития биопленок – необратимая адгезия к поверхности полистирола. Кроме того, отмеченная разница в сорбционных характеристиках живых и убитых клеток, возможно, обусловлена, тем, что убитые клетки стафилококков обладают более низким дзета-потенциалом по сравнению с живыми (Kłodzińska et al., 2010). * различия статистически значимы при сравнении с «живыми» бактериями (p<0,05) Рисунок 6. Адгезия живых и убитых бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста планктонной культуры. Для клеток стационарной фазы достоверного различия между адгезией в живом и убитом состоянии не выявлено, что, вероятнее всего, свидетельствует о неспецифическом связывании с поверхностью полистирола клетками в этой фазе роста за данный промежуток времени. 56 ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА АДГЕЗИЮ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS 4.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от гидродинамических условий культивирования Известно, что гидродинамические условия культивирования оказывают значительное влияние на первые этапы адгезии бактериальных клеток (An and Friedman, 2000; Stepanović et al., 2001). Результаты исследования влияния гидродинамических условий культивирования на адгезию бактерий S. epidermidis 33 разных периодов роста планктонной популяции представлены на Рисунке 7. Так, в первые 30 мин инкубации приложение силы сдвига в 10,7 дин/см2 снижает адгезию как для Количество клеток/поле зрения бактерий логарифмической и стационарной фаз роста примерно в 2,5 раза. Рисунок 7. Динамика сорбции бактерий S. epidermidis 33 логарифмической (А) и стационарной (Б) фаз роста в разных гидродинамических условиях. В тоже время изменение угла наклона кривых (Рисунок 7) свидетельствует о том, что интенсивное перемешивание влияет также и на темп прироста количества сорбированных клеток. Для клеток логарифмической фазы интенсивность прироста в статических условиях составляет 88%/час, а при сдвигающем усилии в 10,7 дин/см2 этот показатель снижается до 61%/час. Клетки стационарной фазы роста проявляют меньшую чувствительность к изменению гидродинамических условий культивирования, так как при приложении тех же 57 усилий сдвига интенсивность прироста изменяется незначительно, с 85 до 78%/час. Изменение интенсивности формирования биопленок хорошо заметно на микрофотографиях препаратов (Рисунок 8). Рисунок 8. Микрофотографии клеток S. epidermidis 33 при адгезии в разных гидродинамических условиях (×2500, микровизор µViso – 103, «Ломо», Россия): А – в статических условиях, Б – при силе сдвига в 10,7 дин/см2. 1, 2 – клетки логарифмической фазы роста, 30 и 120 мин; 3, 4– клетки стационарной фазы роста, 30 и 120 мин. После 30 мин инкубации в статических условиях на поверхности полистирола обнаруживались небольшие конгломераты клеток (10-12 штук), хотя чаще встречались группы по 2-6 клеток. Увеличение времени инкубации до 120 мин приводит к возрастанию количества закрепленных на полистироле клеток. По-видимому, это происходит в результате размножения бактерий, прикрепившихся на первых этапах сорбции. По существу, к этому моменту в препаратах обнаруживались небольшие кластеры делящихся клеток (до 20 штук), покрывающие значительные участки атакованной поверхности. В условиях перемешивания такой четкой разницы между точками отбора проб не наблюдалось, что возможно, связано с тем, что при перемешивании крупные агломераты клеток разрушаются, и плохо закрепленные бактерии удаляются с поверхности, а сорбируются адгезионными свойствами. лишь клетки, обладающие наибольшими 58 Аналогично бактериям, находящимся в стадии логарифмического роста, в экспериментах с клетками стационарной фазы через 120 мин также наблюдалось увеличение числа клеток в кластерах. Менее интенсивное возрастание количества бактерий, по-видимому, связано с более протяженным временем генерации, характерным для клеток этой фазы роста (Рисунок 6). Также отмечено, что при адгезии в условиях перемешивания в течение 2 ч клетки бактерий, в основном, располагаются поодиночке или малыми группами, содержащими не более восьми клеток. Таким образом, сдвигающее усилие в 10,7 дин/см2, которое лежит в области физиологических значений (Goldsmith and Turitto, 1986), приводит к резкому изменению числа сорбированных на поверхности полистирола клеток. Бактерии логарифмической фазы роста культуры проявили большую чувствительность к динамическому воздействию по сравнению с клетками стационарной фазы роста. Полученные нами данные противоречат выводам Wang с соавт. о независимости адгезии бактерий S. epidermidis от силы сдвига в пределах до 18,2 дин/см2 (Wang et al., 1993). Однако, отличие в полученных результатах можно объяснить различием использованных сред и подходов. В нашем исследовании изучалась адгезия, со временем приводящая к формированию биопленок, в то время как в работе Wang с соавт. исследовались процессы сорбции, не связанные с дальнейшим ростом бактериальной популяции. 4.2. Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis Изучение влияния температуры окружающей среды на процессы сорбции исследованных бактерий на полистироловые поверхности показало, что данный фактор оказывает сходный эффект на адгезию всех исследованных штаммов S. epidermidis (Рисунок 9). При сравнении зависимости численности сорбированных клеток в питательной среде и 0,9% растворе NaCl от температуры окружающей среды было обнаружено, что стимулирующее действие высоких температур проявляется и в том, и в другом случае (Рисунок 9). Однако, в богатой питательной среде этот 59 эффект более выражен. Показано, что при низких температурах (3°С) адгезия снижается по сравнению с контролем (37 °С) и достигает одинакового уровня в обеих инкубационных средах. * различия статистически значимы при сравнении с данными при 37 °С (p<0,05) Рисунок 9. Адгезия бактерий S. epidermidis на поверхностях полистирола при разных температурах в среде LB (А) или изотоническом растворе NaCl (Б). В исследовании зависимости адгезии бактерий S. epidermidis 33 от их физиологического состояния при разных температурах окружающей среды установлено, что повышение температуры среды от 10 до 30°С приводило к практически одинаковому линейному возрастанию сорбции обеих групп клеток на полистироловой поверхности (Рисунок 10). Однако, при дальнейшем возрастании температуры до 42°С наблюдалось значительное увеличение адгезии клеток лог-фазы, в то время как динамика сорбции бактерий стационарной фазы оставалась прежней. Несмотря на то, что проведенные эксперименты не выявили увеличения сорбционной активности клеток S. epidermidis 33 при температурах ниже 30°С, как то было показано для клинических изолятов S. epidermidis (Fitzpatrick et al., 2005) и для S. epidermidis Staph 1597 при температурах 22 и 6 °С (Jaglic et al., 2011), результаты исследований согласуются с данными о том, что температурный стресс (42 °С) может усиливать адгезию стафилококков (Rachid et al., 2000). Одновременно с этим, пониженные температуры (25 °C) 60 характеризуются сниженным числом сорбированных клеток (Holá et al., 2006). Вероятнее всего, данный эффект связан с тем, что низкая температура повышает гидрофильные свойства клеток, что отрицательно влияет на способность бактерий S. epidermidis связываться с гидрофобными поверхностями, например, с полистиролом (Rode et al., 2007). * различия статистически значимы при сравнении с бактериями стационарной фазы (p<0,05) Рисунок 10. Адгезия бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста бактериальной популяции в среде LB при разных температурах. 4.3. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от кислотности среды Кислотность среды способна оказывать значительное влияние на первые этапы образования биопленок бактериями S. epidermidis за счет изменения заряда и гидрофобности поверхностных структур клеток (Chávez de Paz et al., 2007; Dunne Jr and Burd, 1992; Zmantar et al., 2010). Установлено, что изменение рН среды от кислых (рН 4) до слабощелочных (рН 8) значений не оказывало какого-либо значительного влияния на интенсивность сорбции бактерий S. epidermidis 33 стационарной фазы роста. В то же время для бактерий лог-фазы была характерна тенденция снижения адгезии в слабокислой зоне, достигавшая статистически значимого отличия при рН 4,0, и некоторое увеличение числа сорбированных клеток в слабощелочной зоне (Рисунок 11). Полученные результаты согласуются с данными об усилении адгезии бактерий некоторых штаммов S. epidermidis к поверхности полистирола при инкубации в слабощелочной среде (pH 8,0) (Dunne Jr and Burd, 1992). 61 Возможно, данный эффект связан с тем, что в щелочной среде бактериальные клетки наиболее склонны к агрегации с образованием кластеров из-за увеличения Количество клеток/ поле зрения продукции внеклеточных белков (Chávez de Paz et al., 2007). Бактерии лог-фазы Бактерии стационарной фазы 80 60 40 * 20 0 4 5 6 7 8 рН * различия статистически значимы при сравнении с данными при рН 7,0 (p<0,05) Рисунок 11. Влияние кислотности среды LB на адгезию бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста бактериальной популяции. Полученные нами результаты согласуются также с данными о том, что при кислых значениях рН (3–6) адгезия бактерий S. epidermidis, в основном, ниже, чем в нейтральной среде при рН 7,0 (Dunne Jr and Burd, 1992; Zmantar et al., 2010). Предполагается, что этот эффект может быть связано с изменением характера диссоциации D-аланиновых остатков в тейхоевых и липотейхоевых кислотах при снижении кислотности среды, что, в свою очередь, приводит к изменению уровня поверхностного заряда бактериальных клеток (Nostro et al., 2012). 4.4. Влияние осмолярности среды на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis Повышение осмолярности среды инкубации бактерий оказывает различное влияние на адгезивные свойства клеток. Так, показано, что адгезия бактерий S. epidermidis RP62A снижается при повышении содержания NaCl в среде до 0,776 М (Stewart et al., 2013), в то же время, при концентрации 0,85 М NaCl сорбция бактерий S. epidermidis 220-1 повышается по сравнению с бессолевым контролем (Rachid et al., 2000). Поэтому была проведена оценка влияния осмолярности среды на первые этапы образования биопленок всеми использованными в работе штаммами S. epidermidis (Рисунок 12). 62 Количество клеток/ поле зрения 0.4 Б OD570 0.3 0.2 * 0.1 0.0 LB LB+ 0.5M NaCl * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 12. Влияние присутствия NaCl в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis. Аналогичные данные были получены при исследовании пленкообразования бактериями S. epidermidis (Stewart et al., 2013). Вероятно, данный эффект соли на сорбцию бактерий обусловлен тем, что инкубация даже в 0,9% (0,14 М) растворе NaCl индуцирует снижение экспрессии белка AtlE, основного аутолизина стафилококков, отвечающего за связывание бактерий непосредственно с полимерной поверхностью (Heilmann et al., 1997), как в планктонных, так и в прикрепленных к поверхности полистирола клетках (Vandecasteele et al., 2003). В тоже время показано, что добавление в питательную среду 0,68 М NaCl репрессирует синтез белка Aap (Hennig et al., 2007), необходимого для образования биопленок некоторыми штаммами S. epidermidis (Hussain et al., 1997). Внесение более низких концентраций NaCl в среду инкубации S. epidermidis 33 практически не оказывали влияния на интенсивность адгезии бактерий к полистиролу. Незначительный стимулирующий сорбцию эффект, как логарифмических, так и стационарных клеток S. epidermidis 33, наблюдался при добавлении 50 мМ NaCl или KCl (Рисунок 13). Количество клеток/поле зрения 63 * различия статистически значимы при сравнении с данными при 0 мМ (p<0,05) Рисунок 13. Влияние ионов одновалентных металлов на адгезию к поверхностям полистирола бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста бактериальной популяции. Действительно, известно, что адгезия бактерий может усиливаться при небольших концентрациях NaCl (менее 0,1 M) (Gordon and Millero, 1984). Кроме того экспериментально показано, что при содержании в среде 50 мМ NaCl происходит агрегация клеток стафилококков, бактерии собраны в крупные агломераты и одиночные клетки практически не обнаруживаются (Рисунок 14). Возможно, увеличение скорости осаждения таких структур и облегчает их адгезию. Рисунок 14. Микрофотографии клеток S. epidermidis 33 при адгезии в среде LB с разным содержанием NaCl (×2500, микровизор µViso – 103, «Ломо», Россия): А – 0 мМ (контроль), Б – 50 мМ. В дальнейшем было изучено влияние осмотического давления среды на способность бактерий S. epidermidis 33 сорбироваться на гидрофобных 64 полистироловых и гидрофильных стеклянных поверхностях. Из данных, представленных на Рисунке 15, видно, что в контроле (растворе, не содержащем NaCl) численность бактерий, адгезированных на разных типах поверхностей, отличается почти в два раза. * различия статистически значимы при сравнении с данными на стекле (p<0,05) Рисунок 15. Влияние осмотической силы раствора на адгезию бактерий S. epidermidis 33 на стекле и полистироле. Данный факт согласуется с известным мнением, что адгезия бактерий S. epidermidis на поверхности гидрофобных материалов выше, чем на гидрофильной поверхности стекла (Cerca et al., 2005b). Однако, с повышением концентрации соли в среде инкубации адгезия на стекле и полистироле снижалась, а при концентрации 1,0–2,0 М NaCl разница в количестве сорбированных клеток на разных типах поверхности нивелировалась. Известно, что стафилококки сохраняют жизнеспособностью в высокомолярных растворах NaCl (Шлегель, 1987), очевидно, поэтому в течение экспериментов количество живых клеток в среде оставалось постоянным. Отмеченное нами ингибирующее действие высоких концентрациях ионов Na+ на адгезию может быть связано со способностью этих ионов не специфически связываться с отрицательно-заряженными группами на поверхности клеточной стенки, например тейхоевых, тейхоуроновых кислот, а также пептидогликана 65 (Потехина, 2006). Вследствие этого, отрицательный поверхностный заряд бактериальных клеток снижается, что в свою очередь, приводит к изменению численности сорбированных клеток. 4.5. Адгезия и образование биопленок бактериями S. epidermidis при внесении в среду глюкозы Хорошо известно, что образование биопленок некоторыми штаммами КНС усиливается при внесении в среду роста глюкозы (Mack et al., 1992; Rachid et al., 2000). Однако, результаты изучения возможных зависимостей адгезии и накопления биомассы пленок бактериями S. epidermidis от содержания в среде роста глюкозы показали, что концентрация 0,5% не приводила к значительным изменениям ни в количестве сорбированных на поверхности полистирола клеток, ни в биомассе образованных пленок (Рисунок 16). Некоторыми авторами также отмечалось отсутствие влияния глюкозы на адгезионную активность и формирование биопленок бактерий S. epidermidis. В большинстве случаев, данный эффект связывали с PIA-отрицательным фенотипом изученных штаммов (Hennig, et al., 2007; Michu et al., 2011). Действительно, отсутствие способности к синтезу PIA у исследованных штаммов стафилококков было показано выше с помощью тестирования с использованием индикатора Конго красный (Рисунок 2). Рисунок 16. Влияние присутствия глюкозы в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis. 66 Таким образом, изменение физико-химических условий среды вследствие вариабельности гидродинамических усилий, температурного режима, кислотности и осмолярности среды приводит к существенным изменениям сорбционных характеристик и биопленкообразующей способности бактерий S. epidermidis. 67 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ, МЕНЯЮЩИХ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ, НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS 5.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от содержания в среде ионов двухвалентных металлов Учитывая данные о наличии в пленках стафилококков белковых компонентов (Götz, 2002), было проведено изучение влияния на адгезию и рост формирующихся пленок ионов биологически активных металлов, так как известно, что их присутствие во многом определяет активность внеклеточных протеаз и пептидаз (Mikhailova et al., 2005). Исследования показали, что наличие в среде культивирования катионов кальция снижает количество сорбированных клеток и интенсивность формирования биопленок S. epidermidis 33. Количество адгезированных клеток штаммов 12228 и 29887 практически не меняется в присутствии Ca2+, однако интенсивность формирования пленок снижается в 2 раза (Рисунок 17). * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 17. Влияние ионов кальция (2,5 мМ) и цинка (2,5 мМ) в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis. Обнаружено также, что ингибирующим эффектом как на адгезию, так и образование биопленок для всех исследованных штаммов S. epidermidis обладают ионы цинка (2,5 мМ). Влияние ионов цинка наиболее значительно проявляется на первых этапах образования биопленок, приводя к уменьшению числа 68 сорбированных клеток на 85–97 %, при этом образование биопленок снижается всего в 1,5-2 раза (Рисунок 17). Отмечено, что ингибирующий эффект ионов цинка не связан с его бактерицидным действием, так как количество живых клеток после 30 мин адгезии не изменилось по сравнению с контролем (Таблица 6). Таблица 6 Количество КОЕ после адгезии в течение 30 мин в среде LB с добавлением ионов кальция и цинка (х107 КОЕ/мл) Штамм S. epidermidis 33 S. epidermidis 12228 S. epidermidis 29887 Среда LB LB+Ca (2,5 мМ) LB+Zn2+ (2,5 мМ) 2+ 1,9±0,2 2,0±0,5 2,1±0,2 1,1±0,2 1,0±0,3 1,2±0,4 1,1±0,4 0,7±0,2 1,5±0,6 Для более детального изучения влияния двухвалентных катионов было проведено исследование адгезии и образования биопленок бактериями S. epidermidis 33 при внесении в среду двухвалентных катионов (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+) в диапазоне концентраций от 0 до 2,5 мМ (Рисунок 18). Результаты экспериментов (Рисунок 18А, Г) показали, что увеличение концентрации ионов кальция и марганца в среде культивирования до 0,5 мМ ведет к незначительной активации образования биопленок. Дальнейшее увеличение содержания ионов Ca2+ и Mn2+ в среде оказывал ингибирующий эффект на процессы пленкообразования. Важно отметить, что возрастание содержания в среде ионов Mg2+ до 2,5 мМ повышает способность бактерий образовывать биопленки примерно в 2 раза (Рисунок 18Б). В тоже время, присутствие в среде ионов цинка оказывает ингибирующее действие на образование биопленок (Рисунок 18В), начиная от самой минимальной исследованной концентрации. Одновременно с этим, адгезия бактериальных клеток в значительной мере подавляется в присутствии всех исследованных в работе катионов. Выраженное ингибирование пленкообразования S. epidermidis 33 при введении в среду роста ионов Ca2+, Zn2+, Mn2+ может рассматриваться как следствие активации внеклеточных протеолитических ферментов (Gossas and 69 Danielson, 2006), приводящей к дефициту полноценных белковых компонентов, необходимых для построения матрикса формирующихся биопленок коагулазонегативных стафилококков. Рисунок 18. Влияние содержания в среде LB ионов металлов Ca2+ (А), Mg2+ (Б), Zn2+ (В), Mn2+ (Г) на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis 33. Известно, что ионы кальция и марганца способны ингибировать адгезию к полистиролу, межклеточную агрегацию и образование Bap-зависимых биопленок бактериями S. aureus (Arrizubieta et al., 2004). По-видимому, это обусловлено связыванием ионов кальция с белком Bap через EF-мотив данного белка, что приводит к неспособности к межклеточной агрегации и, тем самым, к образованию биопленок. Можно предположить, что характерен и для бактерий S. epidermidis, подобный эффект обладающих PIA-отрицательным фенотипом. Считается, что за адгезию стафилококков ответственны белки клеточной стенки Aap и SasG, которые имеют Zn-связывающие домены (Conrady 70 et al., 2008). В соответствии с этим можно предположить, что избыток ионов цинка способен оказывать влияние на количество сорбированных клеток. Ионы марганца, возможно, связывались с этими белками не специфически, и тем самым, по-видимому, могли блокировать их основные функции и приводить к заметному снижению способности клеток стафилококков сорбироваться на поверхности полистирола. Кроме того, в составе клеточной стенки грамположительных бактерий имеются компоненты (экзополисахариды, липотейхоевые кислоты), способные связывать ионы кальция (Josefsson et al., 1998; Потехина, 2006). Важно отметить, что такое неспецифическое связывание металлов с поверхностными структурами бактерий может приводить к изменению их электростатических свойств. Действительно, результаты исследования влияния двухвалентных катионов на дзета-потенциал клеток S. epidermidis 33 подтвердили предположение об их способности оказывать влияние на электрический заряд бактериальных клеток (Таблица 7). Максимальное действие на величину дзета-потенциала бактериальных клеток оказывали ионы магния, изменяя его практически на 30%, меньший эффект проявляли ионы кальция, цинка (на 20 и 18%, соответственно) и, наконец, ионы марганца, вызывавшие изменение дзета-потенциала лишь на 7%. Таблица 7 Дзета-потенциал клеток S. epidermidis 33 в среде LB, содержащей ионы двухвалентных металлов Контроль Mg2+ Ca2+ Zn2+ Mn2+ Среда (LB без KCl) (2,5 мМ) (2,5 мМ) (2,5 мВ) (2,5 мМ) Дзета-21,0±0,4 -14,5±1,0* -16,7±0,7* -17,3±0,6* -19,5±0,8* потенциал, mV * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Таким образом, присутствие двухвалентных катионов в среде, по-видимому, оказывает влияние на адгезию бактерий S. epidermidis с помощью двух различных механизмов: специфического связывания с белками и неспецифического связывания с отрицательно-заряженными группировками на поверхности бактериальных клеток, приводящего к изменению дзета-потенциала клеток. 71 5.2. Влияние ЭДТА на адгезию и развитие биопленок бактериями S. epidermidis Как было показано выше, катионы двухвалентных металлов обладают значительном влиянием на первые этапы взаимодействия бактериальных клеток с поверхностями материала. Поэтому присутствие в среде ЭДТА, известного в качестве универсального хелатирующего агента, также может оказывать ингибирующее действие на процессы сорбции бактериальных клеток на полистироле (Dunne Jr and Burd, 1992). Действительно, внесение в среду ЭДТА (2,5 мМ) вызывало ингибирование процесса адгезии бактерий всех использованных в работе штаммов, а так же снижение интенсивности образования биопленок у S. epidermidis 33 и 29887 почти в 3 раза (Рисунок 19). * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 19. Влияние ЭДТА в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis. Для более детального изучения влияния ЭДТА было проведено исследование адгезии бактериями S. epidermidis 33 в диапазоне концентраций 0,5 до 10 мМ ЭДТА (Рисунок 20). Показано, что заметное снижение количества сорбированных клеток выявляется при 0,5–1 мM ЭДТА, что соответствует 0,5– 1хМПК этого соединения для данного штамма (Таблица 4), при этом, отмечено, что количество живых клеток во всем диапазоне исследованных концентраций остается одинаковым в течение 30 мин (Рисунок 20). 72 * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB без ЭДТА) (p<0,05) Рисунок 20. Зависимость количества сорбированных на полистироле и живых клеток бактерий S. epidermidis 33 от содержания ЭДТА в среде LB в течение 30 мин. Полученные данные подтверждаются исследованием Juda et al., в котором было обнаружено, что процессы адгезии и формирования биопленок шестью клиническими изолятами S. epidermidis на поверхности полимерного материала ингибируются внесением в среду культивирования ЭДTA в концентрациях 1,0– 2,0 мМ (Juda et al., 2008). В присутствии ЭДТА продукция внеклеточных полимерных веществ клиническими изолятами S. epidermidis значительно сокращалась (Ozerdem Akpolat et al., 2003). Известно также, что внесение ионов двухвалентных металлов к содержащей ЭДТА среде не восстанавливает прежний уровень биопленки, что означает, что действие ЭДТА основано не на хелаторных свойствах (Chang et al., 2012). Хотя механизм ингибиторного действия ЭДТА до конца не ясен, существует предположение, что действие ЭДТА, по-видимому, не связано с внешними компонентами бактериальных клеток, так как сканирующая электронная микроскопия не выявила каких-либо выраженных морфологических изменений в клеточных стенках бактерий после обработки их ЭДТА (Root et al., 1988). Также считается, что эффект ЭДТА может быть связан с предполагаемыми биоцидными свойствами молекулы (Percival et al., 2005). 73 5.3. Действие детергентов на адгезию бактерий S. epidermidis Специальные исследования были посвящены изучению сорбции бактерий S. epidermidis 33 в присутствии поверхностно-активных соединений. Так, тритон Х-100 и додецилсульфат натрия (SDS) в концентрации 0,1хМПК (Таблица 8), вызывали снижение количества прикрепившихся к полистиролу клеток на 50 – 75 % (Рисунок 21). Выявлено, что SDS оказывает практически одинаковое действие, как в водном растворе, так и в питательной среде LB, тогда как внесение тритона X-100 и цетавлона в питательную среду оказывает на адгезию менее выраженное действие, чем в водных растворах этих детергентов. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 21. Сравнение действия детергентов S. epidermidis 33 в питательной среде и воде. на адгезию бактерий Таблица 8 Среда Вода LB Количество КОЕ в 0,1хМПК растворах детергентов после адгезии в течение 30 мин (х107 КОЕ/мл) Контроль Тритон Х-100 SDS Цетавлон 1,0±0,3 1,1±0,4 1,2±0,3 0,8±0,3 1,5±0,3 1,5±0,4 1,4±0,5 1,5±0,5 Ингибирующее действие детергентов на адгезию, скорее всего, связано с их способностью удалять белковые компоненты с поверхности клеточной стенки (Paul and Jeffrey, 1985). Для сравнительной оценки силы связывания клеток S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола исследовали устойчивость сорбированных в течение 74 30 мин бактерий S. epidermidis 33 к действию детергентов. Инкубация с растворами детергентов (0,1хМПК) в воде или питательной среде LB в течение 30 мин не приводила к достоверным изменениям количества сорбированных клеток (Рисунок 22). 60 40 20 0 Без КонтрольТритон обработки Х-100 Вода LB SDS Цетавлон Без обработки Рисунок 22. Устойчивость сорбированных в течение 30 мин бактерий S. epidermidis 33 к действию детергентов. Устойчивость бактерий S. epidermidis 33 к обработке детергентами, вероятнее всего, обусловлена тем, что за изученный период времени бактерии этого штамма способны необратимо связываться с поверхностью полистирола. Действительно, согласно данным литературы, попытки удаления детергентами связавшихся с поверхностью стафилококков обычно мало эффективны (Gibson et al., 1999). Несмотря на то, что такая обработка может приводить к снижению количества живых бактерий, убитые клетки не теряют своей целостности и остаются прочно связанными с поверхностью (Gibson et al., 1999). 5.4. Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Эффективность антибиотических соединений во многом определяется чувствительностью к ним процессов формирования биопленок бактерий. Известно, что этанол обладает выраженным бактерицидным действием на планктонные бактерии, однако, добавление в среду инкубации этанола, нпропанола и изопропанола в концентрации 2 об.% способно индуцировать 75 образование биопленок бактериями S. epidermidis (Chaieb et al., 2011; Knobloch et al., 2002; Rachid et al., 2000). Следует отметить, что имеются данные о том, что при субингибиторных концентрациях (до 0,25%) перекиси водорода, хорошо известного бактерицидного соединения, применяемого для обеззараживания поверхности кожи, заметно повышается образование биопленок на поверхности полистирола бактериями S. epidermidis (Chaieb et al., 2011), E. coli, S. aureus и K. pneumoniae (Бухарин и Сгибнев, 2012). И лишь повышение концентрации этого соединения в среде до 5% снижает образование биопленок бактерий S. epidermidis (Chaieb et al., 2011). Наши исследования показали, что внесение этанола в среду (2 об.%) не влияет на интенсивность адгезии всех использованных в работе штаммов, но оказывает ингибирующее действие на формирование биопленок S. epidermidis 33 и 29887 (Рисунок 23). * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 23. Влияние этанола (2 об.%) и перекиси водорода (0,004 об.%) в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis. При изучении влияния перекиси водорода на адгезию и формирование биопленок показано, что присутствие в среде активных форм кислорода, продуцируемых при внесении этого соединения в среду инкубации, оказывает более выраженное влияние на процесс адгезии бактериальных клеток, чем на процесс формирования биопленок бактериями S. epidermidis. Так, внесение перекиси водорода в концентрации 0,004% снижает количество сорбированных на поверхностях полистирола клеток всех использованных в работе штаммов на 20- 76 38%, но только в отношении одного штамма (S. epidermidis 33) проявляет выраженное ингибирующее развитие биопленок действие (Рисунок 23). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что сорбционная активность и процессы пленкообразования исследованных нами коагулазонегативных стафилококков достоверно снижаются при внесении в среду инкубации перекиси водорода и этанола в субингибиторных концентрациях. При изучении зависимости адгезии бактерий S. epidermidis 33 от содержания этанола в среде показано, что внесение спирта в среду приводило к снижению связывания бактериальных клеток с поверхностью полистирола, несмотря на то, что концентрация живых клеток остается неизменной во всем диапазоне исследованных концентраций спирта (Рисунок 24). Обнаружено, что влияние этанола на процесс адгезии носило линейный дозозависимый характер. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, что повышение содержание этанола в среде (>4 об.%) однозначно приводит к замедлению темпов сорбции и формирования биопленок бактериями S. epidermidis (Chaieb et al., 2011; Knobloch et al., 2002). * различия статистически значимы при сравнении с контролем (0%) (p<0,05) Рисунок 24. Зависимость количества сорбированных на полистироле и живых клеток бактерий S. epidermidis 33 от содержания этанола в среде LB в течение 30 мин. 77 5.5. Действие мембранотропных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis В работе проведено исследование влияния соединений, нарушающих энергетические функции мембран, на адгезию бактерий S. epidermidis. С этой целью в среду инкубации вносили спиртовые растворы мембранотропных антибиотиков: валиномицина (Val), нигерицина (Nig), и карбонил-цианид-mхлорфенилгидразона (CCCP) – до концентрации 10-6 М. В контрольные образцы вносили эквивалентное количество спирта до концентрации 0,1%. Данные, представленные в Таблице 9, свидетельствуют о том, что мембранотропные соединения существенно не влияют на адгезию бактерий изученных штаммов S. epidermidis в буферных растворах. Таблица 9 Действие мембранотропных соединений (10-6 М) на адгезию бактерий S. epidermidis (количество клеток/поле зрения) Штамм Среда Буфер + вода Буфер + вода + спирт Буфер + вода + ионофор Буфер + KCl Буфер + KCl + спирт Буфер + KCl + ионофор S. epidermidis 33 Val Nig CCCP S. epidermidis 12228 Val Nig CCCP S. epidermidis 29887 Val Nig CCCP 28±10 22±7 17±8 35±8 29±8 14±6 42±10 29±5 23±6 26±9 23±7 20±7 46±8 30±4 25±6 47±15 26±3 25±7 20±8 20±5 19±5 34±14 30±8 24±9 43±10 32±13 23±4 33±8 22±7 22±5 36±8 29±6 24±10 37±7 31±6 24±5 34±10 23±5 21±6 35±9 28±7 16±8 47±12 30±6 15±5 31±11 25±8 21±6 34±10 24±4 21±5 35±9 28±8 19±6 Изучение действия ионофоров на бактерии, суспендированные в питательной среде LB, показало, что лишь наличие в среде нигерицина не оказывает существенного действия ни на адгезию бактерий, ни на образование 78 биопленок (Рисунок 25). В то время как присутствие валиномицина вызывало снижение количества сорбированных на полистироле бактерий S. epidermidis 12228, а также интенсивность образования биопленок S. epidermidis 12228 и 29887. Аналогичное действие на формирование биопленок этих штаммов Количество клеток/поле зрения отмечалось в присутствии СССР. 0.4 Б 0.3 0.2 ** ** 0.1 0.0 LB + спирт LB+ Val LB + Nig LB+ CCCP * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB+спирт) (p<0,05) Рисунок 25. Действие мембранотропных соединений (10-6 М) на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis в среде LB. Скорее всего, данный эффект связан с тем, что в клетках стафилококков СССР вызывает снижение обеих составляющих трансмембранного потенциала, в то время, как валиномицин снижает его электрическую компоненту, а нигерицин снижает лишь значение ΔрН (Vinnikov et al., 1989). Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют о том, что наибольший вклад в адгезию бактерий S. epidermidis вносит электрическая составляющая мембранного потенциала, в то время как изменение ΔрН оказывает значительно меньшее влияние на процессы сорбции и развития биопленок данными бактериями. 5.6. Действие гидролитических ферментов, периодата натрия и ДНК на адгезию и формирование биопленок бактериями S. epidermidis Известно, что препараты различных гидролитических ферментов, а также факторы, окисляющие α-гликольные группировки в углеводах, оказывают 79 существенное влияние на процессы колонизации стафилококками абиотических поверхностей (Hussain et al., 1997; Izano et al., 2008; Rohde et al., 2005). Действительно, как показали наши исследования, внесение в инкубационные среды одновременно с инокулируемыми бактериями препаратов ферментов, расщепляющих белки (трипсин), нуклеиновые кислоты (ДНКаза и РНКаза), клеточные стенки бактерий (лизоцим), внеклеточной ДНК и периодата натрия, окисляющего α-гликольные группировки углеводных соединений, оказывает значительное влияние на адгезию и образование биопленок (Рисунок 26). Показано, что лизоцим, трипсин и периодат натрия отрицательно влияют на процессы адгезии и формирования биопленок бактериями всех использованных в работе штаммов. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 26. Действие ферментов, препаратов ДНК и периодата натрия на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis. Поскольку трипсин в использованной концентрации не оказывал на тестированные штаммы стафилококков бактерицидного действия, можно предполагать, что в его присутствии происходит гидролиз определенных белков, необходимых для колонизации поверхности и образования биопленки. В то же время, действие лизоцима и периодата натрия, скорее всего, связано с их способностью разрушать пептидогликан и его углеводные компоненты. 80 Разрушение внеклеточной ДНК под действием ДНКазы подавляет формирование биопленок, начиная с процесса прикрепления бактерий к поверхности. Исключение составлял штамм S. epidermidis 29887, формирующий биопленки в присутствие ДНКазы на уровне, сравнимом с контролем. Важно отметить, что добавление внеклеточной ДНК (ДНК КРС) не оказывало значительного эффекта на процессы адгезии и формирования биопленок для всех изученных штаммов. В результате экспериментов были обнаружены небольшие отличия между действием РНКазы на бактерии разных штаммов. Так, при внесении этого фермента бактерии S. epidermidis 12228 характеризовались более высоким уровнем сорбции в течение 30 мин. В то же время, наличие РНКазы в питательной среде угнетало развитие биопленок бактерий S. epidermidis 29887, не оказывая влияния на сорбцию этих бактерий. Более детальное изучение влияния гидролитических ферментов на процесс бактериальной адгезии проведено на бактериях S. epidermidis 33. Для этого исследовали эффекты концентраций, а лизостафина так же и лизоцима в широком проводили изучение влияния диапазоне предобработки бактериальных клеток гидролитическими ферментами (трипсином, протеиназой К и лизоцимом) на интенсивность дальнейшей адгезии по сравнению с адгезией в присутствии этих ферментов. Показано, что действие лизоцима и лизостафина на процесс адгезии, во многом, определялось концентрацией фермента в среде (Рисунок 27). Кроме того, лизостафин при использованных концентрациях вызывал резкое снижение уровня сорбированных на поверхности полистирола клеток, проявляя также выраженное бактерицидное действие (Рисунок 27А). Как видно из Рисунка 27Б антиадгезионный эффект был характерен и для лизоцима, но снижение числа связанных с поверхностью клеток наблюдалось только при концентрациях, выше 5 мкг/мл. Высокие концентрации нативного лизоцима (>5 мкг/мл), которые, повидимому, не оказывали губительного действия на клетки в течение использованного периода времени, снижали адгезию клеток примерно в 2 раза. 81 Следует отметить, что инактивированный термической обработкой препарат лизоцима также был способен оказывать небольшое ингибирующее действие на адгезию бактерий S. epidermidis 33. 50 А Б 10 8 60 * 40 10 8 10 7 30 * 40 10 6 10 7 10 6 20 20 10 5 10 10 4 0 0.00 0.05 0 0.0 0.10 Концентрация лизостафина, мкг/мл 10 5 2.5 5.0 7.5 10 4 10.0 Концентрация лизоцима, мкг/мл Адгезия, количество клеток/поле зрения Количество живых клеток, КОЕ/мл Адгезия с инактивированным ферментом Адгезия с нативным ферментом Количество живых клеток, КОЕ/мл * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 27. Действие лизостафина (А) и лизоцима (Б) на численность живых планктонных и сорбированных на полистироле клеток бактерий S. epidermidis 33 в течение 30 мин. Представляют интерес результаты сравнительного изучения эффективности действия различных гидролаз (лизоцима, трипсина, бактериальной протеазы (Streptococcus griseus)) на сорбцию бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола как непосредственно после предобработки ферментами бактериальных клеток в течение 30 мин, так и при одновременном с бактериями внесении этих ферментов в среду инкубации. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в среду инкубации нативных гидролаз приводит к снижению числа сорбированных клеток на 60% (трипсин), 75% (протеаза) и 55% (лизоцим) по сравнению с контролем (Рисунок 28). Тогда как в присутствии инактивированной протеазы количество сорбирующихся на поверхности полистирола бактерий не отличалось от контроля. Предобработка бактериальных клеток нативными и инактивированными протеазами повышала их адгезию в 1,5-2 раза, в то время как обработка бактерий лизоцимом приводила к заметному снижению числа прикрепленных клеток (Рисунок 28Б). Количество клеток/ поле зрения Количество клеток/ поле зрения 82 * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 28. Действие гидролитических ферментов при одновременном внесении в среду инкубации (А) и в случае предобработки бактерий (Б) на численность сорбированных на поверхности полистирола бактерий S. epidermidis 33. Показано, что при внесении в среду инкубации протеазы количество живых клеток после 30 мин адгезии слегка увеличивалось, что, скорее всего, связано с дезагрегацией клеточных агломератов. Присутствие в среде и предобработка бактерий другими ферментами к такому эффекту не приводила (Таблица 10). Таблица 10 Количество КОЕ планктонных бактерий после их инкубации (30 мин) в присутствии гидролитических ферментов или после ферментативной предобработки бактерий S. epidermidis 33 (х107 КОЕ/мл) Форма фермента Нативная Инактивированная Одновременное внесение ферментов и бактерий в среду Контроль 1,9±0,2 Предобработка бактериальных клеток ферментами Трипсин Протеаза Лизоцим Контроль Трипсин Протеаза Лизоцим 2,3±0,3 3,3±0,3* 1,9±0,2 1,2±0,2 1,9±0,3 1,1±0.2 1,2±0,2 1,5±0,2 1,2±0.3 2,1±0,2 2,3±0,3 1,8±0,2 1,0±0,2 * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Стимулирующий бактериальную адгезию эффект, выявленный после предобработки клеток протеазами, может быть связан с частичным протеолизом белков, расположенных на поверхности клеточной стенки стафилококков, в частности, белка Аap, усеченная изоформа которого стимулирует образование биопленок (Rohde et al., 2005). Одновременно с этим, инактивированные протеазы, по-видимому, могут служить дополнительными катионными «мостиками» между атакуемой поверхностью и бактериальными клетками. 83 Многие исследователи придерживаются мнения, что присутствие экзогенной ДНК (экзДНК), одного из компонентов матрикса зрелых биопленок некоторых бактерий, способствует сорбции клеток благодаря увеличению интенсивности кислотно-основных взаимодействий как между клетками и поверхностью, так и непосредственно между бактериальными клетками (Das et al., 2010; Qin et al., 2007b). Последними данными также показано, что удаление экзДНК с поверхности клеток путем обработки ДНКазой не влияет на их дзета-потенциал, но делает поверхности бактериальных клеток более гидрофильными (Regina et al., 2014). Изучение влияния экзДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 обнаружило, что разрушение этого полимера путем внесения в среду инкубации ДНКазы на 80 % снижало количество сорбированных клеток. Тогда как инактивированная форма фермента не влияла на процесс бактериальной сорбции (Рисунок 29). Это позволяет сделать вывод о том, что данный эффект не обусловлен неспецифическим белковым взаимодействием. Поскольку гидролиз экзДНК приводил к ингибированию первых этапов образования биопленок, было изучено влияние внесения экзДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33. Известно, что экзДНК, находящаяся на поверхности бактериальных клеток, не отличается от хромосомной ДНК (Steinberger and Holden, 2005), поэтому в качестве экзДНК использовали различные виды ДНК, аутологичной – выделенной из бактерий изучаемого в работе штамма S. epidermidis 33, а так же бактерий P. acnes и ДНК КРС. Обнаружено, что внесение в среду инкубации аутологичной ДНК приводило к увеличению числа сорбированных клеток в 1,5 раза (Рисунок 29). При внесении чужеродных ДНК как бактериального, так и животного происхождения, значительных изменений в количестве связавшихся с поверхностью полистирола клеток не происходило. Полученные данные позволяют сделать вывод, о том, что действие экзДНК на сорбцию клеток стафилококков видоспецифично и, повидимому, определяется физико-химическими свойствами аутологичной ДНК. 84 * 200 150 100 50 * 0 Контроль Инактив. Нативная ДНК ДНК ДНКаза ДНКаза S.epider- P.acnes m idis ДНК КРС * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 29. Действие внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33. Подобный эффект дополнительной экзДНК на адгезию и формирование биопленок был обнаружен для актиномицетов Rhodococcus ruber, однако, усиление образования биопленок происходило как в случае использования собственной, так и чужеродной экзДНК (Gilan and Sivan, 2013). Установлено, что стимулирующее действие ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 проявляется в отношении живых клеток и зависит от концентрации экзДНК в среде (Рисунок 30). * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 30. Действие собственной экзДНК на адгезию живых и убитых бактериальных клеток S. epidermidis 33. Согласно данным литературы, внесение экзДНК в среду (>4–6×10−9 мкг ДНК на клетку) сдвигает дзета–потенциал бактериальных клеток S. aureus, S. epidermidis и P. аureginosa в более отрицательную сторону, но при дальнейшем 85 повышении уровня адсорбированной на поверхности бактериальной клетки ДНК способность бактерий к межклеточной агрегации снижается (Das et al., 2011). 5.7. Действие гидролитических ферментов и периодата натрия на сформированные биопленки бактерий S. epidermidis Для выявления возможной зависимости действия гидролаз и NaIO4 на процессы адгезии с их воздействием на сформированные биопленки стафилококков была проведена обработка этими факторами суточных биопленок S. epidermidis. Показано, что все использованные протеолитические ферменты, лизостафин, а так же нуклеазы проявляли разрушающее суточные биопленки действие (Рисунок 31). Вместе с тем необходимо отметить, что биопленки всех использованных в работе штаммов были устойчивы к лизоциму и окислительному действию периодата натрия. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 31. Действие ферментов на суточные биопленки бактерий S. epidermidis. Известно, что устойчивость биопленок стафилококков к действию периодата натрия и лизостафина, в основном, проявляется при отсутствии или низком содержании полисахаридного межклеточного адгезина в матриксе биопленок (Qin et al., 2007a). Биопленки, образованные бактериями с PIAотрицательным фенотипом, так же характеризуются чувствительностью к обработке трипсином (Rohde et al., 2007) и протеиназой К (Kogan et al., 2006), в связи с тем, что основным компонентом матрикса биопленки являются белки. 86 Действительно, проведенные нами эксперименты показали, что внесение трипсина и протеиназы К вызывало разрушение сформированных биопленок (S.epidermidis 12228 и 29887). Вместе с тем необходимо отметить, что суточные биопленки всех изученных нами штаммов обладали устойчивостью к лизоциму и окислительному действию периодата натрия. Таким образом, полученные нами результаты действительно свидетельствуют о том, бактерии S. epidermidis 33, 12228 и 29887 используют РIA-независимый механизм формирования биопленок. Общая сравнительная характеристика действия некоторых гидролаз и периодата натрия на процессы адгезии и формирования биопленок (Рисунок 26), а также разрушения сформированных биопленок бактерий S. epidermidis (Рисунок 31) приведена в Таблице 11. Таблица 11 Сравнение влияния ферментов и периодата натрия на адгезию, формирование биопленок и суточные биопленки бактерий S. epidermidis Соединение Этап Штамм S. epidermidis 33 S. epidermidis 12228 S. epidermidis 29887 Трипсин Лизоцим ДНКаза РНКаза NaIO4 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 – – 0 – – 0 – – 0 0 0 – – – 0 – – 0 – – 0 – – 0 + 0 0 – – 0 – – – – – 0 – 0 – 0 – 0 – – 0 Обозначения: 1 – адгезия в присутствие фактора (30 мин), 2 – формирование биопленок в присутствие фактора (24 ч), 3 – действие фактора на сформированные биопленки. «–» – ингибирование, «+» – стимуляция, «0» – эффекта не обнаружено Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, о том, что факторы, ингибирующие процессы адгезии клеток к полистиролу, не всегда оказывают разрушающее действие на сформированные биопленки. Так, наши исследования показали, что снижение количества сорбированных клеток под действием гидролаз хорошо согласуется с торможением процесса 87 формирования биопленок в целом. Однако, в процессе развития биопленок стафилококков претерпевает соотношение компонентов в матриксе, существенные изменения, что вероятнее приводит к всего, изменению чувствительности биопленок к гидролитическим ферментам по сравнению с их действием на первых этапах развития этих бактериальных сообществ. Исходя из полученных данных о том, что процессы адгезии и формирования биопленок существенно (в 2 раза) ингибировались трипсином и периодатом натрия, можно предполагать, что поверхностные белковые и углеводные структуры бактерий вносят важный сопоставимый вклад в колонизацию поверхности на первых этапах образования биопленок PIA-отрицательными стафилококками. Данный факт особо интересен в связи с тем, что согласно данным литературы (Rohde et al., 2007) и нашим результатам относительно чувствительности суточных биопленок стафилококков к трипсину и устойчивости к периодату натрия, матрикс суточных биопленок, образованных бактериями исследованных нами штаммов, имеет в своем составе преимущественно белковые компоненты. Данные литературы свидетельствуют также о том, что ингибирование процесса образования биопленок при добавлении ДНКазы одновременно с инокулятом проявляется в большей степени (Qin et al., 2007b). В тоже время, нашими исследованиями показано, что собственная внеклеточная ДНК играет большую роль на всех этапах развития биопленок PIA-отрицательных стафилококков, так как внесение в среду инкубации ДНКазы вызывало значительное подавление процессов бактериальной колонизации поверхности, а также деструкцию суточных биопленок двух из трех штаммов S. epidermidis. Несмотря на это, дополнительное внесение в среду инкубации препаратов чужеродной ДНК (КРС) не оказывало влияния на все стадии развития биопленок. Интересно отметить, что все исследованные бактериальные штаммы проявляли различную чувствительность к действию РНКазы (Таблица 11). В связи с тем, что в литературе практически нет данных о каком-либо действии РНКазы на процессы образования биопленок стафилококков (Qin et al., 2007b), и 88 РНК не считается важным компонентом матрикса биопленок, можно предполагать, что обнаруженные эффекты в первую очередь связаны с разрушением мРНК или тРНК, которые участвуют в процессах синтеза белка. Таким образом, активными участниками процессов первичной адгезии бактерий S. epidermidis к поверхности полистирола и формирования многослойных клеточных кластеров являются разнообразные поверхностноассоциированные структуры бактерий, в том числе, белковые молекулы и полисахариды. Изменение этих структур за счет взаимодействия с ионами металлов, детергентами, бактерицидными соединениями или вследствие их ферментативного разрушения в большинстве случаев приводит к снижению сорбционных характеристик бактериальных клеток. Важную роль во взаимодействии бактерий S. epidermidis с поверхностью играет изменение поверхностного заряда бактериальных клеток под действием ионов двухвалентных металлов или мембранотропных соединений, а также за счет наличия аутологичной экзогенной ДНК. 89 ГЛАВА 6. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ S. EPIDERMIDIS 6.1. Действие линезолида на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Полученные ранее результаты исследований показали, что основным механизмом адгезии и формирования биопленок изученных штаммов стафилококков на полистироле, вероятно, являются белковые взаимодействия, как на межклеточном уровне, так и на уровне «клетка-поверхность». В связи с этим дальнейшие эксперименты были направлены на исследование адгезионной способности клеток стафилококков в присутствии линезолида – антибиотика, ингибирующего синтез белка (Skripkin et al., 2008). Обнаружено, что линезолид в концентрации 0,05хМПК не оказывал влияния на адгезию и образование биопленок всеми исследованными штаммами стафилококков (Рисунок 32). Внесение антибиотика в концентрации 0,5хМПК (Таблица 4) снижало как адгезию, так и способность образовывать биопленки OD570 бактериями S. epidermidis 33, 12228 и 29887 (Рисунок 32). * различия статистически значимы при сравнении контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 32. Влияние линезолида (0,05× и 0,5×МПК) на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis. Известно, что сублетальные концентрации антибиотиков, в том числе линезолида, как и некоторые другие стрессовые факторы (повышение 90 температуры и осмолярности среды, присутствие этанола) способны стимулировать адгезию бактерий S. epidermidis, продуцирующих полисахаридный межклеточный адгезин (Rachid et al., 2000). Однако, в отношении PIAотрицательных бактерий S. epidermidis антибиотики в субингибиторных концентрациях, в основном, оказывают отрицательное действие на процессы сорбции бактериальных клеток (Pascual et al., 1986; Cerca et al., 2005a). 6.2. Действие антибактериальных пептидов на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Показано, эффективны в что низкомолекулярные отношении начальных катионные этапов пептиды образования особенно биопленок стафилококками (Overhage et al., 2008, Sandiford and Upton, 2012). В связи с этим, нами проведено изучение процессов адгезии бактерий S. epidermidis при введении в инкубационные среды низкомолекулярных катионных пептидов. Низкомолекулярные катионные пептиды варнерин и хоминин были выделены из сред культивирования бактерий S. warneri KL-1 (Коробов и др., 2010) и S. hominis KLP-1 (Патент РФ № 2528055). Как показали результаты экспериментов, введение в среду иинкубации низкомолекулярного катионного пептида варнерина в концентрациях 1х и 10х МПК (Таблица 4) резко снижало сорбционную активность клеток всех исследованных штаммов стафилококков на поверхности полистирола, в том числе бактерий штамма S. epidermidis ATCC®29887, обладающего устойчивостью к метициллину (Рисунок 33). В связи с тем, что внесение варнерина в среду инкубации не приводило к значительному сокращению количества живых клеток в течение 30 мин (Рисунок 33), можно предполагать, что его антиадгезионная активность не связана напрямую с его бактерицидным действием. 91 * различия статистически значимы при сравнении с контролем (без пептида) (p<0,05) Рисунок 33. Динамика численности живых планктонных и сорбированных на полистироле клеток бактерий S. epidermidis при возрастании концентрации варнерина в среде. В дальнейших экспериментах проведен сравнительный анализ действия исследуемых пептидов на адгезию живых и убитых нагреванием бактерий S. epidermidis 33 к различным поверхностям. В контрольных экспериментах бактерии инкубировали в изотоническом растворе NaCl. В экспериментах с живыми клетками бактерий S. epidermidis 33 присутствие в среде обоих пептидов (0,5 мкг/мл) приводило к снижению числа сорбированных клеток как на гидрофобной поверхности полистирола, так и гидрофильной поверхности стекла практически в 2 раза. При этом, присутствие в среде как варнерина, так и хоминина не оказывало влияния на адгезию термостатированных клеток (Рисунок 34). * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 34. Действие катионных пептидов варнерина (W) и хоминина (H) на адгезию живых и убитых бактерий S. epidermidis 33 на поверхностях стекла и полистирола. 92 Как и в предыдущем случае, несмотря на высокую антиадгезионную активность варнерина и хоминина в отношении живых бактерий S. epidermidis 33, изменения количества живых клеток в среде инкубации в течение 30 мин взаимодействия с пептидами были незначительными (Таблица 12). Таблица 12 Количество КОЕ в течение 30 мин взаимодействия с антибактериальными пептидами в среде LB (х107 КОЕ/мл) Время, мин Контроль Варнерин Хоминин 0 1,3±0,3 1,8±0,4 1,0±0,3 30 0,9±0,3 1,5±0,3 0,5±0,3 Таким образом, можно сделать вывод, что изученные антибактериальные пептиды проявляю свой антиадгезионный эффект только в отношении живых клеток стафилококков. Под действием варнерина и хоминина уровень адгезии живых бактерий снижается до уровня сорбции мертвых клеток. Кроме того, ранее уже упоминалось, что живые и убитые с помощью термической обработки бактерии S. epidermidis отличаются по величине дзета-потенциала (Kłodzińska et al., 2010). Анализируя данные факты, можно предположить, что основным механизмом действия варнерина и хоминина на адгезию бактерий S. epidermidis к поверхностям стекла и полистирола является изменение дзета-потенциала бактериальных клеток. Антиадгезионные свойства варнерина и хоминина могут быть так же связаны с их способностью связываться с внеклеточной ДНК (Sang and Blecha, 2008), которая способствует сорбции бактерий S. epidermidis благодаря увеличению интенсивности кислотно-основных взаимодействий как и между клетками и поверхностью, так и непосредственно между бактериальными клетками (Das et al., 2010; Qin et al., 2007b). Анализ литературы свидетельствует о том, что особое внимание исследователей привлекает изучение возможностей подавления бактериального прикрепления и колонизации имплантатов за счет покрытия их поверхностей антимикробными пептидами (Costa et al., 2011). Действительно, в наших экспериментах предобработка поверхностей полистирола растворами обоих пептидов в течение 60 мин приводила к значительному снижению количества 93 адгезированных бактерий (Рисунок 35). Полученные нами данные показали, что снижение уровня адгезии бактерий S. epidermidis 33 на поверхностях полистирола с иммобилизованными пептидами составило 48 % и 67 % от контроля для варнерина и хоминина, соответственно. Тогда как присутствие пептидов в среде инкубации приводило к снижению на 33% и 29% от контроля для варнерина и хоминина, соответственно. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 35. Влияние растворенных и сорбированных на поверхности полистирола варнерина (W) и хоминина (H) на адгезию бактерий S. epidermidis 33 к полистиролу. Отмечено, что оба катионных пептида не изменяли количества жизнеспособных клеток в среде инкубации в течение 30 мин (Таблица 12, 13). Таблица 13 Количество КОЕ в среде инкубации в течение 30 мин в присутствии иммобилизованных АМП (х107 КОЕ/мл) Время, мин Контроль Варнерин Хоминин 0 1,5±0,3 1,4±0,3 1,5±0,3 30 1,1±0,3 1,1±0,3 1,1±0,4 Известно, что механизм действия большинства катионных пептидов связан с образованием нерегулируемых каналов и пор в плазматических мембранах бактериальных клеток (Shai, 1999), однако, имеющиеся в литературе данные указывают на то, что многие катионные пептиды сохраняют свою активность после иммобилизации на полимерных поверхностях (Costa et al., 2011). 94 В связи с тем, что иммобилизация варнерина и хоминина была проведена с помощью метода физической адсорбции пептидов на поверхности материала, сохранение их активности, скорее всего, связано с непрочным связыванием пептидов с поверхностью полимера. Такая связь определяется только электростатическими или гидрофобными взаимодействиями и может легко разрываться при встрече пептидов с бактериальной клеткой, которая несет больший отрицательный заряд, по сравнению с поверхностью полистирола, и представляет более доступную мишень для положительно заряженных пептидов. Некоторые исследователи так же отмечают увеличение эффективности иммобилизованной формы пептидов по сравнению с растворимой (Costa et al., 2011). Скорее всего, это связано с непосредственным концентрированием антибактериальных пептидов на границе раздела фаз, где их действие особенно заметно. Экспериментально было показано, что антиадгезивный эффект варнерина на клетки бактерий S. epidermidis 33 продолжается и после прекращения контакта Количество клеток/поле зрения клеток с пептидом (Рисунок 36). 20 0,5 M NaCl Трис-HCl 15 * 10 5 0 Контроль W * различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p<0,05) Рисунок 36. Влияние предобработки варнерином (W) бактерий S. epidermidis 33 на адгезию к полистиролу. Так, количество сорбированных бактерий после их контакта с варнерином и отмывки от него буферным раствором снижалось примерно в 5 раз, а после отмывки раствором NaCl всего в 2 раза. Возможный механизм такого действия варнерина на адгезию стафилококков, по-видимому, заключается в связывании 95 пептида на поверхности бактериальных клеток с перманентным проявлением его антибактериальной активности. Для изучения продолжительности ингибирующего эффекта варнерина и хоминина на развитие биопленок бактериями S. epidermidis после удаления пептидов из среды инкубации бактериальным клеткам позволяли прикрепиться к поверхности полистирола в течение 30 мин в присутствии 1хМПК (Таблица 4) катионных пептидов. Затем пептиды и несвязавшиеся бактерии удаляли с помощью ФБ или раствора NaCl (0,5 M), нейтрализующего действие катионных пептидов, и вносили питательную среду для последующего роста бактерий. На основании полученных данных установлено, что продолжительность ингибирующего эффекта катионных пептидов различается между бактериями Количество клеток/поле зрения разных штаммов S. epidermidis и составляет 2 – 5,5 ч (Рисунок 37). 1500 29887 1500 12228 1000 1000 500 500 0 0 0 2 4 6 0 Время, ч Контроль + ФБ Контроль + NaCl 2 4 6 Время, ч H + ФБ W + ФБ W + NaCl H + NaCl Рисунок 37. Продолжительность ингибирующего действия варнерина (W) и хоминина (H) на образование биопленок бактериями S. epidermidis после адгезии (30 мин) в присутствии катионных пептидов и их удаления растворами ФБ или 0,5 M NaCl. Максимальная чувствительность к обоим пептидам была обнаружена у бактерий штамма S. epidermidis 33, для которого МПК катионных пептидов было минимальными по сравнению с другими штаммами этого вида (Таблица 4). Так, после удаления из среды катионных пептидов, количество связанных с поверхностью полистирола бактериальных клеток S. epidermidis 33, «стрессированных» катионными пептидами в течение 30 мин, было заметно меньше контрольных на протяжении 5,5 ч. Отделение хоминина от клеток 96 бактерий S. epidermidis 33 с помощью 0,5 М раствора NaCl приводило к сокращению времени генерации бактерий в 1,5 раза по сравнению клетками, промытыми ФБ. В случае варнерина разница между вариантами удаления пептида была более значительной, и отличие во времени удвоения числа сорбированных клеток составило 3,8 раза (Табл. 14). Для бактерий S. epidermidis 12228 ингибирование процесса образования биопленки сохранялось, по крайней мере, в течение 4 ч после удаления пептидов, но после этого периода количество сорбированных клеток начинало увеличиваться с тем же временем удвоения, что и в контроле (Таблица 14). Не было обнаружено отличия во времени удвоения при удалении пептидов с помощью ФБ или раствора NaCl. Наименьший эффект обоих пептидов был выявлен в отношении бактерий S. epidermidis 29887, для которых торможение процесса образования биопленок проявлялось только в течение 2 ч после удаления катионных пептидов. Кроме того, присутствие как варнерина, так и хоминина на этапе адгезии не влияло на последующую скорость роста биопленки (Таблица 14). Как и в случае изучения бактерий S. epidermidis 12228, на время генерации не оказывало влияние природа раствора, с помощью которого клетки были отмыты от низкомолекулярных катионных пептидов. Таблица 14 Время удвоения числа сорбированных клеток бактерий S. epidermidis после адгезии в присутствии 1хМПК варнерина (W) или хоминина (H) (мин) Среда Контроль W H Штамм ФБ NaCl ФБ NaCl ФБ NaCl S. epidermidis 33 77±1 77±1 495 ± 34 130 ± 10* S. epidermidis 12228 60±2 67±1 67±3 70±5 55±4 55±3 S. epidermidis 29887 67±3 73±2 74±2 79±4 88±17 110±35 217 ± 26 141 ± 9* * различия статистически значимы при сравнении данными в ФБ (p<0,05) Для бактерий S. epidermidis 33, проявивших наибольшую чувствительность к использованным пептидам, так же была проведена оценка количества 97 жизнеспособных планктонных клеток во время роста биопленок после адгезии бактериальных клеток в присутствии варнерина и хоминина (Таблица 15). Таблица 15 Изменение количества КОЕ/мл бактерий S. epidermidis 33 после адгезии в присутствии варнерина (W) и хоминина (H) Контроль W H Время, ч Промывка Промывка Промывка Промывка Промывка Промывка ФБ NaCl ФБ NaCl ФБ NaCl 5 5 5 5 5 0 4,2·10 1,2·10 2,3·10 0,6·10 1,8·10 0,8·105 1,5 1,8·106 1,3·106 3,6·105 1,9·105 4,0·105 3,9·105 3 6,8·106 3,9·106 1,2·106 1,7·106 1,1·106 2,4·106 4,5 1,1·107 1,5·107 0,6·107 1,2·107 0,6·107 1,6·107 Полученные данные свидетельствуют о том, что молекулы пептидов, связанные с адсорбированными на поверхности бактериальными клетками, не оказывают значительного антибактериального эффекта на планктонные клетки. Таким образом, можно предположить, что торможение развития биопленок бактериями S. epidermidis 33, скорее всего, связано не с бактерицидным действием изученных антибактериальных пептидов, а их способностью регулировать синтез белков, необходимых для образования биопленок. Так, показано, что пептид LL-37 ингибирует образование биопленок за счет изменения экспрессии генов, необходимых для формирования биопленок (Overhage et al., 2008). Возможно, такой механизм связан с управлением, например, agr системой, способной активироваться короткими аутоиндукторными пептидами (Ji et al., 1997). Подобный длительный эффект ингибирования образования биопленок бактерий S. epidermidis так же обнаружен у пептида гепцидин 20, выделенного из гепатоцитов человека (Brancatisano et al., 2014). Для изучения действия катионных пептидов на зрелые биопленки к сформировавшимся в течение 24 ч в питательной среде LB биопленкам добавляли растворы катионных пептидов в концентрации 0,5 и 2,0 мг/мл. Кроме варнерина и хоминина был проанализирован катионный пептид низин, выделенный из лактобактерий Lactococcus lactis subsp. lactis (Mattick and Hirsch, 1947) и используемый в качестве стандарта при проведении аналогичных исследований. 98 В результате экспериментов для большинства использованных штаммов бактерий было выявлено S. epidermidis характерное снижение уровня биомассы пленок при всех использованных концентрациях пептидов (Рисунок 38). Данный эффект был характерен для всех исследованных пептидов, однако, низин оказывал минимальное разрушающее действие на биопленки стафилококков по сравнению с варнерином и хоминином. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 38. Концентрационная зависимость действия АМП (варнерина, хоминина, низина) на суточные биопленки бактерий S. epidermidis. Имеющиеся в литературе данные указывают на способность многих катионных пептидов проявлять свое литическое действие в отношении планктонных культур бактерий или предотвращать развитие биопленок при внесении одновременно с инокулируемыми бактериями. И лишь некоторые антибактериальные пептиды сформировавшиеся биопленки, обладают причем, способностью чаще всего, разрушать образованные грамотрицательными бактериями (Jorge et al., 2012). Разрушающее действие этих катионных пептидов в отношении биопленок, по-видимому, связано с их способностью, в отличие от традиционных антибиотиков, убивать медленно растущие и покоящиеся клетки, которые преобладают в этих особых бактериальных сообществах (Jorge et al., 2012). Таким образом, нами показано, что низкомолекулярные катионные пептиды варнерин и хоминин обладают не только антиадгезионной активностью в 99 отношении бактерий S. epidermidis, но и выраженным литическим действием на сформированные биопленки этих бактерий, в том числе штамма с устойчивостью к метициллину (S. epidermidis ATCC®29887). 100 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS В ПРИСУТСТВИИ КОМПОНЕНТОВ КРОВИ Известно, что после контакта с кровью поверхность полимера практически мгновенно покрывается белками плазмы (Cottonaro et al., 1981) с достижением полного насыщения через 15 – 60 мин (Cottonaro et al., 1981; Ishiguro et al., 2005). Исследование краевого угла смачивания поверхности полистирола, предобработанной различными белками плазмы крови, показало, что наслоение растворов плазмы и альбумина приводит к тому, что поверхность становится гидрофильной по сравнению с контролем, тогда как в случае предобработки поверхности полистирола фибронектином контактный угол смачивания практически не изменяется (Таблица 16). Таблица 16 Физико-химическая характеристика поверхности полистирола после наслоения белковых компонентов крови в течение 1 ч. Контактный Адгезия к Cредняя Средняя Компонент угол кантилеверу, разница в шероховатость, крови смачивания, ° nN высоте, Rz, нм Ra, нм Контроль 2,9±0,4 2,4±3,5 0,47±0,02 78±2 Плазма 4,9±1,5* 3,4±3,8 0,96±0,02* 18±2* БСА 2,6±0,5 2,1±0,4 0,34±0,002* 21±3* Фн 3,6±0,3 2,9±0,4 0,64±0,002* 73±4 * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Из результатов, полученных с помощью атомно-силовой микроскопии, видно (Рисунок 39), что предобработка поверхности полистирола 10% раствором плазмы крови приводит к повышению шероховатости поверхности почти в 2 раза по сравнению с контролем (Таблица 16). Так же отмечается, что сила адгезии кантилевера к предобработанным белковыми компонентами поверхностям полистирола изменялась в случае наслоения всех содержащих белок растворов (Таблица 16). Максимальный эффект оказывает раствор плазмы (повышение сил адгезии в 2 раза), меньшее – Фн (в 1,5 раза) и, наконец, альбумин вызывает ослабление сил адгезии между кантилевером и поверхностью полистирола практически в 1,3 раза. 101 Рисунок 39. АСМ изображения поверхностей полистирола после предобработки белковыми компонентами крови. a – без обработки; b – плазма крови человека, 10%; c – БСА, 0.5%; d – Фн, 25 мкг/мл. Многочисленными исследованиями установлена тесная связь между ранними этапами бактериальной адгезии и шероховатостью атакуемых поверхностей (Scheuerman et al., 1998). Результаты наших экспериментов показали, что более гладкая (среднее Ra=2,9 нм) необработанная поверхность полистирола характеризуется большей адгезией бактерий по сравнению с таковой после обработки препаратами плазмы (среднее Ra=4,9 нм) (Рисунок 40А). Интересно отметить, что поверхности полистирола после обработки альбумином (Ra=2,6 нм) и фибронектином (Ra=3,6 нм) обладают близкой топологией с необработанной поверхностью (Ra=2,9 нм), но различаются по способности сорбировать бактерии S. epidermidis (Рисунок 40А). Так, адгезия клеток стафилококков к поверхности после обработки альбумином снижается в 2-3 раза по сравнению с контролем. В недавней работе Shida с соавт. показано, что шероховатость поверхности менее чем 10 нм Ra имеет незначительное влияние на адгезию бактерий S. epidermidis (Shida et al., 2013). Это подтверждает более раннее предположение о том, что in vivo шероховатость поверхности ниже пороговой величины (Ra=200 нм) не влияет на бактериальную адгезию (Bollen et al., 1997). Полученные нами экспериментальные данные подтверждают 102 вышеупомянутые утверждения, и позволяют сделать вывод о том, что при сравнении значения шероховатости и гидрофобности полимерной поверхности в процессах адгезии бактерий, последняя характеристика поверхности имеет наибольшее значение. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05)) Рисунок 40. Адгезия бактерий S. epidermidis к полистиролу после адсорбции на его поверхности компонентов крови (А) и в растворах, содержащих белки сыворотки или плазму крови (Б). Следует отметить, что присутствие в среде инкубации плазмы, БСА и Фн не влияло на уровень жизнеспособности клеток стафилококков, что было показано с помощью определения числа живых клеток (КОЕ/мл) (Таблица 17). Таблица 17 Количество КОЕ бактерий S. epidermidis 33 в среде инкубации после адгезии на поверхности полистирола (х107 КОЕ/мл) Компонент крови В растворах, содержащих белки сыворотки или плазму крови Контроль Плазма БСА Фн 1,3 ± 0,4 0,8 ± 0,3 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,3 Результаты проведенных нами При адсорбции белков сыворотки или плазмы крови на поверхности 1,2 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,2 ± 0,3 1,3 ± 0,2 экспериментов (Рисунок 40), характеризующих сорбционную активность плазмы крови и её основного белка – альбумина – согласуются с известным данными о том, что плазма крови и альбумин значительно снижают бактериальную адгезию таких важных патогенов, 103 как псевдомонады и стафилококки (Brokke et al., 1991; Fletcher and Marshall, 1982; Hogt et al., 1985a; Kinnari et al., 2005). Показано также, что бактерии штамма S. epidermidis ATCC®12228, использованного и в нашем исследовании, в меньшей степени способны к адгезии на разнообразных полимерных материалах, включая полиэтилентерефталат, фторэтиленпропилен, полиэтиленуретан, силикон, а так же боросиликатное стекло, после иммобилизации на них альбумина (Linnes et al., 2012). Одновременно с этим, выявлена связь между ослаблением адгезии всех исследованных штаммов S. epidermidis (Рисунок 40) и снижением контактного угла смачивания (Таблица 16) в случае преадсорбции альбумина и плазмы крови на поверхности полистирола. Данный факт позволяет сделать вывод о выраженной зависимости адгезии использованных в настоящей работе штаммов стафилококков к полимерной поверхности от степени её гидрофобности. Это согласуется с утверждением о том, что основные механизмы действия альбумина и плазмы на адгезию бактериальных клеток обусловлены сорбцией белковых соединений на поверхностях полимеров, сопровождающейся снижением свободной энергии этих поверхностей. В дополнение к этому было показано, что макромолекулы, связанные с поверхностями, снижают и их гидрофобность, что было выявлено по измерениям контактных углов смачивания полистирола (Fletcher, 1976) и фторэтиленпропилена (Hogt et al., 1985a) и полиэтилена (Brokke et al., 1991). Как показано в наших экспериментах, предобработка поверхности полистирола Фн могла оказывать как стимулирующее действие на сорбцию бактериальных клеток (S. epidermidis 12228 и 29887), так и не проявлять никакого видимого эффекта (S. epidermidis 33) (Рисунок 40). Аналогичные данные были получены так же Brokke с соавт. при иммобилизации Фн на поверхностях полиэтиленовых катетеров, выявивших значительное снижение количества сорбированных бактерий трех из пяти штаммов S. epidermidis и адгезию на уровне контроля бактерий оставшихся двух штаммов (Brokke et al., 1991). 104 Данный эффект, по-видимому, не связан с изменением гидрофобности поверхности полистирола, так как иммобилизация Фн не изменяла контактный угол смачивания полистирола, в отличие от плазмы и альбумина (Таблица 16) или различием в гидрофобных характеристиках исследованных штаммов S. epidermidis, так как они все обладали схожей адгезией к гексадекану (Таблица 5). Скорее всего, выявленная гетерогенность связывания бактерий различных штаммов стафилококков с предобработанными Фн поверхностями связана с уровнем специфичности взаимодействия между бактериальными клетками отдельных штаммов и данным белком. В работе Linnes с соавт. с помощью вестерн-блота экстрактов клеточных стенок определен уровень синтеза и продукции Фн-связывающего белка Embp нескольких штаммов S. epidermidis, включая S. epidermidis ATCC®12228 (Linnes et al., 2013). Таким образом, повышение адгезии бактерий S. epidermidis 12228 и 29887 к поверхностям полистирола с адсорбированным Фн позволяет предполагать наличие на поверхностях бактериальных клеток белка, подобного Embp, и отсутствие подобных структур на поверхности бактерий S. epidermidis 33. Уровень бактериальной адгезии в растворах плазмы и БСА, а так же покрытия ими поверхности полистирола был практически одинаков для всех изученных штаммов S. epidermidis (Рисунок 40). Данный факт может быть обусловлен тем, что после контакта крови с поверхностью, альбумин адсорбируется на ней в первую очередь (Vroman et al., 1980). В то же время отмечалась разница между адгезией бактерий S. epidermidis 29887 в растворе Фн при сравнении с количеством сорбированных клеток на предобработанной Фн поверхности (Рисунок 40). Обнаруженное отличие, вероятнее всего, отражает конформационные изменения, которые происходят с молекулой Фн после иммобилизации. Так, показано, что в глобулярном белке Фн после его иммобилизации на поверхности полистирола доступным для связывания становится его N-терминальный домен (Proctor, 1987), обладающий высоким сродством к поверхностям бактерий S. epidermidis (Jarvis and Bryers, 2005). 105 ГЛАВА 8. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS Известно, что в биопленках бактерии обмениваются информацией с помощью сигналов системы QS, которые являются молекулами особых соединений, способными регулировать экспрессию генов, чувствительных к плотности бактериальных популяций (Kong et al., 2006). В настоящее время нарушение этих межклеточных коммуникаций рассматривается как перспективный подход борьбы с бактериальными пленками (Романова и Гинцбург, 2011). Сигнальные молекулы QS грамположительных бактерий, чаще всего, являются пептидами, сравнимыми по функциям с феромонами и гормонами, которые состоят из 8 или 12 аминокислотных остатков и имеют в своем составе тиолактоновое кольцо (Olson et al., 2014). Наибольшую роль сигнальные молекулы играют на поздних стадиях развития биопленок, в частности, они участвуют в регуляции клеточного деления, уровня плотности биопленки, продукции экзополимерного матрикса, а также процессов диссеминации зрелых биопленок (Otto, 2012). действие этих соединений показано и на первых этапах формирования бактериальных пленок (Vuong et al., 2000). Вместе с тем, реакция на встречу бактерий с поверхностями различных материалов, по-видимому, так же может сопровождаться синтезом специфических соединений, способствующих их сорбции и индукции заселения. В связи с этим, нами был проведен поиск подобных соединений, продуцируемых во внешнюю среду атакующими поверхность полистирола бактериями S. epidermidis в процессе адгезии и первых этапов роста биопленок, и оценка их влияния на адгезию и образование бактериальных пленок Действительно, использование фильтратов сред, полученных в разные периоды времени развития «прикрепленной» популяции, как инкубационной среды роста другой части бактериальных клеток того же инокулума, позволило выявить значительное повышение интенсивности адгезии бактерий и формирования ими биопленок по сравнению с подобными показателями на 106 исходной питательной среде (Таблица 20). При этом для бактерий S. epidermidis 33 увеличение численности связанных с поверхностью «новых» бактериальных клеток достигало 31–37% при развитии их в фильтратах среды, полученных на первых сроках инкубации бактерий этого же инокулума в течение первых 30–120 мин. Для других штаммов бактерий S. epidermidis такого эффекта на первых этапах колонизации поверхности полистирола выявлено не было, однако, в случае изучения бактерий S. epidermidis 12228 показано, что фильтраты среды после развития биопленок в течение 120 и 240 мин стимулировали развитие биопленок практически в 2 раза. Таблица 20 Адгезия (30 мин) и образование биопленок (24 ч) бактериями S. epidermidis в фильтратах среды, полученных в различные интервалы времени роста бактериальной популяции. Время отбора среды для получения фильтрата Исходная среда 0 мин 30 мин 60 мин 120 мин 240 мин S. epidermidis 33 Адгезия, количество клеток/ поле зрения Биомасса пленок, OD570 S. epidermidis 12228 Адгезия, количество клеток/ поле зрения Биомасса пленок, OD570 S. epidermidis 29887 Адгезия, количество клеток/ поле зрения Биомасса пленок, OD570 49± 7 0,19±0,02 83±19 0,24±0,07 76±17 0,32±0,05 49±12 64±13* 67±10* 62± 7* 44±15 0,17±0,03 0,20±0,02 0,20±0,05 0,16±0,01 0,19±0,03 83±24 78±15 80±15 75±19 85±27 0,25±0,04 0,24±0,03 0,26±0,04 0,41±0,10* 0,47±0,07* 59±14 79±18 66± 9 68± 8 81±16 0,30±0,04 0,24±0,05 0,30±0,02 0,29±0,04 0,24±0,04 * различия статистически значимы при сравнении с данными в «исходной среде» (p<0,05) Для подтверждения механизмов подобного действия неизвестных факторов, которые не могли быть обусловлены истощением питательных компонентов среды культивирования на начальных сроках роста бактериальной популяции, дальнейшие эксперименты проводились по указанной выше схеме, при которой питательная среда была заменена на ФБ (10 мМ, рН 7,2). Кроме того, для оценки влияния на этот процесс характера атакуемой поверхности эксперименты были проведены с использованием полистирола и стекла. 107 Показано, что стимулирующий адгезию эффект был обнаружен только для фильтратов, полученных после 60 мин взаимодействия бактерий S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола. При этом фильтраты, полученные после контакта бактерий с поверхностью стекла, практически не оказывали влияния на адгезию бактерий (Рисунок 41). 60 * 40 20 0 0 20 40 60 Время получения фильтратов, мин Фильтрат после адгезии на полистироле Фильтрат после адгезии на стекле * различия статистически значимы при сравнении с данными при 0 мин (p<0,05) Рисунок 41. Адгезия бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола в фильтратах среды, полученных после адгезии бактерий того же штамма в ФБ на поверхности полистирола и стекла. Масс-спектрометрический анализ полученных фильтратов с помощью метода MALDI-TOF показал, что инкубация клеток S. epidermidis 33 в ФБ на различных типах поверхностей приводит к выделению в среду некоторых соединений (Рисунок 43). При этом адгезия как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхности клетки сопровождается выделением в среду низкомолекулярных соединений с отношением массы к заряду от 264 до 684. Однако, при сорбции на полистироле, поверхность которого более благоприятна для адгезии клеток стафилококков, содержание этих соединений в среде значительно выше, чем при адгезии на стекле (Рисунок 42). С увеличением времени инкубации содержание всех соединений, в основном, увеличивается практически на порядок, независимо от типа поверхности. Кроме того, дополнительно обнаруживаются три соединения с мол. массами 552, 574 и 596 Да. 108 Появление этих соединений по времени совпадает с периодом увеличением числа связанных с поверхностью полистирола бактериальных клеток (Рисунок 41). Это дает основание предполагать возможное наличие у данных соединений функций «агентов кворума». Рисунок 42. Масс-спектры фильтратов, полученных после адгезии бактерий S. epidermidis 33 в ФБ на поверхностях полистирола и стекла: 1 – фильтрат после адгезии на стекле, 30 мин; 2 – фильтрат после адгезии на полистироле, 30 мин; 3 – фильтрат после адгезии на стекле, 60 мин; 4 – фильтрат после адгезии на полистироле, 60 мин. В связи с тем, что регуляторными молекулами систем QS у бактерий рода Staphylococcus выступают короткие пептиды (Vuong et al., 2000; Olson et al., 2014), было высказано предположение, что обнаруженные соединения также могут относиться к группе пептидных молекул. Для этого бесклеточные фильтраты (0,20 мкм), полученные после контакта бактерий с поверхностью полистирола в течение 60 мин, были проинкубированы с протеазами (трипсином и протеиназой К), а затем после удаления ферментов ультрафильтрацией (10 кДа) были вновь использованы в качестве адгезионной среды.. Результаты этих исследований показали, что обработка фильтратов протеолитическими 109 ферментами приводила к потере их стимулирующего действия на адгезию S. epidermidis 33 (Рисунок 43), одновременно выявляя пептидную природу этих соединений. * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p<0,05) Рисунок 43. Адгезия бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола в фильтратах, полученных после адгезии бактерий того же штамма в ФБ на поверхности полистирола в течение 60 мин и обработанных трипсином и протеиназой К. Таким образом, результаты наших исследований процессов адгезии бактерий S. epidermidis выявляют возможность функционирования ауторегуляции процесса сорбции клеток при освоении бактериальной популяцией свободных поверхностей на границах раздела фаз. Кроме того, полученные данные позволяют рассматривать в качестве важных участников этих событий низкомолекулярные соединения, которые, по данным масс-спектрометрии обладают мол. массой 550 – 600 Да и, по-видимому, имеют пептидную природу. 110 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследования последних лет свидетельствуют о том, что сапрофитные бактерии S. epidermidis являются одной из главных причин внутрибольничных инфекций, сопутствующих имплантациям различных медицинских устройств (Vuong, Otto, 2002; Sievert et al., 2013). Распространение ассоциированных со стафилококками инфекций обусловлено способностью этих бактерий колонизировать атакуемые поверхности устройств с образованием на них биопленок – особых структурированных сообществ бактериальных клеток, функционирующих в формируемом ими полимерном матриксе (O’Toole et al., 2000). В таком состоянии бактерии проявляют значительно более выраженную устойчивость к различным физико-химическим воздействиям, антибиотикам и факторам иммунной защиты хозяина (von Eiff et al., 1999). Процессы образования бактериальных пленок, в общем, могут быть представлены в виде последовательных этапов, включающих в себя первичную адгезию бактерий к поверхности, адаптацию к ней путем формирования микроколоний и последующее освоение свободных зон поверхности, благодаря выделению в среду особых высокомолекулярных полимерных соединений. Эти полимеры углеводной и пептидной природы способствуют закреплению адгезированных к данной поверхности бактерий, а затем, заполняя окружающее межклеточное пространство, способствуют удержанию делящихся клеток на поверхности либо распространению их в окружающем пространстве (O’Toole et al., 2000). Известно, что адгезия микроорганизмов в значительной степени определяется как физико-химическими свойствами поверхностей атакуемого материала: гидрофобностью, зарядом, шероховатостью и химическим составом (An, Friedman, 2000), так и физико-химическими характеристиками бактериальных клеток (von Eiff et al., 2002), в частности, уровнем гидрофобности клеточной поверхности (Oliveira et al., 2001) и величиной их поверхностного заряда (van Loosdrecht et al., 1990). Бактериальная адгезия, во многом, зависит и от факторов среды – состава (Hussain et al., 1992), гидродинамических условий 111 (Neu, Marshall, 1990), температуры (Fitzpatrick et al., 2005; da Silva Meira et al., 2012), присутствия антибиотиков и дезинфектантов (Cerca et al., 2005a; Стрелкова и др., 2012). В проведенных нами исследованиях показано, что динамика адгезии бактерий к абиотическим поверхностям, помимо приведенных факторов, зависит и от физиологического состояния бактериальных клеток. При этом, клетки логарифмической фазы роста бактериальной культуры характеризуются как более высокими показателями адгезии (Рисунок 5), так и большей чувствительностью к изменению физико-химических параметров среды (Рисунки 7, 9, 10, 12) по сравнению с клетками стационарной фазы развития бактериальной популяции. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что повышение сдвигающих усилий, понижение температуры и закисление среды инкубации приводят к снижению адгезии бактерий S. epidermidis к поверхности полистирола. Кроме того, адгезия бактерий к поверхностям стекла и полистирола так же снижается при возрастании осмолярности среды, и при увеличении ионной силы раствора (1,0–2,0 М NaCl) различия в количестве сорбированных клеток на разных типах поверхностей практически нивелируются (Рисунок 12). Вместе с тем, внесение в среду роста 0,5% глюкозы не приводит к значимым изменениям ни в количестве сорбированных на поверхности полистирола клеток, ни в биомассе образованных пленок (Рисунок 14). Имеющиеся двухвалентные в литературе катионы способны данные свидетельствуют ингибировать о образование том, что биопленок бактериями S. aureus (Shukla, Rao, 2013), но усиливать образование этих структур бактериями S. epidermidis (Dunne Jr, Burd, 1992; Ozerdem Akpolat et al., 2003). Однако, результаты наших исследований показали, что влияние двухвалентных катионов как на сорбцию, так и на образование биопленок использованными в работе штаммами стафилококков в значительной степени зависит от их концентрации в среде инкубирования (Рисунок 18). При повышении содержания в среде каждого из катионов Ca2+, Mg2+, Zn2+ или Mn2+ до 2,5 мМ, как правило, наблюдалось ингибирование процессов бактериальной колонизации. Возможно, 112 подобное действие ионов металлов на адгезию S. epidermidis бактерий обусловлено их влиянием на дзета-потенциал клеток (Таблица 7). Кроме того, впервые установлено, что внесение в среду мембранотропных соединений также бактериальной оказывает сорбции, значительное вероятно, за счет влияние на изменения интенсивность общего заряда бактериальных клеток. При этом наибольшая роль в адгезии и формировании биопленок бактериями S. epidermidis принадлежит Δψ – электрической составляющей их мембранного потенциала (Рисунок 24). Согласно данным литературы, внесение в среду экзогенной ДНК сдвигает дзета–потенциал бактериальных клеток, в том числе вида S. epidermidis, в более отрицательную зону (Das et al., 2011). Результаты наших исследований указывают на то, что введение в среду инкубации аутологичной ДНК приводит к увеличению числа сорбированных клеток практически в 1,5 раза. При этом действие экзДНК на сорбцию бактерий S. epidermidis обладает видовой специфичностью, поскольку внесение чужеродной ДНК как бактериального, так и животного происхождения, не вызывало значительных изменений количества связавшихся с поверхностью полистирола клеток (Рисунок 28). Известно, что первичное прикрепление бактерий к поверхностям различных материалов, во многом зависит от некоторых поверхностных белков сорбирующихся клеток, которые необходимы для первоначального контакта микроорганизмов с поверхностью (Navarre, Schneewind, 1999). Поэтому изменение поверхности бактериальной клетки путем обработки препаратами, способными влиять на структуру локализованных на внешней поверхности белковых молекул, приводит к изменению сорбционных свойств бактерий. Действительно, внесение в среду инкубации детергентов, солюбилизирующих поверхностные белковые компоненты, приводит к значительному снижению численности сорбированных на поверхностях бактерий (Рисунок 21). В специальных экспериментах показано негативное влияние лизоцима на адгезию использованных в работе штаммов стафилококков, которое, возможно, обусловлено со снижением содержания количества пептидогликана и, как 113 следствие, его отрицательно заряженных группировок в клеточных стенках бактерий (Рисунки 25 и 27Б). Представляют интерес данные сравнительного анализа действия ферментов на различные этапы образования биопленок стафилококков. Показано, что зависимость между чувствительностью зрелых биопленок к действию гидролаз и влиянием этих же факторов на процессы образования биопленок не является жесткой. В свою очередь, снижение количества сорбированных клеток под действием тех же литических ферментов приводит к торможению процесса формирования биопленок (Таблица 11). Согласно данным литературы, сублетальные дозы антибиотиков способны как подавлять (Cerca et al., 2005a; Stewart et al., 2013), так и стимулировать (Rachid et al., 2000) адгезию стафилококков. В то же время, показано, что низкомолекулярные катионные пептиды, рассматривающиеся в качестве перспективной альтернативы современным антибиотикам (Vaara, 2009), обладают ингибирующим действием на начальных этапов образования биопленок стафилококками (Overhage et al., 2008, Sandiford and Upton, 2012). Действительно, нами обнаружено, что низкомолекулярный катионный пептид варнерин в концентрациях 0,1 – 10хМПК оказывал выраженное ингибирующее действие на адгезию стафилококков к полистиролу, в том числе бактерий антибиотикоустойчивого штамма S. epidermidis ATCC®29887 (Рисунок 33). Важно отметить, что оба использованных в экспериментах катионных пептида (варнерин и хоминин) проявляли антиадгезионную активность как в растворенном, так и в сорбированном на поверхности полистирола состояниях (Рисунок 35). Показано, что предобработка бактерий S. epidermidis 33 варнерином значительно, практически, в 5 раз снижает их сорбционную активность (Рисунок 36). При изучении продолжительности ингибирующих эффектов варнерина и хоминина на развитие биопленок бактерий S. epidermidis обнаружено, что длительность постантибактериального эффекта обоих пептидов зависит от штамма бактерий и может составлять от 2 до 5,5 ч (Рисунок 37). Можно предполагать, что торможение развития биопленок бактерий S. epidermidis, скорее 114 всего, связано не с прямым бактерицидным действием изученных катионных пептидов, а с их способностью влиять на синтез белков, необходимых для образования биопленок. Подобный эффект был показан в отношении выделенного из лейкоцитов человека пептида LL-37 (Overhage et al., 2008), и гепцидина 20, изолированного из гепатоцитов человека (Brancatisano et al., 2014). Известно, что в условиях in vivo, вероятнее всего, не существует непосредственного свободными взаимодействия стерильными между абиотическими бактериальными клетками поверхностями, и поскольку, контактирующие с кровью поверхности вводимых имплантатов, практически, мгновенно покрываются белками сыворотки крови (Herrmann et al., 1988; Ishiguro et al., 2005). Эта, так называемая, «кондиционная пленка» способна существенно изменять физико-химические свойства поверхности, влияющие на бактериальную адгезию (Fletcher, 1976). Действительно, полученные в работе данные свидетельствуют о том, что предобработка поверхностей полистирола, широко используемого для изготовления различных изделий медицинского назначения, плазмой крови или альбумином снижает уровень её гидрофобности (Таблица 16) и, в связи с этим, ингибирует адгезию бактерий S. epidermidis. В то же время иммобилизация на поверхности полистирола фибронектина способствует стимуляции адгезии некоторых штаммов бактерий S. epidermidis, по-видимому, за счет его специфических взаимодействий с поверхностными белками бактериальных клеток (Рисунок 40). Следует отметить, что наблюдаемое изменение шероховатости поверхности полистирола за счет адсорбции на ней плазмы, альбумина или фибронектина не коррелирует с изменением связывания бактерий S. epidermidis (Таблица 16, Рисунок 40). Анализ возможности ауторегуляции адгезионных процессов при освоении бактериальной популяцией свободных поверхностей на границе раздела фаз показал, что начальные периоды колонизации поверхности полистирола бактериями S. epidermidis сопровождаются выделением в окружающую среду низкомолекулярных соединений, появление которых установлено масс- 115 спектрометрическим методом (Рисунок 42). В связи с тем, что внесение бактерий в среду инкубации, содержащую эти соединения, вызывало значительное ускорение адгезии бактериальных клеток (Рисунок 41), можно предполагать наличие у них функций факторов регуляции освоения поверхностей по типу систем кворума. Кроме того, чувствительность данных соединений к действию протеаз (Рисунок 43) согласуется с тем, что сигнальными молекулами системы QS грамположительных бактерий, чаще всего, являются пептиды небольшого размера (Olson et al., 2014). 116 ВЫВОДЫ 1. Повышение сдвигающих усилий и осмотического давления среды, понижение температуры и закисление среды сопровождаются снижением адгезии бактерий исследованных штаммов S. epidermidis к поверхностям стекла и полистирола. 2. Увеличение концентрации ионов кальция, магния, цинка и марганца в среде формирования бактериальных пленок приводит к ингибированию процессов сорбции и формирования биопленок бактерий S. epidermidis на поверхностях полистирола, по-видимому, вследствие изменения дзета-потенциала бактериальных клеток. 3. Детергенты и гидролитические ферменты, изменяющие поверхностные характеристики бактериальных клеток, снижают адгезию S. epidermidis к гидрофобной поверхности полистирола. 4. Присутствие в среде аутологичной ДНК оказывает стимулирующий эффект на сорбцию бактерий S. epidermidis, в то время как введение в среду чужеродной ДНК как бактериального, так и животного происхождения, не вызывает каких-либо значительных изменений интенсивности этого процесса. 5. Низкомолекулярные катионные пептиды семейства лантибиотиков варнерин и хоминин снижают адгезию и интенсивность образования биопленок бактерий S. epidermidis, в том числе обладающих устойчивостью к метициллину, как на гидрофобной, так и гидрофильной поверхностях. 6. Обработка поверхности полистирола сывороточным альбумином или плазмой крови ингибирует адгезию к ней бактерий S. epidermidis за счет снижения её гидрофобности, тогда так обработка фибронектином повышает их адгезию, повидимому, за счет специфических взаимодействий этого белка с поверхностными структурами бактериальных клеток. 7. Адгезия бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола сопровождается выделением в среду низкомолекулярных соединений, повидимому, пептидной природы, стимулирующих сорбцию бактерий на начальных этапах освоения ими поверхностей, возможно, в качестве факторов кворума. 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Афиногенова, А.Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса/ А.Г. Афиногенова, Е.Н. Даровская. // Травматология и ортопедия России. – 2011. Т. 3. № 61. – С. 119–125. 2. Бухарин, О.В. Влияние активных форм кислорода на адгезивные характеристики и продукцию биопленок бактериями/ О.В. Бухарин, А.А. Сгибнев. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2012. – № 3. – С. 70–73. 3. Грызунов, Ю.А. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Ю.А. Грызунов, Г.Е. Добрецов / М.: Ириус, 1994. – 226 c. 4. Дерябин, Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность / Д.Г. Дерябин / Екатеринбург: УрО РАН, 2000. – 239 c. 5. Ильина, Т.С. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Мол. генетика, микробиол. вирусол. – 2006. – № 3. – С. 22–29. 6. Выделение и характеристика нового низкомолекулярного антибактериального пептида семейства лантибиотиков/ В.П. Коробов [и др.] // Микробиология. – 2010. – Т. 79. – №2. – С. 228–238. 7. Коробов, В.П. Патент РФ № 2528055. – 2014. 8. Николаев, Ю.А. Биопленка - “город микробов” или аналог многоклеточного микроорганизма?/ Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов. // Микробиология. – 2007. – Т. 76. – № 2. – С. 149–163. 9. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04) // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2004. – Т. 6. – № 4. – С. 306– 359. 10. Потехина, Н.В. Тейхоевые кислоты акиномицетов и других грам- положительных бактерий/ Н.В. Потехина. // Успехи биологической химии. – 2006. – Т. 46. – С. 225–278. 118 11. Романова, Ю.М. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2011. – №3: – С. 100–110. 12. Стимуляция антибиотиками процесса формирования бактериальных биопленок/ Е.А. Стрелкова [и др.] // Микробиология. – 2012. – Т. 81. – № 2. – С. 282–285. 13. Образование биопленок стафилококков на поверхности титана и титана с углеродной алмазоподобной пленкой и действие на них низкомолекулярного катионного пептида варнерина/ И.Ш. Трахтенберг [и др.]. // Перспективные материалы. – 2013. – № 4. – С. 39–44. 14. Новый метод исследования антибиотикорезистентности бактериальных биоплёнок / И.В. Чеботарь [и др.]. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2012. – Т. 14. – № 4. – С. 303–308. 15. Фалова, О.Е. Влияние углеводов на интенсивность адгезии золотистого стафилококка/ О.Е. Фалова. // Вестник новых медицинских технологий. – 2011. – Т. 18. – № 1. – С. 11–12. 16. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ. // под ред. Д. Хоулт и др. М.: Мир, 1997. – 432 c. 17. In vitro oxidant effects of D-glucosamine reduce adhesión and biofilm formation of Staphylococcus epidermidis./ V. Aiassa [et al.] // Rev. Argent. Microbiol. – 2012. – V. 44. – № 1. – P. 16–20. 18. Rapid quantification of staphylococci adhered to titanium surfaces using image analyzed epifluorescence microscopy/ Y.H. An [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 1995. – V. 24. – P. 29–40. 19. The prevention of prosthetic infection using a cross-linked albumin coating in a rabbit model./ Y.H. An [et al.] // J. Bone Joint Surg. Br. – 1997. – V. 79. – № 5. – P. 816–9. 20. An, Y.H. Handbook of Bacterial Adhesion / Y.H. An, R.J. Friedman / New Jersey: Humana Press, 2000. – 644 p. 119 21. The inhibitory activity of serum to prevent bacterial adhesion is mainly due to apotransferrin./ R. Ardehali [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. A. – 2003. – V. 66. – № 1. – P. 21–8. 22. SdrF, a Staphylococcus epidermidis surface protein, binds type I collagen./ C. Arrecubieta [et al.] // J. Biol. Chem. – 2007. – V. 282. – P. 18767–18776. 23. SdrF, a Staphylococcus epidermidis surface protein, contributes to the initiation of ventricular assist device driveline-related infections./ C. Arrecubieta [et al.] // PLoS Pathog. – 2009. – V. 5. – № 5. – P. 1–13. 24. Calcium inhibits bap-dependent multicellular behavior in Staphylococcus aureus./ M.J. Arrizubieta [et al.] // J. Bacteriol. – 2004. – V. 186. – № 22. – P. 7490–7498. 25. Atlas, R.M. Handbook of Microbiological Media / R.M. Atlas // by ed. L.C. Parks. CRC press, 1993. 3th ed – 1079 p. 26. Impact of the accessory gene regulatory system (Agr) on extracellular proteins, codY expression and amino acid metabolism in Staphylococcus epidermidis/ C.F. Batzilla [et al.] // Proteomics. – 2006. – V. 6. – P. 3602–3613. 27. Furanones as potential anti-bacterial coatings on biomaterials./ J.K. Baveja [et al.] // Biomaterials. – 2004. – V. 25. – № 20. – P. 5003–12. 28. Comparison of surface roughness of oral hard materials to the threshold surface roughness for bacterial plaque retention: a review of the literature./ C.M. Bollen [et al.] // Dent. Mater. – 1997. – V. 13. – P. 258–269. 29. Protein antimicrobial barriers to bacterial adhesion./ C.K. Bower [et al.] // J. Dairy Sci. – 1998. – V. 81. – № 10. – P. 2771–8. 30. Use of the atomic force microscope to determine the effect of substratum surface topography on bacterial adhesion/ R.D. Boyd [et al.] // Langmuir. – 2002. – V. 18. – P. 2343–2346. 31. Inhibitory effect of the human liver-derived antimicrobial peptide hepcidin 20 on biofilms of polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-positive and PIA-negative strains of Staphylococcus epidermidis./ F.L. Brancatisano [et al.] // Biofouling. – 2014. – V. 30. – № 4. – P. 435–46. 120 32. Control of staphylococcal adhesion to polystyrene surfaces by polymer surface modification with surfactants./ M.J. Bridgett [et al.] // Biomaterials. – 1992. – V. 13. – P. 411–416. 33. Adherence of coagulase-negative staphylococci onto polyethylene catheters in vitro and in vivo: a study on the influence of various plasma proteins/ P. Brokke [et al.] // J. Biomater. Appl. – 1991. – V. 5. – № 3. – P. 204–226. 34. The relationship between inhibition of bacterial adhesion to a solid surface by subMICs of antibiotics and subsequent development of a biofilm. / N. Cerca [et al.] // Res. Microbiol. – 2005a. – V. 156. – № 5-6. – P. 650–655. 35. Quantitative analysis of adhesion and biofilm formation on hydrophilic and hydrophobic surfaces of clinical isolates of Staphylococcus epidermidis./ N. Cerca [et al.] // Res. Microbiol. – 2005b. – V. 156. – № 4. – P. 506–514. 36. The Calgary Biofilm Device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms/ H. Ceri [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1999. – V. 37. – P. 1771–1776. 37. XTT assay for evaluating the effect of alcohols, hydrogen peroxide and benzalkonium chloride on biofilm formation of Staphylococcus epidermidis./ K. Chaieb [et al.] // Microb. Pathog. – 2011. – V. 50. – № 1. – P. 1–5. 38. Low concentration of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) affects biofilm formation of Listeria monocytogenes by inhibiting its initial adherence./ Y. Chang [et al.] // Food Microbiol. – 2012. – V. 29. – № 1. – P. 10–7. 39. Response to alkaline stress by root canal bacteria in biofilms./ L.E. Chávez de Paz [et al.] // Int. Endod. J. – 2007. – V. 40. – № 5. – P. 344–55. 40. Chmielewski, R.A.N., Biofilm Formation and Control in Food Processing Facilities/ R.A.N. Chmielewski, J.F. Frank. // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. – 2003. – V. 2. – № 1. – P. 22–32. 41. A zinc-dependent adhesion module is responsible for intercellular adhesion in staphylococcal biofilms./ D.G. Conrady [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2008. – V. 105. – № 49. – P. 19456–61. 121 42. Covalent immobilization of antimicrobial peptides (AMPs) onto biomaterial surfaces./ F. Costa [et al.] // Acta Biomater. – 2011. – V. 7. – № 4. – P. 1431–40. 43. Bacterial bioflims: a common cause of persistent infections/ J.W. Costerson [et al.] // Science. – 1999. – V. 284. – P. 1318–1322. 44. How bacteria stick./ J.W. Costerton [et al.] // Sci. Am. – 1978. – V. 238. – P. 86– 95. 45. Costerton, J.W. Overview of microbial biofilms/ J.W. Costerton // J. Ind. Microbiol. – 1995. – V. 15. – P. 137–140. 46. Quantitation and characterization of competitive protein binding to polymers./ C.N. Cottonaro [et al.] // Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. – 1981. – V. 27. – P. 391–5. 47. Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation./ C. Cucarella [et al.] // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183. – № 9. – P. 2888–96. 48. Role of extracellular DNA in initial bacterial adhesion and surface aggregation./ T. Das [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2010. – V. 76. – № 10. – P. 3405–8. 49. DNA-mediated bacterial aggregation is dictated by acid – base interactions/ T. Das [et al.] // Soft Matter. – 2011. – P. 2927–2935. 50. Davey, M.E. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics/ M.E. Davey, G.A. O’ Toole. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. MMBR. – 2000. – V. 64. – № 4. – P. 847–867. 51. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus./ F.R. DeLeo [et al.] // Lancet. – 2010. – V. 375. – № 9725. – P. 1557–68. 52. Quantitative comparison of shear-dependent Staphylococcus aureus adhesion to three polyurethane ionomer analogs with distinct surface properties./ R.B. Dickinson [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. – 1997. – V. 36. – № 2. – P. 152–162. 53. Donlan, R.M. Biofilms: microbial life on surfaces./ R.M. Donlan. // Emerg. Infect. Dis. – 2002. – V. 8. – № 9. – P. 881–90. 54. Donlan, R.M. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms/ R.M. Donlan, J.W. Costerton. // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – V. 15. – № 2. – P. 167–193. 122 55. Dunne Jr, W. The effects of magnesium, calcium, EDTA, and pH on the in vitro adhesion of Staphylococcus epidermidis to plastic./ W. Dunne Jr, E. Burd. // Microbiol. Immunol. – 1992. – V. 36. – № 10. – P. 1019–1027. 56. Dunne, W.M. Bacterial Adhesion: Seen Any Good Biofilms Lately?/ W.M. Dunne. // Clin. Microb. Rev. – 2002. – V. 15. – № 2. 57. New aspects in the molecular basis of polymer-associated infections due to staphylococci./ C. von Eiff [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Off. Publ. Eur. Soc. Clin. Microbiol. – 1999. – V. 18. – № 12. – P. 843–846. 58. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci / C. von Eiff [et al.] // Lancet Infect. Dis. – 2002. – V. 2. – P. 677–685. 59. Infections associated with medical devices: pathogenesis, management and prophylaxis./ C. von Eiff [et al.] // Drugs. – 2005. – V. 65. – № 2. – P. 179–214. 60. Elliott, T.S. Line-associated bacteraemias./ T.S. Elliott. // Commun. Dis. Rep. CDR Rev. – 1993. – V. 3. – P. R91–R96. 61. Fang, H. Rapid Screening and Identification of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Clinical Samples by Selective-Broth and Real-Time PCR Assay/ H. Fang, G. Hedin. // J. Clin. Microbiol. – 2003. – V. 41. – № 7. – P. 2894– 2899. 62. Evidence for low temperature regulation of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis./ F. Fitzpatrick [et al.] // J. Med. Microbiol. – 2005. – V. 54. – № Pt 5. – P. 509–10. 63. Bacterial colonization of functionalized polyurethanes/ R.G. Flemming [et al.] // Biomaterials. – 2000. – V. 21. – P. 273–281. 64. Fletcher, M. The effects of proteins on bacterial attachment to polystyrene./ M. Fletcher. // J. Gen. Microbiol. – 1976. – V. 94. – № 2. – P. 400–404. 65. Fletcher, M. Bubble contact angle method for evaluating substratum interfacial characteristics and its relevance to bacterial attachment./ M. Fletcher, K.C. Marshall. // Appl. Environ. Microbiol. – 1982. – V. 44. – № 1. – P. 184–192. 123 66. Bacteriocins Pep5 and epidermin inhibit Staphylococcus epidermidis adhesion to catheters./ M.B.C. Fontana [et al.] // Curr. Microbiol. – 2006. – V. 52. – № 5. – P. 350– 3. 67. Frank, J.F. Microbial attachment to food and food contact surfaces/ J.F. Frank. // Adv. Food Nutr. Res. – 2001. – V. 43. – P. 319–370. 68. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci/ D.J. Freeman [et al.] //J. .Clin. Pathol. – 1989. – P. 872–874. 69. Is the GehD lipase from Staphylococcus epidermidis a collagen binding adhesin?/ M. Gabriela Bowden [et al.] // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – P. 43017–43023. 70. Early adhesion of bacteremic strains of Staphylococcus epidermidis to polystyrene: influence of hydrophobicity, slime production, plasma, albumin, fibrinogen, and fibronectin./ S. Galliani [et al.] // J. Lab. Clin. Med. – 1994. – V. 123. – P. 685–692. 71. Genetic classification and distinguishing of Staphylococcus species based on different partial gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf gene sequences./ B. Ghebremedhin [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2008. – V. 46. – № 3. – P. 1019–25. 72. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms./ H. Gibson [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 1999. – V. 87 – № 1. – P. 41–8. 73. Gilan, I. Extracellular DNA Plays an Important Structural Role in the Biofilm of the Plastic Degrading Actinomycete Rhodococcus ruber/ I. Gilan, A. Sivan. // Adv. Microbiol. – 2013. – V. 3. – P. 543–551. 74. Surface characteristics and adhesion of Escherichia coli and Staphylococcus epidermidis./ P. Gilbert [et al.] // J. Appl. Bacteriol. – 1991. – V. 71. – P. 72–77. 75. Biofilm susceptibility to antimicrobials./ P. Gilbert [et al.] // Adv. Dent. Res. – 1997. – V. 11. – P. 160–167. 76. Insights on Evolution of Virulence and Resistance from the Complete Genome Analysis of an Early Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain and a Staphylococcus epidermidis Strain / S.R. Gill [et al.] // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187. – № 7. – P. 2426–2438. 124 77. Antimicrobial peptides: the LPS connection./ A. Giuliani [et al.] // Methods Mol. Biol. – 2010. – V. 618. – P. 137–154. 78. Goldsmith, H.L. Rheological aspects of thrombosis and haemostasis: basic principles and applications. ICTH-Report--Subcommittee on Rheology of the International Committee on Thrombosis and Haemostasis./ H.L. Goldsmith, V.T. Turitto. // Thromb. Haemost. – 1986. – V. 55. – P. 415–435. 79. Gordon, A.S. Electrolyte effects on attachment of an estuarine bacterium./ A.S. Gordon, F.J. Millero. // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – V. 47. – P. 495–499. 80. Gossas, T. Characterization of Ca2+ interactions with matrix metallopeptidase-12: implications for matrix metallopeptidase regulation./ T. Gossas, U.H. Danielson. // Biochem. J. – 2006. – V. 398. – P. 393–398. 81. Götz, F. Staphylococcus and biofilms/ F. Götz. // Mol. Microbiol. – 2002. – V. 43. – № 6. – P. 1367–1378. 82. The Genera Staphylococcus and Macrococcus / F. Götz [et al.] // The Prokaryotes / by ed. M. Dworkin [et al.] New York, NY: Springer US, 2006. – P. 5–75. 83. Biomaterial specificity, molecular mechanisms, and clinical relevance of S. epidermidis and S. aureus infections in surgery / A. Gristina [et al.] // Pathogenesis and Clinical Significance of Coagulase-negative Staphylococci / by ed. G. Pulverer [et al.] Starttgart: Fisher Verlag, 1987. – P. 143–157. 84. Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease./ E. Guaní-Guerra [et al.] // Clin. Immunol. – 2010. – V. 135. – P. 1–11. 85. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases./ L. HallStoodley [et al.] // Nat. Rev. Microbiol. – 2004. – V. 2. – P. 95–108. 86. Hall-Stoodley, L. Evolving concepts in biofilm infections / L. Hall-Stoodley, P. Stoodley // Cell. Microbiol. – 2009. – V. 11. – P. 1034–1043. 87. Harden, V. The isoelectric point of bacterial cells/ V. Harden, J. Harris. // J. Bacteriol. – 1953. – V. 65. – № 2. – P. 198–202. 88. The Fbe (SdrG) protein of Staphylococcus epidermidis HB promotes bacterial adherence to fibrinogen./ O. Hartford [et al.] // Microbiology. – 2001a. – V. 147. – P. 2545–2552. 125 89. Identification of residues in the Staphylococcus aureus fibrinogen-binding MSCRAMM clumping factor A (ClfA) that are important for ligand binding./ O.M. Hartford [et al.] // J. Biol. Chem. – 2001b. – V. 276. – P. 2466–2473. 90. Evidence for autolysin-mediated primary attachment of Staphylococcus epidermidis to a polystyrene surface./ C. Heilmann [et al.] // Mol. Microbiol. – 1997. – V. 24. – № 5. – P. 1013–1024. 91. Spontaneous switch to PIA-independent biofilm formation in an ica-positive Staphylococcus epidermidis isolate./ S. Hennig [et al.] // Int. J. Med. Microbiol. – 2007. – V. 297. – № 2. – P. 117–22. 92. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria./ B. Herigstad [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 2001. – V. 44. – № 2. – P. 121–9. 93. Fibronectin, fibrinogen, and laminin act as mediators of adherence of clinical staphylococcal isolates to foreign material./ M. Herrmann [et al.] // J. Infect. Dis. – 1988. – V. 158. – № 4. – P. 693–701. 94. NHSN annual update: antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcareassociated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2006-2007./ A.I. Hidron [et al.] // Infect. Control Hosp. Epidemiol. – 2008. – V. 29. – № 11. – P. 996– 1011. 95. Adhesion of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus to a hydrophobic biomaterial./ A.H. Hogt [et al.] // J. Gen. Microbiol. – 1985a. – V. 131. – № 9. – P. 2485–2491. 96. Adhesion of coagulase-negative staphylococci with different surface characteristics onto a hydrophobic biomaterial/ A.H. Hogt [et al.] // Antonie Van Leeuwenhoek. – 1985b. – V. 51. – № 5-6. – P. 510–512. 97. The dynamics of Staphylococcus epidermis biofilm formation in relation to nutrition, temperature, and time/ V. Holá [et al.] // Scripta Medica. – 2006. – V. 79. – P. 169–174. 126 98. Hood, S.K. Adherence to stainless steel by foodborne microorganisms during growth in model food systems/ S.K. Hood, E.A. Zottola. // Int. J. Food Microbiol. – 1997. – V. 37. – P. 145–153. 99. Importance of medium and atmosphere type to both slime production and adherence by coagulase-negative staphylococci./ M. Hussain [et al.] // J. Hosp. Infect. – 1992. – V. 20. – P. 173–184. 100. A 140-kilodalton extracellular protein is essential for the accumulation of Staphylococcus epidermidis strains on surfaces./ M. Hussain [et al.] // Infect. Immun. – 1997. – V. 65. – № 2. – P. 519–24. 101. Teichoic acid enhances adhesion of Staphylococcus epidermidis to immobilized fibronectin./ M. Hussain [et al.] // Microb. Pathog. – 2001. – V. 31. – P. 261–270. 102. Modes of conformational changes of proteins adsorbed on a planar hydrophobic polymer surface reflecting their adsorption behaviors/ R. Ishiguro [et al.] // J. Colloid Interface Sci. – 2005. – V. 290. – P. 91–101. 103. Differential roles of poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms./ E. a Izano [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2008. – V. 74. – № 2. – P. 470–6. 104. Effect of milk temperature and flow on the adherence of Staphylococcus epidermidis to stainless steel in amounts capable of biofilm formation/ Z. Jaglic [et al.] // Dairy Sci. Technol. – 2011. – V. 91. – № 3. – P. 361–372. 105. Jarvis, R.A. Effects of controlled fibronectin surface orientation on subsequent Staphylococcus epidermidis adhesion/ R.A. Jarvis, J.D. Bryers. // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. – 2005. – V. 75. – P. 41–55. 106. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants./ G. Ji [et al.] // Science. 1997. – V. 276. – P. 2027–2030. 107. The binding of calcium to the B-repeat segment of SdrD, a cell surface protein of Staphylococcus aureus/ E. Josefsson [et al.] // J Biol Chem. – 1998. – V. 273. – P. 31145–31152. 127 108. Adhesion of the positively charged bacterium Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and teflon/ B.A. Jucker [et al.] // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 5472–5479. 109. EDTA as a potential agent preventing formation of Staphylococcus epidermidis biofilm on polichloride vinyl biomaterials/ M. Juda [et al.] // Ann. Agric. Environ. Med. – 2008. – V. 15. – P. 237–241. 110. New trends in peptide-based anti-biofilm strategies: a review of recent achievements and bioinformatic approaches / Jorge [et al.] // Biofouling. – 2012. – V. 28. – № 10. – P. 1033-61 111. Adhesion as an interplay between particle size and surface roughness/ J. Katainen [et al.] // J. Colloid Interface Sci. – 2006. – V. 304. – P. 524–529. 112. Katsikogianni, M. Concise review of mechanisms of bacterial adhesion to biomaterials and of techniques used in estimating bacteria-material interactions./ M. Katsikogianni, Y.F. Missirlis. // Eur. Cell. Mater. – 2004. – V. 8. – P. 37–57. 113. Bacterial adherence to titanium surface coated with human serum albumin./ T.J. Kinnari [et al.] // Otol. Neurotol. – 2005. – V. 26. – № 3. – P. 380–4. 114. Effect of zeta potential value on bacterial behavior during electrophoretic separation./ E. Kłodzińska [et al.] // Electrophoresis. – 2010. – V. 31. – № 9. – P. 1590–6. 115. Alcoholic ingredients in skin disinfectants increase biofilm expression of Staphylococcus epidermidis./ J.K.-M. Knobloch [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2002. – V. 49. – P. 683–687. 116. Biofilms of clinical strains of Staphylococcus that do not contain polysaccharide intercellular adhesin./ G. Kogan [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 2006. – V. 255. – P. 11–16. 117. Staphylococcus quorum sensing in biofilm formation and infection./ K.-F.F. Kong [et al.] // Int. J. Med. Microbiol. – 2006. – V. 296. – № 2-3. – P. 133–9. 118. Kuusela, P. Fibronectin binds to Staphylococcus aureus/ P. Kuusela. // Nature. – 1978. – V. 276. – № 5689. – P. 718–720. 128 119. Shear-dependent inhibition of granulocyte adhesion to cultured endothelium by dextran sulfate./ K. Ley [et al.] // Blood. – 1989. – V. 73. – № 5. – P. 1324–1330. 120. Shear stress affects the kinetics of Staphylococcus aureus adhesion to collagen./ Z.J. Li [et al.] // Biotechnol. Prog. – 2000. – V. 16. – № 6. – P. 1086–90. 121. Involvement of iron in biofilm formation by Staphylococcus aureus./ M.-H. Lin [et al.] // PLoS One. – 2012. – V. 7. – № 3. – P. e34388. 122. Adhesion of Staphylococcus epidermidis to biomaterials is inhibited by fibronectin and albumin./ J.C. Linnes [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. A. – 2012. – V. 100. – № 8. – P. 1990–1997. 123. Giant extracellular matrix binding protein expression in Staphylococcus epidermidis is regulated by biofilm formation and osmotic pressure./ J.C. Linnes [et al.] // Curr. Microbiol. – 2013. – V. 66. – № 6. – P. 627–33. 124. Hydrophobic and electrostatic parameters in bacterial adhesion - Dedicated to Werner Stumm for his 65th birthday/ M.C.M. van Loosdrecht [et al.] // Aquat. Sci. – 1990. – V. 52. – P. 103–114. 125. Electrophoretic Mobility and Hydrophobicity as a Measure To Predict the Initial Steps of Bacterial Adhesion/ M.C.M. van Loosdrecht [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1987. – V. 53. – № 8. – P. 1898–1901. 126. Lowy, F.D. Staphylococcus aureus infections./ F.D. Lowy. // N. Engl. J. Med. – 1998. – V. 339. – № 8. – P. 520–32. 127. The terminal A domain of the fibrillar accumulation-associated protein (Aap) of Staphylococcus epidermidis mediates adhesion to human corneocytes./ R.L. Macintosh [et al.] // J. Bacteriol. – 2009. – V. 191. – № 22. – P. 7007–16. 128. Parallel induction by glucose of adherence and a polysaccharide antigen specific for plastic-adherent Staphylococcus epidermidis: evidence for functional relation to intercellular adhesion./ D. Mack [et al.] // Infect. Immun. – 1992. – V. 60. – P. 2048– 2057. 129. Mack, D. Molecular mechanisms of Staphylococcus epidermidis biofilm formation/ D. Mack. // J Hosp Infect. – 1999. – V. 43 – Suppl. P. S113–25. 129 130. Staphylococcus epidermidis biofilms:Functional molecules, relation to virulence, and vaccine potential/ D. Mack [et al.] // Top. Curr. Chem. – 2009. – V. 288. – P. 157– 182. 131. Mattick, A. Further observations on an inhibitory substance (nisin) from lactic streptococci/ A. Mattick and A.Hirsch // Lancet. – 1947. – V. 12. – P. 5–8. 132. Marambio-Jones, C. A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment/ C. Marambio-Jones, E.M.V. Hoek // J. Nanoparticle Res. – 2010. – V. 12. – № 5. – P. 1531–1551. 133. The ica locus of Staphylococcus epidermidis encodes production of the capsular polysaccharide/adhesin./ D. McKenney [et al.] // Infect. Immun. – 1998. – V. 66. – № 10. – P. 4711–20. 134. Biofilm formation on stainless steel by Staphylococcus epidermidis in milk and influence of glucose and sodium chloride on the development of ica-mediated biofilms/ E. Michu [et al.] // Int. Dairy J. – 2011. – V. 21. – № 3. – P. 179–184. 135. Effect of calcium ions on enteropeptidase catalysis/ A.G. Mikhailova [et al.] // Biochem. – 2005. – V. 70. – P. 1129–1135. 136. Impact of nano-topography on bacterial attachment/ N. Mitik-Dineva [et al.] // Biotechnol. J. – 2008. – V. 3. – P. 536–544. 137. Navarre, W.W. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope./ W.W. Navarre, O. Schneewind. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1999a. – V. 63. – № 1. – P. 174–229. 138. Neu, T.R. Bacterial polymers: physicochemical aspects of their interactions at interfaces./ T.R. Neu, K.C. Marshall. // J. Biomater. Appl. – 1990. – V. 5. – P. 107–133. 139. Japanese features of native valve endocarditis caused by coagulase-negative staphylococci: Case reports and a literature review/ Y. Nishizaki [et al.] // Intern. Med. – 2013. – V. 52. – P. 567–572. 140. Effect of alkaline pH on staphylococcal biofilm formation./ A. Nostro [et al.] // APMIS. – 2012. – V. 120. – № 9. – P. 733–42. 141. Biofilm formation as microbial development/ G. O’ Toole [et al.] // Annu. Rev. Microbiol. – 2000. – V. 54. – P. 49–79. 130 142. A novel Staphylococcus aureus biofilm phenotype mediated by the fibronectinbinding proteins, FnBPA and FnBPB./ E. O’Neill [et al.] // J. Bacteriol. – 2008. – V. 190. – № 11. – P. 3835–50. 143. Bacterial adherence to bioinert and bioactive materials studied in vitro./ M. Oga [et al.] // Acta Orthop. Scand. – 1993. – V. 64. – P. 273–276. 144. The role of hydrophobicity in bacterial adhesion/ R. Oliveira [et al.] // Bioline. – 2001. – P. 11–22. 145. Staphylococcus epidermidis agr quorum-sensing system: signal identification, cross talk, and importance in colonization/ M. Olson [et al.] // J. Bacteriol. – 2014. – V. 196. – P. 3482–93. 146. Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the “accidental” pathogen./ M. Otto. // Nat. Rev. Microbiol. – 2009. – V. 7. – № 8. – P. 555–67. 147. Human host defense peptide LL-37 prevents bacterial biofilm formation/ J. Overhage [et al.] // Infect. Immun. – 2008. – V. 76. – P. 4176–4182. 148. The effects of magnesium, calcium and EDTA on slime production by Staphylococcus epidermidis strains./ N. Ozerdem Akpolat [et al.] // Folia Microbiol. (Praha). – 2003. – V. 48. – № 5. – P. 649–653. 149. Modulation of adherence of coagulase-negative staphylococci to Teflon catheters in vitro./ A. Pascual [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. – 1986. – V. 5. – P. 518–522. 150. S. epidermidis biofilm formation: Effects of biomaterial surface chemistry and serum proteins/ J.D. Patel [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. – 2007. – V. 80. – P. 742–751. 151. MSCRAMM-mediated adherence of microorganisms to host tissues./ J.M. Patti [et al.] // Annu. Rev. Microbiol. – 1994. – V. 48. – P. 585–617. 152. Paul, J. Effects of antimetabolites on the adhesion of an estuarine Vibrio sp. to polystyrene./ J. Paul. // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – V. 48. – № 5. – P. 924–929. 153. Paul, J.H. Evidence for Separate Adhesion Mechanisms for Hydrophilic and Hydrophobic Surfaces in Vibrio proteolytica/ J.H. Paul, W.H. Jeffrey. // Appl. Environ. Microbiol. – 1985. – V. 50. – № 2. – P. 431–437. 131 154. Adhesion of staphylococci to chemically modified and native polymers, and the influence of preadsorbed fibronectin, vitronectin and fibrinogen./ M. Paulsson[et al.] // Biomaterials. – 1993. – V. 14. – P. 845–853. 155. Tetrasodium EDTA as a novel central venous catheter lock solution against biofilm/ S. Percival [et al.] // Infect. Control – 2005. – V. 26. – № 6. – P. 515–519. 156. Surface free energy effect on bacterial retention/ C.I. Pereni [et al.] // Colloids Surfaces B Biointerfaces. – 2006. – V. 48. – P. 143–147. 157. Biophysical model of bacterial cell interactions with nanopatterned cicada wing surfaces./ S. Pogodin [et al.] // Biophys. J. – 2013. – V. 104. – № 4. – P. 835–840. 158. Proctor, R. a. Fibronectin: a brief overview of its structure, function, and physiology./ R. a Proctor. // Rev. Infect. Dis. – 1987. – V. 9 – Suppl 4. – P. S317–321. 159. Formation and properties of in vitro biofilms of ica-negative Staphylococcus epidermidis clinical isolates/ Z. Qin [et al.] // J. Med. Microbiol. – 2007a. – V. 56. – P. 83–93. 160. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis./ Z. Qin [et al.] // Microbiology. – 2007b. – V. 153. – № Pt 7. – P. 2083– 2092. 161. Effect of subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesin expression in biofilm-forming Staphylococcus epidermidis/ S. Rachid [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2000. – V. 44. – № 12. – P. 3357–3363. 162. Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by environmental factors: the possible involvement of the alternative transcription factor sigB./ S. Rachid [et al.] // Adv. Exp. Med. Biol. – 2000. – V. 485. – P. 159–166. 163. Identification of Antimicrobial Peptides and Immobilization Strategy Suitable for a Covalent Surface Coating with Biocompatible Properties/ K. Rapsch [et al.] // Bioconjug. Chem. – 2014. – V. 25. – P. 308–319. 164. Surface Physicochemistry and Ionic Strength Affects eDNA’s Role in Bacterial Adhesion to Abiotic Surfaces./ V.R. Regina [et al.] // PLoS One. – 2014. V. 9. – № 8. – P. e105033. 132 165. Different patterns of biofilm formation in Staphylococcus aureus under foodrelated stress conditions/ T.M. Rode [et al.] // Int. J. Food Microbiol. – 2007. – V. 116. – P. 372–383. 166. Detection of virulence-associated genes not useful for discriminating between invasive and commensal Staphylococcus epidermidis strains from a bone marrow transplant unit./ H. Rohde [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – V. 42. – № 12. – P. 5614–9. 167. Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation via proteolytic processing of the accumulation-associated protein by staphylococcal and host proteases/ H. Rohde [et al.] // Mol. Microbiol. – 2005. – V. 55. – № 6. – P. 1883–95. 168. Polysaccharide intercellular adhesin or protein factors in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus isolated from prosthetic hip and knee joint infections/ H. Rohde [et al.] // Biomaterials. – 2007. – V. 28. – № 9. – P. 1711–20. 169. Inhibitory effect of disodium EDTA upon the growth of Staphylococcus epidermidis in vitro: relation to infection prophylaxis of Hickman catheters./ J.L. Root [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 1988. – V. 32. – № 11. – P. 1627–31. 170. Rosenbach, F.J. Mikroorganismen bei den Wundinfections-Krankheiten des Menschen. / F.J. Rosenbach / Weisbaden, Germany, 1884. – 1–122 p. 171. Adherence of bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cellsurface hydrophobicity/ M. Rosenberg [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1980. – V. 9. – № 1. – P. 29–33. 172. Extracellular Carbohydrate-Containing Polymers of a Model Biofilm-Producing Strain , Staphylococcus epidermidis RP62A/ I. Sadovskaya [et al.] // Infect. Immun. – 2005. – V. 73. – № 5. – P. 3007–17. 173. Sandiford, S. Identification, characterization, and recombinant expression of epidermicin NI01, a novel unmodified bacteriocin produced by Staphylococcus epidermidis that displays potent activity against Staphylococci./ S. Sandiford, M. Upton. // Antimicrob. Agents Chemother. – 2012. – V. 56. – № 3. – P. 1539–47. 133 174. Sang, Y. Antimicrobial peptides and bacteriocins: alternatives to traditional antibiotics./ Y. Sang, F. Blecha. // Anim. Health Res. Rev. – 2008. – V. 9. – № 2. – P. 227–35. 175. Adherence of streptococci to surface-modified glass./ N. Satou [et al.] // J. Gen. Microbiol. – 1988. – V. 134. – P. 1299–1305. 176. Effects of Substratum Topography on Bacterial Adhesion./ T. Scheuerman [et al.] // J. Colloid Interface Sci. – 1998. – V. 208. – P. 23–33. 177. Influence of fibronectin on the adherence of Staphylococcus epidermidis to coated and uncoated intraocular lenses/ A.C. Schroeder [et al.] // J. Cataract Refract. Surg. – 2008. – V. 34. – P. 497–504. 178. Shai, Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides./ Y. Shai. // Biochim. Biophys. Acta. – 1999. – V. 1462. – № 1-2. – P. 55–70. 179. Adherence ability of Staphylococcus epidermidis on prosthetic biomaterials: an in vitro study./ T. Shida [et al.] // Int. J. Nanomedicine. – 2013. – V. 8. – P. 3955–61. 180. Shukla, S.K. Effect of calcium on Staphylococcus aureus biofilm architecture: a confocal laser scanning microscopic study./ S.K. Shukla, T.S. Rao. // Colloids Surf. B. Biointerfaces. – 2013. – V. 103. – № 2010. – P. 448–454. 181. Antimicrobial-Resistant Pathogens Associated with Healthcare-Associated Infections: Summary of Data Reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2009–2010. / Sievert D.M. [et al.] // Infection Control and Hospital Epidemiology. – 2013. – V. 34. – №. 1. – Р. 1–14. 182. Influence of temperature and surface kind on biofilm formation by Staphylococcus aureus from food-contact surfaces and sensitivity to sanitizers/ Q.G. da Silva Meira [et al.] // Food Control. – 2012. – V. 25. – № 2. – P. 469–475. 183. R chi-01, a new family of oxazolidinones that overcome ribosome-based linezolid resistance./ E. Skripkin [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2008. – V. 52. – № 10. – P. 3550–3557. 134 184. Steinberger, R.E. Extracellular DNA in Single- and Multiple-Species Unsaturated Biofilms / R.E. Steinberger, P.A. Holden. // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V. 71. – № 9. – P. 5404-10. 185. Influence of dynamic conditions on biofilm formation by staphylococci./ S. Stepanović [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2001. – V. 20. – P. 502–504. 186. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. / S. Stepanović [et al.] // APMIS. – 2007. – V. 115. – P. 891–899. 187. Role of environmental and antibiotic stress on Staphylococcus epidermidis biofilm microstructure./ E.J. Stewart [et al.] // Langmuir. – 2013. – V. 29. – P. 7017–24. 188. Biofilm material properties as related to shear-induced deformation and detachment phenomena./ P. Stoodley [et al.] // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 29. – № 6. – P. 361–7. 189. Inhibition of biofilm formation by monoclonal antibodies against Staphylococcus epidermidis RP62A accumulation-associated protein./ D. Sun [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2005. – V. 12. – P. 93–100. 190. Understanding effects of viscosity in the BioFlux system [Электронный ресурс]. URL: http://support.fluxionbio.com/entries/26384038-Viscosity-Understanding-effectsof-viscosity-in-the-BioFlux-system (дата обращения: 20.09.2014). 191. Influence of silicone surface roughness and hydrophobicity on adhesion and colonization of Staphylococcus epidermidis./ H. Tang [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. A. 2009. – V. 88. – № 2. – P. 454–463. 192. Tetz, G.V. Effect of DNase and antibiotics on biofilm characteristics / G.V. Tetz N. K. Artemenko, V.V. Tetz // Antimicrob. Agents Chemother. – 2009. – V. 53. – № 3. – P.1204–1209. 193. The Antimicrobial Peptide Database (APD) [Электронный ресурс]. URL: http://aps.unmc.edu/AP/main.php (дата обращения: 20.10.2014). 194. Tolker-Nielsen, T. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities/ T. Tolker-Nielsen, S. Molin. // Microb Ecol. – 2000. – V. 40. – P. 75–84. 135 195. SarA Is an Essential Positive Regulator of Staphylococcus epidermidis Biofilm Development / M.Á. Tormo [et al.] // J. Bacteriol. – 2005. J. Bacteriol. 2005. – V.187. – P. 2348 –56. 196. Vaara, M. New approaches in peptide antibiotics / M. Vaara // Curr. Opin. Pharmacol. – 2009. – V. 9. – P. 571–576. 197. Bacterial surface properties of clinically isolated Staphylococcus epidermidis strains determine adhesion on polyethylene./ K. Vacheethasanee [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. – 1998. – V. 42. – № 3. – P. 425–32. 198. Vadyvaloo, V. Molecular genetics of Staphylococcus epidermidis biofilms on indwelling medical devices./ V. Vadyvaloo, M. Otto. // Int. J. Artif. Organs. – 2005. – V. 28. – № 11. – P. 1069–78. 199. Role of fibronectin in staphylococcal colonisation of fibrin thrombi and plastic surfaces./ P. Valentin-Weigand [et al.] // J. Med. Microbiol. – 1993. – V. 38. – № 2. – P. 90–5. 200. Expression of Biofilm-Associated Genes in Staphylococcus epidermidis during In Vitro and In Vivo Foreign Body Infections/ S.J. Vandecasteele [et al.] // J. Infec.Diseas. – 2003. – P. 188. 201. Adsorption of fibronectin onto polymethylmethacrylate and promotion of Staphylococcus aureus adherence./ P.E. Vaudaux [et al.] // Infect. Immun. – 1984. – V. 45. – № 3. – P. 768–74. 202. Nosocomial infection and related risk factors in a general surgery service: a prospective study/ P. Vazquez-Aragon [et al.] // J.Infect. – 2003. – V. 46. – P. 17–22. 203. Ultrastructural organization and regulation of a biomaterial adhesin of Staphylococcus epidermidis/ G.J.C. Veenstra [et al.] // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 537–541. 204. Vinh, D.C. Device-related infections: a review./ D.C. Vinh, J.M. Embil. // J. Long. Term. Eff. Med. Implants. – 2005. – V. 15. – P. 467–488. 205. [The effect of valinomycin and nigericin on the efficacy of bacteriophage infection of staphylococcal cells] / A.I. Vinnikov [et al.] // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. – 1989. – № 2. – P. 17–20. 136 206. Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery / E. Vives [et al.] // Biochim. Biophys. Acta - Rev. Cancer. – 2008. – V. 1786. – P. 126–138. 207. Interaction of high molecular weight kininogen, factor XII, and fibrinogen in plasma at interfaces./ L. Vroman [et al.] // Blood. – 1980. – V. 55. – P. 156–159. 208. Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) protects Staphylococcus epidermidis against major components of the human innate immune system./ C. Vuong [et al.] // Cell. Microbiol. – 2004. – V. 6. – № 3. – P. 269–275. 209. Impact of the agr quorum-sensing system on adherence to polystyrene in Staphylococcus aureus./ C. Vuong и др. // J. Infect. Dis. – 2000. – V. 182. – № 6. – P. 1688–1693. 210. Vuong, C. Staphylococcus epidermidis infections./ C. Vuong, M. Otto. // Microbes Infect. Inst. Pasteur. – 2002. – V. 4. – № 4. – P. 481–489. 211. Staphylococcus epidermidis adhesion to hydrophobic biomedical polymer is mediated by platelets./ I.W. Wang [et al.] // J. Infect. Dis. – 1993. – V. 167. – № 2. P. 329–336. 212. Wiencek, K.M. Effects of substratum wettability and molecular topography on the initial adhesion of bacteria to chemically defined substrata/ K.M. Wiencek, M. Fletcher. // Biofouling. – 1997. – V. 11. – P. 293–311. 213. Identification of a Fibronectin-Binding Protein from Staphylococcus epidermidis/ R.J. Williams [et al.] // Infect. Immun. – 2002. – V. 70. – № 12. – P. 6805–6810. 214. Wilson, M. Bacterial biofilms and human disease./ M. Wilson. // Sci. Prog. – 2001. – V. 84. – P. 235–254. 215. Wilson, M. Medical implications of biofilms / M. Wilson, D. Devine / Gambridge university press, 2003. – 654 p. 216. Wimley, W. C. Describing the mechanism of antimicrobial peptide action with the interfacial activity model / W. C.Wimley // ACS Chem. Biol. 2010. V. 5. P. 905–917. 217. Is hospital-acquired intravascular catheter-related sepsis associated with outbreak strains of coagulase-negative staphylococci?/ T. Worthington [et al.] // J. Hosp. Infect. – 2000. – V. 46. – P. 130–134. 137 218. Biofilms in Wastewater Treatment: An Interdisciplinary Approach / S. Wuertz [et al.] / 2008. – 424 p. 219. Xu, L.-C. Submicron-textured biomaterial surface reduces staphylococcal bacterial adhesion and biofilm formation./ L.-C. Xu, C.A. Siedlecki. // Acta Biomater. – 2012a. – V. 8. – № 1. – P. 72–81. 220. Xu, L.-C. Effects of Plasma Proteins on Staphylococcus epidermidis RP62A Adhesion and Interaction with Platelets on Polyurethane Biomaterial Surfaces/ L.-C. Xu, C.A. Siedlecki. // J. Biomater. Nanobiotechnol. – 2012b. – V. 03. – № 04. – P. 487– 498. 221. Development and application of loop-mediated isothermal amplification assays on rapid detection of various types of staphylococci strains./ Z. Xu [et al.] // Food Res. Int. – 2012. – V. 47. – № 2. – P. 166–173. 222. Prevention of biofilm formation on titanium surfaces modified with conjugated molecules comprised of antimicrobial and titanium-binding peptides./ M. Yoshinari [et al.] // Biofouling. – 2010. – V. 26. – P. 103–110. 223. Yuan, Y. Contact angle and wetting properties / Y. Yuan, T.R. Lee. // Surface Science Techniques Springer Series in Surface Sciences. / by ed. G. Bracco, B. Holst. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2013. 224. Measurement of polysaccharides and proteins in biofilm extracellular polymers / X. Zhang [et al.] // Water Science and Technology. – 1998. – P. 345–348. 225. Nosocomial infections by Staphylococcus epidermidis: how a commensal bacterium turns into a pathogen/ W. Ziebuhr [et al.] // Int. J. Antimicrob. Agents. – 2006. – V. 28. – P. 14–20. 226. A Microtiter plate assay for Staphylococcus aureus biofilm quantification at various pH levels and hydrogen peroxide supplementation/ T. Zmantar [et al.] // New Microbiol. – 2010. – V. 33. – P. 137–145. 227. Zobell, C.E. The Effect of Solid Surfaces upon Bacterial Activity./ C.E. Zobell. // J. Bacteriol. – 1943. – V. 46. – P. 39–56.